Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02224411 lsss-ol-oC.
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
NOUVEAUX INHIBITEURS DE FARNESYL TRANSFERASE, LEUR
PREP'ARAT~ON EI T F.~, COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUF~.
QUI LES CONTTFl~NENT
La p..~se,.~e invention c--n~ç~ne de nouveaux inhihit~l~ de farnésyl
5 I~ rélase de formule générale:
R'2
X~ N ~ COOR
,~, R2
~J 3 (I)
Rl~<N 'R'
~1 Y
éventuellement leurs sels, leur préparation et les compositions ~h~ elltiq~ qui les
c~nti~nn~nt
L'inhibition de la farnésyl transférase et, par conséquent, de la farnésylation de
la protéine Ras, bloque la c~qp~cite de la protéine Ras mutée à transformer les cellules
normales en cellules cancéreuses.
La séquence C-termin~l~ du gène Ras contient le motif "CAAX" ou "Cys-
Aaa1-Aaa2-Xaa" dans lequel Aaa ~pl~sel.le un ~min~ e ~lirh~tique et Xaa
représente un ~minoaci(le quelconque.
Il est connu que des tétrapeptides avec une séquence CAAX peuv~ inhiber
la farnésylation de la protéine Ras. Par exemple, dans la ~lem~n~i~ PCT WO 91/16340
et dans la ~lem~n~e EP 0 461 869 ont été décrits des peptides inhihi~.~ de la farnésyl
transférase Cys-Aaal-Aaa2-Xaa qui sont particulier~melll représentés par les peptides
Cys-Val-Leu-Ser, Cys-Val-Ile-Met et Cys-Val-Val-Met qui ma~Lre~ t leur activité
inhibitrice à des c~nc~ntrations voisines de 10-6 ou de 10-7M.
Il a ~ ;n~ nt été trouvé, et c'est ce qui fait l'objet de la présente invention,que les peptides de formule générale (I) manir~enl leur activité inhihitriee (ICso) à
des concentrations de l'ordre de 10-8 ou de 10-9M.
Dans la formule générale (I),
Rl représente un radical de formule générale Y-S-Al- dans lequel Y représente unatome d'hydrogène, ou un reste d'~mino~ci-le ou un reste d'acide gras ou un radical
CA 022244ll lsss-0l-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
alkyle ou alkoxy-;a~ yle ou un radical R4-S- dans lequel R4 représente un radical
aLkyle contenant 1 à 4 atomes de carbone éventuellement sllhstitllç par un radical
phényle ou un radical de formule générale:
Rl 2
S~,N~COOR
R2 (II)
X,><YNl R'
5 dans laquelle A1, X, Xl, Y1, R'l, R2, R'2 et R sont définis comme ci-après, et Al
représente un radical alcoylène droit ou ramifié con~l~ 1 à 4 atomes de carbone
éventuellerr.ent sllhstitl~? en a du groupement >C(Xl)(Yl) par un radical amino,alkylamino c-)ntçn~nt 1 à 6 atomes de carbone en chaîne droite ou ramifiée,
dialkylamino dont chaque partie alkyle contient 1 à 6 atomes de carbone en châîne
10 droite ou ramifiée, alcanoylamino contenant 1 à 6 atomes de carbone en châîne droite
ou ramifiée ou alkoxy~;~ubollylamino dont la partie alkyle contiçnt 1 à 6 atomes de
carbone en chaîne droite ou ramifiée,
X1 et Yl l~r~sç~ chacun un atome d'hydrogène ou forment ~n~.mhl~: avec
l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O,
15 R'l représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle droit ou ramifié conle.l~Qt 1
à 6 atomes de carbone,
X représente un atome d'oxygène ou de soufre,
R2 représente un radical alkyle, alkényle ou alkynyle droit ou ramifié conten~nt 1 à 6
atomes de carbone éventuellement substitué par un radical hy~cy, alkoxy colllena,-t
20 1 à 4 atomes de carbone, mercapto, alkylthio contenant 1 à 4 atomes de carbone,
alkylsulfinyle conten~nt 1 à 4 atomes de carbone ou alkylsulfonyle c-)nt-on~nt 1 à 4
atomes de carbone. étant çnt~.n~lu que, lorsque R2 représente un radical alkyle
substitué par un radical hydroxy, R2 peut former avec le radical carboxy en a une
lactone,
25 R'2 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle droit ou ramifié contenant 1
à 6 atomes de carbone, et
CA 022244ll l998-0l-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle cont~n~nt 1 à 6 atomes de
p carbone éventuellement ~uhstitt~é par un radical alcoxy contenan~ 1 à 4 atomes de
carbone, alcoylthio c nt~ l 1 à 4 atomes de carbone, alkylsulfinyle co~lç~A~Il 1 à 4
atomes de carbone, alkylsulfonyle cont~n~nt 1 à 4 atomes de carbone, phényle,
5 phénoxy, phénylthio, pl~ yl~ulfinyl, phénylsulfonyl, alcoylamino collleilAI~l 1 à 4
atomes de carbone, dialcoylamino dont chaque partie alcoyle contiçnt 1 à 4 atomes de
carbone, ou un radical phényle éventuellement substitué par un ou plusieurs atomes ou
radicaux choisis parmi les atomes d'halogène et les radicaux alcoyles, alcoyloxy,
alcoylthio ou alcanoyle,
10 étant ~?nt~Pn~iu que le radical
\
X~><yl 1
est en position -3 ou -4 du noyau naphtyle.
Plus particulièrement,
Rl représente un radical de formule Y-S-Al- dans lequel Y représente un atome
d'hydrogène ou un reste lysine ou un reste d'acide gras contçn~nt jusqu'à 20 atomes de
carbone et Al représente un radical éthylène ou propylène éventuellement ~1lhstih~é
par un radical amino,
Xl et Yl représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment ~n~çmklç avec
l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O,
R' 1 représente un atome d'hydrogène ou un radical méthyle,
X représente un atome d'oxygène,
R2 représente un radical allcyle contçnAnt 1 à 4 atomes de carbone év~nt~ m~nt
sl1hstih~é par un radical hydroxy, méthoxy, mercapto, méthylt~tio, méthylsulfinyle ou
méthylsulfonyle,
o 25 R'2 ~~p esellte un atome d'hydrogène ou un radical méthyle, et
R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle contenant 1 à 4 atomes de
carbone, év~nh1~llernçnt substitué par un radical alcoxy, ou un radical phényle. Plus particulièrement encore,
CA 02224411 1998-01-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
R1 représente un radical de formule Y-S-A1- dans lequel Y leplésel~te un atome
d'hydrogène et A1 représente un radical éthylène ou propylène év~nt~lell~m~nt
s~lhstittlé par un radical amino,
X1 et Yl représont.ont chacun un atome d'hydrogène ou forment ~n.~mhle avec
l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O,
R'1 représente un atome d'hydrogène,
X représente un atome d'oxygène,
R2 repfesenLe un radical méthyle, éthyle, propyle ou butyle év~ntllell~m~nt suhstit~lP
par un radical hy~oxy, méthoxy, mercapto ou méthylthio,
R'2 représente un atome d'hydrogène, et
R reprèsenle un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle c--nten~nt 1 à 4 atomes de
carbone.
Tout particulièrement intéressants sont les produits de formule générale (I)
dans laquelle R1 représente un radical mercapto-2 éthyle ou amino-1 mercapto-2
éthyle, Xl et Yl représentent chacun un atome d'hydrogène ou forment oncemhle avec
l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O, R'1 rep~és~e un atome
d'hydrogène, X ~presenle un atome d'oxygène, R2 représeellle un radical n.butyle ou
méthylthio-2 éthyle et R'2 représente un atome d'hydrogène, et R replésellle un atome
d'hydrogène ou un radical méthyle.
La présente invention concerne ég~lemlont les formes stéréoisomères des
produits de formule générale (I). Les restes des ~min~ ides représentés par
R1C(X1)(Y1)(NR'1) et R'2CH(NR'2)CO-OH ont de préférence la configuration des
~min~ idP~ naturels.
La présente invention c~-nç~rne ég~lem~nt les sels minéraux ou organiques
des produits de formule générale (I).
Les nouveaux produits selon l'invention peuvent etre préparés par application
des méthodes connues dérivées des méthodes lltili~é~s plus particulièrement en chimie
peptidique pour l'assemblage de chames.
Généralement, les produits de formule générale (I), dans laquelle X1 et Y
forment ensemble avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O et
X représente un atome d'oxygène sont obtenus à partir de l'acide 3- ou 4-nitro-
CA 02224411 1998-01-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
ns~rht~l~n~-l-carboxylique sur lequel est con-len~e un ~mino~ le de formule
générale:
HN ~ COOR' (III)
dans laquelle R2 et R'2 sont définis comme précér~emm~nt et R' représente un radical
5 alcoyle cn..lP~ . 1 à 4 atomes de carbone, év~ntu~llem~.nt sllbsti1l~é par un radical
phényle, de ~léréreQCê UQ radical tert-butyle, en opérant en présence d'un agent de
c-)n-l~n~ation, tel que l'hydro~cyL~ ,o~ 7.ole et le dicyclohexylcarbo~ mi~le~ et d'une
base, telle que la triéthylamine, dans UQ SolVaQt organique, tel que le dirnéthyl-
form~micle, pour donner un produit de forrnule générale:
X~N ~ COOR'
,~ R2
~J 3 (IV)
~ NO2
dans laquelle X représente un atome d'oxygène, R2, R'2 et R' sont définis comme
précé~emm~nt qui est réduit, de préférence au moyen de chlorure stanneux, en produit
de formule générale:
R'~
X~, N ~, COOR'
0~ ~ R7 (V)
~ NH2
15 dans laquelle X représente un atome d'oxygène, R2, R'2 et R' sont définis comme
précédemment, sur lequel est condensé un produit de formule générale:
R~ \,OH
Xl/\Yl (VI)
CA 02224411 lsss-0l-05
WO 97/03047 PCTrFR96/0l071
dans laquelle Rl est défini comme précéslçmm~nt et Xl et Yl forment ~n~mhle avecl'atome de carbone auquel ils sont liés un groupement >C=O, étant ~nl~ J que lesfonctions amino et mercapto portées par Rl sont évçnttlell~ment protégées par des
groupements protecteur~ appr~priés tel qu'un radical trityle pour la fonction mercapto
5 ou un radical tert-butoxycarbonyle pour la fonction amino, en opérant de ~lérer~nce
en présence d'un halogénoformiate d'alcoyle (chlolurc"lniate d'isobuty-le) et d'une base
or~niqlle (N-~ yllllolplloline) dans un solvant organique inerte (tétrahy l,~fu~ e)
pour obtenir un produit de formule générale:
lR~2
X~,N~,COOR'
R2
~J 3 (VII)
Rl ~<N'R'
Xl Yl
dans laquelle les symboles X, X1, Y1, R1, R'1, R2, R'2 et R' sont définis comme
précé lemm~nt dont les groupements protecteurs sont remplacés par des atomes
d'hydrogène, au moyen d'acide trifluoroacétique en présence d'éth~n~litiol, lorsque les
groupements protecteurs représ~ntf~nt des radicaux trityle, tert-bu~yc;a,l,onyle ou
tert-butyle, pour obtenir un produit de formule générale (I) dans laquelle X1 et Y
15 forment ~n~emblf~ avec l'atome de carbone auquel ils sont liés un gro--~ment >C=O.
Génér~lemçnt les produits de formule générale (I) dans laquelle les symboles
X1 et Y1 repr~.sentent chacun un atome d'hydrogène peuvent être obtenus par action
d'un aldéhyde de formule générale:
R1-CHO (VIII)
20 dans laquelle Rl est défini comme précécl~mm~nt étant f~nt~n~lu que les f~)n~ti~n~
amino et mercapto portées par R1 sont éventuellement protégées par des groupements
protecteur.s appropriés tel qu'un radical trit.,vle pour la fonction mercapto ou un radical
tert-butoxycarbonyle pour la fonction amino, sur un produit de formule générale (VI)
en présence d'un agent réducteur tel que le cyanoborohydrure de sodium, le
25 borohydrure de sodium, le triacétoxyborohydrure de sodium ou l'hydrogène en
CA 02224411 1998-01-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
présence d'un catalyseur. Génér~lem~nt la réaction s'effectue dans un solvant
organique tel qu'un alcool comme le m~thz~nol éventuellement en association avec un
autre solvant organique tel qu'un éther comme le tétrahydrofuranne. Il est particulière-
~ ment avantageux d'opérer en milieu anhydre.
La c-~n~1~n~tion de l'aldéhyde avec l'amine étant réalisée, les groupements
pr~tecteurs sont r~mrl~c~-~ par des atomes d'hydrogène par applic~tic)n des techniques
h~hi~-Pll~ Ainsi, les groupements protecteurs Boc ou trityle ou tert-butyle peuvent
être remplacés par des atomes d'hydrogène au moyen d'acide trifluoroacétique en
présence d'éth~n~ithiol ou de triéthylsilane.
Génér~lement, les produits de formule générale (I) dans laquelle X représente
un atome de soufre peuvent être obtenus à partir d'un produit de formule générale (IV)
dans laquelle X représente un atome d'oxygène par thion~tinn~ génér~lem~nt avec le
réactif de Lawe:j~on, puis en effectuant les étapes de réduction, de c~-n~l~n.~tion ou
d'~min~tion réductrice selon le cas et de déprotection décrites précé~e------e-~l pour la
p-~p~lion d'un produit de formule générale (I) dans laquelle X représente un atome
d'oxygène.
Lorsque dans la formule générale (I) le symbole R2 forme avec la fonction
c~l~xy en a une lactone, le traitement en milieu basique du produit correspondant
conduit au produit de formule générale (I) dans laquelle R2 représente un radical
aLkyle sl-hstit~e par un radical hydroxy. Généralement, l'ouverture de la lactone
s'effectue dès que le pH devient supérieur à 7. Il est particuliè~m~ll avantageux
d'opérer en présence d'une base minérale (soude, potasse) en milieu hydro-alcoolique
tel qu'un mélange eau-méthanol.
Les produits de formule générale (I) dans laquelle R représente un radical
alcoyle éventuellement sllhstit~ ou un radical phényle év~ntllell~.m~nt substitué
comme indiqué precé~iemm~nt peuvent être obtenus par estérification d'un produit de
formule générale (I) dans laquelle R représente un atome d'hydrogène dans les
conditions habituelles d'estérification qui ne touchent pas au reste de la molécule.
Les produits de formule générale (I) dans laquelle R représente un atome
d'hydrogène peuvent aussi être obtenus par saponification d'un produit de formule
CA 02224411 1998-01-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
générale (VI) suivi du rempl~cQm~nt des ~ments protecte lr~ portés par Rl dans
les conditions décrites précé~1emm~nt
L'acide 3-nitro-n~pht~lène-1-carboxylique peut être préparé selon la méthode
décrite par T. NAKAYAMA et Coll., Chem. Pharm. Bull., 32, 3968 (1984).
L'acide 4nitro-n~pht~l~ne-1-carboxylique peut être préparé selon le procédé
décrit par GJ. LEUCK et R.P. PERKINS, J. Amer. Chem. Soc., 51, 1831 (1929).
Les produits de formule générale (I) ~uvenL être purifiés selon les méthodes
habituelles telles que la chromatographie.
Les exemples sl~iv~lLs illustrent la plépalaLion des produits selon l'invention.
FXFl\~pLE 1
On prépare l'acide 4-nitro-naphtalène-1-carboxylique selon la méthode de
GJ. LEUCK et R.P. PERKINS, J. Amer. Chem. Soc., 51, 1831 (1929).
A une solution de 14,5 g d'acide 4-nitro-n~pht~l~n~-1-carboxylique dans
290 cm3 de chlo,~ .ne et de 87 cm3 de diméthylforrn~mi-l~o, on ajoute 14,67 g dechlo.hy~l.dt~ de l'ester méthylique de la L-méthionine, 9,93 g de 1-hydroxy-
benzotriazole, 7,5 cm3 de triéthylamine et 15,16 g de dicyclohexylcarbo liimi~ Le
mélange réactionnel est agité pendant 3 jours à une température voisine de 20~C puis
filtré sur verre fritté, lavé par 200 cm3 de dichlorométh~ne La solution organique est
lavée 2 fois par 200 cm3 d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 10 %
(p/v) puis par une solution aqueuse d'acide citrique à 10 % (p/v), par de l'eau distillée
puis par une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. La phase or~ni~ue est
séchée sur sulfate de m~g.,é~ , filtrée puis concentrée à sec sous pression réduite.
On obtient 24,5 g d'une huile que l'on purifie par chromatographie sur silice en éluant
avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volumes). On obtient ainsi 19 g
de l'ester méthylique de la N-[(4-nitro-naphtyl)-1-carbonyl]-L-méthionine sous forme
d'une huile orange.
A une solution de 9,5 g de l'ester méthylique de la N-[(4-nitro-naphtyl)-1-
carbonyl]-L-méthionine dans 140 cm3 d'éthanol, on ajoute 29,5 g de dihydrate de
chlorure d'étain (II). Le mélange réactionnel est agité pendant 30 minut~ à une
température voisine de 70~C, puis refroidi à une température voisine de 20~C. Le
CA 022244ll l998-0l-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
mPl~n~e ré~ctionn~l est versé sur de la glace puis amené à pH voisin de 7-8 par
addition d'une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium à 5 % (p/v). Le
mélange obtenu est filtré sur verre fritté garni de célite. On ajoute 1000 cm3 d'acétate
d'éthyle. La phase organique est séparée par dPc~nt~tion et lavée par 800 cm3 d'eau
5 ~ tillPe La phase organique est séchée sur du sulfate de m~ c;..n~, filtrée etcon~ntrée à sec sous pression réduite. L'huile orange obtenue est purifiée par
chromatographie sur silice en éluant avec un mPl~n~ cyclohexane-acétate d'éthyle (1-
1 en volumes). On obtient ainsi 3,6 g d'ester méthylique de la N-[(4-amino-naphtyl)-1-
carbonyl]-L-méthionine sous forme d'une huile dont les caractéristiques sont les10 suiv~lLes:
- spectre de masse (IE): M/Z = 332 (M+)
A une stll~til~n de 3,6g d'ester méthylique de la N-[(4-amino-naphtyl)-1-
carbonyl3-L-méthionine dans 240 cm3 d'acétonitrile on ajoute 9,71 g de
S-triphénylméthyl-N-tert-butoxycarbonyl-cystéinal préparé selon le procédé décrit
dans le brevet EP-0 618 221, 0,62 cm3 d'acide acétique, du tamis moléculaires (3A)
puis 2,04 g de cyanoborohydrure de sodium. Le mélange réactionnel est agité pendant
3 jours à une température voisine de 20~C puis filtré sur verre fritté garni de célite. Le
verre fritté est lavé par de l'acétate d'éthyle. Le filtrat est conce"L.e sous pression
réduite. On obtient une meringue qui est purifiée par chromatographie sur silice en
20 éluant avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (7-3 en volumes). On obtient
1,3 g de l'ester méthylique de la N-~4-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-
triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-1-carbonyl]-L-méthionine sous forme d'un
solide jaune dont les caractéristiques sont les suivantes:
- spectre de masse (LSIMS): M/Z = 764 (MH+)
A une solution de 0,63 g d'ester méthylique de la N-[4-(2(R)-tert-butoxy-
carbonylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino) -naphtyl- 1 -carbonyl] -L-
méthionine dans 3,3 cm3 d'eau distillée et 13 cm3 de tétrahydrofuranne, on ajoute
0,071 g de lithine hydratée. La solution est agitée pendant 20 heures à une température
voisine de 20~C, puis concentrée sous pression réduite. Le résidu est dissous dans de
l'eau distillé puis amené à pH = 2 par addition d'une solution d'acide chlorhydrique N.
CA 022244ll lsss-ol-o~
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
La phase aqueuse est extraite 3 fois par 25 cm3 d'acétate d'éthyle. Les phases
organiques sont réunies, lavées avec une solution aqueuse saturée de chlorure desodium, sé~h~es sur du sulfate de m~gn~Sil1m~ filtrées et conc~ntrées à sec souspression réduite. On obtient 0,6 g de N-[4-(2(R)-tert-buto~ycaLlJol,ylamino-3-
triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl- 1 -carbonyl] -L-méthionine sous forme
d'une m~rin~l~.
A un mélange de 0,6 g de N-[4-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-triphényl-
méthylthio-propylamino)-naphtyl-l-carbonyl]-L-méthionine dans 3,8 cm3 de
dichlorométhane, on ajoute, à une température voisine de 20~C, 0,15 cm3 de
triéthylsilane et 0,61 cm3 d'acide trifluoroacétique. Le mélange réactionnel est agité
pendant 2 heures à une température voisine de 20~C, puis c- n~ntré sous pressionréduite. Le résidu est trituré 3 fois par 15 cm3 d'éther ~lyliq~le puis séché sous
pression réduite. Le résidu est purifié par chromatographie liquide à haute
perform~n~çs (phase C18) en éluant avec un mélange acétonitrile-eau conten~nt 0,1 ~o
d'acide trifluoroacétique. On obtient 0,13 g de trifluoroacétate de la N-[4-(2(R)-
amino-3-mercapto-propylamino)-naphtyl-1-carbonyl]-L-méthionine sous forme d'une
poudre dont les caractéristiques sont les suivantes:
- spectre de rés~ n~nce m~n.?ti~lue nucléaire du proton (400 MHz; (CD3)2SO d6;
en ppm): 2,05 (mt, 2H: CH2); 2,08 (s, 3H: SCH3); 2,60 (mt, 2H: SCH2); 2,86
(mt, 2H: CH2S); de 3,40 à 3,70 (mt, 3H: NCH2CHN); 4,55 (mt, lH: CHCOO);
6,65 (d, J = 8 Hz, lH: H en 3); 6,69 (mt, lH: ArNH); de 7,40 à 7,60 (mt, 2H: H en
6 et H en 7); 7,60 (d, J = 8 Hz, lH: H en 2); 8,10 (mf, 3H: NH3+CF3COO-); 8,20
et 8,42 (2 d, J = 8 Hz, lH chacun: H en 5 et H en 8); 8,48 (d, J = 7.5 Hz, lH:
ArCONH); 12,65 (mf, lH: COOH).
- analyse élémentaire: ClgH2sN3O3S2, 1,2 CF3CO2H:
Calculé ~o): C = 47,2; H = 4,85; N = 7,7; S = 11,78
Trouvé (5'o) : C = 46,6; H = 4,6 ; N = 7,5; S = 11,4.
CA 02224411 1998-01-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
F.XF.~PLE 2
En opérant comme dans l'exemple 1, pour la ~t;p~dLion du trifluoroacét~te de
la N-[4-(2(R)-amino-3-mercapto-propylamino)-naphtyl-1-c~l,onyl]-L-méthionine,
mais à partir de 0,65 g d'ester méthylique de la N-~4-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-
3-triphénylméthylthio-propylamino) -naphtyl- 1 -carbonyl] -L-méthionine, on obtient
0,07 g de trifluoroacétate de l'ester méthylique de la N-[4-(2(R)-amino-3-mercapto-
propylamino)-naphtyl-1-carbonyl]-L-méthionine dont les caractéristiques sont lessuivantes:
- spectre de résonance m~gn~tique nucléaire du proton (300 MHz; (CD3)2SO d6;
en ppm): 2,07 (mt, 2H: CH2); 2,09 (s, 3H: SCH3); 2,63 (mt, 2H: SCH2); 2,90
(mt, 2H: CH2S); de 3,40 à 3,70 (mt, 3H: NCH2CHN); 3,70 (s, 3H: COOCH3);
4,62 (rnt, lH: CHCOO); 6,65 (d, J = 8 Hz, lH: H en 3); 6,73 (mt, lH: ArNH); de
7,40 à 7,60 (mt, 2H: H en 6 et H en 7); 7,63 (d, J = 8 Hz, lH: H en 2); 8,13 (mf,
3H: NH3+CF3COO-); 8,22 et 8,37 (2 d, J = 8 Hz, lH chacun: H en 5 et H en 8);
8,64 (d, J = 7.5 Hz, lH: ArCONH).
- analyse élémentaire: C20H27N3O3S2, 1,2 CF3CO2H
Calculé (~o): C = 48,19; H = 5,09; N = 7,52; S = 11,48
Trouvé (%): C = 48,6 ; H = 5,0 ; N = 7,6 ; S = 11,5.
F~xEMpLE 3
On prépare l'ester méthylique de la N-[(4-nitro-naphtyl)-1-thiocarbonyl]-L-
m~thi~)ni~e, avec un ren~1ement de 35 Yo, par le réactif de LAWESSON, selon la
méthode d'OCAIN et RICH., J. Med. Chem., 1988, 31 (11), 2195 (1988), à partir del'ester méthylique de la N-[(4-nitro-naphtyl)-1-carbonyl]-L-méthionine.
A une solution de 1,1 g d'ester méthylique de la N-[(4-nitro-naphtyl)-1-
~ioc~l,o,lyl]-L-méthionine dans 5,8 cm3 d'éthanol et 23 cm3 d'acétate d'éthyle, on
ajoute 3,28 g de dihydrate de chlorure d'étain (II). Le mélange réactionnel est agité
pendant 3 heures à une température voisine de 70~C, puis refroidi à une ~ pél~ure
voisine de 20~C. Le mélange réactionnel est versé sur de la glace puis amené à pH
voisin de 7-8 par addition d'une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium à
5 ~o (p/v). Le mélange obtenu est filtré sur verre fritté garni de célite. La phase
CA 022244ll l998-0l-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
organique est séparée par ~éc~ntati~ n et la phase aqueuse est extraite s~cce jxiv~,nent
par 2 fois 20 cm3 d'acétate d'étnyle. Les phases organiques sont réunies, séchées sur
du sulfate de m~n.?~ m, filtrées et concentrées à sec sous pression réduite. On obtient
ainsi 0,74 g d'ester méthylique de la N-[(4amino-naphtyl)-1-thiocarbonyl]-
~5 m~thionine sous forme d'une poudre jaune.
A une solution de 0,74 g d'ester méthylique de la N-[(4-amino-naphtyl)-1-
thiocall,o--yl]-L-m~ionine dans 48 cm3 d'acéLuniL ile on ajoute 1,9 g de
S-triphénylméthyl-N-tert-butoxycarbonyl-cystéinal préparé selon le procédé décrit
dans le brevet EP-0 618 221, 0,12 cm3 d'acide acétique concentré, du tamis
10 moléculaires (3~) puis 0,4 g de cyanoborohydrure de sodium. Le mélange ré~cti~nel
est agité pendant 48 heures à une te~-.pé~aLuL~ voisine de 20~C puis filtré sur verre
fritté garni de célite. Le verre fritté est lavé par de l'acél(-..-il. ;le. Le filtrat est concentré
sous pression réduite. On obtient une huile orange qui est purifiée par
chrnm~tographie sur silice en éluant avec un mélange cycl- h~ ne-acétate d'éthyle (6-
4 en volumes). On obtient 0,66 g d'ester méthylique de la N-[4-(2(R)-tert-
butoxycarbonylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-1-thiocaLl o,-yl]-
L-méthionine sous forme d'une huile jaune.
- spectre de masse (LSIMS): M/Z = 780 (MH+); M/Z = 243 (CPh3)
A 0,61 g d'ester méthylique de la N-[4-(2(R)-tert-bu~oxyca.bonylamino-3-
20 triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-1-thiocarbonyl]-L-méthionine dans
3,85 cm3 de dichlor ~méth~ne et 0,15 cm3 de triéthylsilane, on ajoute, à une
le.l.pé.a~ure voisine de 20~C, 0,61 cm3 d'acide trifluoroacétique. Le mélange
réactionnel est agité pendant 2 heures à une température voisine de 20~C, puis
concentré sous pression réduite. Le résidu est trituré s~lcc~ iiv~ ent par 3 fois 5 cm3
25 d'éther éthylique puis séché sous pression réduite. Les composés sont purifiés et
séparés par chromatographie liquide à haute pe-~L~I.ance (phase C18) en éluant avec
un mélange acétonitlile-eau contenant 0,1 Yo d'acide trifluoroacétique. On obtient
0,013 g de ditrifluoroacétate du diester méthylique de la di-{N-[4-(2(R)-amino-3-
mercapto-propylamino) -naphtyl- 1 -thiocarbonyl] -L-méthionine } sous forme d'une
30 poudre.
CA 02224411 1998-01-05
WO 97/03047 PCT/I;R96/01071
Le dil.inuc"~acétate du diester méthylique de la di-{N-[4-(2(R)-amino-3-
mercapto-propylamino)-naphtyl-l-thiocarbonyl]-L-méthionine} présente les
c~ t~ri.~tirlues suLv~ll~s:
- spectre de reson~n~e m~gn~tique nuclé~ire du proton (250 MHz, (CD3)2SO d6, ~ en
ppm): 2,12 (s, 3H: SCH3); 2,20 (mt, 2H: CH2); 2,63 (mt, 2H: SCH2); 3,10 et
3,22 (2 mts, lH chacun: CH2S); de 3,50 à 3,90 (mt, 3H: NCH2CHN); 3,78 (s, 3H:
COOCH3); 5,28 (mt, lH: CHCOO); 6,65 (d, J = 8 Hz, lH: H 3); 6,69 (t, J = 6 Hz,
lH: ArNH); 7,38 (d,J = 8 Hz, lH: H 2); de 7,40 à 7,65 (mt, 2H: H 6 et H 7); de
8,10 à 8,35 (mt, 5H: NH3+CF3COO- - H 5 et H 8); 10,62 (d, J = 7.5 Hz, lH:
ArCSNH).
EXEMpr F.4
On prépare l'acide 6-nitro-naphtalène-1-carboxylique et l'acide 3-nitro-
n~pht~l~ne-l-carboxylique dans un ratio de 80/20 selon la méthode de
T.NAKAYAMA et. coll., Chem. Pharm. Bull., 32, 3968 (1984).
A une solution d'un mélange de 9,84 g d'acide 6-nitro-naphtalène-1-
c~lx~xylique et d'acide 3-nitro-naphtalène-1-c~l~xylique dans 200 cm3 de
chloroforme et de 60 cm3 de di~ lylîorm~mi~le~ on ajoute 9,9 g de chlu,vl-ydl~Le de
l'ester méthylique de la (L)-méthionine, 6,8 g de l-hydroxy-benzotri~7-)1e, 5 cm3 de
triéthylamine et 10,3 g de dicyclohexylcarbo liimi~lç Le mélange réactionnel est agité
20 pendant 2 jours à une température voisine de 20~C puis filtré sur verre fritté, lavé par
50 cm3 de chloroforme. La solution organique est lavée 2 fois par 200 cm3 d'une
solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 10 % (p/v) puis par une solution aqueuse
d'acide citrique à 10 % (p/v), par de l'eau distillée puis par une solution aqueuse
saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur sulfate de
25 m:lgn~sium, filtrée puis concentrée à sec sous pression réduite. On obtient 13,3 g d'une
huile que l'on purifie par chroma~ographie sur silice en éluant avec un mélange
cyclohexane-acétate d'éthyle (1-1 en volumes). On obtient ainsi 0,64 g de l'ester
méthylique de la N-[(6-nitro-naphtyl)-1-carbonyl]-L-méthionine sous forme d'un solide
ainsi que 3,7 g d'un mélange de l'ester méthylique de la N-[(6-nitro-naphtyl)-1-
CA 02224411 1998-01-0~
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
ca~ yl]-L-méthionine et de l'ester méthylique de la N-[(3-nitro-naphtyl)-1-carbonyl~-
L-méthionine dans un rapport 70-30.
A une solution de 3 g de mélange des esters méthyliques de la N-[(6-nitro-
naphtyl)-1-carbonyl]-L-méthionine et de la N-[(3-nitro-naphtyl)-1-carbonyl]-L-
m~hi~nine dans 140 cm3 d'éthanol, on ajoute 9,35 g de dihydrate de chlorure d'étain
(II). Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à une ~e..lpé.dLure voisine de
70~C, puis refroidi à une température voisine de 20~C. On ajoute 140 cm3 d'acétate
d'éthyle. Le mélange réactionnel est versé sur de la glace puis amené à pH voisin de 7-
8 par addition d'une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium à 5 ~o (p/v). Le
10 mélange obtenu est filtré sur verre fritté garni de célite. La phase organique est séparée
par c~ée~ntation et la phase aqueuse est extraite 3 fois par 400 cm3 d'acétate d'éthyle.
Les phases organiques sont réunies, séchées sur du sulfate de m~gn~ m, filtrées et
concentrées à sec sous pression réduite. On obtient ainsi 3 g d'une huile que l'on purifie
par chromatographie sur silice en éluant avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle
(1-1 en volumes). On obtient ainsi 1,82 g de mélange des esters méthyliques de la N-
[(6-amino-naphtyl)-1-carbonyl]-L-méthionine et de la N-[(3-amino-naphtyl)-1-
carbonyl]-L-méthionine dans un rapport 70-30, sous forme d'une huile.
- spectre de masse (DIC; NH3): M/Z = 333 (MH~)
A une solution de 1 g de mélange des esters méthyliques de la N-[(6-amino-
20 naphtyl)-1-carbonyl]-L-méthionine et de la N-[(3-amino-naphtyl)-1-carbonyl]-L-
méthionine dans 65 cm3 de méthanol on ajoute 4,16 g de S-triphénylméthyl-N-tert-butoxycarbonyl-cystéinal, préparé selon le procédé décrit dans le brevet EP-0 618 221,
0,56 cm3 d'acide acétique concentré, du tamis moléculaire (3A) puis 0,58 g de
cyanoborohydrure de sodium. Le mélange réactionnel est agité pendant 48 heures à25 une température voisine de 20~C puis filtré sur verre fritté garni de célite. Le verre
fritté est lavé par de l'acétonitrile. Le filtrat est concentré sous pression réduite. On
obtient une huile orange qui est purifiée par chromatographie sur silice en éluant avec
un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (7-3 en volumes). On obtient 1,67 g de
mélange des esters méthyliques de la N-[6-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-
30 triphénylméthylthio-propylamino) -naphtyl- 1 -carbonyl] -L-méthionine et de la N- [3-
CA 02224411 1998-01-05
WO 97/03047 PCT/FRg6/01071
(2 (R) -tert-bulu~yca~l,onylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino~ -naphtyl- 1 -
c~L~ yl]-L-méthionine dans un rapport 70-30, sous forme d'une huile jaune.
A une .~llltif~n de 0,45 g de m~l~n~e des esters méthyliques de la N-~6-(2(R)-
tert-buto~yc~l~o~ylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-1-carbonyl]-~m~th;c)nine et de la N-[3-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-l-carbonyl]-~méthi- nin~ dans 2 cm3 d'eau distillée et 20 cm3
de tétrahy~lL~ru~ e, on ajoute 0,06 g de li~ine hydratée. La soll1ti~)n est agitée
pendant 20 heures à une température voisine de 20~C, puis con(~.?ntrée sous pression
réduite. On obtient 0,4 g de mélange de la N-[6-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-
triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-l-carbonyl]-L-méthionine et de la N-[3-(2 (R) -tert-butoxycarbonylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino) -naphtyl- 1 -
carbonyl}-L-méthionine, dans un rapport 70-30, sous forme d'une meringue.
A un mel~n~e de 0,4 g de la N-[6-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-
triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-l-carbonyl]-L-méthionine et de la N-[3-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-1-
carbonyl]-L-méthicnine dans 2,2cm3 d'eau rlistillçe, on ajoute, 2 une le,~,~,dLIlre
voisine de 0~C, 2,25 cm3 d'éth~n~ithiol, puis 22,5 cm3 d'acide trifluoroacétique. Le
mélange réactionnel est agité pendant 2 heures à une température voisine de 20~C,
puis concentré sous pression réduite. Le résidu est trituré 3 fois par 15 cm3 d'éther
éthylique puis séché sous pression réduite. Le résidu est purifié par chromatographie
liquide à haute performances (phase C18) en éluant avec un mélange ~cétcnitrile-eau
conten~nt 0,1 ~o d'acide trifluoroacétique. On obtient 0,04 g de trifluoroacétate de la
N- [3 - (2 (R) -amino-3-mercapto-propylamino) -naphtyl- 1 -carbonyl] -L-méthionine sous
forme d'une poudre dont les caractéristiques sont les suivantes:
- spectre de résonance m~gnéti(lue nucléaire du proton (250 MHz, (CD3)2SO d6, ~ en
ppm): 2,07 (mt, 2H: CH2); 2,10 (s, 3H: SCH3); 2,60 (mt, 2H: SCH2); 2,90 (AB
limite, 2H: CH2S); de 3,35 à 3,60 (mt, 3H: NCH2CHN); 4,60 (mt, lH: CHCOO);
6,32 (mf, lH: ArNH); 6,95 (d, J = 2 Hz, lH: H 4); 7,10 (d, J = 2 Hz, lH: H 2);
7,22 (t large, J = 8 Hz, lH: H 7); 7,40 (t large, J = 8 Hz, lH: H 6); 7,66 (d large,
J = 8 Hz, lH: H 5); 7,97 (d large, J = 8 Hz, lH: H 8); 8,10 (mf, 3H:
CA 02224411 1998-01-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
16
NH3+CF3COO-); 8,80 (d, J = 7,5 Hz, lH: ArCONH); 12,70 (mf étalé, lH:
COOH).
- analyse élçm~nt~ire: C1gH2sN3O3S2, 1,25 CF3CO2H:
Calculé (~o): C = 46,9; H = 4,82; N = 7,6; S = 11,6
Trouvé (~ C = 46,8; H = 4,8; N = 7,7; S = 11,9.
EXF.l~IPLE 5
En opérant comme dans l'exemple 4 pour la pf~pal~lion du trifluoro~cét~te de
la N-[3-(2(R)-amino-3-mercapto-propylamino)-naphtyl-1-carbonyl]-L-méthionine,
mais à partir de 0,6g de mélange des esters méthyliques de la N-[6-(2(R)-tert-
b1lLo~cyca- 1,onylamino-3 -triphénylméthylthio-propylamino) -naphtyl- 1 -carbonyl] -L-
méthi(mine et de la N-[3-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-triphénylméthylthio-
propylamino)-naphtyl-1-carbonyl]-L-méthionine, on obtient 0,05 g de trifluoroacétate
de l'ester méthylique de la N-[3-(2(R)-amino-3-mercapto-propylamino~-naphtyl-1-
c~l~or,yl]-L-mé~ionine dont les caractéristiques sont les ~liv~Les:
- spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (400 MHz, (CD3)2SO d6 avecajout de quelques gouttes de CD3COOD d4, ~ en ppm): 2,07 (s, 3H: SCH3); 2,07
(mt, 2H: CH2); 2,60 (mt, 2H: SCH2~; 2,82 et 2,90 (2 dd, J = 15 et 6 Hz, lH
chacun: CH2S); de 3,35 à 3,55 (mt, 3H: NCH2CHN); 3,72 (s, 3H: COOCH3);
4,68 (dd,J = 10et4,5 Hz, lH: CHCOO); 6,95 (d,J =2Hz, lH: H4); 7,10 (d,J =
2 Hz, lH: H 2); 7,20 (t, J = 8 Hz, lH: H 7); 7,38 (t, J = 8 Hz, lH: H 6); 7,60 (d,
J = 8 Hz, lH: H 5); 7,95 (d, J = 8 Hz, lH: H 8).
- analyse élçmçnt~ire: C20H27N3O3S2, 1,25 CF3CO2H:
Calculé (~o): C =47,9; H = 5,05; N = 7,4; S = 11,4
Trouvé (~o): C = 47,9; H = 5,3; N = 7,6; S = 11,4.
EXEMPLE 6
On prépare le mélange des esters méthylique de la N-[(6-nitro-naphtyl)-1-
thiocarbonyl]-L-méthi~nine et de la N-[(3-nitro-naphtyl)-1-thiocarbonyl]-L-méthionine
dans un rapport 70-30, avec un rendement de 50%, par le réactif de LAWESSON,
selon la méthode d'OCAIN et RICH., J. Med. Chem, 31 (11), 2195 (1988), à partir
CA 02224411 1998-01-05
WO 97/03047 PCTlFRg6/01071
17
d'un mf~l~n~e de l'ester méthylique de la N-[(6-nitro-naphtyl)-1-c&l~..yl]-L-
mf~thionine et de l'ester méthylique de la N-[(3-nitro-naphtyl)-1-c~ -yl]-L-
m~ttlionine dans un rapport 70-30.
- spectre de masse (DIC; NH3): M/Z = 379 (MH+)
A une sol~tion de 2 g du mélange des esters méthylique de la N-r(6-nitro-
naphtyl)-1-thioc~l~..yl]-L-méthionin~ et de la N-[(3-nitro-naphtyl)-1-thioc~l,o,.yl]-
L-m~thicnine dans 10 cm3 d'éthanol, on ajoute 5,87 g de dihydrate de chlorure d'étain
(II). Le nnélange réactinnnel est agité pendant 30 minllt~s à une température voisine de
70~C, puis refroidi à une température voisine de 20~C. On ajoute 40 cm3 d'acétate
10 d'éthyle. Le mélange réactionnel est versé sur de la glace puis amené à pH voisin de 7-
8 par addition d'une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium à 5 ~o (p/v). Le
mélange obtenu est filtré sur verre fritté garni de célite. La phase organique est séparée
par ~éc~nt~tion et la phase aqueuse est extraite sllcce~ iv~:ment 3 fois par 150 cm3
d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont réunies, séchées sur du sulfate de
15 m~gn~ m, filtrées et concentrées à sec sous pression réduite. On obtient ainsi 1,8 g
du mélange des esters méthylique de la N-[(6-amino-naphtyl)-1-thiocarbonyl]-L-
méthinnine et de la N-[(3-amino-naphtyl)-1-thiocarbonyl]-L-méthionine dans un
rapport 70-30, sous forme d'une huile.
A une solution de 1,8 g du mélange des esters méthylique de la N-[(6-amino-
20 naphtyl)-1-thioca.l,o-,yl]-L-}néthionine et de la N-[(3-amino-naphtyl)-1-thiocarbonyl]-
L-méthionine dans 70 cm3 d'aceLoniL,ile on ajoute 6,9 g de S-triphé lyl--~ yl-N-tert-
bllL~xycalbol.yl-cystéinal préparé selon le procédé décrit dans le brevet EP-0 618 221,
0,91 cm3 d'acide acétique concentré, du tamis moléculaires (3A) puis 0,97 g de
cyanoborohydrure de sodium. Le mélange réactionnel est agité pendant 24 heures à25 une température voisine de 20~C puis filtré sur verre fritté garni de célite. Le verre
fritté est lavé par de l'acétonitrile. Le filtrat est concentré sous pression réduite. On
obtient une meringue qui est purifiée par chromatographie sur silice en éluant avec un
mélange dichlorométhane-acétate d'éthyle (95-5 en volumes). On obtient 1,2 g de
mélange des esters méthylique de la N-[6-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-
30 triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-1-thiocarbonyl]-L-methi~)nine et de la N-
CA 02224411 1998-01-0~
WO 97/03047 PCT/IPR96/01071
18
[3-(2(R)-tert-butoxye~l,onylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-1 -thiocarbonyl]-L-méthionine dans un rapport 70-30, sous forme d'un solide jaune.
A une solution de 0,9 g de mélange des esters méthylique de la N-[6-(2(R)-
tert-buto~yc~ l,ol,ylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino) -naphtyl- 1 -
thioc~l,onyl]-L-m~hionine et de la N-[3-(2(R)-tert-buloxyca~l,onylamino-3-
triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-l-thiocarbonyl]-L-met~ nine dans
2,25 cm3 d'eau dislillée et 22,5 cm3 de tétrahydrofuranne, on ajoute 0,17 g de lithine
hydratée. La solution est agitée pendant 20 heures à une température voisine de 20~C,
puis concentrée sous pression réduite. On obtient 0,88 g de mélange de la N-[6-(2(R)-
10 tert-butoxycarbonylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino) -naphtyl- 1 -thiocar-
bonyl]-L-méthionine et de la N-[3-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-triphényl-
méthylthio-propylamino) -naphtyl- 1 -thiocarbonyl] -L-méthionine sous forme d'une
meringue.
A 0,4 g de mélange de la N-[6-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-
15 triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-l-thiocarbonyl]-L-méthionine et de la N-
[3-(2(R)-tert-butoxycarbonylamino-3-triphénylméthylthio-propylamino)-naphtyl-1-
thiocarbonyl]]-L-méthionine dans 2,5 cm3 de dichlornméth~nP et 0,1 cm3 de
triéthylsilane, on ajoute, à une température voisine de 20~C, 2,5 cm3 d'acide
trifluoroacétique. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 heure à une température
20 voisine de 20~C, puis concentré sous pression réduite. Le résidu est trituré
successivement par 3 fois 5 cm3 d'hexane, 3 fois 5 cm3 de pentane, 3 fois 5 cm3
d'éther éthylique puis séché sous pression réduite. Les composés sont purifiés et
séparés par chromatographie liquide à haute performance (phase C18) en éluant avec
un mélange acétonitrile-eau contenant 0,1 % d'acide trifluoroacétique. On obtient
25 0,028 g de trifluoroacétate de la N-[6-(2(R)-amino-3-mercapto-propylamino)-
naphtyl-l-thiocalL,or.yl]-L-méthionine et 0,012 g de trifluoroacétate de la N-[3-(2(R)-
amino-3-mercapto-propylamino)-naphtyl-1-thiocarbonyl]-L-méthionine sous forme
de poudres.
Le trifluoroacétate de la N-[3-(2(R~-amino-3-mercapto-propylamino)-
30 naphtyl-l-thiocarbonyl]-L-méthionine présente les caractéristiques suivantes:
CA 02224411 1998-01-05
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
19 _
- spectre de r~son~n(~e m~n~ti(lue nllclé~ire du proton (400 MHz, (CD3)2SO d6, àune température de 333 K, ~ en ppm): 2,15 (s, 3H: SCH3); 2,20 (mt, 2H: CH2);
2,65 (AB limite, 2~I: SCH2~; 2,90 (AB limite, 2H: CH2S); de 3,30 à 3,60 (mt, 3H:' NCH2CHN); 5,30 (mt, lH: CHCOO); 6,15 (mf étalé, lH: ArNH); 6,95 (d,
J = 2 Hz, lH: H 4); 7,10 (d, J = 2 Hz, lH: H 2); 7,22 (t large, J = 8 Hz, lH: H 7);
7,40 (t large, J = 8 Hz, lH: H 6); 7,66 (d large, J = 8 Hz, lH: H 5); 7,96 (d large,
J = 8 H:z, lH: H 8); 8,00 (mf, 3H: NH2); 10,62 (d, J = 7,5 Hz, lH: ArCSNH).
- analyse élémçnt~ire: C19H2sN3O2S3, 1,33 CF3CO2H
Calculé (%): C = 45,2; H = 4,6; N = 7,3; S = 16,7
Trouvé(~o) :C= 45,2;H=4,4;N=7,7;S=16,2.
L'activité inhibitrice de la farné~yl~ sférase et de la farnésylation de la
protéine Ras peut être mise en évidence dans le test suivant:
L'activité farnésyltransférase est déterminée par la quantité de (3H) farnésyl
transférée à partir du (3H) farnésylpyrophosphate [(3H) FPP) sur la protéine p21H-Ras. Le mélange réactionnel standard est composé, pour un volume final de 60 ,ul,
de Tris-HCl 50mM, MgC12 5mM, dithiotréitol 5 mM, octyl-13-D-glucopyranoside
0,2 %, p21 H-ras 200 picomoles, t3H) FPP (à 61000 dpm/picomole) 4,5 picomoles.
La réaction est initiée par addition d'environ 5 ng de farnésyltransférase
hllm~in~ purifiée à partir de cultures de cellules THP1. Après incubation pendant
20 mimll~s à 37~C en plaque de micloli~ldlion contenant 96 trous de 1 cm3 par plaque
(Titer Plate~), Beckm~n), la réaction est stoppée par addition de 0,4 cm3 de SDS à
O,l ~o dans le méthanol à 0~C. Le mélange est ensuite additionné de 0,4 cm3 d'acide
trichloroacétique tTCA) à 30 ~o dans le méthanol. Les plaques sont laissées pendant
1 heure dans la glace. Le contenu précipité est alors retenu sur membrane en fibre de
verre Filtermatt~), Pharmacia) avec l'unité de filtration (Combi Cell Harvester~),
Skatron) et rincé avec de l'acide trichloroacétique à 6 ~o dans l'eau distillée. Les
membranes sont séchées au four à micro-ondes puis imprégnées de s~intill~nt par
fusion sous air chaud de Meltilex~' (Pharmacia) et enfin comptées en cpm dans uncompteur ~3-Plate~) (LKB). Chaque essai est répété 3 fois.
CA 02224411 1998-01-0
WO 97/03047 PcT/~ o7
L'unité d'activité est définie par 1 picomole de (3H~ FPP l ~l~,ré-c:e sur p21
H-Ras en 20 ~ s"
Les po~cenl~ges d'inhibition sont obtenus par compal aison des essais avec et
sans inhihit~llr après ~ ction des blancs, les ICso étant mesurées à partir des
5 inhihition~ obtenues avec 9 concentrations dirré~ es en lltili~nt les Ic~ ielc F..,rille. ~) ou Grafit~).
L'activité sur cellules peut être déterminée de la manière s,liv~te:
La lignée cellulaire est la lignée THAC (cellules CCL 39 transfectées par
Ha-Ras activé) selon K. Seuwen et coll., EMBO J., _(1) 161-168 (1988). Les cellules
10 sont ensemencées dans des boîtes de Petri de 6 cm de diamètre c-nt~n~nt un milieu
DMEM, sérum de veau foetal 5 %, G418 1 ~o.
Après 24 heures de culture, le milieu de culture est changé (avec ou sans
sérum) et le produit à étudier est ajouté en solllti(,n dans le diméLhylro....~mi~l~
(DMF), en présence ou en ~hsence de DTT (concentrations finales de 0,5 % en DMF
et 0,1mM en DTT). Après 24 heures de culture à 37~C, les cellules sont lysées dans
1 cm3 de tampon de lyse (Tris, HCl 20mM, Triton X114 1 %, MgCl2 5 mM, DTT
7 mM, NaCl 150 mM, pH = 7,4). Les lysats sont clarifiés par centrifugation à 4.000
tours/minute pendant 10 minutes L'extraction par le Triton X114 permet de séparer
la protéine Ras farnésylée de la protéine Ras non farnésylée [C. BORDIER, J. Biol.
Chem., ~ (4), 1604-1607 (1981)]. La protéine Ras farnésylée qui est plus hydro-
phohe se trouve dans la phase délergellle tandis que la protéine Ras non farnésylée est
dans la phase aqueuse. Les é~h~ntillons sont dénaturés par chauffage à 95~C dans du
tampon de dénaturation pour électrophorèse et déposées sur un gel de polyacrylamide
à 14 5~o. Lorsque le colorant atteint le bas du gel, les protéines du gel sont transférées
sur une membrane PVDF. La protéine Ras est révélée par la technique de Western
blot: la membrane est incubée avec un anticorps monoclonal spécifique anti-Ras
(pan-Ras Ab3, Oncogène Science) puis avec de la protéine A marquée à 125I. Aprèsautoradiographie, les bandes sont identifiées, découpées et comptées dans un
colll~L~ur y. La radioactivité des bandes correspondant à Ras farnésylée et à Ras non
farnésylée permet de déterminer le pourcentage d'inhibition de la farnésylation de la
protéine Ras.
CA 02224411 1998-01-0~
WO 97/03047 PCT/FRg6/01071
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau I.
,. TABLEAU I
PRODUITActivité inhibitricecell~es (I~IAC)
Exemple 1 23
Exemple 2 100 40 ~o à 10~M
Exemple4 31
Exemple 5 300
Exemple 6 55
Les no~lv~aux produits de formule générale (I) peuvent se présenter sous
forme de sels non toxiques et pharrn~celltiquement acceptables. Ces sels non toxiques
5 compre~ ent les sels avec les acides minéraux (acides chlorhydrique, sulfurique,
brornhydrique, phosphorique, nitrique) ou avec les acides organiques (acides
acétique, propionique, succinique, maléique, hydroxymaléique, benzoique,
fumarique, méth~nesulfonique, trifluoroacétique ou oxalique) ou avec les bases
minérales (soude, potasse, lithine, chaux) ou organiques (amines tertiaires comme la
10 triéthylamine, la pipéridine, la benzylamine) selon la nature des symboles R1et R du
produit de formule générale (I~.
La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques
qui cnntiçnn~nt au moins un produit de formule générale (I) en association avec un
ou plusieurs (lilll~nt~ ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables qu'ils soient
15 inertes ou physiologiquement actifs.
Ces compositions peuvent être ~rimini~rées par voie orale, parellLéldle ou
rectale.
Les compositions pour ~lministration orale co,llpre~ ent des compri.l,és,
des pilules, des poudres ou des granulés. Dans ces compositions le produit actif selon
20 l'invention est mélangé à un ou plusieurs diluants inertes tels que saccharose, lactose
ou amidon Ces compositions peuvent comprendre des substances autres que les
diluants, par exemple un lubrifiant tel que le stéarate de m~gnésillm.
CA 02224411 1998-01-0~
WO 97/03047 PCT/FR96/01071
Comme compositions liquides pour zl~imini~tration orale peuvent être
tili~ées des émulsions pharm~eutiquement acceptables, des solutions, des
s~1sp~n.~ions, des sirops, des élixirs conten~nt des diluants inertes tel que l'eau ou
l'huile de pal~rrille. Ces compositions peuvent également comprendre des s~hsf~n~es
autres que les ~ nt.c, par exemple des produits mouillants, édulcorants ou
arom~ti .~nt~
Les comp- citi-n~ selon l'invention pour aAmini.~tration palellLelale peuvent
être des solutions stériles aqueuses ou non aqueuses, des suspensions ou des
émulsions. Comme solvant ou véhicule, on peut employer le propylèneglycol, un
polyéthylèneglycol, des huiles végétales, en particulier l'huile d'olive ou des esters
organiques injectables par exemple l'oléate d'éthyle. Ces comp- ~itinn.~ peuventégalement contenir des adjuvants, en particulier des agents mo~ nt.~, émulsifiants et
dis~el~lLs. La stérilisation peut se faire de plusieurs façons, par exemple à l'aide d'un
filtre bactériologique, en incorporant à la composition des agents stérilisants ou par
chauffage. Elles peuvent être également préparées sous forme de compositions
solides stériles qui peuvent être dissoutes au moment de l'emploi dans de l'eau stérile
ou tout autre milieu stérile injectable.
Les compositions pour administration rectale sont des suppositoires qui
peuvent contenir, outre le produit actif, des excipients tels que le beurre de cacao.
Les compositions selon l'invention sont particulièrement utiles en thérapeu-
tique h1lm~ine dans le traitement de cancers d'origines diverses.
En thérapeutique humaine, les doses dépendent de l'effet recherché, de la
durée du traitement et des facteurs propres au sujet à traiter.
Généralement, les doses sont comprises, chez l'homme, entre 0,1 et
20 mg/kg par jour par voie intra-péritonéale.
L'exemple suivant illustre une composition selon l'invention.
CA 02224411 1998-01-05
WO 971030'17 PCTtFR96tO1071
F,XF.I~PT ,F.
On dissout 200 mg du produit obtenu à l'exemple 1 dans 100 cm3 de sérum
physiologique. La solution obtenue est répartie aseptiquement en ampoules de
10 cm3.
5Les ampoules sont ~rlmini~trées en injection unique ou en perfusion.
