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NOUVEAUX VARIANTS DE L'APOLIPOPROTEINE A-l
La présente invention concerne un nouveau variant de
l'apolipoprotéine A-l. Elle concerne aussi tout acide nucléique codant pour ce
nouveau variant. Elle concerne également l'utilisation de ces protéine ou
5 acides nucléiques dans un but thérapeutique. Plus particulièrement,
I'invention concerne un nouveau variant de l'apolipoprotéine A-l comportant
notamment une mutation en position 151.
L'apolipoprotéine A-l (apoA-I) est le constituant majeur des
lipoprotéines de haute densité (HDL), qui sont des complexes
10 macromoléculaires composés de cholestérol, phospholipides et de
triglycérides. L'apoA-I est une protéine constituée de 243 acides aminés,
synthétisée sous la forme d'une préproprotéine de 267 résidus, ayant une
masse moléculaire de 28.000 daltons. La forme prépro de l'apoA-I est
synthétisée chez l'homme à la fois par le foie et l'intestin. Cette forme de
protéine est ensuite clivée en proprotéine qui est sécrétée dans le plasma.
Dans le compartiment vasculaire, la proapoA-I est alors transformée en
protéine mature (243 acides aminés) par action d'une protéase calcium
dépendante. L'apoA-I a un rôle de structure et un rôle actif dans le
métabolisme des lipoprotéines: I'apoA-I est notamment un cofacteur de la
lécithine cholestérol acyltransférase (LCAT), responsable de l'estérification
du cholestérol plasmatique.
Le niveau de cholestérol contenu dans la fraction HDL et la
concentration plasmatique de l'apoA-I sont des facteurs de risque négatifs
pour le développement de l'athérosclérose chez l'homme. Les études
épidémiologiques ont en effet démontré une corrélation inverse entre les
concentrations de cholestérol HDL et d'apoA-I et l'incidence des maladies
cardio-vasculaires (E. G. Miller et al. Lancet, 1977:965-968). En revanche,
une longévité serait associée avec un taux de cholestérol HDL élevé.
Récemment, le rôle protecteur de l'apoA-I a été démontré dans un modèle de
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souris transgéniques exprimant l'apolipoprotéine A-l humaine (Rubin et al.
Nature). De même, l'infusion des HDL chez le lapin induit une régression des
lésions (Badimon et al. J. Clin. Invest. 85, 1234-41, 1990). Differents
mécanismes ont été proposés pour expliquer l'effect protecteur des HDL, et
5 notamment un rôle des HDL dans le transport inverse du cholestérol
(Fruchart et al. Circulation, 87: 22-27, 1993) et une action antiioxydant des
HDL (Forte T., Current Opinion in Lipidology, 5: 354-364,1994)).
Le gène codant pour l'apoA-I a été cloné et séquencé (Sharpe et al.,
Nucleic Acids Res. 12(9) (1984) 3917). Ce gène, d'une longueur de 1863 pb,
10 comprend 4 exons et 3 introns. L'ADNc codant pour l'apoA-I a également été
décrit (Law et al., PNAS 81 (1984) 66). Cet ADNc comprend 840 pb (Cf SEQ
ID n~ 1). Outre la forme sauvage de l'apoA-I, différents variants naturels ont
été décrits dans l'art antérieur, dont les différences par rapport à la protéinesauvage sont données dans le tableau ci-après.
Variant: Mutation VariantMutation
Milano Arg173Cys NorwayGlu136Lys
Marburg Lys1070 Pro165Arg
Munster2B Ala158Glu Pro3His
Giessen Pro143Arg Arg1 OLeu
Munster3A Asp103Asn Gly26Arg
Munster3B Pro4Arg Asp89Glu
Munster3C Pro3Arg Lys107Met
Munster3D Asp213Gly Glu139Gly
Munster4 Glu198Lys Glu147Val
Yame Asp13Tyr Ala158Glu
Asp213Gly Glu169Gln
Arg177His
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La présente invention découle de la mise en évidence d'une nouvelle
~ série de variants de l'apolipoprotéine A-l. Cette série de variant présente en
particulier une substitution du résidu arginine en position 151 par un résidu
cystéine. Le variant d'apoA-I selon l'invention présente des propriétés
thérapeutiques remarquables. En particulier, il possède des propriétés de
protection anti-athérogène particulièrement importantes. Ainsi, dans une
situation de niveaux extrêmement bas de cholestérol dans la fraction HDL,
associée à une hypertriglycéridémie, la présence de ce variant prévient le
développement de toute athérosclérose, témoignant d'un rôle protecteur très
10 puissant, spécifique à cette apoA-I mutée. En outre, la présence d'une
cystéine sur l'apoA-I selon l'invention entraîne la formation de dimères et
d'autres complexes reliés par un pont disulfure. Cette apoA-I se retrouve
sous forme libre dans le plasma, liée en dimère à elle-même ou associée
avec l'apolipoprotéine A-ll qui est une autre protéine importante associée au
HDL et qui possède aussi une cystéine dans sa séquence. Par ailleurs, la
perte de la charge liée à l'arginine en position 151 entraîne la visualisation
de ce mutant par électroisofocalisation des protéines plasmatiques suivi
d'une révélation immunologique de l'apoA-I.
Compte tenu de ses propriétés anti-athérogènes particulièrement
remarquables, cette nouvelle protéine selon l'invention offre un avantage
thérapeutique important dans le traitement et la prévention des pathologies
cardiovascu lalres.
Un premier objet de l'invention concerne donc une série de variants de
l'apolipoprotéine A-l humaine comprenant une cystéine en position 151. La
séquence d'acides aminés de l'apoA-I de référence est décrite dans la
littérature (Cf Law précitée). Cette séquence, incluant la région prepro
(résidus 1 à 24), est présentée sur la séquence SEQ ID n~ 1. Une
caractéristique des variants selon l'invention réside donc dans la présence
d'une cystéine en position 151 de l'apoA-I mature (correspondant à la
30 position 175 sur la séquence SEQ ID n~ 1), en substitution de l'arginine
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présente dans la séquence de référence. Un variant préféré selon l'invention
comprend la séquence peptidique SEQ ID n~ 2, et, encore plus
préférentiellement, la séquence peptidique comprise entre les résidus 68 à
267 de la séquence SEQ ID n~ 1, le résidu 175 étant substitué par une
5 cystéine.
Les variants selon l'invention sont représentés notamment par l'apoA-I
Paris, c'est-à-dire une apoA-I présentant une cystéine en position 151 par
rapport à l'apoA-I native. Les variants selon l'invention peuvent également
porter d'autres modifications structurales par rapport à l'apolipoprotéine A-l
10 de référence, et notamment d'autres mutations, délétions eVou additions.
Selon un mode particulier, les variants de l'invention comprennent également
d'autres mutations conduisant au remplacement de résidus par des
cystéines. Ainsi, un autre variant particulier combine les mutation présentes
dans le variant apoA-I Paris et apoA-I milano. D'autres mutations peuvent
15 également être présentes affectant des résidus ne modifiant pas de manière
significative les propriétés de l'apoA-I. L'activité de ces variants peut être
vérifiée notamment par un test d'efflux du cholestérol.
Les variants selon l'invention peuvent être obtenus de différentes
facons. Ils peuvent tout d'abord être synthétisés chimiquement, grace aux
20 techniques de l'homme du métier utilisant des synthétiseurs de peptides. Ils
peuvent également être obtenus à partir de l'apoA-I de ré~érence, par
mutation(s). Avantageusement, il s'agit de protéines recombinantes, c'est-à-
dire obtenues par expression dans un hôte cellulaire d'un acide nucléique
correspondant comme décrit plus loin.
Comme indiqué plus haut, les variants selon l'invention peuvent se
trouver sous forme monomérique ou sous forme de dimère. La présence
d'une cystéine au moins dans la séquence des variants de l'invention permet
en effet la réalisation de dimères par liaison disulfure. Il peut s'agir
d'homodimères, c'est à dire de dimères comprenant deux variants selon
-
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I'invention (exemple: diApoA-I Paris); ou d'hétérodimères, c'est à dire de
dimères comprenant un variant selon l'invention et une autre molécule
possèdant une cystéine libre (exemple :ApoA-I Paris:ApoAII).
Un autre obiet de l'invention réside dans un acide nucléique codant
pour un variant d'apolipoprotéine A-l tel que défini ci-avant. L'acide nucléiquede la présente invention peut être un acide désoxyribonucléique (ADN) ou un
acide ribonucléique (ARN). Parmi les ADN, il peut s'agir d'un ADN
complémentaire (ADNc), d'un ADN génomique (ADNg), d'une séquence
hybride ou d'une séquence synthétique ou semi-synthétique. Il peut en outre
10 s'agir d'un acide nucléique modifié chimiquement, par exemple en vue
d'augmenter sa résistance aux nucléases, sa pénétration ou son ciblage
cellulaires, son efficacité thérapeutique, etc. Ces acides nucléiques peuvent
être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne, virale, synthétique,
etc. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du
15 métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou
encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou
enzymatiqe de séquences obtenues par criblage de banques.
Avantageusement, I'acide nucléique est un ADNc ou un ADNg.
Préférentiellement, I'acide nucléique selon l'invention comprend la
séquence SEQ ID n~ 2. Encore plus préférentiellement, il comprend la
séquence SEQ ID n~ 10.
L'acide nucléique selon l'invention comprend avantageusement une
région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule ou
l'organisme cible, ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de
fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. L'ensemble de ces
éléments constitue la cassette d'expression. Concernant la région promotrice,
il peut s'agir de la région promotrice naturellement responsable de
l'expression du gène de l'apoA-I ou d'un variant de l'ApoA-I lorsque celle-ci
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est susceptible de fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernés. Il
peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de
l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut
s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par
5 exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la
cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur
ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de
facon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. Il peut s'agir en
particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des gènes HPRT, PGK,
10 vimentine, a-actine, tubuline, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques
(par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur Vlll, etc) de
promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine,
protéine intestinale de liaison des acides gras, a-actine du muscle lisse, etc)
ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones
15 stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). De même, il peut s'agir de
séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les
promoteurs des gènes E1A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du
CMV, le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices
peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation,
20 ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire.
Par ailleurs, I'acide nucléique peut également comporter une
séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de
la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle
de l'apoA-I, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal
25 fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
L'acide nucléique selon l'invention peut être utilisé pour produire les
variants d'ApoA-I recombinants par expression dans une cellule hôte
recombinée, ou directement comme médicament dans des applications de
thérapie génique ou cellulaire.
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Pour la production de variants recombinants selon l'invention, I'acide
nucléique est avantageusement incorporé à un vecteur plasmidique ou viral,
qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Ce vecteur est ensuite
utilisé pour transfecter ou infecter une population cellulaire choisie. Les
5 cellules transfectées ou infectées ainsi obtenues sont alors cultivées dans
des conditions permettant l'expression de l'acide nucléique, et le variant
d'apoA-I recombinant selon l'invention est isolé. Les hôtes cellulaires
utilisables pour la production des variants de l'invention par voie
recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi
10 les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les
levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut
citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia,
Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut
citer les cellules COS, CHO, C127, NIH-3T3, etc. Parmi les champignons, on
peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme
hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus,ou Streptomyces. Le variant ainsi isolé peut être ensuite conditionné en vue
de son utilisation thérapeutique.
Selon un mode particulièrement intéressant, I'acide nucléique selon
I'invention est utilisé directement à titre de médicament, dans des
applications de thérapie génique ou cellulaire. A cet égard, il peut être utilisé
tel quel, par injection au niveau du site à traiter ou incubation avec des
cellules en vue de leur administration. Il a en effet été décrit que les acides
nucléiques nus pouvaient pénétrer dans les cellules sans vecteur particulier.
Néanmoins, on préfère dans le cadre de la présente invention utiliser un
vecteur d'administration, permettant d'améliorer (i) I'efficacité de la
pénétration cellulaire, (ii) le ciblage (iii) la stabilité extra- et intracellulaires.
Selon un mode particulier, la présente invention concerne donc un
vecteur comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant.
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Différents types de vecteurs peuvent être utilisés. Il peut s'agir de
vecteurs viraux ou non viraux.
Dans un mode préféré, le vecteur de l'invention est un vecteur viral.
L'utilisation de vecteurs viraux repose sur les propriétés naturelles de
5 transfection des virus. Il est ainsi possible d'utiliser les adénovirus, les
herpès virus, les rétrovirus les virus adéno associés ou encore le virus de la
vaccine. Ces vecteurs s'avèrent particulièrement performants sur le plan de
la transfection.
S'agissant plus particulièrement d'adénovirus, différents sérotypes,
10 dont la structure et les propriétés varient quelque peu, ont été caractérisés.
Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de Ja présente
invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les
adénovirus d'origine animale (voir demande WO94/26914). Parmi les
adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente
15 invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine,
(exemple: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire
ou encore simienne (exemple: SAV). De préférence, I'adénovirus d'origine
animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus
CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De
préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine
humaine ou canine ou mixte.
Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprenent
les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et l'acide nucléique
d'intérêt. Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de
I'invention, la région E1 au moins est non fonctionnelle. Le gène viral
considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de
l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution,
délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes
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considérés. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de
- I'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie
génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. D'autres
régions peuvent également être modifiées, et notamment la région E3
(W095/02697), E2 (W094/28938), E4 (W094/28152, W094/12649,
W095/02697) et L5 (W095/02697). Selon un mode particulièrement préféré,
on utilise dans le cadre de la présente invention un adénovirus recombinant
présentant une délétion de tout ou partie des régions E1 et E4. Ce type de
vecteur offre en effet des propriétés de sécurité particulièrement
avantageuses.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être
préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al.,
Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMB0 J. 3 (1984) 2917). En
particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un
adénovirus et un plasmide portant entre autre l'acide nucléique ou la cassette
de l'invention. La recombinaison homologue se produit après co-transfection
desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La
lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesditséléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la
partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée
pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut
mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J.
Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome,
la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). D'autres lignées ont
été décrites dans les demandes n~ W0 94/26914 et W095/02697.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et
purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme
illustré dans les exemples.
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Concernant les virus adéno-associés (AAV), il s'agit de virus à ADN de
taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils
infectent, de manière stable et site-spécifique. lls sont capables d'infecter unlarge spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la
morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pasimpliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des MV a été
cloné, séquencé et caractérisé. ll comprend environ 4700 bases, et contient à
chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ,
servant d'origine de réplication pour le virus. Le reste du génome est divis~
10 en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie
gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication
virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui
contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in
vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088;
WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Ces demandes
décrivent différentes constructions dérivées des AAV, dans lesquelles les
gènes rep et/ou cap sont délétés et remplacés par un gène d'intérêt, et leur
utilisation pour transférer in vitro (sur cellules en culture) ou in vivo
(directement dans un organisme) ledit gène d'intérêt. Les AAV recombinants
défectifs selon l'invention peuvent être préparés par co-transfection, dans un
lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un
adénovirus), d'un plasmide contenant l'acide nucléique ou la cassette de
l'invention bordée de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV, et d'un
plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV. Les
AAV recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques
classiques (voir notamment W095/06743).
Concernant les virus de l'herpès et les rétrovirus, la construction de
vecteurs recombinants a été largement décrite dans la littérature: voir
notamment Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242,
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EP178220, Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick,
- BioTechnology 3 (1985) 689, etc. En particulier, les rétrovirus sont des virus
intégratifs, infectant sélectivement les cellules en division. Ils constituent
donc des vecteurs d'intérêt pour des applications cancer. Le génome des
5 rétrovirus comprend essentiellement deux LTR, une séquence
d'encapsidation et trois régions codantes (gag, pol et env). Dans les vecteurs
recombinants dérivés des rétrovirus, les gènes gag, pol et env sont
généralement délétés, en tout ou en partie, et remplacés par une séquence
d'acide nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à
10 partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV
("murine moloney leukemia virus"; encore désigné MoMLV), le MSV ("murine
moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus"); le SNV ("spleen
necrosis virus"); le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant l'acide
nucléique ou la cassette de l'invention, un plasmide comportant notamment
les LTR, la séquence d'encapsidation et l'acide nucléique ou la cassette est
construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite
d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales
déficientes dans le plasmide. Généralement, les lignées d'encapsidation sont
donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées
d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée
PA317 (US4,861,719); la lignée PsiCRlP (WO90/02806) et la lignée
GP+envAm~12 (WO89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants
peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer
I'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation
étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61
(1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par
des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout
30 particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus ou un rétrovirus
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recombinant défectif. Ces vecteurs possèdent en effet des propriétés
particulièrement intéressantes pour le transfert de gènes codant pour des
apolipoprotéines. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont
particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une
5 suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment
autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux
selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que
notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des
infections à partir de faibles volumes de suspension virale.
A cet égard, I'invention concerne préférentiellement un adénovirus
recombinant défectif comprenant, inséré dans son génome, un ADN codant
pour un variant de l'apolipoprotéine A-l tel que défini ci-avant.
Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre
de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux
15 contenant la séquence codant pour le variant de l'ApoA-I, pour une
implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont notamment les
cellules PA317 (US4,861,719), PsiCrip (WO90/02806) et GP+envAm-12
(US5,278,056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus
contenant une séquence nucléique codant pour un variant de l'ApoA-I selon
I'invention.
Selon un autre aspect de I'invention, le vecteur utilisé est un vecteur
chimique. Le vecteur selon l'invention peut en effet être un agent non viral
capable de promouvoir le transfert et l'expression d'acides nucléiques dans
des cellules eucaryotes. Les vecteurs chimiques ou biochimiques
représentent une alternative intéressante aux virus naturels en particulier
pour des raisons de commodité, de sécurité et également par l'absence de
limite théorique en ce qui concerne la taille de l'ADN à transfecter.
=
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Ces vecteurs synthétiques ont deux fonctions principales, compacter
I'acide nucléique à transfecter et promouvoir sa fixation cellulaire ainsi que
son passage à travers la membrane plasmique et, le cas échéant, les deux
membranes nucléaires. Pour pallier à la nature polyanionique des acides
5 nucléiques, les vecteurs non viraux possèdent tous des charges
polycationiques.
Parmi les vecteurs synthétiques développés, les polymères
cationiques de type polylysine, (LKLK)n, (LKKL)n, polyéthylène immine et
DEAE dextran ou encore les lipides cationiques ou lipofectants sont les plus
10 avantageux. Ils possèdent la propriété de condenser l'ADN et de promouvoir
son association avec la membrane cellulaire. Parmi ces derniers, on peut
citer les lipopolyamines (lipofectamine, transfectam, etc) et différents lipidescationiques ou neutres (DOTMA, DOGS, DOPE, etc). Plus récemment, il a
été développé le concept de la transfection ciblée, médiée par un récepteur,
15 qui met à profit le principe de condenser l'ADN grâce au polymère cationique
tout en dirigeant la fixation du complexe à la membrane grâce à un couplage
chimique entre le polymère cationique et le ligand d'un récepteur
membranaire, présent à la surface du type cellulaire que l'on veut greffer. Le
ciblage du récepteur à la transferrine, à l'insuline ou du récepteur des
20 asialoglycoprotéines des hépatocytes a ainsi été décrit~
L'invention concerne également toute cellule modifiée génétiquement
par insertion d'un acide nucléique codant pour un variant de l'apolipoprotéine
A-l tel que défini précédemment. Il s'agit avantageusement de cellules
mammifères, susceptibles d'être administrées ou implantées in vivo. Il peut
25 s'agir en particulier de fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes,
cellules endothéliales, épithéliales, gliales, etc. Les cellules sont
préférentiellement d'origine humaine. De manière particulièrement
avantageuse, il s'agit de cellules autologues, c'est-à-dire prélevée à partir
d'un patient, modifiées ex vivo par un acide nucléique selon l'invention en
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vue de leur conférer des propriétés thérapeutiques, puis réadministrées au
patient.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures
primaires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de
5 I'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur
prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci
peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la
technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules
peuvent être utilisées directement pour l'insertion de l'acide nucléique de
10 I'invention (au moyen d'un vecteur viral ou chimique), ou conservées, par
exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en
vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent
également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de
banques préétablies (voir par exemple EP 2284~8, EP 289034, EP 400047,
EP 456640).
Les cellules en culture peuvent en particulier être infectées par les
virus recombinants de l'invention pour leur conférer la capacité de produire
un variant de l'apoA-I biologiquement actif. L'infection est réalisée in vitro
selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le
20 type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré,
I'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le
nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien entendu que ces étapes
doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque
les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses de virus
25 recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées parl'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant
pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro.
Pour l'infection par des rétrovirus, il est également possible de co-cultiver les
cellules que l'on désire infecter avec des cellules productrices des rétrovirus
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recombinants selon l'invention. Ceci permet de s'affranchir de la purification
des rétrovirus.
Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des
cellules de mammifères génétiquement modifiées par insertion d'un acide
nucléique tel que défini ci-avant, et une matrice extracellulaire.
Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 105 à 101~
cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108. Les cellules
peuvent également être des cellules productrices de virus recombinants
contenant inséré dans leur génome un acide nucléique tel que défini ci-
10 avant.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matriceextracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support
permettant l'ancrage des cellules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de
gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion
des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser
l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents
d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que
notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine,
les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente
invention du collagène. Il peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine
ou murine. Plus préférenciellement, on utilise du collagène de type 1.
Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention
comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules.
Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique eVou chimique
eVou physique entraînant l'adhésion eVou la fixation des cellules sur le
support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit
pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux. On préfère utiliser dans le
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16
cadre de l'invention un support solide, non toxique eVou bio-compatible. En
particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou unsupport d'origine biologique (corail, os, collagène, etc).
Les implants selon l'invention peuvent être implantés en différents
5 sites de l'organisme. En particulier, I'implantation peut être effectuée au
niveau de la cavité péritonéale, dans le tissu sous-cutané (région sus-
pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle,
une tumeur, le système nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les
implants selon l'invention sont particulièrement avantageux en ce sens qu'ils
10 permettent de contrôler la libération du variant d'apoA-I dans l'organisme:
Celle-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicité d'infection et par le
nombre de cellules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit
par le retrait de l'implant, ce qui arrête définitivement le traitement, soit par
l'utilisation de systèmes d'expression régulables, permettant d'induire ou de
15 réprimer l'expression des gènes thérapeutiques.
En raison des propriétés anti-athérogènes particulièrement
remarquables des variants de l'invention, les acides nucléiques constituent
ainsi un nouveau médicament dans le traitement et la prévention des
pathologies cardiovasculaires (athérosclérose, resténose, etc).
L'invention concerne à cet effet tout composition pharmaceutique
comprenant un variant de l'apolipoprotéine A-l eVou un acide nucléique eVou
un vecteur eVou une cellule génétiquement modifiée tels que décrits ci-
avant.
La présente invention offre ainsi un nouveau moyen pour le traitement
ou la prévention des pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, en particulier
dans le domaine des affections cardiovasculaires comme l'infarctus du
myocarde, I'angor, la mort subite, la resténose, la décompensation cardiaque
et les accidents cérébro-vasculaires. Plus généralement, cette approche
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offre un moyen d'intervention thérapeutique très prometteur pour chaque cas
où un déficit d'ordre génétique ou métabolique de l'apolipoprotéine A-l peut
être corrigé.
La présente invention sera décrite plus en détail à l'aide des exemples
5 qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Liste des figures
Fig 1 : Carte de restriction du plasmide PXL2116
Fig 2 : Construction du phage M 13 portant l'exon 4 du patient.
Fig 3: Construction du vecteur portant PXL2116 muté.
Fig 4 : Etudes de turbidimétrie en fonction de la température.
Fig 5: Profils de gel filtration.
Fig 6 : Fluorescence des tryptophanes et concentration en
phospholipides par fraction pour les differents complexes.
ExemPles
Exemple 1 - Mise en évidence d'un variant ApoAI
Le variant ApoA-I Paris a été identifié et isolé à partir d'un patient
sélectionné en raison de son bilan lipidique particulier. Plus précisément, le
patient présentait le bilan lipidique suivant (nature du prélévement: sérum).
Normales
Cholestérol total 4.59 mmol/l 4.54-6.97
Triglycérides 2.82 mmol/l 0.74-1.71
HDL-cholestérol 0.25 mmol/l 0.88-1.60
LDL-cholestérol 3.06 mmol/l 2.79-4.85
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17bis
: Liste des ~qures
Fig 1 : Carte de restriction du plasmide PXL2116
Fig 2: Construction du phage M 13 portant l'exon 4 du patient.
Fig 3 : Construction du vecteur portant PXL2116 muté.
Fig 4 : Etudes de turbidimétrie en fonction de la température.
4a: turbidimetrie de l'association de différentes ApoAI et de DPMC en
absence de GndHCI (~-: témoin; ----: recombinante; -~-: plasmatique; -
o-: Paris.).
4b: turbidimetrie de l'association de différentes ApoAI et de DPMC en
présence de GndHCI (~-: témoin; ----: recombinante; -~-: plasmatique;
-o-: Paris.).
4c: turbidimetrie de l'association de l'ApoAI Paris et de DPMC (~-:
en absence de GndHCI; -3-: en présence de GndHCI (0.5M)).
4d: turbidimetrie de l'association de l'ApoAI recombinante et de
DPMC (~-: en absence de GnHCI; -O-: en présence de GnHCI (0.5M)).
4e: turbidimetrie de l'association de l'ApoAI plasmatique et de DPMC
(~-: en absence de GndHCI; -3-: en présence de GndHCI (0.5M)).
4f: effet de GndHCI (0.5M) sur l'association ApoAI / DPMC (~-: en
absence de GndHCI; -~-: en présence de GndHCI)
Fig 5: fluorescence relative des fractions de Superose 6 PG.(~-:
POPC/AI Paris; -~-: POPC/AI recombinante; ---- POPC/AI plasmatique.)
Fig 6: 6a: Fluorescence des tryptophanes et concentration en
phospholipides pour le complexe POPC/AI Paris (~-: fluorescence relative;
-~-: phospholipides).
6b: Fluorescence des tryptophanes et concentration en
phospholipides pour le complexe POPC/AI recombinante(~-: fluorescence
relative; -_-: phospholipides).
_ . ~
FEULLE MnnlFlEE
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18
Apolipoprotéine A-l 0.50 9/l 1.20-2.15
Apolipoprotéine B 1.38 g/l 0.55-1.30
Phenotype apoE: 3/3
De manière inattendue, ce patient ne présentait aucun signe
5 d'athérosclérose malgré une concentration d'HDL extrêmement faible et une
hypertriglycéridémie. Ceci a conduit les demandeurs à rechercher l'origine
de cette protection.
Isolement des HDL contenant l'a~oA-I Paris à ~artir du plasma.
Après une nuit à jeun, du sang est prélevé chez les sujets portant le
10 gène de l'apoA-I Paris. Le plasma est préparé par centrifugation lente du
sang à 4~C (2000 g, 30 minutes). Les lipoprotéines de haute densité sont
préparées par ultracentrifugation séquentielle à la densité de 1.063-1.21 g/ml
(Havel, J. Clin. Invest. 34: 1345-54, 1955). La fraction contenant les HDL est
ensuite dialysée contre du tampon Tris-HCI 10 mM, azide de sodium 0,01 %,
lS au pH 7,4.
Mise en évidence des dimères d'aooA-I Paris.
La fraction HDL dialysée est délipidée dans un mélange diethylether/
ethanol (3/1, v/v) et la contrentration de protéines est estimée par la méthode
de Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-75, 1951). Les protéines de
20 la fration HDL subissent une migration sur un gel de polyacrylamide en
présence de SDS en condition non réductrice. Cette migration permet de
mettre en évidence la taille des differentes protéines des HDL du patient.
Outre la présence des protéines correspondantes aux apoA-I et apoA-II de
tailles normales, cette analyse révèle la présence de protéines de plus hauts
25 poids moléculaires correspondant à des dimères d'apoA-I et des complexes
apoA-I et apoA-II. La présence des apoA-I et apoA-II dans ces complexes a
été vérifiée par une révélation immunologique spécifique.
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19
Mise en évidence de la différence de charge de l'apoA-I mutée
La détection de l'apoA-I mutée directement à partir du plasma a été
réalisée selon le protocole suivant (Menzel, H. J., and Utermann, G.,
Electroforesis, 7: 492-495, 1986): vingt microlitres de plasma sont délipidés
5 toute une nuit avec le mélange éthanol/ether et resuspendu dans un tampon
de dépot. Un aliquot de 5 ,ul subit une électrophorèse sur un gel de focusing
isoelectrique (pH 4-6,5, Pharmolyte), et les protéines sont ensuite
transférées sur une membrane de nylon. Les bandes correspondantes à
l'apoA-I sont détectées par une réaction immunologique à l'aide d'anticorps
10 anti-apoA-I humaine.
La détection de l'apoA-I mutée peut se faire aussi à partir des
protéines HDL. La fraction HDL dialysée est délipidée dans un mélange
diethylether/ ethanol (3/1, v/v) et la contrentration de protéines est estimée
par la méthode de Lowry (Lowry et al., J. Biol. Chem., 193:265-75, 1951).
15 Environ 100 ,ug de protéines subissent une électrophorèse sur un gel de
focusing isoelectrique (pH 4-6,5, Pharmolyte), et les protéines sont ensuite
révélées par coloration au bleu de Coomassie. Cette technique permet de
mettre en évidence que les isoformes les plus importantes des apoA-I du
patient ayant la mutation sont déplacées vers l'anode, ce qui correspond à
20 une différence de charge de -1 par rapport à la charge d'apoA-I normale.
Exemple 2 - Identification du gène et de la mutation
L'ADN génomique du patient a été isolé du sang total selon la
technique de Madisen et al. (Amer. J. Med. Genet, 27: 379-390, 1987). Le
gène de l'apoA-I a ensuite été amplifié par la technique de PCR. A cet effet,
25 les réactions d'amplification ont été réalisées sur 1 1~9 d'ADN génomique
purifié introduit dans le mélange suivant:
- 10 ,ul de tampon 10X (100 mM Tris-HCI pH 8,3; 500 mM KCI; 15
mM MgC12; 0,1 % (w/v) gélatine)
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- 10 ~I de dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2mM
- 20 pmol de chaque amorce
- 2,5 U de Taq polymérase (Perkin-Elmer)
- qsp 100 ,ul H20.
Les amorces utilisées pour l'amplification sont les suivantes:
Sq5490: 5'-AAGGCACCCCACTCAGCCAGG-3' (SEQ ID n~ 3)
Sq5491: 5'-TTCAACATCATCCCACAGGCCTCT-3' (SEQ ID n~ 4)
Sq5492: 5'-CTGATAGGCTGGGGCGCTGG-3' (SEQ ID n~ 5)
Sq5493: 5'-CGCCTCACTGGGTGTTGAGC-3' (SEQ ID n~ 6)
Les amorces Sq5490 et Sq5491 amplifient un fragment de 508 pb
correspondant aux exons 2 et 3 du gène de l'apoA-I et les amorces Sq5492
et Sq5493 amplifient un fragment de 664 pb correspondant à l'exon 4 de ce
gène.
Les produits d'amplification (deux fragments PCR de 508 et 664 pb)
15 ont ensuite été séquencés. Pour cela, une première méthode à été utilisée,
consistant à séquencer directement en utilisant le kit de séquençage de
fragments PCR (Amersham). Les amorces utilisées pour le séquençage sont
les amorces PCR, mais il peut également s'agir d'amorces internes aux
fragments (Cf amorces S4, S6 et S8 ci-dessous).
Une deuxième technique de séquençage a également été mise en
oeuvre qui a consisté à cloner les fragments PCR dans un vecteur M13
mp28. L'ADN double brin du M13 a été clivé par EcoRV puis déphosphorylé.
Ies fragment PCR ont été traités à la Klenow, phosphorylés et ligués au
vecteur M13. Les plages blanches ont ensuite été prélevées et l'ADN simple
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brin amplifié puis purifié sur le Catalyst (Applied Biosystem) a été séquencé
par une amorce -20 fluorescente (Kit PRISM dye primer et protocole n~
401386, Applied Biosystem) ou par des amorces internes aux fragments
après orientations de ceux-ci. La technique des didéoxynucléotides
5 fluorescent est alors utilisée (Kit DyeDeoxyTerminator et protocole n~
401388, Applied Biosystem)
S8 5' -TGG GAT CGA GTG AAG GAC CTG- 3' (SEQ ID n~ 7)
S4 5' -CGC CAG AAG CTG CAC CAG CTG- 3' (SEQ iD n~ 8)
S6 5' -GCG CTG GCG CAG CTC GTC GCT- 3' (SEQ ID n~ 9)
Les séquences issues de plusieurs clones ont ensuite été compilées
et comparées à la séquence de l'ApoAI. La séquence des acides aminé 148
à 154 de l'ApoAI mature est donnée ci dessous (correspondant aux résidus
172~178 sur la séquence SEQ ID n~ 1).
ATG CGC GAC CGC GCG CGC GCC
Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala
151
Une mutation C->T en premiere base du codon codant pour l'aa 151
qui code alors pour une cystéine (cf séquence SEQ ID n~ 2 ci-dessous) a été
retrouvée dans une partie des clones séquencés. Cette mutation est donc
présente à l'état hétérozygote chez le patient sélectionné.
ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC
Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala
151
L'ensemble du cDNA codant pour le variant apoA-I Paris selon
l'invention a été séquencé. Une partie de cette séquence est présentée sur
la SEQ ID n~ 10.
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Exemple 3: Construction d'un vecteur d'expression plasmidique
(pXL21 1 6mute)
L'apoAI Paris presente une mutation ponctuelie situee sur la sequence
de l'exon 4 du gene de l'apoAI du patient. La strategie de construction du
5 vecteur d'expression consiste a substituer, dans un vecteur d'expression de
l'apoAI (le vecteur pXL2116, figure 1) la region correspondant a l'exon 4
provenant du gene du patient.
3.1. Utilisation de l'exon 4 du patient cloné dans M13
L'exon 4 a été produit par PCR à partir de l'ADN purifié des cellules du
10 patient et inséré au niveau du site EcoRV du polylinker du phage M13mp28
(figure 2).
Une mutagénèse par remplacement d'un fragment de l'apo Al par un
fragment issu de M13 portant la mutation est envisagée. Il nous reste donc à
choisir les enzymes appropriées aux deux vecteurs de manière à ce qu'elles
15 génèrent des extrémités cohésives pour le vecteur issu de pXL2116 digéré et
pour l'insert issu de M13 double brin digéré.
3.2. Choix des enzymes de restriction
- Bsu361 possède dans M13 et dans pXL2116 un site unique de
restriction en amont de la mutation.
- La digéstion par BamHI, possédant un site de restriction unique à
l'extrémité 3' de l'apo Al du fait de la technique de clonage, et possédant un
site de restriction dans le polylinker de M13, nous permet:
1 ) une ligation du vecteur provenant de pXL2116 et de l'insert
provenant de M13
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2) et ce en incorporant un fragment de polylinker qui nous sera utile
pour vérifier par digestion enzymatique l'insertion du fragment muté
provenant de M13.
Il est à noter que la présence de ce fragment de polylinker n'altère en
5 rien la séquence codante de l'apo Al puisque celui-ci est situé après le
codon stop.
Le polypeptide riche en histidine dont la séquence nucléotidique a été
clonée en 5' de l'apo Al sera donc aussi synthétisé.
3.3. Construction du vecteur (figure 3).
- Le M13 rendu double brin est digéré par Bsu361/BamHI et ie produit
de la digestion est déposé sur gel. L'insert ainsi généré est récupéré en
quantité suffisante et présente bien une taille de 1 Db.
- Le pXL2116 est digéré par les mêmes enzymes mais non purifié.
De façon à éviter la religation des produits de la digestion, une
15 digestion est effectuée par Xhol qui reconnait deux sites de restriction à
l'intérieur du fragment Bsu361/BamHI.
En effet, une déphosphosylation a été d'abord tentée mais a donné de
très mauvais résultats sur boîte et aucun clone positif sur 24 testés.
Les quantités de vecteur et d'insert optimales pour la ligation ont été
20 évaluées à 50ng de vecteur pour 1 5ng d'insert.
Les souches DH5a sont transformées avec les produits des trois
ligations suivantes:
- vecteur digéré par Bsu361 et BamHI sans ligase (témoin
négatif de ligation)
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24
.
- produit de la digestion + ligase
- produit de la digestion + insert + ligase
Les cellules compétentes sont aussi transformées avec le pUC19 afin
de tester l'efficacité de la transformation.
Les résultats des cellules transformées sur boîte de milieu LB
Chloramphénicol (sélection des souches BL21 ) Ampicilline (sélection des
souches ayant intégré le plasmide) sont reproduits ci-dessous.
RESULTATS OBTENUS SUR BOITE DE PETRI
TRANSFORMATION DH5al RESULTATS INTERPRETATION
pUC19 200 clones Témoin detransformation
vecteur (+fragment) 0 clone Digestion parfaite, pas de
plasmide recircularisé
vecteur (+fragment) + ligase 160 clones Bruit de fond très
important: stratégie de
digestion supplémentaire
peu efficace
vecteur (+fragment) + ligase 120 clones ~ Effet de diminution ~ de
+ insert la ligase souvent constaté.
Les bactéries ne sont pas
obligatoirement
transformés avec une
séquence mutée correcte
48 clones sont réisolés à partir de la boîte 4.
De manière à repérer les clones positifs (c'est-à-dire ayant inséré le
fragment mute de M13), I'ADN plasmidique obtenu par purification sur
chacun des 48 clones est digéré par l'enzyme Ndel.
Si l'insert provenant de M13 a bien été inséré, on verra sur gel deux
fragments: une de 4,5kb et un de 1kb.
Si un autre évènement de ligation s'est produit, on obtiendra soit
plusieurs bandes, soit simplement un plasmide linéarisé (cas général).
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D'après le résultat du gel, les clones 7,8,13,16,26 semblent être
corrects. On sélectionne le clone qui donne un résultat net.
De manière à vérifier totalement la séquence du clone sélectionné, on
procède à six digestions enzymatiques.
La présence du polylinker donc de l'insert est ainsi vérifiée mais
l'évènement de ligation doit être aussi vérifié.
De toute évidence, la ligation est celle attendue puisque la taille du
plasmide est correcte, c'est-à-dire égale à celle du pXL2116.
Sauf évènement de mutation très rare, la séquence de l'apoAI
nouvellement clonée devrait être exacte.
Le clone 8 porte donc le plasmide px12116 muté correctement.
Exemple 4: Expression de variants apoAI recombinants
Cet exemple decrit un procede de production de variants apoAI
recombinants. Ce procede a ete realise dans une bacterie. D'autres
systemes d'expression sont utilisables a cet effet (levures, cellules animales,
etc).
4.1. Principe
L'expression du plasmide au sein de la bactérie a été placée sous le
contrôle des promoteur et terminateur T7. L'isopropyl-b-
thiogalactopyranoside (IPTG), inducteur de l'opéron lactose, induit dans ce
système la synthèse de l'ARN polym~rase T7 qui se fixe ensuite
spécifiquement sur le promoteur T7 et démarre la transcription du gène de la
protéine recombinante. L'ARN polymérase est stoppée par le terminateur T7,
ce qui évite que le flux transcriptionnel ne déborde en aval de la séquence
d'intérêt.
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26
La rifampicine est un antibiotique inhibant l'activité ARN polymérase
endogène d'E.coli . Elle inhibe donc la synthèse des protéines bactériennes,
c'est-à-dire à la fois des protéases, ce qui limite les dégradations de la
- protéine d'intérêt; et des protéines bactériennes contaminantes, ce qui
amplifie l'expression de la protéine d'intérêt.
4.2. Protocole
La souche utilisée pour l'expression est Escherichia coli BL21 DE3
pLys S. L'ADN plasmidique est introduit dans E. coli par transformation
selon les techniques classiques. La culture est conservée sous forme de
suspension congelée à - 20~C, en présence de 25% de glycérol, et aliquotée
par fractions de 500 ,ul.
Une préculture est initiée par l'addition de quelques gouttes de
suspension congelée dans 10 ml de milieu M9 ampicilline, puis incubée sur
la nuit à 37~C. Les erlens de 1 litre sont ensemencés à partir de la
préculture et placés dans un shaker à 37~C jusqu'à obtenir une DO comprise
entre 0,5 et 1 à 610 nm. L'IPTG (Bachem ref Q-1280) est alors ajouté à une
concentration finale de 1 mM. Après 15 minutes d'incubation à 37~C, la
rifampicine (Sigma) est ajoutée à une concentration finale de 100 ,ug/ml.
Puis, après 1 heure de culture, les cellules sont récupérées par
centrifugation (15 minutes, 8000 rpm) et l'expression est vérifiée par
électrophorèse en conditions dénaturantes sur un gel d'acrylamide à 15% et
par immunoblot.
Les resultats obtenus montrent que la proteine mutee s'exprime selon
un bon taux d'expression et que celle-ci est effectivement revelee par les
- 25 anticorps polyclonaux anti-apoAI.
- Exemple 5: Purification des variants apoAI recombinants
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Cet exemple decrit une methode efficace permettant de purifier les
variants apoAI recombinants selon l'invention. Il est entendu que d'autres
procedes peuvent etre utilises.
Les protéines étant exprimées dans le cytoplasme d'E. coli, leur
extraction nécessite, dans un premier temps, d'effectuer une Iyse cellulaire
suivie d'une élimination des acides nucléiques.
5.1. Lyse bactérienne
Après centrifugation de la culture, le culot bactérien est resuspendu
sous agitation douce dans du tampon de Iyse en présence d'inhibiteurs de
protéases et de ~-mercaptoéthanol.
Le ~mercaptoéthanol est un réducteur clivant les ponts disulfure
formés entre deux résidus cystéine. Il ne se forme aucun pont disulfure dans
le cytoplasme de E.coli, la présence d'un agent réducteur s'avère toutefois
nécessaire une fois les protéines extraites. En effet l'addition de 13
mercaptoéthanol dans le tampon de Iyse permet d'éviter la formation de
ponts entre les résidus cystéine des protéines bactériennes et ceux des
protéines recombinantes.
La Iyse cellulaire est obtenue par 3 fois 5 minutes de sonication dans
la glace (Vibracells sonics material, mode pulsed, output control 5), elle est
suivie par une centrifugation à 10000 rpm (1 heure, 4~C sur Beckman J2-21
M/E, rotor JA10) permettant d'éliminer les débris cellulaires. Un dosage
protéique est réalisé sur le surnageant par la méthode colorimétrique de
Bradford.
5.2. Précipitation des acides nucléiques
Elle est réalisée sur le surnageant de Iyse par une solution de sulfate
de streptomycine à 10%, à raison de 10 ml pour 10 9 de protéines, sous
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agitation magnétique douce 1 heure à 4~C. Les acides nucléiques sont
éliminés par centrifugation à 10000 rpm (1 heure, 4~C sur Beckman J2-21
M/E, rotor JA10), et la concentration en protéines du surnageant est évaluée
- par dosage colorimétrique.
A l'issu de ces deux étapes on obtient une solution protéique de
concentration connue regroupant l'ensemble des protéines intracellulaires
dont la protéine d'intérêt. Celle-ci est purifiée par des techniques
chromatographiques.
--> Chromatographie par filtration sur gel
--> Chromatographie d'affinité
5.3. Chromatographie par filtration sur gel
Le but de cette étape est l'élimination de l'EDTA, molécule interférant
avec les conditions requises pour la chromatographie d'affinité. Pour cela le
support Tris-acryl GF 05 (Sepracor) a été retenu. Ce gel permet la
15 séparation des molécules dont la Masse Moléculaire (MM) est comprise
entre 300 et 2500 daltons, et l'exclusion des molécules de MM supérieure à
2500 daltons, dont les protéines. Ce gel présente d'autre part l'intérêt de
posséder une bonne résistance à la pression, ce qui permet de travailler à
débit élevé sans modifier la résolution. La chromatographie du Iysat
bactérien est réalisée en tampon phosphate pH8. La concentration protéique
dans le volume d'exclusion est déterminée, et éventuellement ajustée à 4
mg/ml par dilution dans le tampon phosphate pH8.
Cette étape peut être remplacée par une dialyse contre 2 X 10 litres
de PBS. La solution protéique est ensuite mise en présence d'Hecameg 25
mM, ce détergent favorisant l'étape suivante de purification par diminution
des interactions protéine-protéine.
5.4. Chromatographie d'affinité
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W 096/37608 PCTA~R96/00747
29
Principe
La présence de 6 résidus histidine consécutifs associés à la protéine
recombinante lui confère une affinité particulièrement élevée pour les ions
nickel (Ni2+) (15). Ces ions Ni2+ sont fixés à une matrice d'agarose par
5 I'intermédiaire de l'Acide Nitrilo Acétique (NTA). Entre l'imidazole des
histidine et les ions nickel se produit une liaison de chélation métallique;
cette liaison est plus forte qu'une liaison ionique et moins forte qu'une liaison
covalente.
Protocole
La capacité de fixation du gel NiNTA agarose (Qiagen) est de 2 mg de
protéine pour 1 ml de gel. Ce gel est équilibré dans du tampon pH8
additionné d'Hecameg 25 mM. Les protéines bactériennes contaminantes
sont non retenues à pH8, ou éliminées à pH6, et la protéine d'intérêt est
récupérée à pH5. Ces étapes sont réalisées en présence d'hecameg 25 mM.
Les fractions (2 ml) éluées à pH5 sont additionnées de:
60 1ll de NaOH 1 M (neutralisation)
10 ,ul de PMSF 0,2M
40 ~I d'EDTA 0,1 M
Les fractions sont réunies en fonction de la concentration et de la
20 pureté de la protéine éluée. Ces caractéristiques sont analysées par
électrophorèse (PAGE-SDS 15%).
L'élution à pH5 décroche la protéine associée au nickel en agissant
sur la liaison Ni2+ - NTA. Il est donc nécessaire de dissocier ce cation de la
protéine recombinante. Cette étape est effectuée par compétition grâce à
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W 096/37608 PCT~R96/00747
une incubation sous agitation magnétique douce à 4~C pendant 1 heure en
présence d'histidine 50 mM.
5.5. Dialyses
Elles permettent d'éliminer l'histidine et le nickel. L'échantillon est
dialysé (membrane Spectra/Por MWCO 12-14000 daltons) à 4~C pendant 5
heures puis sur la nuit, contre 2 fois 10 litres de tampon PBS EDTA 2 mM.
Un dosage de protéine est finalement effectué.
Ce procede permet d'obtenir la proteine apoAI Paris sous forme
purifiee, essentiellement depourvue de proteines contaminantes.
Exemple 6: Propriétés physico-chimiques des apoA-I Paris et
apoA-I normale recombinantes.
6.1. Mesures de turbidimètrie
6.1.1. Turbidimétrie en fonction de la température
La mesure de l'absorbance des vésicules DMPC à 325 nm en
15 présence d'apoA-I est une mesure de la formation de complexes
protéoiipidiques discoïdal de petites tailles. L'analyse de variation de
température entre 1 9-28~C nous montre une diminution de l'absorbance
autour de la température de transition des phospholipides (23~C), témoin de
la formation des complexes. La figure 4 (en présence ou non de GdnHDL
20 pour éviter la formation de dimères) montre la comparaison de la formation
de ces complexes avec les apoA-lnormale et apoA-I Paris recombinantes,
ainsi que de l'apoA-I native. Ces trois protéines ont des comportements
~ assez proches mais avec pour l'apoA-I Paris, on note une tendance à
s'associer avec elle-même pour former des dimères.
6.1.2. Turbidimétrie en fonction du temps
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La baisse de turbidimétrie des vésicules de DMPC après incubation
des apoA-I a été suivie à température donnée en fonction du temps en
présence ou non de GdnHDL. La constante du temps (1/t1/2 qui correspond
à 50% de baisse de la turbidimétrie initiaie) est évaluée en fonction de 1/T
5 (température en Kelvin). La vitesse d'association est rapide pour l'apoA-I
native, plus faible pour les apoA-I recombinantes, notamment l'apoA-I Paris.
Par ailleurs, I'addition de GdnHDL augmente l'association protéine -lipides.
Ceci de façon très importante pour les apoA-I recombinantes, notamment
l'apoA-I Paris.
6.2. Spectre d'émission de fluorescence des tryptophanes
Le spectre d'émission de fluorescence des tryptophanes dans les
différentes apoA-I a été mesuré aux longueurs d'ondes entre 300 et 400 nm
(excitation à 295 nm). Les maximums d'émission sont indiqués à la Table 1
ci-dessous pour les apoA-I et pour les complexes apoA-I/cholestérol/POPC.
15 Les maximums d'émission de fluorescence des tryptophanes dans les
différentes apoA-I et complexes sont identiques indiquant que les
tryptophanes sont dans le même environnement dans les trois protéines.
Table 1
ProduitMaximum d'emission
Al Paris 335
POPC/C/AI Paris 332
Al recombinante 334
POPC/C/AI rec 332
Al plasma 336
POPC/C/AI plasma 333
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W 096/37608 PCTA~R96/00747
6.3. Isolation et caractérisation des complexes apoA-I/lipides
Des complexes avec l'apoA-I et du POPC ont été préparés par la
technique au cholate. Les complexes ont été séparés des apoA-I libres par
chromatographie de gel filtration sur une colonne Superose 6PG et leurs
5 compositions analysées. Les profils de gel filtrations sont indiqués sur la
figure 5. Un seul pic homogène est obtenu pour les complexes faits avec
l'apoA-I native tandis qu'avec les apoA-I recombinantes, des populations
hétérogènes sont observées. Les apoA-I libres sont éluées dans les fractions
20 à 24. Les concentrations en phospholipides et la fluorescence des
10 tryptophanes par fractions pour les différents complexes sont indiqués sur la figure 6.
Exemple 7 - Construction d'un vecteur adénoviral pour
l'expression de l'ApoAI mutée
Un ADNc codant pour un variant selon l'invention contenant la
15 mutation Arg -~ Cys en position 151 de l'ApoAI mature est obtenu par PCR.
Les amorces
Alm1: ATC GAT ACC GCC ATG AAA GCT GCG GTG CTG (SEQ ID
n~ 11),
Alm2: ATG GGC GCG CGC GCA GTC GCG CAT CTC CTC (SEQ ID
20 n~ 12),
Alm3: GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC CAT (SEQ
ID n~ 13)
~ et Alm4: GTC GAC GGC GCC TCA CTG GGT GTT GAG CTT (SEQ
IDn~ 14)
sont utilisées. Ies amorces Alm1 et Alm4 introduisent respectivement
des sites Clal en 5' et Sall en 3' de l'ADNc tandis que les amorces Alm2 et
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Alm3 qui sont complémentaires introduisent ia mutation. Des reactions PCR
avec les couples d'amorces AlM1-Alm2 et Alm3-Alm4 sont d'abord pratiqués
sur un ADNc de l'ApoAI non muté. Les fragments issus de ces PCR sont
ensuite réintroduits dans une troisième PCR en présence des amorces Alm1
et Alm4, ce qui génére un fragment de 822pb qui est ensuite cloné dans
pCRII (Invitrogen) pour vérification de sa séquence. Le fragment Clal /Sall
qui contient l'ADNc muté est ensuite introduit par les même sites de
restriction dans le vecteur navette pXL-RSV-LPL qui contient l'ADNc de la
LPL sous contrôle d'un promoteur LTR-RSV et avec un site de
10 polyadénylation de l'hormone de croissance bovine, ensubstitution de l'ADNc
de la LPL (FR9406759). Tout autre vecteur navette peut bien évidemment
être utilisé. Le vecteur résultant est ensuite linéarisé et cotransfecté dans
293 pour l'obtention d'adénovirus recombinants. Les adénovirus ainsi
obtenus peuvent être amplifiés sur plages, purifiés (notamment par chlorure
15 de césium) puis conservés congelés, par exemple dans du glycérol. Pour
leur utilisation thérapeutique, ils peuvent être associés à tout véhicule
pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir en particulier de solutions
salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium,
calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles,
isotoniques, ou de compositions sèches, notamment Iyophilisées, qui, par
addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent
la constitution de solutés injectables. Dans leur utilisation pour le traitementdes pathologies liées aux dyslipoprotéinémies, les adénovirus recombinants
défectifs selon l'invention peuvent être administrés selon différents modes, et
notamment par injection intraveineuse. Préférentiellement, ils sont injectés
au niveau de la veine porte. Les doses de virus utilisées pour l'injection
peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en
fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou
encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les
30 virus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme
de doses comprises entre 104 et 1 o14 pfu/ml. Pour les AAV et les
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adénovirus, des doses de 1 o6 à 1 o10 pfu/ml peuvent également être
~ utilisées. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir
infectieux d'une suspension de virions, et est déterminé par infection d'une
culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du
5 nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du
titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
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W O 96/37608 PcTl~K~lvo747
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S A
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
(B) RUE:
(C) VILLE:
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT PASTEUR DE LILLE
(B) RUE:
(C) VILLE:
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL:
(ii) TITRE DE L'INVENTION: Nouveaux variants de l'apolipoprotéine A-I
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 14
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 842 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE:
~A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..842
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= "human apo AI cDNA"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
60 ATG AAA GCT GCG GTG CTG ACC TTG GCC GTG CTC TTC CTG ACG GGG AGC 48
Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser
1 5 10 15
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W 096137608 PCT/~h~ c747
36
CAG GCT CGG CAT TTC TGG CAG CAA GAT GAA CCC CCC CAG AGC CCC TGG 96
Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp
20 25 30
GAT CGA GTG AAG GAC CTG GCC ACT GTG TAC GTG GAT GTG CTC AAA GAC 144
Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp val Leu Lys Asp
35 40 45
AGC GGC AGA GAC TAT GTG TCC CAG TTT GAA GGC TCC GCC TTG GGA AAA 192
0 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys
50 55 60
CAG CTA AAC CTA AAG CTC CTT GAC AAC TGG GAC AGC GTG ACC TCC ACC 240
Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr
65 70 75 80
TTC AGC AAG CTG CGC GAA CAG CTC GGC CCT GTG ACC CAG GAG TTC TGG 288
Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp
85 90 95
GAT AAC CTG GAA AAG GAG ACA GAG GGC CTG AGG CAG GAG ATG AGC AAG 336
Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys
100 105 110
GAT CTG GAG GAG GTG AAG GCC AAG GTG CAG CCC TAC CTG GAC GAC TTC 384
Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe
115 120 125
CAG AAG AAG TGG CAG GAG GAG ATG GAG CTC TAC CGC CAG AAG GTG GAG 432
Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu
130 135 140
CCG CTG CGC GCA GAG CTC CAA GAG GGC GCG CGC CAG AAG CTG CAC GAG 480
Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu
145 150 155 160
CTG CAA GAG AAG CTG AGC CCA CTG GGC GAG GAG ATG CGC GAC CGC GCG 528
Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala-
165 170 175
CGC GCC CAT GTG GAC GCG CTG CGC ACG CAT CTG GCC CCC TAC AGC GAC 576
Arg Ala Hls Val Asp Ala Leu Arg Thr Hls Leu Ala Pro Tyr Ser Asp
180 185 190
GAG CTG CGC CAG CGC TTG GCC GCG CGC CTT GAG GCT CTC AAG GAG AAC 624
Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn
195 200 205
GGC GGC GCC AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC ACC GAG CAT CTG 672
Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu
210 215 220
AGC ACG CTC AGC GAG AAG GCC AAG CCC GCG CTC GAG GAC CTC CGC CAA 720
Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln
225 230 235 240
GGC CTG CTG CCC GTG CTG GAG AGC TTC AAG GTC AGC TTC CTG AGC GCT 768
Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala
245 250 255
CTC GAG GAG TAC ACT AAG AAG CTC AAC ACC CAG TGA GGCGCCCGCC 814
Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln *
260 265
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W 096/37608 PCTA~R96t00747
GCCGCCCCCC TTCCCGGTGC TCAGAATA 842
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
~ ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iv) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo saplens
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..21
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= "variant apo AI cDNA"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC 21
Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= Sq5490
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AAGGCACCCC ACTCAGCCAG G . 21
50 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
( c ) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S~5491
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
TTCAACATCA TCCCACAGGC CTCT 24
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W 096/37608 PCTA~R96/00747
38
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= Sq5492
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CTGATAGGCT GGGGCGCTGG 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: 1i ne~ ire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= Sq5493
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CGCCTCACTG GGTGTTGAGC 20
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(c) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S8
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
TGGGATCGAG TGAAGGACCT G 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
( ix ) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S4
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
CA 022l87~9 l997-ll-06
W 096/37608 PCT~R96/00747
39
CGCCAGAAGC TGCACCAGCT G 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lineaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= S6
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUEN OE: SEQ ID NO: 9:
GCGCTGGCGC AGCTCGTCGC T 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 603 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:1..603
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
CTA AAG CTC CTT GAC AAC TGG GAC AGC GTG ACC TCC ACC TTC AGC AAG 48
Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys
1 5 10 15
CTG CGC GAA CAG CTC GGC CCT GTG ACC CAG GAG TTC TGG GAT AAC CTG 96
Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu
20 25 30
GAA AAG GAG ACA GAG GGC CTG AGG CAG GAG ATG AGC AAG GAT CTG GAG 144
Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu
' 45
GAG GTG AAG GCC AAG GTG CAG CCC TAC CTG GAC GAC TTC CAG AAG AAG 192
Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys
50 55 60
TGG CAG GAG GAG ATG GAG CTC TAC CGC CAG AAG GTG GAG CCG CTG CGC 240
Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg
65 70 75 80
GCA GAG CTC CAA GAG GGC GCG CGC CAG AAG CTG CAC GAG CTG CAA GAG 288
Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu Hls Glu Leu Gln Glu
AAG CTG AGC CCA CTG GGC GAG GAG ATG CGC GAC TGC GCG CGC GCC CAT 336
Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Cys Ala Arg Ala His
100 105 110
CA 022l87~9 l997-ll-06
W 096137608 PCTn~R96/00747
.
GTG GAC GCG CTG CGC ACG CAT CTG GCC CCC TAC AGC GAC GAG CTG CGC 384
Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg
115 120 125
CAG CGC TTG GCC GCG CGC CTT GAG GCT CTC AAG GAG AAC GGC GGC GCC 432
Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala
130 135 140
AGA CTG GCC GAG TAC CAC GCC AAG GCC ACC GAG CAT CTG AGC ACG CTC 480Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu
145 150 155 160
AGC GAG AAG GCC AAG CCC GCG CTC GAG GAC CTC CGC CAA GGC CTG CTG 528
15 Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu
165 170 175
CCC GTG CTG GAG AGC TTC AAG GTC AGC TTC CTG AGC GCT CTC GAG GAG 576
Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu
180 185 190
TAC ACT AAG AAG CTC AAC ACC CAG TGA 603
Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln *
195 200
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( i i ) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alml
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:
ATCGATACCG CCATGAAAGC TGCGGTGCTG 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYP~: nucleotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: lineaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alm2
(xi) D~SCRIPTION DE LA SEQUEN OE: SEQ ID NO: 12:
ATGGGCGCGC GCGCAGTCGC GCATCTCCTC 30
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
CA 022l87~9 l997-ll-06
W096/37608 PCTA~R96/00747
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alm3
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:
GAGGAGATGC GCGACTGCGC GCGCGCCCAT 30
15 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de bases
~B) TYPE: nucléotide
(c) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE:
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product= alm4
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
GTCGACGGCG CCTCACTGGG TGTTGAGCTT 30
