Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
Nouveau site interne d'entrée des ribosomes et vecteur le contenant
La présente invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique
dérivée de l'extrémité S' de l'ARN génomique ou de l'ADN proviral d'un virus
de la réticuloendothéliose à titre de site interne d'entrée des ribosomes (IRES)et/ou pour améliorer l'encapsidation rétrovirale. Plus particulièrement, elle
concerne des vecteurs d'expression comportant cette séquence et no!~"-"-r.lt desvecteurs polycistroniques permettant l'expression efficace et stable de plusieurs
gènes d'intérêt sous la dépe~ nre d'un même promoteur. La p,ésenLe invention
trouve une application intéressante dans le domaine des vecteurs de thérapie
génique.
La faisabilité de la thérapie génique appliquée à l'homme n'est plus à
démontrer et ceci concerne de nombreuses applications thérapeutiques comme
les m~ lies génétiques, les m~l~di~s infectieuses et les cancers. De nombreux
documents de l'art antérieur décrivent les moyens de mettre en oeuvre une
thérapie génique, notamment par l'intermédiaire de vecteurs viraux. D'une
manière générale, les vecteurs sont obtenus par délétion d'au moins une partie
des gènes viraux qui sont remplacés par les gènes d'intérêt thérapeutique. De
tels vecteurs peuvent être propagés dans une lignée de complern~nt~tion qui
fournit en trans les fonctions virales délétées pour générer une particule virale
défective pour la réplication mais capable d'infecter une cellule hôte. A ce jour,
les vecteurs rétroviraux sont parmi les plus utilisés mais on peut citer également
des vecteurs issus des adénovirus, virus associés aux adénovirus, poxvirus et
virus de l'herpès. Ce type de vecteurs, leur organisation et leur mode d'infection
sont largement décrits dans la littérature ~rces~ihle à l'homme de l'art.
A titre in~ir~tif, le génome rétroviral est constitué par un ARN linéaire,
simple brin et de polarité positive. Outre les séquences de régulation R et US et
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
U3 et R présentes aux extrémité 5' et 3' respectivement, il porte trois gènes:
gag codant pour les protéines de la capside, pol codant pour la transcriptase
inverse et l'intégrase et env codant pour les protéines de l'enveloppe. Les
signaux d'encapsidation, situés en aval des séquences U5 jusqu'au début de la
5 région codante du gène gag, participent à la dimérisation et l'encapsidation de
l'ARN viral dans les particules virales. L'extrémité 5' du génome comprend une
coiffe (cap) et l'e~tlc~liLe 3' est polyadénylée. Lors du cycle infectieux, l'ARN
viral est converti en un ADN proviral linéaire, double brin muni à chaque
extrémité de séquences répétées inversées LTRs (pour Long Terminal Repeat en
10 anglais) n,ocess~ires à l'initiation de la transcription. Celle-ci, réalisée par la
machinerie cellulaire, permet la production des ARN génomiques et
subgénomiques à partir desquels sont synthétisées les protéines virales. Les
rétrovirus peuvent être classés en 4 sous-farnilles A à D, sur la base de leur
morphologie. Le type C regroupe la majorité des rétrovirus dont les virus MLV
15 (Murine Te~-kemi~ Virus) et MSV (Murine Sarcoma Virus) utilisés dans la
plupart des vecteurs de thérapie génique et les virus REV (ReticuloendotheliosisVirus) d'où dérive la séquence nucléotidique de la présente invention.
Il peut être avantageux de disposer de vecteurs de thérapie génique plus
pelrol"~ et capables notamment de produire efflcacem~nt plusieurs protéines
20 d'intérêt. Cependant, la présence de plusieurs promoteurs au sein du même
vecteur se traduit très souvent par une réduction voire même une perte de
l'expression au cours du temps. Ceci est dû à un phénomène bien connu
d'i,.lelri~lence entre les séquences promotrices. Dans ce contexte, la publication
de la demande inte--lationale WO93/03143 propose une solution à ce problème
25 qui consiste à mettre en oeuvre un site interne d'entrée des ribosomes (IRES).
Elle decrit un vecteur rétroviral dicistonique pour l'expression de deux gènes
d'interet placés sous le contrôle du même promoteur. ~a présence d'un site IRES
de picornavirus entre ceux-ci permet la production du produit d'expression issu
du second gène d'intérêt par initiation interne de la traduction de l'ARNm
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R9B/00849
dicistronique.
Normalement, l'entrée des ribosomes au niveau de l'ARN messager
(ARNm) se fait par la coiffe située à l'extrémité 5' de l'ensemble des ARNm
eucaryotes. Les sous unités ribosomales 40S se déplacent le long de l'ARN
5 jusqu'à rencontrer un codon AUG a~pLoplié pour débuter la synthèse protéique.
Généralement, l'initiation a lieu au niveau du premier codon AUG. Mais, si
celui-ci est dans un contexte peu favorable, les sous unités 40S poursuivent
jusqu'à un codon AUG ultérieur situé dans un meilleur contexte traductionnel
(Kozak, 1984, Nucleic Acid Res. 12, 3873-3893; Kozak, 1991, J. Biol. Chem.
266, 19867-19870; Pain, 1996, Eur. J. Biochem. 236, 747-771).
Cepen-l~nt, cette règle universelle connaît des exceptions. L'absence de
coiffe chez certains ARNm viraux laissait supposer l'existence de structures
alternatives permPtt~nt l'entrée des ribosomes à un site interne de ces ARN. A
ce jour, un certain nombre de ces structures, nommées IRES du fait de leur
fonction, ont été i(l~ntifiçes dans }a région 5 ' non codante des ARNm viraux non
coiffés comrne celle notamment des picornavirus tel que le virus de la
poliomyélite (Pelletier et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 1103-1112) et l'EMCV
(Encephalomyocarditis virus (Jang et al., 1988, J. Virol. 62, 2636-2643). Des
ARNm cellulaires possédant des éléments IRES ont également été décrits. On
peut citer ceux codant pour la protéine BIP (pour Inununoglobulin heavy chain
binding protein; Macejak et Sarnow, 1991, Nature 353, 90-94), certains
facteurs de croissance (Teerink et al., 1995, Biochem. Biophy. Acts 1264, 403-
408; Vagner et al., 1995, Mol. Cell. Biol. I5, 35-44), le facteur d'initiation de
la traduction eIF4G (Gan et Rhoads, 1996, J. Biol. Chem. 271, 623-626) et deux
facteurs de transcription de levure T~IID et HAP4 (Iizuka et al., 1994, Mol.
Cell. Biol., 14, 7322-7330). Des sites IRES ont également mis en évidence dans
les retrotransposons murins de type VL30 (Berlioz et al., 1995, J. Virol. 69,
6400-6407) et, plus réce,-,-"~,lt dans les ARNm codant pour le précurseur gag
des virus de la leucçmie murine de Friend (FMLV) et de Moloney (MoMLV)
CA 022~8490 1998-12-23
-
W O 98/49334 PCT~R98/00849
(Berlioz et Darlix, 1995, J. Virol. 69, 2214-2222; Vagner et al., 1995, J. Biol
Chem. 270, 20376-20383).
On a maintenant trouvé un nouveau site interne d'entrée des ribosomes
dans la région 5' non codante de l'ARN du virus aviaire de la
5 réticuloendothéliose (REV) de type A (REV-A) et montré son efficacité pour
initier la traduction de séquences codantes placées à sa suite d'une manière
monocistronique ou dicistonique.
Le site IRES de la présente invention est particulièrement avantageux par
rapport à ceux déjà décrits dans la littérature. En premier lieu, il permet un taux
10 d'expression important du cistron qu'il contrôle. En outre et, de manière
in~enrlue~ il peut également, dans le cadre d'un vecteur rétroviral, contribuer
ou améliorer, en association avec une région d'encapsidation ap~,lopliée, les
fonctions de dimérisation ou d'encapsidation, perrnettant une augmentation du
titre viral. Et enfin, du fait de sa faible homologie avec les séquences rétrovirales
15 murines ~tili~ées dans la plupart des vecteurs de thérapie génique destinés à un
usage hnm~in, son emploi réduit considérablement le risque de production de
virus compétents pour la réplication.
La plupart des protocoles de thérapie génique approuvés par le RAC
(Recombinant DNA Advisory Committee) aux Etats Unis utilisent des vecteurs
20 dérivés du virus MoMLV. A l'heure actuelle, le choix d'un vecteur rétroviral
spécifique pour une application thérapeutique donnée reste empirique et les
facteurs influenç~nt le titre viral et l'expression des gènes n'ont pas encore été
clairement élucidés. L'étude des séquences agissant en c~s qui contrôlent
l'encapsidation et l'établissement des forces relatives de divers éléments IRES
25 peuvent permettre d'optimiser les vecteurs de thérapie génique en termes de titre
et d'expression génique. Un des buts de la presente invention est de proposer denouveaux vecteurs rétroviraux susceptibles d'être propagés à haut titre et de
permettre une expression optimale d'un ou plusieurs gènes d'intérêt.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet l'utilisation d'une
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT/FR98/00849
séquence nucléotidique dérivée de tout ou partie de l'extrémité 5' de l'ARN
génomique d'un rétrovirus de type C à l'exception des virus de la leucémie murine
de Friend (FMLV) et de Moloney (MoMLV), à titre de site interne d'entrée des
ribosomes (IRES) dans un vecteur et/ou pour permettre ou arnéliorer
5 I'encapsidation d'un vecteur rétroviral.
Par séquence nucléotidique, on entend une séquence composée de ribo
(ARN) ou de désoxyribonucléotides (ADN). Dans le cadre de la présente
invention, I'extrémité 5' de l'ARN génomique d'un rétrovirus correspond au quartS' dudit ARN qui s'étend du site d'initiation de la transcription (nucléotide +l)
10 jusqu'à environ 2 kb dans la direction 3'. Le terme rétrovirus est largement défini
dans les ouvrages de base de virologie accessibles à l'homme de l'art et les
car~t~oristiques essentielles ont été résumées à titre indicatif ci-dessus. Le terme
"dérivée" fait référence à une séquence ayant une origine rétrovirale de type C,mais qui peut avoir subi au moins une modification par rapport à la séquence
15 native. La ou les modifications envisageables incluent la délétion, I'addition, la
substitution et/ou la mutation d'un ou plusieurs nucléotides (nt). De telles
modifications peuvent avoir pour but par exemple d'accroître les fonctions IRES,d'encapsidation ou d'introduire des sites de restriction adéquates pour faciliter les
étapes de clonage ultérieures. Le terme "dérivée" comprend également
20 l'équivalent ADN de l'ARN génomique sous une forme modifiée ou non.
Par IRES, on désigne un site capable de promouvoir l'entrée des ribosomes
dans une molécule d'ARN d'une manière indépendante de la coiffe.
Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, la fonction IRES
peut s'exercer dans tout vecteur ou cassette d'expression. Une séquence en usage25 dans le cadre de la présente invention peut également agir en tant qu'élémentactivateur de l'encapsidation des rétrovirus ou vecteurs rétroviraux en favorisant
la dirnélisation de deux copies du génome rétroviral etlou l'encapsidation du
dimère dans les particules virales. Selon un mode de réalisation préféré, laditeséquence est capable d'exercer une fonction IRES et d'améliorer la fonction
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
d'encapsidation lorsqu'elle est introduite dans un vecteur rétroviral ap~,o~,;é.Une séquence nucléotidique telle qu'utilisée dans le cadre de la présente
invention, peut être isolée de l'extrémité 5' de l'ARN génomique ou de l'ADN
proviral d'un rétrovirus de type C ou de tout plasmide de l'état de la technique5 portant le fragment rétroviral d'intérêt Il va sans dire qu'elle peut être générée par
toute technique en usage dans le domaine de l'art, par exemple par clonage à l'aide
de sondes appl-opliées, par PCR (Polymerase Chain reaction) ou encore par
synthèse chimique. Avantageusement, ladite séquence comprend tout ou partie de
la région qui suit le domaine U3 du LTR 5', jusqu'au codon AUG initiateur du
10 gène gag. Aux fins de la présente invention, elle comprend au moins 50
nucléotides, avantageuct ment au moins 100 nucléotides, de préférence au moins
200 nucléotides et de manière préférée au moins 300 nucléotides compris dans
ladite extrémité 5'. Mais, bien Pnten~ elle peut s'étendre au delà dans la direction
5' ou 3' ou comporter des séquences supplémentaires. Avantageusement, ladite
séquence comprend de 100 à 1500 nucléotides et, en particulier, de 300 à 800
nucléotides.
On préfère mettre en oeuvre dans le cadre de la presente invention un
rétrovirus de type C à l'exception des virus FMLV et MoMLV. Un rétrovirus de
type C convenant plus particulièrement, est sélectionné parmi les virus REV
20 (Virus de la réticuloendothéliose), MSV (Murine sarcoma virus) et notamment
celui de Moloney (MMSV), MHV (Mus hortulanus virus), MEV (Mouse
endogenous retrovirus), FMOV (FBR murine osteosarcoma virus), AMLV (AKV
murine lellkemi~ virus), MEELV (Mouse endogenous ecotropic murine leukemia
virus), SFFV (Friend spleen focus-forrning virus), RASV (rat sarcoma virus), FLV25 (Feline leukemia virus), FSV (feline sarcoma virus), EFLV (Cat endogenous
proviral feline le--kemi~ virus), SSV (Simian sarcoma virus), GALV (Gibbon ape
leukemia virus) et BAEV (Baboon endogenous virus).
Selon un mode de réalisation tout à fait préféré, une séquence
nucléotidique en usage dans la présente invention dérive de tout ou partie de
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT/FR98/00849
l'extrémité 5' de l'ARN génomique d'un virus de la reticuloendotheliose (REV).
Les virus REV comprennent notamment différents sous-types A, B et T ainsi que
les virus DIAV (Duck infectious anemia virus), SNV (spleen necrosis virus) et
CSV (Chick syncytial virus) (voir par exemple Encyclopedia of Virology, 1994,
Enrietto, Reticuloendotheliosis viruses, p 1227- 1232 Ed. R. Webster et A. Granoff,
Academic Press, Hartourt Brace Company Publishers). Un virus REV convenant
tout particulièrement est le virus de la réticuloendothéliose aviaire, notammentcelui de type A (REV-A).
Selon cette dernière variante, on aura de préférence recours à une séquence
nucléotidique comprenant au moins 100 nucléotides et au plus 800 nucléotides
(nt) de l'extrémité 5' non codante du virus REV-A et plus particulièrement une
séquence nucléotidique substantiellement homologue ou identique à tout ou partiede la séquence présentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 1. A titred'exemples préférés, on peut citer une séquence nucléotidique substantiellement
homologue ou identique à la séquence présentée dans l'identificateur de séquenceSEQ ID NO: 2:
(i) commençant au nucléotide I et se terminant au nucléotide 578,
(ii) commençant au nucléotide 265 et se terminant au nucléotide 578,
ou
(iii) cornmençant au nucléotide 452 et se terminant au nucléotide 578.
Le terrne substantiellement homologue fait référence à un degré
d'homologie supérieur à 70%, avantage~l~e-ment supérieur à 80%, de ~l~r~lcnce
supérieur à 90% et, de manière tout à fait préférée, supérieur à 95%. Comme déjàindiqué, ladite séquence nucléotidique peut avoir une séquence légèrement
différente de celle décrite dans la SEQ ID NO: I ou 2, à la condition toutefois que
la ou les modifications n'affecte(nt) pas ses fonctions IRES et/ou d'encapsidation.
Selon un mode avantageux, la séquence nucléotidique utilisée dans le
cadre de la présente invention est identique à la séquence présentée dans
l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2:
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
(i) commençant au nucléotide 1 et se terminant au nucléotide 578,
(ii) commençant au nucléotide 265 et se terminant au nucléotide 578,
ou
(iii) commençant au nucléotide 452 et se terminant au nucléotide 578.
5La fonction IRES de ladite séquence nucléotidique est particulièrement
avantageuse dans un contexte pauvre en ion magnésium, par exemple dans un
contexte cellulaire. Un concentration élevée en ions Mg2+ peut diminuer
l'efficacité de llinitiation de la traduction médiée par la séquence.
Une séquence nucléotidique en usage dans la présente invention, est plus
10 particulièrement destinée à être intégrée dans un vecteur de transfert et
d'expression d'un ou plusieurs gène(s) d'intérêt. Le choix d'un tel vecteur est large
et les techniques de clonage dans le vecteur retenu sont à la portée de l'homme de
l'art. Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, on peut
envisager un vecteur plasmidique ou un vecteur dérivé d'un virus animal et, en
15 particulier, d'un poxvirus (canari pox ou virus de la vaccine, notamment
Copenhage ou MVA), adénovirus, baculovirus, virus de l'herpès, virus associé à
un adénovirus ou rétrovirus. De tels vecteurs sont largenlent décrits dans la
littérature~ En particulier, lorsqu'il s'agit d'un vecteur adénoviral, celui-ci peut être
issu d'un adénovirus humain (de préference de type 2 ou 5), animal (de préférence
20 canin ou bovin) ou encore d'un hybride entre des espèces variées. La technologie
générale concernant les adénovirus est divulguée dans Graham et Prevec (1991,
Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene transfer and Expression Protocols;
Ed E.J. Murray, the Human Press Inc, p 109-11~).
Conforrnéments aux buts poursuivis dans le cadre de la présente invention,
25 ladite séquence nucléotidique est de préférence positionnée en amont d'un gène
d'intéret pour améliorer la traduction du produit d'expression pour lequel celui-ci
code~ Elle peut être mise en oeuvre dans une cassette d'~ ession de type
monocistronique (pour l'e~.es~ion d'un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un
promoteur) ou polycistronique (pour l'~ ession d'au moins deux gènes d'intérêt
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
placés sous le contrôle d'un même promoteur). Cette derniere peut contenir
plusieurs éléments en tandem "site IRES-gène d'intérêt" dont au moins un des sites
IRES est constitué par une séquence nucléotidique telle que définie auparavant.
On préfère tout particulièrement l'utilisation dans une cassette dicistronique soit
5 en arnont du premier gène d'intérêt soit en amont du second, cette dernière
variante étant la préférée.
Lorsqu'un vecteur selon l'invention comprend plusieurs cassettes
d'expression, celles-ci peuvent être insérées dans une orientation quelconque les
unes par rapport aux autres, soit dans une même orientation (promoteur agissant
10 dans une même direction) ou en orientation réverse (promoteur ~giss~nt dans une
orientation opposée). Par ailleurs, un vecteur selon l'invention peut comprendreplusieurs séquences nucléotidiques en usage selon l'invention. Dans ce cas, il est
préférable qu'elles dérivent de rétrovirus de type C différents.
Selon un mode de réalisation tout à fait préféré, un vecteur selon
15 I'invention dérive d'un rétrovirus. On peut citer à titre d'exemples, les rétrovirus
aviaires tels que le virus de l'érythroblastose aviaire (ALV), le virus de la leucémie
aviaire (AVL), le virus du sarcome aviaire (ASV), le virus de la nécrose de la rate
(SNV) et le virus du sarcome de Rous (RSV), les rétrovirus bovins, les rétrovirus
félins (FLV, FSV ...), les rétrovirus murins tels que le virus de la leucémie murine
20 (MuLV), le virus de Friend (FMLV) et le virus du sarcome murin (MSV) et les
rétrovirus de primate (GALV, FSV, BAEV...). Bien entendu, d'autres rétrovirus
peuvent être mis en oeuvre. Cependant, on préfère tout particulièrement avoir
recours au virus MoMLV. Les nombreux vecteurs rétroviraux décrits dans la
littérature peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention.
Les vecteurs rétroviraux envisageables aux fins de la présente invention
co~llp,~mlent au moins les éléments suivants associés d'une manière fonctionnelle
: un LTR 5' et un LTR 3' rétroviraux, un ou plusieurs gène(s) d'intérêt, et la
séquence nucléotidique en usage dans le cadre de la présente invention pour
permettre ou améliorer l'encapsidation dudit vecteur dans une particule virale
, . . .
CA 022=78490 1998-12-23
WO 98/49334 PCT/FR98/00849
- 10-
et/ou à titre de site IRES pour perrnettre ou favoriser l'expression d7un gène
d'intérêt positionné en aval de ladite séquence nucléotidique. Il va sans dire que
le LTR 5' rétroviral peut être utilisé comme promoteur mais on peut également
avoir recours à un promoteur interne. Par ailleurs, le LTR 5' et éventuellement 3'
S peuvent avoir la même origine rétrovirale (par exemple REV) que la séquence
nucléotidique ou une origine différente. Par exemple, un vecteur monocistroniquecomprendra de 5' vers 3' un LTR 5', la séquence nucléotidique, un gène d'intérêtet un LTR 3'.
Bien entendu, un vecteur rétroviral selon l'invention peut également
10 comprendre une région d'encapsidation (E+) conventionnelle. Cependant, la
présence de cette dernière n'est pas exigée lorsque la séquence nucléotidique enusage dans la présente invention peut exercer à elle-seule la fonction
d'encapsidation. Un tel mode de réalisation peut être plus particulièrement
envisagé lorsque le LTR 5' rétroviral dérive d'un virus REV et, de préférence du5 SN~, et la séquence nucléotidique est substantiellement homologue ou identique à la séquence présentée dans la SEQ ID NO: 2, commençant au nt I et se
terminant au nt 57~ ou commençant au nt 265 et se terminant au nt 578.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur rétroviral selon
17invention, comprend au moins:
(a) un LTR 5' rétroviral,
(b) une région d7encapsidation,
(c) de manière optionnelle, un premier gène d'intérêt suivi d7une
région promotrice interne d'une origine différente de celle dudit
LTR S' rétroviral,
(d) un second gène d'intérêt,
(e) un site IRES,
(f~ un troisième gène d'intérêt, et
(g) un LTR 3' rétroviral,
l'un au moins de la région d7encapsidation et du site IRES étant constitué
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
par ladite séquence nucléotidique en usage selon l'invention.
Dans le cas où le vecteur rétroviral selon 1' invention comporte une cassette
d'expression dirigée par une région promotrice interne, il est préférable pour
favoriser l'expression génique, que celle-ci soit dans une orientation inverse par
5 rapport aux LTRs 5' et 3' rétroviraux. On peut également inclure d'autres éléments,
par exemple un autre site IRES et un autre gène d'intérêt ou une autre cassette
d'expression.
Un vecteur rétroviral préféré selon l'invention comprend une région
d'encapsidation dérivant d'un rétrovirus murin, notamment d'un MoMLV, ou
10 d'un rétrotransposon de type VL30 et un site IRES comprenant une séquence
nucléotidique substantiellement homologue ou identique à la séquence présentée
dans l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2:
(i) commençant au nucléotide I et se terminant au nucléotide 578,
(ii) comm~nç~nt au nucléotide 265 et se terminant au nucléotide 578,
ou
(iii) comm~nç~nt au nucléotide 452 et se terminant au nucléotide 578.
On peut citer en particulier les vecteurs rétroviraux dicistroniques de type
pREV HW-3 et HW-6, dans lesquels la région d'encapsidation dérive d'un
MoMLV et le site IRES est constitué par une séquence nucléotidique identique à
20 la séquence présentée dans la SEQ ID NO: 2 commenç~nt au nucléotide 265 et sein~l~t au nucléotide 578 ou comm~nç~nt au nucléotide 452 et se terrninant au
nucléotide 578~ Bien entendu, I'homme du métier peut faire varier les gènes
d'intérêt selon l'effet thérapeutique recherché.
~ux fins de la présente invention, un gène d'intérêt en usage dans
25 I'invention peut être obtenu d'un organisme eucaryote, procaryote ou d'un virus par
toute technique conventionnelle de biologie moléculaire. Il peut coder pour un
polypeptide correspondant à une protéine native telle que trouvée dans la naturehomologue à la cellule hôte ou non, un fragment protéique, une protéine
chimérique provenant de la fusion de polypeptides d'origines diverses ou un
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
mutant présentant des propriétés biologiques améliorées et/ou modifiées. Un tel
mutant peut être généré par substitution, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs
résidus acides arninés. En outre, le polypeptide peut être (i) intracellulaire (ii)
membranaire présent à la surface de la cellule hôte ou encore (iii) secrété hors de
5 la cellule hôte et donc comprendre des éléments additionnels appropriés, commeune séquence codant pour un signal de sécrétion ou une région d'ancrage
transmembranaire .
On préfère tout particulièrement mettre en oeuvre un gène d'intérêt
thérapeutique codant pour un produit d'expression capable d'inhiber ou retarder
10 l'établissement et/ou le développement d'une maladie génétique ou acquise. Unvecteur selon l'invention est particulièrement destiné à la prévention ou au
traitement de la mucoviscidose, de l'hémophilie A ou B, de la myopathie de
Ducher~ne ou de Becker, du cancer, du SIDA, de maladies cardiovasculaires
(resténose, arthériosclérose, ischémie...) et d'autres maladies infectieuses dues à
15 un organisme pathogène: virus, bactérie, parasite ou prion. Les gènes d'intérêt
utilisables dans la présente invention, sont ceux qui codent pour les protéines
suivantes:
- une cytokine et notamment une interleukine (IL-2, IL-7, IL-10, IL-
12...), un interféron, un facteur de nécrose tissulaire et un facteur de
croissance et notamment hematopoïétique (G-CSF, GM-CSF),
- un facteur ou cofacteur impliqué dans la coagulation et notarn~nent
le facteur VIII, le facteur IX, le facteur von Willebrand,
I'antithrombine III, la protéine C, la thrombine et l'hirudine,
- une enzyme et notamrnent la trypsine, une ribonucléase, la
phosphatase alcaline (plap) et la 13-galactosidase,
- un inhibiteur d'enzyme tel que l'al-antitrypsine et les inhibiteurs de
protéases virales
- un produit d'expression d'un gène suicide comrne la thymidine
kinase du virus HSV (virus de l'herpès) de type 1, celui du gène ,fitrl
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
et/oufcyl de Sacch~romyces cerevisiae, la ricine,
- un activateur ou un inhibiteur de canaux ioniques,
- une protéine dont l'absence, la modification ou la dérégulation de
l'expression est responsable d'une maladie génétique, telle que la
S protéine CFTR, la dystrophine ou minidystrophine, l'insuline, I'ADA
(adénosine diaminose), la glucocérébrosidase et la
phénylhydroxylase,
- une protéine capable d'inhiber l'initiation ou la progression decancers, telles que les produits d'expression des gènes supresseurs de
tumeurs, par exemple les gènes pS3, p73 et Rb,
- une protéine capable de stimuler une réponse immunitaire, un
anticorps, les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité ou
une immunotoxine,
- une protéine capable d'inhiber une infection virale ou son
développement, par exemple les épitopes antigéniques du virus en
cause ou des variants altérés de protéines virales susceptibles d'entrer
en compétition avec les protéines virales natives,
- un récepteur cellulaire ou nucléaire ou un de leur ligand,
- un facteur de croissance (FGF pour Fibroblast Growth Factor, VEGF
pour Vascular Endothelial cell Growth Factor.. ), et
- un inducteur d'apoptose (Bax...), un inhibiteur d'apoptose (Bc12,
BclX...), un agent cytostatique (p21, pl6, Rb...), une nitric oxide
synthase (NOS), une apolipoprotéine (apoAI, apoE...), une c~t~l~se,
une SOD, un facteur agissant sur l'angiogénèse (PAI pour
Plasminogen Activator Inhibitor.. ).
Par ailleurs, un gène d'intérêt en usage dans la presente invention, peut
également coder pour un marqueur de sélection permettant de sélectionner ou
identifier les cellules hôtes transfectées par un vecteur selon l'invention. On peut
citer le gène néo (néomycine) conferrant une rési~t~nce à l'antibiotique G418, le
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
-14-
gène dh~r (dihydrofolate réductase), le gène CAT (Chloramphenicol Acetyl
Transférase) ou encore le gène gpt (xanthine phosphoribosyl).
D'une manière générale, on aura recours pour l'expression d'un ou des
gène(s) d'intérêt à un promoteur fonctiormel dans la cellule hôte considérée et, de
plefélence, une cellule hllm~ine. Le choix du promoteur est très large et à la portée
de l'homme du métier. Il peut s'agir d'un promoteur gouvernant naturellement
l'expression d'un gène d'intérêt en usage dans la présente invention ou de tout autre
promoteur d'une origine quelconque. Par ailleurs, il peut être de nature constitutive
ou régulable, notamment en réponse à certains signaux cellulaires tissu-
10 spécifiques ou événements-spécifiques. Par exemple, il peut être avantageux de
cibler l'expression du gène d'intérêt au niveau des cellules Iymphocytaires dans le
cadre du SIDA, des cellules pulmonaires dans le cadre de la mucoviscidose ou descellules musculaires dans le cadre des myopathies.
A titre d'exemples, les promoteurs convenant dans le cadre de la présente
15 invention peuvent être choisis parrni les promoteurs SV40 (Virus Simian 40),
CMV (Cytomégalovirus), HMG (Hydroxyméthyl-Glutaryl Coenzyme A), TK
(Thymidine kinase), les LTRs rétroviraux comme celui du MoMLV, RSV ou du
MSV lorsqu'on met en oeuvre un vecteur rétroviral, les promoteurs adénoviraux
ElA et tardif MLP (Major Late Promoteur) notamment dans le contexte d'un
20 vecteur adénoviral, les promoteurs 7,5K, H5R, pKlL, p28 et pl 1 destinés à des
vecteurs poxviraux comme le virus de la vaccine, le promoteur PGK
(Phosphoglycéro kinase), les promoteurs foie-spécifiques des gènes codant pour
l'al-antitrypsine, le facteur IX, l'albumine et la transferrine, les promoteurs des
gènes d'immunoglobulines qui permettent une expression dans les Iymphocytes,
25 et enfin les promoteurs des gènes codant pour le surfactant ou la protéine CFTR
qui prësentent une certaine spécificité pour les tissus pulmonaires. Il peut
également s'agir d'un promoteur stimulant l'expression dans une cellule tumoraleou cancéreuse. On peut citer notarnment les promoteurs des gènes MUC-1
~urex~ é dans les cancers du sein et de la prostate (Chen et al., 1995, J. Clin.
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98149334 PCT~R98/00849
- 15 -
Invest. 96, 2775-2782), CE~A (pour carcinoma embryonic antigen) surexprime
dans les cancers du colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 273~-2748),
tyrosinase surexprimé dans les mélanomes (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53,
3860-3864), ERB-2 sulex~ lé dans les cancers du sein et du pancréas (Harris et
5 al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175), a-fétoprotéine surexprimée dans les cancers
du foie (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465), APC surexprimé dans les
cancers colorectaux, BRCA-1 et 2 (Wooster et al., 1995, Nature 378, 789-792)
sulc~ és dans les cancers des ovaires et PSA (pour prostate specific antigen)
surexprimé dans les cancers de la prostate.
Par ailleurs, le gène d'intérêt en usage dans la présente invention peut
comporter d'autres séquences améliorant son expression, tant au niveau de la
transcription que de la traduction; par exemple une séquence activatrice de la
transcription de type enh~n~er, une séquence intronique, un signal de tennin~icon
de la transcription (polyA) et, comme indiqué précedemment, un signal de
sécrétion ou une région transmembranaire.
L'invention couvre également les particules virales générées à partir d'un
vecteur viral selon l'invention. On procède généralement par transfection de celui-
ci dans une lignée cellulaire adéquate. Si le vecteur viral utilisé est défectif pour
la réplication, on aura recours à une lignée de complémentation. D'une manière
générale, l'homme du métier connaît les lignées pouvant être employées pour
générer des particules virales infectieuses ainsi que le procédé à mettre en oeuvre
selon le vecteur utilisé.
Par exemple, dans le cas d'un vecteur adénoviral, on peut avoir recours à
la lignée 293 (Graham et al, 1977, J. Gen. Virol., 36, 59-72). S'agissant d'un
vecteur rétroviral, on peut envisager d'employer des lignées cellulaires écotropes,
comme la lignée CRE (Danos et Mulligan, 1988~ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,
6460-~6464) ou GP+E-86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120-1124). Mais
on préfère tout particulièrement mettre en oeuvre une lignée de complémentation
arnphotrope telle que la lignée PG13 (Miller et al., 1991, J. Virol., 65, 2220-2224)
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
-16-
ou Psi Env-am (Markowitz et al., 1988, T.A.A.P. Vol. Cl, 212-218).
Généralement, on récupère les particules virales infectieuses dans le surnageantde culture des cellules de complémentation transfectées
L'invention s'étend également aux cellules comprenant un vecteur selon
S l'invention ou infectées par des particules virales infectieuses selon l'invention.
Les méthodes de transfection sont bien connues de l'homme de l'art. On peut citer
la technique de précipitation au phosphate de calcium, celle au DEAE dextrane,
la microinjection ou l'encapsulation dans des véhicules lipidiques. D'autre part, les
vecteurs selon l'invention peuvent être présents dans la cellule hôte sous forme10 intégrée dans le génome cellulaire ou sous forme d'épisomes aussi bien dans le
noyau que dans le cytoplasme. La cellule selon l'invention est avantageusement
une cellule eucaryote, notamment m~mifère et, de préférence, une cellule
humaine. Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine
hématopoiétique (cellule souche totipotente, leucocyte, Iymphocyte, monocyte,
15 macrophage ...), hépatique, épithéliale, fibroblaste, du système nerveux central et,
tout particulièrement, d'une cellule musculaire (myoblaste, myocyte, cellule
satellite, muscle lisse...), cardiaque, vasculaire, trachéale, pulmonaire ou du
système nerveux central.
La présente invention concerne également l'usage thérapeutique d'un~0 vecteur, d'une particule virale ou d'une cellule selon l'invention, pour la
a alion d'une composition ph~ eutique destinée au traitement et/ou à la
prévention d'une maladie traitable par thérapie génique, notamment d'une maladiegénétique, d'une maladie acquise comme le cancer ou d'une maladie infectieuse.
Cependant, un tel usage n'est pas limité à une application de type thérapie
25 génique somatique. En particulier, un vecteur selon l'invention peut être utilisé à
d'autres fins comme la production par voie recombinante dans des cellules
procaryotes ou eucaryote~ de produit(s) d'expression codé(s) par au moins un desgènes d'intérêt. Par exemple, on peut envisager la coexpression de deux gènes
d'intérêt dans un vecteur d'expression dicistronique ~Iti~ nt une séquence
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
nucléotidique selon l'invention. La coexpression d'un gene de resistance à un
antibiotique à titre de second cistron peut permettre d'augmenter l'expression d'un
premier cistron. Il est possible d'obtenir un produit mature par la coexpression de
deux gènes dont le produit d'expression de l'un permet la maturation du
5 polypeptide codé par l'autre (par exemple précurseur polypeptidique et une
protéase clivant le précurseur en polypeptide mature). Dans ce cas, on peut avoir
recours à des cellules procaryotes (E.coli ...), eucaryotes inférieures (levure,champignon, insecte ...) ou animales. Il s'agira ensuite de récolter et
éventuellement purifier ledit produit d'expression d'intérêt du surnageant ou de la
10 culture cellulaire par les techniques conventionnelles. Une autre possibilitéd'utilisation consiste en la production d'~nim~-lx transgéniques ayant intégré dans
leur génome une cassette pour l'expression d'un ou plusieurs gènes d'intérêt et
comprenant une séquence nucléotidique selon l'invention. Il peut s'agir de souris,
rats, lapins, poissons, primates ou d'~nim~-lx de ferme (bovins, ovins, porcins ...)
15 Les techniques pour générer ces ~nim~llx transgéniques sont connues. Le
polypeptide d'intérêt peut être récupéré de manière conventionnelle par exemple
dans les fluides biologiques (sang, lait ... etc) de l'animal.
L'invention s'adresse également à une composition pharmaceutique
comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique un vecteur, une
20 particule virale ou une cellule selon l'invention ou un polypeptide d'intérêt obtenu
conformément à l'utilisation selon l'invention, en association avec un véhicule
acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition ph~rm~ceutique selon l'invention peut être fabriquée de
manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité
25 thérapeutiquement efficace d'un tel agent à un support, un diluant ou un adjuvant
acceptable. Elle peut être a~minictrée selon n'importe quelle route d'a~mini~tration
et cecl en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. On préférera
notamment l'a-lmini~tration intraveineuse, intramusculaire, intrapulmonaire
(éventuellement par aérosolisation) ou intratumorale. La quantité à a-lmini~trer
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
-18-
sera choisie en fonction de différents critères, en particulier l'usage à titre de
traitement ou de vaccin, la voie d'~llmini~tration, le patient, le type de maladie à
traiter et son état d'évolution, la durée du traitement, le vecteur retenu ...etc. A titre
indicatif, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend entre 104
et 10'4 pfu (unité formant des plages), avantageusement entre 105 et 10'3 pfu et, de
préférence, entre 106 et 10" pfu de particules virales. Une composition à base de
vecteur peut être formulée sous forrne de doses comprenant de 0,01 à 100 mg
d'ADN, de préférence, de 0,05 à 10 mg et, de manière tout à fait préférée, de 0,1
a5mg.
La formulation peut également inclure seul ou en combinaison un diluant,
un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique, de
même qu'un agent de solubilisation, de stabilisation ou de conservation. La
composition peut être présentée en dose unique ou en multidoses sous forme
liquide ou sèche (lyophilisat...) susceptible d'être reconstituée de manière
15 extamporanée par un diluant approprié.
Par ailleurs, l'invention concerne une méthode de traitement de maladies
génétiques, cancers et maladies infectieuses selon laquelle on ~tlmini~tre une
quantité thérapeutiquement efficace d'un vecteur, d'une particule virale ou d'une
cellule selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement. Selon un
20 premier protocole thérapeutique, on peut les ~ ini~trer directement in vivo, par
exemple par injection intraveineuse, intramusculaire, intratumorale ou par
aérosolisation dans les poumons. De manière alternative, on peut adopter un
protocole de thérapie génique ex vivo qui consiste à prélever les cellules d'un
patient (cellules souches de la moelle osseuse, Iymphocytes du sang
25 périphérique...), à les transfecter avec un vecteur selon l'invention et à les cultiver
in vi~ro avant de les réimplanter au patient.
Enfin, l'invention concerne l'utilisation d'un vecteur, d'une particule
virale ou d'une composition ph~n~ceutique selon l'invention pour la transfectionou l'infection de cellules pluripotentes, notamrnent de cellules pluripotentes du
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
-19-
système nerveux central.
L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes.
La Figure 1 est une représentation schématique des plasmides
monocistroniques utilisés comme matrices pour la synthèse in vi~ro d'ARN coiffés5 et non-coiffés. Ils contiennent le promoteur précoce du cytomégalovirus (Po
CMV) utilisable pour l'expression in vivo, le promoteur du gène codant pour
l'ARN polymérase du phage T7 (Po T7) utilisable pour les expériences in vi~ro,
différentes portions de l'extrémité 5' non traduite (leader) du virus REV-A (I à578 pour pREV CB-95, 578 à 1 pour pREV CG-53, 1 à 578 délétées des nt 268
à 452 pour pREV CG-54, 265 à 578 pour pREV CG-55 et 452 à 578 pour pREV
CG-56) et le gène LacZ (~LacZ) codant pour une ~-galactosidase tronquée à
l'extrémité C-terminale de masse moléculaire d'environ 46 kDa.
La Figure 2 est une représentation schématique des plasmides
dicistroniques utilisés comme matrices pour la synthèse in vitro d'ARN coiffés et
non-coiffés. Ils contiennent le promoteur précoce du cytomégalovirus (Po CMV)
utilisable pour l'expression in vivo, le promoteur du gène codant pour l'ARN
polymérase du phage T7 (Po T7) utilisable pour les expériences in vitro, le gèneneo, différentes portions de l'extrémité 5' non traduite (leader) du virus REV-A(1 à 578 pour pREV CB-54, 578 à 1 pour pREV CG-50, 1 à 578 délétées des nt
268 à 452 pour pREV CG-52, 265 à 578 pour pREV CB-55 et 452 à 578 pour
pREV CG-58) et le gène LacZ (~LacZ) codant pour une ,B-galactosidase tronquée
à l'extrémité C-terminale de masse moléculaire d'environ 46 kDa.
La Figure 3 A est une représentation sch~m~tique des vecteurs rétroviraux
dicistroniques possédant deux éléments d'origine rétrovirale différente, à titred'IRES et de région d'encapsidation (E) et deux gènes d'intérêt comme les gènes
rappor~eurs plap codant pour la phosphatase alcaline placentaire et neo codant
pour la neomycine phosphotransférase. B) Vecteurs rétroviraux de la série pREV
HW possédant des LTRs dérivés de MLV et placés dans un contexte plasmidique
pBR322. VL30E+ correspond à la région 5' non traduite de HaMSV et MoMLV
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
-2Q-
E+ correspond à la region d'encapsidatio~ de MoML~'. C) Vecteur de référence
pEMCV-CBTV ayant des LTR et la région d'encapsidation de MoMLV et l'IRES
de EMCV. Dans tous les cas, les séquences sont numérotées par rapport au site
cap (position +l) de l'ARN génomique.
La Figure 4 illustre l'effet de la rapamycine sur les activités A)
phosphatase alcaline et B) neomycine phosphotransférase produites dans les
cellules GP+E-86 non transfectées ou transfectées de manière stables par les
différents vecteurs pREV HW ou pEMCV-CBTV (pCB100) et traitées par la
rapamycine (boîtes pleines) ou non traitées (contrôle, boîtes pointillées).
La Figure 5 illustre l'optimisation du protocole de transduction appliqué
aux cellules neuroectodermales Dev. Le pourcentage de cellules Dev transduites
par les virus pEMCV-CBTV (IRES EMCV) et pREV HW-3 (IRES REV-A) est
déterminé par cytométrie de flux.
1 5 EXEMPLES
Les constructions ci-après décrites sont réalisées selon les techniques
générales de génie génétique et de clonage moléculaire détailléec dans Sambrook
et al. (1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) ou selon les
recomm~n~l~tions du fabricant lorsqu'on utilise un kit com~nercial. Les
techniques de PCR sont connues de l'homme de l'art et abon-l~mm~nt décrites
dans PCR Protocols, a guide to methods and applications (Ed: Innis, Gelfand,
Sninsky et White, Atc~lernic Press, Inc.). Les amplifications d'ADN
pl~smiflique sont réalisées dans l~scherichia coli HB101 souche 1035 (recA~. Parailleurs, la position des séquences REV-A utilisées dans les constructions est
indiquée par référence à la molécule ARN, la position + 1 correspondant au
premier nucléotide de la molécule d'ARN, c'est à dire au site d'initiation de latranscription (Darlix et al., 1992, J. Virol. 66: 7245-7252).
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
EXEMPLE 1: Identi~lcation d'un site IRES au niveau de l'extrémité 5'
leader de l'ARN de REV-A.
Des études de synthèse protéique in v~tro ont été e,~e~lises à l'aide
d'une série de plasmides mono et dicistroniques contenant des fr~gment~ du
leader 5' de l'ARN génomique REV-A afin de rechercher s'ils permettent la
traduction de cistrons par liaison interne des ribosomes.
1. Construction des plasmides mono et dicistroniques.
Les fragments d'ADN correspondant aux séquences 1 à 578, 265 à 578
et 452 à 578 de l'ARN REV-A sont isolés par PCR à partir de la matrice
pREVSC-1 (Darlix et al., 1992, J. Virol. 66, 7245-7252). On utilise des
amorces a~pl-o~liées que l'homme du métier peut concevoir, munies à leurs
e~Llell~iLes d'un site NheI. Après digestion par cette enzyme, les fragments PCRsont insérés en amont du gène LacZ dans le vecteur pEMCV-M260-837 (I3erlioz
et al., 1995, J. Virol. 69, 6400-6407) préalablement clivé par NheI. Le gène
LacZ mis en oeuvre code pour un produit ,B-galactosidase tronqué à l'extrémité
C-terminale. On obtient les pl~cmi(~es monocistroniques pREV CB-95 (1-578),
pREV CG-55 (265-578) et pREV CG-56 (452-578) illustrés à la Figure 1. Les
plasmides dicistroniques pREV CB-54 (1-578), pREV CB-55 (265-578) et pREV
CG-58 (452-578) sont représentés à la Figure 2 et résultent de l'insertion des
fragments PCR précédents entre les gènes neo et LacZ de pEMCV-D260-837
(pCB101) (Berlioz et al., 1995, J. Virol. 69, 6400-6407) également soumis à une
digestion par NheI. L'ampli~lcation des nt 1 à 578 délétés des séquences 268 à
452 est réalisée à partir du vecteur pREVSC-l préalablement digéré par KpnI et
SacI, traité par le fragment Klenow de l'ADN polymerase d'E. coli et religué.
Le fragment ampliflé digéré par NheI est cloné dans pEMCV-M260-837 en
amont du gène LacZ ou entre les gènes neo et LacZ de pEMCV-D260-837, les
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
-22-
deux vecteurs ayant été digérés par NheI, pour donner respectivement pREV
CG-54 (Fig 1) et p~EV CG-52 (Fig 2). Enfin des plasmides contrôles
monocistronique pREV CG-53 (Fig 1) et dicistronique pREV CG-50 (Fig 2) ont
été construits par introduction du fragment PCR portant les séquences REV-A
1 à 578 dans les vecteurs précédents en orientation inverse (S78-1). Dans
l'ensemble des constructions contenant les séquences REV-A en orientation sens,
I'initiation de la traduction de la ~-galactosidase est sous le contrôle du codon
AUG du gène gag de REV-A situé en position 574-576, alors ~ue dans les
pl~mitles contrôles, la synthèse de la ~-galactosidase dépend d'un AUG placé
10 dans un contexte de Kozak favorable introduit par PCR.
2. Synthèse d 'ARN et traduction in vitro.
Les ARN coiffés et non coiffés sont synthétisés à partir de 1 ~g d'ADN
plasmidique linéarisé par SspI (position 1240 dans le gène LacZ) à l'aide de
15 l'ARN polymérase T7 (mMessage mMachine TM OU MAXIscript TM, Ambion)
dans un volume réactionnel de 20 ~l selon le protocole indiqué par le
fournisseur. La transcription est stoppée par traitement de la matrice ADN par
l'enzyme DNaseI suivi d'une précipitation des ARN en présence de chlorure de
lithium. Les ARN sont repris dans 50 ~l de tampon TE (Tris-HCl 10 mM
20 pH7,5, EDTA lmM) avant d'etre purifiés et désalés par passage sur une colonneS-300 MicroSpinTM (Pharmacia BioTech) selon les indications du fournisseur.
L'intégrité des ARN ll~lsclits est vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose0,7 % coll~enallt du bromure d'éthi~ m (0,5 ~g/ml). La concentration finale en
ARN est déterminée spectrophotométri~uement.
Les ARN coiffés et non coiffés (10 ~g/ml) sont traduits dans le système
cellulaire RRL (Promega) utilisé à S0 % de sa concentration initiale en présencede 1 mCi de [35S] méthionine par ml (Amersham) à 31~C pendant 1 h. Le
mélange réactionnel est supplémenté par de l'acétate de potassium à une
concentration finale de 120 mM. Par ailleurs, l'ARN luciférase est testé dans les
CA 022~8490 1998-12-23
W 098/49334 PCT~R98/00849
mêmes conditions réactionnelles (témoin positif). Un essai mené en absence
d'ARN constitue le témoin négatif. En parallèle, on teste l'effet de la protéaseL du virus FMDV (Foot and mouth disease virus) sur la traduction des A~N
dicistroniques. Cette protéase clive le facteur d'initiation de la traduction eIF4G
entre la glycine en position 479 et l'arginine en position 480 pour générer deuxfragments peptidiques dépourvus d'activité initiatrice (Kirchweger et al., 1995,J. Virol. 68, 5677-5684). En outre, Ohlmann et al. (1995, Nucleic Acid Res.
23, 334-340; 1996, EMBO J. 15, 1371-1382) a montré que le traitement des
lysats de réticulocyte par la protéase L inhibe la traduction in vitro des ARN
cellulaires coiffés alors que l'initiation interne dirigée par l'IRES du cardiovirus
n'est pas touchée. Ainsi si un élément IRES existe dans le leader 5' REV-A, la
présence de la protéase L ne devrait pas affecter l'expression du cistron dont la
traduction est sous sa dépendance. Dans ce cas, les essais mettent en oeuvre le
système RRL Flexi (Promega) à 50 % de sa concentration initiale, 8 ,ug/ml
d'ARN,1 mCi de [35SI méthionine par ml (Amersham) et 30 ng de protéase L
recombinante et purifiée par les méthodes conventionnelles. Le mélange
réactionnel est supplémenté par du chlorure de potassium à une concentration
finale de 80 mM. La réaction est poursuivie à 31~C pendant 1 h.
Les échantillons sont dénaturés par la chaleur dans 62,5 mM de Tris-HCl
pH6,8, 2 % de sodium dodecyl sulphate (SDS), 10 % de glycérol, 5 % de ,B-
mercaptoéthanol et 0,02 % de bleu de bromophénol et les protéines marquées
analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide 12 % (poids/vol), 0,2 %
SDS. Le produit du gène neo et la ,B-galactosidase migrent à une masse
moléculaire d'environ 28 et 46 I~Da respectivement. L'efficacité de la traduction
coiffe-dépen-l~nte et indépendante est quanti~lée par scanographie (Phospho-
Imageur Storm 840, version 4.00, Molecular Dynamics; Image Quant TM
verslon 1.1, Molecular Dynamics). Dans le cas des vecteurs dicistroniques,
l'intensité du marquage du produit d'expression du second cistron (~-
galactosidase) dont la traduction est médiée par l'IRES est évaluée après
. .
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
- 24 -
standardisation du niveau d'expression du produit neo.
On observe que la traduction des ARN non coiffés obtenus à partir des
pl~cmi~les monocistroniques pREV CB-95, pREV CG-53, pREV CG-54, pREV
CG-55 et pREV CG-56 est aussi efficace que celle des ARN coiffés. Cependant,
5 comme attendu, la quantité de ~-galactosidase générée à partir du plasmide
pREV CG-53 dans lequel les séquences REV-A (1 à 578) sont en orientation
antisens est beaucoup plus faible que celle obtenue avec les constructions
tili~nt une séquence REV-A dans l'orientation sens. Lors4ue les fragments
REV-A sont mis en oeuvre d'une manière dicistronique entre les gènes neo et
10 LacZ, l'expression de la ~-galactosidase n'apparaît qu'en présence d'un IRES
fonctionnel (pREV CB-54, pREV CB-55, et pREV CG-52) alors que celle du
premier cistron (neo) est efficace dans tous les cas (y compris pREV CG-50).
Des essais compatifs de traduction in vitro menés avec les vecteurs précédents
et le plasmide pEMCV-D260-837 co~ ellant l'IRES EMCV de référence
montrent que les fr~gmpntc REV-A 1-578, 265-578 et 452-578 sont capables
d'initier la traduction du second cistron d'une manière plus efficace que celle
dirigée par l'IRES EMCV. Par ailleurs, le traitement des Iysats de réticulocytespar la protéase L s'accompagne d'une inhibition de l'expression coiffe-
dépendante du gène neo alors que l'expression de la ,B-galactosidase dépendante
20 de l'IRES est sensiblement augmentée. Pour le témoin pREV CG-50, on observe
également l'inhibition de l'expression neo alors que l'expression de la ~-
g~l~r-tosidase est à peine clétect~ble que le tr~itPmPn~ à la protéase L ait lieu ou
non. A titre inrlic~tif, I'effet de la protéase sur l'expression des deux gènes
rapporteurs est illustré ci-après.
Tableau 1: Rapport de l'expression des gènes en présence et en absence
de protéase L de FMDV.
CA 022~8490 1998-12-23
W 098/49334 PCT/FR98/00849
Construction neo LacZ
pREV CG-50 - 51,85 - 5,53
pREV CB-54 - 55,36 + 40,24
pREV CB-55 - 34,65 ~ 84,42
pREV CG-58 - 45,07 + 57,51
pEMCV-D260-837 - 79,51 + 33,93
MPLE 2: Vecteurs rétroviraux comprenant une séquence IPcF.
REV-A
On a construit une série de vecteurs rétroviraux llrili.c~nt les séquences
REV-A à titre de sites IRES ou d'éléments augmentant l'encapsidation. La
Fig~lre 3 illustre les vecteurs de la série pREV HW possédant des LTRs de type
MoMLV et les vecteurs témoins utilisés dans les expériences décrites ci-après.
l 5 Bien que ceux-ci ne soient pas le~l~sel1lés, on a également construit des vecteurs
désignés pMC qui diffèrent des pREV HW uniquement par le fait que leurs
LTRs sont d'origine SNV et des contrôles négatifs dans lesquels les séquences
REV-A sont positionnées en orientaLion reverse (3' -~ 5') par rapport aux
LTRs. Pour toutes les étapes de biologie moléculaire, ces vecteurs SOllt
20 introduits dans le plasmide pBR322.
1. Construction des vecteurs rétrovirawc.
Le vecteur témoin pEMCV-CBTV (pBC100) est un vecteur dicistronique
coln~ al1t, outre les LTRs et la région d'encapsidation dérivés de MoMLV,
25 le gène codant pour la phosphatase alcaline placentaire (plap) dont la traduction
est coiffe-dépendante et le gène neo dont la traduction est dépendante du site
IRES EMCV (Torrent et al., 1996, Human Gene Therapy 7, 603-611).
~ es vecteurs~ pREV HW ont été obtenus de la façon suivante:
pREV HW-1: le fragment REV-A s'éte~nt des nt 265 à 578 généré par PCR
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
-26-
et digéré par NheI est cloné entre les gènes plap et neo de pMLV-CB71 (Berlioz
et Darlix, 1995, J. Virol. 691 2214-2222).
pREV HW-2: le fragment EcoRI de pVL CBTS (Torrent et al., 1996, Human
Gene Therapy 7, 603-611) portant le LTR 5 ' MoMLV et les séquences
S d'encapsidation de VL30 est introduit dans le vecteur pREV HW-1 linéarisé par
EcoRI.
pREV HW-3: le fragment EcoRI de pEMCV-CBTV contenant le LTR S' et les
séquences d'encapsidation de MoMLV est inséré dans le vecteur pREV HW-1
linéarisé par EcoRI.
pREV HW~: le fragment REV-A s'étendant des nt 452 à 578 généré par PCR
et digéré par N7leI est cloné entre les gènes plap et neo de pMLV-CB71.
pREV HW-S: le fragment EcoRI de pVL CBTS portant le LTR S' MoMLV et
les séquences d~enr~ps~ tinn de VL30 est introduit dans le vecteur pREV HW~
linéarisé par EcoRI.
pREV HW-6: le fragment EcoRI de pEMCV-CBTV contenant le LTR S ' et les
séquences d'encapsidation de MoMLV est inséré dans le vecteur pREV HW4
linéarisé par EcoRI.
Les vecteurs de la série pMC sont obtenus selon le schéma de
construction suivant: Les LTRs SNV sont générés par PCR à partir du plasmide
REV-A 2-20-6 (O'Rear et Temin, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1230-
1234; Darlix et al., 1992, J. Virol. 66, 7245-7252). Le gène neo est isolé de
pMLV-CB71 par digestion avec SalI et BamHI puis introduit entre les mêmes
sites du vecteur pUC19 (Gibco BRL). Le LTR S' du SNV (nt 1 à 861) est digéré
par Hindm et Sall, et inséré dans pUC19-neo préalablement clivé par ces memes
enzymes. Le LTR 3' SNV (nt 7230-8300) digéré par SmaI et ~:coRl est cloné
dans le vecteur précédent pour donner pCG-61 contenant LTR S ' SNV-neo-LTR
3' SNV. En parallèle, on génère un vecteur désigné pCG-62 qui diffère du
précédent par la délétion des séquences env (nt 7230-7691) obtenu par traitementBgm-AvrII, Klenow et religation. Le gène plap isolé du clone Cla-12AP (DGoffl
. . ~ __ . . ..
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98149334 PCT~R98/00849
est introduit entre les sites EcoPI et XbaI d'un plasmide bluescript préalablement
délété du site Sa~ (digestion EcoRI-XhoI) avant d'être réisolé sous la forme d'un
fragment KpnI-SalI et cloné entre les mêmes sites de pCG-61 et pCG-62, pour
donner pCG-63 et pCG-64 respectivement. Le gène LacZ est obtenu par
5 digestion partielle de pREV CB-95 par les enzymes SalI et Bam~I . Son insertion
entre les sites SalJ et BamHI de pCG-61 et pCG-62 donne lieu à pCG-65 et
pCG-66 respectivement. Enfin, le bloc LTR-Gene-LTR est isolé de chaque
plasmide pCG-62, pCG-64 et pCG-66 par digestion HindIII-EcoRI pour être
inséré dans le vecteur pBR322 clivé par ces mêmes enzymes. On génère pMC1,
10 pMC2 et pMC3.
2. Génération de particules virales infectieuses et détermination du ti~re v~ral et
de l'expression des gènes reporteurs plap et neo.
La lignée de complémentation écotrope GP+E-86 (Markowitz et al.,
l S 1988, J. Virol., 62, 1120-1124) et les cellules cibles NIH3T3 (cellules
fibroblastiques de souris) disponibles à l'ATCC, sont cultivées à 37~C en
présence de 5% de CO2 dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's
Medium, Gibco BRL) complémenté avec 10% de sérum de veau de nouveau-né.
Les cellules helper GP+E-86 et les cellules cibles NIH3T3 sont mises en culture
la veille de la transfection et de l'infection. Les infections virales sont réalisées
selon le protocole conventionnel décrit dans la littérature.
20 ~g de vecteurs pREV HW-1 à 6 ainsi que de vecteur de référence
pEMCV-CBTV sont Ll~reclés en parallèle dans les cellules GP+E-86 (Sx105
cellules par boîte de 10cm) selon la méthode de Chen et Okyama (1987, Mol.
Cell. Biol., 7, 2745-2753; 1988, Bio/Techniques 6, 632-637). Différentes
dilutions de surnageants des cultures GP+E-86 stables ou transitoires sont
utili~ees pour il~Çe-;Ler les cellules cibles NIH3T3 ensemencées la veille de
l'infection à raison de 2x104 cellules par puits. Au préalable, les surnageants
viraux ont été filtrés (sur filtres de 0,45 ~m) et mis en présence de polybrène à
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
- 28 -
une concentration finale de 8 ~Lg/ml. L'infection est pousuivie toute la nuit à
37~C et le jour suivant, les cellules sont lavées et cultivées dans du milieu frais.
Après 48 h, les cellules sont placées en milieu sélectif (1 mglml de G418) ou
colorées pour déterminer le nombre de cellules exprimant la phosphatase alcaline5 plap. On procède tout d'abord à une fixation dans du tampon PBSxl contenant
2% de formaldéhyde et 0,2% de glutaraldéhyde. Après deux rinçages dans du
PBSxl suivis d'une inrub~tion de 30 min à 65~C dans du PBSx1, les cellules
sont lavées à deux reprises dans du tarnpon AP (0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M
NaCI, 50 mM MgCI2 dans du PBSxl) et placées 5 h dans la solution de
10coloration (0,1 mg/ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP), 1
mg/ml d'un sel de térazolium de Nitroblue (N~3T) et 1 mM de Levamisol dans
du tampon AP). Ces expériences de coloration histochimique con~lrment
l'expression de la phosphatase alcaline dans les cellules helper GP+E-86 et dansles cellules cibles NIH3T3.
15Le titre des virus recombinants est déterminé après transfection des
cellules écotropes GP+E-86. Après deux jours d'incubation, le surnageant viral
est récolté et utilisé pour déterminer le titre viral (expression transitoire).
Ensuite, les cellules transfectées sont sélectionnées au G418 pendant un mois.
Après cette sélection, on détermine le titre viral sur le surnageant récolté
20 (expression stable). Celui-ci correspond au nombre de particules infectie~lses par
ml de surnageant. Par la méthode des dilutions limites, les cellules cibles
NIH3T3 sont infectées avec des dilutions en série de surnageant viral et, après
deux jours d'inrllbation, les cellules sont colorées histochimiquement et
comptées. Les résultats suivants sont obtenus (Tableau 2):
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
- 29 -
Vecteur Expression Expression stable
transitoire (cfu/ml) (cfu/ml)
pREV HW-1
pREV HW-2 0,2x104 3,2x106
pREV HW-3 1,6x104 1,4x109
pREV HW-4
pREVHW-5 1,3x104 6,5x105
pREVHW-6 2,0x104 4,5x108
pEMCV-CBTV 1,1x104 2, lx108
Les vecteurs pREV HW-1 et pREV HW-4 dépourvus de région
d'encapsidation conventionnelle sont incapables de produire des particules
virales infectieuses après transfection dans la lignée helper MLV (GP+E-86).
Cependant, on indique que le vecteur pMC1 peut être encapsidé dans des
particules virales SNV après transfection de la lignée helper SNV D17-C3A2
15 (par exemple ATCC CRL8468), indiquant que les séquences REV-A s'étendant
des nt 265 à 578 peuvent être utilisées dans ce contexte à titre de région
d'encapsidation. Les vecteurs rétroviraux comprenant à la fois une séquence
REV-A (265-578 ou 452-578) et une région d'encapsidation conventionnelle
produisent des particules virales à un titre élevé (pREV HW-2, 3, 5 et 6).
20 Cependant l'association avec la région d'encapsidation de MLV s'avère
particulièrement avantageuse puisqu'elle donne des titres viraux 2 (pR~V HW-6)
à 5 fois (pREV HW-3) plus élevés que le vecteur de référence pEMCV-CBTV
combinant cette même région d'encapsidation et l'IRES EMCV. De plus, la
comparaison des données obtenues avec les vecteurs identiques variant
25 uniquernent au niveau du segment REV-A mis en oeuvre (pREV HW-2 et pREV
HW-5, ou pREV HW-3 et pREV HW-6) laisse supposer que la séquence allant
des nt 265 à 578 est capable de coopérer avec la région d'encapsidation et ainsiaméliorer l'encapsidation des ARN viraux et en concéql~enr-e les titres viraux.Un
élément inter~gi~s~nt d'une manière positive avec l'encapsidation pourrait être
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
-30-
présent entre les nt 452 et 265 dans le génome RF,V-A.
3. Analyse des virus recombinants par microscopie électronique.
La morphologie des virions recombinants pREV HW produits après
5 transfection de la lignée GP+E-86 par les vecteurs correspondants est analyséepar microcopie électronique. On utilise à titre de témoins les virus obtenus de
pEMCV-CBTV dans les mêmes conditions et les rétrovirus sauvages obtenus
après infection des cellules NIH3T3 avec la souche FMLV-29 (Friend murine
leukemia virus souche 29). Les résultats de microscopie indiquent que le contenu10 en ARN n'affecte pas la morphologie des virus recombinants.
4. Effet de la rapamycine sur l'expression des cistrons plap et neo.
Les cellules GP+E-86 sont transfectées d'une manière stable par 20 ~g
de vecteurs de la série pREV HW ou pEMCV-CBTV et cultivées en conditions
sélectives (G418) pendant 15 jours. A 70 à 80 % de confluence, elles sont mises
en présence de rapamycine à une concentration finale de 20 ng/ml. Cette
dernière a un effet inhibiteur sur la traduction coiffe-dépendante variant de 15à 40 % selon la lignée cellulaire (Beretta et al., 1996, EMBO J. 15, 658-664)
mais n'affecte pas la traduction cap-indépendan~e. Les extraits cellulaires sontpréparés classiquement après 20 h d'incubation. Brièvement, les cellules sont
lavées deux fois dans du PBSx1, placées dans 1 ml de TEN (40 mM Tris-HCI
pH7,5, 1 mM EDTA, 50 mM NaCI) pour une boîte de 10 cm puis récupérées
par grattage et centrifugées à faible vitesse. Le culot est repris dans 100 ~I de
Tris-HCl 0,25 M, pH8 et soumis à une Iyse cellulaire par 3 cycles de
congélation-décongélation. Après centrifugation 10 min à 14000 g, le surnageant
est récupéré et peut être conservé à -70~C en attendant de procéder aux tests
enzymatiques. La concentration finale en protéine est déterminée par le test
Micro BCA (Pierce). L'activité enzymatique plap des extraits cellulaires est
évaluée spectrophotométriquement (kit alcaline phosphatase, BIORAr)). Les
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
-31-
unités plap sont déterminées par rapport à un standard constitué par la
phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim). Les activités
neo sont mesurées par le transfert de phosphate marqué au [y-32P]sur la
neomycine (Ramesh et Osborne, 1991, Anal. Biochem. 193, 316-318). Les
5 résultats de l'expression des gènes plap et neo mesurés en absence et en présence
de rapamycine sont illustrés à la Figure 4 et présentés dans le Tableau 3.
Tableau 3: effet de la rapamycine sur l'expression des cistrons plap et
neo exprimé en % par rapport aux cellules non traitées.
Lignée cellulaire phosphatase Neomycine
alcalinephosphotransférase
GP+E-86
pREV HW-1 40,9 +21,5
pREV HW-2 +21,3 +26,7
pREV HW-3 +34,8 -6,5
pREV HW4 -94,6 +3,0
~5 pREV HW-5 +66,7 +46,9
pREV HW-6 +46,1 +49,6
pE~CV-CBTV -2,6 +20,5
Dans les vecteurs pREV HW-1 et pREV HW4, la présence de
20 rapamycine réduit la traduction cap-dépPn~l~ntr et augmente celle déperul~nte de
l'IRES. Cette stimnl~tion peut s'expliquer par une moindre coll~péliLion pour lam~rhinr.rie traductionnelle en présence de rapamycine. Lorsque deux éléments
IRES sont présents, l'addition de rapamycine s'accomp~gn~ d'une ~ugm~nt~tion
de l'expression des deux gènes. Cependant, les données qll~ntit~tives
25 d'exE~ression indiquent que l'activité relative des IRES est différente, ce qui
suggère une compétiton entre eux pour les ribosomes.
En résumé, l'ensemble des données montrent la présence d'un site IRES
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
efficace dans le leader 5' des ARN du virus REV-A et, probablement d'un
élément inter~gi~nt de manière positive avec l'encapsidation. L'élément IRES
minim-.m est contenu au sein d'une séquence de 129 nt (positions 452 à 578).
S EXEMPLE 3: Transduction de cellules neuroectoderrnales humaines
pluripotentes
Cette étude est réalisée dans la lignée cellulaire humaine Dev qui constitue
un modèle cellulaire du système nerveux central, cible potentielle pour la thérapie
10 génique humaine. Les cellules Dev dérivent d'une tumeur primaire hurnaine
d'origine neuroectodermale (PNET) et se comportent comme des cellules souches
pluripotentes (Derrington et al., 1997, Oncogene, sous presse). De plus, il est
possible d'induire leur différenciation soit en neurones soit en cellules gliales
(Derrington et al., 1997, supra; Dufay et al., 1994, Eur. J. Neurosci. 6,1633-1640
; Giraudon et al., 1993, Neurosci. 52, 1069-1079). Dans cette étude, le vecteur
dicistronique pREV HW-3 (IRES REV-A 265-578) est comparé au vecteur
contrôle pEMCV CBTV (IRES EMCV).
Les cellules Dev sont infectées avec une dilution au 1/100 de surnageant
viral pendant 2 jours puis fixées, colorées histochimiquement selon le protocole20 ci-dessus et comptées. Le titre viral est similaire pour les deux vecteurs et de
l'ordre de 3x103 TU/ml. Les unités de transduction (TU/ml) correspondent au
rapport du nombre de colonies x dilution du rétrovirus infectant par le volume
total (ml) du vecteur dilué placé sur les cellules.
On vérifie également l'expression des deux cistrons neo et plap. Pour ce
25 faire, les cellules cibles sont cornme précédemment transduites avec une dilution
1/100 de surnageant viral et sélectionnées en présence de G418 pendant 3
semames. On déterrnine l'intensité de la fluorescence par cytométrie de flux avec
un anticorps spécifique pour la plap (DAKO). On indique qu'un anticorps
polyclonal convient. Les résultats montrent la production de l'enzyme plap par les
.,
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
cellules transduites et sélectionnées au G418. En parallèle, la synthèse de
l'enzyme plap est confirmée par coloration histochimique des clones résistants.
Ces données montrent que le vecteur dicistronique pREV HW-3 peut
transduire de façon efficace des cellules hllm~ines dérivées du système nerveux
central et y transférer des gènes d'intérêt et confirment la fonctionnalité du site
IRES REV-A pour médier la production du produit d'expression du second
cistron.
Par ailleurs, différents protocoles de transduction ont été étudiés dans un
but d'optimisation. Les variantes sont les conditions de culture des cellules enprésence ou en absence de sérum et en présence ou en absence de facteurs de
croissance (FGF-2) et la production des virus en présence ou en absence de sérum.
Les six protocoles suivants ont été comparés avec les virus pEMCV CBTV et
pREV HW-3 possédant 11enveloppe polytrope GaLV (production sur cellules
PG13, ATCC CRI,-10686).
Protocole 1: cellules cultivées en milieu avec sérum (10 %), virus produit en
présence de sérum (10 %).
Protocole 2: cellules cultivées en milieu avec sérum (10 %), virus produit en
absence de sérum.
Protocole 3: cellules cultivées en milieu sans sérum, virus produit en présence
de sérurn (10 %).
Protocole 4: cellules cultivées en milieu sans sérum, virus produit en absence de
sérum.
Protocole 5: cellules cultivées en milieu sans sérum, virus produit en présence
de sérum (10 %), présence de FGF-2.
Protocole 6: cellules cultivées en milieu sans sérum, virus produit en absence de
sérum, présence de FGF-2.
Le pourcentage de cellules Dev transduites est ~létP.rrniné par cytométrie
de flux (Figure 5). Le pourcentage de cellules transduites par pREV HW-3
dépasse 30% lorsque la culture des cellules Dev est ef~ectuée en absence de sérurn.
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/00849
-34-
Un tel % n'est pas atteint avec le virus conventionnel pEMCV CBTV. L'ajout de
facteurs de croissance est également avantageux. Parmi tous les protocoles mis en
oeuvre, le protocole 5 permet de transduire plus de 50 % de cellules Dev. Ces
résultats montrent que les vecteurs polycistroniques de l'invention portant l'IRES
S REV-A sont fonctionnels pour transduire les cellules neuroectoderrnales
pluripotentes. Le développement de protocoles pour la transduction efficace de
lignées cellulaires hllm~ines est un point essentiel dans l'élaboration des stratégies
de transfert de gènes.
L'expression des cistrons plap et neo est évaluée après différenciation
10 neuronale et gliale (Derrington et al., 1997, supra). Brièvement, les cellules Dev
adoptent un phénotype différencié en présence de sérum et de FGF-2 alors que
lorsque la culture est réalisée en absence de sérum, le phénotype est pluripotent.
Les résultats d'immunofluorescence avec un anticorps spécifique anti-plap sur
cellules Dev transduites, sélectionnées au G418 et différenciées montrent une
15 expression de la plap dans les cellules neuronales et gliales. Ces données
suggèrent que l'état de différenciation n'inhibe pas la traduction médiée par
l'IRES REV-A.
... . . .
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~Rg8/00849
-35-
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
~i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSERM
~B) RUE: 101 rue de Tolbiac
(C) VILLE: Paris cedex 13
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 75654
(G) TELEPHONE: 01 44 23 60 00
(H) TELECOPIE: 01 45 85 68 56
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Nouveau site interne d'entree des ribosomes
et vecteur le contenant.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS~MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 940 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Reticuloendotheliosis virus
(B) SOUCHE: type A (REV-A)
(C) INDIVIDUEL ISOLE: leader 5' de l'ARN genomique REV-A
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
AAUGUGGGAG GGAGCUCCGG GGGGAAUAGC GCUGGCUCGC UAACUGCCAU AUUAGCUUCU 60
GUAAUCAUGC UUGCUUGCCU UAGCCGCCAU UGUACUUGAU AUAUUUCGCU GAUAUCAUUU 120
CUCGGAAUCG GCAUCAUUUC UCGGAAUCGG CAUCAAGAGC AGGCUCAUAG ACCAUAAAAG 180
GAAAUGUUCG UUGGAGGCGA GCAUCAGACC ACUUGCGCCA UCCAAUCACG AGCAAACACG 240
AGAUCGAACU AUCAUACUGA GCCAAUGGUU GUAAAGGGCA GAUGCUAUCC 'JCCAAUGAGG 300
GAAAAUGUCA UGCAACAUCC UGUCCUGUAA GCGGCUAUAU AAGCCAGGUG CAUCUCUUGC 360
,, ... .. _ .
CA 022~8490 1998-12-23
W O 98/49334 PCT~R98/~~J19
-36-
UCGGGGUCGC CGUCCUACAC AUUGUUGUGA CGCGCGGCCC AGAUUCGAAU CUGUAAUAAA 420
AGUUUUUUUC UUCUAUAUCC UCAGAUUGGC AGUGAGAGGA GAUUUUGUUC GUGGUGUAGG 480
CUGGCCUACU GGGUGGGGUA GGGGUCCGGA CUGAAUCCGU AGUAUUUCGA UACAACAUUU 540
GGGGGCUCGU CCGGGAUUCC UCCCCAUCGG CAGAAGUGCC UACUGUUUCU UCGAACUCCG 600
GCGCCGGUAA GUAAGUACUU GAUUUUGGUA CCUCGCGAGG GUUUGGGAGG AUCGGAGUGG 660
CGGGACGCUG CCGGGAAGCU CCACCUCCGC UCAGCAGGGG ACGCCCUGAU CUGAGCUCUG 720
UGGUAUCUGA UUGUUGUUGG ACCGUCUCCA AGACGGUGAU AAUAUAAGUC GUGGUUUGUG 780
UGUUUGUUUG UUACCUUGUG UUUGUUCGUC ACUUGUCGAC AGCGCCCUGC GAAUUGGUGU 840
GCCCACACCG CGCGGCUUGC GAAUAAUACU UUGGAGAGUC UUUUGCCUCC AGUGUCUUCC 900
GUUUGUACUC GUCCUCCUCU CCCUCUCCGG CCGGGAUGGG 940
(2) INEORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 578 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONEIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARN (génomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Reticuloendotheliosis virus
(B) SOUCHE: type A (REV-A)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
GGGGUCGCCG UCCUACACAU UGUUGUGACG CGCGGCCCAG AUUCGAAUCU GUAAUAAAAG 60
UUUUUUUCUU CUAUAUCCUC AGAUUGGCAG UGAGAGGAGA UUUUGUUCGU GGUGUAGGCU 120
GGCCUACUGG GUGGGGUAGG GGUCCGGACU GAAUCCGUAG UAUUUCGAUA CAACAUUUGG 180
GGGCUCGUCC GGGAUUCCUC CCCAUCGGCA GAAGUGCCUA CUGUUUCUUC GAACUCCGGC 240
GCCGGUAAGU AAGUACUUGA UUUUGGUACC ~CGCGAGGGU UUGGGAGGAU CGGAGUGGCG 300
GGACGCUGCC GGGAAGCUCC ACCUCCGCUC AGCAGGGGAC GCCCUGAUCU GAGCUCUGUG 360
GUAUCUGAUU GUUGUUGGAC CGUCUCCAAG ACGGUGAUAA UAUAAGUCGU GGUUUGUGUG 420
UUUGUUUGUU ACCUUGUGUU UGUUCGUCAC UUGUCGACAG CGCCCUGCGA AUUGGUGUGC 480
CCACACCGCG CGGCUUGCGA AUAAUACUUU GGAGAGUCUU UUGCCUCCAG UGUCUUCCGU 540
UUGUACUCGU CCUCCUCUCC CUCUCCGGCC GGGAUGGG 578
. , .
