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RCV. V(N:EPA-NILE,NCHEN 03 - :25- 9-98 15:(rcr 04 72 69 84 31-= +43 89
23994465;# 8
l
Procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique
cible
La présente invention concerne un procédé
d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible.
On connaît selon le document EP-A-0 285 057, un
procédé de traitement d'un nucléotide consistant à introduire
sur l'un des éléments constitutifs dudit nucléotide, a savoir le
sucre, la base purique ou pyrimidique, et les groupements
phosphate, un groupement fonctionnel ayant diverses utilisations
et notamment celles de marquage. Le nucléotide ainsi traité
obtenu pourrait être incorporé dans un polynucléotide, notamment
sous la forme double-brin sans que la double hélice ne soit
déstabilisée par la présence de ce nucléotide.
Toutefois dans ce cas, les groupements fonctionnels
fixés sur le nucléotide selon cet art antérieur présentent
différents phénomènes tels que par exemple l'encombrement
stérique, des interactions hydrophobes ou des phénomènes de
compl.exation, qui empêchent la reconnaissance du polynucléotide
ayant incorporé ledit nucléotide traité, par la plupart des
enzymes, qui reconnaitraient le polynucléotide correspondant,
dans lequel ledit nucléotide traité n'a pas été incorporé.
Le document wO-A-92/00989 propose un procédé de marquage,
par une protéine, d'une séquence d'acide nucléique, notamment pour
obtenir une sonde marquée, par amplification d'un acide nucléique
cible. Salon ce procédé, on dispose de nucléotides modifiée différant
des nucléotides naturels par la présence d'une fonction réactive, on
amplifie pour obtenir une sonde préfonctionnalizée, et on fait réagir
la sonde obtenue par l'intermédiaire des fonctions réactives avec une
protéine marqueur. A cet effet, la fonction réactive du nucléotide
modifié est une fonction nucléophile choisie parmi les fonctions
thiol, éventuellement protégées, et amine.
L'inconvénient de ce procédé réside dans le marqueur retenu
qui, en raison de sa taille, - le poids moléculaire est de l'ordre de
plusieurs milliers - limitera considérablement la vitesse et/ou le
rendement du couplage covalent entre ledit marqueur et ladite
fonction, ce problème s'accroissant avec le nombre de nucléotides
modifiée incorporés dans la sonde. Au surplus, il peut entraîner un
ralentissement des réactions dans lesquelles sera impliquée la sonde
obtenue, en particulier dans une hybridation.
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g c v . VON : EPA -`1l E : N C I 1 E N o:3 ; 2 - 0-98 ts : of > 04 7.1 69 84
81- +49 89 2099,14(,;5:4 9
1/1
Conformément â la présente invention, on apporte un
procédé d'amplification qui pallie les inconvénients
précédemment cités et qui notamment ne perturbe pas
l'incorporation des nucléotides et en conséquence n'influence
pas de manière significative le rendement et/ou la sensibilité
dans une réaction d'amplification de cible et qui de plus permet
d'obtenir un excellent marquage des produits d'amplification en
évitant des phénomènes d'instabilité du marqueur liés à une
incorporation préalable de ce dernier.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé
d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible, selon
lequel
on dispose au moins de la séquence d'un acide
nucléique cible, d'au moins une amorce oligonucléotidique
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spécifique de la séquence cible, d'une ou plusieurs activités
enzymatiques, de nucléotides,
- on amplifie, dans des conditions adaptées notamment
à l'activité ou les activités enzymatiques, la séquence cible,
procédé selon lequel au moins un des nucléotides est
un nucléotide préfonctionnalisé, différant des autres
nucléotides au moins par la présence d'au moins une fonction
réactive de covalence, non protégée, disposée en au moins un
site prédéterminé de la base dudit nucléotide, pour obtenir un
produit d'amplification préfonctionnalisé comprenant au moins
undit nucléotide préfonctionnalisé.
Selon un procédé avantageux de l'invention il comprend
en outre les étapes suivantes :
- on dispose d'un réactif comprenant une fonction
anti-réactive de covalence, spécifique de la fonction réactive
du nucléotide préfonctionnalisé, et un groupement fonctionnel,
et
- on fait réagir, directement ou indirectement, le
produit d'amplification préfonctionnalisé, avec le réactif, pour
obtenir un produit d'amplification fonctionnalisé.
Avant d'exposer l'invention de manière détaillée,
certains termes employés dans la présente description sont ci-
après définis.
Par nucléotide selon l'invention, on entend un
monomère nucléotidique naturel ou modifié tel que défini ci-
dessous.
Ainsi, le monomère nucléotidique peut être un
nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments
constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base
azotée; dans l'ARN le sucre est le ribose, dans l'ADN le sucre
est le 2'-désoxy-ribose; selon qu'il s'agit de l'ADN ou l'ARN,
la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine,
l'uracile, la cytosine, la thymine; ou un nucléotide modifié
dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre
d'exemple, la modification peut intervenir au niveau des bases,
générant des produits modifiés telles que l'inosine, la méthyl-
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5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-
désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine
et toute autre base modifiée permettant l'hybridation, au niveau
du sucre, à savoir par exemple le remplacement d'au moins un
désoxyribose par un analogue (exemple: P.E. Nielsen et al,
Science, 254, 1497-1500 (1991)), au niveau du groupement
phosphate par exemple des dérivés boronates, alkylphosphonates
ou phosphorothioates.
Par groupement protecteur, on entend les groupements
utilisés de manière classique dans la synthèse chimique de
nucléosides, nucléotides et oligonucléotides (voir par exemple:
Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Edited by Leroy B.
Townsend, Plenum Press, New York and London et Protocols for
Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Edited
by Sudhir Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey).
Un groupe fonctionnel de marquage de l'invention est
une molécule susceptible de générer directement ou indirectement
un signal détectable. Il est notamment choisi parmi les isotopes
radioactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase,
la phosphatase alcaline, la b-galactosidase, et celles
susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou
luminescent, des composés chimiques chromophores, chromogènes,
fluorophores, fluorigènes ou luminescents, des analogues de
bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine.
Dans le cas où le marqueur ne peut générer directement
un signal, par exemple, quand celui-ci est une enzyme, il est
nécessaire d'ajouter un révélateur, par exemple un substrat
correspondant à l'enzyme, la réaction enzyme/substrat générant
un complexe détectable, par exemple un composé chromogène ou
luminescent. A titre d'exemple, le réactif révélateur peut être
l'ortho-phénylène -diamine, la 4-méthyl-umbelliféryl-phosphate.
La fonction réactive de covalence du nucléotide
préfonctionnalisé et la fonction anti-réactive du réactif, sont
respectivement des fonctions chimiques organiques électrophiles
et nucléophiles, ou inversement.
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La fonction chimique organique électrophile est
avantageusement choisie parmi les fonctions aldéhyde, ester
activé, acide carboxylique, isothiocyanate, dérivés haloacyles
et chlorure de sulfonyle.
La fonction chimique organique nucléophile est
avantageusement choisie parmi les fonctions amine, thiol,
oxyamine, hydrazine et hydrazide, de préférence c'est la
fonction alkoxyamine.
Selon une variante de l'invention, la fonction
réactive de covalence du nucléotide modifié est greffée sur la
base par l'intermédiaire d'un bras de couplage.et/ou la fonction
anti-réactive de covalence du réactif est greffée sur le
groupement fonctionnel par l'intermédiaire d'un bras de
couplage.
Le bras de couplage est notamment choisi parmi les
chaînes hydrocarbonées, saturées ou insaturées, éventuellement
interrompues par des fonctions amine, amide et oxy.
Selon un procédé préférentiel, la fonction-réactive de -
covalence est la fonction oxyamine, la fonction anti-réactive de
covalence du réactif est la fonction aldéhyde, et cette dernière
est liée à un groupement fonctionnel de marquage tel qu'un
groupement fluorescent ou luminescent.
Avantageusement la fonction aldéhyde est liée au
groupement fonctionnel par le bras de couplage -NH-CS-NH-(CH2)3-
et le groupement fonctionnel du réactif est la fluorescéine.
Le produit nucléotidique préfonctionnalisé peut
comprendre une ou plusieurs fonctions réactives de covalence,
identiques ou différentes, introduites par un ou plusieurs
nucléotides. Lesdites fonctions réactives de covalence peuvent
réagir avec un ou plusieurs réactifs, identiques ou différents,
de manière simultanée ou séquentielle. La détection des
groupements fonctionnels de marquage du produit fonctionnalisé
peut être simultanée ou séquentielle.
Il est entendu que ce procédé de marquage peut être
appliqué à un ou plusieurs produits nucléotidiques
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ISA/EP
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préfonctionnalisés, notamment pour différencier des produits
préfonctionnalisés issus de cibles différentes.
Le produit d'amplification fonctionnalisé marqué peut
être détecté qualitativement et/ou quantitativement en phase
5 homogène ou hétérogène.
En phase homogène, le réactif et le produit
nucléotidique préfonctionnalisé interagissent dans le même
milieu liquide. En phase hétérogène, le produit
préfonctionnalisé peut être traité avec le réactif avant ou
après capture sur un support solide, c'est à dire directement ou
indirectement. La capture sur le support solide peut être
réalisée par des moyens connus, tels que l'adsorption, la
covalence, notamment en utilisant des fonctions anti-réactives
de covalence disponibles à la surface du support solide ou par
hybridation avec un composé polynucléotidique.
Le support solide, sous toutes formes appropriées
telles que tube, cône, puits, plaque de microtitration, feuille,
puce ou polymère soluble, est choisi parmi les polystyrènes, les
copolymères styrène-butadiène, les copolymères styrène-butadiène
en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des
polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des
copolymères styrène-méthylméthacrylate de méthyle, parmi les
fibres synthétiques et naturelles, parmi les polysaccharides et
les dérivés de la cellulose, le verre, le silicium et leurs
dérivés.
Selon des variantes préférentielles du procédé de
l'invention,
- la séquence d'acide nucléique cible est une séquence
d'ADN ou d'ADN, et les activités enzymatiques comprennent les
activités ADN polymérase ARN- et/ou ADN-dépendantes,
- les activités enzymatiques peuvent en outre
comprendre l'activité ribonucléase H et l'activité ARN
polymérase ADN-dépendante, pour amplifier la séquence d'acide
nucléique cible selon une suite de réactions de transcription
inverse, de transcription et de digestion.
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Les activités enzymatiques ribonucléase H et ADN
polymérase peuvent être apportées par une seule enzyme ou bien
chacune par une enzyme différente.
A titre d'exemple, le procédé de l'invention peut être
utilisé pour l'amplification d'un acide nucléique cible dans un
échantillon selon des techniques bien connues de l'homme de
l'art, telles que la PCR (Polymerase Chain Reaction), la RT-PCR
(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction), la TMA
(Transcription Mediated Amplification) ou la technique NASBA
(Nucleic Acid Sequence Based Amplification) ou toute autre
technique d'amplification enzymatique.
L'invention concerne également un analogue de
nucléotide ou un nucléotide, préfonctionnalisé, susceptible
d'être soumis à un traitement enzymatique.
Par traitement enzymatique d'un analogue de nucléotide
ou d'un nucléotide, on inclut toutes les réactions, in vivo ou
in vitro, au cours desquelles intervient au moins une enzyme
dont l'activité est liée à un nucléotide. Ainsi on comprend
toutes réactions comprenant au moins une étape enzymatique dans
laquelle un nucléotide sert de substrat à l'enzyme, que ledit
nucléotide soit transformé ou non au cours de cette étape
enzymatique ; à titre d'exemple de telles réactions sont
choisies parmi celles utilisées dans les techniques de biologie
moléculaire telles que la transcription, la ligation,
l'élongation, la coupure, et plus particulièrement dans les
techniques d'amplification, (WINN-DEEN, Journal of Clinical
Assay, vol 19, p21-26 (1996).
Ainsi les enzymes dont les activités sont liées à des
nucléotides peuvent en particulier être sélectionnées dans la
liste non exhaustive suivante les ADN polymérases ADN
dépendantes telles que le fragment de Klenow de l'ADN polymérase
I de E. coli, la Taq polymérase, les T7, T4 ou T5 ADN
polymérases, les polymérases eucaryotes cellulaires ou virales
a, b, g ; les ADN polymérases ARN dépendantes telles que les
polymérases de AMV (Avian Myoblastosis Virus), de MMLV (Moloney
Murine Leukemia Virus) ; les ARN polymérases telles que les T7,
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T3, SP6, N4, PBSII ARN polymérases, l'ARN polymérase de E. coli
les enzymes à activité nucléasique telles que les
endonucléases de restriction, la RNAse H ; ou encore les polyA
polymérases, les réplicases, telle que la Q-béta-réplicase, les
terminal transférases, ou les ligases.
Selon un mode préféré, on choisira. pour l'application
du procédé de l'invention la technique TMA pour l'amplification
d'une séquence d'acide nucléique cible ARN ou l'amplification
d'une séquence d'acide nucléique cible ADN après une étape de
transcription inverse, ladite technique étant décrite dans la
demande internationale WO 91/01384 incorporée à titre de
référence.
Un analogue de nucléotide, préfonctionnalisé selon
l'invention répond à la formule générale (I)
B-Zn-X
R3-O
R2 Ri (I)
dans laquelle
B représente une base nucléique,
Z représente un bras de couplage,
n est un entier égal à 0 ou 1,
X représente une fonction réactive de covalence fixée
sur au moins un site de la base nucléique B,
R1 représente H ou OH,
R2 représente H, OH, un groupement mono- di- ou tri-
phosphate, ou un groupement O-R dans lequel R représente un
groupement protecteur,
R3 représente H, un groupement protecteur, ou un
groupement mono-, di- ou tri-phosphate.
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De préférence, R1 et R2 représentent chacun
indépendamment l'un de l'autre--H, OH et R3 représente un
groupement mono-, di- ou tri-phosphate.
Un nucléotide préfonctionnalisé de l'invention est
choisi parmi les nucléotides suivants :
-un nucléotide dont la base nucléique est dérivée de la
cytosine et comporte, au moins sur la fonction aminée en
position 4 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive
de covalence nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de
manière significative, le traitement enzymatique dudit
nucléotide, la fonction réactive de covalence étant choisie
parmi les fonctions NH2, O-NH2, SH, hydrazine et hydrazide et la
fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée
en position 4 du cycle pyrimidique par un bras de couplage
choisi parmi (-CH2-)n1, (-O-CH2-)nl dans lequel nl est un
entier compris entre 1 et 12 ; (-CH2-O-CH2-)n2, (-CH2-CH2-0-CH2-
CH2-)n2, (-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-)n2, (-CH2-O-CH2-CH2-)n2,
dans lequel n2 est =un entier compris entre 1 et 6 ; et -NH-CH2-
O-CH2-CH2. Avantageusement, la fonction réactive de covalence
est liée à ladite fonction aminée par l'intermédiaire d'un bras
de couplage choisi parmi -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-
CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -
CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-, et NH-CH2-O-CH2-CH2.
- un nucléotide dont la base est dérivée de l'uracile
et comporte au moins sur la position 5 du cycle pyrimidique, au
moins une fonction réactive de covalence nucléophile, non
protégée, et n'influençant pas, de manière significative, le
traitement enzymatique, caractérisé en ce que la fonction
réactive de covalence est choisie parmi les fonctions NH2, 0-
NH2, SH, hydrazine et hydrazide; avantageusement, la fonction
réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée par
l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi -C=C-CH2-, et
-C=C-CH2-NH-CO-CH2-, -CH=CH-CH2-NH-CO-CH2- et -CH=CH-CH2;
- un nucléotide dont la base est dérivée de l'adénine
et comporte au moins sur la fonction aminée en position 6 du
cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive de covalence
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91)
ISA/EP
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- - -------- - ----
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nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de manière
significative, le traitement enzymatique, caractérisé en ce que
la fonction réactive de covalence est choisie parmi les
fonctions NH2, CH2-O-NH2, SH, hydrazine et hydrazide ; la
fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée
par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi (-CH2-
)nl, (-O-CH2-)nl dans lequel nl représente un entier compris
entre 1 et 12 ; (-CH2-O-CH2-)n2, (-CH2-CH2-O-CH2-CH2-)n2, (-CH2-
CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-)n2, (-CH2-O-CH2-CH2-)n2, dans lequel n2
est un entier compris entre 1 et 6 ; et NH -CH2-O-CH2-CH2.
Avantageusement, la fonction réactive de covalence est liée à
ladite fonction aminée par l'intermédiaire d'un bras de couplage
choisi parmi -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-
CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-
CH2-CH2-O-CH2-CH2-, et NH-CH2-O-CH2-CH2 ; et de manière préférée
le bras de couplage est -CH2-CH2-CH2-CH2-.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un
nucléotide préfonctionnalisé tel que défini précédemment, dans
un traitement enzymatique d'amplification.
L'analogue de nucléotide ou le nucléotide,
préfonctionnalisé, a, vis-à-vis du traitement enzymatique, un
comportement sensiblement identique à celui de l'analogue de
nucléotide ou le nucléotide correspondant. En effet, la fonction
introduite en un site de la base dudit analogue ou nucléotide,
grâce à son inertie biologique et chimique vis-à-vis des
enzymes, ne modifie pas significativement ni l'affinité, ni la
spécificité de l'enzyme à l'égard de son substrat.
Enfin les derniers objets de l'invention consistent en
des utilisations particulières de nucléotides tels qu'ils
viennent d'être définis. De manière préférentielle, ils sont
utilisés dans des techniques d'amplification, telles que celles
décrites dans les documents suivants EP-0 721 988, WO-
95/03426, US-5 409 818, US-5 399 491.
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L'invention est maintenant décrite plus en détail par
référence aux exemples et figures annexés qui vont suivre et
dans lesquels:
La figure 1 représente un schéma général de synthèse
5 de nucléotides cytidines portant un bras aminé en position 4;
La figure 2 représente un schéma de synthèse du
nucléotide cytidine portant un bras alkyloxyaminé en position 4;
La figure 3 représente un schéma de synthèse par
transamination de nucléotides; et
10 La figure 4 met en évidence l'effet de l'incorporation
de la CTP- (N4) -C602-NHz (27a) sur la sensibilité de la TMA;
La figure 5 met en évidence l'effet de l'incorporation
de la CTP-(N4)-C4-NH2 (27b) sur la sensibilité de la TMA.
Dans les figures 4 à 5 précitées sont représentés en
abscisse le nombre de copies de la cible par réaction et en
ordonnée le nombre d'amplicons obtenus par microlitre de
réaction (volume final réactionnel= 100 microlitres). Aux
courbes des figures 4 et 5 sont affectés des symboles
particuliers, par exemple ^, 12, A, ), =, et un pourcentage. Ce
pourcentage correspond au pourcentage du ou des nucléotides
préfonctionnalisés par rapport aux nucléotides naturels dans la
réaction d'amplification TMA. Les figures 4 et 5 montrent
respectivement les résultats de la semi-quantification par la
technique ELOSA (décrite dans la demande de brevet PCT WO
92/19812) du nombre d'amplicons produits à partir d'une gamme
cible d'ARN 16S de Mycobacterium tuberculosis en présence de
différents rapports des nucléotides 27a et 27b par rapport à
leurs nucléotides naturels respectifs.
Dans les exemples qui suivent et qui permettent
d'illustrer quelques avantages de l'invention, il est fait
référence à un réactif comprenant un groupe fonctionnel de
marquage mais la portée de l'invention n'est bien entendu pas
limitée à de telles propriétés du groupe fonctionnel.
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SYNTHESE DE NUCLEOTIDES ET MARQUEURS PREFONCTIONNALISES.
Pour préfonctionnaliser les nucléotides sur la base
nucléique, la stratégie généralement utilisée consiste en la
synthèse des nucléosides protégés portant une fonction réactive
également protégée. La déprotection de la fonction hydroxyle en
position 5' libère le nucléoside modifié, lequel est finalement
triphosphorylé sur cette position selon la méthode de Ludwig-
Eckstein (J. Ludwig, F. Eckstein, J. Org. Chem., 1989, 54, 631-
635).
L'hydrolyse des groupements protecteurs des fonctions
hydroxyles en 2' et 3' et de celui de la fonction réactive de la
chaîne introduite sur la base, conduit aux nucléotides
triphosphates préfonctionnalisés.
1-Série adénosine:
EXEMPLE 1 : Synthèse du nucléoside à chaîne amine 4.
Voie de synthèse
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N-N
NH2 NH2 NJ\~N N
N -N ~ APTTS / I N~ \'N J N N
> NL ~ N
HO
O J HC(OEt~ HO O J 100 C, 48 h >HO OJ
2
HO OH O O
O O
1 \
CH3CN
HzN,_,,-~
NH-Boc 50 C
3 2 jours
r
H.N^^,NH-Boc
N N
N~- N
HO OJ 4
O H
O
/\
Protection et fonctionnalisation de l'adénosine
Isopropylidène (1) : (Nucleic Acid Chemistry, part 2, Townsend,
Tipson, p. 768, Wiley Interscience)
NH2
N N
HOMO)
Oyo
A une suspension d'adénosine (5g, 18,7 mmol, Aldrich
14659-5) dans de l'acétone (10 ml) contenant de l'APTS (3,9 g,
20,6 mmol), on ajoute goutte à goutte sous argon de
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l'orthoformate d'éthyle (12,44 ml, 74,8 mmol). Après une nuit de
réaction, on ajoute 110 ml d'eau contenant 1,86 ml d'ammoniaque
à 27 %. Après 30 minutes d'agitation, le milieu réactionnel est
évaporé jusqu'à apparition de cristaux blancs. Après 12 h au
frigo, on obtient un précipité blanc que l'on recristallise dans
l'eau. On obtient 4,175 g (13,5 mmol, 72 %) de produit (1) sous
forme d'un poudre blanche. Ce produit a été caractérisé par RMN
du proton.
Triazolo (2) : (Samano, Miles, Robins, J. Am. Chem. Soc., 1994,
....................................
116, 9331-9332)
N1-N
,,1
N
N N\\
j L
N N
HO O 2
O O
>'_1
L'adénosine-isopropylidène (1) (1g, 3,2 mmol) et
l'amidine (1,4 g, 6,5 mmol) sont agitées dans de la pyridine (15
ml) à 100 C sous argon pendant 48 h. La pyridine est alors
évaporée et co-évaporée avec du toluène. L'huile obtenue est
ensuite reprise par de l'acétate d'éthyle et cette phase
organique est lavée avec de l'eau saturée en NaCl. Après séchage
sur Na2SO4 et évaporation, on obtient le produit (2) sous forme
d'une poudre blanche avec un rendement de 60 % (700 mg, 1,9
mmol). Le produit 2 a été caractérisé par spectrométrie de masse
et RMN du proton.
Synthèse de l'amidine: (Bartlett et Humphreg, J. Chem. Soc.,
1967, 1664-1666)
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N-
OHC-NH-NH-CHO + SOCk DMF 2HCI
Le chlorure de thionyle (39,96 g, 24,5 ml, 0,338 mol)
est ajouté goutte à goutte au N-N'-diformylhydrazine (12 g,
0,136 mol) dans le DMF (270 ml) à 10 C. Le mélange devient
jaune. On maintient l'agitation pendant 2 jours. Le précipité
obtenu est filtré et lavé par du DMF puis par de l'éther. Après
séchage sous vide, on obtient l'amidine avec un rendement de 95
(28 g, 0,130 mol).
Substitution du triazolo par le diaminobutane monoprotégé
Monoprotection du 1,4-diaminobutane : synthèse de (3) (Hassen,
.............
Nielsen, Ehrbar, Buchardt, Synthesis, 1982, 404-405)
H2N~~ NH-Boc
3
La solution de 1,4-diaminobutane (0,113 mol., 9,94 g
11,4 ml) dans le chloroforme (250 ml) est refroidie à 0 C. On
ajoute alors goutte à goutte sous argon, une solution de
ditertbutyldicarbonate (0,022 mol, 4,95 g, 5,22ml) dans du
chloroforme (250 ml). Le mélange est agité pendant une nuit à
température ambiante. Le précipité formé est filtré et le
filtrat est évaporé. L'huile résiduelle est reprise par une
solution aqueuse saturée en NaCl (40 ml) . on élimine ainsi le
produit bisprotégé par filtration. On extrait alors la phase
aqueuse avec de l'éther ( 5 x 50 ml). Les phases organiques sont
réunies, séchées sur Na2SO4 et évaporées. On obtient ainsi le
produit (3) sous forme d'huile avec un rendement de 99 % (3,8 g,
0,0218 mol). Le produit (3) a été caractérisé par spectrométrie
de masse et par RMN du proton.
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Substitution du triazolo par le diaminobutane-monoboc = synthèse
de (4)
H, N -,,,~,NH-Boc
N N
i
L N N
HO OJ 4
11
O O
On solubilise le produit (2) (500 mg, 1,4 mmol) dans
ml d'acétonitrile. On ajoute alors le composé (3) (1,31 g,
7 mmol). Le milieu réactionnel est mis à chauffer à 50 C pendant
2 jours et analysé par CLHP.
10 Après évaporation de l'acétonitrile, on reprend le
résidu par de l'acétate d'éthyle et on lave cette phase
organique avec de l'eau saturée en NaCl. Après séchage et
évaporation de l'acétate d'éthyle, le résidu est chromatographié
sur gel de silice (éluant : CH2C12, puis CH2C12/MeOH, 98/2, 95/5
15 (v/v)). Après évaporation et précipitation dans l'hexane, on
obtient le produit (4) sous forme d'une poudre blanche avec un
rendement de 80 % (563 mg, 1,12 mmol) . Le nucléoside (4) a été
caractérisé par spectrométrie de masse et par RMN du proton.
20 Phosphorylation par la méthode de Eckstein (Ludwig, Eckstein, J.
Org. Chem., 1989, 54, 631-635)
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16
H, N -,,_~,NH-Boc
N N
`.NJ N\\
ii
PPPO O J 5
O O
PPP = triphosphate
Le nucléoside (4) (48 mg, 100 mmol) est dissous dans
de la pyridine anhydre et est évaporé 2 fois. On ajoute alors
sous argon 100 ml de pyridine, 300 ml de dioxane et une solution
fraichement préparée de 2-chloro-4H- 1, 2, 3 -dioxaphosphorin-4 -one
dans du dioxane (130 ml, 130 mmol). On laisse l'agitation
pendant 20 minutes puis on ajoute une solution 0,5 M de
pyrophosphate de tributylammonium dans du DMF anhydre (320 ml)
et simultanément 130 ml de tributylamine.
Après 30 minutes d'agitation, on ajoute 2 ml d'une
solution d'iode à 1 % dans un mélange pyridine/eau (98/2, v/v).
Après 20 minutes d'agitation, on détruit l'excès d'iode avec une
solution aqueuse de NaHSO3 à 5 % et on maintient l'agitation
pendant 10 minutes. On évapore à sec puis on effectue une,
extraction eau/dichlorométhane. On vérifie la formation du
triphosphate 5 par HPLC (gradient 0 à 35 % de B en 40 minutes
; A = Tris HC1 20 mM, pH 7,6 ; B = Tris HCl 20 mM, pH 7,6 + 0,5
M NaCl). Temps de rétention = 35 minutes.
Après évaporation, on reprend le résidu dans de l'eau
(10 ml) puis on ajoute 10 ml d'une solution aqueuse de TFA à 50
pour effectuer la déprotection des groupements Boc et
isopropylidène. Après 30 minutes, le TFA est évaporé et
coévaporé avec de l'eau. On observe ainsi la formation d'un
nouveau produit avec un temps de rétention de 19 minutes.
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17
EXEMPLE 2 : Synthèse du nucléotide adénosine à chaîne
oxyamine.
Voie de synthèse de la chaîne
K2CO3
N=C-(CH2) 3 - Br + HO-N-Pht N=C-(CH2) 3 - O-N-Pht 6
N2 H4
r
LiAIH4 (Boc)20
H2N-(CH2) 4 - O-NH-Boc N=C-(CH2) 3- O-NH-Boc- N=C-(CH2) 3- O-NH2
9 8 7
Synthèse du produit (6)
N=C-(CH2) 3 - O-N-Pht 6
On dissout l'hydroxyphtalimide (10 g, 0,061 mole) dans
du DMF (300 ml) . On ajoute alors du K2CO3 (1, 05 eq. , 9 g) . On
observe la formation d'un précipité. Après 1 h d'agitation à
50 C, on ajoute le dérivé bromé (1 eq., 9,03 g) et on maintient
l'agitation à 50 C pendant 2 h. Après filtration sur coton et
évaporation du DMF, on reprend le résidu par de l'acétate
d'éthyle puis on lave la phase organique avec HC1 1N puis avec
une solution de NaHCO3 à 10 % et enfin avec une solution aqueuse
saturée en NaCl. Après séchage et évaporation, on obtient le
produit (6) avec un rendement de 69 % (9,66 g) Il a été
caractérisé par RMN du proton, du carbone 13 et par
spectrométrie de masse.
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Hydrazinolyse : préparation de la chaîne (7)
N=C-(CH2) 3- O-NH2
7
Le produit (6) (9,51 g, 0,041 mole) est mis dans 150
ml d'éthanol à 95 L'addition d'hydrazine (2 eq., 4 ml)
entraîne une solubilisation immédiate du précipité de départ. On
observe ensuite la formation d'un précipité blanc de
phtalhydrazide. Après 3 heures de réaction à 50 C, on filtre et
on lave le précipité avec de l'éthanol. Après évaporation, la
pâte obtenue est chromatographiée sur gel de silice
(CH2C12/CH3CN 9/1, v/v). Après évaporation des fractions
contenant l'oxyamine libre (7) , on ajoute de l'éther puis de
l'acide chlorhydrique concentré. On obtient ainsi le produit (7)
sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 40 % (2,30
g). Il a été caractérisé par RMN du proton et du carbone 13.
Protection sous forme de Boc de l'oxyamine
N=C- (CH2) 3 - O-NH-Boc
8a
On dissout 2,3 g (0,016 mole) de produit (7) dans 10
ml de dioxane. On ajoute alors une solution aqueuse de soude 1N
(2 eq. : 0,032 mole, 32 ml).
On additionne ensuite goutte à goutte, dans la glace,
sous argon, le ditertbutyldicarbonate (1,2 eq., 0,019 mole, 4,18
g) dissous dans 20 ml de dioxane. Après 3 h de réaction à 0 C on
évapore le dioxane puis on ramène le pH à 3 avec une solution
aqueuse d'HC1 iN et on extrait à l'éther (3x50 ml). On lave
ensuite les phases organiques avec une solution aqueuse d'HC1 1N
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puis avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage
sur Na2SO4 et évaporation on obtient le produit (8a) sous forme
d'une huile jaune (2,56 g, 0,013 mol, 80 %). Il a été
caractérisé par RMN du proton et du carbone 13.
Réduction du nitrile par LiAlH4
H2N-(CH2) 4 - O-NH-Boc
8b
Le composé (8a) (2,56 g, 0,013 mol) est solubilisé
dans de l'éther éthylique anhydre (50 ml). Le mélange est
refroidi dans un bain de glace. On ajoute alors LiAlH4 (3 g,
0,079 mol) en trois fois. L'agitation est maintenue pendant une
nuit puis on ajoute de l'eau (10 ml) et une solution aqueuse de
soude à 15 %. Après filtration du précipité blanc ainsi formé on
lave la phase organique avec une solution aqueuse saturée en
NaCl. Après séchage sur Na2SO4 et évaporation on obtient le
produit 9 sous forme d'huile (769 mg, 0,0037 mol, 29 %). Il a
été caractérisé par RMN du proton et du carbone 13. La chaîne
(8b) a été caractérisée par RMN du proton et du carbone 13
Substitution du triazolo par la chaîne oxyamine
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N-N
N HN '-"~~ O NH-Boc
N = N N . N
I HZN~`~ O-NH-Boc ~N
HO O 8b
+ HO O
2 9
oo o~o
Le produit (2) (246 mg, 0,68 mmol) est dissous dans 20
ml d'acétonitrile. On ajoute alors la chaîne (8b) (700 mg, 3,43
mmol) Le mélange est porté à 50 C. La réaction est suivie par
5 HPLC : elle évolue très lentement. Après une semaine, le solvant
est évaporé. Le résidu obtenu est dissous dans de l'acétate
d'éthyle et la phase organique est lavée avec de l'eau saturée
en NaCl. Après séchage sur Na2SO4 et évaporation on obtient une
huile jaune que l'on chromatographie sur gel de silice (éluant :
10 CH2C12/MeOH 97/3, v/v). Après évaporation du solvant on
obtient le produit (9) sous forme d'une poudre blanche (120 mg,
0,24 mmol,35 %) . Le produit (9) est caractérisé par RMN du
proton et par spectrométrie de masse.
15 Phosphorylation du nucléoside (9).:
La phosphorylation du nucléoside (9) en nucléotide
(10) est réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple I
(préparation du nucléotide 5).
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HNO-N H2
N I N
N
PPP-O O
OH OH
II- Série uridine:
5
EXEMPLE 3 : synthèse de l'uridine à chaîne amine (15).
Voie de synthèse
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O
HN Heck
NHBoc
HNJL'
O~ N
1(O OH - ' NH-Boc O N O OH
r 11 I
HO OH 12
HO OH
O
APIS
HC(OEt)3
o O
HNJt'- NHZ HN NH-Boc
OLNJ 1/ Eckstein O,il N/
U0 O-PPP r--- O OH
15 2/ H+
HO oH ô 0 13
Synthèse de la chaîne
-~NH-Boc
11
ml de propargylamine (73 mmol) sont dissous dans un
5 mélange NaOH 1N/dioxane (146 ml/50m1). On ajoute alors goutte à
goutte, à 0 C, sous argon, 20 ml de Boc,O dissous dans 50 ml de
dioxane. On observe la formation d'un précipité. Après 8 h, le
précipité de carbonate est filtré puis on ramène le pH à 3 avec
une solution aqueuse d'HCl 1N et on extrait avec du
dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée avec une
solution aqueuse saturée en NaCl puis séchée sur Na2SO4 et enfin
évaporée. Par addition d'hexane le produit (11) précipite. On
récupère ainsi 8, 92 g (0, 057 mmol, 79 %) . Le produit (il) a été
caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.
Introduction de la chaîne sur la base Couplage de Heck (Hobbs,
J. Org. Chem., 1989, 54, 3420-3422).
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O
HN NHBoc
ON
I.,0~-OH
~--~ 12
HO OH
ml de DMF sont dégazés et placés sous argon. On
ajoute alors de la iodouridine (1 g, 2,56 mmol, Aldrich, 85529-
5 7) et de l'iodure de cuivre (97,5 mg, 0,512 mmol) . La réaction
est placée à l'obscurité puis on ajoute, toujours sous argon, de
la triéthylamine (713 ml, 518 mg, 5,12 mmol) et la chaine-Boc
(11) (1,2 g, 7,68 mmol) . Le mélange est laissé sous argon
pendant 10 minutes. Le démarrage de la réaction est réalisé par
10 addition du catalyseur tétrakistriphénylphosphine palladium (296
mg, 0,256 mmol) . La réaction est suivie par HPLC. Après une
nuit, le DMF est évaporé et coévaporé avec de l'acétonitrile. Le
résidu obtenu est chromatographié sur gel de silice (dépot
solide, éluant : CHZCl2, CHZC1z /MeOH : 98/2, 95/5, 90/10, 85/15-
v/v). Après évaporation on obtient 528 mg de produit (12) (1,3
mmol, 52 %). Le produit (12) a été caractérisé par RMN du proton
et par spectrométrie de masse.
Protection sous forme d'isopropylidène (Townsend, Tipson,
Nucleic acid chemistry, part 2, p. 765, Wiley-interscience).
O
HN-1~,, NH-Boc
OJIN "
LO /-OH
0 13
On ajoute, sous argon à température ambiante,
l'orthoformate d'éthyle (166 ml, 148 mg, 1 mmol) à une
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suspension de produit (12) (200 mg, 0,5 mmol) dans l'acétone (2
ml) contenant de l'APTS (9,5 mg, 0,05 mmol). La réaction est
suivie par CCM (CH2C12 /MeOH 90/10). Après 2 heures on ajoute du
dichlorométhane et on lave la phase organique avec une solution
aqueuse de NaHCO3 à 10 % puis avec une solution aqueuse saturée
en NaCl. Après séchage et évaporation on obtient le produit (13)
sous forme d'une poudre jaune (167 mg, 0,38 mmol, 76 %).
Phosphorylation par la méthode de Eckstein et déprotection
(Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635)
O
HN NH2
O~N
LO~,'-O-PPP
M
HO OH
Le nucléoside 13 (44 mg, 100 mmol) est dissous dans
de la pyridine anhydre et est évaporé 2 fois. On ajoute alors
15 sous argon 100 ml de pyridine, 300 ml de dioxane et une
solution fraichement préparée de 2-chloro-4H-1,2,3-
dioxaphosphorin-4-one dans du dioxane (130 ml, 130 mmol). On
laisse l'agitation pendant 20 minutes puis on ajoute une
solution 0,5 M de pyrophosphate de tributylammonium dans du DMF
anhydre (320 ml) et simultanément 130 ml de tributylamine.
Après 30 minutes d'agitation, on ajoute 2 ml d'une
solution d'iode à 1 % dans un mélange pyridine/eau (98/2, v/v).
Après 20 minutes d'agitation, on détruit l'excès d'iode avec une
solution aqueuse de NaHSO3 à 5 % et on maintient l'agitation
pendant 10 minutes. On évapore à sec puis on effectue une
extraction eau/dichlorométhane. On vérifie la formation du
triphosphate par CLHP (gradient : 0 à 35 % de B en 40 minutes ;
A = Tris HC1 20 mM, pH 7,6 ; B = Tris HC1 20 mM, pH 7,6 + 0,5 M
NaCl). Temps de rétention = 36 minutes.
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Après évaporation, on reprend le résidu dans de l'eau
(10 ml) puis on ajoute 10 ml d'une solution aqueuse de TFA à 50
% pour effectuer la déprotection des groupements Boc et
isopropylidène. Après 30 minutes, le TFA est évaporé et
5 coévaporé avec de l'eau. On observe ainsi la formation d'un
nouveau produit (15) avec un temps de rétention de 20 minutes.
EXEMPLE 4 : Synthèse de l'uridine à chaîne alcoxyamine
21.
10 Voie de synthèse
O O
H YI O Pd(PPh3)4 HN j H O NH-Boc
O~ Il
OH 1 ÇONHBoc Cul
HO---,.OJ N Et3N
\ / H 17 DMF HO~.0 18
HO OH HO" "OH
~O
APTS
HC(OEt)3
O
HN O , H%~O-NH2 HN O , H~O-NH-Boc
l/ Eckstein
O N O NI
PPPO-N'OJ 21 2/ H' HO , o ;I 19
HpH O
Synthèse de la carboxyméthoxyamine-boc 16 (Kurth et al, J. Med.
Chem. , 1993, 1255-1261.)
O O
HOx `.ONH2 + Boc2O - HO%~\0ONHBOC
15 16
Le chlorhydrate de carboxyméthoxylamine (6,6 g, 60,4
mmol) est dissous dans 132 ml d'eau en présence de soude (2 g,
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50 mmol) et de dioxane (66 ml). La solution est refroidie dans
un bain de glace. On ajoute goutte à goutte du di-tert-
butyldicarbonate (13,97 g, 64,1 mmol) dissous dans le dioxane
(66 ml). L'agitation est maintenue pendant une nuit à
température ambiante. On évapore à sec le mélange réactionnel.
Au précipité obtenu, on additionne 250 ml d'eau puis on extrait
à l'éther (2x250 ml). On acidifie la phase aqueuse par HC1 1N
jusqu'à pH 3. Ensuite, on extrait cette phase par de l'éther
éthylique (3x50 ml) et par de l'acétate d'éthyle (3x250 ml). Les
phases organiques sont réunies et séchées sur sulfate de sodium.
Après évaporation on obtient le produit (16) sous forme d'une
poudre blanche (10 g, 52 mmol, 86 %). Le produit (16) a été
caractérisé par RMN du proton.
Synthèse de la chaîne par couplage peptidigue (Costa, Dominguez,
Cutts, Williams, Bowen, J. Med. Chem., 1994, 3'7, 314-321.
DCC O
HOOC-CH2-ONHBoc + = - =- -~ i~JNHBoc
N
NH2
H 17
On dissout le produit (16) (2 g, 10,4 mmol) dans du
THF fraichement distillé. Après refroidissement du milieu dans
la glace, on ajoute (2,15 g, 10,4 mmol) de DCC. Le mélange est
agité à froid pendant 15 minutes. On ajoute alors l'amine
propargylique.(714 ml, 10,4 mmol) L'agitation est maintenue à
température ambiante sous argon pendant 2 heures. Après
filtration, le solvant est évaporé. Le résidu ainsi obtenu est
repris dans du dichlorométhane et est lavé avec une solution
aqueuse de HCl 1N, puis avec une solution de NaHCO3 à 5 % et
enfin avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage
sur Na2SO91 le dichlorométhane est évaporé et le résidu est
chromatographié sur gel de silice (éluant acétate
d'éthyle/hexane 60/40, v/v) . On obtient ainsi le produit (17)
sous forme d'une poudre blanche (1,23 g, 5,4 mmol, 52 %). Le
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produit (17) a été caractérisé par RMN du proton et par
spectrométrie de masse.
Couplage de Heck: Hobbs, J. Org. Chem., 1989,54,3420-3422.
O
O N11L,~-O-NH-Boc
O N
HO-N,OJ
~4 18
HO OH
ml de DMF sont dégazés et placés sous argon. On
ajoute alors de la iodouridine (1g, 2,56 mmol ) et de l'iodure
de cuivre (97,5 mg, 0,512 mmol) . La réaction est placée à
10 l'obscurité puis on ajoute, toujours sous argon, de la
triéthylamine (713 ml, 518 mg, 5,12 mmol) et la chaine (17)
(1,75 g, 7,68 mmol). Le mélange est laissé sous argon pendant 10
minutes. Le démarrage de la réaction est réalisé par addition du
catalyseur tétrakistriphénylphosphine palladium (296 mg, 0,256
mmol). La réaction est suivie par HPLC. Après une nuit, le DMF
est évaporé et co-évaporé avec de l'acétonitrile. On reprend le
résidu obtenu par de l'acétate d'éthyle et on lave cette phase
organique avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après
évaporation de l'acétate d'éthyle le résidu est chromatographié
sur gel de silice (éluant : CH2C12 /MeOH : 90/10, 85/15, 80/20,
v/v) . Après évaporation on obtient 747 mg de produit (18) (1,6
mmol, 62 %). Le nucléoside (18) a été caractérisé par RMN du
proton et par spectrométrie de masse.
Protection sous forme d'isopropylidène (Townsend, Tipson,
Nucleic acid chemistry, part 2, p765, Wiley-Interscience)
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O
O ~-1_ NO-NH-Boc
HN J H
OIL N"
HO oJ 19
o0
On ajoute, sous argon à température ambiante,
l'orthoformate d'éthyle (355 ml, 316 mg, 2,13 mmol) à une
suspension de produit (18) (500 mg, 1,06 mmol) dans l'acétone (3
ml) contenant de l'APTS (20,2 mg, 0,10 mmol). La réaction est
suivie par CCM (CH2C12 /MeOH 90/10). Après 3 heures on ajoute du
dichlorométhane et on lave la phase organique avec une solution
aqueuse de NaHCO3 à 10 puis avec une solution aqueuse saturée
en NaCl. Après séchage et évaporation on obtient le produit (19)
sous forme d'une poudre jaune (395 mg, 0,77 mmol, 73 %). Le
nucléoside protégé 19 a été caractérisé par RMN du proton du
carbone 13 et par spectrométrie de masse.
Phosphorylation par la méthode de Eckstein et déprotection
(Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635)
N O-NH2
H H
O N
PPPO\\.OJ/ 21
/4
HO OH
Le nucléoside (19) (102 mg, 200 mmol) est dissous
dans de la pyridine anhydre et est évaporé 2 fois. On ajoute
alors sous argon 200 ml de pyridine, 600 ml de dioxane et une
solution fraichement préparée de 2-chloro-4H-1,2,3-
dioxaphosphorin-4-one dans du dioxane (260 ml, 260 mmol). On
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29
laisse l'agitation pendant 20 minutes puis on ajoute une
solution 0,5 M de pyrophosphate de tributylammonium dans du DMF
anhydre (640 ml) et simultanément 260 ml de tributylamine.
Après 30 minutes d'agitation, on ajoute une solution
d'iode à 1 % dans un mélange pyridine/eau (98/2, v/v) (4 ml, 314
mmol). Après 20 minutes d'agitation, on détruit l'excès d'iode
avec une solution aqueuse de NaHSO3 à 5 % et on maintient
l'agitation pendant 10 minutes. On évapore à sec puis on
effectue une extraction eau/dichlorométhane. On vérifie la
formation du triphosphate par CLHP (gradient : 0 à 35 % de B en
40 minutes ; A = Tris HCl 20 mM, pH 7,6 ; B = Tris HCl 20 mM, pH
7,6 + 0,5 M NaCl ; colonne DEAE Waters Protein-Pak 8HR
10xlOOmm). Temps de rétention = 35 minutes.
Après évaporation, on reprend le résidu dans de l'eau
(5 ml) puis on ajoute 5 ml d'une solution aqueuse de TFA à 50 %
pour effectuer la déprotection des groupements Boc et
isopropylidène. Après 30 minutes, le TFA est évaporé et co-
évaporé avec de l'eau. On observe ainsi par HPLC la formation
d'un nouveau produit (21) avec un temps de rétention de
30 minutes. Ce produit est purifié par HPLC dans les conditions
décrites précédemment, puis dessalé (Eau milliQ en isocratic,
Colonne Macherey Nagel C18 nucleosil).
III- Série cytidine:
I- Synthèse des nucléotides triophosphates modifiés en position
4 par la présence d'une chaîne alkylaminée
Afin d'introduire une chaîne alkyl aminée en position
4 de la base, cette dernière a été activée par l'introduction du
groupe tosyle selon la méthode de Czernecki et coll. ( S.
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Czernecki, T. Lediguarher, J.M. Valéry, Nucleosides &
Nucleotides, 1989, 54, 631-635) à partir de la [2',3'-O-
isopropylidène, 5'-O- butyldiméthylsilyl]-uridine.
La substitution nucléophile du groupe tosyle par une
5 chaîne alkyl diaminée suivie de la protection par le
trifluoroacétate d'éthyle de la fonction amino libre de la
chaîne introduite, est réalisée en une étape.
La déprotection de la fonction hydroxyle en position
5' libère le nucléoside modifié, lequel est finalement
10 triphosphorylé sur cette position selon la méthode de Ludwig-
Eckstein (J. Ludwig, F. Eckstein, J. Org. Chem., 1989, 54, 631-
635) décrite dans les exemples précédents.
L'hydrolyse des groupes protecteurs des fonctions
hydroxyles en 2' et 3' ainsi que de celui de la fonction amino
15 de la chaîne introduite en 4, conduit aux nucléotides
triphosphates désirés (Figure 1).
Une autre stratégie qui consiste en l'introduction
directe de la chaîne aminée en position 4 du nucléotide par
transamination a été utilisée pour préparer les nucléotides (33)
20 et (34) (Figure 3).
EXEMPLE 5: Synthèse de la [2',3' -O-isopropylidène, 5'
-O-butyldiméthylsilyl]-uridine (22).
La solution de la 2',3' -O-isopropylidène-uridine
25 (immole, Sigma, I-5127) dans la pyridine (5 ml) est traitée par
le chlorure de t-butyldimétylsilyl pendant une nuit sous argon à
température ambiante. La réaction est ensuite arrêtée par
l'addition de l'éthanol absolu (2 ml) évaporée puis co-évaporée
avec le toluène. Le produit (22) est purifié par chromatographie
30 sur gel de silice (éluant : acétate d'éthylehexane 1 :1, v :v,
Rf = 0.3).
FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91)
ISA/EP
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31
EXEMPLE 6: Synthèse de la [2',3' -0-isopropylidène,
5'-O-t-butyldiméthylsilyl-4-p-toluène sulfonyl]-uridine (23).
Le composé (22) (immole) dans l'acétonitrile (17 ml)
est porté au reflux en présence du carbonate de potassium (1.3
mmoles, 1.3 éq.) et du chlorure de p-toluène sulfonyle (1.2
mmoles, 1.2 éq.) pendant 3 heures. Après disparition totale du
produit de départ, la réaction est hydrolysée à température
ambiante par addition de l'eau (2 ml) puis évaporée à sec. Le
résidu obtenu est traité par une partition acétate d'éthyle-eau
et est utilisé tel quel pour l'étape suivante.
CCM : Rf = 0.7 (éluant : acétate d'éthyle-hexane 1:1, v:v) . Le
nucléoside 23 a été caractérisé par
RMN du proton (200MHz, CDC13) d = 8,3 ppm (1H, d, H-6);
6,8(2H, d, H-aroma); 7,3(2H, d, H aroma) ; 6,1(1H, d, H-5);
5,8(1 H, s, H-1') ; 4,7 (2H, s, H-2', H-3') ; 4,4 (1 H, m, H-
4'); 4,0-3,7(2H, m, H-5'a, H-5'b); 2,4 (3 H, s, CH3); 1,6 -
1, 3 (2 x 3H, 2 x s, 2xCH3-isoprop) ; 0, 8 (9H, s, 3xCH3) , 0, 1 (6 H,
s, 2x CH3) .
EXEMPLE 7: Synthèse de la [4-N-alkyl trifluoroacétyl
amino-2',3'-0-isopropylidène, 5'-O-t-butyldiméthylsilyl]-
cytidine (24).
A une solution de (23) (1 mmole) dans le
dichlorométhane (5 ml) est ajouté à température ambiante et sous
argon, le réactif alkyl diaminé (5 mmoles, 5 éq) . Après 5 min
d'agitation, un excès de trifluoroacétate d'éthyle (15 mmoles,
15 éq.) est additionné au milieu réactionnel et l'agitation
maintenue durant 15 min. Le nucléoside désiré (24) est purifié
par chromatographie sur gel de silice (éluant : acétone-hexane
1:2, v:v, Rf = 0.2). La structure des nucléosides intermédiaires
(24) complètement protégés est confirmée par RMN du proton.
Exemple du nucléoside (24a) : RMN (200MHz, CDC13), d =7,7 - 7,5
ppm (2H, m, H-6, NH); 5,9(1 H, s, H-l') ; 5,7 (1H, sl, NH); 5,6
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(1H, d, H-5) ; 4,7 (2H, 1 , H-2' , H - 3 ' ) ; 4, 3 (1 H, m, H-4') ; 4, 0 -
3, 7 (2H, m, H-5' a, H-5'b) ; 3, 7 - 3, 5 (m, 12 H, 6 x CH9) ; 1, 6 -
1,3 (2 x 3 H, 2 x 1, 2 x CH 3 isoprop) ; 0,8 (9H, 1, 3xCH3)
0, 1 (1, 6H, 2xCH 3)
EXEMPLE 8: Synthèse de la [4-N-alkyl trifluoroacétyl amino-2',3'
-0-isopropylidène]- cytidine (25) .
Le composé (24) (1 mmole) dessous dans le THF (5 ml)
est traité par une solution molaire de fluorure de
tétrabutylammonium (1,2 mmoles, 1,2 éq) dans le THF. Après 3 à 4
heures d'agitation à température ambiante et sous argon, la
réaction est neutralisée par l'acide acétique (1 éq.) puis
évaporée à sec. Le composé (25) est purifié par chromatographie
sur gel de silice (éluant acétone-hexane 1 :1, v :v, Rf = 0.3).
EXEMPLE 9: Synthèse de la [4-N-alkyl trifluoroacétyl
amino-2',3'-O-isopropylidène-5'-O-triphosphate] -cytidine (26).
Le composé (25) (0.2 mmoles) est co-évaporé avec la
pyridine (2 x 1 ml) puis mis en solution dans 400 ml d'un
mélange pyridine-dioxane (1:3, v :v). Une solution de chlorure
de dioxaphosphorinone (260 l) est ajoutée à la réaction. Un
précipé blanc se forme au bout de 5 à 10 min et après 20 min
d'agitation une solution de pyrophosphate de butylammonium dans
le DMF (0,5 M, 640 l, 1,6 éq.) suivie de la tributylamine (230
ml) est ajoutée à la réaction. Après 30 min d'agitation, la
réaction est oxydée par une solution d'iode à 1 % dans le
mélange pyridine-eau (98 :2, v :v) (4 ml) et l'agitation
maintenue pendant 30 min. L'excès d'iode est ensuite détruit par
une solution aqueuse de bisulfite de sodium à 5 % et le milieu
réactionnel évaporé à sec. Le résidu obtenu est dissout dans
l'eau (20 ml) et traité par un lavage au dichlorométhane. La
phase aqueuse est récupérée et analysée en HPLC (colonne DEAE 8
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HR Millipore 5x100 mm, tampon A : Tris HC1 20 mM pH 7.6, tampon
B : Tris HC1 20 mM, 0.5 M NaCl pH 7.6, débit : 0.5 ml/min,
gradient : 0 à 35 % B en 40 min). Temps de rétention : 24 à 29
min. CCM : Rf = 0.5, éluant : propanol : eau : NH4OH (6:3 :1,
v :v :v)
EXEMPLE 10: Synthèse de la [4-N-alkyl amino-5'-O-
triphosphate]-cytidine (27).
A la solution de (26) (0.2 mmole) dans l'eau (20 ml)
est ajouté de l'ammoniac aqueux (10 ml) et l'agitation maintenue
durant 1 heure. Le milieu réactionnel est évaporé à sec, puis
repris dans l'eau (20 ml) suivi de l'acide trifluoroacétique
aqueux à 50 % (10 ml) et l'agitation maintenue pendant 30 min.
Le milieu réactionnel est de nouveau évaporé puis co-évaporé à
sec avec l'eau. Le composé désiré est purifié et dessalé par
HPLC. HPLC analytique : temps de rétention : 17 à 20 min.
Purification : colonne préparative Protein Pack 8 HR DEAE 10 x
100 mm, mêmes tampons et gradient utilisés dans l'exemple 9,
débit 2 ml/min. Dessalage : colonne RP 18, tampon A : eau,
tampon B : méthanol. CCM : Rf = 0 .2, éluant : propanol : eau
NH40H (4 : 5 :1, v :v :v)
II- Synthèse des nucléotides triphosphates modifiés en position
4 par la présence d'une chaîne alkyloxyaminée
Dans un premier temps, on a introduit une chaîne
alkyle, hydroxylée à son extrémité, par substitution nucléophile
du groupe tosyle en position 4 de la cytidine. Ensuite, nous
avons réalisé la réaction de Mitsunobu entre la fonction
hydroxyle de la chaîne introduite et la N-phtalamido-
hydroxylamine.
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34
L'obtention du nucléotide triphosphate alkyloxyaminé
correspondant suit les mêmes étapes de synthèse que celles des
nucléotides triphosphates alkylaminés (Figure 2).
EXEMPLE 11: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-ol-2',3'-O-
isopropylidène-5'-t-butyldiméthylsilyl-cytidine (28).
A une solution de (23) (1 mmole) dans le
dichlorométhane (5 ml) est ajouté à température ambiante et sous
argon, le 6-amino-hexanol (5mmoles, 5 éq.) . Après 30 min de
réaction le solvant est évaporé à sec, et le composé (28) est
purifié par chromatographie sur gel de silice.
EXEMPLE 12: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-N-
phtalamido-oxyamino-2',3'-O-isopropylidène-5'-t-
butyldiméthylsilyl]-cytidine (29).
A la solution de (28) (1 mmole) en présence de la
triphénylphosphine (3 mmoles, 3 éq.) et de la N-phtalamido-
hydroxylamine (3 mmoles, 3 éq.) dans le THF (10 ml) est ajouté
le diéthyle azodicarboxylate (le DEAD, 3 mmoles, 3 mmoles, 3
éq.) à température ambiante et sous argon. Après une heure
d'agitation, le solvant est évaporé à sec et le composé (29) est
purifié par chromatographie sur gel de silice.
EXEMPLE 13: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-N-
phtalamido-oxyamino-2',3'-O-isopropylidène]-cytidine (30).
Le composé (30) a été synthétisé selon le protocole
décrit dans l'exemple 8.
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EXEMPLE 14: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-N-
phtalamido-oxyamino-2',3'-O-isopropylidène-5'-0-triphosphate]-
cytidine (31).
Le composé (31) a été synthétisé selon le protocole
5 décrit dans l'exemple 9. HPLC analytique (conditions dans
l'exemple 10) : temps de rétention : 44 min. CCM . Rf = 0.5,
éluant : propanol : eau : NH40H ( 6 :3 :1, v :v :v)
EXEMPLE 15: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-oxyamine-5'-
10 O-triphosphate]-cytidine (32).
Le nucléotide totalement protégé (32) totalement
protégé est déprotégé en 2',3' par l'acide trifluoroacétique
selon le protocole décrit dans l'exemple 10. La déprotection de
la fonction alkoxyamine est réalisée dans une solution aqueuse
15 de l'hydrazine pendant une nuit à température ambiante. Le
nucléotide (32) est ensuite purifié par HPLC dans les mêmes
conditions que celles décrites dans l'exemple 10.
EXEMPLE 16: Synthèse de la [4-N-(2,2-oxy-bis-
20 éthylamine)-5'-O-triphosphate] -cytidine (33) par
transamination.
La cytidine triphosphate (0.1 mmole) est ajoutée à la
solution composée du bisulfite de sodium (12 mmoles, 120 éq.) et
du chlorhydrate de la 2-2' oxy-bis-éthylamine (7.5 mmoles, 75
25 éq.) dans l'eau (2.5 ml) dont le pH a été préalablement ajusté à
7.0 par une solution de soude à 10 M, l'agitation étant
maintenue à 37 C pendant 3 jours. Le composé (33) est purifié et
dessalé par HPLC (voir conditions HPLC dans l'exemple 10).
30 EXEMPLE 17: Synthèse de la [4-N-(acide adipique-
hydraz ide) -5'-O-triphosphate] -cytidine (34) par transamination.
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Le nucléotide (34) a été préparé par transamination
selon le protocole décrit dans l'exemple 16, en utilisant
l'acide adipique dihydrazide (83mg, 0,44moles) pour
l'introduction de la fonction hydrazide. Sa purification et son
dessalage ont été aussi réalisés selon l'exemple 10, sa
structure a été confirmée par RMN du proton.
IV- Fluorophore fonctionnalisé:
EXEMPLE 18 : Synthèse de fluorescéine-aldéhyde (36).
Voie de synthèse
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HO O O
+ H2N 0,-/
i I COOH 0\/
NCS
DMF
HO O O
COOH
HN O_../
O
CH3COOH 30%
HO O O
COOH
36 HN
O H
Couplage du FITC avec l'aldéhyde protégé
5
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38
HO O O
COOH
HN O-Y
O O,-.-
L'isothiocyanate de fluorescéine (913 mg, 2,35 mmol,
Aldrich, F 250-2) est dissous dans du DMF anhydre (10 ml), sous
argon. On ajoute alors l' aminobutylaldéhyde diéthylacétal (421
5 mg, 392 ml, 235 mmol). Au bout d'une heure le DMF est évaporé et
le résidu est chromatographié sur gel de silice (éluant : CH2C12
/MeOH : 90/10, v/v). Après évaporation du solvant on obtient le
produit (35) sous forme d'une poudre orange (1,21 g, 2,2 mmol,
94 %). Il a été caractérisé par RMN du proton et par
10 spectrométrie de masse.
Déprotection de l'aldéhyde
HO O O c 1
COOH
36 HN
O H
Le produit protégé (35) (342 mg, 0,62 mmol) est placé
15 dans 20 ml d'une solution aqueuse d'acide acétique à 30 01. Après
une heure de réaction on évapore le solvant et on co-évapore
avec de l'acétonitrile. Le résidu obtenu est chromatographié sur
gel de silice (éluant CH2C1-. /MeOH - 90/10, v/v) . Après
évaporation du solvant on obtient le produit (36) sous forme
20 d'une poudre orange (145 mg, 0,30 mmol, 48 9.). Il a été
caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.
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EXEMPLE 19 Synthèse chimique d'un polynucléotide
préfonctionnalisé.
Synthèse du nucléoside de départ 2'-désoxy-8-
(pentényl)-thioadénosine (38):
La synthèse du nucléoside de départ a été réalisée en
utilisant le précurseur 2'-désoxy-8-mercaptoadénosine (37)
obtenu selon la stratégie décrite par A. LAAYOUN, J.-L. DECOUT
et J. LHOMME dans Tetrahedron Lett., 1994, 35, 4989-4990.
NH2 NH2
N N
SH S
N N
Br
O
HO O HO--~
K2CO3, DMF
37 38
OH OH
Le 2'-désoxy-8-mercaptoadénosine (16,68 mmol) est
dissous dans du DMF (Diméthyl formamide) anhydre en présence
d'un excès de carbonate de potassium (33,00 mmol). Après
addition sous argon de 1-bromopent-4-ène (18,37 mmol) et une
incubation de trois heures sous agitation à température
ambiante, les sels minéraux sont filtrés sur célite et la DMF
est évaporée. Un résidu marron est obtenu et lavé à l'hexane
puis à l'éther éthylique. Le produit est ensuite purifié par
chromatographie sur colonne de silice (éluant: CH2C12/CH3OH -
95/5(v/v) puis 90/10(v/v)). Le nucléotide de départ ainsi obtenu
est caractérisé par les méthodes spectroscopiques usuelles.
Synthèse chimique d'un polynucléotide préfonctionnalisé:
Dans un premier temps, le nucléoside synthétisé
précédemment est incorporé dans un oligonucléotide. A cet effet,
un synthon phosphoramidite (39) correspondant au nucléoside de
départ, protégé, a été préparé selon la stratégie décrite par A.
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J. ROGERS dans "Oligonucleotide synthesis" (1984), p23-34, M.J.
GAIT Ed., IRL Press, Oxford.
NH.Bz
N N
N N
O
DMT-0--~
39
NC- O-PlN_iPr
iPr
5 Bz = Benzoyl
DMT = diméthoxytrityl
L'amine exocyclique de l'adénine est protégée par un
groupement benzoyle, l'hydroxyle en 5' est protégé par le
10 diméthoxytrityle et l'hydroxyle en 3' par le groupement N,N-
diisopropyl-2-cyanoéthylphosphoramidite.
Le polynucléotide 5'CGCACLCACGC 3', dans lequel L est
la 2'-désoxy-8-(pentényl)-thioadénosine, a été synthétisé sur un
15 appareil Milligen/Biosearch 8700 selon la méthode au
phosphoramidite par voie automatique conformément au protocole
proposé par le constructeur.
La purification du polynucléotide synthétisé est
réalisée par HPLC en phase inverse (colonne semi-préparative
20 Macherey Nagel 10 mm x 25 cm; C18; 5 )um de porosité; éluant:
gradient de 20 min de 0 à 30% d'acétonitrile en mélange avec une
solution aqueuse d'acétate d'ammonium 0,1 M à pH 6) . Les
fractions contenant le polynucléotide sont collectées et
lyophilisées.
25 Après traitement de l'oligonucléotide par de l'acide
acétique (80% dans l'eau) pendant 10min à température ambiante,
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la position 5' du polynucléotide est détritylée puis isolé après
extraction à l'éther.
Dans un second temps, le nucléotide L incorporé à
l'étape précédente est activé de façon à obtenir le
polynucléotide diol 5'CGCACMCACGC 3', dans lequel
NH2
N N
~--5 OH
N N OH
M = 0-
0
340 nmol de polynucléotide 5'CGCACLCACGC 3' sont
traités avec une solution composée de 170 l de tétroxyde
d'osmium 0,02%, 2 l de N-méthylmorpholine-N-oxyde et de 2 l de
H202 3%. Après une incubation d'une nuit à température ambiante,
le polynucléotide 5'CGCACMCACGC 3' est purifié par HPLC selon
les conditions décrites précédemment.
Enfin, le polynucléotide aldéhyde 5'CGCACNCACGC 3'
dans lequel
NH2
N N
S
N N O
N= 0
est obtenu en ajoutant à l'obscurité 200 pl du
métapériodate de sodium 54 M à 200 l d'une solution aqueuse
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110 nM d'oligonucléotide diol 5'CGCACMCACGC 3'. Après 15 min, le
polynucléotide aldéhyde 5'CGCACNCACGC 3' est purifié par HPLC
(colonne semi-préparative Macherey Nagel 10 mm x 25 cm; C18; 7
m de porosité; éluant: gradient de 20 min de 0 à 30'-~; de
méthanol en mélange avec une solution aqueuse de
dihydrogénophosphate de sodium 20mM à pH6).
EXEMPLE 20 Marquage du polynucléotide
préfonctionnalisé obtenu a l'exemple 19 :
La réaction de marquage est réalisée à l'aide du
réactif (40) consistant en un noyau dansyle comme groupement
fonctionnel fluorescent lié par l'intermédiaire d'une chaîne
diéthylène glycol à une fonction oxyamine (nucléophile) . Ce
réactif a été préparé selon la méthode décrite D. BOUTURYN et
al. Dans Tetrahedron, 1997, 53, 5485-5492.
O= S= O
40 HN' O O 0 NH2
La réaction de marquage est réalisée dans l'eau en
présence d'un léger excès de réactif (40) (1,5 équivalent) par
rapport à l'oligonucléotide. Le suivi de la réaction par HPLC
indique une disparition rapide des produits de départ et la
formation d'un nouveau produit correspondant au polynucléotide
fonctionnalisé (41). L'analyse du spectre de RMN du proton
confirme par ailleurs l'accrochage du marqueur dansyle.
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NH2
N N SN-O
N N O
O 0
O
NH
0 41 0= i=0
--J~ Ç)~ :D
N
EXEMPLE 21 : Synthèse enzymatique d'un polynucléotide
préfonctionnalisé par transcription.
Synthèse du nucléotide préfonctionnalisé: 21-désoxy-8-
(butanal)-thioadénosine-5' triphosphate (43):
Cette synthèse est réalisée en utilisant le 2'-désoxy-
8-(pentényl)-thioadénosine (38) (voir Exemple 19). Le nucléotide
de départ (42) est obtenu selon la méthode décrite par J. LUDWIG
et F. ECKSTEIN dans J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635.
NH2
IN N
N N
O Q O
HO-P-O-P-O-P-O
O 0
3Na+ 42
OH
Les étapes d'oxydation nécessaires à l'obtention du
nucléotide préfonctionnalisé 43 sont réalisées comme indiqué
dans l'Exemple 19 :
Incorporation enzymatique du nucléotide
préfonctionnalisé (43):
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44
a) Préparation de la matrice ADN portant un promoteur
Une PCR est réalisée sur le gène HIVgag porté dans un
plasmide pGEM linéarisé, en utilisant un primer classique, et
une amorce portant la séquence sens d'un promoteur pour l'ARN
polymérase du phage T7 en amont d'une séquence d'amorce
classique.
Séquence des amorces
Amorce classique (n 4014) .
5'- AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA 3'
Amorce promoteur(n 4003):
5'AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCA- 3'
On obtient un produit de 158 paires de bases, qui est
purifié par extraction phénol/chloroforme et passage sur
microcon 30.
b) Réaction de transcription :
Les réactions de transcription sont réalisées en tubes
Eppendorf dans un volume final de 25 l, dans un tampon 40 mM de
Tris/HC1, pH 8,1, 20 mM de MgCl2, 5 mM de Dithiotreitol, 1 mM de
spermidine, 8% de polyéthylène glycol, 0,01% de Triton X 100, 50
gg/ml de d'albumine de sérum bovin. Le nucléotide
préfonctionnalisé (43) et les quatre ribonucléotides (CTP, GTP,
ATP, UTP) sont ajoutés respectivement à la concentration de
1,33 mM et 4 mM chacun. La matrice PCR est ajoutée à la
concentration de 109 copies/ l, et l'ARN polymérase du phage T7
(Demande de brevet FR 97 04166) à la concentration de 1 u/ l. La
réaction est incubée durant 60 min à 37 C. 0,5 u/pl de DNAse 1
sont ajoutés au milieu afin de détruire la matrice ADN.
L'échantillon est incubé à 37 C continue pendant 15 min. Les ARN
obtenus sont purifiés par un passage sur Sephadex G50.
En parallèle, un premier contrôle est effectué avec
une réaction sans addition de T7 ARN polymérase. Un second
contrôle est réalisé sans nucléotide activé, comme témoin de la
transcription.
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Les produits de transcription purifiés sont marqués
selon le mode expérimental décrit à l'Exemple 2 et visualisés
sous lampe ultra violette après migration électrophorétique en
gel d'agarose.
5
EXEMPLE 22 Synthèse d'un polynucléotide
préfonctionnalisé au cours d'une réaction d'amplification TMA.
Pour permettre le marquage intense des produits
10 d'amplification TMA, on incorpore des nucléotides
préfonctionnalisés 27a (CTP-(N4)-C602-NH2), 27b (CTP-(N4)-C4-
NH2), 32 (CTP- (N4) -C6-ONH2) , dans les amplicons. Des réactions
d'amplification sont menées en parallèle en présence d'un
nucléotide marqué portant une fluorescéine, l'UTP-12-
15 fluorescéine (Boerhinger, ref 1 427 857.
Les nucléotides préfonctionnalisés 27a, 27b, 32, et
à titre de comparaison, le nucléotide marqué de Boerhinger,
ref 1 427 857, sont testés pour leur incorporation dans les
produits de la réaction d'amplification TMA, selon les kits
20 Gen-Probe amplified TM MTD2 (amplified Mycobacterium
tuberculosis direct test). Cette réaction permet
l'amplification d'un fragment de 136 bases de l'ARN 16S des
mycobactéries. Elle utilise quatre activités enzymatiques (ARN
polymérase ADN dépendante, ADN polymérase ADN dépendante, ADN
25 polymérase ARN dépendante, et ribonucléaseH) et deux enzymes,
la T7 ARN polymérase, et la transcriptase inverse AMV. Par des
réactions récurrentes impliquant des étapes de transcription,
de reverse transcription, et de digestion de l'ARN contenu
dans les double brin ADN:ARN, qui ressemblent à un cycle de
30 réplication des virus à ARN, cette réaction permet
l'amplification spécifique d'une séquence d'acide nucléique
reconnue par deux amorces (une amorce simple et une amorce
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contenant le promoteur de la T7 ARN polymérase) . Le facteur
d'amplification est très important (109) et la sensibilité
très bonne (1 à 10 copies). Les produits obtenus sont pour 90%
des ARN simple brin, et pour 10% des ADN double brin.
On réalise les réactions d'amplification à partir de
106 copies d'ARN 16S de Mycobacterium tuberculoses. Cet ARN
cible est préalablement obtenu et quantifié selon la méthode
suivante: le gène de l'ARN 16S est cloné dans un plasmide,
sous le contrôle d'un promoteur. Par transcription in vitro,
on obtient l'ARN 165. Celui ci est purifié par extraction au
phenol-chlorof orme, et filtration sur microcon 30 TM (Amicon).
Il est dosé par son absorption à 260 nm.
Les réactions TMA classiques contiennent 4 mM de
chacun des rNTP naturels (ATP, CTP, GTP et UTP). Pour
l'incorporation des nucléotides préfonctionnalisés dans les
produits d'amplification, la réaction est effectuée en
incluant un de ces nucléotides modifiés dans le tampon
réactionnel. On étudie la réaction en présence de différents
rapports de concentrations entre le nucléotide modifié et le
nucléotide naturel, tout en gardant à 4 mM la concentration
totale de chaque nucléotide de la même série, modifié ou
naturel. Les rapports étudiés sont 0 %, 10 %, 30 %, 50 % et 70
% (sauf pour l'UTP-fluorescéine, pour lequel on n'a pas pu
tester 70 %) . On effectue un contrôle négatif, consistant en
une réaction comportant tous les réactifs, dont le plus haut
rapport de nucléotides modifiés utilisé (70 ou 50 %), sauf les
enzymes (remplacées par le tampon de reprise des enzymes
lyophilisées).
Les réactions d'amplification sont analysées par
électrophorèse de 5 l de réaction sur gel de polyacrylamide
dénaturant (6% acrylamide, 7M urée, iX TBE, appareil
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d'électrophorèse bioRad, 170 volts, 45 minutes) et coloration
au bromure d'ethidium, puis par Northern. Les acides
nucléiques sont transferés sur membrane (Nylon N, appareil de
transfert semi-sec de bioRad, 0,5 X TBE, 25V, 15 minutes) et
hybridés avec des sondes nucléiques spécifiques de
Mycobactérium tuberculoses:
(séquence : 5'-CGGGATGCATGTCTTGTGGT)
marquées à la péroxydase (préincubation à 37 C durant 30
minutes en PEG, puis incubation à 37 C durant lheure en
présence de PEG contenant 0,1 ng/ l de sonde péroxydase). La
révélation est colorimétrique (substrat Diaminobenzidine,
sigma).
Pour les réactions contenant le nucléotide
fluorescent (UTP-12-fluorescéine), on visualise aussi les
produits d'amplification sur gel avant coloration au bromure
d'ethidium par excitation de la fluorescéine sur une table
ultraviolet.
Pour toutes les réactions, y compris celles incluant
les nucléotides préfonctionnalisés, on visualise après
coloration au bromure d'éthidium les produits d'amplification
attendus, en grande quantité. Après Northern, ces produits
s'hybrident avec la sonde spécifique.
EXEMPLE 23 : Analyse des rendements d'incorporation
dans les produits d'amplification TMA.
Pour évaluer la préfonctionnalisation des amplicons
obtenus en présence des nucléotides préfonctionnalisés 27a
(CTP- (N4) -C602-NH2) , 27b (CTP- (N4) -C9-NH2) , et à titre de
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comparaison, du nucléotide marqué UTP-12-fluorescéine
(Boerhinger, ref 1 427 857), on détermine le rapport entre le
nucléotide préfonctionnalisé incorporé, et le nucléotide
naturel analogue.
Les produits d'amplification obtenus lors de la
réalisation de l'exemple 22 sont séparés des nucléotides en
excès dans la réaction par filtration sur Microcon 30 TM (de
chez Amicon), et repris dans 50 l d'eau. Pour l'amplification
en présence d'UTP-12-fluorescéine, la purification est
effectuée sur sephadex G50 (absorption de la fluorescéine sur
Microcon).
Ils sont ensuite dosés pour leur absorption à 260 nm
(le contrôle sans enzyme doit avoir une concentration très
faible).
Pour les réactions d'amplification incluant les
nucléotides préfonctionalisés (et leurs contrôles), on procède
ensuite à une étape de digestion des acides nucléiques
jusqu'au stade nucléoside :
5 1014 copies de produits d'amplification (environ 35
g) sont dilués dans un volume final de 86 l d'eau (pour le
contrôle sans enzyme, un volume égal au volume d'échantillon
le plus important est utilisé). On rajoute 10 l de tampon 10X
pour la nucléase Pl (tampon CH3COONa pH 5,3, 300mM, 1 mM
ZnSO4) et 4 l de nucléase Pl (Boerhinger, ref 236225, l g/ l,
0,3u/ l). La réaction est incubée à 37 C durant 30 minutes.
On ajoute ensuite 12 l de tampon 10X pour la phosphatase
alcaline (Boerhinger, ref 1246283) et 1 l de phosphatase
alcaline (Boerhinger, ref 713023, 1U/ l), et l'incubation à
37 C est continuée durant 15 minutes. La réaction est arrêtée
dans la glace.
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La composition en nucléosides est alors déterminée
par analyse sur chromatographie liquide haute pression (HPLC,
Beckman, système Gold), et par comparaison à des standards
nucléosides (injection de 50 ng de chaque nucléoside) . On
injecte 20 l de la digestion sur colonne C18 (Ultrasphere),
chauffée à 45 C. La séparation est effectuée en tampon sodium
phosphate 50 mM pH 7, comportant un gradient de méthanol (au
bout de 10 minutes, passage en 15 minutes de 0% à 30% de
méthanol à 95%). Les pics sont visualisés par absorption à 254
nm, et les aires des pics sont calculées par intégration.
Le rapport entre l'aire du pic du nucléotide
préfonctionnalisé, et celui de son analogue naturel permet de
déterminer le rendement d'incorporation, c'est à dire le
rapport entre la quantité de nucléotide préfonctionnalisé
incorporé et la quantité totale de nucléotide de la même série
incorporée.
Le contrôle sans enzyme ne doit pas donner lieu à
l'apparition de pic. Ce contrôle témoigne de la bonne
efficacité de l'étape d'élimination des nucléotides en excès.
Pour les réactions d'amplification incluant l'UTP-
fluorescéine, la quantité de nucléotide fluorescéine incorporé
est mesurée par l'intensité de fluorescence : la lecture de
l'intensité de fluorescence d'une gamme étalon de fluorescéine
est effectuée sur un spectrofluorimètre Perkin LS 50.
L'intensité de fluorescence des différentes réactions
d'amplification est mesurée. Par comparaison avec la courbe
d'étalonnage, on détermine la quantité de fluorescéine
incorporée. On calcule le rendement d'incorporation par
rapport à la concentration en amplicons mesurée par absorption
à 260 nm.
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L'analyse HPLC permet de séparer les huit
nucléosides naturels, ainsi que les trois nucléosides
analogues aux trois nucléotides préfonctionnalisés testés.
Les résultats, présentés dans le tableau ci-dessous
5 montrent que tous les nucléotides CTP préfonctionnalisés
étudiés ont un meilleur rendement d'incorporation dans les
produits d'amplification TMA que l'UTP-12-fluorescéine,
nucléotide marqué classiquement utilisé.
% [nucl.préfonctionnalisé] / 70 50 30 10 0
[nucl. naturel]
27a (CTP-(N4)-C602-NH2)/CTP naturel 1/3 1/5 1/9 1/33 0
27b (CTP-(N4)-C4-NH2)/CTP naturel 1/6 1/15 1/48 ND 0
Boerhinger, ref 1 427 857 ND 1/30 1/45 1/200 0
(UTP-12-fluorescéine)/ CTP naturel
10 ND : non déterminé. Nucl. : nucléotide
Ces résultats montrent que la préfonctionnalisation
du nucléotide CTP permet une meilleure incorporation que le
marquage avec une fluorescéine. La très bonne
préfonctionnalisation des amplicons permet d'obtenir, après
15 fonctionnalisation, un marquage plus intense qu'avec le
nucléotide fluorescéine.
De même, d'autres fonctions réactives intoduites sur
la position N4 de la cytidine, telle que la fonction oxyamine
du nucléotide 32, permettent un meilleur rendement
20 d'incorporation.
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EXEMPLE 24: Analyse de l'impact de l'incorporation
des nucléotides préfonctionnalisés sur la sensibilité TMA.
Pour étudier la sensibilité de la TMA incluant
l'incorporation de nucléotides préfonctionnalisés, on a
effectué la TMA à partir de quantités décroissantes de cible
(ARN 16 S de Mycobacterium tuberculosis, décrit dans l'exemple
22) (10 000, 1 000, 100, 10 et 0 copies) , en présence de
différents rapports entre le nucléotide préfonctionnalisé et
son analogue naturel (100%, 70%, 50% 30% 10% 0%) . Les mêmes
nucléotides préfonctionnalisés sont testés, 27a (CTP-(N4)-
C602-NH2) , 27b (CTP- (N4) -C4-NH2) .
Les produits réactionnels sont étudiés entre autre
par la méthode décrite dans l'exemple 22.
Les produits réactionnels sont aussi analysés de
façon semi-quantitative par ELOSA (PCT WO 92/19812), et
comparaison de l'intensité des signaux avec ceux de gammes
étalons.
Les réactions effectuées en présence de
nucléotide(s) préfonctionnalisé(s) sont analysés par
électrophorèse et coloration, Northern, et ELOSA. Les
résultats obtenus en ELOSA, qui sont représentatifs des
différentes méthodes analytiques utilisées, sont représentés
aux figures 4 et 5. Quelque soit le nucléotide
préfonctionnalisé utilisé (27a, 27b) on peut déterminer une
concentration en nucléotide(s) préfonctionnalisé(s) telle que
la sensibilité de la réaction TMA ne soit pas affectée de
manière significative, même avec un très faible nombre de
copies de cible initiale. Comme cela ressort plus
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spécifiquement de la figure 5 annexée le nucléotide 27b peut
remplacer le nucléotide naturel.
EXEMPLE 25 : Marquage des amplicons
préfonctionnalisés :
Les amplicons préfonctionnalisés obtenus par la
méthode utilisée lors de la réalisation de l'exemple 22 , en
présence du nucléotide préfonctionalisé, 27b (CTP-(N4)-C4-
NH2), sont marqués par une réaction chimique de couplage entre
la fonction nucléophile portée par les amplicons et amenée par
les nucléotides préfonctionnalisés incorporés, et une fonction
anti-réactive électrophile préalablement couplée à la
fluorescéine. Le marquage ainsi obtenu est comparé à celui
obtenu en présence du nucléotide marqué UTP-12-fluoresceine
(Boerhinger, ref 1 427 857).
Les amplicons sont obtenus par la méthode décrite
dans l'exemple 22 à partir de 106 copies de cible ARN 16S de
Mycobacterium tuberculosis, et en présence de 50% de
nucléotide préfonctionalisé 27b.
Les amplicons obtenus sont couplés à la
fluorescéine-NHS (Boerhinger 8370042128), selon la méthode
suivante : 30 i de produits d'amplification TMA sont mélangés
avec 30 l de tampon carbonate 0,2M, NaCl 0,15 M, à pH8,8, et
40 l (environ 200 équivalents) de fluorescéine NHS (3,5 mg/ml
en DMSO). Après agitation durant une heure à température
ambiante, le marquage est analysé.
Les amplicons marqués (15 .il) sont analysés par
électrophorèse sur gel comme décrit dans l'exemple 22, et
visualisés sous ultraviolet, avant et après coloration au
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bromure d'ethidium. Les profils sont comparés avec ceux
obtenus par marquage en présence de 50 % d'UTP-12-
fluorescéine.
Les signaux obtenus sans coloration sont plus
intenses que ceux obtenus par marquage direct à la
fluorescéine. En utilisant la fonction oxyamine telle que
portée par le nucléotide 32, un résultat aussi bon sera
possible après couplage avec le fluorophore 36. La réactivité
du couple oxyamine aldéhyde permet des temps de couplage
réduits comme montré dans l'exemple 20.
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53a
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: CHEMIN DE L'ORME
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Procédé d'amplification d'une séquence
d'un acide nucléique cible
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3
(iv) ADRESSE DE CORRESPONDANCE:
(A) NOM: Swabey Ogilvy Renault
(B) ADRESSE: 1981 McGill College, Suite 1600
(C) VILLE: Montréal
(D) ÉTAT: Québec
(E) PAYS: Canada
(F) CODE POSTAL: H3A 2Y3
(v) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Disquette
(B) ORDINATEUR: Compatible IBM
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: Windows 95
(D) LOGICIEL: WORD 97
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: 2,262,019
(B) DATE DE DEPOT: 1-AOUT-1997
(vii) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: PCT/FR97/01445
(B) DATE DE DEPOT: 1-AOUT-1997
(vii) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 96/09977
(B) DATE DE DEPOT: 2-AOUT-1996
(viii) INFORMATIONS CONCERNANT L'AGENT:
(A) NOM: COTÉ, France
(B) NUMÉRO D'INSCRIPTION: 4166
(C) NUMÉRO DE RÉFÉRENCE: 8708-217 FC/ntb
(ix) INFORMATION DE TÉLÉCOMMUNICATION:
(A) TÉLÉPHONE: (514) 845-7126
(B) TÉLÉCOPIE: (514) 288-8389
(C) TÉLEX:
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
CA 02262019 1999-07-26
53b
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 11 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE/
(A) NOM/CLE : caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT : 6
(D) AUTRES INFORMATIONS : A représente 2'-désoxy-8-(pentényl)-
thioadénosine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
CGCACACACG C 11
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 11 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(ix) CARACTERISTIQUE/
(A) NOM/CLE : caractéristique particulière
(B) EMPLACEMENT : 6
(D) AUTRES INFORMATIONS : A représente M défini dans la
description page 41 lignes 7-9
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CGCACACACG C 11
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAA 29
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 54 paires de bases
CA 02262019 1999-07-26
53c
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGTGCTA TGTCACTTCC CCTTGGTTCT CTCA 54
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CGGGATGCAT GTCTTGTGGT 20
