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NOUVEAUX COMPOSES LIPIDIQUES ET COMPOSITIONS LES CONTENANT
UTILISABLES POUR LE TRANSFERT D'AU MOINS UNE SUBSTAN~E ACTIVE,
NOTAMMENT UN POLYNUCLEOTIDE, DANS UNE CELLU~E CIBLE ET
~ UTILISATION EN THERAPIE GENIQUE
La présente invention concerne de nouveaux composés
lipidiques et de nouvelles compositions les comprenant. Plus
particulièrement, la présente invention concerne l'utilisation
desdits composés ou desdites compositions pour préparer un
vecteur de transfert d'une substance active, notamment
thérapeutiquement comportant des charges négatives, notamment un
polynucléotide, dans une cellule cibie, particulièrement une
cellule de vertébré, et plus particulièrement de mammifère.
Le transfert de gène dans une cellule donnée est la base
1~ même de la thérapie génique. Cette nouvelle technologie dont le
champ d'application est vaste, permet d'envisager le traitement
de maladies graves pour lesquelles les alternatives
thérapeutiques classiques sont peu efficaces, voire
inexistantes, et concerne aussi bien les maladies d'origine
génétique (hémophilie, mucoviscidose, myopathie,...) qu'acquises
(cancer, SIDA,...).
Au cours des 30 dernières années, de nombreu. outils ont
été mis au point permettant l'introduction de divers gènes
hétérologues dans des cellules, notamment des cellules de
2~ mammifère. Ces différentes techniques peuvent être divisées en
deux catégories. La première catégorie concerne les techniques
physiques telles que la microinjection, l'électroporation ou le
bombardement particulaire qui, bien qu'efficaces, sont larqement
limitées à des applications in vitro et dont la mise en oeuvre
e.st lourde et délicate. La seconde catégorie fa~' appel à aes
techniques relatives à la biologie moiéculaire et cellulaire
pour lesquelles le gène à transférer est associé ~ un vecteur de
nature biologique ou synthetiq~le qui favorise l'introduction
dudit matériel.
. . .
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Actuellement, les vecteurs les plus efficaces sont des
vecteurs viraux, en particulier adénoviraux ou rétroviraux. ~es
techniques développées reposent sur les propriétés naturelles
dont disposé-nt ces virus pour traverser les membranes
cellulaires, échapper à la dégradation de leur matériel
génétique et faire pénétrer leur génome dans le noyau. Ces virus
ont déjà fait l'objet de nombreuses études et certains d'entre
eux sont d'ores et déià employés à titre expérimental comme
vecteurs de gènes chez l'homme en vue par exemple d'une
vaccination, d'une immunothérapie ou d'une thérapie visant à
suppléer une déficience génétique. Toutefois, cette approche
virale présente de nombreuses limitations, notamment en raison
de la capacité de clonage restreinte dans le génome viral, des
risques de dissémination dans l'organisme hôte et dans
1~ l'environnement des particules virales infectieuses produites,
du risque de mutagénèse artéfactuel par insertion dans la
cellule hôte dans le cas des vecteurs rétroviraux, et de la
forte induction des réponses immunitaire et inflammatoire in
vivo lors du traitement thérapeutique, limitant considérablement
le nombre d'administrations pouvant être envisagées (Mc Coy et
al, 1995, Human Gene Therapy, 6, 1553-1560 ; Yang et al., 1996,
Immunity, 1, 433-442). Ces nombreux inconvénients, notamment
dans le cadre d'un usage che7 l'homme, ont conduit plusieurs
équipes à développer des systèmes alternatifs de transfert de
2~ polynucléotides.
~ lusieurs méthodes non-virales sont disponibles à l'heure
actuelle. Citons pour exemples la coprécipitation au phosphate
de calcium, l'utilisation de récepteurs mimant les systèmes
viraux (pour une revue voir Cotten et Wagner, 1993, Current
Opinion in Biotechnology, 4, 705~710), ou l'utilisation de
polymères tels que le polyamidoamine (Haensler et Szoka, 1993,
Bioconjugate Chem., 4, 372-379), ou de pol~ère tels que ceux
présentés dans WO 95/24221 décrivant l'utilisation de polymères
dendri-tiques, le document WO 96/02~55 décrivant l'utilisation de
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polyéthylène imine, ou de polypropylène imine et les documents
US-A- 5 595 897 et FR 2 719 316 décrivant l'utilisation de
~ conjugués de polylysine. D'autres techniques non virales
s'appuient s~r l'utilisation de liposomes dont l'intérêt à titre
d'agent permettant l'introduction, à l'intérieur de cellules, de
certaines macromolécules biologiques, telles que par exemple
l'ADN, l'ARN, les protéines ou certaines substances
pharmaceutiquement actives a été largement décrit dans la
littérature. A cette fin, plusieurs équipes ont déjà proposé
l'utilisation de lipides cationiques qui présentent une forte
affinité à l'égard des membranes cellulaires et/ou des acides
nucléiques. En effet, bien qu'il ait été montré, dans le cas des
acides nucléiques, que ce type de macromolécule est capable de
traverser la membrane plasmatique de certaines cellules in vivo
O 90/11092), il n'en demeure pas moins que l'efficacité de la
transfection observée est encore très limitée, en raison
notamment de la nature polyanionique des acides nucléiques qui
prévient leur passage au travers de la membrane cellulaire,
présentant elle-même une charge apparente nette négative. Dés
1989 (Felgner et al., Nature, 337, 387-388) les lipides
cationiques ont été présentés comme des molécules intéressantes
pour favoriser l'introduction de grosses molécules anioniques,
telles que les acides nucléiques, dans certaines cellules. Ces
lipides cationiques sont capables de se complexer aux molécules
2~ anioniques tendant ainsi à neutraliser les charges négatives
desdites molécules et à favoriser leur rapprochement vers les
cellules. De nombreuses équipes ont déjà développé différents
lipides cationiques. A titre d'exemples, on peut citer le DOTM~
(F'elgner et al., 1987, PNAS, 84, 7413-7417), le DOGS ou
Transfecta~ (Behr et al.,1989,PNAS, 86, 6982-6986), le DMRIE et
le DORIE (Felgner et al., 1993, Methods 5, 67-75), le DC-CHOL
(Gao et Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285), le DOTAP~ (McLachlan
et al., 1995, Gene Therapy, 2,674-622) ou la Lipofectamine_,
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ainsi que ceux décrits dans les demandes de brevet W09116024 ou
W09514651.
Plus particulièrement, la demande de brevet WO-A-9116024
décrit des lipides cationiques de formule :
H~C - Y1 ~ Rl
HC - Y~ - R2
( H2C ) n ~ N~R3R4
Rs-O-R"-R7
dans laquelle :
Rl et R2 sont notamment des radicaux alkyle ou alcényle ;
Y1,Y~ sont des radicaux -OCH-- , -OC(=O)- ou -O- ;
R3, Rl sont des radicaux alkyle ou alcényle ;
R5 est une chalne alkylène i
R~ est -C(=O)-(CH2)m-N~-, un acide diaminocarboxylique ou -C(=O)-
l~ (CH,)~-NH- lié audit acide diaminocarboxylique ;
R7 est H, spermine, spermidine, histone, une protéine, un amino
acide, un polypeptide.
Toutefois, plusieurs travaux (à titre d'exemples, voir
Mahato et al., J. Pharm. Sci., 1995, 89, 1267-1271, Thierry et
al., 1995, P.N.A.S, 92, 9742-9746) ont mis en évidence que
l'efficacité du transfert à l'intérieur des cellules de la
macromolécule anionique pouvait varier en fonction notamment de
l'interaction entre les complexes et les men~ranes cellulaires,
de la cellule considérée, de la composition lipidique des
composés cationiques, de la taille des complexes formés avec les
molécules anioniques et plus particulièrement du rapport de
charges positives et négatives des différents ccmposants dudit
complexe. Les mécanismes qui permettent en particulier
l'interaction des complexes avec les membranes cellulaires et e
transfert des complexes à l'intérieur de la cellule sont encc;:e
largement méconnus et les chercheurs procèdent dans leurs
travaux selon une approche fortement empirique. D'autres
facteurs, tels que par exemple la formation des complexes, la
stabilité, le comportement in vivo, ou éventuellement leur
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toxicité, rendent en outre le choix des lipides à priori non
évident. Il est par conséquent souhaitable de proposer d'autres
lipides cationiques, ayant éventuellement des propriétés
améliorees ou-différentes de ceux déjà décrits.
Le déposant a aujourd'hui identifié de nouveaux composés
lipidiques, qui peuvent se présenter sous forme cationique,
utiles notamment pour transférer une substance active, notamment
thérapeutiquement comportant des charges négatives, notamment un
polynucléotide, à l'intérieur d'une cellule cible, dont on peut
envisager l'utilisation notamment in vivo dans le cadre d'une
thérapie génique.
Ainsi, la présente invention a tout d'abord pour objet un
composé lipidique de formule :
1~ R-HN-[-(CH~)m - NR-]n1 - (CH,)~-NH-R
dans laquelle :
les restes R sont, indépendamment les uns des autres, un
atome d'hydrogène ou un groupe de formule II :
(CH~)p-NH-Rl II
-C-CH-NH-R,
o
dans laquelle :
2~ R1 et R~ sont, indépendamment l'un de l'autre, des radicaux
C~-C.3 alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux
-C (=O) - (C~-C~3) alkyle ou -C(=O)-(C~-C~3) alcényle, linéaires ou
ramifiés, des radicaux aryle, des radicaux cycloalkyle, des
radicaux fluoroalkyle, des groupements polyéthylène glycol, des
groupements oxyéthylène ou oxyméthylène éventuellement répétés,
- linéaires ou ramifiés, eventuellement substitués,
p est un nombre entier positif de l à 4,
n est un nombre entier positif de l à 6,
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6 -
m est un nombre entier positif de l à 6 qui peut être
différent pour chaque motif -(CH2)m 1 -et - plu5
particulièrement pour chaque motif -~CH~) m-NR~ lorsque
n ~
le nombre de groupes R de formule II etant compris entre l
et 4.
Par l'expression ~alcényle~, on entend que la chaîne
carbonée peut comprendre une ou plusieurs double(s) liaison(s)
le long de ladite chaîne.
Selon un cas particulier, l'invention concerne un composé
sélectionné parmi les composés de formules :
H2N--[--(cH2)m - NH-] n R III
RNH-[- (CH2) m-NH] n H IIIa
1~ dans lesquelles :
R est un groupe de formule II tel que défini précédemment
et H~N--~ - (CH2 ) m-NR] n-1~ (cH2) m--NH2 IIIb
dans laquelle :
R a l"lne des significations indiquées pour la formule I
~0 pour autant qu'au moins un R est un groupe de formule II et pou-
chacune des formules :
n est un nombre entier positif de l à ~,
m est un nombre entier positif de l à 6 qui peut etre
différent pour chaque motif -(CH2)~ , et plus particulièrement
2~ pour chaque motif -(CH2) m-NR- lorsque n > l.
Selon un cas préféré, les composés de formule IIIb
renferment un ou deux groupes R de formule II.
Selon des modes de réalisation préférés de l'invention, on
choisira les variantes présentées ci-dessous, prises ou non en
combinaison entre elles :
- R1 et R sont, indépendamrnent l'un de l'autre, des
radicaux -C(--0)- alkyle linéaires GU -C (=O ) - alcényle lir,éairec,
- R et R2 sont, indépendamrnent l'un de l'autre, des radicaux -
C(--0)- alkyle ou -C~=0)- alcényle, comprenar~t de 12 à 20 atomes
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de carbone, de preférence 12, 16 ou 18 atomes de carbone,
lorsque le lipide comporte 1 ou 2 groupements R de formule II,
- n est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou
4,
- m est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou
4.
Selon un cas particulier, il est possible de diminuer la
longueur de la chaine alkyle ou alcényle de manière à ce que R
et R2 soient des radicaux de 6 à 10 atomes de carbone mais dans
ce cas on choisira de préférence des composés pour lesquels le
nombre de groupes R de formule II est égal à 2, 3 ou 4.
De préférence, les lipides selon l'invention sont choisis
dans le groupe constitué par les composés de formules suivantes:
H,N ~ NH-R IV
ou R,~
HN ~
2j R \ / ~ ~ IVa
H
H2~ 12
pour lesquelles R~ et R2 sont identiques et choisis parr,i les
radicaux stéaroyle et oléoyle.
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Les composés selon l'invention sont préparés par réaction
d'un composé de formule : -
- --NH-R3
-NH-R~ V
-COOH
dans laquelle:
R3 et R4 sont des groupes protecteurs, notamment Fmoc
(Grandas et al., 1989, Int. Journal pept. prot. Res. vol 33,
10 386-390)avec une amine de formule :
RsNH[(-CH2)m-NRs]n1-(CH~)m NHRs ~I
m, n ayant la même signification que pour la formule I,
Rs étant un groupe protecteur, notamment le t-
butoxycarbonyle (BOC) ou un atome d'hydrogène, au moins un des
radicaux Rs et au plus quatre des radicaux Rs correspondant à
l'atome d'hydrogène.
Les fonctions N-R3, -N-R~ sont ensuite déprotégées pour
fixer par amldation ou alkylation les radicaux R1 et R2 de
manière connue, notamment par action de l'ester -N-
hydroxysuccinimide correspondant.
Le composé obtenu est déprotégé en présence dlacidetrifluoroacétique.
Les amines de formule VI sont préparées de manière connue.
Dans le cas où le composé de formule VI est la 1-4 di-boc-
spermidine on se référera aux exemples indiqués ci-après pour
connaître les modalités pratiques de synthèse. Les procédés
décrits sont applicables en général aux synthèses des composés
selon l'invention moyennant des adaptations à la portée de
l'homme du métier.
Toutefois, les composés de l'invention ne sauraient se
limiter à ceux obtenus par les modes de préparation décrits
précédemment.
Les composés selon l'invention peuvent en outre être
substitués. De telles substitutions peuvent notamment consister
, . ~ _ ,,
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en une molécule de marquage (volr molécules de marquage dans US
4711955) qui permet par exemple de visualiser la distribution
des composés ou des complexes les renfermant après
administration- in vitro ou in vivo, une molécule de ciblage
S cellulaire, une molécule d'ancrage. L'invention concerne par
conséquent également un composé tel que présenté ci-dessus
conjugué à un ou plusieurs éléments de ciblage, également
appelés ligands d'intérêt, par l'intermédiaire d'au moins a) un
des atomes de carbone, en particulier choisis parmi ceux
présents sur les groupements Rl et/ou R~, ou b) un des atomes
d'azote secondaire ou primaire de la chaîne polyamine ou de
l'acide diaminocarboxylique. De tels éléments peuvent permettre
le ciblage vers un type cellulaire par~iculier, faciliter la
pénétration à l'intérieur de la cellule, la lyse des endosomes
ou encore le transport intracellulaire et sont largement décrits
dans la littérature. Il peut s'agir par exemple de tout ou
partie de sucres, de peptides (peptide GRP, Gastrin Releasing
Peptide, par exemple), d'oligonucléotides, de lipides,
d'hormones, de vitamines, d'antigènes, d'anticorps, de ligands
spécifiques de récepteurs membranaires, de ligands susceptibles
de réagir avec un anti-ligand, de peptides fusogèniques, de
peptides de localisation nucléaire, ou d'une combinaison de tels
composés. On peut citer plus particulièrement les résidus
galactosyl permettant de cibler le récepteur
2~ asyaloglycoprotéique à la surface des cellules hépatiques, le
peptide fusogénique IN~-7 dérivé de la sous-unité HA-2 de
l'hémagglutinine du virus influenza (Plank et al. 1994, J. Biol.
Chem. 269, 12918-12924) ou d'un signal de localisation nucléaire
dérivé de l'antigène T du virus SV40 (I,anford et Butel, 1984,
Cell 37, 801-813) ou de la protéine EBNA-1 du virus Epstein Barr
(Ambinder et al., 1991, J. Virol. 65, 1466-1478).
~ e tels conjugués peuvent être aisément obtenus selon les
techniques largement décrites dans la littérature, et plus
particulièrement par couplage chimique, notamment en utilisant
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des groupes protecteurs tels que trifluoroacétyle ou Fmoc ou Boc
sur la polyamine et plus particulièrement en utilisa-nt un ou
plusieurs groupes protecteurs orthogonaux tels que ceux décrits
dans Protective Groups in Organic Synthesis (p. 309-406, 1991,
eds. T.W. Greene, P.G.M. ~uts, Wiley) sur la polyamine ou
l'acide diaminocarboxylique. La déprotection sélective d'un
groupe protecteur permet alors de coupler l'élément de ciblage,
et l'on déprotège ensuite le lipide. Il convient toutefois
d'indiquer que la substitution des groupes non réactifs tels que
les atomes de carbone dans les groupements CH ou CH2, sera
réalisée en cours de synthèse des composés de l'invention selon
des méthodes connues de l'homme du métier ; tandis que les
groupes réactifs, tels que les amines primaires ou secondaires,
peuvent faire l'objet de substitutions sur les lipides de
l'invention néosynthétisés.
Selon un cas avantageux de l'invention, ledit composé est
sous forme cationique, c'est à dire qu'il est sous forme
protonée par fixation d'un proton sur un ou plusieurs atomes
d'azote présents sur la chaîne polyamine. Dans ce cas, ledit
lipide cationique est associé à un ou plusieurs anions
biologiquement acceptables, tels que par exemple l'anion
trifluoroacétate, halogènure, monométhylsulfate, acétate ou
phosphate, iodure, chlorure, bromure... Il est également
possible d'obtenir des composés sous forme cationique par
substitution des amines par exemple avec un radical méthyl,
éthyl, ...
Selon un autre aspect, l'invention concerne également une
composition comprenant au moins un composé tel que décrit ci-
dessus et éventuellement au moins un adjuvant susceptible
d'améliorer la formation de complexe entre undit composé et une
substance active, ou d'améliorer le fonctionnement de ces
complexes vis-à-vis de la cellule.
De manière préférée, un tel adjuvant sera un lipide neutre
ou zwitterionique, tel que par exemple un lipide qui est ou
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dérive d'un triglycéride, d'un diglycéride, du cholestérol (voir
par exemple US 5 438 044), en particulier, un lipide neutre ou
zwitterionique qui est ou qui dérive d'une phosphatidyl
éthanolamine - (PE), phosphatidylcholine, phosphocholine,
sphyngomyéline, céramide ou cérébroside. De manière avantageuse,
on choisira la dioleoylphosphatidyl éthanolamine (DOPE).
Le rapport en poids entre le composé de l'invention et le
lipide neutre ou zwitterionique est généralement compris entre
0,1 et 10, étant entendu que ce rapport peut varier selon la
nature des composants considérés. L'homme du métier dispose des
connaissances suffisantes pour permettre ces adaptations
mineures. Il est également possible d'utiliser un mélange de
lipides neutres et/ou ~witterioniques ou encore un mélange de
lipides cationiques et de lipides neutres et/ou zwitterioniques.
lS L'invention concerne en outre un complexe comprenant au
moins un composé ou au moins une composition tels que décrits
précédemment et au moins une substance active, notamment
thérapeutiquement comportant au moins une charge négative. Selon
une variante de l'invention, ledit complexe peut en outre
renfermer un ou plusieurs amphiphiles cationiques tels que ceux
décrits dans la littérature dont des exemples ont été proposés
plus haut.
Selon un mode particulier de réaiisation, la~ite substance
active, est choisie parmi les acides nucléi~ues et les
protéines. De préférence, la substance active du complexe selon
l'invention est un polynucléotide, ledit composé ou ladite
composition permettant alors d'améliorer le pouvoir transfectant
du polynucléotide dans une cellule.
Par ~polynucléotide~, on entend désigner un fragment d'ADN
et/Gu d'ARN, double brin ou simple brin, linéaire ou circulaire,
naturel isolé ou de synthèse, désignant un enchaînement précis
de nucléotides, modifiés ou non (voir à titre d'exemple
US 55~5711), marqués ou non (voir, par exemple, US 4711955 ou
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EP 302175), permettant de définir un fragment ou une région d'un
acide nucléique sans limitation de taille. Par polynucléotide on
entend désigner notamment un cADN, un ADN génomique, un ADN
plasmidique, un ARN messager, un ARN antisens, un ribozyme, un
ARN de transfert, un ARN ribosomique, ou un ADN codant pour de
tels ARN. ~Polynucléotide~ ou ~acide nucléique~ sont des termes
synonymes dans le cadre de la présente demande. Par "anti sens",
on entend désigner un acide nucléique ayant une séquence
complémentaire à une séquence cible, par exemple une séquence
d'ARNm dont on cherche à bloquer l'expression par hybridation
sur la séquence cible; et par "sens", un acide nucléique ayant
une séquence homologue ou identique à une séquence cible, par
exemple une séquence qui se lie à un facteur de transcription
protéique et impliquée dans llexpression d'un gène donné.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention,
ledit polynucléotide comprend un gène d'intérêt et des éléments
permettant l'expression dudit gène d'intérêt. Dans ce mode de
réalisation, ledit polynucléotide est avantageusement sous forme
de plasmide. Les éléments permettant l'expression sont
l'ensemble des éléments permettant la transcription dudit
fragment d'ADN en ARN (ARN antisens ou ARNm) et la traduction de
l'ARNm en polypepLide. Il s'agit notamment des séquences
promotrices et/ou des séquences de régulation efficaces dans
ladite cellule, et éventuellement les séquences requisent pour
permettre l'excrétion ou l'expression à la surface des cellules
cibles dudit polypeptide. A titre d'exemple, on mentionnera les
promoteurs tels que les promoteurs des virus RSV, MPSV, SV40,
CMV ou 7.5k, du virus de la vaccine,les promoteurs du gène
codant pour la créatine kinase musculaire, pour l'actine, pour
le surfactant pulmonaire. Il est en outre possible de choisir
une séquence promotrice spécifique d'un type cellulaire donné,
ou activable dans des conditions définies. La littérature
procure un grand nombre d'informations relatives à de telles
séquences promotrices. Par ailleurs, ledit polynucléotide peut
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comprendre au moins deux séquences, identiques ou dlfférentes,
présentant une activité de promoteur transcriptionnel-et/ou au
~ moins deux séquences codantes d'ADN, identiques ou différentes,
situées l'une par rapport à l'autre de manière contiguë,
éloignée, dans le même sens ou en sens inverse, pour autant que
la fonction de promoteur transcriptionnel ou la transcription
desdites séquences ne soit pas affectée. De même, dans ce type
de construction d'acide nucléique, il est possible d'introduire
des séquences nucléiques ~neutres~ ou introns qui n'affectent
pas la transcription et sont épissées avant l'étape de
traduction. De telles séquences et leurs utilisations sont
décrites dans la littérature. Ledit polynucléotide pourra
également renfermer des séquences requises pour le transport
intracellulaire, pour la réplication et/ou pour l'intégration.
De telles séquences sont bien connues de l'homme de l'art. Par
ailleurs, les polynucléotides selon la présente invention
peuvent également être des polynucléotides modifiés de sorte
qu'il ne leur est pas possible de s'intégrer dans le génôme de
la cellule cible ou des polynucléotides stabilisés à l'aide
d'agents, tels que par exemple la spermine.
Dans le cadre de la présente invention, le polynucléotide
peut être homologue ou hétérologue à la cellule cible. Il peut
etre avantageux d'utiliser un polynucléotide qui code pour tout
ou partie d'un polypeptide, notamment un polypeptide présentant
2j une activité thérapeutique ou prophylactique, et plus
particulièrement une activité immunogène de type cellulaire ou
humorale. Le terme polypeptide s'entend sans restriction quant à
sa taille ou son degré de modification (par exemple de
glycosylation). On peut à tltre d'exemples citer les gènes
3~) codant pour un enzyme, une hormone, une cytokine, un récepteur
membranaire, un polypeptide structural, un polypeptide formant
un canal membranaire, un polypeptide de transport, une molécule
d'adhésion, un ligand, un facteur de régulation de la
transcription, de la traduction, de la réplication, de la
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stabilisation des transcripts, ou un anticorps, tels que par
exemple le gène codant pour la protéine CFTR, la dystraphine, le
facteur VIII ou IX, E6/E7 de HPV, MUCl, BRACl, l'interféron ~,
l'interféron~y, l'interleukine (IL)2, l'IL-4, l'IL-6, l'IL-7,
l'IL-12, le facteur nécrosant de tumeur (TN~) de t-ype alpha, le
GM-CSF ~Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), le
gène tk du virus Herpes Simplex de type l (HSV-l), le gène
associé au rétinoblastome ou p53 ou tout ou partie
d'immunoglobulines, telles que les fragments F(ab)7, Fab', Fab
ou les anti-idiotypes (US 4,699,880). Bien entendu, cette liste
n'est pas limitative et d'autres gènes peuvent être employés.
Selon un mode de réalisation préféré, les complexes selon
l'invention sont de faible taille ~inférieure à 500 nm,
avantageusement à 200 nm et de préférence à lO0 nm).
1~ Par ailleurs, les expériences de transfection réalisées
montrent qu'avantageusement le rapport en poids du composé
lipidique selon l'invention audit polynucléotide est de 0,Ol à
lO0. Le rapport optimal se situe de 0,05 à lO.
L'invention concerne également ~n procédé de préparation
des complexes composés cationiques/substances actives
anioniques, ledit procédé étant caractérisé en ce que l'on met
en présence un ou plusieurs lipides sous forme cationique ou une
composition selon l'invention dont le lipide est sous forme
cationique avec une ou plusieurs substances actives comportant
2~ au moins une charge négative et en ce que l'on récupère ledit
complexe, éventuellement après une étape de purification. Elle
concerne également les kits pour préparer de tels complexes
comprenant un ou plusieurs lipides ou une ou plusieurs
compositions selon l'invention.
Dans un premier temps, selon une première variante, un ou
plusieurs composés cationiques sont mis en solution avec une
quantité appropriée de solvant ou mélange de solvants miscibles
dans l'eau, notamment l'éthanol, le diméthylsulfoxide (DMSO),ou
de façon préférée un mélange éthanol/DMSO l:l (v:v), de manière
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à former des agrégats lipidiques selon une méthode connue
décrite par exemple dans la demande de brevet WO-A-9603977, ou
selon une seconde variante, sont mls en suspension avec une
quantité appropriée d'une solution de détergent comme un
S octylglucoside tel que le n-octyl ~-D-glucopyranoside, ou le 6-
O-(N-heptylcarbomoyl)-méthyl-a-D-glucopyranoside.
La suspension peut ensuite être mise dans un milieu tampon
et mélangée avec une solution de substance active comportant des
charges négatives.
Dans le cas où l'on souhaite qu'un lipide neutre ou
zwitterionique soit présent dans le complexe final, on forme, de
manière connue, préalablement à la mise en solution dans le
solvant miscible à l'eau ou dans la solution de détergent, un
film avec un mélange renfermant undit composé cationique et
undit lipide neutre ou zwitterionique, tel que par exemple la
DOPE.
Une des caractéristiques importantes du procédé réside dans
le choix du rapport entre les charges positives du lipide
cationique et les charges négatives de la substance active.
Sans vouloir etre limité par un rapport spécifique, on
choisira des quantités des différentes charges de manière à ce
que le rapport entre le nombre de charges positives du composé
ou de la composition cationique et le nombre de charges
négatives de la substance active soit compris entre 0,05 et 20,
25 notamment entre 0,1 et 15 et de préférence entre 5 et 10.
Ce rapport entre le nombre de charges positives du ou des
composés et/ou compositions cationiques et le nombre de charges
négatives de ladite substance active constitue également une
caractéristique avantageuse du complexe selon l'invention.
Le calcul pour arriver à un tel rapport prendra en
considération les charges négatives portées par la substance
active et on ajustera la quantité de compose nécessaire pou.
satisfaire au rapport indiqué ci-dessus. Les quantités et les
concentrations pour les autres composants sont ajustées en
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fonction de leurs masses molaires respectives et de leur nombre
de charges positives et/ou négatives. - -
Dans le cas de la seconde variante et de manièreoptionnelle,~-on peut procéder à une dialyse subséquente pour
réduire le détergent et récupérer les complexes. Le principe
d'une telle méthode est par exemple décrit par Hofland et ai.
(1996, PNAS 93, p 7305-7309) et dans le chapitre II du document
Philippot et al. (G. Gregoriadis, 81-89, CRC Press 1993).
On a montré que la première variante conduit à d'excellents
résultats en terme de taille des complexes obtenus.
Selon une troisième variante, un ou plusieurs composés ou
compositions cationiques, sont mis en suspension dans un tampon
puis la suspension est soumise à une sonication jusqu'à
homogénéité visuelle. La suspension lipidique est ensuite
1~ extrudée au travers de deux membranes microporeuses sous
pression appropriée. La suspension lipidique est alors mélangée
avec une solution de substance active comportant des charges
négatives. Dans le cas où un lipide neutre est présent dans le
complexe, on forme préalablement à la mise en suspension, un
film du mélange de lipide cationique et de lipide neutre comme
la DO~E de manière connue. Les memes remarques concernant le
rapport entre les charges positives du lipide cationique et les
charges négatives de la substance active que celles indiquées
dans la première variante sont applicables à cette troisième
2~ variante. Cette technique dite de sonication-extrusion est bien
connue dans l'art.
Les caractéristiques des complexes formés peuvent être
évaluées par plusieurs moyens permettant de déterminer, par
exemple :
-l'état de complexation avec la substance active, no'.amment
par recherche des acides nucléiques libres par électrophorèse
sur gel d'agarose dans le cas où les substances sor.. des acides
nucléiques,
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-la taille des particules par diffusion quasi élastique de
la lumière,
-l'absence de précipitation à long terme.
La présente invention a également pour objet les complexes
obtenus par la mise en oeuvre des procédés énumérés ci-dessus.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un composé,
d'une composition ou d'un complexe selon l'invention pour
transférer au moins une substance active, notamment
thérapeutiquement active, plus particulièrement un acide
nucléique, dans des cellules cibles, in vitro, ex vivo ou in
vivo, plus particulièrement in vivo.
Par ~cellules cibles~ selon l'invention, on entend les
cellules procaryotes, les cellules de levure et les cellules
eucaryotes, les cellules de plantes, les cellules humain2s ou
1~ animales, et en particulier les cellules de mammifère. Il
convient par ailleurs de citer les cellules cancéreuses. In
vivo, l'invention peut etre appliquée au niveau de l'espace
interstitiel ou luminal de tissus tels que le poumon, la
trachée, la peau, le muscle, le cerveau, le foie, le coeur, la
rate, la moelle osseuse, le thymus, la vessie, la lymphe, le
sang, le pancreas, l'estomac, le rein, les ovaires, les
testicules, le rectum, le système nerveux périphérique ou
central, les yeux, les organes lymphoides, les cartilages,
l'endothélium. Selon un choix avantageux de l'invention, la
2~ cellule cible sera une cellule musculaire, une cellule souche
hématopoiétique ou encore une cellule des voies aériennes, p'us
particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, et
avantageusement une cellule de l'épithélium respiratoire.
Les complexes selon l'invention sont utilisables à titre de
médicament, à but curatif, préventif ou vaccinal. C'est pourquoi
l'invention a également pour objet les complexes de l'invention
à titre de médicament à but curatif, préventif ou vaccinal. De
tels complexes peuvent etre mis en oeuvre dans une méthode de
traitement thérapeutique consistant à transférer au moins une
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substance thérapeutlquement active, notamment un polynucléotide,
dans des cellules cibles, notamment une cellule de mammifère, et
plus précisemment une cellule musculaire, une cellule souche
hématopoiétique, une cellule des voies aériennes, plus
particulièrement une cellule trachéale ou pulmonaire, une
cellule de l'épithélium respiratoire.
Un composé selon l'invention est tout particulièrement
intéressant pour transférer un acide nucléique dans une cellule
musculaire ou une cellule pulmonaire. Il s'agit du composé noté
pcTG37 (voir exemple).
Plus largement, la présente invention concerne également
un procédé pour introduire une substance active comportant des
charges négatives à l'intérieur d'une cellule notamment in
vitro, caractérisé en ce que l'on met en contact des cellules,
1~ notamment cultivées sur un milieu approprié avec un complexe
composé cationique/substance active comportant au moins une
charge négative selon l'invention, notamment sous forme d'une
suspension de complexes. Après un certain temps d'incubation les
cellules sont lavées et récupérées. La vérification de
l'introduction de la substance active peut être effectuée
(éventuellement après lyse de la cellule) par tout moyen
approprié.
Le procédé d'introduction est bien connu en soi. Par le
terme <~introduction~ on entend que la substance active
2~ comportant des charges négatives est transférée dans la cellule
et est localisée, en fin de procédé, à l'intérieur de ladite
cellule ou au niveau de la membrane de celle-ci. Dans le cas où
la substance active est un acide nucléique, on parlera plus
particulièrement de ~transfection~. Dans ce cas, la vérification
de la transfection de l'acide nucléique pourra être effectuée
par tout moyen approprié, par exemple par mesure de l'expression
du gène considéré ou de la concentration de la protéine
exprimée.
, .
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L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation
d'un composé, d'une composition ou d'un compl-exe selon
l'invention pour la préparation d'un médicament à but curatif,
préventif ou vaccinal, destiné au traitement du corps humain ou
animal, notamment par thérapie génique.
Selon une première possibilité, le médicament peut être
administré directement in vivo (par exemple dans un muscle, dans
les poumons par aérosol...). On peut également adopter
l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du
patient (cellules souches de la moëlle osseuse, lymphocytes du
sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter
in vitro selon la présente invention et de les réadministrer au
patient.
Les complexes selon l'invention peuvent être administrés
l~ par voie intramusculaire, intratrachéale, intranasale,
intracérébrale, intrapleurale, intratumorale, intracardiaque,
intragastrique, intrapéritonéale, épidermique, intraveineuse,
intraartérielle par seringue ou tout autre moyen équivalent, les
systèmes adaptés au traitement des voies aériennes ou des
muqueuses tels que l'inhalation, l'instillation, ou
l'aérosolisation. On peut également citer les modes
d'administration par application d'une crème, par administration
orale ou tout autre moyen parfaitement connu de l'homme de l'art
et applicable à la présente invention.
Il est également dans la portée de l'invention de cibler
des organes ou des tissus particuliers par administration,
notamment par voie intraveineuse, d'un complexe selon
l'invention préparé de facon à ajuster le rapport composé ou
composition/substance thérapeutiquement active dans ledit
complexe, la charge apparente du complexe (voir notamment Liu et
al, 1997, Gene Therapy, 4, 517-523 ; Thierry et al., 1995,
P.~.A.S., 92, 9742-9746).
L'invention concerne égalemen' un procédé de therapie
génique consistant à administrer à un patient une quantité
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appropriée d'une composition selon l'invention. Selon la
présente invention et dans le cadre d'une thérapie génique in
vivo, il est possible de répéter plusieurs fois, chez un patient
donné, le ~procédé tel que proposé sans. qu'aucune réaction
immunitaire majeure ne soit déclenchée à l'encontre de l'un des
composés administrés. L'administration peut avoir lieu en dose
unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain
intervalle de temps. L'administration répétée permettrait de
réduire la quantité de substance thérapeutiquement active, d'ADN
plus particulièrement, à administrer pour une dose donnée. La
voie d'administration et le dosage appropriés varient en
fonction de divers paramètres, par exemple de l'individu ou de
la maladie à traiter ou encore du polynucléotide à transférer.
L'invention concerne plus particulièrement une préparation
pharmaceutique comprenant au moins un complexe tel que décrit
précédemment, renfermant éventuellement en outre au moins un
adjuvant capable de stabiliser ladite préparation pharmaceutique
en vue de son stockage par exemple et/ou d'améliorer le pouvoir
de transfection dudit complexe. Un tel adjuvant pourrait par
exemple être choisi parmi le groupe consistant en la
chloroquine, un composé polaire protique notamment choisi parmi
le propylène glycol, le polyéthylène glycol, le glycérol,
l'éthanol, le 1-methyl L -2-pyrrolidone ou leurs dérivés, ou un
composé polaire aprotique notamment choisi parmi le
diméthylsulfoxide (DMSO), le diéthylsulfoxide, le di-n-
propylsulfoxide, le diméthylsulfone, le sulfolane, la
diméthylformamide, le diméthylacetamide, la tetraméthylurée,
l'acétonitrile ou leurs dérivés. De même, ladite préparation
peut renfermer un support acceptable d'un point de vue
pharmaceutique permettant son administration à l'homme ou
l'animal.
Dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé de
traitement in vivo selon la présente invention, il est en outre
possible d'effectuer, avant l'administration d'une préparation
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.
pharmaceutique telle que décrite précédemment, un traitement du
patient visant à observer une -déplétion temporaire des
macrophages permettant d'améliorer le taux de transfection. ~ne
telle techni-que est décrite dans la littérature, voir notamment
Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15, 178-184.
Enfin, l'invention concerne une cellule transfectée par un
complexe tel que défini précédemment, particulièrement une
cellule procaryote, une cellule de levure ou eucaryote,
notamment une cellule animale, en particulier une cellule de
mammifère, et plus particulièrement une cellule cancéreuse.
Selon un cas préféré de l'invention, ladite cellule est une
cellule des voies aériennes, plus particulièrement une cellule
trachéale ou pulmonaire, et avantageusement une cellule de
l'épithélium respiratoire.
Les exemples ci-après illustrent l'invention sans la
limiter en aucune façon. Un schéma de synthèse explicatif
faisant partie intégrante de la description est annexé (Figure
1). La figure 2 indique les résultats observés après injection
intraveineuse de complexes selon l'invention, l'activité
luciférase est indiquée en RLU/mg de protéine).
EXEMPLES
La préparation du ]ipide cationique de formule I dans
laquelle Rl, R~ identiques sont les radicauY oléoyle ou stéaroyle
2~ n = 2 ; ma = 3, m~ = 4 est décrite ci-dessous en liaison avec le
schéma de synthèse représenté a la figure 1. a et ~ sont les
positions des motifs -(CH7)~-NH- à pa~tir du carbonyle.
Svnthèse du lipide cationique de formule I dans laquelle n = 2,
ma = 3, m~ = 4, R = oléoyle (pcTG37) (voir figure 1)
Synthèse de l'intermédiaire 1-4 di-boc-spermidine
Le protocole appliqué pour obtenir le 1,4-di-boc-spermidine est
publié par Goodnow et al. (1990, Tetrahedron 46, 3267-32~6). En
pratique, l'intermediaire N-propionitrile 1,4-diaminobutane est
.
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obtenu par réaction de 37,6 mmoles de diaminobutane (Fluka ;
référence 32790) dilué dans 3,8 ml de dichlorométhane + 2 ml de
méthanol à 0~C avec 18,8 mmoles d'acrylonitrile (Fluka
référence 01710) pendant 1 heure à 20~C. Les groupements aminés
du produit de la réaction sont protégés par 99 mmoles de BOC-ON
[(2-boc-oxyimino)-2-phénylacétonitrile] (Fluka ; référence
15475) dans 50 ml de solvant CH,Cl2/CH3OH 2/1. La réaction de
protection est laissée la nuit à température ambiante. Les
solvants sont évaporés et le produit est repris dans 75 ml
d'acétate d'éthyle pour 3 extractions avec 75 ml de NaOH lM. La
phase organique est à nouveau extraite avec 5~ d'acide citrique,
puis sèchée et filtrée sur Na2SO~ avant évaporation à sec. Puis
on procède à l'étape de réduction des nitriles, dans l'éther à
0~C, en présence de 20 mmoles de LiAIH4 (Sigma ; L0260). Après
lS lheure 30, la réaction est arrêtée par addition de 20 ml de NaOH
lM à 0~C, avec dégagement d'hydrogène. Le mélange est filtré et
extrait 3 fois avec une solution de NaCl 20~ dans de l'eau.
Après séchage de la fraction éthérée, le produit est déposé sur
colonne de silice dans un solvant CH~Cl,/CH30H 2/1, puis élué
20 dans un solvant CH.Cl~/CH30H/(C1H-),N 15/5/1. On détermine par
chromatographie sur couche mince les fractions contenant le di-
boc-spermidine.
données de RMN : RMN-lH (200 MHz, CDCl3) : 1,43-1,48 ppm
(s, 18 H, Boc), 1,48-1,72 ppm (m, 6H, NH(Boc)-CH1-CH -CH,-CH.-
25 N(Boc)-CH,-CH2-CH,-NH2), 2,69 ppm (t, 2H, J = 6,7 Hz, -CH.-NH.),
3,07-3,25 ppm (m, 6H, NH(Boc)-CH--CH7-CH7-CH--N(Boc)-CH,-CH,-CH.-
NH.~, 4,59 ppm (b, lH, NH(Boc)).
Quantité synthétisée (1,45 g ; 5,1 mmol) - rendement 27
par rapport à la quantité d'acrylonitrile.
Synthèse du pcTG37
On ajoute à 140 umoles de N-a N-~, di-Fmoc-
diaminopropionique (Bachem B2265) 140 ~moles de N-
hydroxybenzotriazole (Sigma ; H2006), puis 140 ~msles de di-boc-
spermidine dans l ml de tétrahydrofuranne anhydre, et enfin
.
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180 ~moles de dicyclohéxylcarbodiimide (Sigma ; D3128) dilué
dans 2 ml CH~Cl~. Après 2 heures de réaction, on- fil-tre le
- dicyclohexylurée formé et on purifie le produit sur colonne de
silice dans-un solvant CH,Cl7/CH30H 99/1. Après évaporation, on
élimine les groupements Fmoc du produit dans une solution de 20
pipéridine, 20~ tétrahydrofurane et 60~ CH,Cl~ pendant 1 heure.
Après évaporation, on procède à une nouvelle purification sur
colonne de silice dans un solvant CH~Cl2/CH30H 1/1. On détermine
par chromatographie sur couche mince les fractions contenant le
produit. Le produit est sèché avant le dernier couplage. Au di-
boc-spermidine-diaminopropionamide, on ajoute 510 ~moles de
l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide oléique (Sigma O 9506)
dilue dans 5 ml de CH,Cl, anhydre. Après évaporation, le produit
est purifié sur colonne de silice (éther / acétate d'éthyle i
1/l) . Le produit final, repris dans l ml de CH,Cl, est
déprotégé Boc dans 10 ml d'acide trifluoroacétique (Fluka
91699). Pour éliminer l'acide trifluoroacétique on évapore à
pression réduite après dilution dans 50 ml de n-hexane.
Rendement global de synthèse : 64 ~ (89 mg ; 90 ~mol)
RMN-lH (200 MHz, CDC13/CD30D : 0,81 ppm (t, j = 6,4 Hz, 6H,
CH3), 1,22-1,3 ppm (m, 44 H, -CH.-), 1,51 ppm (m, 4 H, -CH,-CH -
CO-NH-), 1,72-1,90 ppm (m, 6 H, NH3+ -CH~-CH--CH~-CH--NH~ -CH -CH~-
CH -NH-), 1,92 ppm (m, 8 H, CH~-CH=), 2,07-2,2 ppm (m, 4 H, CH--
CO-NH-), 2,89 ppm (m: 6 H, NH3 -CH,-CH,-CH~ -NH. -CH~-CH,-CH~-
NH-), 4,22 ppm (t, 1 H, NH-CO-CHR-NH-), 5,27 ppm (m, 4H,-CH=).
Spectrométrie de masse : mesurée 759,7 Da (calculée 760,2 Da).
Synthèse du lipide cationique de formule I dans laquelle n
= 2, ma = 3, m~ = 4 ; R = stéaroyle (lipide pcTG39)
~0 Le composé pcTG39 est préparé à l'échelle de 140 ~moi de la
même façon en u~ilisant l'acide stéarique et le
dicyclohexylcarbodiimide ou de la (benzotriazol-1-ylo~y)
tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) comme
agent de couplage.
.
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Rendement global de synthèse: 22 96 (30 mg; 30 ~mol)
RMN-1H (200 MHz, CDCl3/CD30D/D~O) : O, 68 ppm (t, j = 6,8 Hz,
6H, -CH3), 1,06 ppm (m, 48 H, -CH,-), 1,37 ppm (m, 4 H, -CH~-CH,-
CO-NH-), 1,~3-1,75 ppm (m, 6 H, NH3 -CH~-CH~-CH -CH~-NH~ -CH -CH -
CH2-NH-), 1,90-2,30 ppm (m, 4 H, CH~-CO-NH=), 2,74 ppm (m, 6H,
NH3+ -CH~-CH2-CH2-CH2-NH2+ -CH2-CH.-CH~-NH-), 3,25-3,55 ppm (m, 4 H,
_
-CH2-NH-CO- ) .
Spectrométrie de masse : mesurée 764,5 Da (calculée 764,3
Da).
Préparation des complexes lipides-ADN par mise en
suspension dans l'éthanol
1. Préparation des complexes lipides pcTG37, éventuellement
DOPE,-ADN
Les quantités de lipides sont calculées en se basant sur la
l~ concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro),
le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de
charges positives du lipide cationique choisi. Pour obtenir un
complexe entre pcTG37/DOPE et de l'ADN plasmidique à un ratio de
10 entre charges positives apportées par le lipide cationique et
20 charges négatives apportées par l'ADN à une concentration d'ADN
finale de 0,1 mg/ml, on mélange les différents ingrédients selon
le calcul suivant:
0,1 mg d'ADN/ml soit (0,1/330) mmoles de charges négatives
(330 Da est le poids moléculaire moyen d'un nucléotide) par ml
2~ correspondent à 0,30 ~mole/ml de charges négatives. Pour obtenir
10 fois plus de charges positives il faut une concentration de
3,0 ~mole/ml de charges positives apportées par le lipide
cationique. La masse molaire de pcTG37 sous forme de
trifluoroacétate est de 988 g/mole et la molécule contient 2
30 charges positives. Donc il faut 1,5 umole/ml de pcTG37 ce qui
correspond à 1,49 mg/ml.
Pour obtenir une concentration équimolaire en L-a-
Dioleoyl-phosphatidyléthanolamine (DOPE, 794 g/mole, Sigma
P0510), il en faut 1,12 mg/ml dans la préparation lipidique. Les
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quantités et les concentrations pour les autres composés sont
ajustées en conséquence de leurs masses molaires respectives et
- de leur nombre de charges positives.
Les lipides sont repris dans du chloroforme, séchés par
évaporation puis solubilisés dans du chloroforme/méthanol (v:v)
et à nouveau séchés. Les lipides cationiques sont pesés et la
quantité de DOPE est ajoutée à partir d'une solution mère de 10
ou 20 mg/ml dans du chloroforme dans un tube en verre stérilisé
à l'alcool et aux UV pour obtenir une concentration de 2 mM en
lipide cationique. Les solvants sont évaporés sous vide (0,2.105
Pa (200 mbar)) pendant 45 min à 45 C en utilisant un vortex de
40 tours par minute (Labconco, Rapidvap, Uniequip, Martinsried,
Allemagne). Le film lipidique est repris dans de l'éthanol pour
être à la concentration de 50 mg/ml en lipide cationique.
I~ pcTG37/DOPE 1,49 mg + 1,12 mg = 2,61 mg dans 30 ~1
d'éthanol. Cette solution est complétée avec 270 ~1 d'HEPES 20.~M
pH 7,5 (ajusté avec ~aOH) pour préparer une solution à 5 mg/ml
finale.
L'ADN plasmidique est préparé à partir d'une solution mère
à 1 mg/ml (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5).
eour une solution de 0,5 ml finale, on prelève 50 ~1 de la
solution mère (50 ~g ADN) auxquels on ajoute 300 ~1 d'HEPES
20~M pH 7,5.
Pour complexer l'ADN avec des préparations lipidiques, on
2~ ajoute des lipides sur l'ADN. La suspension est mélangée par
aspiration/refoulage à la pipette (10 fois). Les complexes sont
conservés à + 4~C.
150 ~1 de pcTG37/DOPE sont ajoutés à 350 ~1 de la solution
ADN pour obtenir 0,5 ml de complexe à 0,1 mg/ml ADN et un
rapport de charges de 10.
La préparation des complexes se fait sous une hotte à flux
laminaire.
On obtient les complexes dont les caractéristiques sont
indiquées dans le tableau 1 ci-après.
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2. Préparation des complexes lipides pcTG39, éventuellement
DOPE,-ADN
On obtient les complexes selon le même protocole que
précédemment.
Préparatlon des complexes lipides-ADN par mise en
suspension dans une solution de détergent
1. Préparation des complexes lipides pcTG37, éventuellement
DOPE,-ADN
Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci-
dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml
pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la
masse molaire et le nombre de charges positives du lipide
cationique choisi. Le mélange des lipides se fait dans un tube
l~ en verre stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une
solution 2 mM en lipide cationique (voir ci dessus). Les
solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans une
solution de n-octyl, ~-D-glucopyranoside (octylglucoside, Sigma,
O 9882) selon un rapport lipide cationique/détergent de l/5
(mole:mole).
On prélève 375 ~1 d'une solution d'octylglucoside 20 m.~!
dans de l'HEPES 20 mM pH 7,5, avec lesquels on reprend le film
de mélange lipidique pcTG37/DOPE. L'ADN plasmidique est préparé
à partir d'une solution mère d'ADN plasmidique à 1 mg/ml dont on
2~ prélève 50 ~1 pour un volume final de 0,5 ml (0,1 mg/ml final)
auxquels on ajoute 262,5 ~l d'HEPES 20 mM pH 7,5. 187,5 ul de la
suspension lipidique sont ajoutés sur l'ADN en aspirant et
refoulant 10 fois à la pipette pour obtenir la suspension finale
à 0,1 mg/ml en ADN et un rapport de charges +/- de 10. Pour
éliminer le détergent une dialyse de 3 fois 4 heures à
température ambiante contre de l'HEPES 20 m'~l pH 7,5 est
entreprise dans des microdoigts de dialyse (seuil d'exclusion de
13,2 kD ; Sartorius, Gottingen, Allemagne). Les complexes
,,
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ADN/lipides dialysés sont conservés à + 9~C. La préparation se
fait dans une hotte à flux laminaire.
On obtient les complexes dont les caractéristiques sont
indiquées dans le tableau 1 ci-dessous.
s
2. Préparation des complexes lipides pcTG39, éventuellement
DOPE,- ADN
Selon le même protocole on obtient les complexes dont les
caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-après.
~ réparation des complexes lipides-ADN par sonication
extrusion
Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci-
dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml
pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la
masse molaire et le nombre de charges positives du lipide
cationique choisi. La mélange des lipides se fait dans un tube
en verre stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une
solution 2 mM en lipide cationique, comme indiqué ci-dessus. Les
solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans
900 ~1 d'HEPES 20 mM pH 7,5 à 4~C pendant environ 16 h. La
suspension est soniquée dans un bain de sonication (Bransonic
221) jusqu'à homogéneité visuelle. La suspension lipidique est
extrudée au travers de deux membranes de 0,2 ~m d- diamètre de
2j pores (Nucleopore, Costar, Cambridge, MA, USA) et rincée avec de
l'HEPES 20mM pH 7,5 (Extruder de Lipex Biomembranes, Vancouver,
Canada) à une pression maximale de 50 bars. La suspension
lipidique est maintenue à température ambiante pendant 1 heure.
450 ~1 de la suspension lipidique sont ajoutés sur 50 ~1 d'une
solution mère de l'ADN plasmidique (1 mg/ml) et mélangés en
aspirant/refoulant 10 fois à la pipette. Les complexes
lipide/ADN sont conservés à +4~C. Les préparations sont faites
sous une hotte à flux laminaire.
. ~ .
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Protocole d'évaluation de la complexation de l'ADN par les
lipides
Un gel à 1~ (w:v) d'agarose est préparé dans un tampon TAE
(TAE : Tris-4,86g/l + acétate de sodium 0,68g/1 + EDTA 0,336g/1
pH 7,8. Si nécessaire, l'échantillon est dilué dans du TAE puis
on ajoute le tampon d'échantillon bleu de bromophénol 0,083~,
cyanol xylène FF 0,083~, glycérol 10~ dans l'eau) de façon à se
trouver à 50 ng d'ADN/~l. L'échantillon est brièvement soumis à
un vortex et laissé 30 min à température ambiante. A titre de
témoin, on utilise le plasmide non complexé préparé à la même
concentration. 10 ~l (500 ng d'ADN) sont déposés sur le gel et
la migration s'effectue à 60mV pendant 3 heures. Le gel est
révélé dans du TAE contenant 0,006~ (v:v) de bromure d'éthidium
à 10 mg/ml pendant au moins 30 min. Ensuite le gel est rincé
dans du TAE et analysé sous UV.
Protocole de mesure de la taille des particules par
diffusion quasi élastique de la lumière
Les analyses sont faites sur un Coulter N4Plus (Coultronics
France S.A., Margency, France) à 25~C après équilibration de
l'échantillon pendant 20 min. Une aliquote de l'échantillon es.
aspirée et refoulée plusieurs fois avant d'etre pipettée.
l'échantillon est dilué dans la cuve de mesure et homogénéisé.
La mesure de la lumière diffractée à 90~ est faite pendant
25 180 sec après 180 sec d'attente. La gamme utilisée va de 3 nm à
10 000 nm en utilisant 31 bins. Pour être valable, l'échantillon
doit donner entre 50 000 et 1 000 000 counts/sec.
Caractéristiques physico-chimiques
Les trois méthodes de formulation "injection d'éthanol",
~ "dialyse de détergent" et ~sonication-extrusion~ sont
appliquées aux lipides cationiques selon l'invention avec ou
sans des quantités équimolaires de DOPE à des rapports de
charges d'environ 10 ou 5. Les formulations sont considérées
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comme appropriées lorsque l'ADN est complètement complexé
(aucune migration dans le gel d'agarose) et que les complexes
- présentent des diamètres déterminés par diffusion quasi
élastique de-la lumière inférieurs à 500 nm. Le tableau 1 résume
les résultats de ces analyses. Tous les complexes ADN~'lipides
indiqués dans le tableau complexent l'ADN complètement.
TABLEAU 1
lipide RapportlTaille (nm)~ Formulation
pcTG37 10 77 éthanol
pcTG37 5 80 éthanol
pcTG37/DOPE 10 79 éthanol
pcTG37/DOPE 5 69 éthanol
pcTG37 10 240 détergent
pcTG37 5 59 détergent
pcTG37/DOPE 10 312 détergent
pcTG39/DOPE 10 312 détergent
pcTG37/DOPE 5 280 sonication
~ : Rapport entre les charges positives du lipide cationique et
les charges négatives de l'ADN.
- : Les populations qui représentent moins de 10 ~ de
l'intensité ne sont pas indiquées. La taille est déterminée 24-
l~ 48 heures après la préparation.
Ces analyses montrent que les formulations remplissent les
exigences requises. La méthode "injection d'éthanol" donne les
meilleurs résultats, les différentes préparations testées
présentant une taille inférieure à 100 nm. La méthode par
dialyse de détergent ou de sonication/extrusion permet également
d'obtenir des complexes répondant aux critères de la présente
invention.
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Transfection in vitro de cellules satellites
Des cultures de muscles de chien et de muscles humains sont
effectuées dans un milieu HamF 14 (Life Technologies)
supplémenté -avec lO ~ de sérum de veau foetal (FCS, Hyclone,
Logan, UT), lO ug/ml d'insuline (Sigma), lO ng/ml d'EGF (Sigma)
et de FGF (Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ) 2mM de glutamine
(bioMérieux), et 40 ~g/ml de gentamycine (Schering Plough).
Les cellules sont ensemencées 24 h à 48 h avant la
transfection dans une boite de culture à 96 puits à raison de
10 5x103 à 104 cellules par puits, à environ 30 ~ de confluence, et
maintenues à 37~C en atmosphère contenant 5 ~ C07 et 95 ~ d'air.
Les transfections sont effectuées avec des mélanges de
quantités variables de lipides et d'ADN plasmidique pour
déterminer les rapports de charges et les concentrations d'ADN
1~ optimales par puits.
Les complexes utilisés sont préparés 29 h à 48 h avant la
transfection et dilués dans le milieu HamF 14 contenant 40 ~g/ml
de gentamycine et 2mM de glutamine.
Après élimination du milieu de culture, lO0 ul de mélanges
de transfection avec ou sans lO ~ de FCS sont transférés dans
chacun des puits et les plaques sont incubées pendant 4 h a
37~C
Tous les milieux de transfection sont alors ajustés à lO~
de FCS, lO ~g/ml d'insuline (Sigma), lO ng/ml d'EGF (Sigma~ et
2~ de FGF (Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ), 2 mM de glutamine
(bioMérieux), et 40 ~g/ml de gentamycine (Schering Plough) pour
un volume final de 250 ~l. Les cultures sont incubées pendant
48h puis les cellules sont récupérées et testées pour leur
capacité à exprimer le gène de la luciférase. Les concentrations
de protéines sont déterminées par le système de test de quantité
de protéine (Promega).
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Transfection de cellules A549 avec des complexes lipidiques
Les cellules A549 (cellules épithéliales dé-rivées de
carcinome pulmonaire humain) sont mises en culture dans du
milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10~ de
sérum de veau foetal (Gibco BRL) 24 heures avant le début de la
transfection dans des plaques de 96 puits (2 x 10~ cellules par
puits) dans une atmosphère humide à 37 C et 5~ C0 /95~ air. Pour
la transfection en l'absence de sérum, le milieu est enlevé et
remplacé par du milieu sans sérum. On prépare dans une autre
microplaque les suspensions de complexes lipides/ADN suivantes
(complexes lipides/ADN à 0,1 mg/ml d'ADN et au rapport de
charges indiqué) : 44 ~1 (4,4 ~g ADN), 22 ~1 (2,2 ~g ADN),
5,5 ~1 (0,55 ~g ADN) de solution stock dans les 3 premiers
puits, et 11 ul (0,11 ~g ADN) de la solution stock diluée 10
1~ fois dans le puits suivant. Le volume est complété à 110 ~1 avec
du DMEM et 100 ~1 sont transférés sur les cellules A549.
L'incubation se fait avec 4, 2, 0,5 et 0,1 ~g d'ADN par puits
pendant 4 heures. 50 ~1 de DMEM + 30~ de sérum de veau foetal
sont ajoutés 4 heures après le début de la transfection puis
20 100 ~1 de DMEM + 10~ de FCS 24 heures après le début de la
transfection. Les transfections en présence de 10 de sérum de
veau foetal sont réal.isées d'une façon identique sauf que la
transfection se passe dans du milieu avec sérum.
2~ Analyse de la transfection
48 h après la transfection, le milieu est éliminé et les
cellules sont lavées avec 100 ~1 de solution phosphate PBS et
lysées avec 50 ~1 de tampon de lyse (Promega). Les lysats sont
congelés à -80~C jusqu'à la mesure de l'activité en lucif~rase.
3~ Celle-ci se fait sur 20 ~1 de mélange pendant une minu~e er.
utilisant le système de détermination de la luciférase~
(Promega) (luminomètre LB96P Berthold) dans des plaques à
96 puits en mode cinétique.
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Transfection in vitro
Les préparations de lipides cationiques pcTG37 ont été
évaluées en tranfection in vitro en utilisant les cellules A549
et les myoblastes primaires de chien.
Les résultats sont résumés dans le tableau 2 ci-dessous et
montrent les unités relatives de lumière (RLU) par puits. Les
valeurs données sont obtenues avec 0,5 ~g d'ADN par puits. Tous
les complexes sont préparés en utilisant la méthode d'injection
d'éthanol. La concentration totale de protéine par puits est
déterminée par les techniques conventionnelles (test BCA,
Pierce). A titre indicatif, un puits contient environ 20 à 30 ~g
de protéine.
TABLEAU 2
Lipide Rapport~ A549~ A549 + myoblastes myoblaste
sérum + sérum
1,7 x 105
pcTG37 10(4,0 x103 3,2 x 10~ 0 1,2 x 105
RLU/mg/
min)
9, 9 x lOi
pcTG37 5(1,4x109 3,9 x 103 8,5 x 10 ~,6 x 103
RLU/mg/
min)
pcTG37/ 103,5 x 105 1,2 x 10~ 1,5 x 10; 4,9 x 10'
DOPE
pcTG37/ 55,0 x 10~ 6,7 x 105 1~ 9 X 105 4,9 x 10
DOPE
1~
- : Rapport entre les charges positives du lipide cationi~ue et
les charges négatives de l'ADM.
~ , .. . ..
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~ :ADN libre entre 0 et 270 unités de lumière relative.
- Un autre mode de synthèse des composés selon l'invention a
été mis au point
1. Synthèse de la partie polyaminée
1.1. Afin de pouvoir synthétiser des composés ~T-branchés~
pour les~uels le groupe R de formule II est fixé sur les amines
secondaires, une N,N'di-boc-spermine a été synthétisée. Le
protocole appliqué pour obtenir le 1,4-diboc-spermidine est
publié par Goodnow et al. (1990, Tetrahedron 46,3267-3286).
L'intermédiaire le N-N'(di-boc) N,N'(dipropionitrile)1,4-
diaminobutane est obtenu par réaction de 37,6 mmoles de
diaminobutane (Fluka; référence 32790) dilué dans 3,8ml de
dichlorométhane + 2ml de méthanol à 0~C avec 75,2mmoles
l~ d'acrylonitrile (Fluka; référence 01710), lheure à 0~C. Le
produit de la réaction est bloqué par 100mmoles de BOC-ON [(2-
boc-oxyimino)-2-phénylacétonitrile] (Flukai référence 15475)
dans 50ml de solvant CH2Cl2/CH3OH 2/1. La réaction de blocage est
placée une nuit à température ambiante. Les solvants sont
évaporés et le produit est repris dans 200ml d'acétate d'éthyle
puis soumis à 3 extractions avec 200ml de NaOH lM. La phase
organique est à nouveau extraite avec 5~ acide citrique, sèchée
et filtrée sur Na~SO~ avant évaporation à sec. On procède alors à
une étape de réduction des nitriles, dans l'éther à 0~C, en
2~ présence de 260 mmoles de LiAlH4 (Sigma; L0260). Après 15heures,
la réaction est arretée par addition de 100ml de soude lM à 0~C,
avec dégagement d'hydrogène. Le mélange est filtré et extrait
3 fois avec une solution de NaCl 20~. Après séchage de la
fraction éthérée, le produit est déposé sur colonne de silice
dans un solvant CH~Cl~/CH30H 1/1, puis élué dans un solvant
CH Cl~/CH30H/(C~Hs)3N 15/5/1. On détermine par chromatographie sur
couche mince les fractions contenant le di-boc-spermine.Pesée du
pLoduit final: 2,45g (5,8mmoles). Rendement ylobal:15,5~
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1.2. Synthèse de N,N' di-boc-spermidine à partir de la
spermidine. 20mmoles de spermidine (Sigma S2626) dilués dans
20ml de dichlorométhane ajoutés à 20ml de méthanol, llmmoles
~2ml) de dii-sopropyléthylamine à 0~C et 90mmoles de BOC-O-BOC
[di-(tert-butyl)-dlcarbonate] (Fluka; référence 34660) dans 80ml
de solvant CH2Cl2/CH3OH 1/1. La réaction de blocage est placée
une nuit à température ambiante. Les solvants sont évaporés puis
le produit est déposé sur colonne de silice, et élué dans des
palliers de solvants CH2Cl2/CH3OH de 9/1 à 8/2. On détermine par
chromatographie sur RP-H~LC les fractions contenant le N,N'di-
boc-spermidine. Une partie pure de N,N' di-boc-spermidine est
ainsi isolée des autres isomères de position de di-boc-
spermidine. Pesée du produit final: 0,58g (1,68mmoles) ~endement
global: 8,5~
1.3 Nouveau procédé de synthèse du 1-4 di-boc-spermidine :
50 mmoles de diaminobutane (~luka; référence 32790) dilué dans
50ml de dichlorométhane sont ajoutés à 20ml de méthanol à 0~C
avec 58mmoles d'acrylonitrile (Flukai référence 01710) et placé
lheure à 0~C. Le produit de la réaction est bloqué par 109mmoles
de BOC-ON [(2-boc-oxyimino)-2-phénylacétonitrile] (~luka;
référence 15475) dans 50ml de solvant CH Cl~/CH,OH 2/1. La
réaction de blocage est placée une nuit à température ambiante.
Les solvants sont évaporés et le produit est repris dans 300ml
d'acétate d'éthyle pour 3 extractions avec 300ml de NaOH lM. La
phase organique est à nouveau extraite avec 5~ acide citrique,
sèchée et filtrée sur Na~SO~ avant évaporation à sec. On procède
ensuite à l'étape de réduction des nitriles, dans l'éther à 0~C,
en présence de 140 mmoles de LiAlH4 (Sigma; L0260). Après
15heures, la réaction est arrêtée par addition de 100ml de sou~e
lM à 0~C, avec dégagement d'hydrogène. Le mélange est filtré e.
extrait 3 fois avec une solution de NaCl 20~. Après séchage de
la ~raction éthérée, le produit est prèt à être d~posé su-
colonne de silice pour la p~lrification finale.
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2 . Synthèse de la partie hydrophobe
Synthèse de l'acide N-a-N-~-Di[oleylamido]-propi~onique. A
4,1mmoles(0.58g) de N-a-N-~-diaminopropionique acide,HCl (Bachem
F3040) dans ~un mélange de 22ml d'eau, 44ml de dioxane et
20,5mmoles (2,65ml) de diisopropyléthylamine, on ajoute
9,04mmoles (3,43g) de l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide
oléique (Sigma O 9506) dilué dans 10ml dioxane. Après 2 heures
de réaction, on procède à 2 extractions à l'éther/HCl 5~, puis
lavage NaCl saturé et séchage sur Na~SO4 avant évaporation à sec
de la fraction éthérée. Le produit est déposé sur colonne de
silice dans un solvant CH~Cl~/CH30H 95/5, puis élué dans des
palliers de solvants CH~C12/CH3OH95/5, puis 92,5/7,5,et enfin
90/10. On détermine par chromatographie sur couche mince les
fractions contenant l'acide n-a-n-~- di[oleylamido]-
1~ propionique.... Contrôle sur CCM (CH2C12/CH30H 90/10) et RMN.
Sèchage .Pesée:0,916g (1,45mmoles), rendemement:35,4~.
Synthèse de l'acide N-a-N-~-Di[laurylamido]-propionique. A
lmmole(0.14g) de N-a-N-~-diaminopropionique acide,HCl (Bachem
F3040) dans un mélange de 10ml d'eau, 20ml de dioxane et 5mmoles
(0,65ml) de diisopropyléthylamine, on ajoute 2,2mmoles(0,65g) de
l'este~ N-hydroxysuccinimide de l'acide laurique (Sigma L3900)
dilué dans 10ml dioxane. Le même protocole de purification (voir
l'acide N-a-N-~-Di[oleylamido]-propionique) est appliqué.
2~ Pesée:0,4g (0,5mmole), rendemement:50~.
Synthèse de l'acide N-a-N-~- Di[palmitylamido]-propionique. A
lmmole(0.14g) de N-a-N-~-diaminopropionique acide,HCl (Bachem
F3090) dans un mélange de 10ml d'eau, 20ml de dioxane et 5mmoles
(0,65ml) de diisopropyléthylamine, on ajoute 2,2mmoles(0,79g) de
l'ester N-hydroxysuccinimide de l'acide palmitique (Sigma P1162)
dilué dans 10ml dioxane. L'ester activé précipite à l'addition
e. la réaction procède en phase hétérogène pendant 15 heures
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sous agitation à température ambiante. Et le même protocole de
purification (voir l'acide N-a-N-~-Di[oleylamido]-propionique)
est appliqué. Pesée:0,14g (0,15mmole), rendemement:15~.
3. Nouvelle synthèse de pcTG37
A 1,45mmoles (500mg) de 1,4di-boc-spermidine dilué dans 30ml
CHCl3 anhydre, on ajoute 1,45mmoles 916mg de l'acide N-a-N-~-
di[oleylamido]-propionique, 1,74mmoles (235mg) de N
hydroxybenzotriazole (Sigma; H2006), 2mmoles (265~1) de
l0 diisopropyléthylamine, et enfin 2,175mmoles (449mg) de
dicyclohéxylcarbodiimide (Sigma; D3128) dilué dans 10ml CHCl3.
Après 2 heures de réaction on filtre et après évaporation,on
redilue dans ether/hexane 50/50, on procède à une nouvelle
filtration-évaporation. Ce produit est purifié sur colonne de
silice déposé dans l'ether et élué dans des palliers de solvant
éther / acétate d'éthyle :75/25, 50/50, 25/75 et 100~ acétate
d'éthyle . Contrôle sur CCM (acétate d'éthyle~ et RMN. Le
produit final, repris dans 10ml CH~Cl~ est dièprotègè Boc en
ajoutant goutte à goutte à 0~C 50ml d'acide trifluoroacétique
20 (Fluka 91699) redistillé à 72~C et dilué dans 50ml CH~Cl... Après
4heures, on évapore 2 fois à pression réduite après dilution
dans 50ml de n-hexane. Le produit est repris dans 10ml d'ether,
précipité dans l'hexane et filtré sur papier filtre. Le produit
est repris par lavage du papier dans un solvant CH~Cl~/CH;OH
1/l.Contrôles sur CCM (acétate d'éthyle),HPLC et ~.
Evaporation et pesée:670mg (0,68mmoles) rendement:47~.
4 . Synthèse de pcTG89 (équivalent de pcTG37mais sous une
forme T-branchée)
On applique le même protocole que pour pcTG37 m~is en
remplaçant le 1,4di-boc-spermidine par le N,N'di-boc-
spermidine.~esée du produit protégé: 170mg (Q,18mmoies),
Lendement:12,22.
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Injection intraveineuse de complexes selon l'invention
Les résultats sont résumés sur la figure 2. Des- complexes
selon l'invention ont été synthétisés selon les méthodes
décrites pre~édemment à partir du composé pcTG337, en présence
ou en l'absence de DOPE (2-:1, mol:mol~, à un ratio de charge
fixe de 5, en utilisant un plasmide contenant le gène de la
luciférase pTG11033 (demande de brevet français n~ 97/08267).
Les souris utilisées sont des souris femelles C57BL/6 de 9
à 11 semaines. Un jour avant l'injection avec le complexe selon
l'invention, les souris sont pré-traitées par injection de 50 ~1
d'une préparation de chlodronate encapsulé dans un liposome
(voir Van Rooijen et Sanders, 1994, J. Immunol. Methods, 174,
83-93) incorporée dans un volume total de 200 ul (+ 150 ~1 de
tampon PBS). Les injections intraveineuses sont effectuées dans
la queue après désinfection de la peau à l'éthanol 705. Le
volume injecté est 250~1 et la quantité d'ADN est 60 ~g, la
quantité de lipide est 345 ~g.
Deux jours après les injections, les souris sont
sacrifiées. Après extraction, les ti~sus sont congelés dans de
l'azote liquide et conservés à -80~C. Afin de mesurer l'activité
luciférase, les tissus sont broyés mécaniquement à l'aide d'un
pilon dans un mortier placé sur la carboglace. 500~1 d'un tampon
de lyse (Promega) sont ajoutés aux débris de tissus obtenus à
partir des poumons et soumis à trois étapes de
congélation/décongélation. Les débris cellulaires sont éliminés
par centifugation et l'activité luciférase (en RLU/min, Unité de
lumière relative par minute) est mesurée sur 20 ~1 de surnageant
conformément aux instructions du fournisseur (Promega) en
ajoutant 100 ~1 de réactif et en mesurant l'activité par
luminescence. L'activité luciférase mesurée est standardisée par
rapport à la quantité protéique à l'aide d'une gamme étalon
réalisée à partir de luciférase disponible dans le commerce
(Promega). La quantité de protéine totale est, par ailleurs,
déterminée par la méthode colorimétrique d'acide bicinchoninique
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BCA (Smith et al., 1985, Anal. Biochem., 150, 76-85 Pierce) à
partir d'un aliquote de surnageant. Ceci permet ~'exprimer
l'activité luciférase en RLU par milligramme de protéine
extraite des- tissus. Des contrôles sont réalisés pour lesquels
les souris n'ont pas été injectées ou ont été injectées avec de
l'ADN seul (60 ~g) dans un tampon 20 mM HEPES pH 7.5.
Les résultats (Figure 2) montrent que l'expression du gène
rapporteur luciférase dans les poumons après injection
intraveineuse de complexes renfermant le composé selon
l'invention à un ratio de charge de 5, en présence de DOPE est
nettement améliorée par rapport à l'injection de l'ADN seul. Les
valeurs indiquées sont des valeurs moyennes obtenues à partir de
3 souris injectées.
... ... . .
