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Vecteur viral recombinant inductible par le glucose
La présente invention con~rne des vecteurs recombin~nt~ d'origine virale, la
~ epa.~Lion de ces vecte3lr~, les compositions pharm~cel1titlues les contPn~nt et leur
5 utilisation thérapeutique, not~mmPnt en thérapie génique et plus particulièrement
pour le traitement et/ou la ~ vellLion de pathologies liées à une hyperglycémie.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une ~n~)m~lie
(mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique
dans la cellule ou l'organe affecté. ClassiquPm~nt, cette information génétique peut
10 être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée
étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu
~ )p~ ié. Différentes techniques ont été décrites pour l'introduction de cette
information génétique, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection
impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1
(1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989)375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de
liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc.
Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes
est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de
transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter
certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS.
etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adénovirus.
La présente invention se rapporte plus particulièrement à la mise au point de
nouveaux vecteurs viraux présentant notamment un intérêt particulier pour le
~ 25 traitement des pathologies liées aux hyperglycémies comme le diabète.
Le diabète sucré est un syndrome habituellPmPnt chronique, dont le symptôme
le plus caractéristique est une hypetglycé~l,ie provoquant, en l'absence d'élévation du
seuil rénal pour le glucose, une glycosurie. Sa cause principale est une carence,
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absolue ou relative, en insuline entrâînant des anomalies non seulement du
métabolisme des hydrates de carbone mais aussi de ceux des protéines et des graisses.
Le diabète est génér~lemPnt traité par ~rlmini~tration d'in~llin~, traitement qui
s'avère très contraignant pour le patient.
La présente invention a précisément pour objet de proposer un vecteur viral
original permettant de suppléer à cette désorg~ni~tion du métabolisme du glucosedans un organisme via la restauration de manière contrôlée d'une concentration
convenable in vivo en insuline.
On sait que le glucose est un facteur de régulation de la transcription de gènesdans la majorité des être vivants. Il a notamment été démontré que le glucose est
capable de stimuler la transcription de gènes codant pour des enzymes glycolytiques
et lipogéniques dans les hépatocytes et adipocytes comme par exemple le gène de la
pyruvate kinase de type L, une enzyme glycolytique tissus spécifique qui joue un rôle
déterminant dans la régulation de la glycolyse et la gluconéogénèse dans le foie.
L'expression de la protéine L-PK, au niveau du foie, est sous contrôle alimentaire et
hormonal. Elle est induite par un régime riche en glucose et au contraire inhibée par
privation et chez les diabétiques. Il a ainsi été démontré que l'expression de son gène
est régulée positivement par le couple glucose/insuline et négativement par le
glucagon via son second messager L'AMP cyclique (A. Kahn; J. Bio. Chem. 264,
(1989), 11584-11590).
Récemment, la c~em~3nfl.?resse a caractérisé différents sites de liaisons
(éléments L1 à LA) pour des facteurs de transcription et en particulier un élément de
réponse au glucose/insuline, ou encore "GIRE", dans la région amont du promoteurdu gène de cette enzyme L-PK (A. Kahn et al.; J. Mol. Biol. 209, (1989), 205-219). Il
25 a ainsi été identifié dans le sens 3' à 5' à partir de la boîte TATA, respectivement
l'élément L1, un site de liaison pour le facteur nllcle~ire 1 des hépatocytes (HNF1),
l'~lément L2, un site de liaison pour le facteur nucléaire 1 (NF1), l'élément L3, un site
de liaison pour le facteur nucléaire 4 des hépatocytes (HNF 4) et l'élément IA, un site
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de liaison pour le facteur transcrpitionnel major late (MLFT)/USF (voir figure 1).
L'élément spécifique de réponse au glucose/insuline, a préci~émt~nt été localisé dans
le gène codant pour la L-PK, sous la forme d'un palindrome parfait entre les
nucléotides -168 à -144 à partir du site cap, soit dans l'élément L4 (voir figure 2). Ce
5 GIRE s'est avéré capable de collfér~r une réponse transcriptionnel au glucose à un
promoteur minim~l de L-PK c-)n~titt-e de la boîte TATA et de l'élément L1.
De manière in~tten~ e, la ~em~n~l~resse a mis en évidence qu'il était possible
de valoriser l'aptitude de cet élément GIRE, à répondre au glucose, dans un contexte
viral pour moduler l'expression d'un protéine d'intérêt en thérapie génique.
Plus précisément, la présente invention se rapporte à un virus recombinant
défectif comprenant au moins un gène hétérologue sous contrôle d'un signal
d'expression inductible par le glucose ou un de ses analogues.
Par analogue du glucose, on entend couvrir tout composé prés~nt~nt des
homologies structurales avec le glucose et étant capable d'induire l'activation du
15 signal d'expression. A titre d'analogues susceptibles d'être utilisés selon la présente
invention on peut notamment citer le fructose, le galactose, le sucrose, le lactose et
tous les sucres pouvant être hydrolysés en ces substances.
Au sens de la présente invention, un signal d'expression inductible au glucose
couvre toute séquence signal d'expression dont l'activation, qui conditionne la
20 transcription subséquente du gène hétérologue associé, est ~ nti~llement induite en
présence de glucose ou un de ses analogues.
Plus particulièrement il s'agit d'un virus défectif recombinant dans lequel
l'expression d'au moins un gène hétérologue est placée sous contrôle d'un signald'expression dérivant en tout ou partie du promoteur du gène codant pour la pyruvate
25 kinase de type L, L-PK. Plus précisement, ce signal d'expression dérive en tout ou
partie du fragment constitué des 183pb situé en 5' de la phase codante du gène codant
pour L-PK.
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De pl~f~L~;:nce, le signal d'expression selon l'invention co~llp-elld tOtlt ou partie
de la séquence SEQ ID N~l.
Selon un mode de réalisation préféréJ ce signal d'expression comprend au
moins tout ou partie de l'élément L4 de ce promoteur.
L'élément L4 est de p-er~ ce représenté par tout ou partie de la séquence
SEQ ID N~2, d'une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une
séquence qui en dérive, et capable d'interagir avec le facteur MLTF/USF.
Au sens de la présente invention, on entend par dérivé, toute sé~uence
obtenue par une ou plusieurs modifications et conservant l'une au moins des
propriétés biologiques de la séquence d'origine et notamment sa capacité d'interagir
avec son ou ses facteur(s) de liaison spécifique(s), dans le cas présent constitué par le
facteur MLTF/USF. Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution,
délétion, addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Ces
modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du
métier.
Dans une variante de l'invention, l'élément L4 est répété sous la forme de 4
oligomères successifs dans le signal d'expression.
Selon un mode préféré de l'invention, le signal d'expression comprend outre
l'élément L4, tout ou partie de l'élément L3 du promoteur du gène codant pour la L-
PK.
Il a en effet été monté que cet élément L3 contribue à une meilleure efficacité
de l'élément L4. ( A. Kahn et al; Nucleic Acids Research 20, (1992)J N''8 pl871).
L'élément L3 est de preré.el-ce représenté en tout ou partie par la séquence SEQ ID
N~3, une séquence hybridant avec tout ou partie de celle-ci ou d'une séquence qui en
dérive, capable d'interagir avec le facteur HNF 4.
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Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le signal d'expression
comprend l'élément L4 du promoteur du gène codant pour la L-PK, fllsi~)nn~ en
amont de l'élément L3 de ce même promoteur. Il est alors f~igné par L4-L3. Plus
pieré.enLiellement, le signal d'expression selon l'invention co~ d 4 oligomères
st1cc~ if~ L4-L3.
Ce signal d'expression comprend en ouke un promoteur dit minim~l
Au sens de la présente invention, promoteur minim:~l désigne toute séquence
promotrice qui seule n'est pas capable d'assurer efficacement la transcription de la
séquence hétérologue qui lui est associée. L'activité d'un tel promoteur s'avèretotalement dépendante de l'activation de l'élément répondant au glucose. En fait, ce
promoteur minim~l a surtout pour fonction d'orienter la transcription. Dans cette
perspective, il est de préférence situé en amont de la séquence hétérologue de manière
à former avec elle une séquence nucléotidique c~-ntinue
Il est possible d'employer selon l'invention un promoteur minim~l dérivant
d'un promoteur conventionnel comme par exemple ceux activant la transcription degène de type thymidine kinase, acétyle transférase chloramphénicol, 13galactosidase
ou luciférase ou notamment dérivant du promoteur du gène codant pour la pyruvatekinase de type L. Ce promoteur minim~l peut également dériver du CMV hl1mz~in Lecas échéant, un tel promoteur peut être rendu minimal par le biais d'une ou plusieurs
mutations génétiques qui le rendent incapable d'assurer seul la transcription du gène
hétérologue.
Selon le même principe, le promoteur minim~l peut dériver du promoteur
naturellement responsable de l'expression du gène hétérologue considéré.
A titre de promoteur minim~l susceptible d'être utilisé selon l'invention on
peut plus particulièrement citer la séquence correspondant au fragment - 119 à 11
situé en 5' du gène codant pour la L-PK.
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De manière générale, ce promoteur minim~l est placé en amont de la séquence
nucléique dont il contrôle l'e~pie~ion, en substitution ou non de son promoteur
naturel. Le propre promoteur de la séquence nucléique peut en effet demeurer présent
- mais sous une forme inactivée ou rendue non fon( tionnelle par différentes techniques
5 connues de l'homme de l'art et nct~mm~nt par suppression, fleléti~n et/ou a~ n d'une ou plusieurs bases.
Plus pl~ré-elltiellement, le signal d'expression répond en tout ou partie à la
SEQ ID N~4 ou l'un de ses dérivés.
Par ailleurs, la région promotrice peut être modifiée par addition de séquences
10 d'activation ou de régulation (séquences enhancer notamment), permettant
d'augmenter la force du promoteur sans affecter son caractère in~luctihle. En
particulier, dans le but d'améliorer la force du promoteur, nous avons contruit un
vecteur hybride dans lequel le promoteur de 183 pb du gène PK-L est précédé d'unfragment de 402 pb situé dans le premier intron du gène de l'aldolase B de rat, du
nucléotide 1920 au nucléotide 2321 par rapport au site d'initiation de la transcription
(SEQ ID N~6 correspondant aux nucléotides 1915 à 2379). Les résultats présentés
dans les exemples montrent que cette construction augmente l'expression d'un gène
d'un facteur 5, en réponse au glucose.
En ce qui concerne la séquence d'acides nucléiques hétérologue placée sous
20 contrôle du signal d'expression selon l'invention, elle comporte un ou plusieurs gènes
thérapeutiques dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un
organisme est recherché.
Les gènes thérapeutiques qui peuve.lL ainsi être transférés sont tout gène dont
la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des
25 produits ayant un effet thérapeutique.
Il peut s'agir en particulier de gènes codant pour des produits protéiques ayantun effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un
peptide, un acide aminé, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la
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cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible
lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'uneprotéine permet par exemple de pallier une expression in~-ffie~nte dans la cellule ou
ie~ion d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une m~ificati~)nJ
5 ou encore de sure~.imer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour
un mutant d'une protéine cell~ ire, ayant une st~hilité accrue, une activité modifiée,
etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible.
Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une
activité déficiente dans la cellule lui permettant de lutter contre une pathologie.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut
citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones comme
l'insuline, les lymphokines: interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les
facteurs de croissance, les neurotr~n~metteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de
synthèse, les facteurs trophiques: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF,
NT3, NT5, etc; les apolipo~ téines: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la
dystrophine ou une minidystrophine (FR 91 11947), etc.
Selon une variante préférée de l'invention, la séquence hétérologue comporte
au moins un gène codant pour l'insuline ou un variant de l'insuline. Au sens de
l'invention, variant couvre notamment les différentes formes de maturation de
20 l'insuline comme par exemple la proinsuline, (Vollenweider et al., J. Biol. Chem.
267, (1992) 14629-14636 et Groskreutz et al., J. Biol. Chem.269, (1994), 6241-
6245).
Plus préférentiellement, le gène codant pour l'insuline et présent dans un
vecteur selon l'invention comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N~5.
Les vecteurs de l'invention peuvent être préparés à partir de différents types de
virus. Préférentiellement, on utilise des vecteurs dérivés des adénovirus ou desrétrovirus.
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Les virus selon l'invention sont défectifs, c'est-à-dire qu'ils sont in~p~hles de
se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des
virus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au
moins des séquences n~c~s.s~ires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
5 Ces régions peuvell~ être soit é-limin~es (en tout ou en partie), soit rendues non-
fonctionnelles, soit ~hstitlléçs par d'autres séquences et not~mment par la séquence
d'ADN codant pour le gène d'intérêt comme par exemple celui de l'in~line
Préférentiellement, le virus défectif conserve nézlnmoins les séquences de son génome
qui sont néce~ires à l'encapsidation des particules virales.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, dirr~ i sérotypes, ~lont la
structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés. Parmi cessérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus
humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir
demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans lecadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine,
murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine,
aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, l'adénovirus d'origineanimale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2
[souche m~nh~ n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on
utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine hl~m~ine ou canine ou
mixte.
PieféL~.ltiellement, les adénovirus défectifs de l'invention co~ ent les
ITR, une séquence permettant l'~nc~p~ tion et la séquence codant pour la protéine
d'intérêt thérapeutique. Encore plus préférentiellement, dans le génome des
adénovirus de l'invention, le gène E1 et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont
non fonctionnels. Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute
technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale,
substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les
gènes considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de
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l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique,
ou encore par tr~item~nt au moyen d'agents mutagènes. Les adénovirus recomhin~nt~
défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de
l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham,
EMBO J. 3 (1984) 2917) .
C~ncçrn~nt les ~e~Lovil us, la construction de vecteurs recombinants a été
largement décrite dans la liLL~lu.~: voir notamment Breakfield et al., New Biologist
3 (1991) 203; EP 453242, EP178220, B~ t~in et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235;
McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les I~Llovilus sont des
10 virus intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Le génome des
r~kovi.us comprend essentiellement deux LTR, une séquence d'~?nc~rsi~tion et trois
régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs recombinants dérivés des
reL.ovirus, les gènes gag, pol et env sont généralement délétés, en tout ou en partie, et
remplacés par une séquence d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs15 peuvent être réalisés à partir de dirr~ types de rétrovirus tels que not~mm~nt le
MoMuLV ("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV
("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV
("spleen necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de
Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence
d'intérêt, un pl~mi~e comportant notamment les LTR, la séquence d'~n~psiti~tion et
ladite séquence d'intéret est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une
lignée cellulaire dite d'enc~rsi-1~tion~ capable d'apporter en trans les fonctions
reLrvvildles déficientes dans le pl~mi~le Généralement, les lignées d'~nc~r~iA~ti~)n
sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées
d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et not~mment la lignée PA317
(US4,861,719); la lignée PsiCRIP (WO90/02806) et la lignée GP+envAm-12
(WO89/07150). A titre d'exemple de lignée on peut notamment citer la lignée
cellulaire ~-2 qui provient de la lignée NIH-3T3 (lignée fibroblastique de souris) par
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transfection par pMOV-~-, un plasmide contenSInt le génome du virus de la leucémie
murine de Moloney (MoMuLV) dont la séquence d'~-ncapsi(1~tion "~" est délétée
(Mann et al., Cell, (1983), 33, 153-159, ). Par ailleurs, les I~LI~Vil~lS recomhin~nts
peuvellL comporter des mo lific~tion~ au niveau des LTR pour supprimer l'activité
5 transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'~nc~p~iA~ion étenr~ s, comportant une
partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. (1987) 61, 1639). Les lel~-~villl
recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Dans le cas particulier de la présente invention, les l~LI~)vi~S peuvent être
préparés par transfection d'un plasmide reLIvvil~l contenant le signal d'expression
10 selon l'invention couplé au gène codant pour la protéine= d'intérêt dans une lignée
cellulaire transcomplémentante qui va permettre de produire des particules virales
dont le génome code pour le transgène.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement
avantageux d'utiliser un adénovirus ou un ~eLL~vil~lS recombinant défectif, le
15 I~L}~vil lls étant tout particulièrement avantageux pour exprimer de l'insuline.
En plaçant, au sein d'un vecteur selon l'invention, l'expression du gène codant
pour l'insuline sous contrôle d'un signal d'expression contrôlé par le glucose et en
transfectant des cellules in vivo à l'aide de ce type de vecteur on induit ces cellules-ci à
produire de l'insuline sous l'effet de leur teneur physiologique en glucose. Ces cellules
20 deviennent capables d'exprimer le transgène de l'insuline en présence d'une
concentration physiologique et sufflsante en glucose.
Selon un mode préféré de l'invention, les cellules transfectées possèdent un
système interne de détection du glucose, encore désigné par m~hin~ri~ senseur deglucose, susceptible d'induire l'activation du signal d'expression. Certains types
25 cell~ ires, comme les hépatocytes et les cellules ~ du pancréas en sont naturellement
pourvues. Il s'agit d'un système notamment composé d'enzymes spécifiques comme le
transpol leur Glut-2-glucose et la glucokinase. Pour ce qui est des cellules ~émlmi~-~ de
ce type de m~hin~rie senseur, il est tout à fait envisageable d'y suppléer
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artificiellement. Dans ce cas particulier, les cellules devant être traitées sont, soit
préalablement ou ~iml1lt~nném~nt, à l'injection de virus selon l'invention, transfectées à
l'aide de constructions génétiques comm~ntl~nt la synthèse du kansporteur Glut-2 de
l'enzyme ~ltl-rlkin~e
L'infection des cellules telles les hépatocytes par des virus recombinants selonl'invention peut être réalisée ex vivo et/ou in vivo rendant les cellules ainsi
transfectées capables de secréter de l'insuline. Les sites d'infection privilégiés dans le
cadre de la présente invention sont les sites naturels de secrétion de l'in~l-line, comme
la veine porte.
La présente invention se rapporte également aux cellules de m~mmifères, de
préférence hllm~ines et plus pleré.~nLiellement aux hépatocytes et/ou cellules 13
pancréatiques infectées par un ou plusieurs virus revendiqués.
Outre leur capacité à induire in vivo l'expression de l'insuline, les vecteurs
selon l'invention permettent avantage--~ement le blocage immédiat de cette secrétion
sous l'effet du glucagon du fait de l'AMP classique. On s'affranchit de cette manière
du risque d'une hypoglycémie induite par une secrétion excessive en in~llline.
En conséquence, les vecteurs revendiqués sont particulièrement avantageux
pour contrôler in vivo via un pht?n~)mène d'induction au glucose, la production
d'in~llline dans une région précise de l'organisme, de préférence dans un site ou elle
est normalement secrétée comme la cirulation porte. Des cellules infectées par un ou
plusieurs virus revendiqués pourraient ainsi être inplantées dans le foie, la rate, le
pancréas ou l'int~stin
La présente invention décrit ainsi une approche nouvelle pour le traitement
notamment des troubles diabétiques dépendant de l'insuline con.~i~t~lnt à induire la
synthèse in vivo d'in~uline en réponse à une teneur physiologique en glucose.
Dans le cas particulier, où les cellules transfectées avec un vecteur selon
l'invention ne possèderaient pas cette teneur physiologique en glucose, initiatrice de
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l'expression d'un gène hétérologue autre que l'in~llline par exemple, on peut envisager
le protocole SUiV~llL~; la concentration en glucose ou en un analogue ayant la même
influence sur la séquence de réponse au glucose (L4-L3), y serait ajustée de manière à
induire l'expression de la protéine d'intérêt via l'activité du signal d'expression selon
5 l'invention. Il est clair que cette cnneentration est déterminée en fonction de la
quantité en v~:leuL~ injectée, de la nature du site d'infection et de l'expression
recherchée en protéine..
Comme indiqué ci-avant, la présente invention cnnc~rne également toute
lltili~tinn d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la ~.~paLa~ion d'une compcsition
10 pharmaceutique not~mment destinée au traitement et/ou à la pL~v~ ion des m~ r1içs
liées à une hyper~lycelllie.
La présente invention concerne é~lement une composition pharmaceutique
com~ ant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits
précé~emment C~es compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue
15 d'~ministrations par voie topique, orale, pa.en~.dle, intranasale, h~LIdv~iLleuse,
intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De ~ierelellce, les
compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceu-
tiquement acceptable pour une formulation injectable. Il peut s'agir en par~iculier de
solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées,
20 qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la
constitution de solutés injectables.
Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être
adaptées en fonction de dirr~ paramètres, et notamment en fonction du vecteur
viral, du mode dl~mini~tration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la
25 durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les virus recombirlants selon
l'invention sont formulés et ~flmini~trés sous forme de doses comprises entre 104 et
1014 pfu/ml, et de pL~;:fél~llce 106 à 101~ pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming
unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par
infection d'une culture cellulaire ap~lvpliée, et mesure, généralement après 48
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heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du
titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature. Conc~rn~nt
les .c:L,ovirlls, les compositions selon l'invention peuvent comporter directem~nt les
cellules productrices, en vue de leur impl~nt~tion
Les exemples et figures, présentés ci-après à titre non l;.. ,;l~l;r de la présente
invention, permettront de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de
la présente invention.
LEGENDES DES FIGURES
Fi~ure l: Représentation ~rh~m~titlue de l'ordre de succession des éléments
10 Ll à L4 identifiés dans le promoteur du gène L-PK et leurs protéines de liaison
respectives.
Fi~ure 2: Représentation du palindrome de l'élément L4.
Fi~ure 3: Représentation partielle du plasmide rétroviral
pHSG(L4L3)4PKCAT et des clones F6 et B8.
Fi~ure 4: Détermination q~ ;ve de l'activité CAT dans des cellules
mhATIIIF transformées avec le clone B8, en fonction de la quantité de glucose
injectée.
Fi~ure 5: Dét~rmin~tion ql~"lil~liv~ de l'activité CAT dans des cellules
rnhATIIIF transformées avec le clone B8 à des temps d"induction différents.
Fi~ure 6: Construction des pl~mitlels pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT.
Fi~ure 7: Induction par le glucose à des doses lirr~ Les de l'expression des
pl~mi~les pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT.
Techniques ~énérales de biolopie moléculaire
Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les
25 extractions ~ pald~ives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en
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gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la
purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au
phénol ou au phénol-chloi~rolllle, la précipitation d'ADN en milieu salin par del'éthanol ou de l'isopiopallol, la transformation dans Escherichia coli, etc ... sont bien
5 c-mmles de l'homme de métier et sont ab~n~l~m~nt décrites dans la liU~la~ule
~Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor
Lal~olaloly, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].
Les pl~cmi~s de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont
10 d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fra~m~ntc d'ADN peuvent être séparés selon leur taille
par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un
mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de
l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recomm~n~l~tions du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proémin~ntes peut être effectué par le
fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d' E. coli (Biolabs) selon les
spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proémin~ntf~s est
effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les
recomm~n~tions du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est
effectuée par un traitement ménagé par la nnclézl~e S1.
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut
être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13
(1985) 8749-8764] en ~1tili~nt le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de
PCR [~olymérase-catalyzed_hain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985)
1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350] peut
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être effectuée en utili~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les
spécifications du fabricant.
La vérific~tion des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la
m~tho l~ développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-
5 5467] en lltili~nt le kit distribué par Am.?rsh~m
EXEMPLE 1: Construction d'un vecteur, cl- ovirdl
Tous les pl~mifl~s sont co~ selon des techniques de clonage d'ADN
standard. Les jonctions sont vérifiées par séquencage ADN. La construction du
plasmide pHSG(L4L3)4-PKCAT, (représentée en Fig. 3), contient la partie
10 constructive MMLV de pHSGNeo et la séquence codant pour le gène CAT sous
contrôle du promoteur du gène pyruvate kinase de type L de rat (bp - 119 to + 11) en
amont duquel des fr~gm~ntc L4L3 oligomérisés 4 fois (c.à.d le GIRE et le site deliaison HNF4 contigu) sont ligaturés. Le fragment L4L3, correspondant au fragment
~ limité entre les pb -172 à- 123, en amont du site d'initi~ti-~n de la transcription L-PK
15 a été obtenu par PCR. La séquence signal polyA utilisée, est celle présente dans le
LTR de l'~LLe~lliLé 3' du MMLV. Le plasmide pHSGNeo (Guild et al. J. Virol. 1988,
62; 3795-3801), un plasmide rétroviral dérivé du MMLV, la lignée psi-CRIP, une
lignée cellulaire complémentaire amphotropique qui apporte en trans les protéines
structurales de MMLV, ont été procurés par le Dr. A. Weber (Institut Cochin de
20 Génétique Moléculaire, Paris); le plasmide pRSVNeo, dans lequel le gène
aminoglycoside-phosphotransférase est sous contrôle du promoteur du LTR du RSV,
est utilisé pour la cotransfection.
EXEMPLE 2: Culture cellulaire et transfection
La lignée cellulaire mhATIIIF, est issue d'une tumeur du foie chez une souris
25 tr~n~nique exprimant les gènes précoces SV40 sous contrôle du promoteur
a ILiLhl..lllbine III spécifique du foie, (ATIII-SV40) (Kahn A. et al. Exp; Cell. Res;
200, 175-185). Ces cellules sont cultivées dans un milieu nutritif DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 vol/vol) avec du glutamax-1 ou DMEM/HamF12 (1:1 vol/vol) (Gibco-
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BRL) avec ou sans D+glucose (Sigma), complementé avec 1 ,uM de dexamethasone,
1 ~M triodoLhy-u~ e, 20nM d'insuline hllm~ine 5 5~o (vovvol) de SVF. Les cellules
NIH3T3 et psi-CRIP sont cultivées dans: DMEM (5.5mM de glucose, 1.0mM
~y.uv~ de sodium) comrlfi-menté~ avec 10 % (vol/vol) de sérum de veall nouveau-
5 né. Tous les milieux sont ~ 1iti(~nn~s d'~mpi~illin~, de ~L~Lolllycl~le et de ~ ;..,.;ne etles cultures sont inrllhe~.e à 37~C avec 5 ~o (vol~vol) C02. Les cellules psi-CRIP sont
cotransfectées avec les pl~emi~les pHSG (L3L4)4- PKCAT et pRSV Neo (le rapport
molaire des deux pl~miecles étant de 10:1) par la méthode liposome cationique
(DOTAP, Boeringer M~nnheim) et sélectionnées en présence de G418 (800 ,ug~ml).
10 Les clones réei~t~nte à G418 sont séparés pour le test de production des ~eLlovillls.
EXEMPLE 3: Préparation de l'ARN viral et PCR-RT en une étape
Les clones cellulaires résistants à G418 sont ~ne~m~nf~e dans des puits de
90 mm et cultivés jusqu'à 100 'rO de confluence. Le sl~rn~nt de la culture cellulaire
est filtré sur une membrane poe.sé~l~nt des pores de 0,22 ~m, incubé avec de la DNase
I (10~g/ml) à 37~C pendant 30 min puis centrifugé à 65000 rpm pendant 2Q minutes à
4~C. L'ARN ~ vi~l est extrait et purifié de culots de précipitation par la protéinase
K et un mélange phénol/chlo.~,ro~llle puis co-précipité avec de l'ARNt. L'~h~ntillon
est dissous dans du pyrocarbonate de diéthyle traité avec de l'eau et contenant 1 mM
de dithiothreitol (DTT), 40 U de RNAsin/100~m, puis soumis à une transcriptase
20 réverse et à une PCR en une seule étape. Les deux sondes l1tili~éf~ pour l'amplification
sont:
- 5'ACTCAAATGCCCAATGAAGTC 3' (SEQ ID N~7), correspondant à la
région Gag de MMLV (pb 1524 à 1544);
- 5' TCAACGGTGGTATATCCAGAT 3'(SEQ ID N~8), correspondant à la
25 région codante du gène CAT (pb 35 to 15 en considérant le site d'initiz~ti~n de la
tr~ ction).
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La transcription inverse à partir de la sonde PCR zlnti~n~ est catalysée par la
transcriptase inverse 8U AMV (Promega) pendant 1 heure à 42~C et la PCR suivanteavec l'ADN polymérase Taq25U est réalisée en 35 à 40 cycles. Le fragment ;lmplifié
attendu est long de 440 pb et contient une partie du gène gag, 4 motifs répétés L3L4,
5 le promoteur -119 L-PK et les 69 premières pb du gène CAT. Si n~c~s~ire, les
fr~ment.~ RT-PCR sont clonés et séquencés.
EXEMPLE 4: Production de rétrovirus recombinants
Les vecteurs rétroviraux pHSG(L4L3)4-119PKCAT et pRSVNeo sont utilisés
pour co-transfecter des lignées cellulaires psi-CRIP. 70 clones résistants à G418 sont
10 analysés. 8 clones positifs en RT-PCR témoignent d'une c~racité à produire des
rétrovirus recombinants infectueux, determinée par PCR spécifique du fragment
attendu de l'ADN génomique des cellules NIH3T3. Il a été mis en évidence la
production de ~ )VilllS à un titre ~ignific~tif chez deux clones.
- Le clone F6 (5.104) ~~Llovil~lS infectueux, produit un i~Llovii~ls avec la
15 région complète de la séquence signal (4 répétitions des fr~gm~nt.c L4L3 entier (voir
figure 3)) et
- le clone B8 (2.105) avec une séquence signal partiellement délété (un seul
motif L4L3 entier et une petite partie de la cassette L3 d'un second motif (voir figure
3~).
Les titres en rétrovirus ont été estimés par PCR-RT semiqtlz~ntit~tive en
tili~nt difré-e,lL~s délétions en pHSG(L4L3)4199PKCAT comme standards.
EXEMPLE 5: Infection par un ~ vil ls recombinant. estimation du
titre en rétrovirus et dosa~e de la protéine CAT
Les clones positifs sont utilisés pour infecter les cellules NIH3T3 afin d'estimer
les capacités infectueuses des rétrovirus produits.
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1 ml de s~rn~Ee~nt de culture cell~ ire à 100 ~o de confluence est utilisé pour
infecter des cellules NIH3T3 en cloi~sance lo~iLLIl.ique avec 8 ~uglml de polybrène.
Après 3 heures d'inruh~tion, le polybrène est dilué à 2 ~glml avec du milieu et la
culture est ~o~L:,uivie 48 heures. L'ADN ~n~mitlue des cellules NIH3T3 infectées est
5 extrait et utilisé pour une amplifi~tion PCR en employant les sondes ~ rit~e en
exemple 3. La détection du fragment ~mrlifié spé~ifique prouve l'intégration desséquences l~Ll~)vhdles dans le génome des cellules infectées. Le titre en est estimé en
comparant les inteneit~e des bandes d'ADN ~mplifié~,e issu de l'ADN génomique des
cellules infectées avec celles issues de dirr~l~llLes flilllti~)ne du lell~vilLls (102 à 106
10 molécules). Les clones qui prc~ ie~nt des I~Ll~vh~lS infectueux sont co-cultivés avec
des cellules mhATIIIF selon le protocole suivant:
- On place à l'intérieur d'un puit de 90 mm, un puit de 60 m~n dont la base a été
retirée et les parois enrillit~s avec de l'huile de silicone, de manière à le diviser en deux
parties.
- On y introdu* les cellules mhATIIIF et les cellules prc~ liez~nt le l~LL~)vilLls
respectivement au centre et en périphérie, et en prenant soin de ne pas melanger les
deux types de cellules.
- Lorsque les cellules sont bien fixées au puits après 6 heures d'incubation, lepetit puit est retiré. Le milieu est changé pour une nouvelle incubation de 16 heures, le
20 polybrène est ensuite ajouté (8 ,ug) et les cellules sont cultivées pendant 48 heures.
- L'activité CAT est mesurée par chromatographie sur couche fine et quantifiée
en cpm par scintill~tion.
EXEMPLE 6: Induction par le ~lucose à des doses et temps dir~ ell~ de
l'expression de la chimère
La lignée cellulaire mhATIIIF ~eeimil~ble aux hépatocytes chez le rat, conserve
sa capacité à répondre au glucose par activation transcriptionnelle du gène L-PK et est
donc ap~l~r;ée pour tester la réponse du transgène CAT, transféré par le vecteurr~ vildl et en conséquence l'activité du L-PK GIRE dans un ellvir n~ m~nt
l~lL~)Vildl.
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Pour accroître l'efficacité de la transfection, les cellules mhATIIIF sont
cultivées deux fois avec des cellules produisant les rétrovirus, ce qui conduit à un taux
d'infection satisfaisant avec le clone B8. Comme le montrent les figures 4 et 5,ion du tr~n.egène L-PK/CAT dans les cellules infectées mhATIIIF est bien
induite par le glucose avec la moitié de l~in~ ction maximale obtenue pour 3-4 mM de
glucose et l'induction maximale pour 8mM de glucose. Pour des concentrations
supérieures en glucose, l'activité CAT demeure relativement stable.
Les cellules mhATIIIF sont cultivées dans un milieu c~nten~nt 17 mM de
glucose~ l'induction du gène est observée à partir de la 8ème heure d'incllh~tion,
l'induction à moitié avant la 24ème heure et l'induction maximale à la 48ème heure.
EXEMPLE 7: Constrllction des plamides p~SG/PK-CAT et pHSG/AL-
PK-CAT
Les pl~mi(les sont construits selon des techniques de clonage d'ADN
standard. Les jonctions sont vérifiées par séquencage ADN. La construction du
plasmide pHSG/PK-CAT contient la partie MMLV de pHSG située entre les
nucléotides de 1 à 2015 et de 3888 à 4445; pour le plasmide pHSG/AL-PK-CAT, les
séquences MMLV sont situées entre les nucléotides de 1 à 2015 et de 4290 à 4847
ffigure 6). La séquence codant pour le gène CAT sous contrôle du promoteur du gène
pryruvate kinase de type L de rat (-183 à + 11 bp) est situé entre les nucléotides 2048
et 3033 pour le plasmide pHSG/PK-CAT et entre 2450 et 3435 pour le pl~mille
pHSG/AL-PK-CAT. La séquence du fragment enhancer du gène de l'aldolase B
(SEQ ID N~6), est située entre les nucléotides 2035 et 2437 dans le plasmide
pHSG/AL-PK-CAT. La séquence signal poly A utilisée est celle de SV40 située entre
les nucléotides 3033 et 3873 dans le pHSG/PK-CAT et entre 3435 et 4275 dans le
pHSG/AL-PK-CAT. Les nucléotides de 2015 à 2048; 2242 à 2452 et 3873 à 3888
sont des adaptateurs entre les différents fragments pour le pl~mi(l~ pHSG/PK-CAT;
ils sont situés pour le plasmide pHSG/AL-PK-CAT de 2015 à 2035; 2437 à 2450;
2644 à 2654 et 4275 à 4290.
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EXEMPLE 8: Induction par le ~lucose à des doses différentes de
l'expression des plasmides pHSG/PK-CAT et pHSG/AL-PK-CAT
La lignée cellulaire mhAT3F est issue d'une tumeur du foie chez une souris
tr~n~nique ~p~ ;...~..l les gènes précoses SV40 sous le contrôle du promoteur
anLilhr.,.l,bine III spécifique du foie (Kahn A. et al. Exp; Cell.Res; 200, 175 185). Ces
cellules ont été cultivées à 37~C avec 5 ~o (volfvol) C02 dans un milieu nutritif
DMEM F12/NUT.MIX. (1:1 vol/vol) avec du glllt~m~x-1 (Gibco-BRL) avec ou sans
D-glucose (Sigma), complémenté avec 1 ~M de dexameth~one, 1 ,uM
triodolhylu~ e et 20 nM d'insuline hllm~in~ 5 ~g du pl~mi~le pHSG/PK-CiAT ~u du
plasmide pHSG/AL-PK-CAT ûnt été transfectés par la méthode liposome cationique
(DOPAP, Boehringer Mannheim). Les cellules ont été par la suite cultivées en
présence de dirré.ellLes concentrations de glucose pendant 24 heures pour induire le
promoteur de la PK-L. L'activité CAT est mesurée par chromatographie sur couche
fine et quantifiée en cpm par s~intill~tion. Les résultat sont présentés sur la figure 7.
Après 24 heures d'induction en présence de différentes conc~ntrations de glucose,
l'expression du plasmide pHSG/PK-L en présence de l'enh~n~er de l'aldolase B est5tfois plus forte en présence de 8 mM glucose que celle du plasmide dépourvu de
l'enhancer de l'aldolase B (figure 7).
Ce promoteur hybride aldolase B/PK-L est donc particulièrement avantageux
pour conférer à un gène un niveau d'expression élevé tout en restant sensible auglucose, notamment dans le cadre du développement de méthode de thérapie géniquedu diabète destinées à produire, en fonction de la glycémie, une concentration
convenable in vivo en insuline.
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LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101, Rue de Tolbiac
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75654 PARIS Cedex 13
(ii) TITRE DE L' INVENTION : VECTEUR VIRAL RECOMBINANT, COMPOSITION
PHARMACEUTIQUE LE CONTENANT ET CELLULES TRANSFORMEES CORRESPONDANTES.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES:8
- 15
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version ~1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 194 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GATCCAGCAG CATGGGCGCA CGGGGCACTC CCGTGGTTCC TGGACTCTGG CCCCCAGTGT 60
ACAAGGCTTC CGTTGGCAAG AGAGATGCTA GCTGGTTATA CTTTAACCAG GACTCATCTC 120
ATCTGAGCCA GGCCCCATCC CACTGACAAA GGCGCAGTAT AAAGCAGACC CACAGACACA 180
GCAGGTAAGC AACG 194
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: 1; n~A; re
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
CA 022l~987 l997-l0-08
W 096/32489 P~~ n~ 00560
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GCGCACGGGG CACTCCCGTG GTTC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
30 CTGGACTCTG GCCCCCAGT - 19
(Z) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A~ LONGUEUR:129 paires de bases
(B) TYPE: acide nucleique
(C) NOMBRE DE BRINS si~ple
(D) CONFIGURATION: lineaire ....
~ (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GGCTTCCGTT GGCAAGAGAG ATGCTAGCTG GTTATACTTT AACCAGGACT CATCTCATCT 60
GAGCCAGGCC CATCCCACTG ACAAAGGCGC AGTATAAAGC AGACCCACAG ACACAGCAGG 120
TAAGCAACG 129
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
. CA 022l~987 l997-l0-08
W 096/32489 PCTn~R96/00560
(i~ CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 416 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TCCTTCTGCC ATGGCCCTGT GGATGCGCCT CCTGCCCCTG CTGGCGCTGC TGGCCCTCTG 60
GGGACCTGAC CCAGCCGCAG CCTTTGTGAA CCAACACCTG TGCGGCTCAC ACCTGGTGGA 120
AGCTCTCTAC CTAGTGTGCG GGGAACGAGG CTTCTTCTAC ACACCCAAGA CCCGCCGGGA 180
GGCAGAGGAC CTGCAGGTGG GGCAGGTGGA GCTGGGCGGG GGCCCTGGTG CAGGCAGCCT 240
25 GCAGCCCTTG GCCCTGGAGG GGTCCCTGCA GAAGCGTGGC ATTGTGGAAC AATGCTGTAC 300
CAGCATCTGC TCCCTCTACC AGCTGGAGAA CTACTGCAAC TAGACGCAGC CCGCAGGCAG 360
CCCCCCACCC GCCGCCTCCT GCACCGAGAG AGATGGAATA AAGCCCTTGA ACCAGC 416
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 464 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
50 AGGCCTCCAC ACTCTATTGC ACTCTGCAGA AGTAACACTA GAGTGACCTT TCTTTAGATT 60
TAGAAAGACT AACACATAAT ATATTGCTGT AATTTCTTTT GTA~ AAGTAGGACA 120
ATAAATATTT ATTACAGATT TCTCTGGAAG TTTTTCATTT GATAATTAAT GAAAATTTTC 180
CATCATACTT GTAAAAATGA AGTGACTTGG GACCTTAGAA ATCAGAAGTT TAAAGGAGTA 240
AAGTTCATTA TTGTTAAGTA TTCCAGGCTG TGTTCTGTCT CCCAGTGACA AACATTGACC 300
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W 096~2489 PCT~R96/00560
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TGTGACTCTG TTTTATGATT AACTGAGGGG CAAAATTTGT GCTGATGTGG TACAGACCTT 360
TAGTCCCTTT GTAGAAGTTT AACTTCCTGT AAACAGGACG AGTTTGACTT GACTTTTCCC 420
5 TGTAATTCTT GTTGAGTTGG CATACCCAGA ATGGAGCAAA TGGC 464
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ACTCAAATGC CCAATGAAGT C 21
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS:simple
(D) CONFIGURATION: lineaire -
40 (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
50 TCAACGGTGG TATATCCAGA T 21
