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PROCÉDÉ D'ISOLATION ET DE PURIFICATION
DU PACLITAXEL
A PARTIR DE SOURCES NATURELLES
DOMAINE TECHNIQUE DE L'INVENTION
La présente invention consiste dans un procédé facile et rapide d'isolation et
de
purification du paclitaxel à partir de sources naturelles. En comparaison avec
les
techniques conventionnelles connues, ce procédé est particulièrement
économique en raison d'un nombre limité d'étapes et de pertes réduites durant
la
purification.
ART ANTÉRIEUR
Le premier travail concernant le paclitaxel, aussi appelé TaxoIMD ou
PacitaxelineMD
a débuté dans les années 1960 aux États-Unis lorsque l'Institut National du
Cancer (National Cancer Institute) commença un programme de sélection des
extraits de plantes susceptibles de posséder des propriétés anti-tumeurs
cancéreuses ou des activités antinéoplastiques.
De 1960 à 1981, plus de 110 000 composés extraits de 35 000 espèces de
plantes ont été isolés et testés (Blume E. J. Natl. Cancer Inst. 1991; 83 :
1054-
1056).
L'if fait partie de ces plantes et le premier extrait à partir des écorces
(Taxus
brevifolia Nutt) de l'if provenant de la côte ouest des États-Unis (Oregon) a
été
obtenu par Wani et al.
L'extrait brut de ces écorces démontre une activité cytotoxique contre les
cellules
leucémiques et une action d'inhibiteur contre une variété de tumeurs.
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Quelques années plus tard, le composé actif de l'extrait a été isolé. Ce
composé
actif est appelé paclitaxel, la structure moléculaire de ce composé a été
déterminée par cristallographie aux rayons X et par spectre 1 H-RMN (Wall et
al.
J. Am. Chem. Soc. 1971; 93 : 2325-2327).
Depuis cette date, les études sur l'effet du paclitaxel vis-à-vis des tumeurs
cancéreuses in-vitro et in-vivo se sont multipliées et les résultats positifs
obtenus
ont amené à classifier ce composé actif comme un des médicaments prometteurs
pour le traitement du cancer de l'ovaire et du sein (Rowinski et al.
Pharmacol.
Ther. 1991; 52 : 35-84).
L'utilisation du paclitaxel pour le traitement de différents cancers a été
approuvée
par la Food and Drug Administration à partir de 1992. La première variété des
ifs
utilisés a été le Taxus brevifolia, d'autres variétés se trouvant aux
différentes
régions de la terre ont aussi été explorées. Il s'agit de : Taxus baccata,
Taxus
canadensis, Taxus walichiana, Taxus yunnanensis, Taxus densiformis, Taxus
hicksii, Taxus wardii, Taxus cuspidata, Taxus capitata, Taxus brownii (Miller
et al.
J. Org. Chem. 1981; 46 : 1469; McLaughlin et al. J. Nat. Prod. 1981; 44 : 321;
Kingston et al. J. Nat. Prod. 1982; 45 : 466; Senilh et al. J. Nat. Prod.
1984; 47 :
131-137; Huang et al. J. Nat. Prod. 1986; 49 : 665-669; Fett-Neto et al.
Bio/Technology 1992; 10: 1572-1575).
Toutes ces espèces contiennent du paclitaxel, mais en quantité très limitée
(Kingston, Pharmacol. Ther. 1991; 52: 1-34) de l'ordre de 0,0004-0,008%, cette
faible teneur en paclitaxel rend son extraction et sa purification encore plus
coûteuses à cause de longs procédés, en général par chromatographies
répétitives.
La faible concentration en paclitaxel de toutes les variétés de l'if produit
un impact
de taille vis-à-vis de l'environnement. Pour obtenir 1 kg de paclitaxel à
partir des
écorces de Taxus brevifolia, il faut abattre environ 3000 arbres matures qui
procurent 10 000 kg d'écorce. La quantité obtenue (1 kg) de paclitaxel permet
de
traiter environ 500 patients or le nombre de patients atteints du cancer est
de
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l'ordre de quelques centaines de milliers. La replantation des arbres ne
répondra
jamais à temps à la demande pressante des besoins humains à cause de leur
lente croissance (Vidensek et al. J. Nat. Prod. 1990; 53 : 1609-1610; Kelsey
et al.
J. Nat. Prod. 1992; 55 : 912-917; Wheeler et al. J. Nat. Prod 1992; 55 : 432-
440).
De nombreuses méthodes d'extraction et de purification du paclitaxel ont été
proposées, par exemple Wani et al (Wall et al. J. Am. Chem. Soc, 1971; 93:
2325-2327) proposent un procédé d'extraction du paclitaxel, à partir des
écorces
de l'if de la côte ouest (Taxus brevifolia) des États-Unis par de l'alcool
suivi de
quelques étapes de purification par chromatographie.
Miller et al (1981) ont extrait le paclitaxel à partir du Taxus walichiana
Zucc selon
la méthode suivante :
1) extraction de la plante et concentration de l'extrait;
2) élimination de la partie grasse par partition entre l'eau et l'hexane;
3) extraction avec du chloroforme et concentration;
4) purification par chromatographie sur colonne de silice;
5) purification par une deuxième chromatographie sur colonne de silice;
6) distribution à contre courant;
7) deuxième distribution à contre courant;
8) chromatographie HPLC préparative.
La méthode utilisée par Senilh et al. (1984) pour isoler le paclitaxel (ou
TaxolMD A :
0,0165%), Céphalomannine (ou TaxolMD B : 0,0064%) et les autres composés à
partir des écorces de Taxus baccata comprend les 7 étapes différentes
suivantes :
1) extraction avec de l'alcool et concentration;
2) partition entre l'eau et le dichlorométhane;
3) filtration chromatographique;
4) chromatographie sur colonne de silice;
5) chromatographie sur alumine;
6) chromatographie à pression moyenne sur colonne de silice;
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7) chromatographie préparative HPLC.
Pour les autres analogues, deux ou trois autres traitements chromatographiques
sur colonne suivis par une chromatographie préparative HPLC sont nécessaires.
Une autre méthode utilisée par Polysciences Inc. est décrite par les étapes
suivantes :
1) l'écorce broyée et séchée est extraite avec du méthanol ou avec de
l'éthanol et l'extrait combiné concentré afin d'éliminer l'alcool,
2) le concentré est alors extrait avec du dichlorométhane et l'extrait
mélangé au solvant concentré jusqu'à l'état de poudre,
3) la poudre est dissoute avec un mélange d'acétone et de ligroin (1:1)
et filtrée afin d'éliminer la matière insoluble,
4) la phase organique qui contient du paclitaxel est concentrée,
dissoute dans 30% de ligroin et appliquée sur une colonne de Florisil`,
5) la fraction paclitaxel issue de la colonne est purifiée par une double
cristallisation,
6) le paclitaxel cristallin est de plus soumis à une chromatographie sur
colonne de silice. Le paclitaxel est séparé des autres taxanes (analogues
voisins, Céphalomannine) au cours de cette étape,
7) le paclitaxel purifié obtenu à partir de l'étape précédente est
recristallisé deux fois, et
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8) les mélanges non séparés et les liqueurs mères sont rechargés dans
la colonne de silice afin d'obtenir une quantité additionnelle de paclitaxel
pur.
Bien sûr, il existe d'autres méthodes de purification du paclitaxel à partir
de
5 sources naturelles, telles que l'expliquent les références suivantes :
Kingston et al.
mentionne de nouveaux taxanes obtenus à partir du Taxus brevifolia (J. Nat.
Prod.
1982; 45: 466-470); Witherup et al. décrit une méthode de séparation du
paclitaxel et de composés voisins à partir du Taxus brevifolia (J. Liq. Chrom.
1989;
12 : 2117-2132).
L'utilisation de tissus d'if ornemental (Taxus x media Hicksii) pour la
purification de
paclitaxel est décrite dans le brevet US-A-5 279 949 délivré au nom de Nair en
1994. La séparation décrite par Nair est conduite de la façon suivante :
1) les aiguilles fraîches sont extraites avec 70% d'alcool,
2) l'extrait est décoloré avec du charbon et filtré,
3) l'extrait est concentré afin d'éliminer la majorité du solvant organique,
4) le concentré aqueux est centrifugé afin de séparer le solide précipité
qui contient du paclitaxel,
5) le solide est alors soumis à une chromatographie classique en phase
silice,
6) une seconde chromatographie à basse pression sur colonne de silice
est conduite pour traiter la fraction brute de paclitaxel, et
7) une colonne à phase renversée est utilisée pour la purification finale.
Dans le brevet US-A-5 654 448 délivré à Pandey et al., la purification du
paclitaxel
à partir de l'écorce de Taxus brevifolia est décrite de la façon suivante :
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1) l'écorce est extraite trois fois avec du méthanol, chaque extraction
est réalisée pendant une période de 5 jours, l'extrait est alors concentré;
2) le concentré à base de méthanol est partitionné à l'aide de chlorure
de méthylène et en présence d'eau, l'extrait à base de chlorure de
méthylène est évaporé jusqu'à séchage complet, le résidu solide contenant
le paclitaxel est d'environ 1,8-2,2% en poids par poids;
3) le solide résiduel est dissous dans l'acétone et mélangé avec un
volume d'hexane afin d'éliminer les impuretés polaires, le mélange est
évaporé jusqu'à 1/3 de son volume;
4) le résidu acétone/hexane est ajouté goutte à goutte à l'hexane
(1,5 L-3,0 L de résidu pour 10-15 L d'hexane) pour atteindre la précipitation,
ce matériau est filtré et séché sous vide poussé (1 mm à 2mm) à une
température de 40 C pour fournir environ 0,5-0,6 kg de matériau;
5) le résidu solide est dissous dans 0,5 L d'un mélange acétone-
chlorure de méthylène, en mélange 1:9 volume par volume et soumis à une
chromatographie sur colonne de silice, la Céphalomannine est co-éluée
avec le paclitaxel, les fractions contenant le paclitaxel et la
Céphalomannine sont mises ensemble et séchées à l'aide d'un évaporateur
rotatif, le résidu solide est un mélange brut de paclitaxel et de
Céphalomannine contenant de 36 à 40 grammes (45-55%) de paclitaxel;
6) un mélange brut (10 g) de l'étape précédente est modifié
chimiquement afin de séparer le paclitaxel de la Céphalomannine par
bromation, le résidu solide obtenu après réaction de bromation a un poids
de 13,2 g;
7) le résidu bromé est dissous dans l'acétone / dans le chlorure de
méthylène 1:9 volume par volume, et chromatographiquement séparé sur
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une colonne de silice, les fractions contenant le paclitaxel sont regroupées
et évaporées jusqu'à séchage; et
8) le résidu solide est dissous dans l'acétone et cristallisé avec un
volume égal de n-hexane ou d'autres hexanes, les cristaux ont été lavés
avec une solution froide d'acétone et d'hexane, 1/1 volume par volume,
filtrés et séchés sous vide à 40 C, les cristaux solides pèsent 4,84 g et
contiennent une quantité > 97% en poids par poids de paclitaxel tel que
mesuré par chromatographie HPLC.
Dans les brevets US-A-5 475 120 et 5 670 673 délivrés à Rao, l'isolation du
paclitaxel a été décrite comme suit :
1) l'écorce, les aiguilles, le bois, les racines, ou une combinaison de ces
composants ont été extraits avec l'alcool et concentrés sous pression (<35-
40 C) afin d'éliminer la majorité de l'alcool;
2) le concentré a été partitionné avec du chloroforme (ou du
dichlorométhane, du dichloroéthane, du tricholoroéthane), l'extrait à base
de chloroforme a été concentré sous pression réduite jusqu'à obtenir un fin
sirop et le sirop est placé dans un cristallisoir et séché dans un four sous
vide (<40 C) pour obtenir une poudre (si l'écorce et le bois étaient
utilisés),
ou des cristaux brillants en forme d'aiguilles (quand les aiguilles étaient
utilisées), à partir de 100 kg d'écorce ou de bois, le rendement de l'extrait
obtenu était de 1,5-2,5 kg et à partir des aiguilles, de 2,4-4,8 kg;
3) les extraits solides à base de chloroforme (2-2,5 kg) ont été dissous
dans l'acétonitrile (5 L) et dans de l'eau (5 L), le mélange était alors
équilibré avec un gel de silice (2-3 L de boue), une quantité additionnelle
d'eau (15 L) a été ajoutée graduellement pendant l'agitation du mélange, la
solution claire a été siphonnée et la fine boue du gel de silice qui était
alors
imprégné d'échantillon, a été transférée sur le sommet d'une colonne en
acier inoxydable. La fraction contenant le paclitaxel et divers analogues
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importants du paclitaxel étaient séparés dans une hotte dans lequel une
lente évaporation du solvant prend place, des cristaux ont commencé à se
former au bout de 1-2 jours et le processus a continué pendant 8-10 jours;
et
4) les cristaux bruts obtenus qui ont moins de 5% de Céphalomannine
ont été cristallisés deux fois à l'aide d'un mélange acétone/ligroin et en
utilisant du noir de charbon pour obtenir 41 g de paclitaxel pur, soit un
rendement de 0,04%, les quantités étant basées sur l'utilisation de 100 kg
d'écorce, de façon alternative, les cristaux bruts ont été décolorés en
faisant passer une solution dans le chloroforme à travers une courte
colonne de silice ou de Florisil. Une autre alternative pour éliminer la
Céphalomannine contaminante est l'utilisation d'ozone, un lavage de la
colonne avec 1-2% de méthanol dans le chloroforme donne la quantité de
paclitaxel récupérée par concentration et par cristallisation, le rendement
était à peu près le même que précédemment, soit 40 g, l'analyse par
chromatographie HPLC montrait que le paclitaxel récupéré comprenait
moins de 0,3% de Céphalomannine.
Dans le brevet US-A-5 969 165 délivré au nom de Liu, l'isolation et la
purification
de paclitaxel et de composés voisins à partir de Taxus canadensis par
chromatographie industrielle préparative à basse pression sont décrites de la
façon suivante.
Les aiguilles et les brindilles de Taxus canadensis (200 kg) ont été extraites
avec
1000 L de méthanol à 60 C pendant 5 heures et filtrées. Les matières premières
ont été extraites avec 700 L de méthanol à 55-60 C pendant un autre 4 heures
et
filtrées. Le filtrat a été combiné et mélangé avec 10 kg de charbon actif (5%
p/p).
Le charbon actif a été éliminé par filtration. Le filtrat a ensuite été
concentré à
approximativement 100 L, puis un mélange de 300 L d'eau et de dichlorométhane
(1:1) a été ajouté. La couche organique a été collectée et la solution aqueuse
a
été extraite deux fois de plus avec 200 L de dichlorométhane. La solution de
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dichlorométhane a été combinée et évaporée jusqu'à former une boue, ensuite
diluée avec 20 L d'acétone.
La solution à base d'acétone a été appliquée sur une colonne chromatographique
chargée avec 20 kg de Celite* 545, séchée puis chargée au sommet de trois
colonnes chromatographiques industrielles à basse pression (150.fois.15 cm).
Chaque colonne a été chargée avec 15 kg d'un absorbant à base d'oxyde
d'aluminium. Les colonnes éluées avec un système solvant constitué par un
mélange hexane : acétone à une pression comprise entre 10 et 15 psi avec un
taux de circulation d'environ 150ml/min.
Les fractions contenant les taxanes ont été récupérées et combinées et ont
alors
été concentrées pour extraire les autres solvants. Le matériau résultant a été
dissous dans le méthanol et conservé à la température ambiante pour une nuit
jusqu'à fournir des cristaux en forme d'aiguille. Les cristaux ont été filtrés
et
recristallisés à partir de l'acétone pour produire des cristaux longs en forme
d'aiguille identifiés comme étant du 13-acétyl-9-dihydrobaccatin III.
Le filtrat a été concentré jusqu'à sécheresse. Le résidu a été dissous dans 3
L
d'acétone. La solution d'acétone a été mélangée avec 1,5 kg de divinylbenzène-
polystyrène. Le solvant éliminé par évaporation et la poudre résultante
chargée au
sommet d'une colonne chromatographique industrielle à basse pression chargée
avec du polystyrène-divinylbenzène est éluée avec 45% d'acétone dans l'eau et
à
un taux de circulation de 150ml/min. sous une pression opératoire inférieure à
psi.
Les fractions contenant du paclitaxel et de la Céphalomannine ont été groupées
ensemble et évaporées pour éliminer l'acétone, puis diluées avec de l'eau
25 désionisée et extraites trois fois avec 2,5 L de dichlorométhane. La couche
organique a été concentrée jusqu'à sécheresse, et le résidu dissous dans 1 L
de
méthanol.
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De l'eau a été ajoutée à raison de 30% (volume par volume) à la solution de
méthanol et le mélange chauffé pour quelques minutes à 60 C puis gardé à la
température ambiante pour la nuit. Le solide brut cristallin obtenu à partir
de la
solution de méthanol a été filtré et séché dans un four sous vide à 70-75 C.
Le
5 solide consiste approximativement de 70% de paclitaxel et de 25% de
Céphalomannine à partir (soit un rendement de 31 grammes à partir de 200 kg)
d'aiguilles et de brindilles de Taxus canadensis.
Le paclitaxel brut a alors été dissous dans 200 ml d'acétonitrile et dilué
avec
250 ml d'eau désionisée et chargé sur une colonne chromatographique. La
10 colonne chromatographique était chargée d'une résine polymérique (Diaion*,
résine macroporeuse de polymethacrylate). La colonne a été éluée avec un
gradient progressif de 35, 40, 45 et d'une solution à 50% d'acétonitrile dans
l'eau.
Les fractions contenant le paclitaxel ou la Céphalomannine ont été combinées
individuellement et conservées à 5 C jusqu'à cristallisation.
Les cristaux de paclitaxel et de Céphalomannine ont été filtrés séparément et
les
deux recristallisés à 65 C à partir du méthanol dans l'eau.
Le paclitaxel a été obtenu sous la forme de cristaux en forme d'aiguille
blanche
avec une pureté >99% et à un rendement de 18,5 g (0,009%). La
Céphalomannine a été obtenue avec une pureté >98% et un rendement de 6,5 g
(0,003%).
La revue des différentes méthodes de purification de paclitaxel citées dans
l'art
antérieur montre que l'obtention de paclitaxel à haute pureté nécessite de
nombreuses étapes de séparation par chromatographie et de purification par
cristallisation. D'où un coût de production de paclitaxel très élevé, en
particulier de
par sa faible teneur dans les différentes espèces de Taxus, la quantité de
biomasse qui peut être purifiée est très limitée à cause de la petite taille
des
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colonnes de chromatographie et à cause du faible rendement en paclitaxel après
la purification.
OBJET ET RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention a principalement les deux objets suivants, à savoir la
mise à
disposition :
- d'un procédé permettant d'éliminer des contraintes au niveau de l'obtention
des biomasses après l'extraction des écorces ou d'aiguilles et des branches
de Taxus de différentes espèces, d'augmenter la quantité de biomasse qui
peut être purifiée par chromatographie, de réduire les étapes de purification,
d'augmenter le rendement en paclitaxel et finalement de ramener le coût de
produit à un niveau plus économique; et
- d'un mélange de cristaux de paclitaxel à haute pureté.
Le premier objet de la présente invention est- atteint grâce à un procédé
d'extraction et de purification du paclitaxel à partir d'une source naturelle
de
taxanes contenant le paclitaxel à extraire, ledit procédé comportant les
étapes
suivantes :
a) extraction, à l'aide d'un solvant organique, d'une matière première
comportant du paclitaxel à partir de ladite source naturelle de taxanes;
b) traitement de ladite matière première dans un milieu basique ou acide
pour obtenir une biomasse par précipitation, isolation de ladite biomasse et
séchage de celle-ci;
c) percoloration de la biomasse ainsi isolée par enlèvement de la résine
et des pigments naturels contenus dans celle-ci, dissolution de ladite
biomasse
dans de l'acétone et puis ajout à celle-ci d'au moins un solvant non polaire,
jusqu'à ce qu'une phase huileuse enrichie en paclitaxel soit obtenue;
d) traitement de la biomasse contenue dans la phase huileuse enrichie
en paclitaxel récupérée dans l'étape précédente, dans un milieu acide quand le
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traitement de l'étape b) a été effectué dans un milieu basique, ou dans un
milieu
basique quand le traitement de l'étape b) a été effectué dans un milieu acide,
de
façon à obtenir une autre biomasse, isolation de cet autre biomasse et séchage
de celle-ci;
e) purification chromatographique effectuée au moins une fois de l'autre
biomasse isolée obtenue dans l'étape précédente dans un solvant volatil du
précipité isolé et cristallisation effectuée au moins une fois de la solution
purifiée
obtenue par chromatographie.
Le deuxième objet de la présente invention est atteint par un mélange de
cristaux
de paclitaxel caractérisé en ce que, après filtrage et séchage des cristaux,
ledit
mélange est constitué de :
53% de cristaux d'une pureté > 99%,
- 22% de cristaux d'une pureté > 98%, et
23% de cristaux d'une pureté > 92%.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
La présente invention décrit un procédé d'extraction et de purification du
paclitaxel
à partir d'une source naturelle de taxanes contenant le paclitaxel à extraire,
ce
procédé comporte cinq étapes de base qui seront ci-après explicitées.
Ce procédé est présenté dans le diagramme de la Figure I.
Étape 1 - Extraction
La source naturelle de taxanes utilisée comme matière première du procédé
selon
l'invention est du genre Taxus.
Il s'agit plus particulièrement de toutes les espèces de conifères contenant
du
paclitaxel.
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Le procédé consiste à extraire des substances contenant le paclitaxel et ses
analogues par un mélange de solvant organique.
Selon un mode particulièrement avantageux de réalisation de l'invention,
l'espèce
de conifère contenant du paclitaxel est choisi dans le groupe constitué par
Taxus
brevifolia, Taxus baccata, Taxus canadensis, Taxus walichiana, Taxus
yunnanensis, Taxus densiformis, Taxus hicksii, Taxus wardii, Taxus cuspidata,
Taxus capitata, Taxus brownii.
Le procédé selon l'invention présente l'avantage d'être applicable au
traitement de
toutes les parties constitutives de la source naturelle de taxanes qui
contiennent
du paclitaxel.
De façon avantageuse, l'extraction est réalisée à partir des écorces de la
source
naturelle de taxanes.
Selon un autre mode préférentiel de l'invention, l'extraction est
simultanément
réalisée à partir des branches et des aiguilles de la source naturelle de
taxanes.
Selon un mode préférentiel l'extrait est ensuite filtré pour enlever les
dépôts et
transvasé dans une cuve à double parois dans laquelle de l'eau chaude (de
préférence à une température de 65-70 C) circule. Le solvant est distillé de
cette
cuve jusqu'à l'obtention d'un liquide très épais. L'extrait est alors récupéré
et
dissous dans du méthanol.
Dans l'étape d'extraction, le solvant organique utilisé est, de préférence,
choisi
dans le groupe constitué par les alcools, les hydrocarbures halogénés et les
mélanges d'alcools et d'hydrocarbures halogénés.
On utilise de façon particulièrement avantageuse du méthanol, du
dichlorométhane, du trichlorométhane ou un mélange de méthanol et
dichlorométhane ou un mélange de méthanol et de trichlorométhane.
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Dans le cas où on utilise un mélange alcool-hydrocarbure halogéné, le rapport
volumique du mélange a une valeur avantageusement comprise entre 9:1 et 1:9.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le rapport volumique
de
ce mélange alcool-solvant halogéné est d'environ 1:1.
2 - Première précipitation
Dans cette étape, la précipitation de la biomasse est réalisée indifféremment
en
milieu basique ou en milieu acide.
Dans le cas où la précipitation est réalisée en milieu basique ce milieu est
avantageusement constitué par une solution d'un sel basique tel qu'un acétate
de
sodium, un acétate de potassium ou tris(hydroxyméthyl)aminométhane aussi
appelé TRIS. Selon un mode particulièrement avantageux le milieu basique est
constitué par une solution d'hydroxyde de sodium.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la concentration
d'hydroxyde de sodium dans la solution basique est comprise entre 10 millimols
et
80 millimols par litre de solution.
De façon encore plus préférentielle, la concentration d'hydroxyde de sodium
est
comprise entre 20 millimols et 50 millimols par litre de solution.
Le pH du milieu basique est habituellement compris entre 8,5 et 11, de
préférence
entre 9 et 10.
Lorsque la précipitation est réalisée en milieu acide, le milieu acide est
habituellement constitué par une solution d'un acide minéral ou par une
solution
d'un acide organique.
L'acide est choisi dans le groupe constitué par les acides chlorhydriques,
acétiques et citriques.
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Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, la concentration en
acide
de la solution est comprise entre 10 millimols et 50 millimols par litre de
solution.
De façon plus préférentielle, la concentration en acide est comprise entre 20
millimols et 30 millimols par litre de solution.
5 Le pH du milieu acide est avantageusement compris entre 2 et 4.
Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, le volume de la
solution
basique ou acide ajoutée pour provoquer la précipitation de la biomasse est
compris entre 1 à 20 fois le volume de l'extrait obtenu dans la première étape
d'extraction.
10 De préférence, le volume de la solution basique ajouté est compris entre 1
à
15 fois le volume de l'extrait obtenu dans l'étape d'extraction.
Dans le cas de la solution acide, le volume ajouté est avantageusement compris
entre 1 à 10 fois le volume de l'extrait obtenu dans l'étape d'extraction.
Dans ces conditions, le précipité formé est très fin et léger, sa filtration
est très
15 difficile. Le précipité ne peut être récupéré totalement par une
centrifugation à
faible vitesse (5000 tpm). Une vitesse de 15 000 ou même de 20 000 tpm est
nécessaire pour efficacement séparer le précipité de la solution.
Selon un mode préférentiel et dans le but de faciliter l'isolation du
précipité de la
biomasse recueillie dans cette première étape de précipitation, la biomasse
obtenue par précipitation dans l'étape 2 est en outre relarguée avant
isolation et
séchage par ajout de chlorure de sodium jusqu'à une concentration comprise
entre 25 et 200 grammes par litre de solution acide ou basique résultant de la
précipitation.
De préférence, le chlorure de sodium est ajouté jusqu'à une concentration
comprise entre 50 et 100, de préférence entre 50 et 75, grammes par litre de
solution acide ou basique résultant de la précipitation.
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16
Ce traitement de relargage de la solution par le chlorure de sodium permet
d'obtenir une floculation. Le précipité ainsi obtenu est plus lourd, plus
aggloméré
et plus facile à filtrer ou à centrifuger à faible vitesse.
Le chlorure de sodium est de préférence ajouté rapidement dans la solution
sous
forte agitation.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la biomasse
précipitée
dans cette étape est séparée de la solution par filtration ou par
centrifugation puis
séchée à l'air libre ou sous vide, de préférence par ventilation ou par
lyophilisation.
Étape 3 - Percoloration
Le ou les solvants non polaires utilisés dans cette étape pour la
percoloration est
(sont) de préférence choisi(s) dans le groupe constitué par les hydrocarbures.
Il s'agit de préférence d'un hydrocarbure miscible avec l'acétone tel que
l'hexane
ou l'heptane.
Au cours de cette étape, la biomasse séchée résultant de l'étape précédente de
précipitation est remise en solution sous forme d'un mélange préparé par
addition
d'acétone jusqu'à un volume égal à 2 volumes de la matière première extraite
dans l'étape 1 et avant précipitation.
De préférence, la biomasse séchée est remise en solution sous la forme d'un
mélange obtenu par ajout d'acétone puis par ajout d'eau.
L'eau est avantageusement ajoutée à raison de 2 à 10 volumes pour 100 volumes
d'acétone ajouté.
Le volume de l'hexane est habituellement de 3 à 4 fois celui de la solution
d'acétone.
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17
Le mélange ainsi obtenu est transféré dans une ampoule à décanter, la phase
huileuse contenant le paclitaxel et les autres taxanes déposés au fond est
récupérée. La phase huileuse est ensuite évaporée et remplacée par du
méthanol.
De façon plus préférentielle encore, l'eau est ajoutée à raison de 5 à 7
volumes
pour 100 volumes d'acétone ajouté.
Cette étape permet d'éliminer considérablement les résines et les pigments
naturels des plantes.
Étape 4 - Deuxième précipitation
Dans cette étape, la phase enrichie en paclitaxel obtenue dans l'étape
précédente
de percoloration est évaporée à sec et remise en solution dans le méthanol.
La solution de méthanol ainsi obtenue est précipitée en milieu basique lorsque
la
première précipitation a été réalisée, dans l'étape 2, en milieu acide, ou en
milieu
basique lorsque la première précipitation a été réalisée, dans l'étape 2, en
milieu
acide, pour donner une biomasse contenant du paclitaxel, et dans laquelle le
paclitaxel est sous forme de précipité.
Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, la biomasse obtenue
par
précipitation dans cette étape est en outre relarguée avant isolation et
séchage
par ajout de chlorure de sodium jusqu'à une concentration comprise entre 30 et
200 grammes par litre de solution acide ou basique résultant de la
précipitation.
De façon préférentielle, le chlorure de sodium est ajouté jusqu'à une
concentration
comprise entre 50 et 100 grammes par litre de solution acide ou basique
résultant
de la précipitation.
Le précipité contenant la biomasse est filtré et séché à l'air libre ou sous
vide ou
lyophilisé.
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18
La solution obtenue, dans un solvant volatil, du précipité isolé dans l'étape
4 de
précipitation est soumise à au moins une purification chromatographique et à
au
moins une étape de cristallisation à partir de la solution purifiée obtenue
par
chromatographie.
5 - Étape de purification chromatographique
Le précipité obtenu après séchage dans l'étape 4 de précipitation est mis en
solution dans un solvant volatil puis soumis à au moins une étape de
purification
chromatographique et à au moins une étape de cristallisation à partir de la
solution
purifiée obtenue par chromatographie.
Selon un mode avantageux de réalisation du procédé selon l'invention, le
précipité
obtenu après séchage dans l'étape 4 de précipitation est soumis à plusieurs
purifications chromatographiques et plusieurs cristallisations.
Selon un mode particulièrement avantageux de réalisation de l'invention, le
précipité obtenu après séchage dans l'étape de précipitation est soumis à
trois
purifications chromatographiques et à trois cristallisations. Ces
purifications et
cristallisations successives constituent les étapes A à F, ci-après
explicitées.
A - Première purification chromatographigue
Dans la première étape de purification chromatographique, la biomasse obtenue
dans l'étape 4 de précipitation est remise en solution dans un solvant volatil
et la
solution de ce solvant est mélangée avec un gel de silice et séchée sous
ventilation, puis le gel de silice recouvert de la biomasse est déposé sur une
colonne chromatographique contenant le même type de gel, la biomasse est alors
purifiée à l'aide d'un mélange d'élution comprenant de 30 à 40% d'acétone et
de
60 à 70% d'hexane.
Selon un mode préférentiel de réalisation de cette étape, le mélange d'élution
comprend environ 40% d'acétone et environ 60% d'hexane.
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19
Le deuxième précipité formé dans l'étape 4 est très fin et léger, ce qui rend
sa
filtration très difficile.
Le précipité ne peut être que partiellement récupéré par une centrifugation à
faible
vitesse (5000 tpm). Une vitesse comprise entre 15 000 et 20 000 tpm permet de
bien séparer le précipité de sa solution. Un relargage de la solution par le
chlorure
de sodium permet d'obtenir une floculation, ceci rend le précipité plus lourd,
plus
aggloméré et plus facile à filtrer ou à centrifuger à faible vitesse. La
concentration
du chlorure de sodium est de 25 à 100 g par litre de solution, préférablement
de
50 à 75 g par litre de solution. Le chlorure de sodium est ajouté rapidement
dans
la solution sous forte agitation.
Le précipité obtenu est dissous avec un minimum d'acétone et filtré pour
éliminer
les particules insolubles. La solution d'acétone est mélangée avec du gel de
silice
et puis séchée sous ventilation ou sous vide.
Le gel imprégné de paclitaxel et de ses analogues est chargé sur une colonne
(142 cm x 7,6 cm de diamètre intérieur) contenant 2,2-2,3 kg de gel de silice.
Le
gel de la colonne est lavé et équilibré avec un mélange de solvant: acétone -
hexane (40-60%, volume par volume). L'élution des fractions est réalisée avec
le
même mélange de solvant, le débit est de 100 ml/min, la pression varie entre 0-
30
psi.
B - Deuxième étape de purification chromatopraphigue
Dans cette étape, les fractions enrichies en paclitaxel récupérées dans
l'étape
précédente de première purification chromatographique sont préférentiellement
groupées ensemble puis évaporées à sec jusqu'à obtention d'un résidu.
Un mélange dudit résidu est alors préparé par solubilisation dans un solvant
volatil. Le mélange ainsi obtenu est alors repurifié par chromatographie dans
les
mêmes conditions que dans l'étape précédente pour fournir de nouvelles
fractions
enrichies en paclitaxel.
CA 02299149 2008-06-27
Selon un mode préférentiel, le résidu est redissous dans de l'acétone, puis
mélangé avec du gel de silice et séché.
Le gel imprégné de paclitaxel et de ses analogues est chargé sur une colonne
(142 cm x 7,6 cm de diamètre intérieur) contenant 2,2-2,3 kg de gel de silice.
Le
gel de la colonne est lavé et équilibré avec un mélange de solvant: acétone -
hexane (40-60%, volume par volume). L'élution des fractions est réalisée avec
le
même mélange de solvant, le débit est de 100 ml/min, la pression varie entre 0-
30
psi.
Les fractions contenant le paclitaxel (en général de 40 à 60% de paclitaxel)
sont
groupées ensemble.
Plus précisément,
- les fractions enrichies contenant du paclitaxel obtenues par chromatographie
à l'étape (el), sont regroupées, évaporées à sec et remises en solution dans
un
solvant volatil;
- la solution obtenue est mélangée avec un gel de silice et séchée sous
ventilation;
- le gel de silice recouvert de la biomasse est déposé sur une colonne de
chromatographie contenant du gel de silice; et
- le paclitaxel est alors repurifié par un mélange de solvant organique
comprenant de 30 à 40% d'acétone et de 60 à 70% d'hexane.
De préférence, le mélange de solvant organique contient environ 40% d'acétone
et 60% d'hexane.
C - Première cristallisation
Dans cette étape, les fractions contenant du paclitaxel, obtenues par
chromatographie dans l'étape précédente de purification, sont regroupées et
évaporées à sec, remises en solution dans l'acétone, la quantité d'acétone
étant
ajustée de façon à obtenir une absorbance de cette solution ayant une valeur
de
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20a
1,0 à 1,5 D.O. pour le pic correspondant au paclitaxel selon l'analyse par
HPLC,
puis le paclitaxel est cristallisé en ajoutant de 3 à 4 volumes d'hexane dans
la
solution d'acétone.
Les cristaux se forment rapidement, le mélange est laissé au repos toute la
nuit à
température ambiante ou à une température comprise entre 2 et 8 C pour
compléter la cristallisation.
D - Deuxième cristallisation
Dans cette étape, les cristaux obtenus par recristallisation dans l'étape
précédente
de première cristallisation sont séparés par filtration, remis en solution
dans
l'acétone avec un volume d'acétone ajusté de façon à obtenir une absorbance de
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la solution variant de 1,0 à 1,5 D.O. pour le pic correspondant au paclitaxel
selon
l'analyse par HPLC.
Puis le paclitaxel contenu dans cette solution est recristallisé par ajout de
3 à
4 volumes d'hexane dans la solution d'acétone.
Les cristaux obtenus dans cette étape ont, selon les analyses HPLC, une pureté
en paclitaxel >80%.
E - Troisième purification chromatopraphigue
Dans cette étape, les cristaux obtenus dans l'étape précédente de deuxième
cristallisation sont filtrés puis remis en solution dans le chlorure de
méthylène.
La solution ainsi obtenue est alors mélangée avec un gel de silice et séchée
sous
ventilation.
Le gel de silice est alors recouvert de paclitaxel et déposé sur une colonne
chromatographique contenant le même type de gel. Le paclitaxel est alors
repurifié pour la troisième fois par un mélange d'élution à base de solvant
organique.
De préférence, le mélange d'élution comprend de 95 à 98% de chlorure de
méthylène et de 2 à 5% d'isopropanol.
Selon un mode préférentiel, les cristaux sont dissous avec du chlorure
méthylène,
ensuite mélangés avec du gel de silice, puis séchés. Le gel imprégné de
paclitaxel
est chargé sur une colonne chromatographique (76 cm x 7,6 cm de diamètre
intérieur) contenant 1,5-1,6 kg de gel de silice. Le gel de la colonne est
lavé et
équilibré avec un mélange de solvants: chlorure méthylène et iso-propanol (98 -
2%, volume par volume). L'élution des fractions est réalisée avec le même
mélange de solvants, le débit est de 50 ml/min, la pression varie entre 0-30
psi.
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F - Troisième cristallisation
Dans cette étape, les fractions enrichies contenant du paclitaxel récupérées
par
chromatographie dans l'étape précédente de purification sont regroupées selon
leur pureté, de préférence selon les puretés +98 à 99% et 90 à 98%, puis
évaporées à sec puis remises en solution dans le méthanol.
Le volume de méthanol ajouté est ajusté de façon à obtenir une absorbance
variant de 1,0 à 1,5 D.O. pour le pic correspondant au paclitaxel selon
l'analyse
par HPLC.
Puis le paclitaxel est recristallisé pour la troisième fois par ajout de 2 à
10 volumes
d'eau dans la solution de méthanol.
Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le paclitaxel est
recristallisé pour la troisième fois par ajout de 4 à 7 volumes d'eau dans la
solution
de méthanol.
De façon préférentielle, et plus particulièrement dans la dernière étape de
purification et de recristallisation, l'eau utilisée est une eau préalablement
purifiée.
La purification de l'eau est, de préférence, réalisée par désionisation et/ou
par
distillation.
Selon un autre mode préférentiel, 7 à 10 volumes d'eau pure préalablement
refroidie à une température comprise entre 2-4 C sont ajoutés dans un volume
de
la solution de méthanol refroidie dans de la glace. Les cristaux apparaissent
immédiatement. La cristallisation est poursuivie toute la nuit à une
température
comprise entre 2-4 C. L'addition de l'eau dans la solution de méthanol peut se
faire à la température ambiante. La formation des cristaux sera alors plus
lente,
elle sera complétée durant la nuit à 2-4 C. Les cristaux sont filtrés et
séchés sous
ventilation ou sous vide, pour obtenir une poudre fine et détachée, les
cristaux
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sont remis en suspension dans de l'eau pure et lyophilisés pendant 66 à 72
heures à une température de l'ordre de -60 C.
Les fractions de taxanes sont analysées par chromatographie HPLC (Waters
system) comprenant 1 Autosampler (Waters 717 plus), 1 Photodiode Array
Detector (Waters 996), 1 Multisolvent Delivery System (Waters* 600E) et 1
colonne Nova-Pak* C18, 60 A, 4pm (3,9 x 150 mm).
L'analyse des fractions est effectuée par injection d'un volume de 5 pi; le
débit de
la phase mobile est de 1ml/min., en utilisant. un gradient de solvant :
acetonitrile -
eau - méthanol (au début 20 : 50: 30; à la fin 35 : 35 : 30).
Les pics des composés sont détectés à 228 nm et le temps d'analyse d'un
échantillon est de 36 minutes.
Selon un mode particulièrement avantageux de réalisation du procédé selon la
présente invention, le solvant volatil utilisé dans les étapes 5, 6 et 9 de
purification
chromatographique pour la solubilisation du résidu est choisi dans le groupe
constitué par les cétones, les alcools légers en C1-C3, l'acétate éthyle, le
chlorure
de méthylène et les mélanges de ces solvants.
A la fin de l'étape F après cristallisation du paclitaxel dans l'eau, après
filtration
puis séchage, on recueille un mélange de cristaux de paclitaxel.
Avantageusement, l'eau utilisée dans l'ensemble du procédé est purifiée par
désionisation et/ou par distillation.
Ce mélange de cristaux de paclitaxel est constitué, après filtrage et séchage
des
cristaux, de :
- 53% de cristaux d'une pureté supérieure à 99%,
22% de cristaux d'une pureté supérieure à 98%, et
23% de cristaux d'une pureté supérieure à 92%.
* marque de commerce
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EXEMPLES DE MISE EN OEUVRE DU PROCÉDÉ SELON L'INVENTION
Les exemples ci-après sont donnés à titre purement illustratif et ne sauraient
être
considérés comme constituant une limitation de la présente invention.
EXEMPLE 1
50 kg d'aiguilles et de petites branches sèches de Taxus canadensis sont
lavées
avec de l'eau déionisée et séchées sous ventilation. Les matières premières
sont
broyées et transférées dans un sac en coton. Ce sac est ensuite mis dans une
cuve inoxydable contenant 150 L d'un mélange de solvant (Chlorure méthylène -
Méthanol; 1:1 volume par volume). L'extraction se fait pendant 16 heures à la
température ambiante. L'extrait est ensuite pompé à travers des filtres dans
une
deuxième cuve à double parois. Le solvant est distillé à l'aide d'une
circulation
d'eau chaude à 70 C dans la double paroi jusqu'à l'obtention d'un liquide très
épais.
Première précipitation
Le concentré de l'extrait est récupéré et dilué avec 2 L de méthanol. La
biomasse
est isolée par précipitation en ajoutant l'extrait dans une solution de NaOH à
20
mM. Un précipité très fin se forme au fur et à mesure de l'ajout de l'extrait
dans la
solution de NaOH. Le rapport de l'extrait par rapport à la solution basique
est de
1:15.
Ce précipité fin est très difficile à filtrer, la centrifugation à haute
vitesse :15 000-
20 000 tpm peut permettre de récupérer la biomasse. Un relargage de la
solution
par NaCI à raison de 50g/L de solution permet de rendre le précipité plus
aggloméré. Le précipité est filtré ou centrifugé à 4200 tpm à 20 C pendant 30
minutes (Centrifugeuse Beckman J6MC, rotor JS 4.2). Une centrifugeuse à flot
continu peut être utilisée pour un grand volume.
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Le précipité récupéré est séché à l'air ou sous vide ou lyophilisé (Freeze
dryer -
FTS Systems), le poids du précipité est de 500-550 g. Ce précipité est
solubilisé
dans 2 L d'acétone et filtré ou centrifugé à 4200 tpm, à 0-2 C pendant 30
minutes
pour enlever les particules insolubles.
5 Percoloration
Ensuite, 1 L de solution d'acétone est transvasé dans une ampoule à décanter
de
6 L, la solution est percolorée par 4 L d'hexane en ajoutant 1 L à la fois
avec une
forte agitation manuelle à chaque fois. Le mélange est laissé à reposer
pendant
une dizaine de minutes, la phase huileuse est récupérée au fond de l'ampoule.
Le
10 volume d'acétone peut être traité totalement en une seule fois en utilisant
un
grand bécher ou une cuve adéquate, la phase hexane est siphonnée et le liquide
restant est transvasé dans une ampoule à décanter pour terminer la
récupération
de la phase huileuse. La phase hexane très colorée est écartée.
Deuxième précipitation
15 La phase huileuse est ensuite évaporée à sec. Le résidu est dissous dans 2
L de
méthanol. La biomasse est isolée pour la deuxième fois par précipitation en
ajoutant la solution de méthanol dans une solution de HCI à 20 mM. Un
précipité
très fin se forme au fur et à mesure de l'ajout de l'extrait. Le rapport de
l'extrait par
rapport à la solution acide est de 1:5. Ce précipité fin est très difficile à
filtrer, la
20 centrifugation à haute vitesse :15 000-20 000 tpm peut permettre de
récupérer la
biomasse. Un relargage de la solution par NaCI (50 g/L de solution) permet de
rendre le précipité plus aggloméré. Le précipité est filtré ou centrifugé à
4200 tpm
à 20 C pendant 30 minutes (Centrifuge Beckman J6MC, rotor JS 4.2). Une
centrifugeuse à flot continu peut être utilisée pour un grand volume.
25 Première purification par chromatographie sur gel de silice à basse
pression
Le précipité récupéré est séché à l'air ou sous vide ou lyophilisé, le poids
du
précipité est de 240-260 g. Ce précipité est solubilisé dans 0.5 L d'acétone
et filtré
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ou centrifugé à 4200 tpm, à 0-2 C pendant 30 minutes pour enlever les
particules
insolubles. La solution d'acétone est mélangée avec 200-250 g de gel de silice
(230-400 mesh, qualité pharmaceutique, Silicycle*, Québec, Canada). Le gel
imprégné de l'extrait est séché à l'air sous ventilation ou sous vide. Le gel
séché
est chargé sur une colonne (142 x 7,6 cm de diamètre intérieur) contenant 2,2
kg
de gel de silice (230-400 mesh). Le gel est lavé et équilibré avec un mélange
d'acétone et d'hexane (40:60%, volume par volume). L'élution est effectuée
avec
le même solvant à l'aide d'un système de délivrance de solvant Dynamax*, le
débit de l'élution est de 100 ml/min. avec une pression entre 10-30 psi. Le
volume
du mélange de solvant est de 30 L et chaque fraction est collectée avec 1 L de
solvant. Les analyses par HPLC indiquent qu'il y a 9 fractions qui contiennent
du
paclitaxel, de la 17e fraction à la 25e fraction.
Les teneurs de paclitaxel déterminées par HPLC dans ces fractions sont comme
suit : 11; 24; 32; 40; 38; 33; 29; 14 et 9%. L'ordre des fractions contenant
du
paclitaxel peut être décalé d'une ou de deux fractions d'une purification à
l'autre.
Deuxième Purification par chromatographie sur gel de silice à basse
pression
Les fractions contenant du paclitaxel sont groupées ensemble et évaporées à
sec.
Le résidu est resolubilisé dans 100 ml d'acétone et mis en contact avec 100 g
de
gel de silice. Le gel enrobé de paclitaxel est séché à l'air sous ventilation
ou sous
vide. Le gel séché est chargé sur une colonne (142 x 7,6 cm de diamètre
intérieur)
contenant 2,2 kg de gel de silice (230-400 mesh). Le gel est lavé et équilibré
avec
un mélange d'acétone et d'hexane (40:60%, volume par volume). L'élution est
effectuée avec le même solvant à l'aide d'un système de délivrance de solvant,
le
débit de l'élution est de 100 ml/min. avec une pression entre 10-30 psi. Le
volume
du mélange de solvant est de 30 L et les fractions sont collectées avec 1 L de
solvant par fraction Les analyses par HPLC indiquent qu'il y a 5 fractions qui
contiennent du paclitaxel de la 22e fraction à la 26e fraction, la teneur de
paclitaxel
* marque de commerce
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déterminée par HPLC dans ces fractions sont comme suit : 40; 58; 66; 50 et
49%.
L'ordre des fractions contenant du paclitaxel peut être décalé d'une ou de
deux
fractions d'une purification à l'autre.
Première cristallisation
Les fractions contenant du paclitaxel sont groupées ensemble et évaporées à
sec.
Le résidu est resolubilisé dans 800 ml d'acétone. L'ajustement du volume
d'acétone est nécessaire selon l'analyse par HPLC de façon à obtenir une
absorbance d'1,0 à 1,5 D.O. pour le pic de paclitaxel. 3 volumes d'hexane (2.4
L)
sont ajoutés à la solution d'acétone. Les cristaux se forment dans l'heure qui
suit.
Le mélange est gardé à une température comprise entre 2-8 C pour toute la
nuit
pour compléter la cristallisation.
Deuxième cristallisation
Les cristaux sont filtrés et redissous dans 400 ml d'acétone. 3 volumes
d'hexane
(1,2 L) sont ajoutés à la solution d'acétone. Les cristaux se forment dans
l'heure
qui suit. Le mélange est gardé à une température comprise entre 2-8 C pour
toute la nuit pour compléter la cristallisation. Les cristaux sont séchés à
l'air ou
sous vide.
Le poids sec obtenu est de 10 g 0,2 g. L'analyse par HPLC indique que la
teneur
de paclitaxel est de l'ordre de 80% et plus.
3e purification par chromatographie sur gel de silice à basse pression
Les cristaux sont dissous dans 75 ml de chlorure méthylène et mis en contact
avec 75 g de gel de silice. Le gel enrobé de paclitaxel est séché à l'air sous
ventilation ou sous vide. Le gel séché est chargé sur une colonne (76 x 7,6 cm
de
diamètre intérieur) contenant 1,5 kg de gel de silice (230-400 mesh). Le gel
est
lavé et équilibré avec un mélange de chlorure méthylène et d'isopropanol
(98:2%,
volume par volume). L'élution est effectuée avec le même solvant à l'aide d'un
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système de délivrance de solvant Dynamax*, le débit de l'élution est de 50
mi/min.
avec une pression entre 10-30 psi. Le volume du mélange de solvant est de 30 L
et les fractions sont collectées avec 1 L de solvant par fraction. Les
analyses par
HPLC indiquent qu'il y a 12 fractions qui contiennent du paclitaxel de la 11e
fraction à la 22e fraction, les teneurs de paclitaxel déterminées par HPLC,
dans
ces fractions, sont comme suit : 80; 97; 99,50; 99,70; 99,70; 99,30; 98,60;
97,30;
94; 92; 89 et 85%. L'ordre des fractions contenant du paclitaxel peut être
décalé
d'une ou de deux fractions d'une purification à l'autre.
3e cristallisation
Les fractions contenant du paclitaxel sont groupées ensemble selon les puretés
et
évaporées à sec. Les fractions de 12 à 16 sont dissoutes dans 100 ml de
méthanol (HPLC grade), les fractions 17 et 18 sont dissoutes dans 45 ml de
méthanol (HPLC grade) et les fractions de 19 à 22 sont dissoutes dans 75 ml de
méthanol (HPLC grade).
1) 700 ml d'eau (HPLC grade) préalablement refroidie à 2-8 C sont
ajoutés dans la solution du méthanol (fractions 12 à 16) refroidi dans la
glace. Les cristaux blancs sont apparus immédiatement.
2) 300 ml d'eau (HPLC grade) préalablement refroidie à 2-8 C sont
ajoutés dans la solution de méthanol (fractions 17 et 18) refroidi dans la
glace. Les cristaux blancs sont apparus immédiatement.
3) 500 ml d'une eau (HPLC grade) préalablement refroidie à 2-8 C sont
ajoutés dans la solution du méthanol (fractions 19 à 22) refroidi dans la
glace. Les cristaux blancs sont apparus immédiatement.
Ces cristaux sont filtrés séparément et séchés à l'air ou sous vide. Les poids
secs
et les puretés des cristaux analysées par HPLC sont comme suit :
* marque de commerce
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Fractions 12 à 16: 3,40 g - Pureté : 99,30%
Fractions 17 à 18: 1,40 g - Pureté : 98,85%
Fractions 19 à 22 : 1.60g - Pureté : 92,70%
Les cristaux qui ont une pureté inférieure à 98% sont conservés et repurifiés
ensemble par chromatographie dans les mêmes conditions que dans la 3e
purification ci-dessus décrite. Cette repurification permet d'obtenir encore
environ
75% de la quantité totale de ces cristaux avec une pureté supérieure à 99%.
EXEMPLE 2
L'exemple 2 ne concerne que deux étapes de précipitation, les autres étapes du
procédé sont identiques à celles présentées dans l'exemple 1.
Première précipitation
Le concentré de l'extrait est récupéré et dilué avec 2 L de méthanol. La
biomasse
est isolée par précipitation en ajoutant l'extrait dans une solution de HCI à
20 mM.
Un précipité très fin se forme au fur et à mesure de l'ajout de l'extrait. Le
rapport
de l'extrait par rapport à la solution acide est de 1:10. Ce précipité fin est
très
difficile à filtrer, la centrifugation à haute vitesse :15 000-20 000 tpm
permet de
récupérer la biomasse. Un relargage de la solution par NaCI (50 g/L de
solution)
permet de rendre le précipité plus aggloméré. Le précipité est filtré ou
centrifugé à
4200 tpm à 20 C pendant 30 minutes (Centrifugeuse Beckman* J6MC, rotor JS
4.2). Une centrifugeuse à flot continu peut être utilisée pour un grand
volume.
Le précipité récupéré est séché à l'air ou sous vide ou lyophilisé, le poids
du
précipité est de 500-520 g. Ce précipité est solubilisé dans 2 L d'acétone et
filtré
ou centrifugé à 4200 tpm, à 0-2 C pendant 30 minutes pour enlever les
particules
insolubles.
* marque de commerce
CA 02299149 2000-02-22
Deuxième précipitation
La phase huileuse est ensuite évaporée à sec. Le résidu est dissous dans 2 L
méthanol. La biomasse est isolée pour la deuxième fois par précipitation en
ajoutant la solution du méthanol dans une solution de NaOH à 20 mM. Un
5 précipité très fin se forme au fur et à mesure de l'ajout de l'extrait. Le
rapport de
l'extrait par rapport à la solution basique est de 1:5. Ce précipité fin est
très difficile
à filtrer, la centrifugation à haute vitesse :15 000-20 000 tpm peut permettre
de
récupérer la biomasse. Un relargage de la solution par NaCI (50 g/L de
solution)
permet de rendre le précipité plus aggloméré. Le précipité est filtré ou
centrifugé à
10 4200 tpm à 20 C pendant 30 minutes (Centrifugeuse Beckman J6MC, rotor JS
4.2). Une centrifugeuse à flot continu peut être utilisée pour un grand
volume.
Les rendements et les puretés du paclitaxel sont sensiblement identiques à
ceux
obtenus pour l'exemple 1.
Les exemples donnés ci-dessus démontrent que la présente invention apporte
15 une nette diminution du coût de production de paclitaxel par rapport aux
différentes techniques décrites dans l'art ultérieur. Cette diminution du coût
est
constituée par une augmentation du rendement de paclitaxel avec une pureté
thérapeutique acceptable; par une économie appréciable en terme de
consommables (solvants, gel...) et en temps de production. En plus de ces
20 avantages, la présente invention présente un procédé très simple, rapide et
facilement applicable à l'échelle industrielle sans être limité par la trop
faible
quantité de paclitaxel dans les biomasses traitées.
