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PROMOTEUR INDUCTIBLE DANS LES PLANTES, SEQUENCE INCORPORANT
CE PROMOTEUR ET PRODUIT OBTENU.
La présente invention concerne un ensemble de
promoteurs végétaux inductibles par des stress biotiques ou
abiotiques, notamment par des pathogênes, leur utilisation,
des vecteurs d'expression comportant lesdits promoteurs et
un gène d'intérêt, des cellules et/ou des plantes
transformées par lesdits vecteurs. L'invention est aussi
relative â des procédés d'obtention desdites cellules ou
1o plantes, lesdites plantes transformées présentant des
résistances améliorées auxdits pathogênes.
Les maladies, qu'elles soient d'origine fongique,
bactérienne ou virale, sont le problème majeur en
viticulture, tant au plan de la qualité des monts et des
vins produits (par exemple Botrytis cinera, agent de la
pourriture grise qui attaque les baies à la vendange et
entrafne des mauvais goflts dans les vina), des baisses de
production (par exemple les maladies foliaires telles que
Mildiou et Oidium, les attaques de Botrytis sur fleurs ou
la maladie de Court noué liée â la présence du virus
G.F.L.V., Grape Fan Leaf Virus), voire â celui de la survie
du vignoble (par exemple les maladies du bois comme
l'eutypiose ou le syndrome de l'esca). L'arsenal classique
de la lutte va de la simple prophylaxie aux traitements
phytosanitaires, la lutte biologique étant jusqu'à présent
d'application trës limitée.
La lutte chimique est bien sar la méthode la plus
utilisée, même si l'on tempère de plus en plus les
traitements (modèles de prévision des risques de maladies
3o poux le Mildiou par exemple). En ce qui concerne les
fongicides par exemple, le vignoble français, qui
représente environ 10 % des terres cultivées en France,
utilise chaque année près de 40 % des fongicides consommés
dans ce pays. Au plan européen, sur près de 4 millions
d'hectares du vignoble, les 9 à 10 traitements effectués
chaque année pour lutter. contre ces maladies entrainent
l'application de 120 000 tonnes de produits fongicides.
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Pour ne citer que le seul problème de la pourriture grise,
on estime que sur les années 1992-1993, il a concerné 25 à
30 % des 3,7 millions d'hectares du vignoble européen, pour
un coflt de produits phytosanitaires de respectivement 97 et
69 millions de Marks allemands (DM).
L'application de ces produits n'est pas sana
conséquence pour l'environnement (c'est le cas par exemple
pour les fumigants des sols utilisés pour détruire les
nématodes, vecteurs du virus du Court noué). Elle pose
aussi quelquefois des problèmes technologiques avec les
difficultés qui peuvent survenir au cours des fermentations
(l'utilisation d'inhibiteurs de la biosynthèse des stérols
peut bloquer la croissance des levures en fin de
fermentation) et commerciaux (procymidone, produit anti-
Botrytis, retrouvé parfois dans les vins, d'o~1 le
contentieux américain des années 1990-1991).
Par ailleurs, l'utilisation de ces produits a
déjà entrafné l'apparition de souches résistantes. Ce
phénomène a été particulièrement marqué en Champagne et
certaines années il a été recommandé par le Comité
Interprofessionnel des Vins de Champagne (CIVC) de ne pas
traiter contre le Botrytis.
Pour pallier ces inconvénients, il est impératif
d'équilibrer l'utilisation de produits phytosanitaires en
mettant au point de nouvelles méthodes de lutte afin de
diminuer de manière importante les quantités de produits
épandues au vignoble.
Deux approches sont actuellement envisagées .
* Renforcer la prophylaxie et diminuer la
quantité de produits appliqués (méthodes culturales et
lutte préventive, modèles de prévision des risques de
maladies, nouveaux matériels d'épandage, nouvelles
molëcules plus dégradables, etc.).
* Améliorer la résistance des cépages à la
maladie.
Pour cette seconde approche, l'amélioration
génétique classique par voie sexuée (hybridation avec des
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variétés tolérantes) est impossible de par la législation
française sur les Appellations d'Origine Contrôlée (A.O.C.)
qui impose les cépages à utiliser pour une appellation
donnée. En outre, techniquement, la vigne, végétal ligneux,
nécessiterait plusieurs dizaines d'annêes pour intégrer un
ou des nouveaux caractères de résistance tout en conservant
les caractéristiques biochimiques et aromatiques des
cépages, facteurs de la qualité organoleptique des vina
produits.
La maftrise de la régénération et de la
transformation génétique de la vigne, réalisée par l'équipe
de recherche des laboratoires de la société Demanderesse
depuis 1989-1990, a permis d'envisager d'utiliser les
techniques modernes de la biologie cellulaire et
15 moléculaire pour accroftre la tolérance des cépages aux
maladies fongiques.
I1 est désormais possible d'une part d'intégrer
dans le génome de la vigne un ou plusieurs gènes homologues
ou hétérologues permettant la surexpresaion ou l'expression
2o d'une molécule d'intérêt de nature protéique ou autre,
et/ou l'ouverture d'une nouvelle voie de biosynthèse, et
d'autre part de régénérer une plante plus tolérante â une
ou des maladies, c'est-à-dire ayant des mécanismes de
défense renforcés vis-à-vis du ou des pathogènes en cause.
25 Chez les végétaux, ces mécanismes sont de
plusieurs ordres. Les uns peuvent être considérés comme
passifs et sont liés aux caractéristiques physico-chimiques
des cellules, des tissus épidermiques et/ou des organes de
la plante (par exemple la cuticule ou les caractéristiques
3o morphologiques de la grappe). Les autres appartiennent à la
dynamique des interactions gêne à gène (gènes de résistance
du vëgétal et d'avirulence du pathogêne, mécanismes des
interactions hôte-parasite). Ces interactions peuvent
conduire au développement de la réaction d'hypersensibilité
35 (mort rapide des cellules du végétal autour du point
d'infection pour bloquer la colonisation de la plante par
le champignon, la bactérie ou le virus), mais aussi à la
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synthèse et à l'accumulation de toute une série de
composée. Parmi ceux-ci, certains peuvent être des
constituants pariétaux, impliqués dans la formation d'une
barrière "physique" autour du point d'infection (callose,
lignine, protéine riche en hydroxyproline, etc.), d'autres
des molécules aux fonctions antimicrobiennes plue ou moins
bien définies (phytoalexines, protéines associées aux
pathogènes . PR protéines (Pathogenesis Related protein),
etc.).
i0 La surexpression de ces molécules aux fonctions
antimicrobiennes ou impliquées dans la formation d'une
barrière physique autour du point d'infection peut
permettre d'obtenir une rësistance "naturelle" des plantes
en réponse à des stress, notamment des stress de type
microbien.
Toutefois, une surexpression constitutive de ce
type de protéines ne peut être envisagée sans inconvénient
pour la plante (coflt énergétique, ralentissement de la
croissance, etc.), c'est pourquoi il est nécessaire de
prévoir l'utilisation de promoteurs inductibles et en
particulier de promoteurs qui soient inductibles par le
stress lui-même. C'est précisément l'objet de la présente
invention.
La présente invention concerne une séquence
d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant .
a) la séquence IND Sl,
b) toute séquence correspondant à un fragment de la
séquence IND S1 et ayant effet de séquence promotrice
chez les plantes.
L'invention concerne également les promoteurs
chez les plantes, choisis dans le groupe comprenant .
a) le promoteur PMs PR10-1 correspondant à la séquence
IND S1,
b) un promoteur de type PMs PR10-1 correspondant à une
séquence selon l'invention.
Sont préférés lesdits promoteurs de type PMs
PR10-1, qui présentent au moins 80 % d'homologie avec la
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séquence IND S1. Particulièrement préférés sont ceux qui
présentent au moins 90 % ou 95 % d'homologie avec ladite
séquence. Les séquences promotrices chez les plantes
caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une
5 séquence identique à celles des promoteurs mentionnés
précédemment, sont également comprises dans la présente
invention.
L'objet de l'invention concerne tout particu
lièrement l'utilisation des promoteurs selon l'invention,
lU pour l'expression, tissus spécifiques ou non, d'un gène de
manière inductible dans les plantes, par un stress biotique
ou abiotique.
Parmi lesdits stress biotiques selon l'invention,
on prëfère en particulier les stress biotiques engendrês
IS par l'attaque d'un parasite tel qu'un virus, une bactérie,
une levure, un champignon.
Parmi lesdits stress abiotiques selon
l'invention, on préfère en particulier les stress
abiotiques engendrés par une blessure mécanique, telle que
2o celle causée notamment par un insecte ou par un phénomène
physique tel que le vent ou le gel.
Les promoteurs ou les séquences promotrices selon
l'invention peuvent être utilisés pour la réalisation de
systèmes d'expression dans les plantes, systèmes pouvant
25 être inductibles et/ou constitutifs suivant les tissus ou
organes de la plante transformés (cf. Exemples 2, 3 et 4).
Ces promoteurs ont été obtenus à partir des
séquences régulatrices de gènes PR protéines chez la
luzerne. On a mis à profit la réponse incompatible
30 (réaction d'hypersensibilité HR) obtenue dans la relation
hôte-parasite entre la luzerne (Medicago sativa) et
Pseudomonas syringae pv pisi pour étudier le promoteur
responsable de cette réaction.
Lors de l'attaque par Paeudomonas de la luzerne,
35 l'apparition dune réaction de la plante est observée dans
la zone d'infection..
Le matériel végétal a donc été prélevé après
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G
l'attaque bactérienne afin de constituer une banque d'ADNc
à partir des ARNs messagers produits dans les zones
infectêes et voisines de la nécrose. Une amplification par
réaction de polymérisation en chafne (PCR), utilisant des
polynucléotides de synthèse correspondant à des motifs
conservés de gènes de PR protéines de légumineuses, a
permis d'obtenir une sonde radioactive qui a été ensuite
utilisée pour sélectionner des transcrits dans la banque
d'ADNC. Parmi ceux-ci, l'un d'entre eux a été retenu car,
après séquençage, il présentait une bonne homologie avec
des gènes équivalents codant pour des PR protéines connus
pour d'autres plantes (cf. Figures 1 et Ibis reprësentant
le schéma génëral de la méthode d'isolement du promoteur).
L' analyse a montré qu' il correspondait â un gène
codant pour une PR protéine de classe 10 selon la
classification de van Loon (1994). C'est pourquoi ce gène a
été dénommé Ms PR10-1 (Medicago sativa PR protéine classe
10, clone 1).
La présente invention a également pour objet des
systèmes d'expression d'un gène chez les plantes et
caractérisés en ce qu'ils comportent au moins la séquence
dudit gène sous contrôle d'un promoteur ou d'une séquence
selon l'invention. Parmi les systèmes d'expression selon
l'invention, on préfère les vecteurs d'expression et
notamment les vecteurs d'expression de type plasmidique.
Avantageusement, lesdits vecteurs d'expression sont
caractérisés en ce qu'ils peuvent être transférés dans des
souches d'Agrobacterium.
L' invention a également pour objet un système ou
vecteur d'expression d'un gêne chez les plantes selon
l'invention, caractérisé en ce qu'il est inductible dans
les plantes par un stress biotique ou abiotique, de
préférence un stress biotique ou abiotique tel que ceux
décrits précédemment.
L'invention concerne en outre les systèmes ou
vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce que ledit
gène est un gène d'intérêt.
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Un gène est considéré comme un gène d' intérêt si
sa modulation peut être souhaitée ou utilisée dans tout
genre d'industrie, y compris l'agriculture. Outre l'agri-
culture déjà citée, on pensera aux industries telles que
par exemple l'industrie agro-alimentaire, l'industrie
cosmétique, l'industrie pharmaceutique, l'industrie
chimique, etc.. Cette liste d'exemples n'est bien sQr pas
limitative.
Le gène pourra donc être par exemple un gène
io d'intérêt agronomique ou un gène permettant à la plante de
produire des substances présentant un intérêt pour la
nutrition ou la santé humaine ou animale. Parmi les gènes
d'intérêt agronomique, on entend, par exemple, tout gêne
dont l'expression permet de moduler la physiologie de la
i5 plante, telle que notamment l'inhibition, le ralentis-
sement, l'accëlération ou le déclenchement d'étapes ou de
phênomènes intervenant à une période donnée de la vie de la
plante, ou tout gène dont l'expression permet d'améliorer
ou de diminuer la résistance de la plante à des agressions
20 physiques, chimiques ou biologiques. Parmi les gènes
d'intérêt permettant à la plante de produire des substances
présentant un intérêt pour la nutrition ou la santé humaine
ou animale, on entend par exemple les gènes codant pour des
composés pharmaceutiques, enzymatiques (pouvant être
25 utilisés pour la biosynthèse ou la biodégradation de
composés organiques ou à valeur nutritive, ou des gènes
permettant de moduler ou d'inhiber l'expression de composés
pharmaceutiques, nutritifs, toxiques ou d'arômes.
L'invention comprend en particulier les systèmes
30 ou vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce que ledit
gène d'intérêt est un gène impliqué dans la réponse a un
stress biotique ou abiotique, de préfêrence dans la réponse
au stress biotique ou abiotique inducteur.
De maniëre préférée, l'invention concerne les
35 systèmes ou vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce
que le stress biotique est l'attaque d'un parasite et le
gêne d'intérêt un gêne de résistance audit parasite.
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De manière encore plus préférée, l'invention
comprend les systèmes ou vecteurs selon l'invention,
caractérisés en ce que le parasite est un virus, une
bactérie, une levure ou un champignon, et le gène d'intérêt
est un gène intervenant dans la synthèse de molécule à
action anti-pathogêne, de préférence un gène intervenant
dans la synthèse des phytoalexines ou des PR.
Les constructions permettant l'expression de ces
gènes pourront bien entendu comporter, outre le gène
d'intérêt, des séquences notamment de polyadénylation à
l'extrémité 3' du brin codant, ainsi que des séquences
"enhancer" dudit gène ou d'un gène différent.
Bien entendu, les constructions devront être
adaptées afin d'assurer que le gène sera lu en phase de
IS lecture correcte avec le promoteur et il sera évidemment
possible de prévoir d'utiliser, si cela est nécessaire,
plusieurs promoteurs du même type ainsi que plusieurs
séquences "enhancer".
I1 est également possible d'exprimer à l'aide des
promoteurs selon la présente invention plusieurs gènes,
soit placés en cascade, soit portés par des systèmes
d'expression différents.
Parmi les gènes d'intérêt pouvant être exprimés
par les constructions selon la présente invention, il faut
citer les gènes qui peuvent être placés sous le contrôle du
promoteur PMs PR10-1 afin de déclencher des mécanismes de
résistance aux pathogènes des plantes que sont les
viroides, les virus, les phytoplasmes, les bactéries, les
champignons, voire aussi la résistance à des insectes ou à
des ravageurs (le promoteur étant aussi inductible, chez le
tabac notamment, par des blessures).
Parmi les stratégies possibles, on peut se
référer aux revues de LAMB et al., 1992 ; VAN LOON et al.,
1994 ; BROOGLIE et BROOGLIE, 1993 ; CHET, 1993 et à celle
de PAPPINEN et al., 1994.
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A titre d'exemple, on peut citer qu'ils soient
homologues ou hétérologues, des gènes codant pour .
- des enzymes hydrolytiques tels que les chitinases
(BROOGLE et al., 1991), les ~i 1-3 glucanases (KAUFFMAN et
al., 1987) ou des combinaisons de gênes codant pour ces
deux enzymes,
- des PR protéines (VAN LOON et al., 1994) comme l'osmotine
(LIU et al., 1994 ; ZHU et al., 1995), les "thaumatines
like PR-proteines" (VIGERS et al., 1992), les PR
IO protéines de classe 1 (CUTT et al., 1989 ; HAHN K. et
STRITTMATTER G., 1994),
- des protéines RIP (Ribosome Inactivating Protein) de
plantes (LOGEMANN J. et al., 1992) ou d'autres organismes
ou micro-organismes,
- des protéines ayant un rôle inhibiteur d'enzymes
d'attaque des champignons . inhibiteur de protéases
(MASOUD et al., 1993), des protëines inhibitrices de
polygalacturonase (TOUHART et al., 1992), ou d'autres
protéines inhibitrices,
- des lectines ou des protéines se liant à la chitine
(chitin binding proteins) (BROEKAERT et al., 1989 ;
LERNER et RAIKHEL, 1992),
- des protéines de type lysozyme de phage (T4) ou de
mammifères (DURING et al., 1992),
- des protéines impliquées dans la voie de biosynthèse de
phytoalexines (HAIN et al., 1993),
- des peptides antimicrobiens de type défensine (BROEKAERT
et al., 1995 ; VIGERS et al., 1991 ; TERRAS et al.,
1995),
- des protéines de résistance à des pathogênes (DE WIT,
1992) impliquées dans ou déclenchant des réactions
d'hypersensibilité (STRITTMATTER et al., 1995) ou des
enzymes conduisant à la production d'eau oxygénée (WU et
al., 1995),
- des protéines amenant à la production de toxines
antifongiques, antibactériennes ou anti-insectes (KINAL
et al., 1995),
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des protéines à fonction péroxydase pouvant intervenir
dans la polymérisation des lignines (LAGRIMINI et al.,
1987) ou dans d'autres réactions oxydatives (BRADLEY et
al., 1992),
5 - des protéines d'origine virale telles que des protéines
de la coque des virus en position sens ou antisens (voir
HEJARANO and LICHTENSTEIN, 1992),
- des protéines impliquées dans la synthèse de molécules
déclenchant la chafne de transduction des signaux des
lo mécanismes de stress (acide jasmonique, acide
salicylique, etc.) ou des protéines impliquées ellea-
mêmes comme signal de stress ou intermédiaires dans la
chafne de transduction (systémine, "GTP binding
proteines") voir pour cela SCHEEL et al., 1991 ; VERMA et
al., 1994 ; VERA-ESTRELLA et al., 1994),
- des protéines toxiques pour les insectes (VAECK et al.,
1987 ) .
Cette liste n'est pas limitative.
La présente invention a également pour objet des
2o cellules végétales transformées par un système ou un
vecteur selon la présente invention. Avantageusement,
lesdites cellules végétales sont des cellules de vigne et
le gène d'intérêt est un gêne confêrant la résistance à un
parasite.
La présente invention concerne également des
procédés d'obtention de cellules, caractérisés en ce qu'on
transforme des cellules végétales à l'aide d'un procédé
microbiologique incluant un système ou un vecteur
d'expression selon l'invention.
Parmi les méthodes de transformation les plus
utilisées, il faut citer notamment les méthodes mettant en
oeuvre Agrobacterium, qu'il s'agisse d'Agrobacterium
tumefaciens ou d'Agrobacterium rhizogenes.
Ces méthodes sont connues et elles ne seront pas
décrites de nouveau en détail.
Cette technologie, partant de systèmes
plasmidiques, permet d'effectuer une première trans-
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il
formation d'une souche de bactéries compétentes, en général
E. coli, ce qui permet de contrôler la structure des
plasmides, puis la souche est utilisée pour transférer les
plasmides recombinants dans des souches d'agrobactëries qui
seront ensuite utilisées pour transformer les cellules
végêtales.
La présente invention concerne également les
cellules végétales transformées obtenues par ce procédé.
L'invention comprend en outre un procédé
lo d'obtention de plante exprimant un gène d'intérêt,
caractérisé en ce qu'on transforme des cellules végétales
de ladite plante â l'aide d'un système ou d'un vecteur
selon l'invention, on sélectionne les cellules exprimant le
gène d'intérêt et l'on régénère une plante à partir
desdites cellules sélectionnées.
L'invention comprend également les plantes
comportant un système ou un vecteur selon l'invention,
et/ou des cellules selon l'invention, de préférence les
plantes obtenues par la mise en oeuvre d'un procédé selon
l'invention.
I1 faut en particulier remarquer que les
constructions selon la présente invention et utilisant les
promoteurs inductibles ont permis de transformer des
plantes diverses, notamment le tabac (Nicotiana
benthamiana) , la luzerne (Lotus corniculatus) et également
la vigne ( Vi tis sp. ) .
Lors de la régénération de plantes à partir de
cellules, on a d'ailleurs pu mettre en évidence l'intérêt
du promoteur selon la présente invention. En effet, les
promoteurs des constructions équivalentes mettant en oeuvre
des promoteurs constitutifs forts n'ont jamais permis
d'obtenir des plantes régénérêes, et il se pourrait que la
production de protéines de défense conduise três rapidement
à la nécrose des cellules, empêchant ainsi la régénération.
I1 s'agit là d'un avantage annexe des constructions selon
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la présente invention dans certains systèmes de trans-
formation et de régénération de plantes.
D'autres caractéristiques et avantages des
constructions et des procédés selon la présente invention
pourront être mis en évidence dans les exemples qui vont
suivre.
Lgg~endes des Fiauras
Figures 1 et Ibis , schéma génëral représentant
lo les différentes étapes de la méthode d'isolement du
promoteur inductible PMs PR10-1 correspondant à la séquence
IND S1.
Figure 2 . présentation des divers clones isolés
et correspondant à un Southern blot, hybridé avec les
parties 5' et 3' de l'ADN-PR7, délimitées par un site Bam
HI (B) interne, détecté dans cet ADNc.
Sites de restriction . E = Eco RI, B = Bam XI.
Les valeurs indiquées sur la Figure sont
exprimées en kb (kilo bases).
2o Figure 3 . séquence d'ADN correspondant à la
séquence IND S1, séquence génomique isolée du promoteur
inductible de luzerne PMs PR10-1.
EXemple 1
Obtention de clones aênomiauea comprenant des séauences
rêaulatrices de aènee PR protéine de luzerne
e n ' h d r m r f.
F~,aures 1 et Ibis)
3o La réponse incompatible (réaction d'hyper-
sensibilité . HR), obtenue dans la relation h8te-parasite
luzerne (Medicago satina) et Paeudomonas syringae pv pisi a
permis de constituer une banque d'ADNc. Elle a été réalisée
à partir d'ARNS messagers extraits et purifiés de la zone
voisine de la nécrose provoquée par l'infection bactérien-
ne. Les prélêvements de matériel vëgêtal ont été effectués
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6 heures après l'infiltration par la suspension bactérien-
ne.
Chez les légumineuses, les PR protéines sont
connues pour avoir des motifs conservés, ceci a permis la
synthèse d'oligonucléotides correspondant à ces motifs,
définis à partir des séquençages déjà réalisés sur PR
protéines de pois et de soja. Une amplification par PCR a
permis d'obtenir une sonde radioactive, utilisée ensuite
pour sélectionner dans la banque d'ADNc des transcrits.
l0 Parmi ceux-ci, un des clones . ADNc-PR7 a été retenu car
après séquençage il a présenté 87 % d'homologie avec les
gènes codant pour les PR protéines de pois et de soja.
L'analyse a montré qu'il correspondait en fait à un gène
codant pour une PR protéine de classe 10 selon la
classification de VAN LOON et al. (1994). Il a été nommé Ms
PR10-1 (Medicago satina PR protéine classe 10, clone 1).
Un contr8le, effectué chez la luzerne par
Northern blot, a montré que le transcrit correspondant
s'accumulait dès 3 heures après l'infection dans le cas de
la réponse incompatible, passait par un maximum entre 24 et
48 heures et diminuait lentement à partir de 72 heures.
Ce fragment est caractérisé par l'existence d'un
site Bam-BI interne (noté B sur la figure 1) qui délimite
deux parties .
- l'une dite 5', d'environ 340 bases, inclut la région
amont de l'ATG (transcrite mais non traduite) et une
séquence aval correspondant é 306 bases,
- l'autre dite 3', correspond à la fin de la partie
codante soit 165 bases et à la région 3' non traduite soit
186 nucléotides du codon stop jusqu'au début du poly A.
n
~R protéines
* Isolement de clones génomiques
Une banque génomique de luzerne, préparée dans
EMBL4 (titre . 7.108 p. f .u. (plates forming unit) .ml-1) , a
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été utilisée à cette occasion et 6.105 p.f.u. étalées. Pour
cribler cette banque, le fragment 5' de Ms PR10-1 (ADNc-
PR7) a servi de sonde et 45 clones ont donné un signal
intense sur 13 d'entre eux. Les cartes de restriction et
les hybridations, réalisêes avec les fragments 5' et 3' de
Ms PR10-1, ont permis de conclure à l'existence de 7 clones
distincts (cf. Figure 2). La comparaison des tailles des 7
clones (9,3 ; 6,5 ; 6,1 ; 5,8 ; 4,8 ; 4,2 ; 2,2 kb) obtenus
â partir du criblage de la banque, â celle des bandes
l0 détectées sur Southern blot d'ADN génomique de luzerne a
montré une bonne concordance entre ces deux types de
données expérimentales (cf. Figure 2). I1 a donc été
possible d'en déduire que les gènes codant pour la protéine
PR7 correspondaient à une petite famille multigénique.
Les fragments (sites Eco-RI/Eco-RI) de ces clones
(hormis le clone C12) ont ensuite été sous-clonés en
totalité ou en partie et les sëquençages entrepris.
* Séquençages réalisée
Un clone a été choisi pour être séquencé en
2o premier, le clone C15 (cf. Figure lbis).
Les premiers travaux de séquençage ont mis en
évidence la présence d'un intron d'environ 315 nucléotides
dans le cadre ouvert de lecture du gène codant pour la PR
protéine. Le clone étudié a été analysé ensuite après
digestion par Bam HI (cf. Figure lbis).
Clone C15 . 6,1 kb
L'analyse du clone par Eco RI et Eam HI a permis
d'obtenir deux fragments E-B (environ 2,4 kb) et B-E
(environ 3,7 kb). Après séquençage et comparaison de la
séquence codante (interrompue par un intron de 600
nucléotides) avec celle du Ms PR10-1 (ADNc-PR7), il est
apparu que ce clone génomique était absolument identique â
cet ADNc de référence.
* Analyse de l'expression des clones isolés dans le
système luzerne-Pseudornonas
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Les expériences ont porté sur le clone C15, en
utilisant la technique d'extension en 5', pour déterminer
les messagers effectivement transcrits lors de l'induction
des réactions de défense. Cette technique a en outre
5 l'avantage de permettre de localiser le site d'initiation
de la transcription. Les rësultats ont montré que le clone
C15 était effectivement exprimé lors de l'induction des
réactions de défense dans les feuilles, lors de l'inter-
action luzerne-Pseudomonas.
Exemple 2
Transformations crénéticrues rëalisées pour vërifier
l~activité promotrice du clone ieolê
Régions promotrices ~r; ~ ; s~sa~
Pour ces transformations de contrôle, deux
promoteurs ont été retenus . un promoteur témoin et le
promoteur PR isolé du génome de la luzerne, issu de C15
(correspondant au promoteur PMs PR10-1).
* Promoteur Ca MV-35S
Ce promoteur, dit constitutif, est classiquement
utilisé. I1 correspond â la séquence de régulation de la
transcription du gène de la sous-unité ARN 35S du virus de
la mosaïque du chou-fleur (CaMV). La région promotrice qui
a été utilisée pour réaliser la construction avec le gène
rapporteur gus, correspond en fait à une fraction de ce
promoteur, isolée de nouveau sous forme d'un fragment Eco
RI/9am HI à partir du plasmide pDH51 (PIETRZAK et al.,
1986) .
* Promoteur PR
La région promotrice du clone génomique C15 a été
étudiée. Ce promoteur a été appelé par la suite PMs PR10-1.
PMs PR 10-1 .
I1 provient du fragment Eco RI/Bam HI (E/B) de
2,4 kb du clone C15 Figure lbis). L'intégration de ce
fragment dans le plasmide binaire, en amont du gëne
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1G
rapporteur (voir ci-après), a été rendue délicate car aucun
site de restriction n'existait sur le clone C15 entre la
bofte TATA (initiation de la transcription) et l'ATG
(initiation de la traduction). Des expériences de délétion
ont donc été réalisées jusqu'à obtenir un fragment de
1,5 kb environ (séquence IND S1). Puis, par ligation en
bout franc, un autre site Bam HI a été ajouté au fragment
ainsi obtenu pour permettre son insertion en amont des
différentes séquences codantes utilisées par la suite. Ce
fragment comprend donc en se référant à l'ADNc qui a servi
à le cloner et outre la région promotrice amont . 39
nucléotides terminaux de la 5'UTR (UnTranslated Region) du
gène Ms PR10-1, située à 10 bp du codon ATG initiateur,
l'ATG du gène Ms PR10-1 et un court fragment de sa région
codante (10 bp), juste en amont du site Bam HI intégré.
Tenant compte des sites de clonage, le promoteur ainsi
construit présente un ATG potentiel ce qui pourrait
conduire à la présence de deux codons ATG, à faible
distance l'un de l'autre, lors des constructions de gènes
2o chimériques. Un risque de modification de la phase codante
du gëne utilisé (gène rapporteur ou gène d'intérêt
agronomique) pourrait alors exister.
Pour les expériences de transformation avec le
gène rapporteur, PMs PR10-1 (PRI) a été utilisé tel quel
après clonage dans le plasmide pSK+/- Bluescript de
STRATAGENE. I1 a pu être de nouveau isolé sous la forme
d'un fragment Eco RI/Bam HI de 1,5 kb environ.
* Plasmides utilisés
a) p35S - gus intron (VANCANNEYT et al., 1990)
Ce plasmide est un dérivé de pBinl9 (BEVAN, 1984)
et possède comme tel les bordures droite et gauche des
plasmides binaires permettant l'insertion de la partie
comprise entre ces bordures dans les plantes via des
agrobactéries.
Le développement du gëne rapporteur gus intron
(intron dérivé du gène LSI de la pomme de terre) a permis
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d'éliminer les faux positifs (notamment en expression
transitoire) dus aux agrobactéries contaminantes. Elles
sont incapables d'épisser les introns.
Classiquement, ce gène codant pour une /3
glucuronidase permet, en utilisant un substrat particulier
(le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ~ glucuronide), d'obtenir
une coloration bleue. Celle-ci indique alors la nature
transformée de la plante analysée et, par voie de
conséquence, la transcription de la séquence codante du
gène correspondant à l'enzyme, donc l'induction du
promoteur qui la commande.
b) pPR97
Ce plasmide a été construit par l'un des
laboratoires participant au projet pour tester l'efficacité
de promoteurs (P. RATET, ISV, cité dans SZABADOS et al.,
1995). I1 a notamment l'avantage de posséder un site de
clonage multiple, permettant une fusion transcriptionnelle
avec la phase codante du gène gus (uid A d'E. coli)
contenant l' intron LSI. I1 possède en ourrP r.A,-r~; "ea ae~
2o caractéristiques du plasmide précédent p35S - gus intron
(bordures d'intégration dans le génome des plantes, gène de
sélection permettant la résistance aux antibiotiques de
type néomycine . npt II gène).
L'activité du promoteur peut être révélée et
mesurée par des tests histochimique et enzymatique de type
GUS.
* Dérivés de pPR97
Deux constructions principales ont été faites et
utilisées par la suite pour la transformation de plantes
modèles.
a) pPR97 - 35S
Le promoteur 355, cloné dans le plasmide pDH51
(cf, paragraphe ci-dessous concernant les souches d'agro-
bactéries), a été extrait et inséré dans le site de clonage
multiple de pPR97, en amont du gène rapporteur, sous forme
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d' un fragment Eco RI/Bam HI. Ce plasmide est à la fois un
contrôle positif, pour démontrer que la construction est
fonctionnelle et, une référence car le promoteur 35S a été
placé dans le même environnement que le promoteur isolé des
clones de PR protéine.
b) pPR97 - PMs PR10-1
Les 1,5 kb ont été insérés dans le même site de
clonage que celui défini ci-dessus, sous la forme là aussi
d'un fragment Eco RI/Bam HI.
c) pG3-3
Il a permis de réaliser un contrôle positif tort
par un test histochimique et un test enzymatique en clonant
deux promoteurs 35S en tandem inversé. Les séquences
activatrices des promoteurs agissent alors en synergie. La
phase codante du gène gus intron a été alors placée sous le
contrôle de l'un des deux promoteurs 35S.
* Les souches d'agrobactéries réalisées
Les différents plasmides ont été utilisés pour
transformer des bactéries compétentes E. coli souche DHSa
par choc thermique en milieu chlorure de calcium. Après
sélection des bactéries transformées sur milieu anti-
biotique (Kanamycine) et contrôle par miniprep de leur
nature recombinante, elles ont servi à transférer les
plasmides recombinants dans des souches d'agrobactéries par
conjugaison triparentale, en utilisant la souche d'E. coli
HB101 contenant le plasmide pRK2013 autotransférable
(DITITA et al., 1985).
Deux souches d'agrobactéries ont été retenues .
EHA 105, Agrobacterium tumefaciens désarmée, permettant la
régénération de plantes transformées (transformations
stables) et, A4TC24 Agrobacterium rhizogènes utilisée pour
obtenir la réaction de type chevelu racinaire (Hairy root)
et des plantes composites, possédant des racines
transformées mais dont le reste de la plante est de
phénotype identique à celui d'origine.
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* Transformations génétiques sur plantes modèles
Deux types de transformations (transitoires et
stables) ont été réalisés en utilisant trois plantes
modèles NicoCiana benthamiana, Medicago truncatula et Lotus
corniculatus.
On exposera principalement les résultats obtenus
avec N. benthamiana.
* Transformations transitoires
Cette première série d'expériences a été
effectuée afin de permettre une vérification rapide de la
fonctionnalité des constructions rêaliaéea avec le gène gus
dans les cellules d'eucaryotes.
Des feuilles de N. benthamiana ont donc été
excisées et mises en coculture sur milieu gélosé avec les
différents dérivée de la souche EHA 105. Des tests
hiatochimiques ont été ensuite pratiquée 48 h après la
transformation puis examinée après une nuit d'incubation
(12 h) .
Les plasmides de contrôle p35S-gus intron et
pPR97-35S ont donné une coloration GUS positive bien que
faible avec le second plasmide.
Cette faible réactivité vient sans doute d'un
problème de construction car, â proximité du site
d'initiation de la transcription et de l'ATG du gène gus,
une partie du polylinker a dQ être gardée. Celle-ci
comportant une séquence répétée peut gêner la transcription
du gêne.
La construction pPR97 - PMs PR10-1 a montré une
activité du gène gus semblable à celle du contrôle positif
35S gus intron. Ce promoteur que l'on attendait inductible,
a donc présenté un effet comparable à un promoteur
constitutif dans ce cas.
Ce résultat peut être expliqué comme la
conséquence soit de l'infection bactérienne soit des
blessures effectuées sur les feuilles lors du prélèvement
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ou de la mise en culture. La première hypothèse ne pouvant
être vérifiée, le protocole expérimental a été modifié pour
diminuer le stress causé aux explants (élévation de
l'osmolarité du milieu de coculture en utilisant des
5 concentrations de saccharose de 10 à 30 g.l~l, réalisation
d' une gamme de vide plus ou moins poussée . de 10 à 80 mm
de mercure de vide relatif et création de lésions plus ou
moins fortes sur les feuilles avec écrasement important ou
moyen de 1~épiderme).
l0 Les résultats ont montré que plus la pression
était importante, plus le nombre de cellules transformées
était élevé. Cependant, un compromis doit être trouvé pour
obtenir des transformations stables car les nombreuses
transformations transitoires, obtenues dans ce cas, se
IS révèlent par la suite souvent létales pour les cellules.
Elles sont alors incapables de donner des cals et donc de
régénérer des bourgeons puis des plantes.
Par ailleurs, la nature inductible du promoteur
est en partie confirmée car si la coloration due à la
2o construction 35S gus intron est détectable jusqu'à 5 jours
après la coculture, celle obtenue avec pPR97 - PMs PR10-1-
gus intron apparaft plus rapidement â 48 heures mais
décroft ensuite très vite.
* Transformations stables
a) Tabac . N. benthamiana
Une série de transformations a été réalisée avec
pPR97-355, pPR97-PMs PR10-1 et pG3-3. Un nombre important
de plantules a été obtenu avec cette série de
transformations. Pour chacun des plasmides utilisés, on a
3o cherché à obtenir au moins 7 plantes acclimatées.
Cependant, cela n'a pas été possible pour p35S - gus intron
o~l seulement 5 plantes ont été régénérées et acclimatées.
Les résultats obtenus sont rassemblés au Tableau 1.
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21
Tableau 1 .
Transformations stables obtenues sur N. benthamiana par
transformation avec la souche EF~A 105 d'Agrobacterium
tumefaciens et ses dérivés.
Cala explants Pl~es
constructions mis en Bourgeons
culture obtenus In vivo
Accl
p35S-gus intron 10(45) 6(1) 5 5
pPr97-355 115/122 23 13 12
gus intron
pPR97-PMs PR10-1 135/139 27 20 7
gus intron
pG3-3-35S en
tandem invers non valu 37 28 20
(promot. fort)
Lécrende Tableau 1
Les résultats sont exprimés en quantité obtenue.
Accl. . plantules acclimatées.
l0 Nombre de bourgeons par explants . le chiffre
entre parenthèses correspond au nombre de bourgeons obtenus
à un mois, pour la première série. Pour celle-ci
(comportant les constructions 35S gus intron), les cals ont
été laissés plus longtemps sur le milieu de culture afin
IS d'obtenir un maximum de bourgeons et donc de plantes à
acclimater. Pour la seconde série, après un mois, un nombre
suffisant de bourgeons a été obtenu et l'expérience a alors
été arrêtée.
Les transformations génétiques . elles sont
20 faites classiquement sur des morceaux de limbe de feuilles
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de 1 cm2, immergés 30 secondes dans la suspension
d'Agrobacterium puis, cocultivés 48 heures avant repiquage
sur milieu gélosé de division cellulaire et de caulo-
génèse . M.S. (MURASHIGE et SKOOG, 1992), ANA (acide
naphtalène acétique) 0,1 mg.l'', BAP (benzyl amino purine)
1 mg.l'l, cefotaxime 400 mg.l'1 (élimination des agro-
bactéries) et kanamycine 70 mg.l'1 (agent de sélection des
cellules transformées). Dès l'apparition des premiers
bourgeons (environ un mois après coculture), ils sont
placés sur milieu d'enracinement identique au premier mais
ne comprenant pas d'hormones végétales.
L'analyse des résultats, en fonction de
l'expression du gène gus intron, selon la nature dm
promoteur situé en amont de la phase codante du gène,
!5 montre que le promoteur PMs PR10-1 donne les meilleurs
résultats de l'ensemble des promoteurs testés. Une analyse
plus détaillée est présentée ci-après.
* Caractéristiques du promoteur PMs PR10-1
Plasmide pPR97 - PMs PR10-1 - gus intron
Ce promoteur a donné les meilleurs résultats avec
des différences d'expression constitutive du gène gus selon
les organes testés.
a) Activité dans les cala
Une expression constitutive forte a été trouvée.
Quelques minutes d'incubation ont suffi pour obtenir un
test histochimique positif. Le promoteur est donc fortement
induit dans ce type de matériel, ce qui est en accord avec
les résultats obtenus par VAN LOON (1985). Les cala en
culture in vitro sont en état de stress et dans ces
conditions les PR protéines sont exprimées.
b) Activité sur plantes entières acclimatées
Racines
Le promoteur est induit et le test histochimique
est positif aprês 2 heures d'incubation (contre 5 heures
avec le promoteur 35S). L'activité du gène gus n'est pas
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uniforme dans les racines de tabac, seul l'épiderme des
parties âgées et le meristème apical ont donné la
coloration bleue caractéristique du test. Selon la
littérature, une activité des gënes de défense dans les
racines est aussi classiquement observée.
Fleurs
Chez toue les tabacs transformés par cette
construction, une forte activité constitutive a été trouvée
dans les fleura et plus particulièrement dans les anthères
lo et le pollen. Une activité du gène gus a aussi été décelée
dans les trichomes des sépales et plus faiblement dans les
pétales. Ces résultats sont aussi en accord avec ceux de
VAN LOON (1985) qui indiquent une expression des gênes de
défense dans les pièces florales.
Feuilles
Une faible activité constitutive gu,e a été
observée dans les trichomes de jeunes feuilles de plantes
adultes. Chez le tabac, le stade rosette à larges feuilles
correspond au stade juvénile et le stade vieillissant à
celui de la formation des graines. Cette faible activité a
été constatée majoritairement dans les trichomes pluri-
cellulaires. L'expression d'une protéine PR dans de telles
structures n'a jamais été décrite à notre connaissance.
Une activité inductrice constitutive du promoteur
isolé PMs PR10-1 est donc possible dans les trichomes des
feuilles de tabac (3 plantes sur 7) mais elle semble sous
l~influence des stades de développement.
En l'absence d'induction par un pathogène,
l'activité du promoteur chez le tabac est donc limitée à la
racine, aux pièces florales (anthères et pollen) et à
quelques cellules de la partie aérienne (trichomes
essentiellement).
Exemple 3
Autres espèces vêaétalee transformées
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* Medicago truncatula
Pour cette espèce, on a cherché à réaliser des
plantes composites, c'est-à-dire possédant à la fois une
partie aérienne de type sauvage (non transformée généti-
quement) et des racines transformées.
De jeunes germinations ont été utilisées. Aprës
développement de la racine principale, les hypocotyles,
excisés, ont été trempés dans une suspension
d'Agrobacterium tumefaciens EHA 105 possédant soit le
plasmide p35S-gus intron soit le plasmide pPR97-PMs PR10-1-
gus intron, de façon à obtenir par la suite des racines
néoformées transformées. Après une semaine, des racines ont
été obtenues et un test histochimique GUS a été réalisé.
Pour cette expérimentation, le témoin a été constitué par
de jeunes germinations traitées de manière identique aux
lots précédente (hypocotyles excisés, mais non trempées
dans la suspension d'agrobactéries).
Tous les explants du lot témoin ont néoformé des
racines en une semaine ; par contre, 50 % seulement ont
réagi pour les lots traités par les agrobactêries. Quel que
soit le traitement, aucune racine n'a donné de réponse
positive au test GUS. En revanche, la base des hypocotyles
des lots traités, bien que nécrosée, a souvent réagi pour
donner une coloration bleue (présence de cellules
transformées). La partie nécrosée des explants a alors été
excisée et ils ont été remis en enracinement. 50 % ont
alors développé des racines néoformées dont certaines se
sont révélées, dans quelques zones, positives au test.
Ce sont donc des racines chimériques (cellules
3o transformées et non transformées) qui ont été obtenues, les
parties transformées correspondant â des lignées cellu
laires ayant intégré la construction dans une cellule
souche de base.
Les deux constructions testées, p35S-gus intron
et pPR97-PMs PR10-1-gus intron, ont donné ces lignêes
cellulaires racinaires transformées dans respectivement 3
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et 2 explants sur les 6 mis en expérimentation pour chaque
lot.
Bien que le modèle expérimental ne soit pas
adapté à l'étude poursuivie (étude de l'expression des
5 protéines PR lors du phénomène de nodulation par
Rhizobium), il n'en a pas moine démontré que le promoteur
PMs PR10-1 est tout aussi fonctionnel dans cette plante que
dans la plante d'origine (Medicago eativa).
Lotus corniculatus
l0 L'expérimentation avait, là aussi, pour but
d'étudier l'induction du promoteur lors de la nodulation
par la bactérie symbiote Rhizobium meliloti NZP 2037 (PETIT
et al., 1987). Des plantes composites ont donc été
réalisées en transformant des cellules de l'hypocotyle de
15 jeunes germinations de Lotier par Agrobacterium rhizogenea
souche A4TC2~, pour obtenir le phénomène de chevelu
racinaire (phénotype hairy root). Une fois celui-ci
développé, les racines principales ont été excisées et les
plantules ont été placées en milieu liquide pour accroftre
20 le développement du phénomène. Une fois les plantes
acclimatées, l'étude de l'induction du ou des promoteurs)
a été réalisée en plaçant les plantules en condition de
nodulation (BLONDON, 1964). Les deux promoteurs d'étude
retenus ont été les mêmes que ceux utilisés lors de
25 l'expérimentation menée avec M. trunculata . 35S et PMs
PR10-1. Pour ces deux constructions, moins de 10 % des
racines â phénotype hairy root ont montré des racines
positives au test GUS. D'une manière générale, les racines
ayant ce phênotype ont donné moins de nodules que les
racines témoins.
Pour celles obtenues avec la construction
comportant le promoteur 35S, seule les nodules ont présenté
une réponse positive au test GUS, alors que pour l'autre
(promoteur PMs PR10-1), la coloration s'est développée sur
toute la racine, exceptée au point d'initiation des racines
secondaires. Par ailleurs, cette dernière construction n'a
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pas permis d'obtenir des nodules sur les racines issues de
chevelu racinaire en interaction avec Rhizobium meliloti.
Exemple 4
ude e la r c ion 'h rs n ibili ab n f
ave les n r i e i n r m r n
luzerne et le aène ct~s intron
Réaction d'hypersensibilité sur N. benthamiana
transformé- avec les constructions associant le
promoteur du gène PR de luzerne et le gène gus intron.
* Test de réaction d'hypersensibilité (HR)
La réaction d'hypersensibilité (HR), développée
dans l'interaction N. benthamiana - Paeudomonas syringae
pv. pisi, a été utilisée dans cette étude. Des plants de
tabac transformés, ayant incorporé dans leur génome les
différents inserts des plasmides p35S-gus intron et pPR97 -
PMs PR10-1-gus intron, ont été acclimatés puis infiltrés
par une suspension de P. syringae (ESNAULT et al., 1993) à
une concentration de 109 bactéries par ml. La solution a
été injectée dans le limbe à l'aide d'une seringue
hypodermique. Avec un tel modèle, en 48 heures, la réaction
de type HR est considérée comme bien développée. Les
feuilles, infiltrées par les suspensions de bactéries, ont
été prélevées 24, 48 et 96 heures aprês inoculation pour
évaluer, par test histochimique GUS, l'induction des
différents promoteurs étudiés. L'analyse d'une éventuelle
réponse systêmique a été aussi évaluée, en utilisant le
même test histochimique, sur des feuilles situées en
dessous de la feuille infiltrée.
* Etude de l'induction des promoteurs en conditions de
réaction de type HR
a) Promoteur constitutif 35S
Dans le cas du promoteur constitutif 35S
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(plasmide pG3-3 par exemple), l'inoculation par P. syringae
n'a pas modifié la réponse au test et cela en quelques
minutes d'incubation. L'infiltration par les bactéries
n'altère donc pas l'activité glucuronidase de type
constitutive obtenue avec le promoteur 355.
b) Promoteur du gène de protéines PR . Promoteur PMs
PR10-1
Comme le montre le tableau 2, ce promoteur est
bien inductible par l'attaque par un pathogëne. A 24
heures, la réaction de type HR n'est pas encore entièrement
développée (48 heures pour l'exposition complète),
cependant, le test GUS est dëjà positif. Avec les jeunes
plants de tabac transformés obtenus, la coloration est
faible et est localisée majoritairement dans le limbe de la
feuille infiltrée.
En réponse systémique, réponse au niveau de la
feuille inférieure à la feuille infectée, la coloration est
uniquemer_t dans le limbe. Lea plants de tabac adultes
(tiges développées mais n'ayant pas encore fleuri) et
juvéniles (en rosette) ont le même type de réponse avec une
activité faible du gcne gus, déterminée par le test
histochimique.
Pour les tabacs plus âgés, en fleur ou portant
des graines, la coloration obtenue lors du test est plus
intense, surtout dans les nervures et les trichomes de la
feuille infectée et uniquement dans ces tissus pour la
réponse systémique.
Des différences d'expression du gène rapporteur
sont donc mis en évidence selon l'âge de la plante. Cette
3o réponse, dépendante du stade de développement, a été
trouvée dans la plupart des études menées aur les protéines
PR des végétaux. L'induction du promoteur PMs PR10-1 est un
phénomène transitoire puisque l'expression du gène
rapporteur n'est plus visible 96 heures aprês l'inoculation
par les bactêries.
L'induction n'est pas non plus limitée à la
réaction de type HR obtenue lors de l'interaction
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plante/bactérie. Le même type de réponse a été obtenu avec
la construction PMs PR10-1-gus intron lors d'une infection
de l'un des explants par un champignon. Une expression
homogène du gène gus a alors été visible aux l'ensemble de
la feuille infectée, hormis la zone de contamination qui,
elle, s'est nécrosée.
Tableau 2
Induction des différents promoteurs étudiés lors de la
réaction de type HR entre N. benthamiana et P. syringae.
~4h aprs ~h aprs inocula i
inoculation
on
Construction Feuille Feuille infiltre
Feuille raction type HR
infiltre
infrieure
PMs PR10-1 6/7 6/7 0/3
pG3-3 (35S) 3/3 3/3 0/3
L~crende Tableau 2
Les résultats sont présentés en nombre de plantes
répondant positivement au test histochimique GUS par rapport
au nombre de plantes analysées.
r 'on n i 'v u n s n r"
des différents nromoteur~.
La méthode est basée sur un test enzymatique.
Elle utilise .
a) un extrait brut de l'enzyme codée par le gène gus
obtenu à partir des planta de tabac transformés, et
b) un substrat, le p nitro-phenyl-glucuronide. La
vitesse d'hydrolyse du substrat est suivie au spectro
photomêtre et est rapportée à la quantité totale de
protéines de l'extrait. La méthode nécessite par contre la
présence d'un promoteur fort, en amont du gène gus, car
elle est peu sensible.
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En conséquence, elle n'a pas été appliquée aux
essais pour lesquels 12 heures ou plus d'incubation avec
le substrat utilisé pour le test histochimique (X gluc .
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-~îglucuronide) ont été néces
eaires.
Dans ces conditions expérimentales, le promoteur
355, placé dans le plasmide pG3-3, a donné une vitesse
d'hydrolyse du substrat (exprimée en unité arbitraire) 5
fois plus élevée que le promoteur PMs PR10-1, placé quant à
lui dans le plasmide pPR97. Par contre, le promoteur PMs
PR10-1 a donné une plus forte expression du gène gus que le
promoteur 35S, si celui-ci est placé dans le plasmide p35S-
gus intron. En effet, dans ce dernier cas aucune détection
d'hydrolyse du substrat n'a été obtenue.
De même, les autres constructions n'ont pas
permis de donner de valeurs détectables au spectro-
photomètre.
S~nclus ions
Le promoteur PMs PR10-l, isolé de M. sativa
(luzerne), répond bien aux caractéristiques requises pour
l'utiliser comme séquence de régulation d'un gène d'intérêt
agronomique pouvant agir dans la défense des plantes contre
une attaque d'un pathogène. I1 est inductible par un
pathogène (bactérie et champignon) et cela y compris dans
un système hétérologue, le tabac. I1 a en outre une
activité constitutive faible, principalement dans les
racines, y compris dans d'autres sytèmes hétérologues (M.
truncatula et L. corniculata) .
3o Une autre activité constitutive, non encore
expliquée, a aussi été constatée dans les cala embryogènes
de luzerne.
CA 02320420 2000-08-10
WO 99/41391 PCT/FR99/00315
REFERENCES
BEJARANO E.R. and LICHTENSTEIN C.P., 1992. Prospects for
engineering virus resistance in plants with antisense RNA.
5 TIB TECH, 10, 383-387.
BEVAN M., 1994. Hinary Agrobacterium vectora for planta
transformation Nucl. Acid. Rea., 12, 8711-8721.
l0 BLONDON F., 1964. Contribution à l~étude du développement
des graminés fourragères . Ray grass et Dactyle. Rev. Gén.
Bot., 71, 293-381.
BRADLEY D.J., KJELBOM P. AND LAME C.J., 1992. Elicitor and
15 wound induced oxidative cross-linking of a plant cell wall
proline-rich protein . a novel, rapid defense response
Cell, 70, 21-30.
BROEKAERT W.F., VAN PARIJS J., LEYRUS F, JOOS H. and
20 PENMANS W.J., 1989. A chitin-binding lectin from stinging
nettle rhizomes with anti-fungal properties. Science 245,
1100-1102.
BROEKAERT W.F., TERRAS F.R.G., CAMMUE H.P.A. and OSBORN
25 R.W., 1995. Plant defensins . Novel Antimicrobial-peptides
as components of the host defense system. Plant Physiol.
108, 1353-1358.
BROOGLE K., CHET I., HOLLIDAY M., CRESSMAN R., BIDDLE P.,
30 KNOWLTON C., MAUVAIS C.J. and BROOGLIE R., 1991. Transgenic
plants with enhanced resistance to fungal pathogen
Rhizoctozlia solalti. Science, 254, 1194-1197.
BROOGLE R., BROOGLE K., 1993. Production of disease
resistant transgenic plants. Curr. Opin. Biotech. 4, 148
151.
CA 02320420 2000-08-10
WO 99/41391 PCT/FR99/00315
31
CHET I., 1993 Biotechnology in plant disease control, ed.
WLEY-LISS XVI, 373 pp illus. WILEY Series in Ecological and
Applied Microbiology.
CUTT J.R., HARPSTER M.H., DIXON D.C., CARR J.P., DUNSMUIR
P. and KLESSIG D.F., 1989. Distase responae to tobacco
mosaic virus in tobacco plants that constituvely express
the pathogenesis related PR lb Bene. VIROLOGY 173, 89-97.
DE WIT P.J.G.M., 1992. Molecular characterization of gene
for Bene systems in plant fungus interactions and the
application of avirulence genes in control of plant
pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 30, 391-418.
DITTA G., SCHMIDTHAUSER T., YACOBSON E., LU P., LIANG A.W.
et al., 1985. Plasmid related to the broad range vector,
pRK290, useful for Bene cloning and for monitoring Bene
expression. Plasmid 13, 149-153.
DURING K., FLADUNG M. and LORZ H., 1992. Antibacterial
resistance of transgenic potato plants producing T4
lysozyme. Abstract Sixth Intl. Symp. Mol Plant-Microb.
Inter, Seattle.
ESNAULT R . , BUFFARD D . , BREDA C . , SALLAUD C . , EL TURK J . ,
KONDOROSI A., 1993. Pathological and molecular
characterizations of alfalfa interactions with compatible
and incompatible bacteria Xanthomonas campestria pv.
Alfalfae and Pseudomonas syringae pv. pisi. Mol. Plant-
Microbe Interact. 6, 655-664.
HAHN K. and STRITTMATTER G., 1994. Pathogen defence gene
prpl-1 from potato encodes an auxin - responsive
glutathione S Transferase. Eur J. Biochem. 226, 619-626.
HAIN R., REIF H.J., KRAUSE E., LANGEBARTELS R., KINDL H.,
WORNAM B., WIESE W., SCHMELZER E., SCHREER P.H., STOECKER
CA 02320420 2000-08-10
WO 99/41391 PCT/FR99/00315
32
R.H. and STENZEL K., 1993. Disease resistance results from
foreign phytoalexin expression in a novel plant. NATURE,
361, 153-156.
KAUFFMANN S., LEGRAND M., GEOFFROY P., FRITIG B., 1987.
Biological function of pathogenesis related proteins . four
PR proteins of tobacco have (3 1-3 glucanase activity. EMBO
J.6, 3209-3212.
KAVANAGH T.A. and SPILLANE, 1995. Strategies for
engineering virus resistance in transgenic plants.
Euphytica 85, 149- 158.
KINAL H., PARK C.M., BERRY J.O., KOLTIN Y. and BRUENN J.A.,
1995. Processing and secretion of virally encoded
antifungal toxin in transgenic tobacco plants . Evidence
for a Kex 2p. pathway in plants. Plant Cell 7, 677-688.
LAGRIMINI L.M., BURKHART W., MOYER M, and ROTHSTEIN S.,
1987. Molecular cloning of complementary DNA encoding the
lignin forming peroxidase from tobacco . Molecular analysis
and tissue specific expression. Proc. Nat. Acad. Sci. USA
84, 7542-7546.
LAMB C.J., RYALS J.A., WARD E.R., DIXON R.A., 1992.
Emerging strategies for enhancing crop resistance to
microbial pathogens. Bio/technology 10, 1436-1445.
LERNER D.R. and RAIKHEL N.V., 1992. The Bene for stinging
nettle lectin (Urtica dioica agglutinin) encodes both a
lectin and a chitinase. J.Biol. Chem. 267, 11085-11091.
LIU D., RAGHOTHAMA K.G., HASEGAWA P.M., BRESSAN R.A., 1994.
Osmotin over expression in potato delays development of
disease symptoms. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91, 1888-1892.
CA 02320420 2000-08-10
WO 99/41391 PCT/FR99/00315
33
LOGEMANN J., JACH G., TOMMERUP H., MUNDY J. and SCHELL J.,
1992. Expression of a Barley Ribosome - Inactivating
Protein leads to increased of fungal protection in
transgenic tobacco plants. Bio/technology 10, 305-308.
MALEHORN D.E., BORGMEYER J.R., SMITH C.E. and SHAH D.,
1994. Characterization and expression of an antifungal
zearnatin-like protein (Zlp) Bene from zen maya. Plant
Physiol. 106, 1471-1481.
MASOUD S.A., JOHNSON L.B., WHITE F.F. and REECK G.R., 1993.
Expression of a cysteine proteinase inhibitor in transgenic
tobacco plants. Plant Mol. Hiol. 21, 655-663.
MURASHIGE T. and SKOOG F., 1962. A revised medium for rapid
growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol.
Plant. 15, 473-497.
PAPPINEN A., KEINOWEN MATAELAE K., SUSI A., Von WEISSENBERG
2o K., 1994. Molecular biology of resistance to insects and
diseases in birch and pines.
Abstract Proc. Applications of Biotechnology to tree
culture, protection and utilization. USDA For. Serv. Gen.
Tech. Rep. NC 175 page 31.
PETIT A., STOUGAARD J., KUHLE A., MARCKER K.A. and TEMPE
J., 1987. Transformation and regeneration of the legume .
Lotus corniculatus. A system for molecular studies of
symbiotic nitrogen fixation. Mol. Gen. Genet. 207, 245-250.
PIETRZAK M., SHILLITO R.D., HOHN T. and POTRYKUS I., 1986.
Expression in planta of two bacterial antibiotic genes
after protoplast transformation with a new plant expression
vector. Nucl. Acids Res. 14, 5857-5869.
SCHELL D., COLLING C., HEDRICH R., KAWALLECK P., PARKER
J.E., SACKS W.R., SOMSSICH I.E. and HAHLBROCK K., 1991.
CA 02320420 2000-08-10
WO 99/41391 PCT/FR99/00315
34
Signal in plant defense gene activation. Adv. Mol. Genet.
Plant Microb. Inter. V1, HENNECKE H. and VERMA DPS (eds),
KLUMER, Dordrecht, The Netherlands p 373-380.
STRITTMATTER G., JANSSENS J., OPSOMER C. and BOTTERMAN J.,
1995. Inhibition of fungal disease development in plants by
engineering controlled cell death BIO/TECHNOLOGY 13, 1085-
1089.
l0 SZABADOS L., CHARRIER B., KONDOROSI A., De BUIJN F.T. and
RATET P., 1995. New promoter and enhancer testing vectore.
Mol. Breeding.
TERRAS F.R., EGGERMONT K., KOVALEVA V., RAIKHEL N.V.,
OSBORN R.W., KESTER A., REES S.B., TORREKENS S., VAN LEUVEN
F., VAN DER LEYDEN J., CAMMUE B.P.A. and BROEKAERT W.F.,
1995. Small cystein - Rich Antifungal Proteins from
Radish . Their Role in Host Defense. Plant Cell 7, 573-588.
TOUBART P., DESIDERIO A., SALVI G., CERVONE F., DARODA L.,
DE LORENZO G., BERGMAN C., DARVILL A.G. and ALBERSHEIM P.,
1992. Cloning an characterization of the Bene encoding the
endo Poly Galacturonase - Inhibiting Protein (PGIP) of
Phaseolus vulgaris. Plant J. 2, 367-373.
VAECK M., REYNAERTS A., HOFTE H., JANSENS S., DE BEUCKELEER
M., DEAN C., ZABEAU M., VAN MONTAGU M., LEEMANS J., 1987.
Transgenic plants protected from insect attack. Nature 327,
33-37.
VANCANNEYT G., SCHMIDT R., O'CONNOR-SANCHEZ A., WILLMETZER
L. and ROCHA-SOZA M., 1990. Construction of an intron-
containing marker-Bene . splicing of the intron in
transfenic plants and its use in monitoring early events in
Agrobacterium-mediated transformation. Mol. Gen. Genet.
220, 245-250.
CA 02320420 2000-08-10
WO 99/41391 PCT/FR99/00315
VAN LOON L.C., 1985. Pathogenesis Related Proteins. Plant
Mol. Biol. 4, 111-116.
VAN LOON L.C., PIERPOINT W.S., BOLLER T., CONEJERO V.,
1994. Recommendations for naming plant pathogenesis related
proteine. Plant Mol. Hiol. Rep. 12, 245-264.
VERA-ESTRELLA R., HIGGINS V.J. and BLUMWALD E., 1994. Plant
Defense Response to Fungal Pathogens II. G Protein -
10 Mediated Changes in Host Plasma Membrane Redox Reactions.
Plant Physiol. 106, 97-102.
VERMA D.P.S., CHEON CHONG III and HONG Z., 1994. Small GTP
Binding Proteins and Membrane Biogenesis in Plants. Plant
15 Physiol. 106, 1-6.
VIGERS A.J., ROBERTS W.K., SELITRENNIKOFF C.P., 1991, A New
Family of Plant Antifungal Proteins. Mol. Plant-Microbe
Interact. 4, 315-323.
VIGERS A.J., WIEDEMANN S., ROBERTS W. K., LEGRAND M.,
SELITRENNIKOFF C.P. and FRITIG B., 1992. Thaumatin - like
pathogenesis - related proteins are antifungal. Plant
Science 83, 155-161.
zs
WU G., SHORTT B.J., LAWRENCE E.B., LEVINE E.B., FITZSIMMONS
K.C. and SHAM D.M., 1995. Disease resistance conferred by
expression of a gene encoding H202 generating glucose
oxidase in transgenic potato plants. Plant Cell 7, 1357
1368 .
ZHU B., CHEN T.H.H. and LI P.H., 1995. Activation of two
osmotin like protein genes by abiotic stimuli and fungal
pathogen. Plant Physiol. Soil. 108, 930-937.
