Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
PROCEDE ET KIT POUR LA QUANTIFICATION ET LA DETECTION DES
MICRO-ORGANISMES
La présente invention concerne la quantification et
la détection des micro-organismes. Elle concerne plus
particulièrement le dosage quantitatif et/ou la détection
des micro-organismes porteurs d'un génome à ADN ou à ARN.
L~invention s'applique à tous les micro-organismes
connus, tels que des virus, bactéries, bacilles,
protozoaires, hématozoaires, porteurs d'un génome à ADN ou
à ARN, touchant l'homme, l'animal ou les végétaux, ainsi
qu'aux micro-organismes tels ~u'ils existent chez l'homme,
les animaux et les végétaux, en état pathologique ou
normal; elle s'appli~ue également à la quantification et
la détection de ces memes micro-organismes dans les
produits issus des animaux, y compris l'homme, et des
végétaux, de meme que de ceux susceptibles d'exister dans
l'eau.
La méthode selon l'invention est décrite plus loin
pour la quantification de l'infection par le virus à ARN
de l'immunodéficience humaine (VIH) et de l'infection par
le virus de l'hépatite B à ADN humain (VHB).
L'étude de l'épidémiologie, le traitement et la
prophylaxie des pathologies humaines, animales et
végétales sont de nos jours un objectif prioritaire de la
médecine humaine et vétérinaire et de l'agronomie ou de
l'industrie phytosanitaire. L'identification et la
quantification des micro-organismes dans des milieux tels
que par exemple les tissus, les fluides biologiques et les
préparations in vitro sont des étapes indispensables à la
bonne conduite de tels projets. Compte tenu de la taille
de la plupart des micro-organismes, notamment des virus,
et de leur concentration dans les milieux biologiques (en
général de l~ordre de lol à 1012 micro-organismes/ml),
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
seuls les outils technologi~ues actuels faisant appel à
l'amplification de fragments de génomes permettent à la
fois l'identification moléculaire et une évaluation
quantitative. La méthode d'amplification génomi~ue la plus
utilisée actuellement est dénommée amplification en chaîne
par polymérase ou ACP (en anglais polymerase chain
reaction ou PCR). Grâce à une enzyme, la polymérase, il
est ainsi possible d'amplifier un fragment de génome à
ADN. De même, on peut réaliser une rétrotranscription (ou
transcription réverse) d'ARN en ADN et une amplification
grâce au couple transcriptase réverse + polymérase ou à
une enzyme réalisant les deux opérations. Une fois
amplifié, ce morceau de génome ou amplificat est
spécifi~uement identifié par différentes méthodes (sonde
radioactive ou colorée, taille du fragment).
Des méthodes de quantification de VIH par ACP sont
par exemple décrites par Holodniy M. et al., dans J.
Infect. Dis. 163, 862-866 (1991); Aoki-Sei S. et al., dans
J. AIDS Res. Hum. Retrovirus 8, 1263-1270 (1992);
Bagnarelli P. et al., dans J. Virol. 66, 7328-7335 (1992);
Piatak Jr. M. et al., dans Science 259, 1749-1755 (1993);
Bruisten S.M. et al., dans AIDS 7 (suppl. 2), S15-S20
(1993).
Des méthodes de quanti~ication d'ARN du virus de
l'hépatite C ont été décrites par exemple par Kumar U. et
al., dans J. Virol. Methods 47(1-2), 95-102 (1994); Manzin
A. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(8), 1939-44 (1994);
Ravaggi A. et al., J. Clin. Microbiol. 33(2), 265-9
(1995); Young K.K. et al., J. Clin. Microbiol. 33(3), 654-
7 (1995).
Des méthodes de quanti~ication d'ADN du virus del'hépatite B ont été décrites par exemple par Lehtovaara
P. et al., dans PCR Methods Appl. 3(3), 169-75 (1993); Wu
J. et al., dans J. Virol. Methods g9(3), 331-41 (1994);
Zaaijer H.L. et al., dans J. Clin. Microbiol. 32(9), 2088-
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
91 (1994); Kaneko S. et al., dans J. Clin. Microbiol.
27(9), 1930-33 (198g).
Cependant, la relation entre le produit amplifié et
l'ADN ou l'ARN initial n'est réellement pas vraiment
constante d'une expérience à l'autre, d'où la nécessité de
se préoccuper du problème de la mesure d'un étalon dont
les concentrations sont connues par ailleurs.
Les capacités d'amplification de l'ACP ont pu être
évaluées jusqu'ici grâce à des cellules n'ayant le génome
à doser qu'en un nombre constant d'exemplaires ou à des
plasmides comportant chacun un unique morceau de gène. Il
a ainsi pu être établi que même un seul fragment de gène
peut, grâce à l'ACP, être spécifiquement identifié. On a
également établi qu'il existait un rapport de
proportionnalité entre des concentrations d'ADN d'un
plasmide soumises à amplification et les concentrations
d'ADN mesurées après amplification. Cependant ce rapport
de proportionnalité s'est avéré changer d'une expérience à
l'autre, car l'amplification par ACP est un processus
biologique, résultant de l'action de la polymérase, qui
n'est pas maîtrisé de façon aussi complète que le serait
une technique purement physique.
Cela a conduit les chercheurs et les ingénieurs des
firmes de biotechnologie à introduire un étalonnage dans
chaque expérience de quantification virale. Jusqu'à
présent, l'étalon est constitué d'une série de
concentrations (trois à cinq en général) d'un plasmide
étalon dont le fragment d'ADN à ampli~ier a les mêmes
amorces et est selon les technologies de séquence
partiellement différente ou de séquence identique. Le
rapport dlamplification de l'ADN de concentrations égales
de deux plasmides à amorces identiques, mais de longueur
et donc de séquences différentes: 1) peut être différent
d'un cas à l'autre et 2) n~est pas nécessairement
CA 02236842 l998-o~-o~
identique à celui de l'ADN issu de concentrations
identiques de virus natifs au sein de la même expérience.
Le problème est plus complexe encore si l'on cherche
à quanti~ier ou à identi~ier des virus à ARN, tels que par
exemple celui du SIDA (VIH). En e~~et, l'étape
d'ampli~ication par ACP doit, pour les virus à ARN, être
associée à une étape de rétrotranscription souvent
réalisée soit gr~ce à une autre enzyme, la transcriptase
réverse ou transcriptase inverse (en abrégé TR), soit
grâce à une enzyme ayant les deux actions (de
rétrotranscription et d'ampli~ication de l'ADN). Dans l'un
et l'autre cas, les enzymes actuellement disponibles sur
le marché permettent d'obtenir des rapports de
rétrotranscription pouvant varier d'une expérience à
l'autre de 10 : 1 (c'est-à-dire que 10 copies d'ARN
donnent 1 copie d'ADN) à 100 : 1 (100 copies d'ARN donnent
1 copie d'ADN). Le problème qui en résulte, à savoir la
non-comparabilité des résultats d'expériences sucessives,
a jusqu'à présent été résolu par incubation simultanée
d'une gamme de concentrations d'un ~ragment d'ARN étalon
(transcrit étalon) utilisant les mêmes amorces, mais dont
la partie ampli~iée est soit identique si on l'utilise en
étalon externe, soit di~~érente, en séquence ou en
longueur, si on l'utilise en coampli~ication, le transcrit
étant alors incubé dans le même tube que l'ARN du micro-
organisme cible à doser.
C'est ainsi que le document FR-A-2691162 décrit une
méthode de dosage quantitati~, applicable spéci~iquement
aux rétrovirus, comprenant l'utilisation comme étalon
externe de concentrations de cultures de cellules
in~ectées par des quantités déterminées dudit rétrovirus,
titrées en leur protéine virale de ré~érence ou "protéine
de core", notamment la protéine P24/25 ou P27 pour les
virus VIHl ou VIH2.
F~UlL~F M¢DIF~EE
. . CA 02236842 1998-o~-o~
.
. 4a
Il apparait malheureusement que les concentrations
d'ampli~icats issus des mêmes concentrations de deux
transcrits peuvent être dif~érentes et de même di~érentes
de celles issues d'ARN provenant de ConcentratiQns
identiques de virus.
En conclusion,
- les techniques connues de rétrotranscription et/ou
dlampli~ication ne donnent pas des résultats identiques
d'une expérience à l'autre pour un même échantillon;
F~ L ~ C~ .L~
CA 02236842 1998-0~-0~
Wog7/1746s PCT~R96/01736
- un étalon s'impose, qui peut être soit interne, soit
externe;
- un étalon externe composé soit d'un plasmide pour un
micro-organisme à ADN, soit d'un ARN transcrit pour un
micro-organisme à ARN, ne permet qu'une quantification
relative, car le rapport d'amplification n'est pas
nécessairement identique à celui de l'ADN ou de l'ARN du
micro-organisme completi
- un étalon interne coamplifié fait de plus intervenir des
longueurs ou des séquences différentes du plasmide ou du
transcrit et a les memes inconvénients qu'un étalon
externe utilisant un plasmide ou un transcrit.
Dans l'état de la technique actuelle, l'amplification
de l'ADN d'un plasmide n'est pas vraiment proportionnelle
à celle subie par l'ADN viral. Quant à llétalon
actuellement utilisé pour les virus à ARN, il s'agit d'un
transcrit, qui a les memes inconvénients qu'un plamside et
y ajoute la possibilité de dégradation d'ARN libre.
Il y avait donc un besoin pour des tests de
quanti~ication et de détection de micro-organismes
procurant des valeurs absolues du nombre de micro-
organismes cible.
On a maintenant trouvé que l~on peut quantifier ou
détecter de façon absolue et directe n'importe quel micro-
organisme à ADN ou à ARN, à la condition:
(l) que l'on connaisse ou que l'on puisse déterminer parailleurs une concentration étalon du micro-organisme ou la
concentration de l'ADN ou de l'ARN porté par ce micro-
organisme, appelé micro-organisme étalon, et
(2) que l'on compare la quantité du produit de la
transcription réverse et/ou de l'amplification de l'ARN ou
de l'ADN issu d'une concentration inconnue du micro-
organisme avec des quantités d'amplificat issues de l'ARN
ou de l'ADN de plusieurs concentrations connues du dit
micro-organisme.
CA 02236842 1998-o~-o~
wo97/l746s PCT~R96/01736
Un tel procédé constitue le premier objet de la
présente invention.
Selon une variante de ce procédé, l'étape (2) peut
consister essentiellement en une révélation comparative
fondée sur la comparaison des concentrations de l'étalon
avec les concentrations du micro-organisme cible telles
que détectées de préférence au moyen de la méthode dite de
1 'ADN branché ou de toute autre méthode de révélation qui
n'amplifie pas les ADM ou les ARN de l'étalon ou du micro-
organisme cible.
Pour préparer des concentrations connues de micro-
organisme, on procède selon l'une quelconque des
techniques connues de l'homme du métier, de préférence en
centrifugeant et purifiant (à partir d'échantillons
humains, animaux ou végétaux du milieu à tester, ou à
partir de cultures cellulaires) des quantités quelconques
du micro-organisme à doser, puis en extrayant l'ADN ou
1 'ARN de ces préparations centrifugées purifiées, par des
moyens classiques. Les quantités à mettre en oeuvre dans
la suite du procédé sont des quantités quelconques, qui
doivent seulement être su~fisantes pour ~ue l'on obtienne
finalement des quantités d' ADN ou d' ARN du micro-organisme
étalon mesurables par les méthodes microbiologiques
directes, n~utilisant pas l'amplification de type ACP et
qui sont à la portée de l'homme du métier. Dans la
pratique et compte tenu de la précision des matériels
actuellement disponibles dans les laboratoires pour ces
mesures, des quantités de l'ordre de plusieurs centaines
de nanogrammes ou de quelques microgrammes conviennent.
Le procédé selon l'invention comporte avantageusement
les étapes selon lesquelles:
1) on prélève et on purifie une quantité quelconque du
micro-organisme à doser, à partir d'échantillons de
prélèvement humains, animaux ou végétaux, ou à partir de
cultures cellulaires, la quantité de micro-organisme étant
CA 02236842 1998-0~-0~
wo97/l746s PCT~R96/01736
avantageusement suffisante pour que les concentrations en
ADN ou ARN cible soient mesurables par des méthodes
directes;
2) on extrait l'ADN ou l'ARN et on en mesure la quantité
texprimée en ng ou en ~g) recueillie;
3) on utilise par ailleurs le nombre de bases
nucléotidiques du micro-organisme concerné, ce nombre
étant connu, par exemple d'après des banques de données,
ou déterminable par des méthodes classiques;
4) on calcule à partir de ce nombre de bases
nucléotidiques la masse moléculaire totale de l'ADN ou de
l'ARN du dit micro-organisme, en tenant compte de la masse
moléculaire moyenne d'un nucléotide, elle aussi connue
(environ 330 daltons);
5) on calcule ainsi, en utilisant le nombre d'Avogadro
(soit 6,02 x 1023), la quantité d'ADN ou d'ARN portée par
chaque micro-organisme;
6) on prépare et/ou utilise une gamme de concentrations de
micro-organisme étalon obtenue à partir des dilutions
successives du micro-organisme préalablement étalonné
selon ses concentrations d'ADN ou d'ARN, pour former un
étalon externe, dont on connaît ainsi pour chaque dilution
(a) la concentration d'ADN ou d'ARN et (b) la concentra-
tion en micro-organismes;
7) on extrait l'ADN ou l'ARN des micro-organismes étalon
et cible et on soumet les extraits en parallèle à une
révélation au moyen de la méthode dite à l'ADN branché ou
de toute autre méthode de révélation qui n'amplifie pas
les ADN ou les ARN du micro-organisme étalon ou cible
etJou à une rétrotranscription et/ou à au moins une
amplification et on enregistre les valeurs obtenuesi et
8) on compare les concentrations d'ADN ou d'ARN des micro-
organismes étalon et cible ou les produits d'amplification
des micro-organismes cible avec ceux de l'étalon externe,
de ~açon à en déduire les valeurs de concentration en ADN
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
Ou.ARN ou en micro-organisme total dans chaque échantillon
de micro-organisme cible.
A titre d'exemples de sources bibliographiques dans
lesquelles on peut trouver des indications ou les
références de banques de données concernant le nombre de
bases nucléotidiques des micro-organismes, on peut citer:
Virus Res. 23, 39-53 (1992); Gene 81, 275-284 (1989);
Virology 177, 305-311 (1990) et J. Gen. Virol. 69, 2575-
2583 (1988).
Selon une variante avantageuse pouvant être mise en
oeuvre si les micro-organismes sont assez gros pour
pouvoir être détectés et comptés directement, notamment
par des moyens optiques et/ou électror.iques, les étapes 2)
à 5) susdites du procédé selon l'invention sont remplacées
par la simple mesure directe du nombre de micro-
organlsmes.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré le procédéselon la présente invention peut comprendre en option
l'addition d'un contrôle interne, de préférence sous la
forme d~un ADN de plasmide hétérologue ou d'un ARN de
transcrit hétérologue, et dont la séquence et les amorces
n'ont pas de rapport avec les ADN ou les ARN de la cible.
Ledit contrôle interne est avantageusement ajouté à chacun
des échantillons à examiner et sert de contrôle interne
(ci-après en abrégé "CI"), c'est-à-dire pour le contrôle
de l'efficacité d'amplification ou de l'efficacité de
l'amplification liée à la transcription réverse (ci-après
"TR").
En variante, on peut remplacer dans le procédé selon
l~invention la préparation de concentrations connues de
micro-organisme par la préparation de concentrations
connues:
. du même micro-organisme inactivé, dont l~ADN ou l'ARN
demeure apte à la détection ou la quantification au moyen
d'une méthode de révélation telle que la méthode de
CA 02236842 l998-o~-o~
W097/17465 PCT~R96/01736
révélation dite à l'ADN branché et/ou la
~ rétrotranscription et/ou à l'amplification de façon
identique à l'ADN ou l'ARN du virus natif,
. d~une séquence nucléotidique complète, extraite du meme
micro-organisme, ou
. d~une séquence nucléotidique complète, fabri~uée par
synthèse.
Selon une variante particulièrement avantageuse du
procédé selon l'invention, on prépare et on stocke jusqu'à
leur mise à la disposition de l'utilisateur des
préparations de concentrations connues étalonnées du
micro-organisme complet à ADN ou à ARN du type à
quantifier ou à détecter, ou des préparations de
concentrations d' ADN ou d' ARN du génome du dit micro-
organisme correspondant à des concentrations connues de cemicro-organisme.
Pour simplifier l'exposé, il est fait référence dans
la suite, à titre de simple exemple illustratif, à une
détection accomplie par une amplification, plus précisé-
ment au moyen d~une ACP ou d~une TR-ACP, mais d~autres
méthodes d'amplification peuvent également etre employées,
comme par exemple la méthode dite NASBA (c' est-à-dire la
méthode par ~nucleic acid sequence based assay~
Une quantification moléculaire et une détection selon
l'invention présentent un intéret marqué aussi bien pour
de petits micro-organismes ~ue pour de plus gros micro-
organismes, mais en faible concentration ou dont les
techniques empiriques traditionnelles d'évaluation ne sont
plus systématiquement maitrisées dans les pays développés
L'invention a également pour objet un kit ou ensemble
de moyens pour la quantification et la détection de micro-
organismes à ADN ou à ARN, comprenant essentiellement,
dans des récipients appropriés et/ou sous la forme de
dispositifs appropriés:
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
- une série de concentrations connues étalonnées du micro-
organisme complet à ADN ou à ARN du type à quantifier ou à
détecter, ou de concentrations d'ADN ou d'ARN
correspondant à des concentrations connues du dit micro-
organisme,
- des moyens d'extraction, de révélation et/ou de
rétrotranscription et/ou d'amplification, notamment par
ACP, TR-ACP ou NASBA de l~ADN ou de l'ARN du micro-
organisme cible et étalon,
- des moyens pour l'analyse de l~ADN ou de l'ARN du micro-
organisme cible et étalon ou des produits de révélation ou
d'amplification.
Ledit kit ou ensemble de mmoyens peut également
comprendre en option un contrôle interne, par exemple sous
la forme d'approximativement 103 copies/~l d'un ADN de
plasmide hétérologue ou d'ARN de transcrit hétérologue, en
tant que contrôle pour l'e~ficacité d'amplification ou de
l~efficacité de l'amplification liée à la TR.
Il convient de noter que les moyens d'analyse des
produits d'ACP ou de TR-ACP peuvent consister en des
moyens extérieurs au kit et destinés à être utilisés en
combinaison avec celui-ci. Ces moyens peuvent par exemple
comprendre des dispositifs et/ou des produits pour la
détermination par életrophorèse, par colorimétrie, par
radiométrie ou par tout autre moyen analytique approprié.
Le procédé et les moyens susdits procurent de manière
originale une quantification absolue des micro-organismes
à ADN ou à ARN, car le micro-organisme cible ou son génome
à doser, est identique au micro-organisme étalon ou son
génome traité en parallèle. De plus, ce procédé et ces
moyens se sont avérés procurer une technique universelle
de quantification et d'identification, car ils permettent
la quantification de tous les micro-organismes.
En dehors même des préoccupations de quanti~ication,
le procédé et les moyens selon l'invention peuvent être
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
11
employés pour une détection de la quantité minimale de
micro-organisme mesurable avec les méthodes actuelles de
transcription réverse et/ou d'amplification des micro-
organismes à ARN ou à ADN. En pratique, la quantité
minimale mesurable est de l'ordre de un à cinq micro-
organismes pour les micro-organismes à ADN, tandis qu'elle
est de l'ordre de 10 à 100 micro-organismes pour les
micro-organismes à ARN.
L'invention est décrite plus concrètement ci-après en
référence aux dessins annexés, qui ne la limitent aucune-
ment et dans lesquels:
- Fig. 1 représente graphiquement la variation de la
sensibilité de détection et de l'efficacité
d'amplification de différentes expériences d'ACP
effectuées avec plusieurs concentrations différentes
d'ADN étalon du même virus;
- Fig. 2 représente graphiquement la variation de la
sensibilité de détection et de l'efficacité
d~amplification de différentes expériences de TR-ACP
effectuées avec plusieurs concentrations d'ARN du
même virus;
- Fig. 3 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences
d'ACP effectuées avec plusieurs concentrations d'ADN
issues de préparations de virus provenant de
di~férents patients, au sein de la même expérience;
- Fig. 4 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences
d'ACP effectuées respectivement avec plusieurs
concentrations d'ADN isues de plusieurs préparations
~ du même virus et avec plusieurs concentrations d~ADN
issues de deux plasmides différents;
- Fig. 5 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences de
TR-ACP effectuées avec plusieurs concentrations d~ARN
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
12
issues de préparations de virus provenant de
dif~érents patients;
- Fig. 6 représente graphiquement la variation de
l'efficacité d'amplification dans des expériences de
TR-ACP effectuées respectivement avec plusieurs
concentrations d'ARN issues de préparations de virus
provenant de différents patients et avec deux ARN de
transcrits dif~érents.
Ainsi, à titre indicatif, on a concentré, purifié et
extrait l~ARN de VIH issu d'une culture de façon à en
obtenir 300 ng; sachant que le nombre total de nucléotides
du VIH est de l9000 et que la masse moléculaire d'un
nucléotide est de 330 daltons, on en a=déduit que la masse
moléculaire globale d'un ARN de VIH est de 6.300.000
daltons. On a alors obtenu, par un calcul utilisant le
nombre d'Avogadro, le nombre exact de génomes viraux et
donc de virus d'où émane la quantité de 300 ng d'ARN, soit
approximativement 3xl0l~ virus. Connaissant la concentra-
tion de virus d'une partie aliquote de la préparation
virale purifiée, on peut alors préparer une gamme étalon
de ce virus et l'utiliser dans le procédé selon la
présente invention.
Le procédé selon l'invention permet une
identi~ication fiable et/ou une quantification absolue,
car le micro-organisme cible (à doser) est identique au
micro-organisme étalon. La méthode que ce procédé met en
oeuvre est en outre universelle, car elle permet la
quantification de tous les micro-organismes dont la
quantité est mesurable parallèlement.
Ce procédé et le kit pour sa mise en oeuvre peuvent
être utilisés non seulement pour la quantification des
micro-organismes dans tous milieux ou spécimens, mais
également pour la détection de la quantité minimale de
micro-organisme mesurable avec les méthodes actuelles de
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
13
transcription réverse et/ou d'amplification des micro-
organismes à ARN ou à ADN.
Pour les micro-organismes à ADN la quantité minimale
mesurable est de l'ordre de 1 à 5 micro-organismes, tandis
gu'elle est d'environ 10 à 100 micro-organismes pour ceux
à ARN.
La présente invention apporte un progrès décisif aux
moyens et aux méthodes de dosage quantitatif de micro-
organismes in vitro en procurant un moyen et une technique
simples et efficaces pour la standardisation des dosages.
L'invention est décrite plus en détails dans les
exemples ci-après, qui ne la limitent aucunement et dans
lesquels les proportions et les pourcentages sont en
poids/poids, sauf indication contraire.
ExemDle 1: Démonstration de l'intérêt d'un étalon
universel pour la détection et la quantification d'ADN
cible par ACP (en anglais PCR).
On a étudié la variation de la sensibilité de
détection et de llefficacité d'amplification de l'ACP sur
l'ADN issu de dif~érentes concentrations du même VHB. Les
plasmas ont été obtenus à partir de porteurs de VHB
chroniques par plasmaphérèse avec des titres en HBsAg
élevés. Du virion à ADN de VHB a été purifié par
centrifugation (pendant une nuit à 25.000 tours/min et à
4~C dans une centrifugeuse Spinco 25) à travers un lit à
30 % (en poids/volume) de saccharose dans du milieu TEBM
(Tris-HCl 0,01 M, pH 7,6, NaEDTA 0,001 M, 1 ~ d'albumine
sérique bovine et 0,3 % de 2-mercapto-éthanol). La pureté
des virions de VHB fractionnés a été suivie par
microscopie électronique. L'ADN associé aux virions a été
extrait par l'intermédiaire d'un kit de purification d'ADN
du commerce. L'ADN viral obtenu a été quantifié par
spectrophotométrie. Le nombre de copies d'ADN viral a été
calculé au moyen de la masse moléculaire du génome viral
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/1746~ PCT~R96/01736
14
de l'ADN de VHB. En variante le nombre de virions peut
également être quantifié par microscopie électronique. Des
dilutions en série (l0, l00, l000, 10.000 copies) de l'ADN
de VHB ont été soumises à une succession de cycles d'ACP
identiques (94~C pendant 60 s, 56~C pendant 60 s et 72~C
pendant 90 s), avec l00 pmol de paires d'amorce de VHB
spécifi~ues pour le gène C: (GCTTTGGGGCATGGACATTGCC/
GACTACTAGATCCCTGGATGCTGG). Les produits d'ACP spécifiques
ont été analysés par une hybridation dot-blot avec une
sonde marquée à l'extrémité par ~_3 2 p
(TCAGCTCTGTATCGAGAAGCC) et les comptages par minute (cpm)
de chaque signal d'ACP ont été relevés par l'intermédiaire
d'un compteur de rayonnement bêta.
Les résultats ont été enregistrés et reportés sous
~orme graphique sur la figure l. Il apparaît clairement
~ue l'étalon donnerait des résultats différents et doit
donc être mis en oeuvre dans cha~ue expérience en
parallèle avec l'échantillon cible.
Ainsi, pour chaque input d'ADN de matrice constante
(nombre de copies), il existe d'après les courbes de la
~igure l un large intervalle de concentrations de produit
d'ACP d'une expérience à l'autre.
Exem~le 2: Démonstration de l'intérêt d'un étalon
universel pour la détection et la quantification d'ARN
cible par TR-ACP (en anglais RT-PCR).
On a étudié la variation de la sensibilité de
détection et de l'efficacité de la transcription
réverse/amplification de l'ACP sur l'ARN issu de
différentes concentrations du même VIH-l. Du virion à ARN
de VIH-l a été purifié par passage du surnageant de
culture de blastes de cellules mononuclées du sang
infectés par un isolat primaire sur une colonne de
sépharose. La pureté des virions de VIH-l ~ractionnés a
été suivie par microscopie électronique. L'ARN associé aux
CA 02236842 1998-0~-0~
WO 97/17465 PCT/FR96/01736
virions a été extrait par l'intermédiaire d'un kit
d'isolation d'ARN du commerce. L'ARN viral obtenu a été
quantifié par spectrophotométrie. Le nombre de copies
d'ARN viral a été calculé au moyen de la masse moléculaire
5 du génome viral de l'ARN de VIH-l. Après addition de
microgramme d'ARNt, des dilutions en série (l.000.000,
lO0.000, lO.000, lO00 copies) de l'échantillon d'ARN ont
été pastillées et remises en suspension dans lO ~Ll. Une
partie aliquote de lO ~ll d'ARN et l ~g d'ARNt de référence
lO (exempt de VIH) ont été ajoutés immédiatement à chacun des
mélanges réactionnels (90 ~ll) de TR-ACP contenant lO
unités de transcriptase réverse de virus de leucémie
murine de Moloney recornbinant et 3 unités d'ADN polymérase
ampliTaq pour l'amplification du gène gag du VIH. La TR-
15 ACP a été mise en oeuvre pendant 25 minutes à 42~C, puispendant 5 min à 94~C et ensuite sur 40 cycles (94~C
peandnt 60 s, 56~C pendant 60 s et 72~C pendant 90 s)
d'ACP utilisant lO0 pmol de chacune des paires d'amorce de
VIH spécifiques du gène gag (GGAACATCAAGCAGCCATGC/
20 TCCTTTGGTCCTTGTCTTATGTC). Les produits d'ACP spécifiques
ont été analysés par hybridation par dot-blot avec une
sonde marquée à 1 'extrémité par ~y_ 3 2 p
(ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC) et les
comptages par minute (cpm) de chaque signal d'ACP ont été
25 relevés par l'intermédiaire d'un compteur de rayonnement
bêta.
Les résultats ont été enregistrés et reportés sous
forme graphique sur la figure 2. Il apparaît que la
variabilité des résultats est très importante d'une
30 expérience à l'autre. Là encore, il apparaît clairement
que l'étalon donnerait des résultats différents et doit
donc être mis en oeuvre dans chaque expérience en
parallèle avec l'échantillon cible.
Ainsi, pour chaque input d'ARN constant (nombre de
35 copies), il existe d~après les courbes de la figure 2 un
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
16
la~ge intervalle de concentrations de produit d'ACP d'une
expérience à l'autre.
Exem~le 3: Validation d'un étalon d'ADM de virion.
Cet exemple illustre l'identité d'efficacité de
l'amplification par des cycles d'ACP identiques d'ADN de
virion de VHB natif provenant de sérums de différents
patients infectés par VHB. Des dilutions en série
dléchantillons de différents ADN de virion de VHB préparés
comme indiqué dans l'exemple 1 ont été soumises à un même
nombre de cycles d'ACP dans la même expérience. Le produit
d'ACP (output) a été quantifié par dot blot et comptage de
cpm.
Les résultats reportés sous ~orme graphique sur la
figure 3 montrent que l'efficacité diamplification par ACP
est identique quelle que soit la source du virion VHB (ici
pour quatre sources différentes).
Exem~le 4: Validation d'un étalon d'ADN de virion.
En procédant comme indiqué dans l'exemple 3, mais en
mettant en oeuvre à chaque fois dans les mêmes cycles
d'ACP un ADN de virion nati~ et des ADN issus de deux
plasmides VHB (input), on a pu établir les efficacités
comparées de l'amplification par ACP (voir figure 4).
Des fragments d'ADN de la séquence de gène C de VHB
ont été produits par ACP à partir de sérums de HBVsAg+ et
ligaturés dans des plasmides pGEM-3Z (Promega) et pCT~
(Invitrogen) (respectivement plasmide ADN1 et ADN2 de
VHB). Tous les construits ont été confirmés par séquençage
d'ADN au moyen d'un kit commercial approprié.
Les résultats reportés sous forme graphique sur la
figure 4 montrent ~u'un nombre connu de copies peut avoir
ou non une efficacité d'amplification comparable à celle
d'un nombre de copies identique d'ADN viral natif issu de
plusieurs échantillons.
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
17
Il ressort ainsi des exemples 3 et 4 que des
concentrations connues d'ADN de virion VHB de différentes
provenances constituent un étalon universel idéal, alors
que des fragments d'ADN viral intégrés dans des plasmides
différents ont des comportements différents entre eux et
différents des ADN natifs.
~xem~le 5: Validation d'un étalon d'ARN de virion.
Cet exemple illustre l'identité d'efficacité de
l'amplification par des cycles de TR-ACP identiques d'ARN
de virion de VIH natif provenant de sérums de différents
patients infectés par du VIH. Des dilutions en série
d'échantillons de différents ARN de virion de VIH préparés
comme indiqué dans l'exemple 2 ont été soumises à un cycle
de TR-ACP dans la même expérience. Le produit d'ACP
(output) a été quantifié par dot blot et comptage de cpm.
Les résultats reportés sous forme graphique sur la
figure 5 montrent que l'efficacité d'amplification par TR-
ACP est identique quelle ~ue soit la source du virion VIH
Exem~le 6: Validation d'un étalon d'ARN de virion.
En procédant comme indiqué dans l'exemple 5, mais en
mettant en oeuvre à chaque fois dans les mêmes cycles de
TR-ACP un ARN de virion natif et un ARN de transcrit avec
un nombre connu de copies (input), on a pu établir les
ef~icacités comparées de l'amplification par TR-ACP (voir
figure 6).
Des fragments d'ARN de séquence gag de VIH-l ont été
produits par transcription de matrices d'ADN de VIH-l
(respectivement plasmide pBR322 d'ADN de VIH-Z6 et
plasmide pBHlO-R3 d'ADN de VIHIIIg) avec de l'ARN
polymérase de T7 (respectivement transcrits ARNl et ARN2
- de VIH).
Les résultats reportés sous forme graphique sur la
figure 6 montrent qu'un ARN de transcrit ayant un nombre
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/1746s PCT~96/01736
18
connu de copies a une e~icacité d'amplification par TR-
ACP différente de celle d'un ARN d'échantillon.
Il ressort ainsi des exemples 5 et 6 que des
concentrations connues d'ARN de virion VIH de différentes
provenances constituent un étalon universel idéal, alors
que des fragments d'ARN viral intégrés dans des plasmides
différents ont des comportements différents entre eux et
différents des ARN natifs.
Ainsi:
- l'utilisation selon l'invention d'ADN de virion comme
étalon externe est de loin plu5 précise et commode que
celle d'un ADN de plasmide servant d'étalon externe ou
interne pour le suivi de l'efficacité de l'amplification
dans un essai d'ACP quantitative;
- l'utiIisation selon l'invention d'ARN de virion comme
étalon externe est de loin plus précïse et commode que
celle d'un ARN de transcrit servant d'étalon externe ou
interne pour le suivi de l'e~ficacité de 1'amplification
dans un essai de TR-ACP ~uantitative.
Exem~le 7: Kit de quantification du génome du virus de
l'immunodé~icience humaine (VIH) pour détection par
visualisation
7.l. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de
l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente
invention a été concu pour la détection et la
quantification d'ARN génomique de VIH (y compris tous les
génotypes VIH-0, VIH-l et VIH-2) dans tous fluides
biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum,
liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire,
etc.), ainsi que les surnageants de culture. On y a inclus
des réactifs pour permettre d'isoler l'ARN viral par une
méthode rapide - la transcription réverse de l'ARN de
CA 02236842 l998-0~-0~
W097/17465 PCT~R96/01736
19
virion VIH en ADNc au moyen de transcriptase réverse du
virus de leucémie murine de Moloney cloné - l'amplifica-
tion utilisant alors de la Taq ADN polymérase - et
finalement la détection quantitative par une procédure
simple de visualisation sur gel d'agarose, qui permettait
une limite de détection de 1000 copies d'ARN viral et une
gamme de quantification de plus de 4 ordres de grandeur en
un seul test en 8 heures. Suffisamment de réactifs étaient
fournis pour 100 réactions (40 ~l chacune) dans un
protocole avec volume final de 50 ~l.
Le kit contenait un ensemble d'étalons de virion VIH
(ci-après "VirionStandard") comme expliqué plus haut (104,
103, 102 et 10 copies/~l, fournis pour 4 séries de tests),
qui permettaient une mesure précise de la concentration
d~ARN de virion VIH du plasma/sérum. Le kit contenait
également un ADN de VIH de plasmide (102 copies par
réaction, pour 4 séries de tests), qui servait de contrôle
de signal d'amplification positif, ainsi qu'en option un
ARN de tanscrit hétérologue, ajouté à chacun des
échantillons à examiner et servant de contrôle interne
(ci-après "CI") (103 copies par réaction, fourni pour 100
réactions).
7.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VIH doit de
préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une
solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est
stocké dans des conditions appropriées, le produit reste
stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une
étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Commentaires
VirionStandard de VIH
la VirionStandard 1 (104 copies/lll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon
Ib VirionStandard 2 (103 copies/,ul) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon
Ic VirionStandard 3 (102 copies/lll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'él~han~illon
Id VirionStandard4(10 copies/lll) 0,4ml I Calibrel'ARNd'échantillon
le VirionStandard 5 (serum négatif auVlH) 0,4 ml I Contrôle de spécificité (négatif) O
2 ARNt (0,1 mg/ml) I ml I Sert d'ARN support pour l'ARN d'échantillon
3 Tampon de reserve d'ARN 250 111 4 Dissout Ies echantillons d'ARN
4 Mélange d'amplification de VIH, avec arnorces I ml 4 S'llybride à l'ARN de VIH et aux génomes
de VIH et amorces de Cl, ~ventuellement d'ADNc
Mélange enzymatique 28 111 4 Retrotranscrit l'ARN de cible et
amplifie l'ADNc
6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 40 ~l I Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VIH
7 Cl optimal (103 copies/lll) 1 ml I Contrôle interne d'efficacite d'amplification
lice à la TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 111 ] Contrôle de signal (négatif) de fond
~ .
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
21
7.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
7.3.l. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses)
- Isopropanol (pur pour analyses)
- Ethanol à 75 % (pur pour analyses)
- Agarose (exempt de DNase)
- Bromure d'éthidium
- Solution d'isolement d'ARN
7.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C)
- Installation de mise sous vide
- Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant
- Générateur et bain pour électrophorèse
7.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
7.4.l. EXTRACTION D'ARN
l00 ~l d'échantillons de VirionStandard de VIH et de
plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ~l de
solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations
dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloroforme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes
et laissé reposer sur de la glace pendant l0 minutes. La
suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15
minutes.
Après addition de chloroforme et centrifugation, il se
formait deux phases: la phase phénol-chloroformi~ue
inférieure (~240 ~l) et la phase aqueuse supérieure (~320
~l). Les ARN restaient exclusivement dans la phase
aqueuse, tandis ~ue les ADN et les protéines étaient dans
l'interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~l) a été transférée dans de
nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
~ et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant l
heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant l0
minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
CA 02236842 1998-0~-0~
WO 97/17465 PCT/FR96/01736
22
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet
d'ARN a eté lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 ,~Ll)
sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a
été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans ll
,Ul de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune
(visible seulement en grande ~uantité) au fond du tube. Il
est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher
complètement, car le séchage diminue fortement sa
l0 solubilité.
7.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc
10 ,ul d'échantillons diARN et de contrôles positif/-
négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ,ul).
40 ~ul de mélange de transcription réverse/amplification
(MTRA) (38,9 ,ul de mélange d~amplification de VIH + l,l ~ll
de mélange enzymatique) ont été placés dans cha~ue tube.
Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant
un cycle thermis~ue (dénommé commercialement Thermal
Cycler), à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et
72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5
minutes.
7.5. VISUALISATION ET QUANTIFICATION
10 ,ul du mélange post-réactionnel ont été distribués
sur du gel d'agarose à 1,596 contenant 0,5 ,ug/ml de bromure
d'éthidium et on a effectué une électrophorèse sous 150 V
30 pendant l0 minutes.
Les séquences de VIH spécifi~uement amplifiées
pouvaient être visualisées aisément par différences de
taille. Les gammes de copies d'ARN de viron VIH dans l00
,ul d'échantillons de plasma/sérum pouvaient être estimées
CA 02236842 1998-o~-o~
WO97/17465 PCT~R96/01736
23
par comparaison de leurs bandes d'amplification avec
celles du VirionStandard de VIH (semi-quantification).
~ xem~le 8: Kit de quantification de génome de virus
d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection avec un
lecteur de densité optique
8.l. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de
l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente
invention a été conçu pour la détection et la
quantification d~ ARN génomique de vIH (y compris tous les
génotypes VIH-0, VIH-l et VIH-2) dans tous fluides
biologiques exempts de cellules (tels que plasma, sérum,
lS liquide séminal, fluide de lavage broncho-alvéolaire,
etc.), ainsi que les surnageants de culture. On y a inclus
des réactifs pour permettre d'isoler l'ARN viral par une
méthode rapide - la transcription réverse de l' ARN de
virion VIH en ADNc au moyen de transcriptase réverse du
virus de leucémie murine de Moloney cloné - l'amplifica-
tion utilisant alors de la Taq ADN polymérase - et
finalement la détection quantitative par une procédure
d'hybridation liquide liée à la DIG (digoxigénine), qui
permettait une limite de détection de l00 copies d' ARN
viral et une gamme de quantification d~environ 2 ordres de
grandeur en un seul test en 8 heures. Suffisamment de
réactifs étaient fournis pour l00 réactions (40 ~l
chacune) dans un protocole avec volume final de 50 ~l.
Le kit contenait un ensemble d'étalons de virion VIH
~VirionStandard" (103, l02, l0 et l copies/~l, fournis
pour 4 séries de tests), qui permettaient une mesure
précise de la concentration d' ARN de virion VIH du
- plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VIH de
plasmide (102 copies par réaction pour 4 séries de tests),
qui servait de contrôle de signal d'amplification positif,
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
24
ainsi qu'en option un ARN de tanscrit hétérologue, ajouté
à chacun des échantillons à examiner et servant de
contr81e interne "CI" (103 copies par réaction, fourni
pour lO0 réactions).
8.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VIH doit de
préférence etre conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une
solution de conservation d'enzyme appropri~e. S'il est
stocké dans des conditions appropriées, le produit reste
stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une
étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Commentaires
I Amplification de génome de VIH liée à une ll dnS~ utiOn réverse (TR) et Illdl ~ludge par DIG
VirionStandard de VIH
la Vi-iooJtdl-dard 1 (103 copies/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon
lb VirionStandard 2 (102 copies/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'~h~ntill()n
Ic Vi-;ollJl~llddl-l 3 (10 copies/~,ll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon
ld VirionStandard 4 (1 copie/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'e- h~n~illon D
le VirionStandard 5 (sérum négatif auVlH) 0,4 ml 1 Contrôle de spécificité (négatif) o
2 ARNt (0,1 mg/ml) 1 ml 1 Scrt d'ARN support pour l'ARN d'échantillon
3 Tampon de réserve d'ARN 250 111 4 Dissout les échantillons d'ARN ~,
4 Mélange d'amplification de VIH, avec amorces 1 ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes 'J' ~,
de VIH et Cl, (5% de DlG-dUTP) d'ADNc
Mélange enzymatique 28 ~,11 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et
amplifie l'ADNc
6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/~ll) 40 111 1 Contrôle de signal (positif) d'ADNc de VIH
7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/!ll) 1 ml 1 Contrôle interne d'efficacité d'amplification liée à TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 1,11 I Contrôle de signal (négatif) de fond
Il Hybridation liquidc et détection par DIG
9 Sonde de VIH biotinylée 200 111 1 Capture d'ADNc dc VIH en hybridation liquide
10 Contrôle interne biotinyle, 100 111 I Capture d'ADNc de Cl en hybridation liquide Z
sonde spécifique d'ADN
11 Tampondcdenaturation 4ml 1 Pcrmetdenaturationd'ADNdsamplifié
12 Tampon d'hybridation 40 ml 1 Permet hybridation de la sonde à l'ADN de cible
13 Tampon dc lavage (10x) 50 ml 1 Elimine l'ADN non-spécifique
14 Billes revêtues de streptavidine (ou microplaque) 200 (8 puits) 1 (24) Capture d'ADNc de VIH hybridé en hybridation liquide
15 Solution de travail anti-DIG-POD 40 ml 1 Se fixe aux molécules DIG du produit
spécifiquement amplifié D
16 Solution de substrat ABTS 40 ml 1 Permet le de~lop~"~-,t de couleur en système POD o
CA 02236842 1998-0~-0~
WO 97/17465 PCT/FR96/01736
27
8.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
- 8.3.l. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses)
- Isopropanol (pur pour analyses)
- Ethanol à 75 % (pur pour analyses)
- Solution d'isolement d'ARN
- Microplaque revêtue de streptavidine
8.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C)
- Installation de mise sous vide
- Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant
- Bain-marie ou incubateur pour hybridation liquide
- Lecteur de densité optique automatisé
8.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
8.4.l. EXTRACTION D'ARN
100 ~Ll d'échantillons de VirionStandard de VIH et de
plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ,ul de
solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations
dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloroforme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes
et laissé reposer sur de la glace pendant l0 minutes. La
suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15
minutes.
Après addition de chloroforme et centrifugation, il se
formait deux phases: la phase phénol-chloroformique
inférieure (~240 ~l) et la phase aqueuse supérieure (-320
~l). Les ARN restaient exclusivement dans la phase
aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans
l~interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~l) a été transférée dans des
nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant
heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant l0
minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
CA 02236842 l998-0~-0~
WO 97/17465 PCT/FR96/01736
28
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet
d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol a 7596 (500 ,ul)
sous l'effet d'un vortex, et ~inalement le pellet d'ARN a
été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans 11
,Ul de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune
(visible seulement en grande ~uantité) au fond du tube. Il
est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher
complètement, car le séchage diminue fortement sa
10 solubilité.
8.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc
10 ~11 d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/-
négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ~
40 ~Ll de mélange de transcription réverse/amplification
15 (MTRA) (38,7 ,ul de mélange d'ampli~ication de VIH + 1,1 ,~Ll
de mélange enzymati~ue + 0,2 ~Ll de DIG-dUTP) ont été
placés dans chaque tube. Les tubes ont été transférés dans
un appareil fournissant un cycle thermis~ue, à couvercle
chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 36 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et
72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5
minutes.
8.5. DETECTION ET QUANTIFICATION
2 ,ul de produit amplifié (x2) et une dilution par 10
fois (x2) ont été ajoutés dans de nouveaux tubes et
mélangés avec 18 ~Ll de solution de dénaturation à
30 température ambiante pendant 10 minutes. Après addition
jus~u'à 180 ~Ll de solution d'hybridation ~x4) contenant
une sonde de VIH et une sonde de CI, vortex, puis
transfert à la pipette dans un puits d'une microplasIue
revêtue de streptavidine, puis 2 heures d'incubation à
35 37~C sur une secoueuse, la solution a été jetée et chacrue
CA 02236842 l998-o~-o~
wo97/l746s PCT~R96/01736
29
puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec 200 ~l de tampon
- de lavage, 200 ~l de solution de substrat ABTS ont été
ajoutés dans chaque puits, suivis d'une incubation de 30
- minutes à 37~C avec agitation. La plaque a été maintenue
dans l'obscurité pendant l'incubation. On a lu
1'absorbance à 405 nm. Les nombres de particules de VIH
par ml de chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être
enregistrés par un système automatique informatisé
utilisant une courbe étalon générée à partir du
VirionStandard de VIH (quantification absolue).
~xem~le 9: Kit de quantification de génome de virus
d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection par
fluorescence
9.1. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de
l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente
invention a été conçu et mis en oeuvre sensiblement comme
décrit dans l'exemple 8, sauf que la gamme de
quantification était de plus de 4 ordres de grandeur en un
seul test en 7 heures.
9.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VIH doit de
préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une
solution de conservation d~enzyme appropriée. S'il est
stocké dans des conditions appropriées, le produit reste
stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une
étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Co~ l,tdiles
I A,l.plifi~dlion de génomc de VIH liée à une ll dns~ lion réverse (TR)
VirionStandard de VIH
la VirionStandard I (103 copies/!ll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'erh~ntillon
Ib VirionStandard 2 (102 copies/~,ll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon
Ic Viliul,Stdndard3(10copies/~ul) 0,4ml 1 Calibrel'ARNd'échantillon ~
1d Vil;vllStdndard4(1copie/,ul) 0,4ml I CalibrellARNd'échantillon D
le VirionStandard 5 (sérum négatif au VIH) 0,4 ml 1 Contrale de spécificité (négatif)
2 ARNt (0,1 mg/ml) 1 ml I Sert d'ARN support pour l'ARN d'échantillon
3 Tampon de réserve d'ARN 250 ~,ll 4 Dissout les échantillons d'ARN 1-
4 Mélange d'amplification de VIH, avec amorces 1 ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes O
de VIH et amorces de Cl d'ADNc ~~n
Mélange enzymatique 28 111 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et
amplifie l'ADNc
6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 40 111 I Contrale de signal (positif) d'ADNc de VIH
7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/lll) 1 ml I ContrBle interne d'efficacité d'amplification liée à TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 ,ul I Contrale de signal (négatif) de fond
II Hybridation liquide et comptage de fluorescence
9 Microplaque revêtue de sondes de VIH (souches + & -) 8 puits 12 Capture d'ADNc de VIH en hy~l i.;ldlion liquide
10 Mi.:lo~ld.lue revêtue de sonde de CI 8 puits 12 Capture d'ADNc de CI en hybridation liquide 5
11 Tampon de dénaturation 2 ml 1 Permet dénaturation d'ADNds amplifié
12 Tampon d hybridetion 20 ml 1 Permet hybridahon de la sonde à l'ADN de cible
13 Tampon de lavage 100 ml I Retient spécifiquement l ADN amplifié
dans la microplaque
14 rlilo,~l,-o",e 10 ml 1 Permet la détection d ADNds post-amplification
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
32
9.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
9.3.1. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses)
- Isopropanol (pur pour analyses)
- Ethanol à 75 % (pur pour analyses)
- Solution d'isolement d'ARN
9.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C)
- Installation de mise sous vide ou pompe centrifuge
- Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant
- Bain-marie ou incubateur pour hybridation liquide
- Fluorimètre sensible
9.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
9.4.1. EXTRACTION D'ARN
100 ~l dléchantillons de VirionStandard de VIH et de
plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ~l de
solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations
dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloro~orme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes
et laissé reposer sur de la glace pendant 10 minutes. La
suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15
minutes.
Après addition de chloroforme et centrifugation, il se
~ormait deux phases: la phase phénol-chloroformi~ue
inférieure (~240 ~l) et la phase aqueuse supérieure (~320
~l). Les ARN restaient exclusivement dans la phase
aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans
l'interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~l) a été transférée dans de
nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant 1
heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10
minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet
CA 02236842 l998-0~-0~
WO 97/17465 PCTtFR96/01736
33
d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 ~11)
~ sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a
été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans 11
- ,~Ll de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune
~visible seulement en grande quantité) au fond du tube. Il
est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher
complètement, car le séchage diminue fortement sa
solubilité.
9.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION D'ADNc
10 ~Ll d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/-
négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ~l).
40 ~Ll de mélange de transcription réverse/amplification
(MTRA) (38,9 ,ul de mélange d'amplification de VIH + 1,1 ~Ll
de mélange enzymatique) ont été placés dans chaque tube.
Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant
un cycle thermique, à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et
72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5
minutes.
9.5. DETECTION ET QUANTIFICATION
5 ~Ll (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés
dans de nouveaux tubes et mélangés avec 15 ~Ll de solution
de dénaturation à température ambiante pendant 10 minutes.
Après addition jusqu'à 180 ,ul (x2) de solution
d'hybridation, vortex, puis trans~ert à la pipette dans un
puits d'une microplaS~ue revêtue de sondes de VIH, puis 2
heures d'incubation à 37~C sur une secoueuse, la solution
a été jetée et chaque puits ou alvéole a été lavé 3 fois
avec 200 ,ul de tampon de lavage. 100 ,ul de solution de
fluorochrome ont été ajoutés, suivis par le transfert de
CA 02236842 1998-o~-o~
WO97/17465 PCT~R96/01736
34
la microplaque sur un fluorimètre automatisé pour comptage
de fluorescence et édition des résultats.
~ xem~le lO: Kit de quantification de génome de virus
d'immunodéficience humaine (VIH) pour détection par
chimioluminescence
10.1. INTRODUCTION
Un kit de quantification du génome du virus de
l'immunodéficience humaine (VIH) selon la présente
invention a été concu et mis en oeuvre sensiblement comme
décrit dans l'exemple 8, sauf que la gamme de
quantification était de plus de 4 ordres de grandeur en un
seul test en 7 heures.
10.2. LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quanti~ication de genome de VIH doit de
préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une
solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est
stocké dans des conditions appropriées, le produit reste
stable jusqu'à une date de contrôle imprimée sur une
étiquette.
No. Réactif Volume Quantité Co~ lailes . u,
I Amplification de génome de VIH liée à une ll àlls~ I iplil)ll réverse (TR)
VirionStandard de VIH
la VirionStandard I (103 copies/~ll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon
Ib Vil ;onSldl~dard 2 (102 copies/lll) 0,4 ml 1 Calibre l'ARN d'échantillon
Ic VirionStandard 3 (10 copies/lll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon
Id VirionStandard 4 (I copie/~Ll) 0,4 ml I Calibre l'ARN d'échantillon D
le VirionStandard 5 (sérum négatif auVlH) 0,4 ml I Contrôle de s~ificilé (négatifl
2 ARNt (0,1 mg/ml) I ml I Scrt d'ARN support pour l'ARN d'échantillon ,0
3 Tampon de réserve d'ARN 250 ,ul 4 Dissout les échantillons d'ARN
4 Mélange d'amplification de VIH, avcc amorces I ml 4 S'hybride à l'ARN de VIH et aux génomes
de VIH et amorces de CI biotinylées d'ADNc O
Melange enzymatique 28 ~,ll 4 Rétrotranscrit l'ARN de cible et o
amplifie l'ADNc
6 ADN de VIH de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 40 ~,ll I Contrôle de signal (positif) d'ADNc dc VIH
7 ADN de transcrit hétérologue (103 copies/lll) I ml I Contrôle interne d'efficacite d'amplification liée à TR
8 Eau passée à l'autoclave 40 ,ul I Contrôle de signal (négatif) de fond
Il Hybridation liquide et Illal~ludge par chimiolulllillescence
9 Sonde sy~;c~ ue pour VIH 100 ~l I S'hybride spécifiquement à l'ADNc de VIH
10 Sonde ~I,éciQ.lue de l'ADNc de CI 100 111 I S'hybride spécifiquement à l'ADNc de Cl
Il Tampon de dénaturation 5 ml I Permet d~llaluldlion d'ADNds amplifié
12 Tampon d'hybridation 50 ml 1 Permet hybridation de la sonde à l'ADN de cible ~,,
13 Tampon de lavage (x10) 50 ml 1 Elimine l'ADN non-s~eciri-lue dans la ~ o~ld~ e
14 Billes revêtues de streptavidine (ou .n;c,.",la.lue)200 (8 puits) 1 (24) Capture d'ADNc de VIH hybridé en hyb, iddlioll liquide
15 Solution de travail anti-ADNds-PAL 10 ml 1 Marquage d'ADN cible hybridé
16 Solution de substrat de chimiol~ .oe 10 ml I Permet détection par ll l " ,;"(x~,~ce et q~~an~ifir~tion
D
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
37
10.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
10.3.1. REACTIFS
- Chloroforme (pur pour analyses)
- Isopropanol (pur pour analyses)
- Ethanol à 75 ~ (pur pour analyses)
- Solution d'isolement d'ARN
10.3.2. EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube (4~C)
- Installation de mise sous vide ou pompe centrifuge
- Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant
- Bain-marie ou incubateur pour hybridation li~uide
- Luminomètre
10.4. PROTOCOLE POUR QUANTIFICATION DE VIH PAR
AMPLIFICATION DE GENOME LIEE A TRANSCRIPTION REVERSE
10 4.1. EXTRACTION D'ARN
100 ~1 d'échantillons de VirionStandard de VIH et de
plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 400 ~l de
solution d'isolement d'ARN, avec quelques oscillations
dans un homogénéiseur. 60 ~l de chloroforme ont été
ajoutés et on a agité vigoureusement pendant 15 secondes
et laissé reposer sur de la glace pendant 10 minutes. La
suspension a été centrifugée à 12.000 g à 4~C pendant 15
minutes.
Après addition de chloro~orme et centrifugation, il se
formait deux phases: la phase phénol-chloroformique
inférieure (-240 ~1) et la phase aqueuse supérieure (-320
~1). Les ARN restaient exclusivement dans la phase
aqueuse, tandis que les ADN et les protéines étaient dans
l'interphase et dans la phase organique.
La phase aqeuse (300 ~1) a été transférée dans de
nouveaux tubes. Un volume égal d'isopropanol a été ajouté
et les échantillons ont été conservés à -20~C pendant 1
heure. Les échantillons ont été centrifugés pendant 10
minutes à 12.000 g (4~C) et le pellet (pastille) a été
brièvement séché. Le surnageant a été éliminé, le pellet
CA 02236842 1998-0~-0~
WO 97/17465 PCT/FR96/01736
38
d'ARN a été lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (500 ~l)
sous l'effet d'un vortex, et finalement le pellet d'ARN a
été séché sous vide. Le pellet d'ARN a été dissous dans ll
~1 de tampon de réserve d'ARN.
Le précipité d'ARN formait un pellet blanc-jaune
(visible seulement en grande quantité) au fond du tube. Il
est important de ne pas laisser le pellet d'ARN sécher
complètement, car le séchage diminue fortement sa
solubilité.
l0 l0.4.2. TRANSCRIPTION REVERSE D'ARN ET AMPLIFICATION
D'ADNc
10 ~Ll d'échantillons d'ARN et de contrôles positif/-
négatif ont été ajoutés dans de nouveaux tubes (200 ~l).
40 ~ll de mélange de transcription réverse/amplification
(MTRA) (38,9 ~Ll de mélange d'amplification de VIH + l,l ,ul
de mélange enzymatique) ont été placés dans chaque tube.
Les tubes ont été transférés dans un appareil fournissant
un cycle thermique, à couvercle chauffant.
- 42~C pendant 25 minutes;
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 55~C pendant 45 s et
72~C pendant 60 s);
- puis 55~C pendant 5 minutes et ensuite 72~C pendant 5
minutes.
25 l0.5. DETECTION ET QUANTIFICATION
5 ,ul (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés
dans 2 tubes frais et mélangés avec 15 ~l de solution de
dénaturation à température ambiante pendant l0 minutes.
Après addition jusqu'à 180 !ll (x2) de solution
30 d'hybridation contenant une sonde spécifique pour VIH ou
une sonde spécifique pour l'ADN du contrôle interne (CI),
vortex, puis transfert à la pipette dans le tube de billes
revêtues de streptavidine ou transfert dans le puits d'une
microplaque revêtue de streptavidine, puis 2 heures
35 d'incubation à 37~C sur une secoueuse, la solution a été
-
CA 02236842 1998-o~-o~
W097/17465 PCT~R96/01736
39
jetée et chaque puits ou alvéole a été lavé 3 fois avec
200 ~1 de tampon de lavage. 200 ~1 des anticorps anti-
ADNds conjugués avec de la phosphatase alcaline (PAL) ont
été ajoutés, suivis d'une incubation pendant 30 minutes à
37~C sur une secoueuse. Après lavage 3 fois avec 200 ~1 de
tampon de lavage, 100 ~1 de solution de substrat de
chimioluminescence ont été ajoutés. Ensuite, la
microplaque a été immédiatement transférée sur un
luminomètre pour comptage de chimioluminescence et édition
des résultats. Les nombres de particules de VIH par ml de
chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être
enregistrés par un système automatique informatisé
utilisant la courbe étalon générée à partir du
VirionStandard de VIH (quantification absolue).
~xem~le 11: Kit de quantification de génome de virus de
l'hépatite B humaine (VHB) pour détection par
chimioluminescence
11.1. INTRODUCTIOM
Un kit de quantification du génome du virus de
l'hépatite B humaine (VHB) selon la présente invention a
été conçu pour la détection et la quantification d'ADN
génomique de VHB dans tous fluides biologiques exempts de
cellules (tels que plasma, sérum, liquide séminal, fluide
de lavage broncho-alvéolaire, etc.). On y a inclus des
réactifs pour permettre d~isoler l'ADN viral par une
méthode rapide, l'amplification de l'ADN du virion VHB
avec de la Taq ADN polymérase et la détection quantitative
par une procédure d'hybridation liquide liée à la
chimioluminescence, ~ui permettait une limite de détection
de 50 copies d'ADN viral et une gamme de quantification de
~ plus de 4 ordres de grandeur en un seul test en 5 heures.
Suffisamment de réactifs étaient fournis pour 100
CA 02236842 l998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
réactions (40 ~l chacune) dans un protocole avec volume
final de 50 ~
Le kit contenait un ensemble dletalons de virion VHB
"VirionStandard" (104, 103, 102 et 10 copies/~l, fournis
pour 4 séries de tests), ~ui permettaient une mesure
précise de la concentration d'ADN de virion VHB du
plasma/sérum. Le kit contenait également un ADN de VHB de
plasmide (103 copies par réaction, pour 4 séries de
tests), qui servait de contrôle de si~nal d'amplification
positif, ainsi ~u'en option un ADN de plasmide
hétérologue, ajouté à chacun des échantillons à examiner
et servant de contrôle interne "CI" (103 copies par
réaction, fourni pour 100 réactions).
11. 2 . LISTE DES COMPOSANTS DU KIT
Le kit de quantification de génome de VHB doit de
préférence être conservé à -20~C dans un congélateur à
température constante ou à 4~C avec utilisation d'une
solution de conservation d'enzyme appropriée. S'il est
stocké dans des conditions appropriées, le produit reste
stable jus~u'à une date de contrôle imprimée sur une
étiquette.
No. Reactif Volume Quantite Commentaires
l Amplification de ~énome de VHB
VirionStandard de VHB tn
la VirionStandard I (104 copies/lll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'echantillon
Ib VirionStandard 2 (103 copies/lll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'echantillon
Ic VirionStandard 3 (102 copies/lll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'~clIantillon
ld VirionStandard 4 (10 copies/!ll) 0,2 ml I Calibre l'ADN d'echalItillon
Ie VirionStandard 5 (serum negatif au VHB) 0,2 ml I Contrôle de spe~cificite (negatif)
2 Melange d'amplification de VHB, avec amorces 1,1 ml 4 S'llybride au g~nome d'ADN de VHB O
3 ADN polymérase Taq 25 Ill 1 Amplifie l'ADN de cible
4 ADN de VHB de plasmide (102 copies d'ADN/Ill) 50 ~ll I Contrôle de si~nal (positif) d'ADNc de VHB
ADN de plasmide hetérologue (102 copie~s d'ADN/Ill) I ml 1 Contr(31e interne d'efficacite d'amplification ~ ~,
6 Eau pass~ à l'autoclave 100 Ill I Contrôle de signal (négatif) de fond
7 Tampon de decllarge ou liberation d'ADN
Il Hybridation liquide et marquage par chimioluminescellce
8 Sonde spécifique pour VHB 100 !ll I S'hybride specifiquement à l'ADNc de VHB
9 Sonde spécifique de l'ADN de Cl 100 Ill I S'hybride specifiquement à l'ADN de Cl
10 Tampon de dCnaturation 5 ml I Permet denaturatiolI d'ADNds amplifie~
Il Tampon d'hybridation 50 ml I Permet hybridatioll de la sonde à l'ADN de cible
12 Tampondelavage (x10) 50ml I Eliminel'ADNnon-specifique
13 Billes revetues de streptavidine (ou microplaque)200 (8 puits) I (24) Capture d'ADNc de VHB hybride en hybridatiolI liquide
1~ Solution de tMvail anti-ADNds-PAL 10 ml I Marquage d'ADN cible hybride
15 Solution de substrat de chimiol-"ni-,e~c "ce 10 ml I Permet detection par lulllillescell~e et quantification
CA 02236842 l998-0~-0~
WO 97/17465 PCT/FR96/01736
42
11-.3. REACTIFS ET EQUIPEMENTS
- Centrifugeuse à microtube
- Appareil pour cycle thermique à couvercle chauffant
- Bain-marie pour hybridation liquide
- Luminomètre
11.4. PROTOCOLE POUR PREPARATION D'ECHANTILLON ET
AMPLIFICATION
11.4.1. PREPARATION D'ECHANTILLON
50 ,ul d'échantillons de VirionStandard de VHB et de
10 plasma ou de sérum ont été homogénéisés avec 50 ,ul de
tampon de décharge ou libération d'ADN, et on a ensuite
laissé reposer à 98~C pendant 10 minutes.
Après centrifugation, les ADN restaient exclusivement
dans la phase liquide (10-15 ,ul), tandis que les protéines
15 étaient dans le pellet.
11.4.2. AMPLIFICATION D'ADNc
10 ~l de la phase liquide ont été transférés dans de
nouveaux tubes (200 ,ul). 40 ,ul de mélange d'amplification
de VHB + 5 ,ul de Taq ADN polymérase) ont été placés dans
20 chaque tube. Les tubes ont été transférés dans un appareil
fournissant un cycle thermique, à couvercle chauffant.
- 94~C pendant 5 minutes;
- 35 cycles (94~C pendant 35 s, 60~C pendant 45 s et
72~C pendant 60 s);
- puis encore 72~C pendant 5 minutes.
11.5. VISUALISATION ET QUANTIFICATION
5 ~l (x2) du mélange post-réactionnel ont été ajoutés
dans 2 nouveaux tubes en parallèle et mélangés avec 15 ,Ul
de solution de dénaturation à température ambiante pendant
30 10 minutes. Après addition jusqu'à 180 ~l (x2) de solution
d'hybridation contenant une sonde spécifique pour VHB ou
une sonde spécifique pour l'ADN du contr81e interne (CI),
vortex, puis transfert à la pipette dans le tube de billes
revetues de streptavidine ou transfert dans le puits d'une
35 microplaque revetue de streptavidine, puis 2 heures
CA 02236842 1998-0~-0~
WO97/17465 PCT~R96/01736
43
d'incubation à 37~C sur une secoueuse, la solution a été
jetée et chaque puits ou alvéole a été lave 3 fois avec
200 ~1 de tampon de lavage. 200 ~1 des anticorps anti-
ADNds conjugués avec de la phosphatase alcaline (PAL) ont
été ajoutés, suivis d'une incubation pendant 30 minutes à
37~C sur une secoueuse. Après lavage 3 fois avec 200 ~1 de
tampon de lavage, 100 ~1 de solution de substrat de
chimioluminescence ont été ajoutés. Ensuite, la
microplaque a été immédiatement transférée sur un
luminomètre pour comptage de chimioluminescence et édition
des résultats. Les nombres de particules de VHB par ml de
chaque échantillon de plasma/sérum peuvent être
enregistrés par un système automati~ue informatisé
utilisant la courbe étalon générée à partir du
VirionStandard de VHB (quantification absolue).
