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WO 96/24686 PCT/FR96/00202
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Détection de bactéries du genre Li.steria selon des techniques d'hybridation
de
sondes nucléiques.
La présente invention concerne le domaine des techniques de détection et/ou
S d'amplification, à l'aide de sondes ou d'amorces oligonucléotidiques, et
leur application à la
recherche de la présence ou à l'identification de bactéries du genre Listeria.
Les Listeria sont des bactéries Gram + appartenant à la famille des
Listeriaceae,
qui est subdivisée en deux genres : le genre Listeria et le genre Brochothrix
(Collins et al.,
1991, International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 240-246). Le genre
Listeria
regroupe les espèces bactériennes suivantes : Listeria monoévtogenes, Listeria
irmocua,
Listeria seeligeri, Listeria welshimeri, Listeria ivanovü, Listeria niurrayi
et Listeria grayi.
Seule l'espèce Listeria monocytogenes présente un pouvoir pathogène pour
l'homme. Cette
espèce est notamment responsable chez l'homme de pathologies sévères telles
que des
méningo-encéphalites, septicémies ou avortements. Par ailleurs, depuis 1981,
l'espèce Listeria
1 S monocytogeries est reconnue comme agent responsable de plusieurs épidémies
d'intoxications
alimentaires, notamment au Canada en 1981, aux Etats Unis de 1983 à 1985, en
Suisse de
1983 à 1987 et très récemment en France en 1992 et 1993. Le taux de mortalité
associé à ces
épidémies est très élevé, un tiers environ des cas aboutissant à un avortement
ou à un décès.
Il est donc important de développer un test de diagnostic bactériologique
suffisamment spécifique et sensible pour permettre une détection rapide et
sélective de l'espèce
Listeria monocytogenes, utilisable notamment dans l'industrie alimentaire et
le diagnostic
médical.
Une première génération de tests rapides a été proposée, basés sur la
technique de
cytométrie de flux (Donnelly C.W., G.J. Baigent, and E.H. Briggs, 1988 : Flow
cytometry for
2S automated analysis of mille containing Listeria monocytogenes ; J. Assoc.
Off. Anal. Chem.71:
6SS-6S8) ou sur la méthode ELISA ("enzyme-linked immunosorbent assay")
(Mattingley J.A.,
B.T. Butman, M.C. Planck, R.J. Durham, and B.J. Robinson, 1988 : Rapid
monoclonal
antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Listeria
in food
products ; J. Assoc. Ofl'. Anal. Chem. 71: 679-681 ). Toutefois, ces
techniques ne permettent
que la détection des bactéries appartenant au genre Listeria sans aucune
discrimination des
espèces, et notamment de l'espèce pathogène Li.steria !?10i10C'ytOgei72s.
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D'autres techniques de détection par hybridation d'acides nucléiques,
utilisant des
marqueurs génétiques, ont ensuite été développées. II a ainsi été montré que
certaines
séquences d'acides nucléiques sont spécifiques de la seule espèce L.
monocytogenes. Ces
séquences font notamment partie des gènes codant pour des déterminants de
virulence, tels que
la région en aval du gène hlyA (listeriolysine O) (Mengaud J., M.F. Vicente,
J. Chenevert, J.
Moniz-Pereira, C. Geoffroy, B. Gicquel-Sanzey, F. Baquero, J.C. Perez-Diaz,
and P. Cossart,
1988 : Expression in Escherichia coli and sequence analysis of the
listeriolysin O determinant
of Listeria mônocytogenes ; Infect. Immun. 56: 766-772) ou le gène iap
("invasion-associated
protein", encore appelée p60, K~hler S., M. Leimeister-W~chter, T.
Chakraborty, F.
Lottspeich, and W. Goebel, 1990 : The Bene coding for protein p60 of Listeria
monocytogenes
and its use as a specific probe for Listeria mor~ocytoge~~es ; Infect. Immun.
58: 1943-1950).
Toutefois, l'utilisation de ces marqueurs nécessite une étape préalable
d'amplification d'acide
nucléique afin d'obtenir une sensibilité convenable des tests, car chacun de
ces gènes n'est
présent qu'en monocopie.
La présente invention pallie les inconvénients précédemment cités pour la mise
en
évidence de la présence de bactéries du genre Listeria, et plus
particulièrement de l'espèce
Listeria mofiocytogenes, par utilisation d'un marqueur génétique dans un
procédé de détection
par hybridation d'acides nucléiques, alliant spécificité, sensibilité et
rapidité.
Les ribosomes bactériens contiennent au moins trois molécules d'ARN distinctes
appelées ARNr SS, 16S et 23S. Historiquement, ces dénominations ont été
choisies par
référence à leur vitesse de sédimentation, qui est reliée à la taille de ces
molécules d'ARN.
Dans le procédé de l'invention, l'ARN ribosomique (ARNr) des bactéries peut
être
utilisé comme cible. Un des avantages de cette utilisation est que l'ARNr est
retrouvé en
abondance dans toutes les cellules des organismes vivants.
L'utilisation de l'ARNr 16S de Listeria dans le diagnostic des Iisterioses a
été décrite
(voir notamment Wang R.-F.et al., 1991 : Development of a 16S rRNA-based
oligomer probe
specific for Listeria monocytogënes ; Appl. Environ. Microbiol. 57:3666-3670,
les demandes
de brevet n° EP 314 294, n° WO 90/0884 et le brevet des Etats
Unis n° US 5 089 386).
On a maintenant découvert sur l'ADN codant pour l'ARN ribosomique de la sous-
unité
23S des zones variables selon les genres bactériens, mais qui apparaissent
conservées parmi les
espèces appartenant au genre des Listeria, ce qui permet de discriminer au
moins un groupe
d'espèces du genre Listeria d'autres genres ou groupes de genres bactériens.
Par ailleurs, il
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existe dans lesdites zones conservées parmi les espèces du genre Listeria, des
variations
mineures de séquence entre lesdites espèces. Ces dü~érents résultats ont
permis de concevoir
des sondes nucléiques spécifiques d'espèces ou de groupes d'espèces de
Listeria.
Avant d'exposer pius en détail l'invention, différents termes utilisés dans la
description
et les revendications sont définis ci-après
- par "acide nucléique extrait de bactéries" on entend soit l'acide nucléique
total,
soit l'ARN ribosomique, en particulier l'ARNr 23 S, soit l'ADN génomique, soit
encore l'ADN
obtenu à partir de la transcription inverse de l'ARN ribosomique 23 S ;
- un "fragment nucléotidique" ou un "oligonucléotide" sont deux termes
synonymes désignant un enchaînement de motifs nucléotidiques caractérisé par
la séquence
informationnelle des acides nucléiques naturels (ou éventuellement modifiés)
et susceptibles de
s'hybrider, comme les acides nucléiques naturels, avec un fragment
nucléotidique
complémentaire ou sensiblement complémentaire, dans des conditions
prédéterminées.
L'enchaînement peut contenir des motifs nucléotidiques de structure différente
de celle des
acides nucléiques naturels. Un fragment nucléotidique (ou oligonucléotide)
peut contenir par
exemple jusqu'à 100 motifs nucléotidiques. II contient généralement au moins
10, et en
particulier au moins 12 motifs nucléotidiques et peut être obtenu à partir
d'une molécule
d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique etlou par
synthèse chimique,
- un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide
naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un
groupement
phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose,
dans l'ARN le sucre
est le ribose ; selon qu'il s'agit d'ADN ou d'ARN, la base azotée est choisie
parmi l'adénine, la
guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un
nucléotide modifié dans
l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la
modification peut intervenir
soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la
méthyl-5-
désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-
2,6-purine, la
bromo-S-désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit
au niveau du
sucre, pas exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide
(P.E.
Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 ( 1991 )), soit encore au niveau du
groupement
phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi
les
diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates,
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- par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de motifs de
type nucléotidique, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de
référence constituent une
information analogue à celle donnée par la séquence des acides nucléiques
naturels,
- par "hybridation", on entend le processus au cours duquel, dans des
conditions
appropriées, deux fragments nucléotidiques ayant des séquences suffisamment
complémentaires sont susceptibles de s'associer par des liaisons hydrogène
stables et
spécifiques, pour former un double brin. Les conditions d'hybridation sont
déterminées par la
"stringence", c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires.
L'hybridation est d'autant plus
spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est
fonction notamment de
la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de
mésappariement
entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des
paramètres de la
réaction d'hybridation, tels que la concentration et le type d'espèces
ioniques présentes dans la
solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants
et/ou la température
d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction
d'hybridation doit être
réalisée dépend notamment des sondes utilisées. Toutes ces données sont bien
connues et les
conditions appropriées peuvent éventuellement être déterminées dans chaque cas
par des
expériences de routine. En général, selon la longueur des sondes utilisées, la
température pour
la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65°C, en
particulier entre 35 et 65°C
dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1M.
- une "sonde" est un fragment nucléotidique comprenant par exemple de 10 à
100 motifs nucléotidiques, notamment de 12 à 35 motifs nucléotidiques,
possédant une
spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un
complexe
d'hybridation avec un acide nucléique cible ayant, dans le cas présent, une
séquence
nucléotidique comprise soit dans un ARN ribosomique, soit dans un ADN obtenu
par
transcription inverse dudit ARN ribosomique, soit encore dans un ADN (appelé
ici ADN
ribosomique ou ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de
transcription; une sonde
peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de
détection) ou à
des fins de thérapie,
- une "sonde de capture" est immobilisée ou immobilisable sur un support
solide
par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par
synthèse directe
sur un support solide (voir notamment la demande de brevet WO 92 10092)
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- une "sonde de détection" peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi
par exemple parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des
enzymes
susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent
(notamment une
peroxydase ou une phosphatase alcaline), des composés chimiques chromophores,
des
composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases
nucléotidiques,
et des ligands tels que la biotine,
- une "amorce" est une sonde comprenant par exemple de 10 à 100 motifs
nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions
déterminées pour
l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique
d'amplification
telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé de séquençage,
dans une
méthode de transcription inverse, etc.,
Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées, à des fins de diagnostic,
dans la
recherche de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique cible dans un
échantillon, selon
toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de
dépôt ponctuel sur
filtre, dites "dot-blot" (MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor, 1982), les
techniques de transfert d'ADN dites "Southern blot" (SOUTHERN. E.M., J. Mol.
Biol., 98,
503 (1975), les techniques de transfert d'ARN dites "Northern blot", ou les
techniques dites
"sandwich" (DUNN A.R., HASSEL J.A., Cell, 12, 23 (1977)) ; on utilise en
particulier la
technique sandwich, avec une sonde de capture et/ou une sonde de détection,
lesdites sondes
étant capables de s'hybrider avec deux régions différentes de l'acide
nucléique cible, et l'une au
moins desdites sondes (généralement la sonde de détection) étant capable de
s'hybrider avec
une région de la cible qui est spécifique de l'espèce ou du groupe d'espèces
recherché, étant
entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent avoir des
séquences
nucléotidiques au moins partiellement différentes.
Dans des conditions qui sont précisées dans l'exemple 1 ci-après, on a
déterminé la
séquence nucléotidique de l'ADNr correspondant à l'ARN ribosomique 23 S de
deux espèces de
Listeria, ainsi que d'une espèce du genre phylogénique immédiatement voisin de
celui des
Listeria, à savoir le genre Brochothrix. Cette étude a porté sur les espèces
L. monocytogenes,
L. innocua et Brochothrix thermoaphacta.
On a recherché des régions fortement conservées pour le seul genre Listeria,
permettant
de le distinguer des autres genres bactériens, ainsi que des régions variables
au sein du genre
Listeria, et qui permettent donc de distinguer plusieurs espèces ou groupes
d'espèces de
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Listeria. On a ainsi sélectionné, en faisant référence à la numérotation de la
séquence
nucléotidique de l'ARNr 23S de Listeria morroévtogenes ATCC 19115, trois
régions
intéressantes, à savoir 664-728, 1188-1251 et 2209-2275. On a déterminé les
séquences de ces
mêmes régions pour différentes souches des autres espèces de Listeria ainsi
que pour l'espèce
Brochothrix campestris. Les résultats de ces différents séquençages sont
résumés dans le
tableau de séquences présenté en Annexe. Dans les séquences de ce tableau, le
signe
représente un site vacant dont la représentation est nécessaire pour
l'alignement des séquences
en tenant compte de certaines espèces possédant à ce site un motif
nucléotidique
supplémentaire.
Les résultats de ces recherches, c'est-à-dire les alignements de séquences
figurant dans le
tableau en Annexe, ont permis de concevoir des sondes permettant de détecter
des groupes
d'espèces ou d'identifier certaines espèces du genre Listeria. En choisissant
des sondes dans les
régions conservées chez toutes les espèces de Listeria, on peut détecter la
présence ou
l'absence d'au moins une bactérie quelconque du genre Listeria. En utilisant
des sondes
contenant des zones mutées pour une espèce particulière (par rapport à
l'espèce de référence,
ici L. nrorrocytogenes), il est possible de détecter directement la présence
d'une telle espèce.
Dans les techniques d'hybridation sandwich, utilisant deux sondes en
combinaison (sonde de
capture et sonde de détection), on utilisera par exemple en combinaison une
sonde spécifique
du genre Listeria et une sonde spécifique de l'espèce considérée. On peut
aussi utiliser en
combinaison deux sondes spécifiques de ladite espèce, lorsqu'elles existent,
ces deux sondes
étant complémentaires de régions non chevauchantes de l'ARNr 23 S de ladite
espèce.
Dans d'autres cas (notamment pour Listeria morrocytogenes), il n'existe pas de
sonde
unique permettant de caractériser directement une espèce donnée. Il est alors
possible d'utiliser
en combinaison deux sondes, (notamment selon la technique d'hybridation
sandwich), à savoir,
par exemple : d'une part, une première sonde permettant l'hybridation avec
l'ARNr (ou l'ADNr)
de Listeria nrorrocytogenes et d'une seconde espèce de Listeria, et d'autre
part, une deuxième
sonde capable de s'hybrider avec l'ARNr ou l'ADNr de Listeria morrocytogenes
et d'une ou
plusieurs autres espèces de Listeria mais pas de ladite seconde espèce. Si on
observe une
hybridation de l'acide nucléique de l'échantillon avec un tel système de deux
sondes, on peut
conclure à la présence de Listeria morrocytogerres.
Comme on l'a indiqué précédemment, les sondes nucléotidiques de l'invention
peuvent
être utilisées dans les méthodes classiques d'hybridation. L'acide nucléique à
détecter (cible)
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peut être de l'ADN (éventuellement obtenu après amplification) ou de l'ARN.
Dans le cas d'une
cible nucléique double brin, il convient de procéder à sa dénaturation avant
la mise en oeuvre
du procédé de détection. L'acide nucléique cible peut être obtenu par
extraction selon les
méthodes connues des acides nucléiques d'un échantillon à examiner. La
dénaturation d'un
acide nucléique double brin peut être effectuée par les méthodes connues de
dénaturation
chimique, physique ou enzymatique, et en particulier par chaui~age à une
température
appropriée, supérieure à 80°C.
Dans certains cas, la mise en évidence de la présence d'une espèce de Listeria
donnée
nécessite (utilisation de sondes permettant la détection d'une mutation
ponctuelle. Pour cela, il
convient d'opérer avec des sondes d'une longueur (nombre de motifs
nucléotidique)
prédéterminée, dans des conditions elles-mêmes prédéterminées. D'autres
précisions sont
données ci-après, en faisant référence plus particulièrement à la méthode
d'hybridation
sandwich qui constitue l'une des méthodes d'hybridation les plus pratiques
actuellement. Cette
méthode comprend la mise en contact d'une première sonde fixée sur un support
solide avec
une solution contenant l'acide nucléique à analyser, et la mise en contact
dudit support avec la
sonde de détection, l'incubation du mélange obtenu, le rinçage du support,
pour éliminer les
constituants non fixés sur le support par hybridation spécifique, et la
détection qualitative ou
quantitative, à l'aide d'une réaction de révélation du marqueur fixé sur le
support, de la sonde
de détection fixée. La révélation de la présence du marqueur peut être
ef~èctuée par exemple
par colorimétrie, fluorescence ou luminescence. La mise en contact de la sonde
de capture avec
l'échantillon et avec la sonde de détection peut être ei~'ectuée de façon
séquentielle,
éventuellement avec rinçage intermédiaire du support. On peut également opérer
par mise en
contact simultanée ou quasi-simultanée de la sonde de capture fixée sur le
support avec une
solution contenant l'échantillon et la sonde de détection qui peuvent être
ajoutées sous forme
de mélange ou séparément.
Les stades d'incubation et de lavage consécutif, qui constituent les étapes-
clés du
procédé d'hybridation sandwich, sont chacune effectuée à une température
constante qui peut
être par exemple comprise dans la gamme mentionnée plus haut (voir les
"Définitions"). On
sait que les hybrides d'acides nucléiques ont une température de dissociation
qui dépend du
nombre de bases hybridées (la température augmentant avec la taille de
l'hybride) et qui dépend
également de la nature des bases hybridées et, pour chaque base hybridée, de
la nature des
bases adjacentes. La dissociation des hybrides se produit sur un intervalle de
température de
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ô
quelques degrés et peut être facilement déterminée, par exemple en
spectroscopie U. V.. Il est
possible de déterminer expérimentalement la température de demi-dissociation
de l'hybride
formé par une sonde donnée avec la cible de séquence complémentaire, par de
simples
expériences de routine. La température d'hybridation utilisée dans la
technique d'hybridation
sandwich doit évidemment être choisie en-dessous de la température de demi-
dissociation. Plus
exactement, on opère à une température inférieure à la température de demi-
dissociation de
l'hybride le moins stable parmi les deux hybrides que forme la cible avec
d'une part la sonde de
capture et d'autre part la sonde de détection, afin que les deux hybrides
soient stables à la
température à laquelle on opère. Une mutation ponctuelle, c'est-à-dire une
mutation entraînant
un mésappariement portant sur une seule paire de bases dans l'h~bride,
entraîne une
modification, généralement un abaissement, de la température de démi-
dissociation. En
utilisant des sondes suffisamment courtes, un tel mésappariement unique peut
entraîner un
abaissement relativement important de la température de demi-dissociation, de
l'ordre de
quelques degrés. Ainsi, en choisissant, à l'aide d'expériences de routine
préalables, une sonde
de longueur appropriée, en opérant dans une solution tampon donnée, il est
possible de
déterminer une température à laquelle il sera possible de n'observer
l'hybridation que dans le
cas où la sonde est strictement complémentaire de la cible. En outre, grâce au
choix de sondes
courtes de longueur prédéterminée, il est possible de mettre en oeuvre la
technique
d'hybridation sandwich à une température unique prédéterminée, par exemple
37°C. Pour une
2 0 discussion plus détaillée de la technique d'hybridation sandwich avec
utilisation de sondes
courtes, on peut se reporter notamment à la demande de brevet FR-2.663.040.
L'invention a donc pour objet un oligonucléotique monocaténaire, caractérisé
par le fait
qu'il est choisi parmi les oligonucléotides, ayant au moins 12 motifs
nucléotidiques, dont la
séquence est incluse dans l'une des séquences (a,) à (aio) de la liste
suivante
(al) GGAGCCGTAG CGAAAGCGAG TCTGAATAGG GCGCATAAGT AACAGGTCGT
AGACCCGAAA CCAGG
(a2) GGAGCCGTAG CGAAAGCGAG TCTGAATAGG GCGAATAAGT AACAGGTCGT
AGACCCGAAA CCAGG
(a3) GGAGCCGTAG CGAAAGCGAG TCTGAATAGG GCG'rATGAAG TAACAGGTCG
TAGACCCGAA ACCAGG
30 (a4) CCGAAACTGT GGATGAACCT CTTTAGAGGT TCGTGGTAGG
(a5)CCGAAACTGT GGATGAACCT CTTCGGAGGT TCGTGGTAGG
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(a6) CCGAAACTGT GGATGA~'1CCT CTTATAGAGG TTCGTGGTAG G
(agi) CCGAAACTGT GGATGAACAT CTTCGGATGT TCGTGGTAGG
(aR) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCCGCC ACGCTTAGCG CGTGGGGAGA
CAGTGTCAGG TGGGCAG
(a9) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCCACC ACGCTTAGCG CGTGGGGAGA
CAGTGTCAGG TGGGCAG
(a,o) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCCGCC ACGCTAAGCG CGTGGGGAGA
CAGTGTCAGG TGGGCAG ;
ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit oligonucléotide ;
à (exception de foligonucléotide GTGGCGGGT TAGAATGGTC et de son
complémentaire,
et à l'exception de foligonucléotide TCCACAGTTT CGGTAATATG et de son complémen-
tair e.
Parmi les olieonucléotides de l'invention dont la séquence est incluse dans la
séquence
(a4), on citera en particulier ceux dont la séquence est incluse dans la
séquence (a',~)
(a'~) CCGAAACTGT GGATGAACCT CTTTAGAGGT TCGTGGTAGG
Parmi les oligonucléotides de l'invention, certains peuvent être utilisés pour
caractériser
une espèce ou un groupe d'espèces du genre Listeria. Ce sont notamment les
oligonucléotides
définis à l'aide des séquences (b,) à (bts) et (cl) à (c14) ci-après.
L'invention concerne en particulier un oligonucléotide tel que défini ci-
dessus,
2 0 caractérisé par le fait qu'il comporte une séquence d'au moins cinq motifs
nucléotidiques
consécutifs incluse dans une séquence comprise à l'intérieur des crochets
figurant dans les
séquences (6l) à (b15) de la liste suivante
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(b1)AGTCTGAATA GG[GCGCATA]A GTAACAGGTC GTAGA
(b2)AGTCTGAATA GG[GCGAATA]A GTAACAGGTC GTAGA f
(b;)AGTCTGAATA GG[GCGTATGA AG]TAACAGGT CGTAGA
(ba)CCGAAACTGT GGATGAACCT [CTTTAGAG]GT TCGTGGTAGG
5 (b5)CCGAAACTGT GGATGAACCT [CTTCGGAG]GT TCGTGGTAGG
(b6)CCGAAACTGT GGATGAACCT [CTTATAG]AGG TTCGTGGTAG G
(b7)CCGAAACTGT GGATGAACAT CTT[CGGATGT T]CGTGGTAGG
(b8)A[AACGTAT]TA GGATGAA
CCGAAACTGT
(b9)CCGAAACTGT GGATG[AACAT CT]TCGGATGT TCGTGGTAGG
10 (blp)TGGCTGTATG ACCATTCTAA [CCCGCCA] CGC T
(b11)CCAC [GCTTAGC] GCGTGGGGA GACAGTGTCA GG
(bit)TGGCTGTATG ACCATTCTAA [CCCACCA]CGC TTAGCGCGTG
GGGAGACAGT GTCAGG
(b13)TGGCTGTATG ACCATTCTAA CCCGCCAC[GC TAAGC]GCGTG
GGGAGACAGT GTCAGG
(bia)[CCGCCA]CGC T TAGCGCGTGG GGAGACAGTG TCAGGTGGGC AG
(b15)TGGCTGTATG ACCATTCTAA CCCGCCACjGC TTAG] ;
ainsiqu'un oligonuclotide
complmentaire
dudit oligonuclotide.
L'invention dfini prcdemment,
concerne
notamment
un oligonuclotide
tel que
caractris
par
le
fait
que
sa
squence
est
incluse
dans
l'une
des
squences
(cl)
(cia)
suivantes
(cl)GAATAGGGCG CATAAGTAAC A
(c2)GAATAGGGCG AATAAGTAAC A
-
(c3)ATAGGGCGTA TGAAGTAACA
(ca)TGAACCTCTT TAGAGGTTCG TG
(c5)TGAACCTCTT CGGAGGTTCG TG
(c6)TGAACCTCTT ATAGAGGTTC G
(C7)GTGGATGAAC ATCTTCGGAT GTTCGTG.GTA
AAACGTATTA CCGAA
(cg)ATTCTAACCC GCCACGCT
(clp) ACCACGCTTA G
ATTCTAACCC
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(c11) CCACGCTTAG CGCGTGG G
(c12) CCGCCACGCT AAGCGCGTGG G
(c13) CCGCCACGCT TAGCGCGTGG G
(C14) TTCTAACCCG CCACGCTTAG ;
ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit nucléotide.
Parmi les oligonucléotides de l'invention, certains sont utilisables comme
sonde
permettant de détecter toute bactérie du genre Listeria. Ce sont notamment les
oligonucléotides définis à l'aide des séquences (dl) à (d6) ci-après.
L'invention a donc également pour objet un oligonucléotide tel que défini
précédemment,
caractérisé par le fait que sa séquence est incluse dans l'une des séquences
(dl) à (d6)
suivantes
(d1) AAGTAACAGG TCGTAGAC
(d2) TATTACCGAA ACTGTGGATG AAC
(d3) ACCCTGGCTG TATGACCATT CTAACCC
1 S (d4) AGCGCGTGGG GAGACAGT
(d5) CAGTGTCAGG TGGGCAG
(d6) GTTCGTGGTA GGAGAGCGTT .
Pour l'utilisation dans les techniques d'hybridation classiques, les
oligonucléotides
de l'invention peuvent être immobilisés sur un support solide (c'est notamment
le cas d'une
sonde de capture) ou marqués avec un agent traceur (sonde de détection).
L'invention a également pour objet un procédé de détermination de la présence
ou
de l'absence d'au moins une bactérie du genre Listeria, dans un échantillon
contenant ou
susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie,
selon une méthode
dans laquelle on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde
nucléique, puis on
détermine de façon connue en soi la formation ou l'absence de formation d'un
complexe
d'hybridation entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon,
caractérisé par le fait que
ladite sonde est un oligonucléotide choisi parmi ceux qui ont été définis
précédemment.
Pour la détermination de la présence ou de l'absence d'une espèce ou d'un
groupe
d'espèces de bactérie du genre Listeria, on peut utiliser comme sondes
nucléiques d'une part
une première sonde telle que définie précédemment et d'autre part une sonde
telle que définie
par l'une des séquences (b1) à (b15) ou (cl) à (c14), étant entendu que
lesdites première et
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seconde sondes sont capables de s'hybrider avec des régions non chevauchantes
de l'ARNr 23 S
(ou son complémentaire) d'une bactérie du genre Listeria. La première sonde
est par exemple
immobilisée sur un support solide et la seconde sonde est marquée avec un
agent traceur. Pour
déterminer la présence ou l'absence d'au moins une bactérie (quelconque) du
genre Listeria, on
peut utiliser comme sonde au moins un oligonucléotide tel que défini par les
séquences (dl) à
(d6).
On peut détecter la présence de certaines bactéries du genre Listeria,
éventuellement
avec une seule sonde, par exemple
- Listeria seeligeri : sonde incluse dans la séquence (b2), (b12), (c2) ou
(clo) ;
- Listeria irrnocua : sonde incluse dans Ia séquence (blé) ou (c12> ;
- Listeria ivar~ooü : sonde incluse dans la séquence (b6) ou (c6) ;
- Listeria grayi et/ou Listeria nmrrayi (ces deux espèces ne pouvant pas être
distinguées à l'aide des sondes de l'invention) : sonde incluse dans la
séquence (b~), (b7), (b8),
(b9)~ (cs)~ (c7) ou (ca).
Lorsqu'on souhaite utiliser une sonde qui dérive de l'Annexe 1/3, en vue de la
détermination d'une espèce particulière, il convient de vérifier préalablement
à l'aide des sondes
(b6) ou (c6) si Listeria ioanovü est présente. Dans l'affirmative, on ne peut
pas utiliser une
sonde dérivée de l'Annexe 1/3 pour la détermination envisagée (car la séquence
correspondant
à l'Annexe 1/3 n'a pas été déterminée pour L. ivanovü).
Lorsqu'on utilise un système à deux sondes, on peut utiliser, pour déterminer
les
bactéries qui viennent d'être mentionnées, d'une part une sonde spécifique du
genre Listeria
(incluse dans l'une des séquences (dl) à (d6)) en combinaison avec les
séquences spécifiques qui
viennent d'être indiquées. Lorsqu'il existe plusieurs sondes spécifiques de
l'espèce recherchée,
on peut bien entendu utiliser la combinaison de deux telles sondes spécifiques
de cette espèce.
Pour la détermination de la présence ou de l'absence de Listeria
moraocytogertes, on
utilise un système à deux sondes, en particulier dans un procédé caractérisé
par le fait
- que l'une des sondes a une séquence incluse dans la séquence (b1), (blo),
(bi,~) ou (bls)
et l'autre sonde une séquence incluse dans la séquence (b4),
- ou que l'une des sondes a une séquence incluse dans la séquence (cl), (c9),
(c13) ou
(c14) et l'autre incluse dans la séquence (c4).
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Les divers oligonucléotides qui ont été définis précédemment peuvent également
être
utilisés comme amorces nucléotidiques pour la synthèse d'un acide nucléique en
présence d'une
polymérase de façon connue en soi, et notamment dans des méthodes
d'amplification utilisant
une telle synthèse en présence d'une polymérase (PCR, RT-PCR, etc...).
On peut utiliser notamment les oligonucléotides de l'invention comme amorces
pour la
transcription inverse spécifique d'une séquence d'ARN ribosomique 23S d'au
moins une espèce
ou d'au moins un groupe d'espèces du genre Listeria pour obtenir une séquence
d'ADN
complémentaire correspondante. Une telle transcription inverse peut constituer
le premier
stade d'une RT-PCR, le stade suivant étant l'amplification par PCR de l'ADN
complémentaire
obtenu. On peut également utiliser ces oligonucléotides comme amorces,
notamment pour
l'amplification spécifique par réaction de polymérisation en chaîne de la
séquence d'ADNr
complémentaire d'une séquence d'ARN ribosomique 23 S d'au moins une espèce ou
d'au moins
un groupe d'espèces du genre Lisleria. Les oligonucléotides définis
précédemment peuvent
être également utilisés comme sondes de thérapie pour traiter les infections
provoquées par au
moins une espèce ou un groupe d'espèces de bactéries du genre Listeria. Ces
sondes de
thérapie, capables de s'hybrider sur l'ARN ribosomique 23 S et/ou sur l'ADN
génomique
desdites bactéries peuvent bloquer les phénomènes de traduction et/ou de
transcription et/ou
de réplication. Le principe des méthodes de thérapie génique est connu et
repose notamment
sur l'utilisation d'une sonde correspondant à un brin anti-sens : la formation
d'un hybride entre
la sonde et le brin sens est capable de perturber au moins l'une des étapes du
décryptage de
l'information génétique. La formation d'un duplex entre un oligonucléotide
selon l'invention et
l'ARN ribosomique 23 S des bactéries-cibles est également susceptible de
perturber la
configuration spatiale dudit ARNr et/ou l'association dudit ARNr avec les
protéines
constitutives du ribosome. Les sondes de thérapie sont donc utilisables comme
médicaments
antibactériens, permettant de lutter contre les infections causées par des
Listeria, y compris
Listeria monocytogeoes.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
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EXEMPLE 1 : Détermination de Ia séquence nucléotidique des ARN ribosomique 23S
de Listeria
La séquence nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN ribosomique de la
sous-
unité 23 S pour les espèces suivantes a été déterminée
L. mouocytogenes ATCC 19115
L. innocua ATCC 33090
L. seeligeri CCUG 15330
Brochothrix thermosphacta ATCC 11509
Le séquençage a été réalisé selon les étapes suivantes : extraction de l'ADN
des
souches par la méthode de Sj~bring et al. (1990. Polymerase drain reaction for
detection of
Mycobacterium tuberculoses. J. Clin. Microbiol. 28 (10):2200-2204),
amplification par PCR de
l'ADN ribosomique 23S à l'aide d'amorces eubactériennes définies dans les
zones
phylogéniquement conservées de ce type d'ARN. Les couples de sondes
eubactériennes
utilisés, correspondant à des séquences communes à toutes les bactéries,
étaient les suivants
a) 5 ' TCCGAATGGG GAAACCC 3 ' positions 115-130
5' GATCTGGGCT GTTTC 3' positions 988-1002
b) 5 ' AAGAGGGAAA CARCCCAGA 3 ' positions 982-1000
5' GGAACTTACC CGACAAGG 3 ' positions 1963-1982
c) 5' GAAATTCCTT GTCGGGT 3' positions 1957-1975
5' CTAGGTCTGA CCTATCAAT 3' positions 2864-2882
On rappelle que R signifie : G ou A.
Cette étape a permis l'amplification de 3 zones d'environ lkb permettant de
couvrir
l' ensemble de la cible 23 S et qui ont été séquencées sur chacun des 2 brins
par la méthode de
terminaison de chaine sur un séquenceur Applied Biosystems ABI 360 (Sanger et
al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 5463-5467).
On a ensuite sélectionné trois régions correspondant aux séquences
nucléotidiques
664-728, 1188-1251 et 2209-2275 (référence à L. monocytogenes ATCC 19115 ;
voir i
Annexes 1/3 à 3/3).
L'ARN 23 S de ces régions a été séquencé pour diverses espèces et souches de 4
Listeria et de Brochothrix. Les résultats sont rassemblés dans le tableau de
séquences figurant
en Annexe.
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EXEMPLE 2 : Utilisation de sondes dirigées contre l'ARN ribosomique 23S du
genre
Listeria pour l'identification spécifique de Listeria monoCytogenes
On a préparé la sonde suivante (complémentaire d'une séquence de la page 2/3
de
5 l'Annexe)
ACGAACCTCT AAAGAG
Cette sonde a été utilisée comme sonde de détection dans un test d'hybridation
sandwich.
Une autre sonde (complémentaire d'une séquence de la paie 3/3 de l'Annexe) a
été
10 préparée
TAAGCGTGGC GGGTTAGAAT,
et a été utilisée comme sonde de capture dans ce test.
L'ARNr 23 S d'une collection de souches de Listeria et d'autres espèces
bactériennes (voir ci-dessous) a été testée par hybridation à l'aide de ces
deux sondes
15 - 23 souches de L. nrorrocytogenes , de sérovars et de provenances variées
-17 souches de L. irrrrocTia
- 8 souches de L. seeligeri
- 9 souches de L. ~~elshimeri
16 souches de L. ivano>>ü
- 3 souches de L. grayi
- 4 souches de L. mz~rrayi
- 2 souches de Brochothrix thermosphacta
- 1 souche de Brochothrix campestri.s
- 1 souche de Bacilhrs snbtilis
- 1 souche de Bacilles cererrs
- 1 souche de Bacillr~s megaterirrnr
- 3 souches de Erysepelothrix rhrrsiopalhiae
- 1 souche de Lactobacillus acidophiles
- 2 souches de Slreptococcus groupe A
- 1 souche de .Streptococcus groupe B
- 1 souche de Streptococcus groupe C
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- 1 souche de Streptococcus jaecalis
- 1 souche de Streptococcus suis
- 1 souche de Escherichia coli
S L'hybridation des ARN ribosomiques d'une bactérie-cible a été conduite selon
le
procédé de détection semi-automatisé décrit dans le brevet français n°
2.663.040. La sonde de
détection est conjuguée à la phosphatase alcaline.
L'ARN ribosomique des souches a été extrait selon le protocole de base pour
l'extraction de l'ARN des bactéries Gram + décrit dans "Current Protocole in
Molecular
Biology" 1987, Ausubel FM et al., Wiley interscience, New York. Dans une
plaque de
microtitration (Nunc 439454) est déposée une solution de 1 ng/pl de
l'oligonucléotide de
capture, dont l'extrémité S' est couplée avec le réactif Aminolink 2 (marque
déposée, Applied
Biosystems, Foster city , Californie) dans du PBS 3X (0.45 M NaCI ; O.1S M
phosphate de
sodium ; pH 7.0). La plaque est incubée 2 h à 37° C puis lavée 3 fois
avec 300 u1 de PBST
(PBS 1x, Tween 20: O,S %o (Merck 822184)). Le réactif Aminolink 2 permet
d'ajouter à
l'extrémité S' de la sonde un bras comportant un groupement 6-aminohexyle.
L'utilisation d'une
sonde couplée à un ligand possédant un groupement polaire (amine primaire)
fixée de façon
passive sur le support, permet d'obtenir un signal amélioré {demande FR
2.679.255).
La cible (10 u1 d'ARN totaux) mélangée avec 40 p1 de tampon PBS saumon (PBS-
3X + ADN de sperme de saumon 10 ug/ml (Sigma D 91 S6) est déposée dans le
puits en
présence de SO p1 d'une solution du conjugué oligonucléotide-peroxydase,
constituant la sonde
de détection, à la concentration de 0.1 ng/pl en oligonucléotide dans un
tampon PBS-cheval
(PBS 3X + 10 % sérum de cheval (BioMérieux 55842)). La plaque est incubée 1 h
à 37° C
puis lavée par 3 fois avec 300 p1 de tampon PBST. Dans chaque puits, on ajoute
100 p1 de
2S substrat OPD (ortho-phénylènediamine Cambridge Medical Biotechnology
ref/4S6) à la
concentration de 4 mg/ml dans un tampon (O,OSS M acide citrique, 0,1 M
monohydrogénophosphate de sodium, pH 4,93), auquel on ajoute extemporanément
du
peroxyde d'hydrogène à 30% dilué au 111000. Après 20 min de réaction
l'activité enzymatique
est arrétée par I00 p1 d'acide sulfurique IN et la lecture est effectuée à 492
nm sur un appareil
Axia Microreader (ARIA) (bioMérieux).
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Les résultats des tests effectués ont montré que la combinaison de sondés
utilisée
est spécifique de L. monocytogef~es.
L'adaptation de la combinaison spécifique de sondes testées sur l'automate
VIDAS
(BIO MERIEUX-VITEK) a été effectuée. La paroi du puits de microplaque est ici
remplacée
par le SPR ("Solid Phase Receptacle") (BIOMERIEUX~-VITEK-USA) qui est un
support
conique réalisé à partir d'un matériau appelé K résine (marque déposée pour un
copolymère
butadiène-styrène). Les divers réactifs sont déposés dans une barrette à
plusieurs cuvettes et
les différentes étapes se déroulent dans le SPR qui est capable d'aspirer et
de refouler les
réactifs. La réaction d'hybridation sandwich décrite dans le protocole ci-
dessous se produit sur
la paroi interne du cône.
Dans un premier temps, l'oligonucléotide de capture cômportant à son extrémité
5'
le ligand Aminolink 2 (Applied Biosystems-réf.400808) est fixé passivement sur
la surface
interne du SPR, à une concentration de 1 ng/ul dans un volume de 315 u1 d'une
solution de
PBS 4x (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCI 600 mM). Après une nuit à
température
ambiante ou deux heures à 37°C, les cônes sont lavés 2 fois par une
solution PBS Tween, puis
séchés sous vide
La barrette associée à l'automate VIDAS contient dans des cuvettes les
réactifs
nécessaires à la détection, c'est à dire:
- dans le premier puits de la barrette, 10 p1 de l'ARN extrait dans le même
tampon
que pour le protocole microplaque ci-dessus
- dans un second puits, 200 g1 d'une solution à 0,1 ng/gl du conjugué de
détection
oligonucléotide-phosphatase alcaline,
- dans un troisième et un quatrième puits, 600 u1 de solution de lavage PBS
Tween
- et enfin une cuvette avec 250 p1 de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl
phosphate) en solution dans un tampon diéthanolamine.
Les contenus du premier et du second puits sont aspirés dans le cône prétraité
comme indiqué précédemment. Après incubation 30 minutes, le cône est lavé 2
fois par une
solution de PBS Tween et 250 p1 de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl
phosphate) sont
aspirés puis relachés dans une cuvette de lecture. L'appareil mesure le signal
fluorescent
exprimé en URF (unités relatives de fluorescence) de la cuvette.
Les résultats obtenus avec ce système sont identiques à ceux obtenus en plaque
de
microtitrat~on.
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EXEMPLE 3
De façon analogue, on peut détecter la présence de L. irmoczia à l'aide de la
combinaison des deux sondes suivantes pour la capture et la détection,
respectivement : '-
lère sonde : GGGTTAGAAT GGTCATACAG CCAGGGT
2ème sonde : CCACGCGCTT AGCGTGG
EXEMPLE 4
De façon analogue, on peut détecter la présence de L. ivanovü à l'aide de la
combinaison des deùx sondes suivantes pour la capture et la détection,
respectivement
lère sonde : TTCATCCACA GTTTCGGTAA TATGT
2ème sonde : CGAACCTCTA TAAGAGGTTC A
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Annexe 1/3
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Annexe 3/3
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