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PURIFICATION D'ADN PLASMIDIQUE DE QUALITE PHARMACEUTIQUE
La présente invention conc~rne un nouveau procédé pour la pllrific~tion
d'ADN. Le procédé selon l'invention permet de purifier rapi~lemPnt de l'ADN double
brin lltili~hle pharmacologiq~lemçnt, Plus particulièrement, le procédé de pllrifi~tion
5 selon l'invention ne fait inlel ven r que de la diafiltration et des chro--,alographies.
Les techniques de thérapie génique et cellulaire conn~ çnt actuell~m~n1 un
developpement extraordinaire. Néanmoins, ces techniques impliquent la pos.eihilité de
produire des quantités importantes d'ADN de pureté pharmacologique, en particulier
d'ADN pl~mi~lique. En effet dans ces nouvelles thérapies, le met~ ment est souvent
10 con.~tit~le par l'ADN lui-même, et il est essentiel de pouvoir le fabriquer dans des
quantités adaptées, l'isoler et le purifier de manière app,~.priée à un usage
thérapeutique chez l'homme, notamment par voie i..~aveilleuse.
Ces problèmes de quantités et de pureté n'ont pas été pris en compte dans les
méthodes classiques d'isolement de l'ADN. De ce fait les méthodes utili~ee~ en
laboratoire ne sont pas transposables dans le domaine de l'industrie pharmace~ltique
pour purifier de l'ADN pl~smi~lique~ Deux de ces méthodes sont les plus lutili.cé~s et
sont celles qui donnent les meilleurs résultats. Elles consistent à partir d'un lysat
bactérien brut et à l'enrichir en ADN pl~mi~ique en ~limin~nt un maximum de
cnnt~min~nt~ En particulier le Iysozyme du blanc d'oeuf est utilisé pour casser la paroi
bactérienne puis le Iysat est centrifugé pour ~liminer les débris celllll~ires. Le
st~rn~ nt est ensuite soumis à l'action d'une Rnase pancréatique d'origine animale qui
permet d'Plimin~r l'ARN, qui représente à ce moment environ 75% des acides
nucléiques présents.
Les protéines sont alors précipitées par un mélange phénol/
~ 25 chloroforme/isoamyl-alcool. Le surnageant obtenu après centrifugation est débarassé
des protéines et de l'ARN mais contient encore de grandes qu~ntiteS d'ADN
chromosomique qui doit être éliminé lors d'une étape supplémentaire. Cette étapeconsiste en une ultracentrifugation en présence de Bromure d'Ft~li(litlm et de Chlorure
de Césium. Les trois types d'acides nucléiques que sont l'ADN chromosomique, l'ADN
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pl~mitlique et l'ARN ont une plus ou moins grande capacite à fixer le b~mu~e
d'éthidium. De ce fait ils se séparent en trois phases (lictinctes lors d'une
ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium.
Une variante de ce protocole consiste à faire suivre l'action de la Rnase
5 pancréatique par une réduction en présence d'un détergent alc~lin,~ivie par une
extraction au phénoV chloroforme. L'ADN est alors précipité par de l'éthanol, remis en
suspension et reprécipité au polyéthylène glycol.
Ces deux méthodes qui permettent d'obtenir une solution d'ADN pl~mi~ ue
sont cependant in~ltili~hles pour la production industrielle d'un produit de pureté
10 pharmaceutique. En effet l'utilisation d'enzymes d'origine animale pose problème. Ainsi
le lysozyme et la Rnase pancréatique, du fait de leur origine, risquent d'introduire une
cc,-,la~ tion virale dans le produit final. De plus, les solvants organiques sont
extrèmement toxiques et doivent être ~?limines si l'on veut pouvoir utiliser le produit
comme médicament. Ces solvant-infl1lic~nt également une a~ nt~tion considérable
15 des coûts.liée not~mm~nt à leur stockage, leur lltilis~tion dans des conditions de
sécurité maximales et l'~limin~tion des déchets toxiques qu'ils imposent, et aussi en
raison de la difficulté rencontrée pour réussir à valider l'élimin~tion complète de tels
produits de la solution finale. Le bromure d'éthidium est quand à lui tellement toxique,
mutagène et tératogène que sa présence même sous forme de traces ne peut être
20 tolérée dans un produit à destin~tion pharmaceutique. L'utili~ation de solvants, de
réactifs toxiques, de même que d'enzymes d'origine animale est incompatible avec un
procédé industriel répondant aux Bonnes Pratiques de Fabrication.
La présente invention décrit un nouveau procédé simple et particulièrement
efficace pour la purification d'ADN. Le procédé décrit dans la présente ~em~n-le25 permet la production en grande quantité d'un ADN de très grande pureté. D'unemanière particulièrement avantageuse le procédé décrit dans la présente dem~n~lepermet d'éviter l'emploi de solvants organiques toxiques et d'enzymes d'origine
~nim~le Il permet également de s'affranchir de centrifugations nombreuses et
f~ti~ u~t~c difficiles à extrapoler et de faible ren~em~nt en raison notamment d'étapes
30 de précipitation au PEG, à l'acétate d'amm~-nit~m ou au CaC12. Le procédé selon
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l'invention permet ég~lemçnt d'obtenir de grandes quantités d'ADN (100 mg, lg, 10 g
ou plus) en un seul lot, sans ~liffi~llté technique particulière. En outre le procédé selon
l'invention fait appel à des méthodes compatibles avec les Bonnes Pratiques de
Fabrication et permet d'obtenir un ADN de qualité pharmaceutique.
Un premier objet de l'invention cQnc~me un procédé pour la purifi~atic-n
d'ADN double-brin permettant d'obtenir très rapi-lement de grandes q~l~n~;tes d'ADN
pl~mit1ique de pureté pharmaceutique, faisant .n~- ~nir une étape de
chrom~tographie sur colonne hydro~yapa~ile sous forme céramique. L'hydlvAy~palile
sous forme cri~talline était déjà connue mais, du fait de sa fragilité, d'un emploi difficile
et limité. La forme céramique est beaucoup plus rési.~t~nte autant sur un plan physique
que sur un plan chimique.
D'une manière préférée, le procédé de l'invention comprend deux étapes de
chrom~tographie, l'une au moins étant une chromatographie sur hyd~oxyapatile.
Avantageueement, la deuxième chromatographie est une chromatographie
d'affinité ou d'échange d'ions. Les deux chromatographies peuvent être faites dans un
ordre indifférent.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le procédé selon
l'invention comp~end une étape de chromatographie sur colonne hydroxy~pa~ile et une
étape de chromatographie d'affinité Triple-Hé}ice. La chromatographie d'affinitéTriple-Hélice est basée sur l'utilisation d'un support sur lequel est couplé de manière
covalente un oligonucléotide capable de former par hybridation une triple hélice avec
une séquence spécifique présente sur ledit ADN. Les deux chromatographies peuvent
être faites dans un ordre indifférent.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend une
étape de chromatographie sur colonne d'hydroxy~palile et une étape de
chromatographie d'échange d'anions.
Avantageusement, le procédé de l'invention comprend en outre une étape de
diafiltration. Celle-ci est généralement réalisée avant les chromatographies.
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Une étape importante du procédé de l'invention fait inte, venir une
chromatographie sur colonne hydroxyapatite.
L'hydroxyapatite est un phosphate de calcium complexe comportant dix
atomes de calcium. La forme céramic plus stable que la forme cri.ct~lline à été mise
5 au point par Bio-Rad Laboratories et Asahi Optical Co., Ltd. Le composé céramique
a les mêmes propriétés que le composé cristallin sans en avoir les lirnitations
physiques; ce matériau est surtout utilisé en chromatographie pour la purification des
protéines, mais présente des avantages et permet d'obtenir de très bons résultats lors
de la purification d'acides nucléiques. Il est macroporeux, sphérique, chimiquement et
10 physiquement très stable et peut être réutilisé plusieurs tli7~ines de fois sans pertes
d'efficacité. Cette forme ceramic peux supporter des pressions élevées, des pH très
élevés, des flux très rapides et les solvants organiques.
La chromatographie sur colonne de ceramic hydoxyapatite est un type de
chromatogaphie particulier qui n'est ni une chromatographie d'affinité ni un échange
15 d'ion aux sens stricts. Elle ell,preillte ses propriétés à ces deux types de
chromatographies et l'on pourrait la définir comme a une pseudo-affinité et un pseudo
échange d'ions.
Les acides nucléiques se lient à l'hydroxyapatite par la vertu d'interactions
entre les groupes phosphate du squelette du polynucléotide et les résidus calcium du
20 support. Les acides nucléiques peuvent être élués de façon différentielle en faisant
varier la force ionique des tampons phosphates. Les acides nucléiques peuvent être
ainsi séparés des protéines et entre eux, les ADN des ARN et les ADN simple brins
des ADN double-brins. Les ARN sont ceux qui se lient de la manière la moins solide
et peuvent être élués avec un tampon de force ionique relativement faible. Les ADN
25 simple brins sont également moins fortement fixé que les ADN double-brins qui sont
plus solidement liés au support et nécéssitent un tampon plus fort.
Le matériel biologique dans un tampon phosphate de faible force ionique est
déposé sur la colonne. Les acides nucléiques ADN et ARN sont fixés. Un second
tampon, de force ionique plus élevée, est ensuite utilisé pour éluer l'ARN qui est
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quasiment complétement éliminé à ce stade. Un troisième tampon de force ionique
supérieure est utilisé pour éluer l'ADN double brin qui est recueilli. L'utilisation
d'hydroxyapatite dans le procédé de l'invention perrnet de récupérer de l'ADN double
brin ayant un très grand degré de pureté.
Comme indiqué ci-avant, un mode de réalisation préféré de l'invention
comprend en outre une étape de chromatographie d'affinité triple hélice.
La chromatographie d'affinité triple hélice consiste à faire passer la solution
obtenue sur un support sur lequel est couplé de manière covalente un oligonucléotide
capable de forrner par hybridation une triple hélice avec une séquence spécifique
présente sur l'ADN à purifier (WO96/18744).
La séquence spécifique peut être une séquence présente naturçllem~nt sur
l'ADN double-brin, ou une séquence synthétique introduite artificiellement dans
celui-ci. Les oligonucléotides utilisés dans la présente invention sont des
oligonucléotides hybridant directement avec l'ADN en double-brin. Ces
15 oligonucléotides peuvent contenir les bases suivantes:
- thymidine (T), qui est capable de former des triplets avec les doublets A.T
de l'ADN double-brin (Rajagopal et al, Biochem 28 (1989) 7859);
- adénine (A), qui est capable de forrner des triplets avec les doublets A.T de
l'ADN double-brin;
- guanine (G), qui est capable de forrner des triplets avec les doublets G.C de
l'ADN double-brin;
- cytosine protonée (C+), qui est capable de forrner des triplets avec les
doublets G.C de l'ADN double-brin (Rajagopal et al précitée);
- uracile (U) qui est capable de former des triplets avec les paires de bases
A.U ou A.T.
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Préférentiellement, l'oligonucléotide utilisé comprend une séquence
homopyrimidique riche en cytosines et la séquence spécifique présente sur l'ADN est
une sé~uence homopurique-homopyrimidique. La présence de cytosines permet
d'avoir une triple hélice stable à pH acide, où les cytosines sont protonées, et5 déstabilisée à pH alcalin, où les cytosines sont neutralisées.
Pour permettre la fonnation d'une triple-hélice par hybridation, il est
important que l'oligonucléotide et la séquence spécifique présente sur l'ADN soient
complémentaires. A cet égard, pour obtenir les meilleurs rendements et la meilleure
sélectivité, on utilise dans le procédé de l'invention un oligonucléotide et une10 séquence spécifique parfaitement complémentaires. Il peut s'agir en particulier d'un
oligonucléotide poly-CTT et d'une séquence spécifique poly-GAA.A titre d'exemple,
on peut citer l'oligonucléotide de séquence 5'-
GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(GAGG(CTT)7;(SEQ ID n~l), dans
lequel les bases GAGG ne forment pas de triple hélice mais permettent d'espacer
15 l'oligonucléotide du bras de couplage. On peut également citer la séquence (CTT)7
(SEQ ID n~2). Ces oligonucleotides sont capables de former une triple-hélice avec
une séquence spécifique comportant des motifs complémentaires IGAA). Il peut
s'agir en particulier d'une région comportant 7,14OU17 motifs GAA. comme décr,t
dans les exemples.
Une autre séquence d'intérêt spécifique est la séquence:
5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3'(SEQID n~3).
Cette séquence forme une triple hélice avec les oligonucléotides
5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'(SEQ ID n~4) ou
5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3'(SEQID n~5).
Dans ce cas, l'oligonucléotide se fixe dans une orientation anlipar~llèle au brin
polypurique. Ces triples hélices ne sont stables qu'en présence de Mg2+ (Vasquez et
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al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251; Beal et Dervan, Science, 1991, 251, 1360-
1363).
Comme indiqué ci-avant, la séquence spécifique peut etre une séquence
~ présente naturellement sur l'ADN double-brin, ou une séquence synthétique
5 introduite artificiellement dans celui-ci. Il est particulièrement intéressant d'utiliser un
oligonucleotide capable de former une triple-hélice avec une séquence présente
naturellement sur l'ADN double-brin, par exemple dans l'origine de réplication d'un
pl~micle ou dans un gène marqueur. A cet égard, la clem~n~eresse a effectué des
analyses de séquence de plasmides et a pu montrer que certaines régions de ces ADN,
10 not~mm~nt dans l'origine de réplication, possédent des régions homopurique-
homopy,i",idiques. La synthèse d'oligonucléotides capables de former des triple-hélices avec ces régions homopurique-homopyrimidiques naturelles permet
avantageusement d'appliquer le procédé de l'invention a des plasmides non modifiés,
notamment des plasmides comr~erciaux de type pUC, pBR322, pSV, etc. Parmi les
15 séquences homopuriques-homopyrimidiques naturellement présentes sur un ADN
double brin, on peut citer une séquence comprenant tout ou partie de la séquence 5'-
CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3'(SEQ ID n~6) présente dans l'origine de
réplication ColE1 de E. coli. Dans ce cas, l'oligonucléotide formant la triple hélice
possède la séquence: 5'-GAAGGG~Cl-rCCCTClTICC-3'(SEQ ID n~7) et se fixe
20 alternativement sur les deux brins de la double hélice, comme décrit par Beal et
Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) et Jayasena et Johnston (NucleicAcids Res. 1992, 20, 5279-5288). On peut aussi citer la séquence 5'-
GAAAAAGGAAGAG-3'(SEQ ID n~8) du gène de la ~-lactamase du plasmide
pBR322 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508).
25 L'utilisation d'un oligonucléotide capable de former une triple-hélice avec une
séquence présente dans une origine de réplication ou un gène marqueur est
particulièrement avantageuse car elle permet, avec le même oligonucléotide, de
purifier tout ADN contenant ladite origine de réplication ou ledit gène marqueur. Il
n'est donc pas néce~.c~ire de modifier le pl~mide ou l'ADN double-brin pour lui
30 incorporer une séquence spécifique artificielle.
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Bien que des séquences parf:litem~nt compl~ nt~ires soient préférées il est
ent~?n~u toutefois que certains mésappariements peuvent être tolérés entre la s~équ~nçe
de l'oligonucléotide et la séquence présente sur l'ADN, dès lors qu'ils ne con~ çnt
pas à une perte trop grande d'affinité. On peut citer la séquence 5'-
5 AAAAAAGGGAATAAGGG-3'(SEQ ID n~9) présente dans le gène de la ~ ct~m~e
de E. coli. Dans ce cas, la thymine inlel~u,l")anl la séquence polypurique peut être
reconnue par une guanine du troisième brin, formant ainsi un triplet ATG qui eststable quand il est encadré par deux triplets TAT (Kiessling et al., Biochemistry,
1992, 31, 2829-2834).
Selon un mode de réalisation particulier, les oligonucléotides de l'invention
co,l-~)renilent la séquence (CCT)n, la séquence (CT)n ou la séquence (CTT)n, dans
laquelle n est un nombre entier compris entre 1 et 15 inclus. Il est particulièrement
avantageux d'utiliser des séquences de type (CT)n ou (Cl~r)n. La demanderesse a en
effet montré que le rendement de purification était influencé par la quantité de C dans
15 l'oligonucléotide. En particulier, comme indiqué dans l'exemple 7, le rendement de
purification a1lgmçnte lorsque l'oligonucleotide comporte moins de cytosines. Il est
çnten-lu que les oligonucléotides de l'invention peuvent également combiner des
motifs (CCT), (CT) ou (CTT).
L'oligonucléotide utilisé peut être naturel (composé de bases naturelles, non
20 modifiées) ou modifié chimiquement. En particulier, l'oligonucléotide peut présenter
avantageusement certaines modifications chimiques permettant d'augmenter sa
résistance ou sa protection vis à vis des nucléases, ou son affinité vis à vis de la
séquence spécifique.
Selon la présente invention on entend aussi par oligonucléotide tout
25 enchainement de nucléosides ayant subi une modification du squelette dans le but de
le rendre plus résistant aux nucléases. Parmi les modifications possibles on peut citer,
les oligonucléotides phosphorothioates qui sont capable de former des triples hélices
avec l'ADN (Xodo et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322-3330), de même que les
oligonucléotides po.~éd~nt des squelettes formacétal ou méthylphosphonate
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(~ttetlc~i et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7767-7768). On peut également
utiliser les oligonucléotides synthétisés avec des cc-anomères de nucléotides, qui
forment également des triples hélices avec l'ADN (Le Doan et al., Nucleic Acids
Res., 1987, 15, 7749-7760). Une autre modification du squelette est la liaison
5 phosphor~mid~te. On peut citer par exemple la liaison internucléotidique N3'-P5
phosphor~mid~te décrite par Gryaznov et Chen, qui donne des oligonucleotides
formant avec l'ADN des triples hélices particulièrement stables (J. Am. Chem. Soc.
1994, 116, 3143-3144). Parmi les autres modifications du squelette, on peut citer
également l'utilisation de ribonucléotides, de 2'-O-méthylribose, de
phosphodiester,.. (Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 116, 3143-3144). Le
squelette phosphoré peut enfin être remplacé par un squelette polyamide comme dans
les PNA (Peptide Nucleic Acid), qui peuvent également former des triples hélices(Nielsen et al., Science, 1991, ~, 1497-1500; Kim et al., J. Am. Chem. Soc., 1993,
115, 6477-6481)) ou par un squelette à base de gll~ni-line, comme dans les DNG
(déoxyribonucleic guanidine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097-6101),
analogues polycationiques de l'ADN, qui forment également des triples hélices.
La thymine du troisième brin peut aussi être remplacée par une 5-
bromouracile, ce qui augmente l'affinité de l'oligonucléotide pour l'ADN (Povsic et
Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059-3061). Le troisième brin peut
20 également contenir des bases non naturelles, parmi lesquelles on peut citer la 7-
déaza-2'-déoxyxanthosine (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), la
1- (2-déoxy-~-D-ribofuranosyl)-3-méthyl-5-amino-1H-pyrazolo[4,3-dlpyrimi-line-7-
one (Koh et Dervan,J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), la 8-oxoadenine, la2-aminopurine, la 2'-O-méthyl-pseudoisocytidine, ou toute autre modification connue
25 de l'homme du métier (voir pour revue Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol.
1993, 3, 345-356).
Un autre type de modification de l'oligonucléotide a plus particulièrement
pour objet d'améliorer l'interaction et/ou l'affinité entre l'oligonucléotide et la
séquence spécifique. En particulier, une modification tout à fait avantageuse selon
30 I'invention consiste à méthyler les cytosines de l'oligonucléotide. L'oligonucléotide
~ . . _
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ainsi méthylé présente la propriété remarquable de former une triple hélice stable
avec la séquence spécifique dans des zones de pH plus proches de la neutralité(> 5).
Il permet donc de travailler à des pH plus élevés que les oligonucléotides de l'art
antérieur, c'est à dire à des pH où les risques de dégradation de l'ADN pl~mi~lique
5 sont bien inférieurs.
La longueur de l'oligonucléotide utilisé dans le procédé de l'invention est d'aumoins 3 bases, et de préférence, comprise entre 5 et 30. On utilise de manière
avantageuse un oligonucléotide de longueur supérieure à 10 bases. La longueur peut
être adaptée au cas par cas par l'homme du métier en fonction de la sélectivité et de la
10 stabilité de l'interaction recherchées.
Les oligonucléotides selon l'invention peuvent être synthétisés par toute
technique connue. En particulier, ils peuvent être préparés au moyen de synthétiseurs
d'acides nucléiques. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut bien
évidemment être utilisée.
Pour permettre son couplage covalent sur le support, l'oligonucléotide est
généralement fonctionnalisé. Ainsi, il peut être modifié par un groupement terminal
thiol, amine ou carboxyle, en position 5' ou 3'. En particulier, l'ajout d'un groupe
thiol, amine ou carboxyle permet, par exemple, de coupler l'oligonucléotide sur un
support portant des fonctions disu}fure, maléimide, amine, carboxyle, ester, époxyde,
20 brc,,~lure de cyanogène ou aldéhyde. Ces couplages se forment par établi~ement de
liaisons disulfure, thioether, ester, amide ou amine entre l'oligonucléotide et le
support. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut être utilisée, telle
que des réactifs de couplage bifonctionnels, par exemple.
Par ailleurs, pour améliorer l'hybridation avec l'oligonucléotide couplé, il peut
25 être avantageux que l'oligonucléotide contienne un "bras" et une séquence de bases
"espaceur". L'utilisation d'un bras permet en effet de fixer l'oligonucléotide à une
t~nce choisie du support permettant d'améliorer ses conditions d'interaction avec
l'ADN. Le bras est avantageusement con~titue d'une chaîne carbonée linéaire,
comprenant 1 à 18, et de préférence 6 ou 12 groupes (CH2), et d'une amine qui
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permet la liaison à la colonne. Le bras est relié a un phosphate de l'oligonucléotide ou
d'un "espaceur" composé de bases n'interférant pas avec l'hybridation. Ainsi,
"l'espaceur" peut comprendre des bases puriques. A titre d'exemple, "l'espace~r" peut
comprendre la séquence GAGG. Le bras est avantageusement composé d'une chaîne
5 carbonée linéaire comprenant 6 ou 12 atomes de carbones.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, dirfér~ s types de supports
peuvent être utilisés. Il peut s'agir de supports de chromatographie fonctionn~ és, en
vrac ou précon(litionnés en colonne, de surfaces plastiques fonctionn~ é~ ou de
billes de latex fonctionnalisées, magnétiques ou non. Il s'agit préférentiellement de
10 supports de chromatographie. A titre d'exemple, les supports de chromatographie
pouvant être utilisés sont l'agarose, l'acrylamide ou le Dextran ainsi que leurs dérivés
(tels que Séphadex, Sépharose, Superose,...), les polymères tels que le
poly(styrènedivinylbenzène), ou la silice greffée ou non greffée, par exemple. Les
colonnes de chromatographie peuvent fonctionner en mode de diffusion ou de
15 perfusion.
Pour obtenir de meilleurs rendement de purification, il est particuliérement
avantageux d'utiliser, sur le plasmide, une séquence comportant plusieurs positions
d'hybridation avec l'oligonucléotide. La présence de plusieurs positions d'hybr~dation
favorise en effet les interactions entre ladite séquence et l'oligonucléotide, ce qui
20 conduit à améliorer les rendements de purification. Ainsi pour un oligonucléotide
comportant n réphitions de motifs (CCT), (CT) ou (CTT), il est préférable d'utiliser
une séquence d'ADN comportant au moins n motifs complémentaires et, de
p~efé~ ce, n+1 motifs complémentaires. Une séquence portant n+1 motifs
complémentaires offre ainsi deux positions d'hybridation à l'oligonucléotide.
25 Avantageusement, la séquence d'ADN comporte jusqu'a 11 positions d'hybridation,
c'est à dire n+10 motifs complémentaires.
Selon un autre mode de réalisation la chromatographie sur colonne
d'hydroxyapatite céramique est suivie ou précédée d'une étape de chromatographiesur colonne d'échange d'anions. On utilise de préférence une colonne échangeuse
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d'anions faibles,. les anions forts ont en effet la propriété de fixer très fortement l'ADN,
si fortement qu'il est très difficile de récupérer le produit (le rendement est alors
inférieur à 605c). C'est pourquoi la ~lPrn~n~eresse utilise des échangeurs d'anions
faibles qui ne retiennent pas l'ADN pl~cmi~lique mais qui fixent les ARN r~ci-hlelc.
S Comme indiqué ci-avant, le procédé selon l'invention comprend
avantageusement une étape de diafiltration. La diafiltration est une étape de
concentration de l'érh~ntillon au cours de laquelle on élimine l'eau et les petites
molécules (telles que les sels, les protéines et les acides nucléiques de petite taille)
présentes dans le lysat clair. Les sels sont remplacés par un tampon phosphate pour la
chromatographie. Aprés diafiltration, la solution est de 5 a 50 fois plus concentrée
que la solution de départ (le facteur de concentration dépend du volume de la solution
de départ).
L'utilic~tiQn de la diafiltration présente plusieurs av~n~g~s. Elle permet entreautres d'éviter l'utilisation de solvants organiques tel que l'isopropanol dont l'emploi
nécessiterait une in.ct~ tion anti-déflagrante. De plus, cette technique est utili~hle
pour des volumes très variables. Il suffit en effet d'allgmenter la surface des
membranes en fonction du volume à traiter.
On utilise avantageusement pour la diafiltration un appareil servant de support
à une membrane de polyether sulfone modifié ou d'acétate de cellulose modifié
permettant d'avoir un flux de liquide à débit régulable. Ces membranes sont définies
par leur point de coupure qui est en valeur nominale la taille maximale des molécules
pouvant traverser ladite membrane. Rapporté à une valeur réelle une membrane dont
le point de coupure est égal à 100 kD permet de retenir des molécules de taille
supérieure à 30 kD.
Un procédé préféré selon l'invention comprend les étapes suivantes:
diafiltration,
chromatographie sur colonne de Ceramic hydroxyapatite,
et chromatographie d'affinité par hybridation spécifique entre une séquence de
l'ADN et un oligonucléotide avec formation d'une triple hélice.
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Le procédé selon la présente invention peut être utilisé pour purifier tout typed'ADN double brin. Il s'agit par exemple d'ADN circulaire, tel qu'un pl~cmi~e portant
généralement un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique. Ce pl~mi~le peut porter
également une origine de réplication, un gène marqueur, etc.... Ce procédé permet
5 aussi de purifier de l'ADN, linéaire ou circulaire, portant une séquence d'intérêt, à
partir d'un mélange comprenant des ADN de différentes séquences.
Généralement, I'ADN de départ est produit par un microo~ ..,e hôte
modifié par les techniques de l'ADN recombinant. A cet égard l'hôte c-~nten~nt l'ADN
double brin que l'on cherche à récupérer est tout d'abord multiplié et amplifié. Pour ce
10 faire on utilise les techniques classiques de fermentation permettant d'obtenir une forte
densité cellulaire. La technique la plus courament employée est celle dite de "fed-
batch" qui est abondament décrite dans la litterature (Jung et al. Ann. Inst. Pasteurl
Microbiol. 1988, 139, pl29-146; Bauer et al. Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, p81-94).
La fermentation est suivie par une Iyse des cçlIul~s. Pour Iyser les cellules on15 peut utiliser soit un système mécanique soit un sysème chimique suivant le type de
cellules concerné ou suivant que l'on souhaite travailler sur Iysat brut ou sur lysat
clair. Pour la Iyse mécanique, on utilise de preré~eIlce des systèmes qui ne dénaturent
pas l'ADN (agitation, choc thermique, choc osmotique). Ces méthodes ne sont pas
adaptées à l'extraction d'ADN à partir des cellules procaryotes. En effet les
20 traitements mécaniques utilisés pour casser des cellules procaryotes sont dénaturant
pour l'ADN. La Iyse mécanique est préférentiellement réservée aux cellules
eucaryotes, pour les cellules procaryotes on préférera une Iyse chimique.
Les cellules procaryotes sont Iysées chimiquement par toute technique connue
de l'homme du métier (détergents, Iysozymes, éventuellement combinés à un choc
25 thermique, etc). Préférentiellement, on utilise un mélange de soude et de SDS. Durant
ce traitement le pH passe à 12. Le pH du Iysat ainsi obtenu est ensuite ramené àenviron 6 ce qui entraine la précipitation des protéines d'une partie de l'ADN
chromosomique et de l'ARN. On élimine ce précipité par centrifugation.
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Un mode de réalisation préféré de l'invention consiste tout d'abord à faire subir
aux cellules contenant l'ADN double brin à purifier une lyse chimique qui permetd'obtenir un Iysat clair. Le lysat clair ainsi obtenu subit une diafiltration et c'est le
concentrat ainsi obtenu qui est chromatographié sur colonne hy~J~Ly~pa
5 céramique.
Le lysat cellulaire peut être un lysat de cellules procaryotes ou eucaryotes.
S'agi~s~nt de cellules procaryotes, on peut citer par exemple les bactéries E.
ÇQ!i, B. subtilis. S. typhimurium ou Streptomyces. S'agissant de cellules eucaryotes,
on peut citer les cellules animales, les levures, les champignons, etc..., et plus
10 particulièrement, les levures Kluyveromyces ou Saccharomyces ou les cellules COS,
CHO, Cl27, NIH3T3, etc....
Le procédé de l'invention est particulièrement avantageux puisqu'il permet
d'obtenir, de manière rapide et ~imple, de l'ADN plasmidique de très haute pureté. En
particulier, comme illustré dans les exemples, ce procédé permet de séparer
15 efficacement l'ADN pl~cmidique considéré de composants cont~min~nt~, tels quel'ADN chromosomique fragmenté, I'ARN, les endotoxines, les protéines, les
nuclé~ces, etc.... Plus particulièrement, le procédé de l'invention permet d'obtenir des
préparation d'ADN double brin, not~mm~nt pl~cmi~ique, pratiquement exemptes
d'ADN chromosomique (< 0,5%). En outre les prepald~ions d'ADN obtenùes ont
20 également une teneur en endotoxines très faible (< 50 EU/mg), compatible avec une
utilisation pharmaceutique.
La demanderesse a montré que, de manière tout à fait étonn~nte, la
combinaison des deux étapes décrites plus haut à savoir chromatographie sur colonne
Hydroxyapatite suivie ou précédée par une chromatographie Triple Hélice, permet
25 d'obtenir des pl~pala~ions d'ADN pl~mi~lique ayant une teneur en ADN
chromosomique de 0.01%. De manière tout à fait préférentielle l'invention concerne
également des p~epardtion d'ADN pl~midique ayant une teneur en ADN
chromosomique inférieure ou égale à 0.01~,7o.
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L'invention concerne eg~l~mPnt des préparations d'ADN pl~mi~ ue ayant une
teneur en endotoxines inférieure à 50 EU/mg, p~l~ltn~iell~m~nt inférieure à 10 EU/
mg. La teneur en endotoxines est donc très en dessous de la teneur autorisée qui est de
350 EU/ injection pour une personne pesant 70 kg (une EU est une Endotoxin Unit et
est égale à 100 pg).
La présente invention décrit donc des compositions comprenant de l'ADN
pl~mi~1ique ~-tili.~able pharm~ceutiquement not~mm~nt en thérapie génique ou
cellulaire in vivo ou ex vivo. A cet égard, l'invention a ég~lement pour objet une
composition pharm~ceutique comprenant de l'ADN double brin, linéaire ou
plasmidique, préparé selon le procédé décrit ci-avant.
Les compositions peuvent comporter l'ADN pl~cmi~lique "nu" ou associé à des
vecteurs de transport tels que les liposomes, les nanoparticules, les lipides cationiques,
les polymères, des protéines ou virus recombin~nts, etc.
La présente dem~de sera décrite plus en détail à l'aide des exemples qui
suivent, qui doivent être con~iderés comme illustratifs et non limit~tif~
MATERIEL ET METHODES
l. Construction du plasmide pXL2784.
Dans les expériences qui suivent on a utilisé un pl~mide spécifique pXL2784.
Ce plasmide comporte une c~3csette conten~nt le promoteur du Cytomégalovirus, legène codant pour la luciférase et une séquence homopurique- homopyrimidique
(GAA)17. La construction de ce plasmide est décrite ci-après. Il est bien évident que
le procédé selon l'invention n'est pas limité au pl~mi~e décrit.
1.1. Description du plasmide pXL2784
Le plasmide pXL2784 est construit à partir du vecteur pl~cm~ ue pXL2675
(2,513 kb), réplicon minimal du plasmide ColE1 issu du plasmide pBluescript (ORI) et
ayant pour marqueur de sélection le gène du transposon Tn5 codant pour la résistance
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à la kanamycine. Le plasmide pXL2784 contient aussi une séquence homopurique-
homopyrimidique (GAA)17 issue du pl~mide pXL2563 et pouvant se lier à un
oligomère (CTT)n où n=1 à 17, pour générer localement une structure triple hélice et
permettre une purification par affinité. Le plasmide pXL2784 possède le locus cer
(382 bp) issu du p~ e ColE1 et cloné dans le plasmide pXL565; le locus cer
contient une séquence site spécifique des recombinases XerC/XerD et conduit à larésolution de multimères de pl~mides. Le transgène cloné sur ce pl~mi~le pXL2784est une cassette d'expression (3,3 kb) du gène luc codant pour la luciférase de
Photinus pyralis sous contrôle du promoteur P CMV cytomégalovirus hllm~in, cettec~sette provient du pl~micle pXL2622.
Le plasmide a une taille de 6390 bp. La carte du plasmide pXL2784 est
présentée sur la figure 1,~ ét sa construction est détaillée ci-après.
1.2. Vecteur minimal pXL2675
Après avoir rendu l'extrémité BsaI franche par action du fragment de Klenow,
le fragment BsaI-PvuII de 1,15 kb du plasmide pBKS+ ~Stratagen) a été cloné avec le
fragment SmaI de 1,2 kb du plasmide pUC4KIXX (Pharmacia) pour générer le
plasmide pXL2647.
L'oligonucléotide 5542:
5'-AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG AGC
GGCCGCG AGCTCC-3' (SEQ ID N~10)
et roligonucléotide 5543:
5'-AGCTGGAGCT CGCGGCCGCT CTAGAGGATC CGAATTCGAT ATC
CTGCAGC TCGAGA-3'(SEQ ID N~11)
ont été hybridés entre eux puis clonés au site HindIII du pXL2647 générant le
pl~cmil1e pXL2675. Ce p!~mide comprend le multisite HindIII, XhoI, PstI, EcoRV,
EcoRI, BamHI, XbaI, NotI, SstI entre l'origine de réplication et le gène codant pour
la résistance à la kanamycine.
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1.3. Cassette luciférase dans le plasmide pXL2622
Le promoteur CMV contenu dans le fragment MluI-HindIII de 660 bp du
- pl~mi~le pcDNA3 (provenant d'Invitrogen) a été cloné entre les sites MluI-HindIII du
pl~ e pGL2 basic (Promega contient le gène de la luciférase) pour générer le
plasmide pXL2622.
1.4. Pl~cmides pXL2563 et pMTL22-TH contenant une séquence susceptible
de former une triple hélice avec un oli~onucléotide.
L'oligonucléotide 4817:
5'-GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA A
GAAGAAGAA GAAGAAGG-3'(SEQ ID N~12)
et l'oligonucléotide 4818:
5'-AAl~CCl-rCT TCTTClYCl-r CITCTI Cl-rC l-rCTTC~CT TCI~CT
TCTT Cl-rCl~CG-3' (SEQ ID N~13)
ont été hybridés entre eux et clonés aux sites EcoRI et BamHI du pl~mi~
pBluescriptII KS pour former le plasmide pXL2563. Le fragment EcoRI-BamHI de
62 bp est cloné aux sites EcoRI-BamHI du plasmide pMTL22 (P. Minton 1988 Gene
68:139) pour générer le plasmide pMTL22-TH.
1.5. Plasmides pXL565 et pXL2781 contenant le locus cer
Le fragment HpaII de 382 bp du plasmide ColE1 (P-L Biochemicals) a été
cloné au site AccI du plasmide M13 mp7 (Messing et coll. 1981 Nucleic Acids Res
9:309) pour former le plasmide pXL565. Le fragment BamHI de 382 bp du pXL565 a
alors été cloné au site ~II du plasmide pSL301 (Invitrogen) pour créer le p~cmi-ie
pXL2781.
1.6. Construction du plasmide pXL2784
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Le fragment BamHI-XhoI du pl~mi~le pXL2781 de 382 bp et cont~on~nt le
locus cer est cloné aux sites BamHI et XhoI du pl~mi~le pXL2675 pour créer le
pl~mide pXL2782.
Le fragment BglII-BamHI du pl~smi~le pMTL22-TH de 62 bp conle~-~nl Ia
séquence (GAA)17 est cloné au site BamHI du pl~crnide pXL2782 pour former le
pl~smi(~e pXL2783.
Enfin le fragment SalI-SpeI de 3,3 kb du plasmide pXL2622 et contPn~nt la
c~.sette de la luciférase est cloné aux sites XhoI et NheI du pl~smi(le pXL2783 pour
créer le pl~mide pXL2784. Il est bien entendu que toute autre c~ssette d'expression
d'un gène peut être insérée à la place de la cassette luciferase
La souche DH1 (Maniatis et al., 1989) contenant ce pl~smi~e est cultivée en
fermenteur de 2, 7 et jusqu'à 800 litres. D'autres souches peuvent également êtres
~tli.sée,s.
2. Fermentation
L'hôte contenant l'ADN plasmidique à cultiver peut être obtenu par des
techniques classiques de fermentation (Jung et al. Ann. Inst. Pasteurl Micro~iol. 1988,
139, pl29-146; Bauer et al. Biotechnol. Bioeng. 1976, 18, p81-94) la technique du
fed batch étant préférée. Après fermentation, les cellules sont récupérées, à l'échelle
laboratoire, c'est à dire pour des volumes inférieurs à 51, par centrifugation çl~c~ ue
(20 mn à 10000 rpm) ou par centrifugation en continu pour des volume plus
importants (volumes industriels pouvant aller jusqu'a plusieurs c~.nt~in~s de litres). Les
cellules ainsi récupérées peuvent être utilisées tout de suite ou congelées à - 80~C.
3. Lyse chimique (Iysat clair)
Les cellules sont, le cas échéant, décongelées puis lysées. La lyse chimique se
décompose en trois étapes. La première consiste à remettre en suspension les cellules
dans un tampon Tris 25mM pH 6,8, glucose 50mM, ETDA 10mM ou équivalent. La
lyse des cellules est alors effectuée dans un mélange contenant NaOH 0,2M et SDS
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1G7O. Le pH de la solution est d'environ 12. Le choix d'un détergent ionique s'impose,
en effet un détergent non ionique donne des rendements d'extraction 10 fois plusfaibles. La Iyse est suivie d'une pseudo-neutralisation du milieu en présence d'acétate
de potassium (le pH final de la solution est compris entre 5.5 et 6). Cette ~ci~ifi~tic)n
5 du milieu conduit à l'apparition d'un précipité con~enanl les protéines, une partie de
l'ADN chromosomique et de l'ARN. Cette précipitation est due à la réaction du
sodium dodecyl sulfate (SDS) avec l'acétate de potassium qui forment un précipité
blanc de potassium dodecyl sulfate
Le précipité doit être éliminé. Pour ce faire on procède par centrifugation en
pots (15 min, 8000 rpm) si les volumes sont inférieurs à 5 litres ou par centrifugation
en continu si les volumes sont plus élévés (> 5 litres). Une autre méthode pour
~limin~r le surnageant consiste à effectuer une filtration sur filtre en profondeur de
porosité supérieure ou égale à 20 !lm (PALL, profile II utilisé selon les spécific~tions
du fabricant).
4. Diafiltration
Le surnageant récupéré après la Iyse chimique est soumis à une diafiltration
afin de concentrer l'ADN pl~mi~1ique et d'~liminer les molécules de petites masse
moléculaire, en particulier les sels qui sont présents à fortes concentrations. Cette
diafiltration se fait sur membrane de point de coupure compris entre 50 et 300 kD
20 suivant la taille des pl~mide~ De préférence on utilise une membrane de point de
coupure 100kD. La valeur de 100kD est une valeur nominale donnée pour des
protéines qui sont des molécules globulaires. On considère que pour les molécules
d'acides nucléiques,qui ont une structure spatiale différente, toutes les molécules ayant
un poids moléculaire inférieur à 30kd sont éliminées. On mesure par HPLC la quantité
25 d'ADN présent dans la solution aprés diafiltration et la quantité présente dans le Iysat
clair. Le rapport ainsi déterminé donne le rendement de cette étape qui est superieur
ou égal à 80~G.
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Au cours de cette diafiltration, les sels sont elimin~s Ils sont remplacés par un
tampon phosphate 10mM. Il est ainsi possible d'appliquer le produit directement sur
une colonne de chromatographie, en particulier de Ceramic HydroxyapatiteTM
L'ADN pl~mi~iique issu de la chromatographie d'affinité triple hélice est de
5 nouveau diafiltré afin de concentrer l'éch~ntillon et d'éliminer les sels indésirables. Ceci
permet d'équilibrer le produit dans le tampon de formulation approprié. Pour cela, une
diafiltration sur membrane de point de coupure compris entre 10 et 50kD est effectué.
Le rendement est supérieur à 80%.
Le produit est ensuite filtré stérilement et soumis à analyses avant forrnulation.
5. Chromatographie sur colonne de Ceramic hydroxyapatiteTM
Le gel de Ceramic HydroxyapatiteTM est coulé dans une colonne de taille
ap,ulop-iée suivant le volume de l'échantillon à purifier et selon la pureté de
l'érh~ntillon de départ. Pour déterminer la taille de la colonne et le volume du gel on
mesure par HPLC la quantité en mg/ml d'ADN présent dans la solution de départ. On
15 estime en effet que au moins 0.1mg d'ADN sont fixés par ml d'Hydroxy~palile cette
valeur pouvant varier jusqu'a 1 mg voir plus en fonction de la quantité d'ARN présent
dans la solution de départ. L'ARN se fixe sur le gel et plus la quantité d'ARN est
importante moins l'ADN pourra se fixer. L'ARN est eliminé par élution différentielle.
La colonne est équilibrée en tampon phosphate de faible force ionique (10 mM).
20 L'é~h~ntillon est déposé sur le gel à un débit linéaire de 50 cm/h. Le gel est ensuite
soumis à un lavage par un tampon phosphate de conductivité plus élévée (150 mM).La majeure partie de l'ARN contenu dans l'é~ ntillon est elimin~ à ce stade. L'ADN
pl~mi-lique est élué en augmentant à nouveau la conductivité du tampon phosphate(250mM). Les derniers contaminants sont élimines par application de NaOH 0.5N qui
25 est neutralisée par du tampon phosphate à forte molarité (500mM) avant réutili~ation
éventuelle de la colonne. Dans le cas d'une production pharmaceutique, ce support a
l'avantage de pouvoir subir une décont~min~tion chimique en place puisqu'il résiste à la
soude 0.5M, agent de nettoyage classi~ue en chromatographie, mais aussi à des fortes
concentrations d'éthanol.
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La résolution de l'hydroxyapatite céramique est excellente. Cette étape du
procédé permet d'éliminer plus de 80% des ARN, 99.9% d'ADN chromosomique et de
imin~l~r d'un facteur 1000 la teneur en endotoxines. De plus cette technologie évite
l'emploi de toutes enzymes d'origine bovine ou autre (pas de Rnase, ni de protéinase
5 K), en outre sa rési~nce aux agents chimiques nous a permis de l'utiliser à ce jour
plus de 40 fois sans problème de reproductibilite. Le rendement de chromatographie
est supérieur ou égal à 80%.
6. Chromatographie d'affinité avec formation d'une triple hélice.
6.1. Préparation de la colonne
0 Matériel: La colonne utilisée est une colonne HiTrap activée au NHS (N-
hydroxysuccinimide, Pharmacia) de 5 ml, connectée sur une pompe péristaltique
(débit < lml/min). L'oligonucléotide spécifique utilisé possède un groupement NH2
en 5'.
Les tampons utilisés dans cet exemple sont les suivants:
- Tampon de couplage: NaHCO3 0,2 M, NaCI 0,5 M, pH 8,3.
- Tampon A: éthanolamine 0,5 M, NaCI 0,5 M, pH 8,3.
- Tampon B: acétate 0,1 M, NaCI 0,5 M, pH 4.
Méthode: La colonne est lavée par 30 ml de HCI 1 mM, puis l'oligonucléotide
dilué dans le tampon de couplage (250 nmoles dans 5 ml) e,st appliqué sur la colonne
20 et laissé 30 minutes à température ambiante. La colonne est lavée 3 fois successives
par 30 ml de tampon A puis 30 ml de tampon B. L'oligonucléotide est ainsi lié
covalemment à la colonne par une liaison CONH. La colonne est stockée à 4~C et
peut être utilisée au moins quatre fois.
6.2. Purification de plasmide
Matériel:
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Le plasmide pXL2784 (décrit en 1) a été purifié sur la colonne HiTrap
couplée à l'oligonucléotide décrite en 7.1. Les tampons utilisés lors de cette
purification sont les suivants:
Tampon F: NaCl 2M, acétate 0,2 M, pH 4,5.
Tampon E :Tris 1 M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.
Méthode:
La colonne est lavée avec du tampon F, puis la solution conten~nt le plasmide
est appliqué sur la colonne et incubé a moins deux heures à température ambiante. La
colonne est lavée avec du tampon F puis l'élution se fait par du tampon E.
7. Chromatographie échangeuse d'ions.
L'échantillon pré-purifié est ensuite soumis à une chromatographie sur colonne
échangeuse d'anions faibles. En effet les anions forts ont la propriété de fixer très
fortement l'ADN, si fortement qu'il est très difficile de récupérer le produit (le
rendement est alors inférieur à 60~o). C'est pourquoi la dern~n~Presse utilise des
15 échangeurs d'anions faibles qui ne retiennent pas l'ADN pl~midillue mais qui fixent les
ARN résiduels. On utilisera donc de préférence un échangeur d'anions faibles de type
DEAE Sepharose ou DEAE hyper D ou équivalents. Le gel est équilibré en tampon
phosphate 10mM, l'échantillon provenant de l'étape de chromatographie sur Ceramic
Hydroxyapatite est directement appliqués sur le gel. L'ARN fixé est ensuite éliminé en
20 appliquant une solution concentrée de NaCI. La décont~min~tion chimique peut être
faite avec une solution de soude 0.5 M ce qui permet de travailler dans de bonnes
conditions d'hygiene (élimin~tion des endotoxines et des risques de contamin~ionmicrobienne.)
8. Dosage de l'ADN plasmidique dans des échantillons complexes par
25 HPLC
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L'objectif de cette méthode est de pouvoir quantifier l'ADN pl~midi(lue au
cours des différentes étapes de purification afin de déterminer des rendements. On peut
ainsi juger quantitativement et qualitativement de l'efficacité des différentes opératiorls
La technique utilisée est la suivante:
Le support chromatographique est un gel Poros R2 de chez Pe,sepLi-~e
Biosystems. Il s'agit d'un support de polystyrènedivinylbenzène, la taille des particules
est de 10 ,um. La taille des pores de perfusion est de 6000 à 8000 Angstroms, la taille
des pores de diffusion étant de 500 à 1000. Le volume du gel est de 1,7ml.
Il s'agit d'une chromatographie paire d'ions. Le système de solvants est eau,
triéthylamine acétate pH 7,1 / triéthylamine acétate acétonitrile 90~o.
Le débit est de 3 mVmin. Nous avons défini le gradient de façon à ~istin~u~r
l'ADN plasmidique des ARN.
L'échantillon de référence est un ADN pl~mi~i~lue purifié sur Qiagen selon les
instructions du fabricant. Sur un gel d'agarose, cet échantillon ne contient que de r
ocDNA et du cccDNA. En HPLC, il ne donne qu'un seul pic. Sa concentration a été
déterminée en mesurant sa DO à 260 nm et en prenant pour base 1 unité DO = 50
~g/ml d'ADN.
Nous avons donc injecté des quantités croi~ntes de ce produit afin d'effectuer
une gamme d'étalonnage.
La surface des pics correspondant au temps de rétention de l'ADN de référence
sont comparés à la gamme. Une quantification peut donc être effectuée.
9. Dosage de l'ADN chromosomique résiduel
L' ADN génomique résiduel est quantifié par PCR en ~Jtili~nt des amorces
dans le gène galK d'E. coli. La séquence des amorces du gène ~ d'E. coli est
(Debouck et al., Nucleic Acids Res., 1985, L3, 1841-1853):
5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (SEQ ID N~14)
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et 5'-CCA AGC l~C ACT Gl-r CAC GAC GGG TGT-3' (SEQ ID N~15).
Le milieu réactionnel comprend, dans du tampon PCR (Promega France,
Charbonnières): 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay); 0,5 ~M en
arnorce; 20 U/ml Taq polymérase (Promega). La réaction est effectuée suivant la
5 séquence: - 5 min. à 95~C
- 30 cycles delO sec. à 95~C
30 sec. à 60~C
1 min. à 78~C
- 10 min. à 78~C.
Le fragment d'ADN amplifié, d'une longueur de 124 paires de bases, est séparé
par électrophorèse sur gel d'agarose à 3% en présence de SybrGreen I (Molecular
Probes, Eugene, USA), puis quantifié par référence à une gamme d'ADN génomique
Ultrapur d'E. coli, souche B (Sigma, réf. D4889).
10. Transfection in vitro de cellules de mammifères
Cette méthode est employée pour doser l'activité biologique du pl~mi~le
purifié par le procédé selon l'invention. Les cellules utilisées sont des NIH 3T3,
en~emenl~ées la veille de l'expérience dans des plaques de culture à 24 puits, à raison
de 50.000 cellules/puits. Le plasmide est dilué dans du NaCl 150 mM et mélangé avec
un lipofectant. On utilise un rapport charges positives du lipofectant/charges négatives
20 de l'ADN égal à 3. Le mélange est vortexé, laissé 10 min~tes à température ambiante,
dilué dans du milieu de culture dépourvu de sérum de veau foetal, puis ajouté aux
cellules, à raison de 1 llg d'ADN par puits de culture. Après deux heures à 37~C, on
ajoute 10% v/v de sérum de veau foetal et les cellules sont incubées 48 heures à 37~C
en présence de 5~o de C02. Les cellules sont lavées deux fois au PBS et l'activité
25 luciférase est mesurée selon le protocole décrit (kit Promega, Promega Corp.
Madison, WI), sur un luminomètre Lumat LB9501 (EG et G Berthold, Evry). Les
protéines som dosées avec la technique BCA (Pierce, Interchim, Asnières).
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11. Techniques diverses:
Le plasmide obtenu, analysé par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration
au bromure d'éthidium, se présente sous la forme d'une seule bande d'ADN circulaire
"super enroulé". Aucune trace d'ADN de haut poids moléculaire (chromosomique), ni
5 d'ARN n'est détectable dans le pl~smi~e purifié.
La concentration en protéines dans les éch~ntillons est mesuré par Micro-BCA
(Pierce) selon les instructions du fabricant.
La concentration en endotoxines est estimée par le dosage LAL (Biosepra)
selon les instructions du fabricant.
Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que les digestions par
des enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, la transformation dans E. coli, la
précipitation des acides nucléiques etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis et al.,
T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual,
second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Labo,aloJy
15 Press, New York; Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith,
J. G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-
1988. John Willey and Sons, New York. ). Les séquences nucléotidiques ont hé
déterminées par la méthode de terminaison de chaînes en suivant le protocole déjà
présenté (Ausubel et al., 1987).
Les enzymes de restriction ont été fournies par New-F.ngl~n~l Biolabs, Beverly,
MA (Biolabs).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont incubés dans un tampon Tris-HCl
pH 7.4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase
du phage T4 (Biolabs, ).
Les oligonucléotides sont synthétisés en utili~nt la chimie des
phos~hl~ramidites protégés en ~ par un g-ol-pe-~lent cyanoéthyl (Sinha, N. D., J.
Biemat, J. McManus and H. Koster. 1984. Polymer support oli~n1lcleotide synthesis,
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W O 97/35002 PCTfFR97/00472
26
XVIII: Use of ~-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of
deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragmentc simplifying deprotection andisolation of the final product. Nucl. Acids Res., 12, 4539-4557; Giles, J. W. 1985.
Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./~ec.) avec le
syrth~ti~eur automatique d'ADN Biosearch 8600 en utili.c~nt les recl-mm~nrl~tions du
fabricant.
Les ADN ligaturés ou à tester pour leur efficacité de L~ansîol"~ation sont
utilisés pour transformer la souche rendue compétente: E. coli DH5a [F / endA1,
hsdR17. supE44. thi-1, recA1, gyrA96, relA1, D(lacZYA-3~F)U169, deoR,
F80dlac(~DM15)]
Les miNp,epaldlions d'ADN plasmidique sont faites suivant le protocole de
Klein et ah, 1980.
Le milieu de culture LB est utilisé pour la croissance des souches d'E. ÇQli
(Maniatis et ah, 1982). Les souches sont incubées à 37~C. Les bactéries sont étalées
sur des boites de milieu LB supplémenté avec des antibiotiques app~op,iés.
EXEMPLES
Exemple 1. Purification d'un ADN plasmidique sur colonne
hvdroxyapatite céramique
1.1. Préparation du lysat clair
Matériel:
Les solutions ut~ ées dans cet exemple sont les suivantes:
Tris 25mM pH 6,8, glucose 50mM, ETDA 10mM: solution 1
NaOH 0,2M et SDS l~o: solution 2
Acétate de potassium 3M, pH 5: solution 3
Méthode:
20û g de cellules sont mises en suspension dans 2200 ml de solution 1. La
solution 2 12200 ml également) est ensuite additionnée. Enfin, 1100 ml de solution 3
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sont rajoutés. Le précipité alors formé est éliminé par centrifugation à 9000 rpm
pendant 30 min. On obtient 5200 ml de surnageant.
1.2. Diafiltration
Matériel:
Membrane Maximate (Filtron) de point de coupure 100 kD de surface 1860
cm2
Tampon: Pho~sph~te de sodium 100 mM pH 6,8
Méthode:
Avant tltilication, la membrane subit une décontamination chimique à la soude
0,5M pendant lH. La soude est ensuite éliminée par de l'eau ppi.
Le surnageant obtenu lors de l'étape 1.1 est concentré environ 10 fois puis
diafiltré contre 4 volumes d'eau puis contre 4 volumes de tampon phosphate 100mMet pH 6,8. Le volume final est de 810 ml. L'éch~ntillon contient alors 224 mg d'ADN
pl~midique déterminé par HPLC.
1.3. Purification sur Ceramic HydroxyapatiteTM
Matériel:
Les tampons utilisés lors de cette purification sont les suivants:
Tampon A = tampon 10 mM phosphate pH 6.8
Tampon B = tampon 150 mM phosphate pH 6.8,
Tampon C = tampon 250 mM phosphate pH 6;8
Tampon D = tampon 500 mM phosphate pH 6,8
NaOH 0,5M
Méthode:
La colonne (de diamètre 113 mm et de hauteur 17 cm) contient 1700 ml de gel.
Avant utilisation, le gel subit une décontamination chimique par de la soude
0,5M pendant 1 heure. La soude est ensuite éliminée par application de tampon D.Puis, la colonne est équilibrée en tampon A.
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On applique sur le gel 610 ml provenant des 810 ml (soit 171 mg) obtenus
précédemment. Le débit est de 60 ml/min. Le gel est ensuite lavé par 6 L de tampon B.
Le produit est ensuite élué en appliquant du tampon C. Le volume d'éluat est de 1520
ml et contient 147 mg d'ADN plasmidique (déterminé par HPLC).
Le gel est ensuite régénéré par lavage avec de la soude (NaOH 0,5M) suivi par
du tampon D. Le gel est alors prêt pour un nouveau cycle.
L'ensemble des opérations est suivi par spectrométrie UV à 254 nm.
1.4. Purification sur DEAE Sepharose
Matériel:
Les tampons utilisés lors de cette purification sont les suivants:
Tampon A, NaCI lM et NaOH 0,5M.
Méthode:
La colonne (de diamètre 50 mm et de hauteur 6 cm) contient 110 ml de gel.
Avant ~ ation, le gel subit une décont~min~tion chimique par de la soude
0,5M pendant 1 heure. La soude est ensuite é1imin~e par une solution de NaCI lM .
Puis, la colonne est équilibrée en tampon A.
1130 ml issues des 1520 ml (soit 110 mg) obtenus précédemment sont
appliqués sur le gel à un débit de 50 mVmin. L'ADN n'étant pas retenu, I'efl~uent est
recueilli (1036 ml) et contient 104 mg d'ADN. Les produits retenus sur le gel sont
ensuite elimine~ par une solution de NaCl lM. Le gel est alors lavé par de la soude
0,5M suivi de NaCI lM. Le gel est alors prêt pour une nouvelle opération.
L'ensemble des opérations est suivi spectrométrie UV à 254 nm.
1-5 Diafiltration
Matériel:
Membrane Ultrasette (Filtron) de point de coupure 30 kD de surface 860 cm2
Tampon: eau ppi
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Méthode:
Avant utilisation, la membrane subit une déco~ ,;n~tion chimique à la soude
0,5M pendant lH. La soude est ensuite éliminée par de l'eau ppi. 720 ml du produit
obtenu lors de l'étape précédente sont concentrés environ 3 fois puis diafiltrer deux
5 fois contre 4 volumes d'eau ppi. Le volume final est de 210 ml. L'é~h~ntillon contient
alors 62 mg d'ADN pl~cmi-lique déterminé par HPLC.
1.6 Caractéristiques de l'ADN .
Le procédé décrit ci-dessus permet d'obtenir le plasmide quasiment pur. Les
différentes composants de l'échantillon final ont été déterminés et sont récapitulés
10 ci-après.
- ARN: non détect~hle en gel d'agarose ou en HPLC
- ADN chromosomique déterminé par PCR: <0.5 %
- ADN super-enroulé déterminé par HPLC >80 %
- endotoxines (LAL) < 50 EU/mg
- protéines (microBCA) < l!lg/ml
- activité biologique in vitro:
pXL2784 lot 42DNA95: 20*10 RLU/ ~g proteines (à col,lpa,~r avec le
même plasmide purifié sur gradient de Chlorure de Cesium = 13*106 RLU/ llg
protéines).
1.7 Variante.
Le procédé décrit ci-dessus a été reproduit en effectuant dans l'étape 1.1, une
filtration sur membrane de profondeur à la place de la centrif1le~tion. Cette variante du
procédé permet d'obtenir un plasmide de pureté pharmaceutique, dont les
caractéristiques sont récapitulés ci-après.
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- ARN: non détectable en gel d'agarose ou par HPLC
- ADN chromosomique déterminé par PCR: < 0.5 ~o
- ADN superenroulé déterminé par HPLC >70 ~o
- endotoxines (LAL) < 50 EU/mg
- protéines (micro BCA) < 1 ~g/ml
Exemple 2 Purification de l'éluat d'hvdroxyapatite par chromato~raphie
d'afflnité triple hélice
2.1. Préparation de la colonne d'affinité
La colonne utilisée est une colonne HiTrap activée au NHS (N-
10 hydroxysuccinimide, Pharmacia) de 5 ml, connectée sur une pompe péristaltique.
L'oligonucléotide spécifique utilisé possède un groupement NH2 en 5'. Sa séquence est
la suivante:
5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID N~l).
Les tampons utilisés dans cet exemple sont les suivants:
Tampon de couplage: NaHC03 0,2 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3.
Tampon A: éthanolamine 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3.
Tampon B: acétate 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4.
La colonne est lavée par 30 ml de HCI 1 mM, puis l'oligonucléotide dilué dans
le tampon de couplage (250 nmoles dans 5 ml) est appliqué sur la colonne et laissé 30
20 minutes à température arnbiante. La colonne est lavée 3 fois successives par 30 ml de
tampon A puis 30 ml de tampon B. L'oligonucléotide est ainsi lié covalemment à la
colonne par une liaison CONH. La colonne est stockée à 4~C.
2.2. Purification du plasmide
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Les tampons utilisés sont les suivants:
Tampon F: NaCl 2M, acétate 0,2 M, pH 4,5.
Tampon E :Tris 1 M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.
La colonne est équilibrée dans le tampon F, puis 9ml d'éluat d'hydro~yapaLile
5 obtenu dans les conditions décrites dans l'exemple 1.3., préalablement ajustés à 2M
NaCl et pH 4,5, sont appliqués en boucle sur la colonne pendant une nuit à
température ambiante (débit 0,5 ml/min). La colonne est lavée avec du tampon F puis
l'élution se fait par du tampon E. L'ADN est détecté par spectrométrie U.V. à 254 nm.
2.3. Caractéristiques de l'ADN purifié
L'ADN purifié analysé par HPLC (méthode décrite ci-dessus) se présente sous
forme d'un seul pic à un temps de rétention de 24,8 min. Aucune trace d'ARN n'est
etect~hle. De même, après électrophorèse sur gel d'agarose 1~o et coloration au
bromure d'éthidium, l'ADN purifié ne présente aucune trace détectable d'ARN.
L'ADN a également été analysé par chromatographie échangeuse d'anions sur
15 colonne Gen-Pak Fax Waters, qui sépare l'ADN relaché de l'ADN surenroulé.
L'érh~ntillon purifié contient 97~ d'ADN surenroulé contre 80% d'ADN surenroulé
dans l'échantillon déposé.
L'ADN génomique d'E. coli a été quantifié par PCR selon la technique décrite
au paragraphe 3: l'ADN purifié sur colonne d'affinité contient environ 0,01% d'ADN
20 génomique.
Exemple n~3
3.1. Purification du plasmide.
On utilise une colonne d'affinité préparée comme décrit à l'exemple 2 avec
l'oligonucléotide de séquence:
5'-Cl-r CTT Cl'r Cl~ crr C~ Cl~-3' (SEQ ID N~2).
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Wo 97/3s002 PCT/FRg7/00472
Les tampons utilisés sont:
Tampon F: NaCl 2M, acétate de sodium 0,2 M, pH 4,5.
Tampon E :Tris 1 M, HCI pH 9, EDTA 0,5 mM.
La colonne est équilibrée dans le tampon F, puis on dépose 0.8mg de plasmide
5 purifié selon le protocole de l'exemple 1.7, dilué dans 10 ml de tampon F. L'érh~ntillon
est recirculé en boucle sur la colonne pendant une nuit à température ~m~i~nte (débit
0,5 ml/min). La colonne est lavée avec du tampon F puis l'élution se fait par du tampon
E. L'ADN est détecté par spectrométrie U.V. à 254 nm.
3.2. Caractéristiques de l'ADN purifié
L'ADN obtenu a été analysé par chromatographie échangeuse d'anions sur
colonne Gen-Pak Fax Waters, qui sépare l'ADN relaché de l'ADN surenroulé.
L'érh~ntillon purifié contient 100% d'ADN surenroulé, contre 72~o dans l'érh~ntillon
déposé sur la colonne d'affinité.
L'ADN génomique d'E. coli a été quantifié par PCR selon la technique décrite
15 plus haut: l'ADN purifié sur colonne d'affinité contient environ 0,01% d'ADN
génomique, contre environ 0.3~o dans l'échantillon déposé sur la colonne d'affinité.
Exemple 4: Chan~ement d'échelle de la chromato~raphie d'affinité triple
hélice après purification de l'éluat d'hvdroxvapatite ~pXL 2784)
4.1. Préparation de la colonne d'affinité
La colonne utilisée est une colonne contenant du Sépharose 4 Fast Flow activé
au NHS (N-hydroxysuccinimide, Pharmacia) et couplé à un oligon~1cléotide de
sequence:
5'-Cl~ CTT CTT Cl'r CTT Cl~ Cl~-3' [(Cl~)7: SEQ ID n~ 2]
selon la méthode décrite dans l'exemple 2.1.
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W O 97/35002 PCTAFR97/00472
La colonne (diamètre 26 mm, hauteur: 16cm ) contient 80 ml de gel et est
connectée sur une pompe péristaltique.
4.2. Purification du plasmide
Les tampons utilisés sont les suivants:
Tampon F: NaCI 2M, acétate de sodium 0,2 M, pH 4,5.
Tampon E :Tris 1 M, HCI pH 9, EDTA 0,5 mM.
La colonne est équilibrée dans le tampon F, puis 135 ml soit 8 mg d'éluat
d'hydroxyapatite obtenu dans les conditions décrites dans l'exemple 1.3., préalablement
ajustés à 2M NaCI et pH 4,5, sont appliqués sur la colonne (débit 1,25 mVmin) enrecirculant quatre fois. La colonne est lavée avec du tampon F puis l'élution se fait par
du tampon E. L'ADN est détecté par spectrométrie U.V. à 254 nm: 2,2 mg sont
récupérés.
4.3. Caractéristiques de l'ADN purifié
L'ADN purifié analysé par HPLC (méthode décrite ci-dessus) se présente sous
forrne d'un seul pic à un temps de rétention de 24,4 min. Aucune trace d'ARN n'est
détectable. De même, après électrophorèse sur gel d'agarose 1% et coloration au
bromure d'éthidium, I'ADN purifié ne présente aucune trace détectable d'ARN.
L'ADN a également été analysé par chromatographie échangeuse d'anions sur
colonne Gen-Pak Fax Waters, qui sépare l'ADN relaché de l'ADN surenroulé.
L'é-~h~ntillon purifié contient 100% d'ADN surenroulé contre 94% d'ADN surenroulé
dans l'échantillon déposé.
L'ADN génomique d'E. coli a été quantifié par PCR selon la technique décrite
au paragraphe 3: I'ADN purifié sur colonne d'affinité contient environ 0,02% d'ADN
génomique contre 2% dans l'échantillon déposé.
Exemple 5: Purification à ~rande echelle d'un ADN plasmidique sur colonne
hvdroxyapatite céramique
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wo 97/35002 PCT/FR97/00472
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5.1. Préparation du Iysat clair
Le lysat clair est préparé comme décrit dans l'exemple 1.1 à partir d'une culture
de bactéries E.coli transforrnées par le plasmide pXL2774. Le plasmide pXL2774 aune taille réduite (environ 4,5 kb) et comprend not~mm-?nt:
- une cassette d'expression du gène Luc (promoteur CMV-luc-poly(A)+)
- le marqueur de sélection sup Phe
- l'origine de réplication ori ~ de R6K
- le fragment cer de ColE1
0 Méthode:
456 g de cellules sont mises en suspension dans 5000 ml de solution 1. La
solution 2 (5500 ml) est ensuite additionnée. Enfin, 2500 ml de solution 3 sont
rajoutés. Le précipité alors forrné est éliminé par centrifugation à 9000 rpm pendant
30 min ou par filtration. On obtient 12,3 L de surnageant.
5.2. Diafiltration
Matériel:
Membrane Maximate (Filtron) de point de coupure 100 kD de surface 1860
cm2
Tampon: Phosphate de sodium 100 mM pH 6,8
Méthode:
L'échantillon est diafiltré selon la méthode décrite dans l'exemple 1.2
Le volume final est de 945 ml. L'érh~ntillon contient alors 253 mg d'ADN
plasmidique déterminé par HPLC.
5.3. Purification sur Ceramic HydroxyapatiteTM
Matériel:
Les tampons utilisés lors de cette purification sont les suivants:
Tampon A = tampon 100 mM phosphate pH 6.8
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wo 97/35002 PcT/FRs7/00472
Tampon B = tampon 150 mM phosphate pH 6.8,
Tampon C = tampon 250 mM phosphate pH 6;8
Tampon D = tampon 500 mM phosphate pH 6,8
NaOH 0,5M
Méthode:
La colonne (de diamètre 100 mm et de hauteur 23 cm) contient 1700 ml de gel.
Avant utilisation, le gel subit une déco"l~-";~l~tion chimique par de la soude
0,5M pendant 1 heure. La soude est ensuite élirninée par application de tampon D.
Puis, la colonne est équilibrée en tampon A.
On applique sur le gel 475 ml provenant des 945 ml (soit 128 mg) obtenus
précédemrnent. Le débit est de 65 ml/min. Le gel est ensuite lavé par 6 L de tampon B.
Le produit est ensuite élué en appliquant du tampon C. Le volume d'éluat est de 1760
ml et contient 100 mg d'ADN plasmidique (déterminé par HPLC).
Le gel est ensuite régénéré par lavage avec de la soude (NaOH 0,5M) suivi par
15 du tampon D. Le gel est alors prêt pour un nouveau cycle.
L'ensemble des opérations est suivi par spectrométrie UV à 254 nm..
5.4 Diafiltration
La diafiltration a été réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple 1.5.
5.5 Caractéristiques de l'ADN .
Le procédé décrit ci-dessus permet d'obtenir le pl~cmid~ q ~ m~nt pur. Les
di~ér~llles composants de l'échantillon final ont été delelminés et sont récapitulés
ci-après.
- ARN: non détectable en gel d'agarose
- ADN chromosomique déterminé par PCR: 0.6 %
- ADN super-enroulé déterminé par HPLC: 87 %
- endotoxines (LAL) < 50 EU/mg
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- protéines (microBCA) < 1~g/ml
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LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: (1) 40.91.70.36
(H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.91
(ii) TITRE DE L' INVENTION: PURIFICATION D'ADN PLASMIDIQUE DE
QUALITE PHARMACEUTIQUE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 15
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC co~patible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéalre
( i i ) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25
45 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 palres de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: si~ple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT T 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
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W O 97l35002 PCT~R97/00472
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AAGGGAGGGA GGAGAGGAA
19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AAGGAGAGGA GGGAGGGAA 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: slmple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
~xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
TTGGTGTGGT GGGTGGGTT 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( i i ) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
60 CTTCCCGAAG GGAGAAAGG 19
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W O 97/35002 PCT~R97/00472
39
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7
GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 paires de bases
(B) TYPE: nucléotlde
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8
GAAAAAGGAA GAG 13
35 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9
AAAAAAGGGA ATAAGGG 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIOUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 56 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
, .
CA 0224946~ l998-09-l6
W O 97/35002 PCTAFR97/00472
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10
AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG AGCGGCCGCG AGCTCC 56
s
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
~A) LONGUEUR: 56 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
~C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ii ) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11
20 AGCTGGAGCT CGCGGCCGCT CTAGAGGATC CGAATTCGAT ATCCTGCAGC TCGAGA 56
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
( i ) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 58 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: llnéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12
GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGG 58
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 58 palres de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
( D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13
AATTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCG 58
55 ( 2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: slmple
CA 0224946~ 1998-09-16
W O 97/35002 PCT~R97/00472
41
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14
CCGAATTCTG GGGACCAAAG CAGTTTC 27
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15
CCAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT 27
