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UTILISATION DE MOLECULES ANTAGONIST~S DE CHEMOKINES
POUR LEUR ACTIVITE ANTIVIRALE NOTAMMENT CONTRE UN
RETROVIRUS DE TYPE VIH.
La presente demande a pour objet l'utilisation de composés
antagonistes de molécules de la famille des chemokines ou des
antagonistes des produits dérivés de chemokines ayant conservé toutes
les propriétés biologiques des chemokines, lesdits composés étant
caractérises en ce qu'ils permettent d'obtenir l'inhibition d'une infection
virale ou de ses effets in vitro ou in vivo~ lesdits composés présentant à
titre préférentiel une activité anti-virale vis-à-vis d'infections dues à des
rétrovirus provoquant une immunodéficience chez un hôte, et en particulier
chez un patient humain, notamment des rétrovirus de type HIV ou VIH
(virus de l'immunodéficience humaine).
s Les chemokines sont des molécules de la famille des cytokines, qui
présentent des proprietés d'activation, notamment de cellules de la famille
des leucocytes faisant intervenir notamment des proprietés
chemoattractives, des propriétés de mobilisation du calcium par
augmentation du calcium intracellulaire et des propriétés de relargage
d'enzymes (exocytose). Ces chemokines sont connues pour leur rôle
eventuel en tant que médiateurs de l'inflammation.
Les chemokines ont été decrites par leur structure par leur affinité
pour un ou plusieurs recepteurs et par leurs proprietés biologiques dans
une publication de Baggiolini M. et al (Advances in Immunology (1994),
vol. 55, pages 97-179).
Une publication de Wells T.N.C. et al (Journal of Leukocyte Biology,
vol. 59, January 1996, 53-60) décrit la structure tri-dimensionnelle de
- plusieurs chemokines et leurs recepteurs spécifiques ou non.
De façon génerale, ces chemokines sont caractérisees par la
présence dans leur structure primaire, de résidus cystéine conservés (1 à
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4 résidus notamment) sur la base desquels plusieurs sous-familles ont été
distinguees selon la position des deux premieres cystéines. Ces familles
comprennent celles des protéines CXC ou des protéines CC. La présence
de ces résidus cystéine induit la formation de ponts disulfure.
s Parmi ces chemokines, différentes molécules ont fait l'objet d'études
spécifiques. A cet égard, on citera la molécule RANTES décrite dans la
publication de Schall T.J. et al. (The Journal of Immunology, August 1,
1988, vol. 141, 1018-1025, No. 3). La molécule RANTES (abréviation de
Regulated upon Activation, Normal T-Express and presumably Secreted) a
o été décrite dans cet article, notamment à l'aide de la séquence
nucléotidique de son ADN complémentaire et à l'aide de la séquence
d'acides aminés de la phase ouverte de lecture. Les proprietés biologiques
de RANTES ont eté décrites notamment dans l'article de Baggiolini précité.
Ces récepteurs, spécifiques ou non, ont été identifiés dans la publication
de Wells précitée ou dans les articles auxquels elle se réfère.
D'autres chemokines telles que les chemokines MIP (Macrophage
Inflammatory Protein) observées, isolées et purifiées à partir de
macrophages de souris (WOLPE S.D. et al, J. Ex. Med. (1988), 167-170)
ont été décrites du point de vue de leurs propriétés biologiques dans
I'article de Baggiolini et al. (1994).
Une autre catégorie de chemokines, appelées MCP (Monocyte
Chemotactic Protein) a été identifiée à partir de basophiles. Dans les
familles MIP et MCP, on connaît notamment les chemokines MIP1 a,
MIP1,B, MCP1, MCP2 et MCP3.
Dans une publication de Cocchi F. et al (Science, 15 Déce~"bre
1995, vol. 270, 1811-1815), les auteurs ont émis l'hypothèse que des
molécules telles que RANTES, MlP1a et MIP1~ produites notamment par
des Iymphocytes T CD8~, pourraient constituer des facteurs suppresseurs
de la réplication des isolats primaires du VIH. Ils ont ainsi émis l'hypothèse
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que les protéines RANTES, MlP1a et MIP1~ produites par des
Iymphocytes T exprimant des récepteurs CD8 pourraient participer au
contrôie de l'infection par un rétrovirus VIH en tant que facteur
suppresseur de la replication. Des anticorps obtenus contre les
5 chemokines RANTES ou MlP1(x ou MIP113 ont selon Cocchi et al., la
capacite de bloquer partiellement ou totalement, lorsqu'ils sont utilisés
conjointement, I'activité anti-HlV des chemokines.
L'article de Cocchi et al. précité ne contient pas de donnees
expérimentales sur le rôle et le stade de l'intervention des chemokines
o dans le contrôle de l'infection par un rétrovirus VIH.
Les auteurs de la présente demande se sont intéressés a l'effet que
peuvent exercer les chemokines sur la réplication du retrovirus VIH et
après avoir vérifié l'effet anti-viral des molécules telles que RANTES,
MlP1a et MIP1~ vis-à-vis de HIV, les inventeurs de la présente demande
15 se sont interessés au mécanisme biologique permettant l'interférence de
chemokines avec la replication du rétrovirus VIH dans les Iymphocytes T.
De façon surprenante, les inventeurs ont caractérisé des composés,
dépourvus des activites biologiques des chemokines et ayant perdu
notamment l'activite chemo-attractive des chemokines vis-à-vis des
20 cellules de type leucocytes, en particulier des Iymphocytes ou des
monocytes, composés susceptibles néanmoins de jouer un rôle dans le
contrôle, voire l'inhibition, des effets d'une infection virale, en particulier
d'une infection de cellules par un rétrovirus de type VIH.
Ainsi, les inventeurs ont mis en évidence que des antagonistes de
25 chemokines, par exemple des antagonistes de chemokines de la famille
CXC ou de la famille CC, notamment de RANTES et/ou de MIP et/ou de
MCP peuvent s'opposer à la réplication d'isolats primaires du rétrovirus
VIH dans des Iymphocytes du sang périphérique (PBL) normaux.
L'invention a donc pour objet un composé antagoniste encore
30 appelé ~ antagoniste ~ d'une ou plusieurs molecules de la famille des
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chemokines pour l'utilisation pour le traitement ou la prévention d'une
infection due à un virus et plus particulièrement à un rétrovirus du type
VIH. Dans le cadre de cette définition, le composé antagoniste est utilisé
notamment pour la préparation d'un médicament pour la prévention ou le
traitement de l'infection due à un retrovirus de type VIH.
Dans le cadre de la présente description, le terme ~ antagoniste ~
fait référence à un composé dont la presence chez un hôte et notamment
chez un patient humain, est susceptible d'affecter l'activité d'une ou
plusieurs chemokines tout en ayant la capacité d'empêcher ou d'inhiber
o une infection virale in vivo ou in vitro; en particulier, un tel antagonistepeut bloquer ou déplacer la liaison d'une ou plusieurs chemokines à un ou
plusieurs récepteurs de chemokines, sur des cellules, par exemple, des
Iymphocytes, des monocytes ou des macrophages, et, donc le cas échéant
de façon indirecte, cet antagoniste est susceptible d'affecter les propriétés
s biologiques d'activation cellulaire de ces chemokines. Les propriétés
recherchées ainsi définies de cet antagoniste peuvent être
avantageusement vérifiées grâce à un test effectue in vitro sur des
Iymphocytes PBL normaux stimules par un mitogene et infectés par des
isolats primaires de rétrovirus VIH.
Selon la présente demande, on entend par l'expression ~ prévention
ou traitement d'une infection due à un rétrovirus de type VIH ~ la capacité
du composé antagoniste précité d'intervenir soit sur la replication virale
d'isolats primaires de VIH dans des cellules participant à l'immunité de
l'hôte, et en particulier dans des Iymphocytes du sang périphérique, par
exemple des Iymphocytes T-normaux. Cette expression englobe également
la prévention et le traitement des infections telles que les infections dites
opportunistes ou des tumeurs précédant et/ou accompagnant le
développement de la maladie SIDA et de ce fait, définies comme maladies
reliées a l'infection par un rétrovirus VIH.
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Le test effectué in vitro sur des Iymphocytes PBL (Iymphocytes du
sang périphérique) infectés a l'aide de souches primaires de VIH, est une
indication pertinente des propriétés thérapeutiques ou prophylactiques
recherchées des antagonistes décrits.
s Le terme ~ VIH ~ comprend les virus et rétrovirus humains ou
animaux susceptibles d'induire une immunodeficience, tels que les
rétrovirus connus sous les noms de VIH-1 et VIH-2 et notamment les
différents isolats caractérisés jusqu'à ce jour, qu'il s'agisse d'isolats
primaires ou d'isolats modifiés pour répondre à des contraintes de culture
o in vitro. ou des clones HIV infectieux provenant d'isolats primaires.
Les composés antagonistes selon l'invention permettent, dans le
cadre du traitement ou de la prévention d'une infection due à un rétrovirus
de type VIH, de diminuer la réplication et/ou ia dissémination du rétrovirus
dans l'organisme de l'hôte infecte et/ou de corriger le déficit immunitaire
résultant de cette infection ou ses manifestations.
~ Selon un premier mode de réalisation de l'invention, I'antagoniste
est un compose susceptible d'entrer en competition avec une ou plusieurs
chemokines, pour la liaison à un ou plusieurs récepteur(s) cellulaire(s) de
cette (ces) dernière(s).
Les molécules appartenant à la famille des chemokines sont
connues pour avoir au moins pour certaines d'entre elles, la capacite de
lier différents récepteurs cellulaires présents sur les cellules dérivées des
lignées Iymphoïde ou myéloïde, et en particulier plusieurs récepteurs
présents sur des cellules de type Iymphocytes, monocytes, basophiles, ou
eosinophiles.
L'antagoniste utilisable dans le cadre de la présente demande, peut
selon un premier mode particulier de réalisation de l'invention, être
sélectionné pour sa capacité à interférer avec l'interaction normale entre
les chemokines et leur(s) récepteur(s) et en particulier à modifier l'accès,
par exemple la reconnaissance conformationnelle d'une ou plusieurs
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chemokines vis-à-vis de son(ses) récepteur(s) ou encore à bloquer la
liaison d'une ou plusieurs chemokines avec un ou plusieurs recepteurs
cellulaires naturels de ces chemokines.
Avantageusement, cet antagoniste se substitue à une ou plusieurs
5chemokine dans l'activité de liaison à un ou plusieurs recepteurs.
En dépit de l'existence d'une multi-spécificité de liaison des
chemokines à des récepteurs celluiaires, I'invention a egalement pour
objet selon un autre mode de realisation parti~culier, des composés
antagonistes selectionnés pour leur affinité spécifique vis-à-vis d'un
orécepteur déterminé ou d'un nombre déterminé de récepteurs de
chemokines .
Selon une variante de réalisation de l'invention, I'antagoniste mis en
oeuvre est choisi pour sa capacité à deplacer la liaison d'une ou plusieurs
chemokines vis-à-vis d'un ou plusieurs recepteurs cellulaires de ces
dernieres.
. Selon un mode de réalisation particulierement avantageux de
l'invention, I'antagoniste a une activité de compétition avec une ou
plusieurs chemokines choisies parmi RANTES, MIP1 a, MIP1~, MCP1,
MCP3.
20Des parentés de structures ont été constatées entre les différentes
chemokines précitees, en particulier entre les chemokines RANTES et
MIP, tant au niveau de la séquence d'acides aminbs formant la structure
primaire de ces chemokines que de leurs structures secondaires ou tri-
dimensionnelles telles qu'établies par la technique de spectroscopie de
2sRésonnance Magnétique Nucléaire (Wells T.N.C. et al, Journal of
Leukocyte ~iology, vol. 59, Janvier 1996, pages 53-60).
Les inventeurs ont constaté que des antagonistes de la molécule
RANTES sont par exemple capables de lier les récepteurs de plusieurs
chemokines en particulier ceux de RANTES, MCP3 et MCP1. De tels
30antagonistes présentent des propriétés tout-à-fait intéressantes, du fait de
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leur capacité à occuper les sites normalement occupés par RANTES,
ladite occupation entralnant une activité anti-virale vérifiable notamment in
vitro sur des Iymphocytes normaux infectés par des isolats primaires de
~ VIH.
Un composé antagoniste intéressant dans le cadre de la réalisation
de l'invention est par exemple un compose dont la structure est dérivée de
la structure d1une chemokine, par exemple d'une chemokine choisie parmi
les molécules RANTES, MIP ou MCP définies précédemment.
On peut considerer qu'une structure est dérivée de celle d'une
o chemokine lorsque le composé ayant cette structure est différent par
exemple dans sa nature, sa composition, sa conformation, par rapport à la
chemokine de référence tout en conservant les propriétés de ladite
chemokine pour la réalisation de la fonction d'antagoniste définie ci-
dessus, par exemple la capacité de se lier à un ou plusieurs récepteurs .
13 De façon particulièrement avantageuse, cet antagoniste est en outre
caractérisé en ce qu'il est dépourvu des propriétés biologiques de la
chemokine ou des chemokines dont il affecte l'activite.A cet égard,
I'invention vise des antagonistes de chemokines dépourvus des propriétés
de chemoattraction habituellement reconnues aux chemokines et
20 avantageusement à la molécule RANTES.
D'autres propriétés biologiques peuvent être atténuees voire
supprimees dans lesdits antagonistes.
Par exemple, I'antagoniste peut être caractérise en ce qu'il est
dépourvu de la capacité de transduction d'un signal dans les cellules
25 auxquelles il est lié par l'intermédiaire d'un ou plusieurs récepteurs
déterminés. En d'autres termes, I'antagoniste est caractérisé en ce qu'il ne
transduit aucune activité biologique à travers le ou les récepteurs auxquels
il est lie. De façon essentielle, cet antagoniste conserve neanmoins
l'activité antivirale reconnue a la molécule RANTES, à tout le moins a un
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niveau permettant de réduire la réplication ou la dissémination virale ou
leur effet et de façon avantageuse, de l'inhiber.
Outre la diminution, voire la disparition des propriétés
chemoattractives dévolues à la molecule native RANTES, un antagoniste
selon l'invention peut egalement être caractérisé en ce qu'il est depourvu
de la capacite naturelle de la molécule RANTES d'une part à induire la
libération ou l'entrée du calcium dans les cellules auxquelles elle est liée
par un récepteur et/ou d'autre part, à affecter l'exocytose par relargage
d'enzymes à partir de ces cellules.
o Ainsi, I'invention met avantageusement à disposition des molécules
ayant des effets anti-viraux d'une ou plusieurs chemokines qui sont
néanmoins dépourvues des effets secondaires des chemokines actives.
Un antagoniste interessant selon l'invention peut en outre être
caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide dérive d'une chemokine, dont
la structure comprend au moins un, voire deux ponts disulfure.
~ Ainsi, selon un mode de realisation préféré de l'invention pour
l'utilisation dans le traitement d'une infection due à un rétrovirus ViH, on
aura recours à un antagoniste de type polypeptidique, dérivé du
polypeptide RANTES répondant à la sequence d'acides aminés
représentée à la figure 1, par substitution, addition ou deletion d'au moins
un résidu d'acides aminés, ledit antagoniste étant dépourvu des proprietés
chemo-attractives des chemokines vis à vis des leucocytes, en particulier
des Iymphocytes.
Le terme ~ polypeptide ~ fait référence à une structure d'acides
aminés comprenant de 10 à 100, de préference de 10 à 70 acides aminés,
laquelle structure peut être utilisee sous forme linéaire ou sous forme
conformationnelle. A cet égard, I'invention concerne avantageusement des
antagonistes ayant une structure correspondant à la structure conferée par
la présence de plusieurs et notamment de deux ponts disulfure telle qu'on
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I'observe dans les cytokines, notamment dans les molécules RANTES,
MIP et MCP.
Un polypeptide dérivé du polypeptide RANTES, utilisable dans le
cadre de l'invention est par exemple obtenu par delétion de tout ou partie
5 de sa séquence N-terminale et en particulier par délétion de tout ou partie
de la séquence comprise entre les residus d'acides aminés 1 et 15 ou
entre les acides aminés 1 et 9 ou 1 et 8 (y compris les résidus extrêmes)
de la séquence d'acides amines representée a la figure 1 C.
Selon un mode de realisation préféré de l'invention, I'antagoniste
o utiiisable pour le traitement ou la prévention d'une infection due a un
rétrovirus VIH est un polypeptide répondant à la séquence d'acides aminés
suivante (appelée RANTES 9-68 ):
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKWV
15 REYINSLEMS ou la séquence R8-68suivante,
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW
VREYINSLEMS
La suppression de ces résidus diminue les effets de signalisation à
travers les récepteurs de chemokines occupés, tout en gardant i'activite
antivirale de cet antagoniste.
Les séquences d'acides aminés sont identifiees par référence au
code à une lettre habituellement utilise.
Cet antagoniste peut être utilise sous la forme de sa structure
primaire ou sous une forme tri-dimensionnelle par exemple sous une forme
reproduisant les caractéristiques essentielles de la structure
conformationnelle de la molécule RANTES a tout le moins de la partie de
cette molécule impliquée dans la liaison à son ou ses récepteur(s)
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1()
cellulaire(s). Cette structure a été rapportée dans l'article de Wells T.N.C.
précité et de Chung C.W. (Biochemistry 34, 9307-9314).
Alternativement ou au contraire selon une caractéristique
supplémentaire, I'antagoniste utilisable dans le cadre de l'invention est un
polypeptide dérivé du polypeptide RANTES lequel est representé par sa
séquence d'acides amines à la figure 1 C, par délétion de tout ou partie de
sa séquence C-terminale comprise entre les résidus d'acides aminés 50 et
68, de préférence 60 et 68 de la séquence représentée à la figure 1 C.
Un antagoniste dérivé du polypeptide RANTES par substitution ou
o par mutation peut alternativement être caractérise en ce que environ 5% à
environ 10% des résidus d'acides aminés, à l'exception des résidus
cystéine impliqués dans la formation de ponts disulfure, sont remplacés.
Les résidus d'acides aminés substitués peuvent l'être par des
acides aminés neutres, ou constituant une substitution conservatrice ou
15 choisis le cas échéant en tenant compte de l'encombrement stérique.
A titre d'exemple des residus Iysine peuvent être remplaces par des
résidus isoleucine, leucine ou valine.
A titre d'exemple, de tels antagonistes utilisables pour la réalisation
de l'invention répondent à l'une des séquences d'acides aminés
20 suivantes:
MPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKW
VREYINSLEMS
25 PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV
REYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV
RQYINSLQMS
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WO 97/44462 PCT/FR97/00900
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLWV
AQYINSLQMS
MTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKK
5 WVREYINSLEMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW
VREYINSLEMS
o TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW
VRQYINSLQMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW
VAQYINSLQMS
Selon une variante de l'invention, I'antagoniste mis en oeuvre est
caractérisé en ce qu'il s'agit d'une molécule RANTES dont l'extrémité N-
terminale a éte allongée par addition d'au moins un résidu d'acide aminé
ou alternativement d'une molécule RANTES dont les extrémités N- et C-
20 terminales ou dont les séquences internes à ces régions N- ou C-
terminales ont été allongées par addition d'un ou plusieurs résidus
d'acides aminés dans des conditions permettant d'obtenir l'effet
antagoniste recherché.
L'invention a egalement pour objet une séquence de nucléotides
25 comprenant une sequence codant pour un polypeptide dérive du
polypeptide F~ANTES repondant à la séquence d'acides aminés
représentée à la figure 1, par delétion de tout ou partie de la sequence N-
terminale de ce dernier.
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Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, cette
séquence code pour un polypeptide antagoniste tel qu'il a été défini dans
les pages précédentes.
De façon préférée, la séquence de nucléotides est caractérisée en
s ce qu'elle répond à l'enchaînement suivant:
CCCTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC
CCACATCAAG GAGTATTTCT ACACCAGTGG CMGTGCTCC
AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CACCCGAAAG MCCGCCAAG
0 TGTGTGCCAA CCCAGAGMG MATGGGTTC GGGAGTACAT
CAACTCTTTG GAGATGAGCT AG
ou à l'enchainement suivant:
ACACCCTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC
5 CCACATCMG GAGTATTTCT ACACCAGTGG CMGTGCTCC
AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CACCCGAMG MCCGCCMG
TGTGTGCCAA CCCAGAGMG AMTGGGTTC GGGAGTACAT
CAACTCTTTG GAGATGAGCT AG
Une sequence de nucleotides selon l'invention peut le cas echeant
comprendre également des séquences exogènes, notamment des
sequences de régulation et/ou d'activation capables de contrôler et/ou de
réguler l'expression de la séquence codant pour un antagoniste selon
25 I'invention dans une cellule hôte, in vitro ou in vivo.
Elle peut également être recombinee avec une autre séquence
codante susceptible d'exprimer dans un hôte cellulaire un polypeptide
d'intérêt, notamment dans le but de traiter ou de prevenir une infection due
à un retrovirus VIH ou avec une séquence codante pouvant remplir la
30 fonction de molécule porteuse. Par exemple, une séquence de nucléotides
de l'invention peut être fusionnée avec tout ou partie d'une séquence
codant pour la ,~-galactosidase. Dans ce cas, la séquence codante de la ~-
galactosidase contient avant le premier codon correspondant au premier
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acide aminé proline de la molécule R9-68 ou R8-68, une séquence
peptidique du type X-glycyl-L-propyl, reconnue spécifiquement par une
collagénase, permettant ainsi la réalisation d'une coupure spécifique
après le residu glycine du polypeptide formé, libérant l'antagoniste. Cette
technique est décrite dans la demande de brevet européen 0115974.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la séquence de
nucléotides est caractérisée en ce qu'elle est inserée dans un vecteur
d'expression ou adsorbée sur un support susceptible d'être internalisé
dans une cellule eucaryote ou encore dans une bactérie capable d'entrer
o dans des cellules eucaryotes telle que Shigella selon le procédé decrit par
Courvalin P. et al. (C.R. Acad. Sci. Paris, 1995, 318:1207-12). Ce vecteur
est avantageusement choisi pour permettre l'expression in vitro dans un
hôte cellulaire, d'un antagoniste tel que defini précedemment ou pour
permettre l'expression in vivo chez un hôte auquel il est administre,
notamment chez un patient infecté par un rétrovirus VIH, à des fins
d'expression transitoire ou continue d'un antagoniste tel que défini dans
les pages qui précedent.
Les séquences de nucléotides ainsi definies dans le cadre de
l'invention sont par exemple utilisables dans le cadre d'un protocole de
thérapie génique visant à prévenir ou à traiter une infection due a un
rétrovirus VIH. A cet égard, on pourra avoir recours à des vecteurs
utilisables dans le cadre de ces therapies, tels que ceux décrits dans les
demandes de brevet internationales publiées sous les numéros WO
95/14785 et WO 94124298.
Ces séquences de nucléotides peuvent aussi être administrees en
faisant appel aux techniques décrites dans le brevet FR 2711670 ou dans
la demande de brevet internationale WO 90/11092, pour l'expression
in vivo.
De façon genérale, et compte tenu des caractéristiques particulières
de l'infection par un rétrovirus VIH, on peut avoir recours à des vecteurs
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permettant l'administration ou le relargage contrôlé voire retardé de ces
séquences nucléotidiques ou de leur produit d'expression chez l'hôte
traité, afin d'obtenir un effet antiviral continu ou itératif à tout le moins sur
une période suffisante pour diminuer voire inhiber l'infection par le
5 rétrovirus ou ses effets. A cet égard, des techniques telles que celles
faisant appel à l'utilisation d'un gel de phosphate de calcium peuvent être
utilisées pour obtenir un relargage avec effet retard d'un produit actif. De
telles techniques sont par exemple décrites dans le brevet français 2 543
439.
Des séquences reconnues par des protéases cellulaires ou
extracellulaires peuvent être utilisees pour permettre la production de
formes matures des molécules antagonistes de RANTES à partir de ces
vecteurs. La forme mature de la proteine RANTES est en effet produite
après clivage d'une séquence de 23 acides aminés situés en amont du
s premier residu (serine) de la forme active de la protéine.
Les taux sériques à atteindre chez les patients traités seraient de
l'ordre de 1 à 100 nM.
L'invention a également pour objet un polypeptide correspondant au
produit d'expression dans une cellule hôte, par exemple une cellule
20 bactérienne ou une cellule eucaryote, notamment une cellule de levure,
une cellule de mammifère, par exemple CHO, d'une séquence de
nucléotides telle que définie précédemment.
Un polypeptide particulier est un polypeptide caractérisé en ce qu'il
répond à l'une des séquences d'acides aminés suivantes:
2s
MPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANP{~KKW
VREYINSLEMS
PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLWV
30 REYINSLEMS
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PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW\/
RQYINSLQMS
5 PCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLV\N
AQYINSLQMS
MTPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKK
V\NREYINSLEMS
TPCCFAYlARPLPRAHiKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPELLW
VREYINSLEMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW
VRQYINSLQMS
TPCCFAYIARPLPRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPQLLW
VAQYINSLQMS
Un autre polypeptide antagoniste utilisable dans le cadre de
l'invention est par exemple un poiypeptide RANTES modifié par addition
d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés en amont de son extrémite N-
terminale. Par exemple, I'addition d'une méthionine en amont du premier
résidu (sérine) de la forme mature de RANTES presenterait l'avantage
d'inhiber la capacité chemoattractive de la chemokine tout en conservant
sa capacité d'inhibition de l'infection virale, grâce à sa capacité non
modifiée à se lier spécifiquement a son recepteur.
La production de molécules modifiees de RANTES ou d'autres
polypeptides antagonistes peut être réalisée par synthèse chimique ou par
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recombinaison et expression dans une cellule procaryote ou eucaryote par
exemple dans la levure ou chez E coli.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le
polypeptide est un antagoniste d'une ou plusieurs chemokines choisies
5 parmi RANTES, MIP ou MCP, caractérisé en ce qu'il est dérivé du
polypeptide RANTES répondant à la sequence d'acides aminés
représentée à la figure 1, par substitution, addition ou déletion d'au moins
un résidu d'acides aminés, ledit antagoniste étant dépourvu des propriétés
chemoattractives des chemokines par exemple vis-à-vis des leucocytes, en
o particulier des Iymphocytes, ledit polypeptide étant sous forme d'un
polypeptide de fusion, capable de lier le(les) récepteurs cellulaires de
RANTES et/ou MIP etlou MCP.
Les polypeptides de l'invention peuvent être prépares par génie
génétique ou par synthèse chimique par exemple sur un appareil (Applied
S Biosystems) ou par synthèse sur phase solide décrite par Merrifiel, par
exemple selon la technique décrite dans la demande WO 95/09868.
L'invention vise également une composition caractérisée en ce
qu'elle comprend pour l'administration séparee ou simultanée un composé
antagoniste d'une ou plusieurs molécules de la famille des chemokines
20 telles que définies précédemment, et un ou plusieurs agents actifs
susceptibles d'être utilisés dans le traitement d'une infection par un
rétrovirus VIH, par exemple un agent utilisable en chimiothérapie tel qu'un
composé anti-transcriptase inverse ou anti-protéase virale ou un composé
tel qu'un antagoniste du récepteur CD4 présent sur des Iymphocytes de
2s patients infectés par un rétrovirus VIH ou encore un composé utilisable en
immunothérapie, par exemple une cytokine et notamment l'interleukine 2.
Le cas échéant, ladite composition comprend, outre le composé
antagoniste d'une ou plusieurs chemokines et une ou plusieurs substances
actives en chimiothérapie antivirale,ettou un agent de traitement des
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infections opportunistes se développant lors de l'infection par un rétrovirus
VIH ou lors de l'évolution de l'infection in vivo.
Les produits définis dans l'invention, qu'il s'agisse des antagonistes
ou des séquences de nucleotides codant pour de tels antagonistes, le cas
5 échéant en combinaison avec d'autres éléments, sont utilisables pour le
traitement de patients à tous les stades de l'infection par un retrovirus de
type VIH et notamment pour le traitement des enfants nes de meres
séropositives ou des personnels soignants contamines accidentellement.
Les composés de l'invention peuvent être à cet egard administrés par
o injection par voie intraveineuse par exemple par perfusion, par voie
intramusculaire ou sous-cutanée. Dans le cas de l'utilisation en thérapie
génique des composés décrits dans l'invention, on pourra avoir recours a
des cellules du patient, par exemple des fibroblastes, myoblastes ou
cellules hématopoïétiques traitées avec des vecteurs appropriés contenant
15 les sequences nucléotidiques de l'invention, ces cellules étant ensuite
réimp~antées chez le patient pour l'expression des susdites séquences de
nucléotides.
L'efficacité du traitement ainsi effectue peut être evaluée en
contrôlant et en suivant la charge virale, plasmatique et cellulaire et en
20 examinant l'évolution du nombre de Iymphocytes porteurs de récepteurs
CD4, ainsi que le statut immunologique et inflammatoire du patient.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront
dans les exemples et la figure qui suivent.
2s Fiqure 1: Séquence de nucléotides et d'acides aminés de RANTES.
A: Séquence de cDNA comprenant la séquence codante
B: Séquence codante de la protéine RANTES mature
C: Séquence d'acides aminés de RANTES.
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Fiqure 2: Séquence de nucléotides et d'acides aminés des polypeptides
R9-68 et R8-68 et de polypeptides substitués.
A: Séquence codante de R9-68 et de R8-68
B: Séquence des polypeptides R9-68 et R8-68
C: (a) (b) (c) Séquence des polypeptides R9-68 et R8-68 substitués dans
la partie C-terminale.
EXEMPLES
o Evaluation de l'activite antivirale de l'antagoniste RANTES 9-68
Un antagoniste de la chemokine RANTES a été défini et obtenu
sous la forme d'un polypeptide tronqué dont la séquence d'acides aminés
correspond aux résidus d'acides aminés 9 à 68 de la sequence d'acides
aminés de la molecule RANTES telle que définie à la figure 1.
L'antagoniste RANTES 9-68 a été produit en utilisant la technique décrite
dans la publication de Gong JH et al (J B C vol 271 N18, issue of may 3,
1996 p 10521 -10527).
Il a eté utilise à des concentrations variables de 1000 nM à 10 nMet a été
ajouté à des cultures cellulaires après infection par différents isolats de
VIH. A cet effetl un clone d'un isolat primaire obtenu a partir du fluide
cérébrospinal d'un patient atteint de SIDA (désigné par VIH JR-CSF
Koganagi Y et al Science 236: 819, 1987 et Cann AJ et al, J Virol 64:
4735, 1990) a éte utilisé ainsi qu'un clone PYU2 correspondant a une
souche primaire de VIH ayant un tropisme pour ies Iymphocytes T et les
monocytes et isolé à partir du cerveau (Li et al, J. Virol., 1992, vol 66-
6587). Pour obtenir le clone JR-CSF, I'ADN proviral a ete transfecté dans
des cellules COS7 et le surnageant obtenu après trois jours de la culture
transfectée contenant les particules infectieuses a été utilisé pour infecter
des PBL.
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La capacité antivirale de R9-68 mise en évidence dans des cellules
infectées par HIV pYU2 et HIV JR-CSF était similaire à celle de MlP1a En
effet, des niveaux de suppression de la réplication virale supèrieurs ou
égaux à 95% des cultures contrôles infectées ont été obtenus à la
concentration de 10nM, la plus faible concentration de MlP1a a induire un
tel effet suppresseur sur la réplication de HIV-JR-CSF ou HlV-pYU2
o Les propriétés antivirales de l'antagoniste R9-68 ont éte testées en
déterminant la capacite de cet antagoniste à bloquer la réplication du virus
VIH.
La capacité d'une molécule à bloquer la réplication du virus VIH a
pu être testee en utilisant la technique mettant en oeuvre des leucocytes
isolés sur un gradient de Ficoll à partir de donneurs sains, lesquels
leucocytes ont été infectés in vitro avec des isolats viraux primaires,
incapables de se repliquer dans des lignées cellulaires transformées.
~ A cet égard, des cellules de six donneurs difféfents, le plus souvent
des blastes induits par un traitement à la phytohémaglutinine (PHA)
pendant 48 à 72 heures ont été infectés pendant 2 ou 3 heures avec les
isolats de VIH. La quantité d'inoculum viral a été estimee par quantification
de la protéine GAG P24 et s'est avéree être comprise entre 150 à 5000
picogrammes pour 10 000 000 de cellules. Après des lavages pour
éliminer les particules virales residuelles, les cellules ont éte cultivées sur
2~ des microplaques de 96 puits (2 x 105/200 microlitres) en présence des
molécules testées purifiées dans un milieu de culture enrichi en
interleukine 2. Les surnageants de culture ont éte collectés
périodiquement et les cultures cellulaires ont éte repiquées avec des
milieux frais et les molécules testées. Dans certains cas, les blastes traites
avec la PHA ont également été ajoutés pour apporter à la culture infectée
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des cellules fraîches servant de cible pour VIH. La réplication virale a été
mesurée en utilisant le kit ELISA P24 (Dupont de Nemours) (seuil de
détection: 3 pg/ml).
Ainsi, pour un des donneurs les celluJes infectées par pYU2 et
traitées avec R9-68 à la concentration de 1000nM ont produit 7 pg/ml de
protéine p24 au jour 11 (76 et 24 pg/ml aux jours 6 et 8 respectivement).
La protéine p24 n'a pas été détectée dans les cultures de ce même
donneur infectees par JR-CSF en présence de R9-68 au jour 11 (62 et 15
pg/ml ont été détectés aux jours 6 et 8 respectivement). Des cultures
o contrôles infectées par pYU2 et JR-CSF mais non traitées par R9-68 ont
montré une réplication virale intense qui a généré 7 ng/ml et 113 ng/ml de
protéine P24 au jour 11 respectivement. Au contraire de R9-68,
I'antagoniste MR-IL8 (1000 nM de la protéine IL8 était dépourvu d'effet
antiviral.
Pour approfondir la connaissance des mécanismes d'interférence
dans. Ia réplication du VIH, induits par R9-68, des expériences visant
l'analyse de l'internalisation de particules infectieuses et la
rétrotranscription de l'ARN viral génomique en ADN proviral ont été
realisées.
Après infection par la souche JR-CSF de cellules mononuclées du
sang activées par la PHA, en présence ou en l'absence de 100nM de R9-
68, des extractions d'ADN ont été pratiquées 3h post-infection, ou d'ADN
20h post-infection. Les cultures infectées en présence de R9-68 ont eté
maintenues en présence de la molécule iusqu'à extraction de l'ARN ou de
I'ADN. Par des techniques d'amplification par PCR soit du RNA g~enomique
rétrotranscrit in vitro, soit de l'ADN proviral, une légère diminution de
l'accumulation de RNA génomique viral intracellulaire a éte mise en
evidence dans les cellules traitées par R9-68 par rapport aux contrôles de
cellules infectées mais non traitées. En revanche l'analyse de l'ADN
proviral a révélé une profonde diminution du signal spécifique dans les
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cellules infectees en présence de R9-68. La spécificité du signal obtenu de
I'ADN proviral était démontrée par son abolition dans des cellules
infectées et traitées par l'inhibiteur de la réverse transcriptase virale, 3'-
azido-3'deoxythimidine (AZT). Des résultats comparables ont eté obtenus
s avec RANTES dans des experiences réalisées en parallèie avec celles ci-
dessus décrites.
Ces résultats indiquent que l'interférence de R9~68 et aussi celle de
RANTES, dans la réplication de l'isolat primaire HIV-JR-CSF aurait lieu
précocément mais de preférence après internalisation du virus.
o Des données similaires concernant l'activité antivirale des
chemokines RANTES et MIP1 a ou de l'antagoniste R9-68 ont été
obtenues lorsque des blastes traités avec la PHA provenant d'un autre
donneur ont été infectés avec l'isolat JR-CSF ayant subi deux semaines de
passage dans des cultures de PBL traitées avec l'IL2.
Dans tous les cas la viabilité des cellules traitées avec R9-68 ou
avec RANTES était comparable à celle des cultures controles infectées
mais non traitees Les méthodes de mesure ont ét faite en comparaison des
thymidines tritiées ou du contage direct du nombre de cellules à la fin des
pèriodes de culture.
