Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
I
PROCEDE D'IDENTIFICATION ET/OU DE DOSAGE DE SUBSTANCES
BIOLOGIQUES, PRESENTES DANS UN LIQUIDE CONDUCTEUR,
DISPOSITIF ET CAPTEUR D'AFFINITE UTILES POUR LA MISE EN
OEUVRE DE CE PROCEDE
DOMAINE TECHNIQUE :
Le domaine de l'invention est celui de la détection de produits, de
préférence biologiques ( affins ), tels que les acides nucléiques, ou bien
encore les
biopolymères de nature protéïque.
Plus précisément, la présente invention concerne, d'une part, un procédé
d'analyse qualitative et/ou quantitative de substances biologiques SBC, de
préférence
des polynucléotides PN présentes dans un milieu liquide (solution ou gel)
conducteur
LC, par l'intermédiaire de mesures optoélectrochimiques et, d'autre part, les
dispositifs et les capteurs d'affinité destinés à la mise en oeuvre de ce
procédé.
Les substances biologiques, plus particulièrement mais non limitativement,
visées par l'invention sont les polynucléotides PN. Sous ce terme général, on
englobe
conformément à l'invention, les molécules composées d'au moins deux
nucléotides
(oligonucléotides et polynucléotides stricto sensu), dont notanunent les
acides
nucléiques ARN ou ADN et toute structure génétique en comprenant. L'invention
concerne également les composés susceptibles d'être impliqués dans des
réactions de
couplage immunologique [Antigène Ag/anticorps Ac], voire de reconnaissance
Enzyme/Substitut E/S.
ART ANTERIEUR :
Pour détecter, identifier ou doser ces molécules, on a exploité leurs
propriétés de bioafiinité, à savoir leur aptitude singulière à s'apparier
spécifiquement
avec leurs complémentaires, selon des mécanismes d'hybridation génétique
PN/PNc,
(PN~ = PolyNucléotide complémentaire) de couplage immunologique Ag/Ac ou de
reconnaissance E/S.
C'est ainsi que, dans le domaine immunologique, on connaît des méthodes qui
sont
fondées sur le couplage antigène/anticorps et qui font intervenir une étape de
révélation des couples formés à l'aide de marqueurs radioactifs, enzymatiques,
fluorescents, colorés ou analogues. De telles méthodes sont longues et
complexes à
i n
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
2
mettre en oeuvre. De plus, les réactifs utilisés sont peu disponibles et
onéreux. Enfin,
ces méthodes ne permettent pas des mesures en continu et encore moins in vivo.
Ces techniques ont été transposées avec leurs défauts au domaine de la
détection de
séquences nucléiques, qui doivent ainsi nécessairement être marquées pour
pouvoir
être dosées et/ou identifiées.
Dans un autre registre, il a été proposé de s'attacher à la détection des
signaux physiques de toute nature, susceptibles d'être induits par les
réactions
biochimiques d'hybridation nucléotidique ou couplage immunologique. Pour ce
faire,
il convient, tout d'abord, d'isoler un type de signaux particuliers et
caractéristiques,
puis d'adopter un transducteur apte à convertir lesdits signaux en une
grandeur
physique mesurable. Ces signaux peuvent être, par exemple, la production d'une
espèce chimique, une variation d'épaisseur, d'indice optique, de masse ou bien
encore
une variation de propriétés électriques. Les transducteurs peuvent donc être
des
capteurs électrochimiques, piézoélectriques, optiques ou électriques. Toute la
difficulté réside dans la mise en évidence des signaux spécifiques de
l'appariement et
dans la mise au point d'un transducteur correspondant fiable, sensible et
fidèle.
L'invention décrite dans la demande de brevet français n 94 08688
s'insère parfaitement dans cet état de la technique fondé sur la détection des
signaux
électriques, induits par des hybridations PN/PNc ou par des réactions antigène-
anticorps, dans un milieu liquide conducteur de l'électricité.
Cette demande de brevet décrit un procédé d'analyse qualitative et/ou
quantitative de
substances biologiques, en particulier, des polynucléotides, des antigènes,
des
anticorps, des enzymes, des substrats, dans lequel on met en oeuvre une
structure
multicouches comprenant une plaquette de semi-conducteur recouverte d'un
isolant
dont la surface est fonctionnalisée par l'une des espèces des paires de
substances
biologiques sus-visées, appariables spécifiquement. Selon ce procédé, on
polarise le
semi-conducteur contenant des polynucléotides PN à doser ou à identifier, on
recueille les variations des signaux électriques induites par un phénomène
d'effet de
charge directement et essentiellement lié aux appariements des substances
biologiques
visées avec leurs ligands complémentaires fixés sur l'isolant, éventuellement
par
l'intermédiaire d'une membrane sensible.
Cette technique de mesure par transduction électrique ne nécessite pas
d'intermédaire
de réaction, pas plus que de marqueur spécifique ni de réaction enzymatique.
Elle
donne satisfaction mais reste néanmoins perfectible en ce qui concerne la
simplicité de
mise en oeuvre et l'accès à une possibilité de réalisation de séries de
mesures rapides
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCTIFR98/01213
3
de différents substrats, sans utiliser autant de capteurs qu'il existe de
natures
différentes de substrats à analyser.
Selon cette technique, le phénomène d'effet de charges peut être appréhendé
par
mesure d'impédance électrochimique d'une structure semi-conducteur/isolant/
membrane sensible/liquide conducteur. Selon une variante, la caractérisation
de
l'effet de champ dû à la variation de la charge superficielle induite par
l'appariement,
peut être réalisée à l'aide d'un transistor à effet de champ polarisé et sur
lequel on
mesure les variations du potentiel grille/source induit par l'effet de champ.
Il existe par ailleurs, des propositions techniques d'identification et/ou de
dosage de molécules biologiques, qui combinent
= d'une part, des moyens de révélation des substances à doser faisant
appel à des marqueurs radioactifs, enzymatiques, fluorescents, colorés,
modificateurs
de potentiel redox ou de pH, ou analogues,
= et d'autre part, des moyens de transduction électrochinziques ou
optoélectrochimiques.
Malheureusement, une telle combinaison n'est pas de nature à supprimer les
inconvénients liés aux techniques basées sur la révélation, ni à améliorer les
techniques
d'analyse électrochimique.
C'est ainsi que les brevets américains N 4 591 550 et 5 500 188 divulguent un
procédé et un dispositif pour la détermination et le dosage d'une ou plusieurs
substances contenues dans un milieu liquide gazeux ou solide et capables de
modifier
les caractéristiques de photoréponse d'un élément photosensible, comprenant
des
moyens de reconnaissance desdites substances. Ces derniers impliquent un
mécanisme
de révélation par un ou plusieurs produits traceurs susceptibles de modifier
les
caractéristiques physicochimiques du nûlieu d'analyse (pH, potentiel redox)
et/ou
susceptibles d'être mis en évidence par un marqueur radioactif coloré ou
fluorescent.
Il s'agit donc d'une technique hybride associant des moyens de transduction
optoélectrochimique et des moyens de révélation physicochimiques.
Le dispositif mis en oeuvre dans ce procédé connu comprend un ou plusieurs
capteurs
constitués chacun par une plaquette de senû-conducteur (silicium recouvert
d'une
couche d'isolant Si02 ou nitrure de silicium), la surface de cette dernière
étant
éventuellement fonctionnalisée par des moyens de reconnaissance des substances
à
doser et/ou à identifier. Ce dispositif est également pourvu de moyens de
polarisation
de la structure semi-conducteur/isolant (e.g. circuit d'application d'une
tension de
polarisation, ledit circuit comprenant d'une part, une contre-électrode et une
électrode
de référence et étant relié, d'autre part, à la structure semi-
conducteur/isolant). Le
= CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
4
dispositif comporte, en outre, des moyens d'irradiation du ou des éléments
photosensibles ainsi que des moyens de mesure de signaux électriques
résultants, de
détection et/ou d'identification des substances considérées.
Il est à noter que chaque élément photosensible comprenant la structure semi-
conducteur/isolant est nécessairement associé à des moyens d'éclairement, des
moyens de polarisation et des moyens de mesure. Il s'ensuit une extrême
complexité
du dispositif dans ses variantes visant la multidétection de substances
différentes, à la
fois sur le plan de la structure en tant que telle et sur le plan de la prise
en charge et
du traitement des mesures et des signaux résultants.
La couche d'isolant des éléments photosensibles selon cet art antérieur, est
fonctionnalisée dans le cas où les substances à analyser sont des systèmes
affins
PN/PNc, E/S, Ag/Ac. Dans ce cas, les ligands de reconnaissance
fonctionnalisant la
couche d'isolant sont systématiquement marqués. Cela est illustré notamment
pour
l'analyse d'ADN ou ARN, dans laquelle les ligands complémentaires de
reconnaissance sont marqués avec le biotine (Cf colonne 14 lignes 49 à 63 de
l'US-
A-5 500 188). Dans de telles configurations, on doit donc supporter tous les
inconvénients liés à ces techniques de révélation par marqueur. Il convient
d'ailleurs
d'observer que celles qui font intervenir l'absorption ou l'émission de
radiations
lumineuses, risquent de surcroît de perturber l'irradiation d'activation
prévue selon ce
procédé.
Dans l'hypothèse où il ne s'agit pas de systèmes affins sous-tendant une
fonctionnalisation spécifique de l'isolant des capteurs, les moyens traceurs
sont e.g.
des variations de pH ou de potentiel Redox. Il doit être considéré que ces
moyens ne
sont pas des plus fiables car il existe bon nombre de facteurs dans le milieu
d'analyse,
qui est par exemple un liquide conducteur, susceptibles d'interférer sur ces
paramètres, sans que cela ne soit lié au dosage et à l'identification des
substances
visées.
De plus, bien qu'il n'exclut pas le fait que le signal mesuré au sortir de
leur capteur
puisse être le photopotentiel, la photoconductance, la photocapacitance ou la
photoinductance, ou des combinaisons de celles-ci (colonne 3, lignes 36 et 37-
US-A-5
500 188), il est précisé lignes 41 à 43 colonne 3 de ce même brevet que le
signal
mesuré est la résultante d'un changement d'un courant continu d'un courant
alternatif
ou de l'effet d'un courant continu sur un courant alternatif. Cette préférence
quant à
la prise en compte du photocourant comme signal résultant, ressort également
de
manière claire et exclusive des exemples de ces brevets US, dans lesquels on
prend en
compte soit le courant nécessaire pour maintenir un potentiel constant entre
l'élément
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCTIFR98/01213
sensible et la référence (colonne 19 lignes 4 à 7), soit les variations de ce
courant, qui
correspondent aux changements de l'environnement chimique au voisinage de
l'isolant
de l'élement sensible (colonne 19 lignes 43 à 45) soit le potentiel requis
pour
maintenir un courant constant (colonne 191ignes 62 à 65), soit la variation du
courant
5 d'alimentation des moyens d'irradiation nécessaires pour maintenir un
potentiel
constant entre la structure de mesure et la référence (colonne 20 lignes 42 à
49). Cela
ressort également des passages colonne 26 lignes 7 à 9 et lignes 30 à 34.
Il apparaît donc que le signal central pris en considération dans le procédé
et le
dispositif selon les brevets US-A-4 591 550 et 5 500 188, est le photocourant
mesuré
de manière directe ou indirecte. Or, la relation entre l'éclairement et ce
photocourant
est mal définie et englobe plusieurs phénomènes physiques. Il en résulte donc
une
incertitude sur l'interprétation des mesures.
Force est donc de constater, que cette proposition technique hybride évoquée
ci-
dessus, ne donne nullement satisfaction en matière d'analyse qualitative et/ou
quantitative de substances, en particulier biologiques, et plus
particulièrement encore
polynucléotidiques. Les Demandeurs en veulent d'ailleurs pour preuve qu'il
n'existe à
ce jour sur le marché aucune application industrielle et commerciale de
l'invention
décrite dans ces brevets US N 4 591 550 et 5 500 188.
BREF EXPOSE DE L'INVENTION :
Aussi, pour poser la problématique à la base de la présente invention, les
inventeurs se sont fixés notamment comme objectif essentiel de fournir un
procédé
d'identification et de dosage de substances biologiques, de préférence de
polynucléotides, ce procédé devant intégrer notamment les spécifications
suivantes :
- spécificité,
- haute sensibilité,
- commodité de mise en oeuvre,
- applicabilité à une grande variété de substances biologiques, et
notamment aux substances polynucléotidiques,
- faible coût de revient,
- miniaturisation possible de façon à permettre des mesures
analytiques, in situ et/ou in vivo, de façon continue ou discontinue ;
- grande fiabilité
- bonne reproductibilité
CA 02294627 2008-08-15
6
- accès à la multidétection, c'est-à-dire l'identification et/ou le dosage
de substances différentes (polynucléotides hétéroclites) contenues
dans un seul et même milieu d'analyse,
- application au diagnostic de maladies virales, génétiques, dès lors
qu'il s'agit de multidétection simple à mettre en oeuvre à interpréter
vis-à-vis de polynucléotides.
Pour satisfaire à ces objectifs, parmi d'autres, les inventeurs ont eu le
mérite de mettre
en évidence, de façon tout à fait surprenante et inattendue, que les
appariements
spécifiques entre des molécules de préférence biologiques et plus
préférentiellement
encore entre des brins polynucléotidiques complémentaires, induisent une
modification de la charge électrique superficielle dans une structure
multicouches,
semi-conducteur Scrisolant Is fonctionnalisé superficiellement. Cette
modification
intervient plus précisément à l'interface avec un milieu liquide conducteur
LC, ledit
effet de charge constituant le signal de base d'identification et de dosage,
perçu de
manière directe ou indirecte par des moyens de transduction
optoélectrochimiques.
La mise en pratique de ce concept original et avantageux s'est
exprimé au travers de la présente invention, qui a donc pour objet un
dispositif d'identification et/ou de dosage de substances biologiques
présentes dans un milieu liquide conducteur, comprenant :
- une chambre pour le milieu liquide conducteur ;
- un capteur d'affinité disposé dans ladite chambre ; ledit capteur
d'affinité comprenant :
= un matériau semi-conducteur ayant une surface inférieure et
une surface supérieure ;
= ledit matériau semi-conducteur ayant un contact ohmique
disposé sur la surface inférieure ;
= une couche d'isolant disposée sur la surface supérieure dudit
matériau semi-conducteur ;
= une pluralité de sondes en contact avec ledit milieu liquide
conducteur ;
= ladite pluralité de sondes étant disposée sur la surface de
ladite couche d'isolant ;
CA 02294627 2008-08-15
7
= ladite pluralité de sondes comprenant une substance
biologique de reconnaissance qui est capable de s'hybrider
spécifiquement avec une substance biologique chargée,
présente dans le milieu liquide conducteur, où des
appariements spécifiques des substances biologiques
chargées avec leurs substances biologiques de
reconnaissance complémentaires sont formés, lesdits
appariements spécifiques modifiant la charge électrique de la
surface du capteur d'affinité ;
- des moyens de polarisation du matériau semi-conducteur par rapport
au liquide conducteur ;
- des moyens d'éclairement du matériau semi-conducteur ;
- des moyens. de mesure du photopotentiel Vp,, aux bornes du capteur
d'affinité ;
- des moyens de transformation des signaux détectés en variations de
potentiel de bande plate Vf, qui sont induits par un phénomène d'effet
de charge associé avec lesdits appariements modifiant la charge
électrique de la surface du capteur d'affinité ; et
- des moyens de calcul et d'interprétation des AVth en termes
d'identification et/ou de dosage des substances biologiques chargées.
L'invention concerne aussi le capteur d'affinité défini ci-dessus.
L'invention concerne aussi le procédé d'identification et/ou de dosage
de substances biologiques présentes dans un milieu liquide conducteur,
utilisant un dispositif comprenant :
- une chambre pour le milieu liquide conducteur ;
- un capteur d'affinité disposé dans ladite chambre ; ledit capteur
d'affinité comprenant :
= un matériau semi-conducteur ayant une surface inférieure et
une surface supérieure ;
= ledit matériau semi-conducteur ayant un contact ohmique
disposé sur la surface inférieure ;
CA 02294627 2008-08-15
7a
= une couche d'isolant disposée sur la surface supérieure dudit
matériau semi-conducteur ;
= une pluralité de sondes en contact avec ledit milieu liquide
conducteur ;
= ladite pluralité de sondes étant disposée sur la surface de
ladite couche d'isolant ;
= ladite pluralité de sondes comprenant une substance
biologique de reconnaissance qui est capable de s'hybrider
spécifiquement avec une substance biologique chargée,
présente dans le milieu liquide conducteur, où des
appariements spécifiques des substances biologiques
chargées avec leurs substances biologiques de
reconnaissance complémentaires sont formés ;
- des moyens de polarisation du matériau semi-conducteur par rapport
au liquide conducteur ;
- des moyens d'éclairement du matériau semi-conducteur;
- des moyens de mesure du photopotentiel VPh aux bornes du capteur
d'affinité ;
- des moyens de transformation des signaux détectés en variations de
potentiel de bande plate Vf, qui sont induits par un phénomène d'effet
de charge associé auxdits appariements modifiant la charge électrique
de la surface du capteur d'affinité ; et
- des moyens de calcul et d'interprétation des variations OVf, en termes
d'identification et/ou de dosage des substances biologiques chargées ;
dans lequel le procédé comprend :
- une fourniture à titre de sonde des substances biologiques de
reconnaissance non-marquées ;
- une mise en contact de la substance biologique chargée avec la
substance biologique de reconnaissance non-marquée, où des
appariements spécifiques des substances biologiques chargées avec
leurs substances biologiques de reconnaissance complémentaires
CA 02294627 2008-08-15
,. ,
7b
sont formés, ledit appariement spécifique modifiant la charge
électrique de la surface du capteur d'affinité ;
une polarisation du matériau semi-conducteur de sorte que le niveau
de Fermi corresponde approximativement au, ou passe par le niveau
intrinsèque en surface du matériau semi-conducteur ;
une soumission du matériau semi-conducteur à un éclairement
périodique comprenant des photons dont l'énerqie est supérieure à
l'énergie de la bande interdite du matériau semi-conducteur ;
une mesure du photopotentiel Vph aux bornes du capteur d'afFinité ;
- une détermination de l'impédance complexe du capteur d'affinité à
partir du photopotentiel Vph, une détermination des variations AVfb du
matériau semi-conducteur qui sont induites par un phénomène d'effet
de charge avec lesdites appariements spécifiques des substances
biologiques chargées avec leurs substances biologiques de
reconnaissances complémentaires; à l'exclusion :
(iii) des variations résultant d'éventuels effets de charges et/ou de
transferts de charges provoqués par des réactions chimiques
catalysées par des enzymes et dans lesquelles se produit une
consommation d'une partie des substances à détecter ; et
(iv) des variations de la photoréponse liées à l'apparition dans le
milieu liquide conducteur d'au moins un produit traceur
susceptible d'être révélé au travers de variations de pH ou de
potentiel redox, et/ou au travers de marqueurs absorbant ou
émettant des radiations ; et
- une identification et/ou un dosage des substances biologiques
chargées dans le milieu liquide conducteur par l'interprétation des
signaux reçus.
Un tel mode de mesure par transduction optoélectrochimique répond aux
spécifications recherchées de simplicité, sensibilité, spécificité, fiabilité
et
reproductibilité.
Par ailleurs, la technique selon l'invention présente également l'avantage
CA 02294627 2008-08-15
7c
d'être réversible. En effet, on peut aisément réaliser le désappariemént des
espèces
complémentaires ayant réagi spécifiquement au niveau de la membrane sensible
de la
structure semi-conductrice. La membrane sensible peut être ainsi régénérée
après
chaque utilisation et ce à de multiples reprises.
De tels résultats avantageux étaient, a priori, difficilement prévisibles.
En particulier, cette technique s'est révélée être d'une efficacité
remarquable dans le cadre de la reconnaissance de séquences polynucléotidiques
par
hybridation des monobrins d'acides nucléiques (ligands), qui forment ces
séquences,
avec des monobrins polynucléotidiques complémentaires, immobilisés sur la
couche
d'isolant de la structure Sc/Is. Ainsi, selon un mode préféré de mise en
oeuvre du
procédé selon l'invention les SBC sont des polynucléotides PN et les SBR sont
des
polynucléotides PNc.
La présente invention permet d'envisager, notamment, la reconnaissance de
séquences
nucléotidiques, par exemple en vue de la détection de maladies génétiques, de
la
détection et la caractérisation de virus, de bactéries et de parasites ou pour
l'établissement de cartes génétiques, l'étude de l'expression et/ou de la
mutation des
gènes.
i ^
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
8
Outre, l'hybridation nucléotidique, il est envisageable d'exploiter d'autres
appariements spécifiques que sont par exemple, les mécanismes biochimiques de
couplage immunologique, voire de complexation enzyme/substrat, pour peu que
l'appariement entraîne une variation de charges électriques à la surface de
Is.
EXPOSE DETAILLE DE L'INVENTION :
Le principe d'analyse qui gouverne le procédé selon l'invention est
exclusivement optoélectrique ou optoélectrochimique. Cela signifie que l'on a
à faire
à une reconnaissance biochimique affine, c'est-à-dire qui ne fait pas
intervenir de
réactions chimiques ou enzymatiques et qui se déroule sans production ou
consommation d'espèces chimiques intermédiaires. En outre, la révélation de
cette
reconnaissance biochimique affine ne se fait pas au travers d'une détection
indirecte à
l'aide de moyens physicochimiques de révélation : traceurs colorés,
fluorescents,
radioactifs, potentiels redox, pH. Conformément à l'invention, la
reconnaissance
biochimique s'opère essentiellement, voire exclusivement par une transduction
optoélectronique soustendant la polarisation de la structure Sc/Is par rapport
à LC,
ainsi que l'éclairement périodique de ladite structure.
Au sens de l'invention, l'expression électriquement chargées signifie
que lors de l'interaction affine de la PN, avec la PN, la charge électrique de
surface
est modifiée.
La première étape - a - du procédé selon l'invention consiste à mettre
exclusivement en oeuvre des sondes So, en particulier des PNc, non marqués,
c'est-à-
dire non porteurs de moyens de révélation physicochimiques (fluorescence,
colorimétrie, radioactivité, potentiel redox, pH).
Dans le cas d'une structure fonctionnalisée en surface par des sondes
constituées par des monobrins polynucléotidiques PNc par exemple d'ADN,
l'hybridation de ces derniers avec les brins à doser ou à identifier dans le
milieu LC
entraîne un accroissement de charges sur la surface de la structure. Ceci
conduit à une
modification de la répartition des porteurs de charge dans la zone de charge
d'espace
du semi-conducteur, afin de satisfaire au nouvel équilibre thermodynamique de
la
structure. Cette nouvelle répartition se traduit par une modification de la
courbure des
bandes du semi-conducteur dans sa zone interfaciale en contact avec le
diélectrique.
Le potentiel de bandes plates Vbp est le potentiel qu'il faut appliquer au
semi-
conducteur par rapport au milieu LC (électrolyte) en contact avec le
diélectrique Is
pour obtenir une courbure nulle des bandes du Sc. Conformément à l'invention,
on
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
9
mesure cette grandeur physique Vbp ou sa variation OVbp, de manière à
caractériser
l'état d'équilibre de la structure. Ainsi, la modification de la charge de
surface
correspond à une variation de Vbp, qui est elle-même une signature de
l'hybridation
PN/PNc.
Pour qu'il y ait variation de la courbure de bandes du Sc et donc de Vbp, il
convient
conformément à l'étape b du procédé selon l'invention, de créer une courbure
de
bande initiale du Sc, en procédant à l'ajustement des niveaux de fermi du Sc
et du
milieu LC, de préférence par l'imposition d'une tension de polarisation Vp
continue à
la structure Sc/Is - PNc, par rapport au milieu LC.
Conformément à un premier mode de mise en oeuvre du procédé selon
l'invention, l'ajustement du niveau de Fermi du semi-conducteur Sc
sensiblement à
son niveau intrinsèque en surface, s'opère en imposant une tension de
polarisation Vp
au Sc par rapport au LC, selon un balayage entre une tension négative et une
tension
positive limites, choisies de telle sorte que le niveau de Fermi du Sc passe
par son
niveau intrinsèque en surface, Vp évoluant ainsi avantageusement dans une
gamme de
tension correspondant au régime de désertion et de faible inversion du Sc.
Cette polarisation continue est associée, d'une part à l'éclairement
périodique selon l'étape c et d'autre part, à une mesure des variations de Vbp
suivant
l'étape d. Cette mesure est effectuée comme suit :
- recueil du photopotentiel (Vph) aux bornes du Sc (entre Sc et LC)
et/ou du photocourant (Iph)
- calcul des impédances optoélectrochimiques en phase Zop et/ou en
quadrature Zoq pour chaque valeur de Vp,
- réalisation de la (ou des) courbe(s) Zop et/ou Zoq et/ou Vph et/ou
Iph en fonction de Vp,
- et suivi du déplacement de cette (ou ces) courbe(s) parallèlement à
l'axe des abscisses (potentiels Vp), ledit déplacement correspondant
aux variations de Vbp recherchées.
Les impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq permettent d'accéder aux
propriétés énergétiques de la structure Sc/Is-So ainsi que de sa zone
interfaciale avec
le LC, et notamment aux différents effets de charge pouvant intervenir aux
interfaces.
Ces impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq sont liées au photopotentiel
Vph et
au courant Ihv, générés suite à l'excitation lumineuse périodique du Sc, par
ailleurs
soumis à une polarisation continue. En effet, l'éclairement modulé - c - du Sc
par des
photons d'énergie supérieure ou égale à la largeur de sa bande interdite,
génère des
paires électrons-trous, porteurs de charge. Ces derniers sont séparés sous
l'effet du
i ^
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
champ électrique existant dans la zone de charge d'espace du semi-conducteur
Sc
(dans la zone en contact avec le diélectrique Is). Ce phénomène entraîne
l'apparition
de Ihv périodique dans le semi-conducteur Sc, ce qui conduit aux bornes de la
structure Sc/Is-So à un photopotentiel Vph périodique ou à un photocourant Iph
5 périodique.
Il est donc possible d'utiliser indifféremment Vph et/ou Iph et/ou les
composantes impédimétriques Zop et/ou Zoq, en tant que paramètres de
transduction
des phénomènes énergétiques d'effet de charge, directement liés aux
appariements
auxquels on s'intéresse.
10 Dans le cas où la puissance de l'éclairement selon l'étape c est faible,
les
impédances optoélectrochimiques Zop et Zoq sont des fonctions de transfert
reliant
Vph à Ihv induit par l'éclairement modulé. Plus précisément, les impédances
optoélectrochimiques Zop et Zoq de la région de la zone de charge d'espace du
Sc
sont directement proportionnelles aux valeurs efficaces des composantes en
phase et
en quadrature du Vph mesuré. Le coefficient de proportionnalité dépend de
l'intensité
ou de la puissance, de l'éclairement.
Le photopotentiel est donc l'image de l'impédance opto-électrochimique de la
structure.
Dans cette variante, on préfère que l'éclairement soit non seulement faible
mais également sensiblement sinusoïdal.
Dans le cas où l'éclairement mis en oeuvre à l'étape c est fort, on accède
aux variations de Vbp, dans le cadre de l'étape d, de préférence :
^ en recueillant Vph et/ou Iph,
^ en établissant la courbe Vph = f(Vp) et/ou Iph = f(Vp),
^ et en suivant le déplacement de cette (ou ces) courbe(s) parallèlement à
l'axe des abscisses (potentiels Vp), ledit déplacement correspond aux OVbp
recherchées.
En effet, à fort éclairement, si la charge de surface varie du fait de
l'appariement des
PN du LC avec les PNc des sondes So de la structure Sc/Is, il s'ensuit une
modification du Vbp qui se traduit par un glissement de la courbe de la valeur
efficace
du photopotentiel Vph et/ou du photocourant Iph, parallèlement à l'axe des
potentiels
de polarisation de la structure.
Selon l'invention, les notions de faible et fort éclairement sont définies
comme suit :
- le faible éclairement est un éclairement qui conduit à une perturbation du
second ordre de la structure par rapport à l'équilibre thermodynamique dans
-
._._-.--T-T-------
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
11
l'obscurité. Il est de préférence inférieur ou égal à 10 W/cm2 et
préférentiellement à
1 W/cm2.
- le fort éclairement est un éclairement qui perturbe fortement l'équilibre
thermodynamique de la structure dans l'obscurité. Il est de préférence
supérieur à
10 W/cm2.
Dans les variantes à faible et à fort éclairement évoquées ci-dessus, pour
la description du premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention,
les
calculs de Zop et/ou Zoq, le pilotage et l'acquisition des mesures, ainsi que
le traçage
des courbes Zop et/ou Zoq et/ou Vph et/ou Iph =f(Vp), se font par
l'intermédiaire
d'un microordinateur, selon des procédures connues en soi (notamment calcul
des
impédances selon la loi d'Ohm).
Conformément à un deuxième mode de mise en oeuvre du procédé selon
l'invention, on adopte la méthodologie suivante :
A dans l'étape b : on fixe le niveau de Fermi du Sc sensiblement au
niveau intrinsèque en surface du Sc, en imposant une tension de
polarisation Vpi correspondant environ à l'abscisse du point
d'inflexion de la courbe Vph = f (Vp) ou Zoq = f(Vp) ou Iph =
f(Vp), Vph, Zoq et Iph étant tels que définis supra (p.9 1.4 à 7), de
telle sorte que l'ordonnée de ce point d'inflexion corresponde
environ à Vph max/2, Zoq max/2 ou Iph max/2 ;
0 et dans l'étape d, on appréhende les variations OVbp de Vbp :
(i) par la mesure de l'évolution de Vph et/ou Iph et/ou Zoq, dans le cas
où les variations AVbp sont faibles et en considérant queVbp varie
linéairement avec Vph, alors AVbp = KOVph, où K représente la
pente de la courbe Vph = f(Vp) au point d'inflexion ;
(ii) et/ou par la prise en compte des variations de la tension de
polarisation OVp, rendues nécessaires pour réguler et maintenir
constant Vph max/2, Zoq max/2 ou Iph max/2, cet ajustement OVp
étant le reflet de àVbp.
Il s'agit donc selon ce mode de mise en oeuvre de polariser la structure
Sc/ls de telle sorte que le niveau de Fermi soit au voisinage de la position
intrinsèque
du semi-conducteur. Le potentiel imposé Vpi est voisin du potentiel
correspondant au
point d'inflexion de la courbe d'allure sigmoïdale du photopotentiel Vph, du
photocourant Iph ou de l'impédance optoélectrochimique en quadrature Zoq en
fonction du potentiel de polarisation Vp.
i ^ ~
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
12
Au sens de l'invention, on entend par voisinage du niveau de Fermi
par rapport au niveau intrinsèque en surface du Sc, la position voisine du
milieu de la
bande interdite du semiconducteur à sa surface au contact de l'isolant Is,
dans une
plage telle que le semiconducteur se trouve en surface en situation de
désertion ou
faible inversion, de telle sorte que le photopotentiel Vph, et/ou le
photocourant Iph,
et/ou l'impédance optoélectrochimique en quadrature Zoq varie beaucoup avec le
potentiel de polarisation Vp.
Par suite, Vpi correspondant environ au potentiel du point d'inflexion ,
doit s'entendre, selon l'invention, par une plage d'incertitude de 0,5 Volt.
L'ordonnée du point d'inflexion de ces courbes Vph, Iph ou Zoq = f(Vp)
est avantageusement choisie comme paramètre de référence à maintenir constant
dans
le cadre de cette régulation par ajustement de Vp. La référence est en
pratique donnée
par la valeur maximale qu'atteint Vph, Iph ou Zoq dans chacune des courbes
sigmoïdales caractéristiques.
Vph max, Iph max et Zoq max correspondent en d'autres termes à la
valeur maximale du photopotentiel, du photocourant et de l'impédance
optoélectrochimique en quadrature, respectivement, lorsque le semi-conducteur
est en
régime de forte inversion.
Dans la mesure où la détermination de la valeur de consigne Vpi passe
par la prise en compte de l'abscisse et de l'ordonnée du point d'inflexion
d'au moins
l'une des courbes Vph ou Zoq ou Iph = RVp), il est prévu dans ce deuxième mode
de
mise en oeuvre d'établir au moins l'une desdites courbes, de préférence comme
décrit
supra pour le premier mode de nûse en oeuvre.
La variante (i) de l'étape d selon ce deuxième mode de mise en oeuvre
consiste à suivre AVbp par la mesure de la variation de Vph, Iph ou Zoq, après
calibration. Cela revient à établir la courbe Vph et/ou Iph et/ou Zoq = f(t)
et de
considérer que toute variation àVph, AIph ou OZoq correspond à une variation
AVbp. La variante (i) est utilisable dans le cas d'une variation modérée du
Vbp
permettant d'établir une relation simple (linéaire par exemple) entre à Vph et
àVbp.
En pratique, on préfère recourir à la variante (ii) de l'étape d selon le
deuxième mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention. Dans cette
variante, on maintient Vph max/2 constant en ajustant la polarisation Vp de la
structure, de préférence par l'intermédiaire d'une régulation électronique.
Le OVp de régulation correspond au AVbp que l'on cherche à mesurer.
CA 02294627 1999-12-14
` Répa.~4e à 1 ` oFi,ûor. Cc.ie du 9;Li11et :599
13
Selon une disposition avantageuse de l'invention, la régulation
électronique que l'on peut mettre en oeuvre dans le cadre de la variante (ii)
de prise
en compte de OVp, s'effectue de la façon suivante
- on détecte vPh,
- on amplifie éventuellement le signal vph,
- on redresse éventuellement ce signal de manière à disposer d'un
signal continu v'ph,
- ori compare ce signal v'ph continu à un signal de référence U
correspondant sensiblement à la valeur de v'ph max/2 (ordonnée de
point d'inflexion de la courbe v'ph = F (Vp) soit v'Ph max/2),
= - on recueille la différence 0(v'Ph-U) entre V'ph et U,
- on amplifie éventuellement 0(v'pb-q,
- on applique 0(v'ph-U) éventuellement amplifiée entre Sc et LC en
complément de Vp,
- on enregistre 0(v'Ph-U).
L'intérêt d'une telle procédure de régulation résulte du fait que le
potentiel électriquement imposé est directement et linéairement l'image des
variations
de Vbp provoquées par les interactions à la surface du diélectrique Is. Il est
donc
indépendant des propriétés de la structure et permet d'obtenir une bonne
sensibilité et
une excellente reproductibilité de mesure.
Selon la nomenclature adoptée dans le présent exposé, Vph désigne aussi
bien le photopotentiel primaire vPb mesuré entre Sc et LC'=que v'p6
correspondant à vPe
redressé et éventuellement amplifié.
~ S'agissant de l'étape c d'éclairement, qui est conunune aux deux modes
de mise en oeuvre évoqués ci-dessus, il y a lieu de préciser que ledit
éclairement peut
être effectué en regard de n'importe quelle zone des faces externes de la
structure
Sc/Is-So, y compris sur son épaisseur le cas échéant, voire sur la totalité de
l'extérieur
de cette structure.
En d'autres termes, l'éclairement périodique de la structure Sc/Is est donc
effectué
soit en regard de la ou des faces externes du Sc, soit en regard de la ou des
faces
externes de l'isolant Is, soit en regard de toutes les faces externes de la
structure.
Dé préférence, pour l'étape c, on choisit la longuetir d'onde de l'éclairement
1 de telle
sorte qu'elle soit supérieure ou égale à10 = 1240 run~ de
E(énergie bandeinterdite)
préférence comprise entre 100 et 3000 nm, E étant l'énergie de la bande
interdite de
Sc exprimée en électron-volt.
Ce seuil 4 est fonction de la nature du semi conducteur.
FEUILLE MODIFIEE
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
14
Selon un troisième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention,
on peut éliminer radicalement les réponses non spécifiques, en mettant en
oeuvre une
mesure différentielle, selon laquelle, on fait intervenir dans le capteur
d'affinité au
moins une autre structure Sc/Is de référence, dans laquelle Is n'est pas
fonctionnalisé
par So, et en suivant la différence entre les Vbp mesurées par les 2 capteurs,
ainsi que
la variation de cette différence.
Dans ce troisième mode de mise en oeuvre la structure Sc/Is-So de mesure et la
structure Sc/Is de référence sont mises au contact du même milieu LC. Elles
sont
polarisées de la même façon, de préférence au moyen d'une même contre-
électrode,
une électrode de référence n'étant pas nécessaire. Enfin, conformément à
l'étape c,
elles sont sounûses à un même éclairement de lumière modulée.
Par ailleurs, les moyens d'interprétation des signaux recueillis mis en oeuvre
dans
l'étape d sont choisis de manière à permettre le suivi de la différence entre
les
potentiels de bande plate VbpO et Vbpl propres aux deux structures Sc/Is et
Sc/Is-
So, respectivement.
Cette disposition permet d'obtenir une mesure très précise et en continu de la
variation du Vbpl de la structure Sc/Is-So fonctionnalisé, en s'affranchissant
des
phénomènes parasites pouvant apparaître et qui sont liés à d'autres paramètres
que
l'appariement et, en particulier, que l'hybridation PN/PNc.
Un quatrième mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention est
caractérisé, en ce que, dans une étape préalable ao, on fonctionnaGse
différentes zones
de la surface d'une couche d'isolant Is d'une même structure Sc/Is, par
plusieurs
sondes So différentes de par la nature des PNc qui les composent, et on
réalise ensuite
à l'aide de cette structure l'analyse de LC contenant un ou différents
substrats PN :
- par éclairements successifs des zones de la surface de l'Is, lesdites
zones étant chacune fonctionnalisée par une même So (PNc
identiques), la nature des So variant d'une zone à l'autre,
- et par recueil et interprétation des OVbp.
Ce quatrième mode de mise en oeuvre correspond à la multidétection de
substrats, en
particutier de PN, de natures différentes, dans le domaine de la génétique. La
multidétection selon l'invention permet d'accéder à des méthodes de détection
simple
et rapide de maladies virales et de maladies génétiques. Il est également
envisageable
de réaliser des vérifications de compatibilité tissulaire, de même que des
cartographies
de populations hétérogènes de polynucléotides, par exemple de génômes. Cela
constitue en outre un outil pour l'étude de la mutation des gènes, de
l'expression des
gènes, ou du séquençage génomique.
'` = CA 02294627 1999-12-14
Réponse à 1" ')pin~on écr, te du () Juille=. 1l 9
L'intérêt de la multidétection selon ce quatrième mode de mise en oeuvre
réside dans
la simplicité méthodologique et structurelle du procédé et du dispositif
correspondants.
De manière commune aux troisième et quatrième modes de mise en
5 oeuvre évoqués ci-dessus, à savoir respectivement la mesure différentielle
et la
multidétection, il y a lieu de noter que l'étape de mesure directe ou
indirecte de àVbp
peut être réalisée conformément à la procédure décrite pour le premier mode de
mise
en oeuvre dans l'urie ou l'autre de ces variantes à faible ou à fort
éclairement, de
même que selon la procédure propre au deuxième mode de mise en oeuvre, quelle
que
10 soit la variante (i) ou (ii) retenue.
= L'invention est une méthode de mesure fondée sur la reconnaissance de la
variation du potentiel de bandes plates (OVbp) d'une structure Sc/Is-So
possédant
une zone sensible. faite de sondes So à base de substances biologiques de
reconnaissance SBR (e.g. des PNc) aptes à réagir spécifiquement avec des
susbtances
15 biologiques électriquement chargées SBC (e.g. des PN) dans un milieu LC.
Avantageusement, les substrats à analyser sont des PN, de préférence
choisis dans la liste suivante :
nucléotides, oligonucléotides, polynucléotides, acides nucléiques (ADN ou ARN)
ainsi que les analogues et les mélanges desdits substrats.
Conformément à l'invention, les sondes So mises en oeuvre dans le procédé sont
des
moyens de reconnaissance spécifique, en particulier des PNc, non-marqués,
c'est-à-
dire non porteurs de moyens de révélation de l'appariement PN/PNc
(fluorescence,
colorimétrie, radioactivité).
~ Bien que l'on privilégie des substances biologiques du type séquence
polynucléotidique (ARN, ADN, gène, plasmide ou tout autre matériel génétique),
cela
n'exclut pas pour autant d'autres substances biologiques du type antigène,
haptène,
anticorps ou, de manière générale, toute espèce d'un couple formé par une
macromoléculaire biologique et son complément spécifique. Comme exemples de
couples ou de paires d'appariement spécifique, on peut citer : antigène-
anticorps,
haptène-anticorps, ADNc/ADN, ARNc/ARN, poly dT-ARNm, eucaryote,
lectineglycoconjugué, marqueur de cellules (ou de microorganismes)-cellules
(ou
microorganisme), HcG- récepteur tissulaire et T3 - TGB (thyrôxin binding
protein).
Le procédé selon l'invention passe tout d'abord par l'immobilisation d'au
moins un type de ces espèces biologiques PNc réactives pour constituer la ou
les
FEUILLE MODIFIEE
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
16
sondes So. Celle-ci peut se faire directement sur la couche isolante ou à
l'aide d'un
matériau intermédiaire (composés d'espacement par exemple), accolé à l'isolant
Is et
apte à recevoir par liaison physique (e.g. adsorption-absorption) et/ou
chimique (e.g.
liaison covalente), les ligands biologiques spécifiques PNc.
Selon l'invention, il est parfaitement envisageable de prévoir une des
sondes So hétérospécifiques, formées d'espèces biologiques PNc de natures
différentes, aptes à réagir avec leurs complémentaires.
Le milieu liquide conducteur LC utilisé peut être toute solution tampon
compatible avec les substances biologiques considérées PN. Ce milieu liquide
LC
possède avantageusement une conductivité équivalente à celle d'une solution
aqueuse
de NaCI ayant une concentration pouvant aller de 0,005M à 3M et
préférentiellement
de l'ordre de 0,1 M.
Le pH du milieu liquide peut être compris entre 0 et 12, de préférence entre 6
et 8 de
façon à favoriser les appariements par bioaffinité. La stringence du milieu
liquide peut
également être ajustée pour favoriser l'hybridation.
Les intéractions non spécifiques, par échange d'ions ou par interactions
hydrophobes,
peuvent être supprimées en tout ou partie à l'aide de tampon de force ionique
appropriée. (e.g. Tris-HCI/Tris-base).
Avantageusement, la température de mesure peut être comprise entre 0 et
50 C. Elle est contrôlée plus précisément de façon à favoriser les réactions
biochimiques concernées.
La présente invention a également pour objet un dispositif pour la nûse en
oeuvre du procédé tel que décrit supra, ledit dispositif étant caractérisé en
ce qu'il
comprend :
- au moins un capteur d'affinité formé par au moins une structure
Sc/Is-So dans laquelle la ou les sondes So comprennent des ligands
SBR aptes à s'hybrider spécifiquement avec les substances
biologiques SBC à analyser, contenues dans le milieu liquide
conducteur LC, en provoquant un phénomène d'effet de charge, à
l'origine des OVbP du Sc,
- des moyens de polarisation du Sc par rapport au LC,
- des moyens d'éclairement du Sc du capteur,
- des moyens de mesure du photopotentiel Vph ou du photocourant
Iph,
- des moyens de transformation des signaux recueillis en variation de
Vbp,
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
17
- et des moyens de calcul et d'interprétation des OVbp en termes
d'identification et/ou de dosage des substances biologiques SBC.
Grossièrement, ce dispositif comprend donc
- d'une part une ou des structures multicouches semi-conductrices
simples, assimilables à des électrodes de mesure,
- de deuxième part, une source de lumière modulée pour l'éclairement de
cette ou ces structures,
- et de troisième part, des périphériques électroniques de polarisation
électrique, de mesure, de calcul et d'interprétation.
Les mesures du photopotentiel Vph et/ou des impédances optoélectrochimiques en
phase Zop et/ou en quadrature Zoq sont réalisées dans une configuration de
circuit
ouvert c'est-à-dire que le circuit de mesure doit comporter une très forte
impédance
de charge.
Les mesures de photocourant Iph sont réalisées avantageusement dans une
configuration de circuit fermé (court-circuit).
Ces moyens techniques relèvent de technologies classiques et parfaitement
maitrisées
par les hommes de l'art.
En outre, ce dispositif bénéficie d'un faible coût de revient. Il peut être
produit aisément à l'échelle industrielle et offre une grande fiabilité et une
bonne
reproductibilité de mesure.
De surcroît, le caractère déjà miniaturisé voire miniaturisable des
capteurs d'affinité constituant le dispositif, ouvre des perspectives
prometteuses
notamment pour certaines applications in vivo ou in vitro.
De manière préférée, mais non limitative, l'electrode de mesure (c'est-à-
dire la structure multicouches Sc/IS-So) du capteur d'affinité du dispositif,
est formée
par au moins une plaquette de Sc, de préférence en silicium, recouverte sur
l'une de
ses faces d'au moins une couche Is d'isolant de préférence en silice, à la
surface de
laquelle sont fixées au moins une sonde So sensible comprenant au moins un
ligand
d'appariement biospécifique, de préférence des polynucléotides PNc de
reconnaissance spécifique par hybridation,
ce capteur comportant également au moins un contact ohmique permettant la
connexion de la structure Sc/Is-So, notamment, avec les moyens de polarisation
et/ou
les moyens de mesure de Vph.
Le dispositif comprend outre cette structure Sc/Is-So, au moins une
électrode auxiliaire, éventuellement prévue sur la couche Is de la Structure
Sc/Is-So.
I = CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
18
Avantageusement, la couche de matériau diélectrique bloquant Is est par
exemple, une couche d'oxyde et/ou de nitrure ou tout autre matériau minéral ou
organique de faible épaisseur, empêchant ou limitant les phénomènes
faradiques.
Cette structure est associée à un milieu liquide conducteur contenant les
substances
SBC à doser à détecter ou à identifier LC.
En pratique, le silicium choisi à titre de semi-conducteur est du type n ou p
moyennement dopé, de préférence à hauteur de 1015 à 1019 cm-3, de préférence
1016
cm-'. L'épaisseur de la plaquette de silicium est, par exemple, comprise entre
0,01 et 2
mm.
La couche isolante Is est avantageusement constituée de silice ou de nitrure
de
silicium. Elle a pour fonction d'anihiler d'éventuels processus faradiques qui
pourraient perturber les mesures, par l'intermédiaire de signaux électriques
parasites.
Cette couche Is permet également d'éviter les difficultés liées à une possible
corrosion
du matériau semi-conducteur par le milieu conducteur LC en contact.
L'épaisseur de cette couche Is est comprise entre 1 et 500 nanomètres, de
préférence
entre 1 et 50, et plus préférentiellement encore est de l'ordre de 10
nanomètres.
La couche diélectrique Is supporte les sondes So PNc, lesquelles constituent
ce qu'on
pourrait dénommer membrane bio-réceptrice en contact avec le milieu LC.
DESCRIPTION DES FIGURES :
- La Figure 1 est une représentation schématique du dispositif d'analyse
qualitative et/ou quantitative de substances biologiques, de préférence
polynucléotidiques PN présent dans un milieu liquide conducteur LC, conforme à
l'invention.
- Les Figures 2 et 3 sont des vues en coupe transversale droite, de
variantes de réalisation du capteur d'affinité montré à la Figure 1.
- La Figure 4 représente le schéma du circuit électrique de mesure des
impédances optoélectrochimiques Zop, Zoq du capteur d'affinité selon
l'invention,
conformément au premier mode de mise en oeuvre du procédé, dans sa variante
faible
éclairement.
- La Figure 5 représente le schéma synoptique d'une forme d'exécution
particulière du dispositif de mesure selon l'invention correspondant à la
variante ii de
la deuxième forme de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
19
- La Figure 6 est une représentation schématique en coupe transversale
droite d'une forme d'exécution du dispositif selon l'invention, à savoir le
capteur
différentiel correspondant au troisième mode de mise en oeuvre du procédé.
- La Figure 7 annexée est un schéma de principe de la structure
multicapteur Sc/Is-Sol à So..
- La figure 8 annexée montre les courbes Zop et Zoq = F(Vp) obtenues.
- La Figure 9 correspond aux courbes d'impédances obtenues à chaque
étape d'élaboration d'une structure active fonctionnalisée pour la
reconnaissance de
brins simples d'ADN.
- La Figure 10 est une courbe Vph = F(Vp) obtenue à l'exemple 3 pour
illustrer un premier mode de mise en oeuvre du procédé à fort éclairement.
- La Figure 11 donne la réponse en àVp de la structure fonctionnalisée
pour la détection d'oligonucléotides. Exemple 4 - 2ème mode de mise en oeuvre -
variante (ii) -
***
La présente invention sera comprise à la lumière de la description qui suit,
d'exemples
de réalisation du dispositif et de mise en oeuvre du procédé qu'elle concerne,
en
référence aux dessins annexés. Ces illustrations non limitatives font
ressortir de
nombreux avantages et variantes de l'invention.
***
La Figure 1 montre le dispositif selon l'invention qui comprend un capteur
d'affinité 1 formé par une structure 7 Sc/Is-So au contact, par sa face
supportant les
So, avec un milieu liquide conducteur LC, désigné par la référence 2. Ce
dispositif
comporte également des moyens de polarisation 3, des moyens d'éclairement 4,
des
moyens 5 de mesure de Vph, et une unité 6 de calcul et de commande comprenant
des
moyens de transformation des signaux recueillis en variation de Vbp et des
moyens de
calcul et d'interprétation des DVbp en terme d'identification et/ou de dosage
des
substances biologiques électriquement chargées à analyser, également désignées
SBC.
Le capteur d'affinité 1 est constitué par une structure 7 Sc/is-So, elle-même
formée
par une plaquette Sc de silicium 7.1, une couche d'isolant Is en silice 7.2 et
des
sondes So désignées par la référence 7.3, fixées sur la surface de l'isolant
Is 7.2 pour
fonctionnaliser cette dernière. Selon une variante, on peut déposer
éventuellement à la
surface, une couche fonctionnelle perrnettant de mieux accrocher les sondes
So. Le
capteur d'affinité 1 est pourvu sur sa face externe opposée à celle porteuse
des sondes
So 7.3, d'un contact ohmique 8 relié aux moyens de polarisation 3. Le contact
i ^
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
ohmique 8 est isolé du milieu LC 2 par l'intermédiaire d'un joint 81
périphérique. Ce
dernier coopère par contact étanche avec un support isolant 82 sur lequel
repose en
somme le capteur 1. Avantageusement, ces sondes sont constituées par des
Substances Biologiques de Reconnaissance spécifique (SBR) des SBC. Dans le
5 présent exemple, les SBC et les SBR sont des polynucléotides PN et PNc.
Une électrode de référence 9 et une contre-électrode 10 baignent également au
sein
du milieu 2 conducteur LC avec le capteur d'affinité 1. Ces deux électrodes 9
et 10
sont connectées aux moyens de polarisation 3.
Conformément à une caractéristique préférée de l'invention, une résistance de
charge
10 élevée est prévue dans le circuit potentiostatique de mesure.
Avantageusement, cette
résistance élevée R. est insérée dans la connexion reliant la contre-électrode
aux
moyens de polarisation 3. En pratique, la résistance RL est préférablement
supérieure
à 100 kS2, de préférence 50 MS2 et plus préférentiellement encore est de
l'ordre de
100 MS2.
15 Les Figures 2 et 3 montrent chacune une variante de réalisation du
capteur d'affinité 1 dans laquelle la structure 7 constitue le fond d'une
cellule de
mesure comprenant des parois 1, et un joint 12 assurant l'étanchéité entre le
fond 7 et
lesdites parois 11.
Les éléments communs aux Figures 1 à 3 sont désignés par les mêmes
20 références.
La variante de la Figure 2 se distingue de celle de la Figure 3 en ce que la
zone sensible comprenant les sondes So 73 est délirnitée dans la première
alors qu'elle
ne l'est pas dans la seconde (toute la surface de l'IS comporte des sondes So
73).
Les moyens de polarisation 3 du dispositif selon l'invention sont, de
préférence,
constitués par un potentiostat adapté, ayant par exemple une forte constante
de temps
(supérieure à 1 s). Il permet la polarisation de la structure tout en ne
perturbant pas le
photopotentiel Vph.
Dans l'exemple montré sur le schéma synoptique de la Fig. 1, qui correspond à
une
réalisation préférée de l'invention, les moyens d'éclairement 4 comportent au
moins
une source de lumière, en l'occurence une, disposée
^ soit en regard de la membrane bioréceptrice 7.3. formée par les sondes
So fixées sur l'isolant Is 7.2,
^ soit en regard de la face du Sc 7.1 opposée à la face 7.3. porteuse du
contact ohmique 8 (hypothèse symbolisée par des pointillés sur le schéma de la
Figure 1),
^ soit en regard de tout ou partie de l'extérieur de la structure 7.
- --r-~------_ . _ _
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
21
Cette source lumineuse 4 est, par exemple, constituée par un laser tel qu'un
laser
hélium-néon ayant une longueur d'onde d'émission égale = 632,8 nm.
Avantageusement, le faisceau lumineux traverse un modulateur acousto-optique
(non
représenté sur Fig.l) dont le contrôleur est piloté par un générateur basse
fréquence,
désigné par la référence 4.1 sur la Fig.l.
Un filtre non représenté permet d'ajuster la puissance lumineuse à des valeurs
inférieures, égales ou supérieures, au seuil déterminant les plages de faible
éclairement
et de fort éclairement. De préférence, la puissance lumineuse est de l'ordre
ou
inférieure ou égale à 1 W/cm2 pour les conditions de faible éclairement et
supérieure
à 10 W/cm2 pour le fort éclairement.
Les nioyens 5 de mesure de Vph sont, en pratique, constitués, par exemple, par
un
adaptateur d'impédance présentant une impédance d'entrée comprise entre 10852
et
101252, plus préférentiellement de l'ordre de 1010 S2.
Les moyens de mesure 5 comprennent également un organe de détection synchrone
piloté par le générateur basse fréquence 4.1. qui, on l'a vu ci-dessus,
détermine par
ailleurs, la modulation de l'éclairement. Cet organe de détection synchrone
donne les
composantes en phase et en quadrature de Vph.
Le micro-ordinateur 6 comprend les moyens de transformation des signaux
recueillis
en variation de Vbp ainsi que les moyens de calcul et d'interprétation àVbp,
en
termes d'identification et/ou de dosage des substances biologiques en
l'occurence des
polynucléotides PN.
Le schéma du circuit électrique de mesure est représenté sur la Fig. 4.
Dans la variante à faible éclairement, les impédances optoélectrochimiques Zop
et Zoq
sont les fonctions de transfert reliant Vph à l'intensité de l'éclairement.
Comme le montre la Fig. 4, l'effet de l'éclairement peut être représenté par
un
générateur de courant en parallèle avec la région de charge d'espace dont
l'impédance, notée Zsc, inclut les paramètres liés à la surface. Zd, est
l'impédance du
diélectrique. Elle peut être représentée par une capacitance pure. Rel et Re2
sont les
impédances de la solution electrolytique, respectivement, entre l'électrode de
travail et
l'électrode de référence, et entre l'électrode de référence et la contre-
électrode. Zp est
la résistance interne du potentiostat. RL est la résistance de charge
introduite dans le
circuit potentiostatique de mesure. Son rôle est de conférer au circuit de
mesure les
propriétés de circuit quasi ouvert vis-à-vis du photopotentiel, tout en
permettant la
polarisation de la structure ; sa valeur doit donc être suffisamment élevée
par rapport
aux autres impédances intervenant dans la mesure. Vph est le photopotentiel
mesuré
et V, est le photopotentiel qui apparaît aux bornes du semi-conducteur.
D'après le
i ^
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
22
schéma électrique, le courant total Ihv généré par l'éclairement a deux
composantes
Il qui traverse le semiconducteur et 12 qui circule dans le circuit de mesure.
On peut
alors écrire les relations suivantes :
Ihv = I1 + I2 = (Vl / Zsc) + (Vl/(RL + Rel + ReZ + Zd + Zp))
si RL Re, + Re2 + Zd + Zp alors : Vph = V, et Ihv =(Vph / Zsc) +(Vph/RL)
d'où Zsc = Vph / Ihv.
Ainsi, les impédances optoélectrochimiques en phase et en quadrature de la
région de
la zone de charge d'espace du semi-conducteur sont directement
proportionnelles aux
composantes du photopotentiel mesuré : le coefficient de proportionnalité
dépend de
l'intensité de l'éclairement.
La mesure des impédances optoélectrochimiques peut donc être utilisée pour la
détection du processus d'appariement, en particulier d'hybridation de PN/PNc,
lequel
processus étant le reflet quantitatif et qualitatif des SBC (PN) à analyser.
Les Exemples 1 et 2 ci-après illustrent la variante faible éclairement du
premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
S'agissant de la variante fort éclairement de ce premier mode, il consiste à
accéder
aux variations du potentiel de bande plate Vbp du Sc, consécutives au
phénomène de
reconnaissance biologique, par l'intermédiaire de la valeur efficace de Vph
(ou selon
une variante de Iph). Dans ce cas, l'éclairement modulé - de préférence à
basse
fréquence - utilisable n'est pas nécessairement sinusoïdal, mais peut être
simplement
périodique. Ainsi, dans le dispositif de la Figure 1, si la charge de surface
varie avec
la présence de l'espèce cible PN dans le nvlieu LC désigné par la référence 2,
cela
entraîne un AVbp, qui se traduit par un glissement de la courbe de la valeur
efficace
de Vph, parallèlement à l'axe des potentiels de polarisation de la structure.
L'exemple 3 ci-après illustre cette variante fort éclairement du premier mode
de
mise en oeuvre du procédé de l'invention, à l'aide du dispositif adapté.
Selon le deuxième mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, on
polarise la structure Sc/Is-So, de telle sorte que le niveau de fermi du Sc
soit au
voisinage de la position intrinsèque en surface du Sc. Le potentiel Vp alors
imposé est
voisin du potentiel correspondant au point d'inflexion de la courbe d'allure
sigmoïdale
de la valeur efficace de Vph, de Iph ou de Zoq.
La mesure de la variation de la valeur efficace de Vph de Iph ou de Zoq après
calibration, permet d'accéder au OVbp.
Selon la variante (ii), on ajuste la valeur efficace de Vph à une valeur
proche de sa valeur Vph. max 2 = Vphi en jouant sur la polarisation continue
initiale,
qui sera une valeur de consigne Vpi. On maintient ensuite constante la valeur
efficace
-- ~ -
CA 02294627 1999-12-14
Réponse à 1è" opinion ecrte du Q.iuitle- 1999
23
de Vphi, Iphi ou de Zoqi, en ajustant Vp par rapport à la valeur de consigne
Vpi de la
structure, au moyen d'une régulation électronique. Cet ajustement de la
polarisation
est directement l'image de AVbp. Les valeurs efficaces de Vph, de Iph et de
Zoq sont
Vph. max Iph. max Zoq. max
respectivement 2 , 2 , 2 Elles représentent chacune
sensiblement l'ordonnée du point d'inflexion de la courbe correspondante.
L'exemple 4 illustre le deuxième mode de mise en oeuvre sans fort éclairement
dans
la variante (ii).
Pour la mise en oeuvre de cette variante (ii), on a recours à une forme
particulière
d'exécution du dispositif selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend
des
~ 10 moyens d'évaluation de la variation du signal Vph ou Iph, ou Zoq par
rapport à une
référence U imposée par une polarisation Vp se surajoutant à l'éclairement
ainsi que
des moyens de correction et de régulation de la variation par action sur les
moyens de
polarisation.
La Figure 5 annexée présente le schéma synoptique d'un exemple de cette forme
particulière d'exécution du dispositif selon l'invention. Dans cet exemple, on
choisit
Vph conune signal traceur.
Comme le montre cette Figure 5, dans laquelle les éléments conununs avec ceux
de la
Figure 1, sont repérés par les mêmes références, le photopotentiel vp6 est
détecté aux
bornes du capteur d'affinité 1 (cellule, de mesure) au moyen d'un adaptateur
d'impédance 14 présentant une forte impédance d'entrée de manière à ne pas
perturber la structure. Le signal est ensuite amplifié au moyen d'un
amplificateur
alternatif basse fréquence 15, transformé en un signal continu V'Ph grâce à
une
détection synchrone 5 et à un circuit RC 16 qui permet de diminuer le bruit et
de
stabiliser la régulation.
Le signal continu v'Ph est amplifié au moyen d'un amplificateur continu 17, de
gain
G17. Gl est le gain de l'ensemble amplificateurs 15 et 17 et détection
synchrone 5. Le
signal continu v'Pe amplifié est ensuite comparé à un signal de référence U à
l'aide
d'un amplificateur différentiel 18. U est ajusté à la valeur de Vpi qui donne
au
photopotentiel une valeur moitié du photopotentiel correspondant à la forte
inversion
(Vph.max/2). La différence de valeur résiduelle 0(v'Pb-U) de ces deux signaux
est
amplifiée par l'amplificateur différentiel 18 de gain G2 et la tension de
sortie 0(v'p,,-
U) est appliquée à la structure 1 en même temps que la polarisation continue
Vp
imposée par un générateur de tension 19 couplé à un sommateur 20. Un
générateur de
signal basse fréquence 4.1. (BF) permet, après amplification à l'aide d'un
amplificateur 2.1., de commander la diode 4 dont le faisceau excite la
structure 1 et
également de référencer la détection synchrone 5. Le microordinateur 6, qui
est
FEUILLE MODIF!EE
, CA 02294627 1999-12-14
Réponse à 1~` )pinion ecrte du e juillet <<i99
24
notamment relié à un organe 22 d'acquisition de la variable v(v'P,,-U), permet
de
suivre et d'enregistrer la variation de polarisation de la structure OVp
occasionnée
par la variation du potentiel de bandes plates (OVbp).
L'intérêt d'un tel montage est que le potentiel électroniquement imposé est
directement et linéairement l'image des variations du potentiel de bandes
plates Vbp,
provoquées par les interactions à la surface du diélectrique. Il est donc
indépendant
des propriétés de la structure et permet d'obtenir une bonne sensibilité et
une
excellente reproductibilité.
La cellule (capteur) est semblable à celle décrite supra en référence à la
Figure 1.
La mesure du photopotentiel étant réalisée au moyen d'un circuit de mesure
possédant une forte impédance d'entrée, il est possible d'admettre un contact
ohmique de médiocre qualité. Pour mesurer le photopotentiel du semiconducteur
par
rapport à la solution, une électrode possédant un potentiel constant par
rapport à la
solution est nécessaire. Cependant, du fait de la forte impédance du circuit
de mesure,
il est possible d'utiliser une pseudo-électrode de référence constituée par un
métal
noble tel que le platine, par exemple. L'électrode peut être indépendante ou
être
réalisée par dépôt, sous forme d'une grille ou d'un anneau externe, sur la
surface du
diélectrique de façon à satisfaire à la miniaturisation du capteur.
L'éclairement de la structure peut être obtenu au moyen d'une diode laser ou
d'une
diode électroluminescente émettant dans le domaine de longueur d'onde du
visible ou
du très proche infra-rouge, entre 400 et 1000 nm avec une puissance lumineuse
de
l'ordre de 0,1 à 100 W/cmz. Il est tout à fait technologiquement concevable
~ d'envisager l'éclairement de la structure par la face arrière et même
d'intégrer au
capteur la partie génératrice de la lumière. Ces possibilités techniques
permettraient de
disposer d'un capteur de très faibles dimensions, dont seule la face avant
serait au
contact de la solution et qui serait ainsi, de part la nature des matériaux
qui la
composent, très peu sensible à l'agression chimique.
D est tout à fait possible d'utiliser comme signal traceur Iph. Dans ce cas,
l'adaptateur
d'impédance 14 est remplacé par un convertisseur courant/tension.
Les formes d'exécution du dispositif selon l'invention représentées aux
Fig. 1 et 5 décrites supra sont dénommées arbitrairement GENOPTEL.
Conformément à une autre forme d'exécution du dispositif selon
l'invention, correspondant au troisième mode de mise en oeuvre du procédé,
ledit
dispositif est caractérisé en ce que le capteur d'affnité comprend au moins
une
structure Sc/Is-So et au moins une structure de référence Sc/Is non
fonctionnalisée
par So, de manière à pouvoir réaliser une mesure différentielle.
FEUILLE MCDIr1CL
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
Cette forme d'exécution que l'on appelera DIGENOPT est représentée à la Figure
6.
Elle correspond au cas où l'on a un capteur d'affinité 1 ou cellule de mesure
comprenant avantageusement deux structures Sc/Is 31 et 32 quasi identiques,
l'une
étant fonctionnalisée par So, l'autre non. Ces deux structures (ou électrodes)
sont
5 mises en contact avec le même milieu 2 LC et sont polarisées au moyen d'une
même
contre-électrode 33. Une électrode de référence n'est pas nécessaire. Elles
sont
éclairées de manière identique par une lumière modulée fournie par une diode
4.
L'acheminement de la lumière vers le milieu LC 2 se fait par l'intermédiaire
d'un
conducteur optique 34, ménagé au travers du corps 35 du capteur 1.
10 Les deux structures Sc/Is 31 et 32 (électrodes) sont montées chacune à la
pointe d'un
élément 36 vissable dans le corps 35 du capteur 1.
Le corps 35 comprend une cavité fermée latéralement par les électrodes 31 et
32,
contenant le milieu LC - 2 -.
Des joints 37 sont prévus pour assurer l'étanchéité entre les différentes
parois. La
15 paroi du dessus recoît les moyens d'éclairement 4 et 34. Le fond est
traversé par la
contre-électrode 33. Les périphériques électroniques adaptés permettent de
suivre la
différence de leur Vbp respectif = Vbp 1- VbpO.
On terminera l'illustration non limitative du dispositif de l'invention, en
décrivant une dernière forme d'exécution, mais non la moindre, qui est celle
selon
20 laquelle le dispositif est caractérisé en ce que le capteur d'affinité
comprend au moins
une structure Sc/Is-So, dans laquelle les sondes So sont de différentes
natures, les
sondes So de même nature étant regroupées dans une même zone de la couche
d'I(s,
chaque zone étant circonscrite par rapport aux autres de manière à pouvoir
être
éclairée séparément partiellement ou en totalité par les moyens d'éclairement.
25 Cette forme d'exécution arbitrairement désignée par l'expression GENMAP, a
été
rendue possible en raison du fait que le principe de la mesure selon
l'invention est telle
que le photopotentiel et/ou le photocourant dépend du flux de lumière mais est
pratiquement indépendant de l'aire de la surface éclairée. Il est donc ainsi
envisageable
de réaliser sur la même structure Sc/Is des régions différemment
fonctionnalisées qui
répondent de manière spécifique à différentes espèces cibles (e.g. PNl à PNn),
la
lecture de l'appariement ou de l'hybridation étant effectué au moyen d'un
faisceau
lumineux par scrutation successive ou de manière simultanée par plusieurs
faisceaux
lunûneux.
Une telle structure Sc/Is est assimilable à un multicapteur biologique donnant
accès à
la multidétection.
^ CA 02294627 1999-12-14 =
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
26
Les différentes zones de la surface de l'Is peuvent être délimitées ou non
physiquement.
La lecture multizone par les moyens d'éclairement permet d'accéder au
potentiel de
bande plate local de chaque zone fonctionnalisée spécifiquement :
- soit par mesure de l'impédance optoélectrochimique selon le prenûer
mode de mise en oeuvre - variante faible ou fort éclairement,
- soit par mesure de la valeur efficace de Vph-variante (i) du deuxième
mode de mise en oeuvre,
- soit par prise en compte des variations de Vp permettant la régulation et
le maintien de Vph à une valeur proche de sa valeur moyenne (variante ii du
deuxième
mode de mise en oeuvre).
En d'autres termes, l'acquisition de Vbp peut s'effectuer selon l'un
quelconque des
modes de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
La Figure 7 annexée est un schéma de principe de la structure
multicapteur Sc/Is-Sol à So,,. On a repris les mêmes références que sur la
Figure 1
pour désigner les moyens d'éclairement 4, les sondes So1 à So. repérées par la
référence 7.3, la couche Is 7.2. et la plaquette de semi-conducteur Sc
référencée par
7.1. On retrouve également le contact ohmique S.
APPLICATION INDUSTRIELLE :
Ce type de dispositif ouvre la voie des applications nombreuses et variées
dans le
domaine de la génétique : détection de maladies virales, et de maladies
génétiques,
vérification de la compatibilité cellulaire, réalisation de cartes de génômes,
expression
ou mutation de gènes etc.
L'intérêt de ce dispositif comparativement aux autres dispositifs utilisés
pour la
multidétection, réside dans sa simplicité de réalisation et dans la simplicité
du mode de
lecture associé à la reconnaissance directe du processus d'hybridation.
Selon un autre de ces aspects, l'invention concerne également les capteurs
d'affinité, c'est-à-dire les structures Sc/Is-So de mesure et Sc/Is de
référence, telles
que décrites supra.
Les exemples qui suivent permettront de mieux comprendre l'invention et
de faire ressortir tous ses avantages et ses variantes, tant sur le plan du
procédé que
sur celui du dispositif.
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCT/FR98/01213
27
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : MESURE DES IMPEDANCES OPTOELECTROCHIIVIIQUES A L'AIDE DU
DISPOSTTIF DE L'INVENTION COMPRENANT UNE STRUCTURE SC/IS ELEMENT DE
BASE DU BIOCAPTEUR
1.1. APPAREILLAGE
Le dispositif mis en oeuvre dans cet exemple correspond à celui
représenté à la Fig.l.
La structure Sc/Is comprend :
- un semiconducteur ayant une épaisseur de 0,03mm est du Silicium dopé
p à hauteur d'environ 1015 cm-3, avec en face â.rrière une couche Au/Cr
assurant le
contact ohmique.
- et un isolant Is est de la silice d'une épaisseur de 10 nm obtenue par
oxydation thermique.
1.2. MILIEULIQUIDELC : SOLU770N TAMPON TRIS IM.
Cette solution tampon de pH 7.1 est composée de 10 mM TrisHCl
(Sigma) et 50 mM NaCI.
1. 3. LES CONDITIONS EXPERbLiENTALES SONT LES SUIVANTES :
la fréquence des modulations de la lumière est de 316 Hertz.
La source lumineuse est un laser hélium-néon émettant un éclairement de
longueur d'onde a, = 632,8 nm.
La puissance lumineuse est de 0,6 W/cm2
1.4. RESULTATS
La figure 8 annexée montre les courbes d'impédances
optoélectrochiniiques Zop et Zoq en fonction de Vp obtenues pour la structure
décrite précedemment.
Dans le domaine de polarisation négative, l'impédance en quadrature est
due à la capacité de la zone de charge d'espace du semi-conducteur, celle-ci
est
directement liée au dopage du semiconducteur. Dans le domaine de polarisation
positive, l'impédance en quadrature est très faible car le semi-conducteur est
en
situation d'accumulation et la capacité de la zone de charge d'espace est très
élevée.
Dans le domaine de polarisation intermédiaire, le semiconducteur passe
successivement de la situation d'inversion, à la désertion, puis à
l'accumulation,
lorsque la polarisation augmente. L'impédance en phase présente un pic dans le
domaine intermédiaire. Ce pic est dû à la présence d'états d'interface situés
entre le
semiconducteur et la couche d'oxyde. Ainsi, les impédances
optoélectrochimiques
donnent les informations énergétiques sur le semi-conducteur et sur les états
de
^ CA 02294627 1999-12-14 ^
WO 98/57157 PCT/F'R98/01213
28
surface du semiconducteur mais ne donne pas d'informations sur la couche
diélectrique. Cependant, elles permettent de déterminer le potentiel de bandes
plates
du semiconducteur. La valeur du potentiel de bandes plates est corrélée à la
position
de la courbe d'impédance en quadrature par rapport à l'axe des potentiels.
C'est le
paramètre qui permet de caractériser la charge de surface de la structure.
EXEMPLE 2 : APPLICATION DES MESURES D'IMPEDANCES SELON L'EXEMPLE A LA
DETECTION BIOLOGIQUE : PN = ADN (OLIGO dT) 1ER MODE DE MISE EN OEUVRE-
VARIANTE FAIBLE ECLAIREMENT
2.1. LE DISPOSITIF
Le dispositif utilisé, y compris la structure Sc/Is et le milieu conducteur
LC, sont les mêmes qu'à l'exemple l, à la différence près que la structure
Sc/Is est
fonctionnalisée par des sondes So constituées par des nucléotides PNc
complémentaires à des espèces cibles PN contenues dans LC.
2.2. FONCTIONNALISATION DE LA SURFACE DE L'ISOLANT IS PAR DES SONDES SO
CONSTITUES PAR DES OLIGONUCLEOTTDES dT DE 20 BASES
Après hydroxylation de la surface de Si/So2, on dépose une couche
polymérique d'APTS (AminoPropylTriéthoxySilane). Les brins d'oligonucléotides
(dT) sont greffés sur la surface par bromation : cette méthode permet de fixer
à
l'APTS le nucléotide sans utiliser les sites intervenant dans l'hybridation.
Enfin
l'hybridation est obtenue après avoir laissé la structure au contact d'une
solution
contenant des brins complémentaires poly (dA) à ceux fixés sur la surface.
2.3. RESULTATS
La Figure 9 correspond aux courbes d'impédances obtenues à chaque
étape d'élaboration d'une structure active fonctionnalisée pour la
reconnaissance de
brins simples d'ADN.
Les courbes de la Figure 9 montrent le déplacement lié à l'hybridation des
brins complémentaires PNc /PN d'ADN.
EXEMPLE 3 : ANALYSE DE POLYNUCLEOTIDES (PN) A L'AIDE DU DISPOSITIF SELON
L'INVENTION (FIG 1) - 1ER MODE DE MISE EN OEUVRE DU PROCEDE - VARIANTE
FORT ECLAIREMENT
La Fig. 10 représente la courbe Vph = f(Vp) GENOPTRODE
CA 02294627 1999-12-14
WO 98/57157 PCTIFR98/01213
29
EXEMPLE 4: ANALYSE DE POLYNUCLEOTIDES (PN) A L'AIDE D'UNE VARIANTE DU
DISPOSITIF SELON L'INVENTION (FIGURE 5), SELON LE DEUXIEME MODE DE MISE
EN OEUVRE DU PROCEDE - VARIANTE (ii)
4.1. LE DISPOSITTF
Le dispositif utilisé est celui décrit en Figure 5. La cellule de mesure et le
capteur d'affinité sont ceux représentés sur la Figure 2. La lumière modulée
est
fournie au moyen d'une diode électroluminescente ; la puissance lumineuse
utilisée est
de 10 mW/cm2.
4.2. CONDITIONS EXPERI1LIENTALES ET FONCTIONNALISATION
Le liquide conducteur LC est une solution aqueuse de 10 mM
tris(hydromethyl)aminomethane hydrochloride (Sigma) et 50 mM NaCI ; l'ensemble
de la solution est à pH 7.1. La mesure est faite à température ambiante, soit
22 C,
dans l'obscurité.
La structure Sc/Is-So est telle que décrite dans les exemples précédents.
Dans cet exemple, les sondes sont des PNc, et plus précisémment des oligos dT
de 20
bases, déposées sur la zone comme représenté en7.3 de la figure 2 à partir
d'une
solution composée de 20 l de solution aqueuse de n-bromosuccinimide en
concentration de 0,01 M ajoutée à 1 ml de solution aqueuse 1M NaHCO3 contenant
des oligos (dT)20 en concentration de lmg/ml. La structure est laissée une
nuit en
contact avec la solution des Pnc, puis abondamment rincée avec le liquide LC,
puis
montée sur la cellule de mesure. Cette cellule est alors remplie de LC et la
chaine de
mesure initialisée.
4.3 RESULTATS
La Figure 11 donne la réponse en àVp au cours du temps de la structure
fonctionnalisée Sc/Is-So où les sondes sont des oligo dT.
La courbe A correspond à la réponse obtenue lorsque le capteur est en
contact avec une solution LC à laquelle on a ajouté des cibles
(polynucléotides dC en
concentration de 1 g/ml) non complémentaire aux sondes fixées sur le capteur.
La courbe B correspond à la réponse obtenue lorsque le capteur est en
contact avec une solution LC à laquelle on a ajouté des cibles
(polynucléotides dA en
concentration de 1 g/ml) complémentaires aux sondes fixées sur le capteur.
