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POLYPEPTIDE CAPABLE DE REA(;IR AVEC LES ANTICORPS DE
PATIENTS ATTEINTS DE SCLER08E EN PLAQUES ET UTILISATIONS
La présente invention concerne la détermination de
polypeptides immunoréactifs, capables de réagir
spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de
sclérose en plaques (SEP), et l'utilisation de ces
polypeptides.
La Demanderesse a défini un polypeptide capable de
réagir spécifiquement avec les anticorps de patients
atteints de sclérose en plaques, et qui doit en outre
répondre à au moins l'une quelconque des définitions
suivantes, à la condition que ledit polypeptide soit
différent des polypeptides ayant l'une des séquences
suivantes . SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22,
SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25,
SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 .
- sa séquence peptidique comprend au moins une
séquence choisie parmi SEQ ID No: 1 à SEQ ID NO: 19, et
leurs séquences équivalentes ;
- sa séquence peptidique consiste en une séquence
choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs
séquences équivalentes ; de préférence, elle est choisie
parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: l0, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12,
SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 et
SEQ ID NO: 19 ;
- il comprend une séquence équivalente à
SEQ ID NO: il, ladite séquence équivalente présentant pour
une suite de 8 acides aminés contigus au moins 35 % (ce
.. qui correspond à au moins 3 acides aminés), de préférence
50 % (ce qui correspond à au moins 4 acides aminés),
d'identité, et/ou au moins 60 % (ce qui correspond à
environ au moins 5 acides aminés), de préférence 75 % (ce
qui correspond à au moins 6 acides aminés), d'homologie
avec une séquence de la protéine SAT3 du virus de la
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fièvre aphteuse, ledit polypeptide étant différent de tout
ou partie de ladite protéine SAT3 ;
- il comprend une séquence équivalente â
SEQ ID NO: 13 présentant pour une suite de 12 acides
aminés contigus au moins 40 %, de préférence 50 %,
d'identité, et/ou au moins 55 %, de préférence 65 %,
d'homologie avec une séquence p30/p10/5'v-fsm de la région
codante du virus du sarcome félin (FSV) [référence NCBI
gi/554646], ledit polypeptide étant différent de tout ou
partie de ladite séquence p30/p10/5'v-fsm.
Par ailleurs, les travaux de la Demanderesse, dans
la recherche d'une étiologie de la SEP, l'ont conduite à
la découverte de l'existence d'au moins un agent
pathologique et/ou infectant, le rétrovirus MSRV-1,
notamment associé à la sclérose en plaques.
Les techniques de culture et de détection de
matériel rétroviral mises en oeuvre dans les travaux
réalisés par la Demanderesse sur un agent associé à la
sclérose en plaques (SEP) sont décrites dans les demandes
de brevet français 92 04322, 92 13447, 92 13443, 92 01529,
94 01530, 94 01531, 94 01532 et dans la publication de H.
PERRON et coll. (Res. Virol. 1989 ; 140, 551-561) (dont le
contenu est incorporé par référence à la présente
description).
Ce rétrovirus peut étre issu d'une souche virale
choisie parmi les souches dénommées respectivement POL-2,
déposée le 22.07.1992 auprès de l'ECACC sous le numêro
d'accès V92072202, et MS7PG dêposée le 08.01.93 auprès de
l'ECACC sous le numéro d'accès V93010816, ou produit par
une lignée cellulaire choisie parmi les lignées dénommées
respectivement PLI-2 déposée le 22.07.1992 auprès de
l'ECACC sous le numéro d'accès 92072201, et LM7PC déposée
le 08.01.93 auprès de l'ECACC sous le numéro d'accès
93010817.
Parmi les polypeptides de l'invention, la
Demanderesse a déterminé un polypeptide (dénommé de façon
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générique, pxMSRV-1, dans la suite de la description)
capable de réagir spécifiquement avec au moins un liquide
biologique d'un patient chez lequel des séquences virales
de MSRV-1 ont été détectées. Selon l'invention, ce
polypeptide possède une séquence peptidique qui comprend
au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et leurs
sêquences équivalentes, ledit polypeptide étant différent
des polypeptides ayant l'une quelconque des séquences
suivantes . SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25.
De préférence, la séquence du polypeptide pxMSRV-1
consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou
SEQ ID NO: 4.
Avant d'exposer l'invention plus en détails, on
définit ci-aprës différents termes employés dans la.
description et les revendications.
Par "polypeptide", on désigne un peptide, à l'état
isolé, présentant un enchainement d'un nombre variable
d'acides aminés, tel qu'un oligopeptide, une protéine, une
protéine de fusion, un peptide de fusion, un peptide de
synthèse. Un polypeptide peut être obtenu par différentes
techniques bien connues de l'homme du métier, et notamment
par synthèse chimique ou par des techniques de
recombinaison génétique. Les polypeptides selon
l'invention peuvent être obtenus par des méthodes de
synthèse classique, par exemple avec un synthétiseur
automatique de peptides, ou par les techniques de~ génie
gênêtique comprenant l'insertion d'une séquence d'ADN
codant pour ledit polypeptide dans un vecteur d'expression
tel qu'un plasmide ou un virus, et la transformation de
cellules avec ce vecteur d'expression et culture de ces
cellules.
Un polypeptide de l'invention comporte
avantageusement au plus 50 acides aminés,
préférentiellement au plus 30 acides aminés, ou mieux
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encore au plus 20 acides aminés, voire au plus 15 acides
aminés.
Par "séquence peptidique équivalente à une
séquence peptidique de référence, on entend une séquence
d'acides aminês modifiée par insertion et/ou délétion
et/ou substitution et/ou allongement et/ou
raccourcissement et/ou modification chimique d'un ou
plusieurs acides aminés, pour autant que ces modifications
préservent substantiellement voire , développent les
propriétés immunoréactives de ladite séquence peptidique
de référence. Avantageusement, ladite séquence équivalente
prêsente, pour au moins une suite de 6 acides aminés, un
pourcentage d'identité d'au moins 40 %, préférentiellement
d'au moins 50 %, ou mieux encore d'au moins 60 % voire
70 %, avec ladite séquence de référence. Ce pourcentage
d'identité est calculé selon les étapes suivantes . on
compare une suite de 6 acides aminés contigus de la
séquence analysée avec une suite de 6 acides aminés
contigus de la séquence de référence, on détermine les
acides aminés communs entre la séquence analysée et la
séquence de référence, localisés en même position, et on
déduit le pourcentage d'identité.
Ainsi on entend par "séquence équivalente",
notamment les séquences dans lesquelles un ou plusieurs
acide aminé est substitué par un ou plusieurs autres
acides aminés ; les séquences dans lesquelles un ou
plusieurs acide aminé de la série L est remplacé par un
acide aminé de la série D, et vice-versa ; les séquences
dans lesquelles on a introduit une modification des
chaines latérales des acides aminés, telle qu'une
acétylation des fonctions amines, une carboxylation des
fonctions thiols, une estérification des fonctions
carboxyliques ; une modification des liaisons peptidiques .
telles que par exemple des liaisons carba, rétro, inverso,
retro-inverso, réduites et méthylène-oxy.
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L'équivalence d'une séquence peptidique par
rapport à une séquence peptidique de référence peut être
dëfinie par son identité ou son homologie, exprimée en
pourcentage, avec ladite séquence de référence. Ce
5 pourcentage est déterminé, pour une suite d'un nombre
donné d'acides aminés contigus, par alignement des deux
séquences, déplacement de l'une par rapport à l'autre, et
comparaison des acides aminés dans les deux séquences. Le
pourcentage d'identité est déterminé à partir du nombre
d'acides aminés qui sont identiques à des acides aminés de
la séquence de référence, dans la méme position. Le
pourcentage d'homologie est déterminé à partir du nombre
d'acides aminés qui sont équivalents à des acides aminés
de la séquence de référence, dans la même position. En
utilisant le programme BLAST (BLAST p matrix Blosum62)-
disponible publiquement (sur Internet, au National Center
for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, USA)
l'homme du métier est à même de savoir si la séquence
qu'il a retenue présente le pourcentage d'homologie requis
selon l'invention, par rapport â la séquence de référence.
Conformément au programme BLAST, deux acides aminés sont
équivalents s'ils possèdent des propriétés physico-
chimiques similaires, telles que hydrophilie, point
isoélectrique.
Par séquence virale du virus MSRV-1, on entend
notamment toutes les sêquences nucléotidiques décrites
dans les demandes de brevet français 92 04322, 92 13447,
92 13443, 92 01529, 94 01530, 94 01531, 94 01532,
95 09643, au nom de la Demanderesse.
Par fixation d'anticorps, on comprend la
- séparation, l'isolement, la détection et/ou la
quantification de ces anticorps, l'enrichissement d'une
fraction en anticorps, selon une méthode de fixation
spécifique ou aspécifique, de manière qualitative et/ou
quantitative.
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Par "polynucléotide", on entend soit une séquence
d'ADN, soit une séquence d'ARN, soit une séquence d'ADNc
résultant de la transcription inverse d'une séquence
d'ARN, d'origine naturelle ou de synthèse, avec ou sans
bases modifiées.
L'invention concerne en outre .
- un réactif pour la détection de la sclérose en
plaques chez un patient et/ou le suivi d'un patient
atteint de sclérose en plaques, comprenant au moins, ou
consistant en, un polypeptide capable de réagir
spécifiquement avec les anticorps de patients atteints de
sclérose en plaques {SEP) et dont la séquence peptidique
comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1
à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences équivalentes, ledit
poiypeptide étant éventuellement marqué ; ainsi qu'un kit.
comprenant ce réactif, ce dernier étant supporté sur un
support immunologiquement compatible avec ledit réactif ;
- un réactif pour la détection d'une infection par
le virus MSRV-l, comprenant au moins, ou consistant en, un
polypeptide pxMSRV-1 capable de réagir avec au moins un
liquide biologique d'un patient chez lequel des séquences
virales de MSRV-1 ont été détectées et dont la séquence
peptidique comprend au moins, ou consiste en, une séquence
choisie parmi SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 4, et leurs séquences équivalentes, ledit
polypeptide étant éventuellement marqué ; ainsi qu'un kit
comprenant ce réactif précité éventuellement supporté sur
un support immunologiquement compatible avec ledit
réactif ;
Avantageusement un réactif de l'invention comprend
au moins deux polypeptides différents tels que définis ci- -
dessus et notamment trois polypeptides tels que définis
ci-dessus. Dans une forme particulièrement préférée, un .
réactif comprend les trois polypeptides dont la séquence
peptidique de chacun consiste en SEQ ID NO: 12,
SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 16, respectivement.
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- un procédé pour la fixation, dans un échantillon
- biologique, d'anticorps caractéristiques et/ou spécifiques
de la sclérose en plaques, consistant â mettre en contact
- ledit échantillon avec un réactif de l'invention, et après
avoir éventuellement détecté la présence d'un complexe
immun, à séparer ce dernier ;
- un procédé pour la fixation, dans un échantillon
biologique, d'anticorps dirigés contre le virus MSRV-1,
comprenant les étapes consistant â mettre en contact ledit
échantillon avec un réactif de l'invention comprenant au
moins un polypeptide pxMSRV-1, et après avoir
éventuellement détecté la présence d'un complexe immun, à
séparer ce dernier ;
- selon une mise en oeuvre préférentielle d'un
quelconque des procédés de fixation de l'invention,
l'échantillon est choisi parmi le sérum, le liquide
cëphalo-rachidien et l'urine ;
- une composition immunothérapeutiquement active,
notamment préparation vaccinale, comprenant au moins un
polypeptide capable de réagir spécifiquement avec les
anticorps de patients atteints de sclérose en plaques
(SEP) et dont la séquence peptidique comprend au moins une
séquence choisie parmi SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et
leurs séquences équivalentes, et éventuellement un support
pour ledit polypeptide et/ou un excipient
pharmaceutiquement acceptable ;
- l'utilisation d'au moins un polypeptide capable
de réagir spécifiquement avec les anticorps de patients
atteints de sclérose en plaques (SEP) et dont la séquence
peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi
- SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 19, et leurs séquences
équivalentes, pour fixer dans un échantillon biologique
des anticorps caractéristiques et/ou spécifiques de la
sclérose en plaques, et l'utilisation d'au moins un
polypeptide pxMSRV-1 de l'invention pour fixer dans un
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échantillon biologique des anticorps dirigês contre le
virus MSRV-1 ; et
- un polynucléotide dont la séquence nucléotidique
comprend une séquence codant pour un polypeptide de r
l'invention.
L'invention exposée ci-dessus est à présent
illustrée dans les exemples 1 à 6 suivants à l'appui des
figures 1 à 7 selon lesquelles .
La Figure 1 représente la réponse en IgG du
polypeptide SEQ ID NO: 3 vis-à-vis de sérums humains, sur
un histogramme rassemblant les résultats exprimés en
valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le
tableau 2 annexé à la description ; le polypeptide est
testé en ELISA vis-à-vis de sérums dilués au 1/100 ; les
sérums SEP- correspondent à des sérums d'individus sains ;-
les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de
la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au
stade rémittent.
La Figure 2 représente la réponse en IgG du
polypeptide SEQ ID NO: 4 vis-à-vis de sérums humains, sur
un histogramme rassemblant les résultats exprimés en
valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le
tableau 3 annexê à la description ; le polypeptide est
testé en ELISA vis-â-vis de sérums dilués au 1/100 ; les
sérums SEP- correspondent à des sérums d'individus sains ;
les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de
la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au
stade rémittent.
La Figure 3 représente la séquence nucléotidique
et sa traduction en acides aminés du clone LB19 ; la suite
d'acides aminés commune avec SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 3
est soulignée ;
La Figure 4 représente la séquence nucléotidique .
partielle et sa traduction en acides aminés du clone GM3 ;
la suite d'acides aminés commune avec SEQ ID NO: 2 et
SEQ ID NO: 4 est soulignée ;
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La Figure 5 représente la réponse en IgM du
polypeptide SEQ ID NO: 8 vis-à-vis de sérums humains, sur
un histogramme rassemblant les résultats exprimés en
valeurs de densité optique (x 1000) et figurant dans le
tableau 4 annexé à la description ; le polypeptide est
testé en ELISA vis-à-vis de sérums dilués au 1/100 ; les
sérums SEP- correspondent à des sérums d'individus sains ;
les sérums SEP+ correspondent à des sérums de malades de
la SEP qui n'ont jamais été traités et qui sont tous au
stade rémittent.
La Figure 6 représente la réponse en IgM des LCR
vis-à-vis des phages exprimant les séquences SEQ ID NO: 14
(EPM), SEQ ID NO: 13 (FCP), SEQ ID NO: 16 (SRG),
SEQ ID NO: 17 (QSP), vis-à-vis du phage sauvage (sans
séquence exprimée) et d'une autre séquence non spécifique.
(RTG) ; cette représentation est donnée par un histogramme
rassemblant les résultats exprimés en valeurs de densité
optique obtenues pour chaque LCR diminuées de celles
obtenues avec des contrôles tampon PBS à la place des
phages ; l'immunoréactivité des clones de phages est
testée en ELiSA comme décrit dans l'exemple 2, vis-à-vis
de LCR dilués au 1/10 ; LCR 12 correspond à un patient
atteint d'une maladie neurologique autre que la SEP ;
LCR 4 et LCR 7 correspondent à deux malades atteints de
SEP.
La figure 7 représente la réponse en IgG des
polypeptides dont la séquence peptidique consiste en,
respectivement, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 12,
SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, et
SEQ ID NO: 15, vis-à-vis de LCR dilués au 1/10 ; les
- résultats rassemblés dans le tableau 5 annexé, sont
exprimés par la différence des valeurs de densité optique
- obtenues pour le polypeptide testé et les valeurs obtenues
pour le polypeptide VIH utilisé comme témoin ; ND
correspond à des malades atteints d'une maladie
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neurologique autre que la SEP, et SEP+ correspond à des
malades atteints de la SEP.
Exemple 1 Sélection d'hexapeptides capable de
5 réacxir spécificruement avec des sérums de malades atteints
de sclérose en Taques.
Dans un premier temps, une banque d'expression
d'hexapeptides a été construite dans un phage filamenteux
selon la méthode décrite par SCOTT et SMITH (1990,
10 Science, 249, 386-390). Cette banque est réalisée en
insérant ~un oligonucléotide synthétique au niveau d'un
gène codant pour une protéine phagique d'enveloppe
{protéine PIII) dont cinq copies sont présentes à la
surface du phage. Cet oligonucléotide consiste en une
séquence ayant un code dégénéré [(NNK)6] où NNK représente
un mélange égal des codons correspondants aux 20 acides
aminês et le codon stop Amber. Cette banque d'expression
permet d'obtenir à la surface du phage, cinq copies d'une
protéine fusionnée (PIII - hexapeptide). Le site
d'insertion de l'hexapeptide dans la séquence de la
protéine PIII correspond à la séquence .
NHZ Ala Asp Gly Ala [hexapep] Gly Ala Ala Gly Ala Glu Thr Val Glu COOH
Dans un second temps, le fond d'une boite de Pétri
de 35 mm de diamètre est traité avec 1 mi d'une solution
de streptavidine à la concentration de 10 ~g/ml dans du
NaHC03 O,1M et incubé pendant une nuit à 4°C. Après
élimination de-la solution de streptavidine, une solution
de O,1M NaHC03, 0,1% de sêrum albumine bovine (BSA),
0,1 ~Cg/ml de streptavidine et 0,02% de NaN3 est ajoutée
afin de saturer les sites de liaison non spécifiques et
l'ensemble est incubé pendant 2 heures à température -
ambiante. La boite de Pétri est lavée 6 fois avec du
tampon TBS {tampon Tris 0, iM pH 7, 2) / Tween 0, 5 % et 10 ~Cg _
d'antiimmunoglobulines humaines totales biotinylées
(Southern Biotechnology Associates Inc.) sont ensuite
ajoutées et incubées 4 heures à 4°C. Après 1 heure
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d'incubation supplémentaire en présence de 20 ~l de
biotine 2mM, la boite de pétri est à nouveau lavée 6 fois
avec du TBS/tween 0,5%.
Par ailleurs, 20 ~,1 de sêrum (environ 100 ~g
d'immunoglobulines totales) provenant d'un malade atteint
de sclérose en plaques au stade rémittent (dit malade N°1)
ont été préincubés pendant 8 heures à 4°C sous agitation
avec 50 ~C1 (environ 5.1012 virions) d'une solution de
phages sauvages c'est à dire ne comportant pas de séquence
peptidique insérée. Ceci permet d'éliminer toute fixation
éventuelle des immunoglobulines sur des protéines
phagiques autres que la séquence peptidique insérëe. Ce
mélange est ajouté dans la boite de Pétri traitée comme
décrit précédemment et incubé pendant 1 nuit à 4°C sous
agitation. Ceci permet d'obtenir, de façon connue, des.
boites de Pétri au fond desquelles sont immobilisés
lesdits anticorps par l'intermédiaire de la streptavidine
et des antiimmunoglobulines totales humaines biotinylées.
Après IO nouveaux lavages en tampon TBS/tween
0,5%, un échantillon de la banque d'expression contenant
environ 1012 virions est alors incubé pendant quatre
heures â 4°C en présence desdits anticorps fixés au fond
de la boite de Pétri. Après plusieurs lavages avec du TBS,
les phages qui sont restés fixés aux anticorps contenus
dans le sérum du malade N°1 sont élués avec 400 ~1 d'une
solution d'HC1 O,iN pH 2,2 contenant 0,1% de BSA, puis
neutralisés par 75 ~1 d'une solution Tris-HC1 iM pH 9,1.
Après concentration à 100 ~.1, la suspension de
phages élués est soumise à une étape d'amplification par
infection d'une suspension à 5.109 bactéries/ml d'une
- souche d' E. coli (K9lKan). Les bactéries infectées (voir
Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning . A Laboratory
Manual, 2nd Édition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor) sont incubées pendant 45 minutes à 37°C
dans 20 ml de milieu NZY (tryptone 10 g/l, extrait de
levure 5 g/1, NaCl 5 g/1, pH ajusté à 7) contenant
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0,2 ~g/ml de tétracycline. La concentration en
tétracycline du milieu est ensuite élevée à 20 mg/ml. Les -
phages infectieux portant un gène de résistance â la
tétracycline, seules les bactéries ayant ëté infectées par
le phage sont amplifiées. La culture des bactéries se
poursuit pendant une nuit à 37°C. Après centrifugation de
la culture afin d'éliminer les cellules bactériennes, 3 ml
de polyéthylène-glycol (PEG) 16,3% - NaCl 3,3M sont
ajoutés au surnageant afin de précipiter les phages
l0 présents. Après une incubation une nuit à 4°C et une
centrifugation, le culot de phages est repris dans 1 ml de
TBS (tampon Tris O,1M pH 7,2) et reprécipité par 150 ~,1 de
PEG/NaCl. Une centrifugation permet d'obtenir un culot de
phages qui est remis en suspension dans 200 ~,1 de TBS. La
concentration en phages après cette amplification est
d'environ 2.1013 virions/ml.
La 2ème sélection ou "biopanning 2" est effectuée
suivant le protocole décrit prêcëdemment en utilisant
~1 de sérum du malade N°2 et environ 1012 virions issus
20 de l'ëtape d'amplification précédente.
De même, la Sème sélection sera effectuée en
utilisant respectivement 20 ~,1 de sérum du malade N°3 et
1012 virions issus de l'amplification de la 2ème
sélection.
La 4ème sélection utilisera 20 ~cl de sérum du
malade N°4 et 1012 virions issus de l' amplification de la
Sème sélection.
La Sème sélection est effectuée différemment:
20 ~1 d'un pool de 5 sérums correspondant aux malades
N°5,6,7,8,9,10 sont préincubés avec 50 ~.1 de phage sauvage
pendant 8 heures à 4 °C avant d' être dëposés dans la boite -
de Pétri et incubés 1 nuit à 4°C sous agitation pour être
capturés par les antiimmunoglobulines totales humaines -
biotinylées. Par ailleurs, 100 ~,l des phages amplifiés
après la 4ème sélection (environ 1012 virions) ont été
préincubés 1 nuit à 4°C sous agitation avec 100 ~l d'un
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pool de 5 sérums d'individus sains (soit environ 1,2 mg
d'immunoglobulines totales). Après l0 lavages de la boite
de pétri par du TBS / Tween 0,5%, le mélange précêdent:
phages issus de la 4ème sélection et sérums d'individus
sains, est mis en contact dans la boite de Pétri avec les
immunoglobulines totales du pool de malades. Les
immunoglobulines fixées dans la boite de pétri et non
spécifiques de la maladie seront ainsi en compétition avec
un large excès de ces mêmes immunoglobulines présentes
dans le mélange pour interagir avec les phages. Seule la
sélection des phages interagissant avec les
immunoglobulines spécifiques de la maladie sera favorisëe.
Après 10 nouveaux lavages de la boite de Pétri, les phages
fixés sont élués et l'éluat neutralisé comme il a été
décrit pour la lëre sélection.
10 ~1 des dilutions 10-8 et 10-9 des phages élués
précédemment, sont utilisés pour infecter chacune 10 ~1
d'une suspension à 5.109 bactéries/ml de la souche K9lKan.
Après 10 min d'incubation à température ambiante, 1 ml de
milieu NZY contenant 0,2 ~.g de tétracycline sont rajoutés
pour une incubation supplémentaire de 45 minutes à 37°C
sous agitation. Les suspensions de bactéries infectêes par
les phages sont ensuite étalées dans des boites de Pétri
(85 mm de diamëtre), sur du milieu NZY solide contenant
40 ~g/ml de tétracycline et 100 ~.g/ml de kanamycine.
Après 24 heures d'incubation à 37°C, 108 colonies
bactériennes infectées choisies au hasard sont inoculées
individuellement dans 1,7 ml de milieu NZY-tétracycline
(20 ~g/ml). Après culture sous agitation pendant 16 â 24
heures à 37°C, les cellules sont éliminées par
. centrifugation. Le surnageant ( 1 ml ) est mélangé à 150 ~,1
d'une solution de PEG / NaCl et incubé pendant quatre
heures à 4°C. Après centrifugation, les phages sont remis
en suspension dans 500 ~,1 de TBS.
Les préparations de phages ainsi obtenues
contiennent environ 5.1011 phages par millilitre.
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Exemple 2 Analyse immunologvique desdits clones
par la technique ELISA.
Chaque clone est testé simultanément pour son .
immunoréactivité en IgG et IgM vis à vis d'un pool de 5
sérums d'individus sains et d'un pool de sérums de malades
atteints de sclérose en plaques au stade rémittent. Chaque
essai est effectué en triple.
Dans un premier temps, 100 ~,1 d'anticorps anti-
phages M13 dilués au 1/500 dans du NaHC03 O,1M pH 8,6
(commercialisé par Prinn, Inc. Boulder, CO 80303) sont
fixés une nuit dans les puits de plaques de microtitration
Nunc maxisorb (nom commercial). Après trois lavages avec
du TBS / Tween 0,05%, les plaques sont passivëes 1 heure à
37°C avec 250 ~1 de TBS contenant 10% de sérum de chèvre
et à nouveau lavées trois fois avec le méme tampon. 100 ~C1
des différents clones de phage purifiés sont ensuite
incubés pendant deux heures à 37°C dans les puits. Après
trois lavages avec du TBS / Tween 0,05%, 100 ~,1 d'une
dilution au 1/50ème de sérum sont ajoutés et incubés 2
heures à 37°C. Après quatre lavages en TBS/Tween 0,05%,
100 ~C1 de conjugué anti-IgG humaines marqué à la
peroxydase diluées au 1/10000 (commercialisé par Jackson
Immuno Research Laboratories Inc.) sont ajoutés avant une
incubation pendant une heure à 37°C. La réaction
enzymatique de révélation est effectuée en ajoutant 100 ~,1
d'une solution H202/ ortho-phénylène-diamine (OPD) et en
incubant l'échantillon 30 minutes à température ambiante.
La réaction de coloration est interrompue par l'addition
de 50 ~1 d'acide sulfurique 1,8N. La densité optique est
mesurée sur un lecteur de plaques BioMérieux à 492 nm. La
réponse IgM est déterminée par addition de 100 ~1 de
conjugué anti-IgM biotinylé dilué au 1/4000 (anticorps
monoclonal Biomérieux) suivie de l'addition après lavages
du conjugué streptavidine-peroxydase diluë au 1/10000. La
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réaction de révélation est ensuite effectuée comme décrit
ci-dessus.
Les résultats obtenus en ELISA sont -exprimés en
. soustrayant pour chaque clone la moyenne des valeurs
5 obtenues avec le pool de sérums d'individus sains de la
moyenne des valeurs obtenues avec le pool de sérums de
malades. Une réponse positive est ainsi obtenue pour 37
clones phagiques.
10 Exemple 3 Détermination de la séauence des
clones t~haaiaues sélectionnés
L'ADN des phages correspondant aux 37 clones ayant
donné une réponse positive en ELISA a été préparé selon la
méthode décrite par Sambrook et al., 1989. Molecular
15 Cloning . A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring.
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor.
Ces clones ont été sêquencés en utilisant une
amorce de 20 bases (5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'). Cette
amorce est complémentaire des nucléotides 1717-1736 du
gène codant pour la protéine PIII native du phage. Le
séquençage a été effectué sur un séquenceur automatique
(Applied Biosystems, 373 A) en utilisant le "Prism ready
reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing dye"
suivant le protocole du fournisseur (Applied Biosystems).
Les séquences nucléiques obtenues, lorsqu'elles
sont converties en séquences d'acides aminés, indiquent
que les séquences peptidiques SEQ ID NO: 3
(I~eu Gln Gln Ala Val Phe) et SEQ ID NO: 4
(Ser Thr Gly Arg Pro Leu) sont retrouvées respectivement
11 fois et 6 fois dans les clones sélectionnés pour leur
. réponse positive. De plus comme le montre le tableau
suivant, d'autres séquences sont représentées en double ou
triple exemplaires.
Par ailleurs la séquence des clones pour lesquels
on observe une réponse négative ne possède aucune
homologie avec ces séquences.
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Le tableau 1 suivant donne les réponses IgG et IgM
des différents clones de phages exprimant les séquences
SEQ ID NOs: 3 à 9.
Les résultats sont exprimés en soustrayant pour
chaque clone la moyenne des valeurs obtenues avec le pool
de sérums d~individus sains de la moyenne des valeurs
obtenues avec le pool de sérums de malades.
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Tableau 1
Sq. peptide Nb de clones Rp IgG Rp IgM
SEQ ID NO: 3 11 0,135 0
LQQAVF 0,160 0,009
0,266 0
0,335 0,074
0,105 0,097
0,280 0,056
0,267 0,061
0,137 0,043
0,113 0,026
0,383 0,069
0,310 0,067
SEQ ID NO: 4 6 0,264 0
STGRPL 0,182 0,007
0,160 0
0,131 0,026
0,110 0,054
0,287 0,023
SEQ ID NO: 5 2 0,185 0,068
RLVLVP 0,366 0,012
SEQ ID NO: 6 3 0,058 0,042
FLENGV 0,016 0,042
0,020 0,044
SEQ ID NO: 7 2 0,206 0,066
KGTSLS 0,116 0,017
SEQ ID NO: 8 1 0,119 0,506
LAVRIiD
SEQ ID NO: 9 1 0,280 0,247
TFDRRI
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Exemple 4 Synthèse chimique de deux pentadéca
peptides et test ELISA avec des sérums humains positifs
Selon les indications obtenues à partir des
exemples précédents, les hexapeptides SEQ ID NO: 3 et
SEQ ID NO: 4 ont été synthétisés et biotinylés selon la
méthode décrite dans la demande de brevet n° EP 93420183
avec les modifications suivantes: le peptide encore fixé
sur la résine est sélectivement déprotégé en position N-
10~ terminale. Aprês une nuit d'incubation avec de la biotine-
NHS à 50% dans du DMF, le peptide est ensuite clivé de la
résine et traité comme décrit dans le brevet cité ci-
dessus.
Ces peptides ont ensuite été testés en ELISA vis
à-vis de leur réactivité à l'égard de plusieurs séra de
malades de la sclérose en plaques et d'individus sains.
Les puits d'une plaque de microtitration Maxisorb
(nom commercial, Nunc) sont saturés par 100 ~,1 d'une
solution de HC03Na 50 mM pH 9,6 contenant l0 ~,g/ml de
,streptavidine durant 2 heures à 37°C. La plaque est lavée
avec du tampon TBS / Tween 20 0,05%. Les puits sont
ensuite saturés par 250 ~,1 de tampon de lavage additionné
de 10% de sërum de chèvre pendant 1 heure à 37°C puis
lavés comme décrit précédemment.
Les sérums à analyser sont dilués au 1/100 dans le
tampon de saturation, additionné de 0,05% en Tween 20 et
incubés 2 heures à 37°C. Après lavage, une solution de
conjugué anticorps de chèvre asti-immunoglobulines G
humaines marqué à la peroxydase (commercialisé par ,Tackson
Immuno Research Laboratories Inc.) est ajoutée à la
dilution de 1/10 000 et les plaques sont incubées 1 heure
à 37°C. Après lavages, le substrat ortho-phénylène-diamine
(OPD) est ajouté et la réaction est arrétée après 10
minutes par l'addition de 50 ul de H2S04. La densité
optique est lue à 492 nm.
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La réponse IgM est déterminée par ajout d'une
solution au 1/4000 de conjugué anticorps monoclonal de
souris anti-immunoglobulines M humaines marquées à la
phosphatase alcaline (Ac bioMérieux 5AlOD5). Après 1 heure
d'incubation à 37°C, la plaque est à nouveau lavêe et le
substrat p-~itrophényl phosphate à 1 mg/ml dans une
solution de diéthanolamine M, pH 9,8 contenant 1 mM de
MgCl2 est ajouté. La réaction est arrêtée au bout de 30
minutes par l'addition de 50 ~,1 de soude 3N. La densité
optique est lue à 405 nm.
Dans un test ef fectué avec des dilutions au 1/ 100
de li sérums anglais de malades SEP au stade rémittent et
de 4 sérums anglais négatifs, les peptides SEQ ID NOs: 3
et 4 sont reconnus par 4 sérums sur 11 qui donnent un
signal positif en IgG par rapport au sérum négatif ayant.
donné le plus fort signal. Si l'on fait la moyenne des
valeurs obtenues avec les sérums négatifs et que l'on
ajoute 3 fois l'écart-type pour déterminer un cut-off, les
2 peptides sont encore reconnus de façon significative par
3 sérums sur 11. (figures 1 et 2).
La séquence SEQ ID NO: 3 présente 4 acides aminés
consécutifs et identiques dans la région de MSRV-1 codée
par le clone LB19 (représenté à la figure 3). De même, la
séquence SEQ ID NO: 4 présente 4 acides aminés consécutifs
et identiques dans la région de MSRV-1 codée par le clone
GM3 (représenté à la figure 4).
Le motif SEQ ID NO: 8 n'a été retrouvé qu'une
seule fois après séquençage, cependant il a donné une
réponse positive en IgM et présente une homologie de
séquence avec gag de HTLV1. Ce motif a donc été aussi
- synthétisé et biotinylé. La réponse IgM testée vis à vis
du même panel de sérums décrit ci-dessus montre que 7
sérums sur 11 reconnaissent ce peptide (figure 5).
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Exemple 5 Sélection de pentadécapeptides capable
de réaair spécifiauement avec des sérums de malades -
atteints de sclérose en plaques
Une banque de pentadécapeptides portés sur 300
5 copies de la protéine VIII du phage a été construite sur
le même principe que la banque d'hexapeptides en utilisant
le vecteur f88-4 d'après les travaux de Greewood et al.
(J. Biol. Mol. 1991). Lorsque f88-4 est propagé en
présence de IPTG, le pentapeptide étranger est exprimé sur
10 toute la surface du virion.
Le même protocole de sélection que celui décrit
dans l'exemple 1 a été utilisë pour cibler cette banque de
pentadécapeptides avec de nouveaux sérums rémittents.
Aprës 5 cycles de biopannings, 72 clones de phages
15 ont été immunoanalysés: 39 clones ayant donné un signal
positif vis à vis d'un pool de sérums positifs par rapport
à pool de sérums négatifs ont été séquencés:
17/39 portent la séquence SEQ ID NO: 10:
Asn Ala Cys Tyr Val Asp Leu Phe Leu Gly Ala Ser Val Cys Pro,
20 ces clones donnent une réponse positive moyenne en IgG de
0,069 avec une dilution des sérums au 1/200
12/39 clones portent la séquence SEQ ID NO: 11:
Ser Ser Ala Lys Ser His Cys Tyr Ala Phe Cys Ser Gly Leu Pro,
avec une réponse positive moyenne de 0,248.
I1 est à noter que ces 2 motifs portent tous les
deux, les acides aminés Cys-Tyr. De plus, d'après le
programme BLAST, SEQ ID NO: 11 partage 62 % d'identité et
87 % d'homologie avec la protéine SAT3 du virus de la
fièvre aphteuse.
Par ailleurs, 2/39 clones portant la séquence
SEQ ID NO: 18 ont aussi une réponse positive moyenne de
0,358.
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Exemple 6 Sélection de pentadécapeptides
cat~ables de réagir spécifiquement avec des liciuides
cét~halo-rachidiens de malades atteints de sclérose en
placLues
La même banque de pentadëcapeptides a été ciblée
en utilisant les liquides céphalo-rachidiens (LCR) de
malades atteints de sclérose en plaques non traités, en
phase rémittente ou chronique progressive. Ces LCR ont été
sélectionnés en fonction de leur profil oligoclonal en
focalisation isoélectrique et de leur index d'IgG, ces 2
paramètres montrant une synthèse intrathécale d'IgG.
Dans un protocole A, 4 biopannings ont été
effectués avec les LCR de 4 malades différents selon le
principe décrit dans l'exemple 1. 41 clones de phages ont
ensuite été isolës et leur ADN séquencé par séquençage~
automatique en utilisant une amorce de 20 bases
(5'-TGAAGAGAGT CAAAAGCAGC-3') spécifique de la protéine
VIII.
Les motifs obtenus sont les suivants:
MPVSRLCIELDWCPP 4/41 SEQ ID NO: 12
FCPPILPYSAWCPVP 4/41 SEQ ID NO: 13
EPMTPHQWITLYRSY 15/41 SEQ ID NO: 14
DTPYPWGWLLDEGYD 9/41 SEQ ID NO: 15
RGTQEWTELWVSFRA 2/41 SEQ ID NO: 19
Parallèlement dans un protocole B, 4 biopannings
successifs ont été effectués en utilisant le même LCR
(LCR 4 utilisé pour le premier biopanning du protocole A)
à des dilutions croissantes . 1, 1/10, 1/20 et 1/100.
32 clones de phages issus du protocole B ont été
aussi isolés et séquencés. Les résultats montrent que 2
. motifs obtenus avec le protocole A sont aussi retrouvés
avec le protocole B en utilisant une dilution au 1/100 de
LCR.
EPMTPHQWITLYRSY 21/32 SEQ ID NO: 14
FCPPILPYSAWCPVP 2/32 SEQ ID NO: 13
SRGSHEWAVLFRFYY 3/32 SEQ ID NO: 16
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RGTQEWTELWVSFRA 2/32 SEQ ID NO: 19
QSPLEDRILRFLSPP 2/32 SEQ ID NO: 17
Les clones de phages portant les séquences
SEQ ID NOs: 13, 14, 16 et 17 ainsi que le phage non _
recombinant (c'est-à-dire ne comportant pas de
pentadécapeptide inséré), ont êté testés en ELISA vis à
vis d'un LCR d'un malade neurologique, le LCR 4 (utilisé
dans le protocole B et le ler biopanning du protocole A)
et le LCR 7 utilisé pour le 2ème biopanning du protocole
A.
La figure 6 montre que la séquence SEQ ID NO: 13
est reconnue spécifiquement par les LCR 7 et 4, tandis que
SEQ ID NO: 14 n'est reconnu que par le LCR 7. Cependant le
motif majoritaire n'est reconnu par aucun de ces deux LCR.
La séquence SEQ ID NO: 13 apparaît être.
intéressante puisque d'après le programme BLAST, elle
partage 58 % d'identité et 75 % d'homologie avec la
séquence p30/p10/5'v-fsm de la région codante du virus du
sarcome félin (FSV) [référence NCBI gi/554646].
Dans une expérience similaire, la banque de
pentadécapeptide a été criblée dans le même ordre
d'utilisation avec les sérums provenant des patients dont
les LCR ont été utilisés ci-dessus.
De façon identique à l'Exemple 5, les séquences
SEQ ID NO: 10 (18/36), SEQ ID NO: 11 (2/36) et
SEQ ID NO: 18 (12/36) sont à nouveau retrouvées
majoritairement. Aucune des autres séquences sélectionnées
ne correspond â celles sélectionnées par les LCR et vice
versa.
La différence des proportions relatives des clones
par rapport à l'Exemple 5 peut s'expliquer par le fait que
les sérums utilisés ici proviennent de patients
majoritairement à un stade chronique de la maladie alors
que dans l'Exemple 5 tous les malades sont à un stade
rémittent.
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Le tableau 5, illustré à la figure 7, rassemble
les résultats sur la reconnaissance spécifique de LCR de
patients atteints de SEP, pour 6 polypeptides de
l'invention, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14,
SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 15.
I1 ressort du tableau 5 que ïa combinaison des
polypeptides les plus immunoréactifs, à savoir SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 16, permet de détecter
des anticorps spécifiques dans 13 échantillons de LCR de
patients atteints de SEP sur 15.
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Tableau 2
REPONSE
IGG AU
PEPTIDE
LP Blotinyl
D01 002 O MOYENNE ~
~
~
Tbmotn 15 i 8 1 7 t 7 815
i
S N12 550 640 726 639
E N13 3b6 369 407 377
P N14 367 285 270 307
N15 439 496 422 452
33/8 535 586 626 587
3318 ~ 990 941 1271 1067
S 33/18 601 339 246 395
E QS2 294 339 293 309
P Q$3 618 784 779 727
f GIS 4 1 161 1293 1583 1346
GZS 8 806 263 407 325
GIS 7 t 307 1298 1461 t 365
QS 8 664 635 545 615
QS 11 428 169 108 235
QS 12 405 472 316 398
Tous
IriOYET~~ 4 44
. ECARTiYPE 124
eRUrr e s s
o~
FoNO
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Tableau 3
REPONSE (GG AU PEPTIDE S4L. Biotinylé
D01 D02 003 MOYF~ GNE DE 6ASE
Tbn~otn 16 17 37 23 67a
1
S NZ2 567 5t8 469 518
E N13 266 278 268 271
P N14 322 b01 354 359
- NZ6 423 432 470 442
33/6 465 498 525 496
33/8 849 820 753 807 X
g$~18' 258 243 299 267
E QS 2 267 296 267 277
p G1S 3 688 618 585 fi24
QS 4 1096 1 120 862 1026 X
QS 6 204 212 201 206
QS 7 1379 1437 1323 1380 X
QS 8 523 504 630 562
QS 11 272 273 26! 269
QS 72 271 227 272 237
Tous
MOYF1~NE 3 9 7
ECaRTiYPE 92
BEiUtT DE FQNO 674
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Tableau 4
RÉPONSE IGM AU PEPTIDE L4D BIOt(nyl~
~t DOt 002 D03 MOYENNE MOYEN
Tbmotn 213 t 70 t 36 173 t 73 76
1
S N12 222 1 75 t 63 1 87 14 __
E N13 146 154 196 t65 -8
p N14 320 165 143 209 36
N15~ 264 205 1 T3 21 t 38
3318 518 529 481 60 336 X
3318 609 bt2 568 563 390 X
S 33/18 277 262 255 265 92 X
E QS 2 281 280 231 264 91 X
p QS 3 1 91 169 164 1 T5 2
t G1S 4 374 36t 346 360 187 x
QS 6 156 t 47 t 51 t 51 -22
aS 7 311 290 164 255 82 X
QS 8 305 221 265 264 9t X
QS 11 t 64 160 t 39 154 -19
QS 1i2 123 57 148 109 -64
~,~Qyt~NE 2 0
TYpE 19
UCxNE OE BASE 78
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Tableau 5
Patients SEQ ID SEQ ID SEO ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
NO: 13 NO: 1 NO: 14 NO: 16 NO: 19 NO: 15
2
' 1 + + + + - _
2 + + + + - -
3 + - + + - -
+ + + + + -
g - + - + + -
7 + + + + + -
8 + + - + + -
10 + + + + + -
16 - + . _ _ _
17 - - - - . _
1g + + + + + -
19 - . - _ _ _
+ _ - . _ _
15 21 + + + + + -
- - + + -
15 10 + 10 + 8+ 11 + 8+ 0+
Pour chaque polypeptide testé, identifié dans le
tableau 5 par sa séquence peptidique, les LCR des patients
1-22 atteints de SEP, sont déterminés comme positifs (+)
si la valeur de la DO à 492 nm pour une dilution du LCR de
1/10, est supérieure à la moyenne des valeurs obtenues
pour les LCR des patients ND + 3 fois l'écart-type.
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LISTAGE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: CHEMIN DE L'ORME
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280
(ii) TITRE DE L' INVENTION: POLYPEPTIDE CAPABLE DE REAGIR AVEC LES
ANTICORPS DE PATIENTS ATTEINTS DE SCLEROSE EN PLAQUES ET UTILISATIONS
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 27
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
2 O (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 4 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Gln Gln Ala Val
1 4
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
29
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 4 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Thr Gly Arg Pro
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
2 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Leu Gln Gln Ala Val Phe
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACT'ERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(8) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire
(fi) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 4:
4 0 Ser Thr Gly Arg Pro Leu
1 5
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
5 (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
Arg Leu Val Leu Val Pro
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 6:
Phe Leu Glu Asn Gly Val
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 7:
4 0 Lys Gly Thr Ser Leu Ser
1 5
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
31
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
Leu Ala Val Arg His Asp
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 6 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
2 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:
Thr Phe Asp Arg Arg Ile
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
4 0 Asn Ala Cys Tyr Val Asp Leu Phe Leu Gly Ala Ser Val Cys Pro
1 5 10 15
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PC'T/FR98/00870
32
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Ser Ser Ala,Lys Ser His Cys Tyr Ala Phe Cys Ser Gly Leu Pro
1 5 10 15
1 5 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
2 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Met Pro Val Ser Arg Leu Cys Ile Glu Leu Asp Trp Cys Pro Pro
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 13:
4 0 Phe Cys Pro Pro Ile Leu Pro Tyr Ser Ala Trp Cys Pro Val Pro
1 5 10 15
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98l00870
33
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Glu Pro Met Thr Pro His Gln Trp Ile Thr Leu Tyr Arg Ser Tyr
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
2 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 15:
Asp Thr Pro Tyr Pro Trp Gly Trp Leu Leu Asp Glu Gly Tyr Asp
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 16:
4 0 Ser Arg Gly Ser His Glu Trp Ala Val Leu Phe Arg Phe Tyr Tyr
1 5 10 15
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
34
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
Gln Ser Pro Leu Glu Asp Arg Ile Leu Arg Phe Leu Ser Pro Pro
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 18:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminë
2 0 (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
2 5 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:
His Cys Arg Lys Val Thr Gly Ser Asp Tyr Leu Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 19:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUEN~E:
(A) LONGUEUR: 15 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
3 5 (D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:
4 0 Arg Gly Thr Gln Glu Trp Thr Glu Leu Trp Val Ser Phe Arg Ala
1 5 10 15
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 20:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 565 acides aminés
5 (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
{xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:
Met Lys Met Arg Pro Arg Tyr Ser Val Ile Ala Ser Ala Val Ser Leu
1 5 10 15
Gly Phe Val Leu Ser Lys Ser Val Met Ala Leu Gly Gln Pro Asp Thr
25 30
Gly Ser Leu Asn Arg Giu Leu Glu Gln Arg Gln Ile Gln Ser Glu Ala
35 40 45
Lys Pro Ser Gly Glu Leu Phe Asn Gln Thr Ala Asn Ser Pro Tyr Thr
50 55 60
Ala Gln Tyr Lys Gln Gly Leu Lys Phe Pro Leu Thr Gln Val Gln Ile
65 70 75 80
Leu Asp Arg Asn Asn Gln Glu Val Val Thr Asp Glu Leu Ala His Ile
85 90 95
Leu Lys Asn Tyr Val Gly Lya Glu Val Ser Leu Ser Asp Leu Ser Asn
100 105 110
Leu Ala Asn Glu Ile Ser Glu Phe Tyr Arg His Asn Asn Tyr Leu Val
115 120 125
Ala Lys Ala Ile Leu Pro Pro Gln Glu Ile Glu Gln Gly Thr Val Lys
130 135 140
Ile Leu Leu Leu Lys Gly Asn Val Gly Glu Ile Arg Leu Gln Asn His
145 150 155 160
Ser Ala Leu Ser Asn Lys Phe Val Ser Arg Leu Ser Asn Thr Thr Val
165 170 175
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
36
Asn Thr Ser Glu Phe Ile Leu Lys Asp Glu Leu Glu Lys Phe Ala Leu
180 185 190
Thr ile Asn Asp Val Pro Gly Val Asn Ala Gly Leu Gln Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Lys Lys Val Gly Glu Ala Asn Leu Leu Ile Lys Ile Asn Asp Ala
210 215 220
Lys Arg Phe Ser Ser Tyr Val Ser Val Asp Asn Gln Gly Asn Lys Tyr
225 230 235 240
Thr Gly Arg Tyr Arg Leu Ala Ala Gly Thr Lys Val Ser Asn Leu Asn
245 250 255
Gly Trp Gly Asp Glu Leu Lys Leu Asp Leu Met Ser Ser Asn Gln Ala
260 265 270
Asn Leu Lys Asn Ala Arg Ile Asp Tyr Ser Ser Leu Ile Asp Gly Tyr
275 280 285
Ser Thr Arg Phe Gly Val Thr Ala Asn Tyr Leu Asp Tyr Lys Leu Gly
290 295 300
Gly Asn Phe Lys Ser Leu Gln Ser Gln Gly His Ser His Thr Leu Gly
305 310 315 320
Ala Tyr Leu Leu His Pro Thr Ile Arg Thr Pro Asn Phe Arg Leu Ser
325 330 335
Thr Lys Val Ser Phe Asn His Gln Asn Leu Thr Asp Lys Gln Gln Ala
340 345 350
Val Tyr Val Lys Gln Lys Arg Lys Ile Asn Ser Leu Thr Ala Gly Ile
355 360 365
Asp Gly Ser Trp Asn Leu Ile Lys Asp Gly Thr Thr Tyr Phe Ser Leu
370 375 380
Ser Thr Leu Phe Gly Asn Leu Ala Asn Gln Thr Ser Glu Lys Lys His
385 390 395 400
Asn Ala Val Glu Asn Phe Gln Pro Lys Ser His Phe Thr Val Tyr Asn
405 410 415
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
37
Tyr Arg Leu Ser His Glu Gln Ile Leu Pro Lys Ser Phe Ala Phe Asn
420 425 430
Ile Gly Ile Asn Gly Gln Phe Ala Asp Lys Thr Leu Glu Ser Ser Gln
435 440 445
Lys Met Leu Leu Gly Gly Leu Ser Gly Val Arg Gly His Gln Ala Gly
450 455 460
Ala Ala Ser Val Asp Glu Gly His Leu Ile Gln Thr Glu Phe Lys His
465 470 475 480
Tyr Leu Pro Val Phe Ser Gln Ser Val Leu Val Ser Ser Leu Phe Tyr
485 490 495
Asp Tyr Gly Leu Gly Lys Tyr Tyr Lys Asn Ser Gln Phe Leu Glu Gln
500 SOS 510
Gly Val Lys Asn Ser Val Lys Leu Gln Ser Val Gly Ala Gly Leu Ser
515 520 525
Leu Ser Asp Ala Gly Ser Tyr Ala Ile Asn Val Ser Val Ala Lys Pro
530 535 540
Leu Asp Asn Asn Ile Asn Asn Ala Asp Lys His Gln Phe Trp Leu Ser
545 550 555 560
Met Ile Lys Thr Phe
565
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PGT/FR98/00870
38
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 21:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 359 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21:
1 MAKLLDIVKP GWTGEDVQK VFAYAKEHNF AIPAVNCVGS DSVNAVLETA
51 ARVKAPVIIQ FSNGGAAFYA GKGIKPTSGT RPDVLGAIAG AKQVHTLAKE
101 YGVPVILHTD HAAKKLLPWI DGLLDAGEKH FAETGRPLFS SHMIDLSEES
151 MEENMAICRE YLARMDKMGM TLEIEIGITG GEEDGVDNSD VDESRLYTQP
201 SDVLYVYDQL HPVSPNFTVA AAFGNVHGVY KPGNVKLKPS ILGESQEFVS
251 KERNLPAKPI NFVFHGGSGS SREEIREAIG YGAIKMNIDT DTQWASWNGI
301 LNFYKANEAY LQGQLGNPEG PDAPNKKYYD PRVWLRKMEE SMSKRLEQSF
351 EDLNCVDVL
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
39
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 22:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 304 acides aminés
~ 5 (B) TYPE: acide aminë
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:
1 MTKMKQMLIC ILCGHLCITW IQMMCGIRQQ VGSIKLAFTT YMEHLNTIMC
51 YLLMMQRDIV LLENGKLKLI RKLCLLLSLA PHHQGHQEDK QTQTPPPRPP
101 PPPQPPLTPR PDANPSINSH NKPKPNEEGT DGDHQAEQGD RKRTKGDPDP
151 DPGRGPVLKP TLPPPPPPPP TGPGLRRSTR LVLVPGQGPP PDLPAPPVEG
201 EVEGHPQGKD RDHPPPTPQN GHGKETQGAE GGGDKGEQGA VGGESSDGEG
251 DHSQPPLTPP NESDGSLLNT VACLLARWES NFDQLVQNIQ GDLEGYWRKL
301 GTPQ
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 23:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 425 acides aminés
5 (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:
1 MRQVAYRRRR ESSCAVLVHH VGRDGDGEGE AAKKTCKKTG.RSVAGIPGEK
51 LRRTWTTTP ARRLSGRHTE QEQAGMRLCE KGKKRIIMCR RESLRTLPWL
101 FWVLLSCPRL LEYSSSSFPF ATADIAEKMW AENYETTSPA PVLVAEGEQV
151 TIPCTVMTHS WPMVSIRARF CRSHDGSDEL ILDAVKGHRL MNGLQYRLPY
201 ATWNFSQLHL GQIFSLTFNV SMDTAGMYEC VLRNYSHGLI MQRFVILTQL
2S1 ETLSRPDEPC CTPALGRYSL GDQIWSPTPW RLRNHDCGTY RGFQRNYFYI
301 GRADAEDCWK PACPDEEPDR CWTVIQRYRL PGDCYRSQPH PPKFLPVTPA
351 PPADIDTGMS PWATRGIAAF LGFWSIFTVC FLCYLCYLQC CGRWCPTPGR
401 GRRGGEGYRR LPTYDSYPGV RKMKR
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
41
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 24:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 96 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:
Tyr Leu Arg His Thr Glu Glu Tyr Glu Val Glu Leu Ile Leu Arg Leu
1 5 10 15
Cys Lys Val Pro Leu Asn Pro Asp Val Leu Ala His Leu Asn Val Met
25 30
Asp Lys Asn Ile Leu Glu Asp Trp Gln Leu Ser Phe Val Pro Pro Pro
20 35 40 45
Pro Gln Gly Ile Glu Asp Ala Tyr Arg Tyr Ile Met Ser Gln Ala Thr
50 55 60
2 5 Met Cys Pro Thr Asp Val Pro Asn Thr Glu Arg Glu Asp Pro Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Tyr Thr Phe Trp Thr Ile Asp Leu Gln Glu Arg Phe Ser Asn Glu
g5 90 95
CA 02288337 1999-10-27
WO 98/49285 PCT/FR98/00870
42
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 25:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 64 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü ) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:
Gly Arg Asp Gly Tyr Ile Val Asp Ser Lys Asn Cys Val Tyr His Cys
1 5 10 15
Tyr Pro Pro Cys Asp Gly Leu Cys Lys Lys Asn Gly Ala Lys Ser Gly
25 30
15 Ser Cys Gly Phe Leu Val Pro Ser Gly Leu Ala Cys Trp Cys Asn Asp
35 40 45
Leu Pro Glu Asn Val Pro Ile Lys Asp Pro Ser Asp Asp Cys His Lys
50 55 60
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 26:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
2 5 (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 26:
Lys Arg Asp Ser Ile Ser Pro Tyr Ser
1 5 9
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 27:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 acides aminés
3 5 (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ü) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 27:
4 0 Arg Arg Asp Thr Ile Ser Pro Tyr Ser
1 5 9
