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VECTEURS DE TRANSFERT D'ACmES NUCLEIOUES. COMPOSITIONS LES
CONTENANT. ET LEURS UTILISATIONS
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs et leur utilisation pour
le
transfert d'acides nucléiques. Plus particulièrement, l'invention concerne de
nouveaux
vecteurs capables de diriger des acides nucléiques vers des cellules ou des
compartiments cellulaires spécifiques.
Le transfert d'acides nucléiques est une technique à la base de toutes les
applications majeures de la biotechnologie et l'augmentation de l'efficacité
du transfert
des acides nucléiques constitue un enjeu très important pour le développement
de ces
Io applications. L'efficacité du transfert des acides nucléiques dépend de
nombreux
facteurs parmi lesquels la capacité des acides nucléiques à atteindre la
cellule cible, leur
faculté à franchir la membrane plasmique et leur aptitude à être transportés
au sein de
la cellule jusqu'au noyau.
Un des obstacles majeurs à l'efficacité du transfert des acides nucléiques
provient du fait que l'information génétique est souvent peu ou pas dirigée
vers
l'organe cible auquel elle est destinée. Par ailleurs, une fois que l'acide
nucléique a
pénétré dans la cellule cible, il doit encore être dirigé vers le noyau afin
d'y être
exprimé. De plus, dans le cas de transfert d'acides nucléiques dans des
cellules
différenciées ou quiescentes, le noyau est limité par une enveloppe nucléaire
qui
2o constitue une barrière supplémentaire au passage de ces acides nucléiques.
Les virus recombinants utilisés comme vecteurs possèdent des mécanismes
évolués et efficaces pour guider les acides nucléiques jusqu'au noyau.
Cependant, les
vecteurs viraux présentent certains inconvénients inhérents à leur nature
virale, qu'il
n'est malheureusement pas possible d'exclure totalement. Une autre stratégie
consiste
donc soit à transfecter l'ADN nu, soit à utiliser des agents non viraux
capables de
promouvoir le transfert d'ADN dans des cellules eucaryotes. Mais les vecteurs
non
viraux ne possèdent pas de signaux de ciblage sub-cellulaires ou nucléaires.
Ainsi, le
passage de l'ADN nu, ou en combinaison avec un agent non-viral, du cytoplasme
vers
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le noyau est par exemple une étape qui présente une efficacité très faible
(Zabner et al.,
1995).
Différentes tentatives d'attachement de signaux de ciblage ont ainsi été
faites.
Notamment, des fragments peptidiques pour le ciblage ont été attachés
covaIemment à
des oligonucléotides dans une stratégie de ciblage d'un oligonucléotide
antisense
[Eritja et al., Synthesis of deftned peptide-oligonucleotide hybrids
containing a
nuclear transport signal seguence, Tetrahedron, Vol. 47, N° 24, pp.
4113-4120,
1991 ]. Les complexes ainsi formés sont de bons candidats comme inhibiteurs
potentiels de l'expression de gènes endogènes.
1o Des vecteurs de transfection comprenant un polypeptide synthétique couplé
par
des interactions électrostatiques à une séquence d'ADN ont également été
décrits dans
la demande de brevet WO 95/31557, ledit polypeptide étant constitué d'une
chaîne
polymère d'acides aminés basiques, d'un peptide NLS, et d'une région charnière
qui
connecte le peptide NLS à 1a chaîne polymérique et permet d'éviter les
interactions
1s stériques. Mais ce genre de constructions pose un problème de stabilité car
les
interactions mises en jeu entre l'ADN et le signal de ciblage sont de nature
électrostatique.
Il existe par ailleurs des chimères acide nucléique-peptide de ciblage
spécifique
décrites dans la demande de brevet WO 95/34664, la liaison entre les deux
étant de
2o nature chimique. Mais cette méthode passe notamment par des étapes
enzymatiques
difficilement contrôlables et ne permettant pas de produire de grandes
quantités
d'acides nucléiques.
Enfin, il a été montré qu'il est possible d'attacher une séquence NLS («
Nuclear
Localisation Signal ») à un ADN plasmidique par l'intermédiaire d'un
25 cyclopropapyrroloindole (Nature Biotechnoiogy, Volume 16, pp. 80-85,
janvier 1998).
Mais une inhibition totale de la transcription du gène d'intérêt du fait de
l'attachement
au hasard de plusieurs centaines de séquences NLS sur le plasmide a été
observée. Une
solution proposée par les auteurs pour y remédier consiste à lier les
séquences NLS
sur des fragments linéaires d'ADN, puis à coupler ces fragments modifiés avec
d'autres
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fragments non-modifiés. Cependant, cette technique présente comme précédemment
l'inconvénient de passer par au moins une étape enzymatique.
Ainsi, toutes les méthodes proposées jusqu'à présent ne permettent pas de
résoudre de manière satisfaisante les difficultés liées au ciblage des ADN
double brin.
La présente invention propose une solution avantageuse à ces problèmes. Plus
particulièrement, la présente invention met en oeuvre des oügonucléotides
conjugués à
des signaux de ciblage et capables de former des triples hélices avec une/des
séquences) spécifiques) présentes) sur une molécule d'ADN double brin.
Un tel vecteur présente l'avantage de pouvoir diriger un ADN double brin vers
1o des cellules ou des compartiments cellulaires spécifiques grâce au signal
de ciblage,
sans que l'expression génétique ne soit inhibée. La demanderesse a en effet
montré
que, grâce à la formation de triples hélices site-spécifiques stables, il est
désormais
possible de lier un signal de ciblage à un ADN double brin de façon site-
spécifique. En
conséquence, il est possible de fixer le signal de ciblage en dehors de la
cassette
d'expression du gène à transférer. La demanderesse a ainsi montré que
l'expression
génétique dans la cellule n'est pas inhibée malgré la modification chimique de
l'ADN.
De plus, la présence d'une triple hélice comme moyen pour lier le signal de
ciblage à
l'ADN est particulièrement avantageuse car cela permet de conserver une taille
d'ADN
adaptée à la transfection.
Le vecteur obtenu présente de plus l'avantage d'incorporer des signaux de
ciblage qui sont liés de façon très stable à l'ADN double brin, en particulier
lorsque
l'oligonucléotide susceptible de former la triple hélice est modifié par la
présence d'un
agent alkylant.
Un autre avantage de l'invention est de permettre de coupler l'ADN à
transférer
à des signaux de ciblage dont on contrôle à la fois le nombre et la nature. En
effet, il
est possible de contrôler le nombre de signaux de ciblage liés à chaque
molécule
d'ADN double brin en introduisant un nombre adapté de séquences spécifiques
propices à la formation de triples hélices sur ladite molécule d'ADN double
brin. De la
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même façon, il est possible d'introduire sur une même molécule d'ADN double
brin
plusieurs oligonucléotides liés à des signaux de ciblage différents
(intracellulaires et/ou
extracellulaires), et dans ce cas il est également possible d'en déterminer
préalablement
les proportions respectives. En outre, ces différents signaux de ciblage
peuvent être
fixés à la molécules d'ADN double brin de façon plus ou moins stable selon que
la
triple hélice est formée avec ou sans liaison covalente (c'est-à-dire avec ou
sans
l'utilisation d'un agent alkylant).
Enfin, la triple hélice fonctionnalisée obtenue ne résulte que d'étapes de
transformations chimiques et peut donc être obtenue de façon simple,
reproductible, et
lo en très grandes quantités, notamment industrielles.
Un premier objet de l'invention concerne donc un vecteur utile en transfection
capable de cibler une cellule et/ou un compartiment cellulaire spécifique.
Plus
particulièrement, le vecteur selon l'invention comprend une molécule d'ADN
double
brin et au moins un oligonucléotide couplé à un signal de ciblage et capable
de former
par hybridation une triple hélice avec une séquence spécifique présente sur
ladite
molécule d'ADN double brin.
On entend au sens de l'invention par "ADN double brin" un acide
désoxyribonucléique
double brin qui peut être d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne,
virale,
etc...Il peut être obtenu par toute technique connue de l'homme du métier, et
notamment par criblage de banque, par synthèse chimique ou enzymatique de
séquences obtenues par criblage de banques. II peut être modifié chimiquement
ou
enzymat~quement.
Cet ADN double brin peut être sous forme linéaire ou circulaire. Dans ce
dernier cas, l'ADN double brin peut être dans un état superenroulé ou relâché.
Préférentiellement, la molécule d'ADN est de forme circulaire et dans une
conformation superenroulée.
L'ADN double brin peut également porter une origine de réplication
fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs,
des
séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des gènes
d'intérêt
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thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non, des régions de liaison
à
d'autres composants cellulaires, etc... De préférence, l'ADN double brin
comprend une
cassette d'expression constituée d'un ou plusieurs gènes d'intérêt sous
contrôle d'un ou
plusieurs promoteurs et d'un terminateur transcriptionnel actifs dans les
cellules cibles.
5 On entend au sens de l'invention par « cassette d'expression d'un gène
d'intérêt » un fragment d'ADN qui peut être inséré dans un vecteur à des sîtes
de
restriction spécifiques. Le fragment d'ADN comprend une séquence d'acide
nucléique
codant pour un ARN ou un polypeptide d'intérêt et comprend en outre les
séquences
nécesaires à l'expression (enhanceur(s), promoteur(s), séquences de
polyadénylation...) de ladite séquence. La cassette et les sîtes de
restriction sont
conçus pour assurer une insertion de la cassette d'expression dans un cadre de
lecture
approprié pour la transcription et la traduction.
Il s'agit généralement d'un plasmide ou d'un épisome portant un ou plusieurs
gènes d'intérêt thérapeutique. A titre d'exemple on peut citer les plasmides
décrits dans
les demandes de brevet WO 96/26270 et WO 97/10343 incorporées à la présente
par
référence.
Au sens de l'invention, on entend par gëne d'intérêt thérapeutique notamment
tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le
produit
thérapeutique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce
produit
2o protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire
un produit qui
est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente
aucune
pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de
pallier une
expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine
inactive ou
faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer
ladite
protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut aussi coder pour un mutant
d'une
protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc...
Le produit
protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans
ce cas,
une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité
déficiente
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dans le cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler
une réponse
immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut
citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones,
les
iymphokines [interleukines, interférons, TNF, etc (FR 92/03120)], les facteurs
de
croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de
synthèse, les
facteurs trophiques [BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NTS,
HARP/pléiotrophine, etc, la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/11947)],
la
protéine CFTR associée à la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs
[p53,
1o Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93/04745)], les gènes codant pour des
facteurs
impliqués dans la coagulation [Facteurs VII, VIII, IX], les gènes intervenant
dans la
réparation de l'ADN, les gènes suicides [thymidine kinase, cytosine
déaminase], les
gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les gènes
correspondant
aux protéines impliquées dans le métabolisme des lipides, de type
apolipoprotéine
l3 choisie parmi les apolipoprotéines A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D,
E, F, G, H,
J et apo(a), les enzymes du métabolisme comme par exemple la lipoprotéine
lipase, la
Iipase hépatique, la lécithine cholestérol acyltransférase, la 7 alpha
cholestérol
hydroxylase, la phosphatidique acide phosphatase, ou encore des protéines de
transfert
de lipides comme la protéine de transfert des esters de cholestérol et la
protéine de
2o transfert des phospholipides, une protéine de liaisons des HDL ou encore un
récepteur
choisi par exemple parmi les récepteurs LDL, récepteurs des chylomicrons-
remnants et
les récepteurs scavenger, etc...
L'ADN d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou une séquence
antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler
l'expression de
25 gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent,
par
exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm
cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique
décrite dans
le brevet EP 140 308. Les gènes d'intérêt thérapeutique comprennent également
les
séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire
sélectivement des
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ARN cibles (EP 321 20I ), ou les séquences codant des anticorps
intracellulaires à
simple chaîne comme par exemple les ScFv.
Comme indiqué plus haut, l'acide désoxyribonucléique peut également
comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de
générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode
particulier
de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation soit de vaccins soit
de
traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment
contre des micro-organismes, des virus ou des cancers. II peut s'agir
notamment de
peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du
virus de
1o l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming
virus", du
virus de la grippe, du cytomégalovirus (CMV), d'autres virus ou encore
spécifiques de
tumeurs (EP 259 212).
Préférentiellement, l'acide désoxyribonucléique comprend également des
séquences permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du
gène
codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré. Il peut
s'agir des
séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène
considéré
lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule
transfectée. Il
peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de
l'expression
d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de
séquences
promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, iI peut s'agir de
séquences
promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même,
il peut
s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A cet égard, on
peut
citer par exemple les promoteurs des gènes E 1 A, MLP, CMV, RS V, etc. En
outre, ces
séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences
d'activation,
de régulation, etc... Il peut aussi s'agir de promoteur, inductible ou
répressible.
Une triple hélice correspond à la fixation d'un oligonucléotide modifié ou non
sur de l'ADN double brin par des liaisons hydrogènes dites "de Hoogsteen"
entre les
bases du troisième brin et celles de la région en double hélice. Ces
appariements se
produisent dans le grand sillon de la double hélice et sont spécifiques de la
séquence
3o considérée [Frank-Kamenetski, M.D., Triplex DNA Structures, Ann. Rev.
Biochem.,
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1995, 64, pp. 65-95). La séquence spécifique en double hélice peut notamment
être
une séquence homopurique-homopyrimidique. On distingue deux catégories de
triples
hélices suivant la nature des bases du troisième brin [Sun, J. and C. Hélène,
Oligorrucleotide,directed triple-helix formation, Curr. Opin. Struct. Biol.,
1993, 3, pp.
345-356] : les bases puriques permettent d'obtenir des appariements C-G*G et T-
A*A,
et les bases pyrimidiques permettent d'obtenir des appariements C-G*C+ et T-
A*T (le
symbole * correspond à l'appariement avec le troisième brin).
Ces structures ont été caractérisées du point de vue physico-chimique grâce à
de nombreuses études de RMN (Résonance Magnétique Nucléaire), de température
1o d'hybridation ou de protection à des nucléases, ce qui a permis de définir
leurs
propriétés et leurs conditions de stabilité. Pour les triples hélices avec un
troisième brin
purique, ce brin est antiparallèle par rapport au brin purique de l'ADN et la
formation
de la triple hélice dépend fortement de la concentration en ions divalents :
les ions tels
que Mg2+ stabilisent la structure formée avec le troisième brin. Pour les
triples hélices
avec un troisième brin homopyrimidique, celui-ci est parallèle par rapport au
brin
purique, et la formation de la triple hélice est dépendante du pH : un pH
acide inférieur
à six permet la protonation des cytosines et la formation d'une liaison
hydrogène
supplémentaire stabilisant le triplet C-G*C+. Il existe également des triples
hélices
"mixtes" pour lesquelles le troisième brin porte des bases puriques et
pyrimidiques.
2o Dans ce cas, l'orientation du troisième brin dépend de la séquence de bases
de la région
homopurique.
Les oIigonucléotides utilisés dans la présente invention sont des
oligonucléotides hybridant directement avec l'ADN double brin. Ces
oligonucléotides
peuvent contenir les bases suivantes
- thymidine (T), qui est capable de former des triplets avec les doublets A.T
de l'ADN double brin (Rajagopal et al, Biochem 28 (1989) 7859),
- adénine (A), qui est capable de former des triplets avec les doublets A.T de
l'ADN double brin,
- guanine (G), qui est capable de former des triplets avec les doublets G.C de
l'ADN double brin,
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- cytosine protonée (C+), qui est capable de former des triplets avec les
doublets G. C de l'ADN double brin (Rajagopal et al précitée),
- uracile (U) qui est capable de former des triplets avec les paires de bases
A.U ou A.T.
Pour permettre la formation d'une triple hélice par hybridation, il est
important
que l'oligonucléotide et la séquence spécifique présente sur l'ADN soient
complémentaires. A cet égard, pour obtenir les meilleures fixations et la
meilleure
sélectivité, on utilise pour le vecteur selon l'invention un oligonucléotide
et une
séquence spécifique parfaitement complémentaires. Il peut s'agir en
particulier d'un
oligonucléotide poly-CTT et d'une séquence spécifique poly-GAA. A titre
d'exemple,
on peut citer foligonucléotide de séquence
5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (GAGG(CTT),, SEQ ID N° 1 ), dans
lequel les bases GAGG ne forment pas de triples hélice mais permettent
d'espacer
l'oligonucléotide du bras de couplage. On peut également citer la séquence
(CTT),
(SEQ ID N°2). Ces oligonucléotides sont capables de former une triple
hélice avec une
séquence spécif que comportant des motifs complémentaires (GAA). Il peut
s'agir en
particulier d'une région comportant 7, 14, ou 17 motifs GA.A. Une autre
séquence
d'intérët spécifique est la séquence : S'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (SEQ ID
N°3). Cette séquence forme une triple hélice avec les
oligonucléotides
5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ ID N°4) ou
5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEQ ID N°5).
Dans ce cas, l'oligonucléotide se fixe dans une orientation antiparallèle au
brin
polypurique. Ces triples hélices ne sont stables qu'en présence de Mg2+ comme
cela a
été précisé précédemment (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34, 7243-7251 ;
Beal
et Dervan, Science, 1991, 251, 1360-1363).
La séquence spécifique peut être une séquence présente naturellement sur
l'ADN double brin, ou une séquence synthétique ou d'origine naturelle
introduite
artificiellement dans celui-ci. Il est particulièrement intéressant d'utiliser
un
oligonucléotide capable de former une triple hélice avec une séquence présente
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naturellement sur l'ADN double brin. En effet, cela permet avantageusement
d'obtenir
les vecteurs selon l'invention avec des plasmides non-modifiés, notamment des
plasmides commerciaux de type pUC, pBR322, pSV, etc... Parmi les séquences
homopuriques-homopyrimidiques naturelles présentes sur l'ADN double brin, on
peut
5 citer une séquence comprenant tout ou partie de la séquence 5'-
CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEQ m N°6) présente dans l'origine de
réplication ColEl de E. coli. Dans ce cas, l'oligonucléotide formant la triple
hélice
possède la séquence : 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (SEQ 1D N°7) et se
fixe
alternativement sur les deux brins de la double hélice, comme décrit par Beal
et
lo Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976-4982) et Jayasena et Johnston
(Nucleic
Acids Res. 1992, 20, 5279-5288). On peut aussi citer. la séquence 5'-
GAA.AAAGGAAGAG-3' (SEQ ID N°8) du gène de la ~3-lactamase du
plasmide
pBR322 (Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504-508).
Une
autre séquence est AAGAAAAAAAAGAA (SEQ 1D N° 9) présente dans l'origine
de
réplication y des plasmides à origine de réplication conditionnelle tel que
pCOR.
Bien que des séquences parfaitement complémentaires soient préférées, il est
entendu toutefois que certains mésappariements peuvent être toiérés entre la
séquence
de l'oligonucléotide et la séquence présente sur l'ADN, dès lors qu'ils ne
conduisent
pas à une trop grande perte d'affinité. On peut citer la séquence 5'-
2o AAAAAAGGGAATAAGGG-3' (SEQ m n°10) présente dans le gène de la J3-
lactamase de E. coli. Dans ce cas, la thymine interrompant la séquence
polypurique
peut être reconnue par une guanine du troisième brin, formant ainsi un triplet
ATG qui
est stable quand il est encadré par deux triplets TAT (Kiessling et al.,
Biochemistry,
1992, 31, 2829-2834).
L'oligonucléotide utilisé peut être naturel (composé de bases naturelles, non
modifiées) ou modifiées chimiquement. En particulier, foligonucléotide peut
présenter
avantageusement certaines modifications chimiques permettant d'augmenter sa
résistance, sa protection vis-à-vis des nucléases, son affinité vis-à-vis de
la séquence
spécifique ou permettant encore d'apporter d'autres propriétés additionnelles
(J.
3U Goodchild, Corrjugates of Oligonucleotides a»d Modified Oligoriucleotides :
A
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Review of their Synthesis and Properties, Bioconjugate Chemistry, Vol. 1
N°3, 1990,
pp. 165-187).
Selon la présente invention on entend aussi par oligonucléotide tout
enchaînement de nucléosides ayant subi une modification du squelette. Parmi
les
modifications possibles on peut citer, les oligonucléotides phosphorothioates
gui sont
capable de former des triples hélices avec l'ADN (Xodo et al., Nucleic Acids
Res.,
1994, 22, 3322-3330), de même que les oligonucléotides possédant des
squelettes
formacétal ou méthylphosphonate (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991,
113.
7767-7768). On peut également utiliser les oligonucléotides synthétisés avec
des a
lo anomères de nucléotides, qui forment également des triples hélices avec
l'ADN (Le
Doan et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749-7760). Une autre modification
du
squelette est la liaison phosphoramidate. On peut citer par exemple la liaison
internucléotidique N3'-P5' phosphoramidate décrite par Gryaznov et Chen, qui
donne
des oligonucléotides formant avec l'ADN des triples hélices particulièrement
stables (J.
Am. Chem. Soc., 1994, 116. 3143-3144). Parmi les autres modifications du
squelette,
on peut citer également l'utilisation de ribonucléotides, de 2'-O-
méthylribose, de
phosphotriester,...(Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol., 116. 3143-
3144). Le
squelette phosphoré peut enfin être remplacé par un squelette polyamide comme
dans
les PNA (Peptide Nucleic Acid), qui peuvent également former des triples
hélices
(Nielsen et al., Science, 1991, 254. 1497-1500 ; Kim et al., J. Am. Chem.
Soc., 1993,
115. 6477-6481 ) ou par un squelette à base de guanidine, comme dans les DNG
(déoxyribonucleic guanidine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92 6097-6101),
analogues polycationiques de l'ADN, qui forment également des triples hélices.
La thymine du troisième brin peut aussi être remplacée par une 5-bromouracile,
ce qui augmente l'a~nité de foligonucléotide pour l'ADN (Povsic et Dervan, J.
Am.
Chem. Soc., 1989, l I l, 3059-3061). Le troisième brin peut également contenir
des
bases non naturelles, parmi lesquelles on peut citer la 7-déaza-2'-
déoxyxanthosine
(Milligan et al., ~ Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327-333), la I-(2-déoxy-b-D-
ribofuranosyl)-3-méthyl-5-amino-lH-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine-7-one (Koh et
Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470-1478), la 8-oxoadénine, la 2-
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aminopurine, la 2'-O-méthyl-pseudoisocytidine, ou toute autre modification
connue de
l'homme du métier (voir pour revue Sun et Hélène, Curr. Opinion Struct. Biol.,
1993,
3 345-356).
Un autre type de modification de l'oligonucléotide a plus particulièrement
pour
objet d'améliorer l'interaction etlou l'affinité entre l'oligonucléotide et la
séquence
spécifique. En particulier, une modification tout à fait avantageuse consiste
à coupler
un agent alkylant à l'oligonucléotide. La liaison peut se faire soit
chimiquement, soit
photochimiquement par l'intermédiaire d'un groupement fonctionnel
photoréactif. Des
agents alkylants avantageux sont notamment les agents alkylants
photoactivables, par
lo exemple les psoralènes. Sous l'action de la lumière, ils forment des
liaisons covalentes
au niveau de bases pyrimidiques de l'ADN. Quand ces molécules sont intercalées
au
niveau de séquences 5'-ApT-3' ou 5'-TpA-3' dans un fragment d'ADN double brin,
ils forment des liens avec les deux brins. Cette réaction de liaison induite
par la lumière
peut se produire sur un site spécifique du plasmide.
1~ Comme cela a été souligné précédemment, un avantage de la présente
invention est donc la possibilité de former des triples hélices très stables
et site-
spécifiques entre l'oligonucléotide et une séquence spécifique de l'ADN double
brin
grâce à une liaison covalente formée via un agent alkylant.
La longueur de l'oligonucléotide utilisé dans le procédé de l'invention est
d'au
2o moins 3 bases, et de préférence, comprise entre 5 et 30 bases. On utilise
de manière
avantageuse un oligonucléotide de longueur comprise entre 10 et 30 bases. La
longueur peut bien entendu être adaptée au cas par cas par l'homme du métier
en
fonction de la sélectivité et de la stabilité de l'interaction recherchées.
Les oligonucléotides selon l'invention peuvent être synthétisés par toute
25 technique connue. En particulier, ils peuvent être préparés au moyen de
synthétiseurs
d'acides nucléiques. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut
également être utilisée.
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Au sens de l'invention, on entend par « signal de ciblage » des molécules de
ciblage de nature variée. Il s'agit dans la plupart des cas de peptides connus
pour le
ciblage. Ils peuvent être utilisés pour interagir avec un composant de la
matrice
extracellulaire, un récepteur de la membrane plasmique, pour cibler un
compartiment
intracellulaire ou pour améliorer le trafic intracellulaire d'ADN, lors du
transfert non
viral de gènes en thérapie génique.
Ces signaux de ciblage peuvent comprendre par exemple les facteurs de
croissance (EGF, PDGF, TGFb, NGF, IGF I, FGF), les cytokines (IL-l, IL-2, TNF,
Interferon, CSF), les hormones (insuline, hormone de croissance, prolactine,
glucagon,
lo hormone thyroïdienne, hormones stéroidiennes), les sucres qui reconnaissent
des
lectines, les immunoglobulines, les ScFv, la transferrine, les lipoprotéines,
les vitamines
telles que la vitamine B 12, les hormones peptidiques ou les neuropeptides
(tachykinines, neurotensine, VIP, endothéline, CGRP, CCK, ...), ou tout motif
reconnu par les intégrines, par exemple le peptide RGD, ou par d'autres
protéines
extrinsèques de la membrane cellulaire.
On peut utiliser des protéines entières, ou des séquences peptidiques dérivées
de ces protéines, ou encore des peptides se fixant sur leur récepteur et
obtenus par la
technique de "phage display" ou par synthèse combinatoire.
Des signaux de cibiage intracellulaires peuvent être envisagés. Beaucoup de
2o séquences d'adressage nucléaire (NLS) de composition en acides aminés
variée ont été
identifiées et permettent de cibler différentes protéines impliquées dans le
transport
nucléaire de protéines ou d'acides nucléiques. Parmi ces séquences figurent
notamment des séquences courtes (le NLS de l'antigène T de SV40 (PKKICRICV,
SEQ 117 N° I 1 ) est un exemple), des séquences bipartites (le NLS de
la nucléoplasmine
qui contient deux domaines essentiels pour le transport nucléaire
KRPAATKKAGQAKKKKLDK, SEQ ID N°12), ou ia séquence M9
(NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY, SEQ ID N°13) de
la protéine hnRNPAI. Les protéines portant ces séauencec NT.C ~P ~YP.,r ~",~
,~p~
récepteurs spécifiques, tels que les récepteurs de la famille des importines
ou
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karyophérines par exemple. Le rôle de ces séquence est de diriger l'ADN à
l'intérieur
du noyau, où il est alors immédiatement disponible pour Ia machinerie de
transcription,
et peut être exprimé.
Les signaux de ciblage "mixtes", c'est-à-dire qui peuvent à la fois servir
pour le
ciblage intracellulaire et extracellulaire, entrent également dans le cadre de
la présente
invention. On peut par exemple citer les sucres qui ciblent des lectines qui
se situent
sur la membrane cellulaire mais également au niveau des pores nucléaire. Le
ciblage
par ces sucres concerne donc aussi bien le ciblage extraceIlulaire que
l'import
nucléaire.
D'autres signaux sont impliqués dans le ciblage mitochondrial (par exemple, la
partie N-terminale de l'ornithine transcarbamylase (OTC) de rat permet le
ciblage des
mitochondries) ou dans l'adressage vers le réticulum endoplasmique. Enfin,
certains
signaux permettent la rétention nucléaire ou au niveau du réticulum
endoplasmique
(tels que la séquence KDEL).
Avantageusement, les signaux de ciblage selon l'invention permettent de
diriger
spécifiquement l'ADN double brin vers certaines cellules ou certains
compartiments
cellulaires. A titre d'exemple, les signaux de ciblage selon l'invention
peuvent cibler des
récepteurs ou des ligands à la surface de la cellule, notamment les récepteurs
de
l'insuline, de la transferrine, de l'acide folique, ou tout autre facteur de
croissance,
2o cytokines, ou vitamines, ou des polysaccharides particuliers à la surface
de la cellule
ou sur la matrice extracellulaire avoisinante.
La synthèse de chimères oligonucléotide-signal de ciblage se fait en phase
soude ou en solution et tient compte des propriétés de stabilité chimique très
différentes des oligonucléotides et des signaux de ciblage [Erijita, R. et
al., Synthesis
2s of defrned peptide-oligonucleotide hybrids containing a nuclear transport
signal
sequence, Tetrahedron, 1991, 47(24), pp. 4113-4120]. En solution, des
couplages en
une étape sont envisageables : le signal de ciblage peut par exemple être
synthétisé
avec un groupement portant des fonctions disulfirre, maléimide, amine,
carboxyle,
ester, époxyde, bromure de cyanogène, ou aldéhyde, et être couplé à un
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oligonucléotide modifié par un groupement terminal thiol, amine, ou carboxyle
en
position 3' ou 5'. Ces couplages se forment par établissement de liaisons
disulfure,
thioéther, ester, amide, ou amine entre I'oligonucléotide et le signal de
ciblage. Toute
autre méthode connue de l'homme du métier peut être utilisée, telle que les
réactifs de
5 couplage bifonctionnel par exempie.
Un autre objet de l'invention concerne les compositions comprenant un vecteur
tel que défini précédemment.
Avantageusement, les vecteurs selon l'invention peuvent également être
associés à un ou plusieurs agents connus pour transfecter l'ADN. On peut citer
à titre
10 d'exemple les lipides cationiques qui possèdent des propriétés
intéressantes. Ces
vecteurs sont en effet constitués d'une partie polaire, cationique,
interagissant avec
l'ADN, et d'une partie lipidique, hydrophobe, favorisant la pénétration
cellulaire et
rendant l'interraction ionique avec l'ADN insensible au milieu externe. Des
exemples
particuliers de lipides cationiques sont notamment les lipides monocationiques
15 (DOTMA : Lipofectin~), certains détergents cationiques (DDAB), les
lipopolyamines
et en particulier ta dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS) ou la 5-
carboxyspermylamide de la palmitoylphosphatidyléthanolamine (DPPES) dont la
préparation a été décrite par exemple dans la demande de brevet EP 394 111.
Une
autre famille intéressante de lipopolyamines est représentée par les composés
décrits
dans la demande de brevet WO 97/18185 incorporée à la présente par référence.
De
nombreux autres lipides cationiques ont été développés et peuvent être
utilisés avec les
vecteurs selon l'invention.
Parmi les agents de transfection synthétiques développés, les polymères
cationiques de type polylysine et DEAE dextran sont également avantageux. II
est
aussi possible d'utiliser les polymères de polyéthylène imine (PEI) et de
polypropylène
imine (PPI) qui sont accessibles commercialement et peuvent être préparés
selon le
procédé décrit dans la demande de brevet WO 96/02655.
D'une manière générale, tout agent synthétique connu pour transfecter l'acide
nucléique peut être associé aux vecteurs selon l'invention.
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Les compositions peuvent en outre comporter des adjuvants capables de
s'associer aux complexes vecteur selon l'invention/agent de transfection et
d'en
améliorer le pouvoir transfectant. Dans un autre mode de mise en oeuvre, la
présente
invention concerne donc des compositions comprenant un vecteur tel que défini
précédemment, un ou plusieurs agents de transfection tels que définis ci-avant
et un ou
plusieurs adjuvants capables de s'associer aux complexes vecteur selon
l'invention/agent(s) de transfection et d'en améliorer le pouvoir
transfectant. La
présence de ce type d'adjuvant (lipides, peptides ou protéines par exemple)
peut
permettre avantageusement d'augmenter le pouvoir transfectant des composés.
1o Dans cette optique, les compositions de l'invention peuvent comprendre
comme adjuvant, un ou plusieurs lipides neutres dont l'utilisation est
particulièrement
avantageuse. La demanderesse a en effet montré que l'addition d'un lipide
neutre
permet d'améliorer la formation des particules nucléolipidiques et de
favoriser la
pénétration de la particule dans la cellule en déstabilisant sa membrane.
Plus préférentiellement, les lipides neutres utilisés dans le cadre de la
présente
invention sont des lipides à 2 chaînes grasses. De manière particulièrement
avantageuse, on utilise des lipides naturels ou synthétiques, zwitterioniques
ou
dépourvus de charge ionique dans les conditions physiologique. Il peuvent être
choisis
plus particulièrement parmi la dioleoylphosphatidyléthanolamine (DOPE),
l'oléoyl-
2U palmitoylphosphatidyléthanolamine (POPE), les di-stéaroyl, -palmitoyl, -
mirystoyl
phosphatidyléthanolamines ainsi que leurs dérivé N-méthylés 1 à 3 fois, les
phosphatidylglycérols, les diacylglycérols, les glycosyldiacylglycérols, les
cérébrosides
(tels que notamment les galactocérébrosides), les sphingolipides (tels que
notamment
les sphingomyélines) ou encore les asialogangliosides {tels que notamment les
asialoGM 1 et GM2).
Ces différents lipides peuvent être obtenus soit par synthèse, soit par
extraction à partir d'organes (exemple : le cerveau) ou d'oeufs, par des
techniques
classiques bien connues de l'homme du métier. En particulier, l'extraction des
lipides
naturels peut être réalisée au moyen de solvants organiques (voir également
Lehninger,
3o Biochemistry).
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La demanderesse a démontré qu'il était également particulièrement
avantageux d'employer à titre d'adjuvant, un composé intervenant ou non
directement
au niveau de la condensation de l'ADN (WO 96/25508). La présence d'un tel
composé,
au sein d'une composition selon l'invention permet de diminuer la quantité de
composé
s transfectant, avec les conséquences bénéfiques qui en découlent sur le plan
toxicologique, sans porter un préjudice quelconque à l'activité transfectante.
Par
composé intervenant au niveau de la condensation de l'acide nucléique, on
entend
définir un composé compactant, directement ou non, l'ADN. Plus précisément, ce
composé peut soit agir directement au niveau de l'ADN à transfecter soit
intervenir au
1o niveau d'un composé annexe qui lui est directement impliqué dans la
condensation de
cet acide nucléique. De préférence, il agit directement au . niveau de l'ADN.
Notamment, cet agent intervenant dans la condensation de l'ADN peut être tout
polycation, par exemple la polylysine. Selon un mode de réalisation préféré,
cet agent
peut aussi être tout composé dérivant en tout ou partie d'une histone, d'une
nucléoline,
15 d'une protamine et/ou de l'un de leurs dérivés. Un tel agent peut également
être
constitué, en tout ou partie, de motifs peptidiques (KTPKKAICKP) et/ou
(ATPAKKAA), le nombre des motifs pouvant varier entre 2 et 10. Dans la
structure
du composé selon l'invention, ces motifs peuvent être répétés de manière
continue ou
non. C'est ainsi qu'ils peuvent être séparés par des liens de nature
biochimique, par
2o exemple par un ou plusieurs acides aminés, ou de nature chimique.
L'invention a également pour objet l'utilisation des vecteurs tels que définis
ci-
avant pour fabriquer un médicament destiné à soigner les maladies par
transfection
d'ADN dans des cellules primaires ou dans des lignées cellulaires établies. Il
peut s'agir
de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrocytes,
cellules
25 gliales), hépatiques, de la lignée hématopoiétique (lymphocytes, CD34,
dendritiques,
etc...), épithéliales, etc..., sous formes différenciées ou pluripotentes
(précurseurs).
Les vecteurs de l'invention peuvent à titre illustratif ëtre utilisés pour la
transfection in vitro, ex vivo ou in vivo d'ADN codant pour des protéines ou
des
polypeptides.
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Pour des utilisations in vivo, soit en thérapie soit pour l'étude de la
régulation
de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les compositions
selon
l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique,
cutanée,
orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse,
intramusculaire, sous-
cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale, intrapéritonéale,
etc... De
préférence, les compositions de l'invention contiennent un véhicule
pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour
une
injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par
voie
topique (sur peau et/ou muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions
stériles,
isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par
addition
selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la
constitution de
solutés injectables. Les doses d'acide nucléique utilisées pour l'injection
ainsi que le
nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents
paramètres,
et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie
concernée,
du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui
concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir soit
d'une
injection directe dans les tissus ou les voies circulatoires, soit d'un
traitement de
cellules en culture suivi de leur réimplantation in vivo, par injection ou
greffe.
L'invention concerne en outre une méthode de transfection d'ADN dans les
2o cellules comprenant les étapes suivantes
(1) synthèse de la chimère oligonucléotide - signal de ciblage selon le
procédé
décrit précédemment,
(2) mise en contact de la chimère synthétisée en (1) avec un ADN double brin
pour former des triples hélices,
(3) éventuellement, complexation du vecteur obtenu en (2) avec un ou
plusieurs agents de transfection et/ou un ou plusieurs adjuvant(s), et
(4) mise en contact des cellules avec le complexe formé en (2) ou le cas
échéant en (3 ).
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La mise en contact des cellules avec le complexe peut être réalisée par
incubation des cellules avec ledit complexe (pour de utilisations in vitro ou
ex vivo),
ou par injection du complexe dans un organisme (pour des utilisations in
vivo).
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse
s pour le traitement de maladies par administration d'un vecteur selon
l'invention
contenant un acide nucléique apte à corriger ladite maladie. Plus
particulièrement,
cette méthode est applicable aux maladies résultant d'une déficience en un
produit
protéique ou peptidique, l'ADN administré codant pour ledit produit protéique
ou
peptidique. La présente invention s'étend à toute utilisation d'un vecteur
selon
lo l'invention pour la transfection in vivo, ex vivo ou in vitro de cellules.
L'invention concerne également toute cellule recombinante contenant un
vecteur tel que défini ci-avant. II s'agit préférentiellement de cellules
eucaryotes, par
exemple des levures, des cellules animales, etc... Ces cellules sont obtenues
par toute
technique permettant l'introduction d'un ADN dans une cellule donnée et connue
de
15 l'homme du métier.
Les exemples suivants destinés à illustrer l'invention sans en limiter la
portée"
permettent de mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la
présente
invention.
FIG- URSS
2o Fi~~ure 1 : Couplage d'un oligonucléotide (ODN) et du peptide maléimide-
NLS.
Fi ure 2 : Analyse sur gel de polyacrylamide 15 % de la chimère
oligonucléotide -
peptide (Pso-GA19-NLS) par action protéolytique de la trypsine.
1 = oligo Pso-GA~9-SH
2 = chimère oligonucléotide-peptide Pso-GA,9-NLS
25 3 = chimère oIigonucléotide-peptide Pso-GA,9-NLS après digestion par la
trypsine
Fi ure 3 : représentation schématique du plasmide pXL2813.
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Figure 4 : représentation schématique du plasmide pXL2652.
Figure 5 : Analyse sur gel de polyacrylamide 15 % de la formation de triples
hélices
entre le plasmide pXI,2813 et la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GAl9-NLS.
L'oligonucléotide pso-GA,9-NLS et le plasmide sont mélangés dans un tampon
s contenant 100 mM de MgCl2. L'excès en molarité de l'oligonucléotide par
rapport au
plasmide varie de 0 à 200. Le mélange est photoactivé, après une nuit à
37°C, puis
digéré par deux enzymes de restriction qui coupent le plasmide de part et
d'autre de la
région de formation des triples hélices.
1 = pas d'oligonucléotide
2 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de I S
3 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de 50
4 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de 100
5 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de 200
6 = oligonucléotide seul photoactivé
15 7 = oligonucléotide seul non photoactivé
8 = excès en molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide de 30, le
mélange
n'ayant pas été photoactivé.
Fi ure 6 : Expression in vitro du transgène (J3-galactosidase) pour des essais
effectués
avec le plasmide pXL2813 seul, le vecteur pXL,2813-Pso-GA,9-NLS, et sans
plasmide.
2o Fi ure 7 : Caractérisation de la partie peptidique de la chimère
oligonucléotide-peptide
Pso-GA,9-NLS par interaction avec l'importine 60-GST (analyse sur gel de
polyacrylamide I S %).
1 = oligo Pso-GA19 ( I pg)
2 = chimère oligonucléotide-peptide Pso-GAl9-NLS (l~cg)
3 = surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes
d'impor-
tines 60 et de l'oligonucléotide Pso-GA,9, et séparation du culot de billes
(contenant
les éléments interagissant avec les importines) du surnageant
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2I
4 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes
d'importines 60
et de l'oligonucléotide Pso-GA19, et séparation du culot de billes (contenant
les
éléments interagissant avec les importines) du surnageant
= surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes
d'impor-
5 tines 60 et de la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GA~9-NLS, et
séparation du
culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du
surnageant
6 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes
d'importines 60
et de la chimère oligonucléotide-peptide Pso-GA19-NLS, et séparation du culot
de
billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du
surnageant.
Io Fi ure 8 : Analyse sur gel de polyacrylamide 15 % de la chimère
oIigonucIéotide-
peptide (GA,9-NLS) par action protéolytique de la trypsine.
1 = oligo GA,9-SH (200 ng)
2 = chimère oligonucléotide-peptide GA,9-NLS ( 1 pg) avant purification par
chroma-
tographie liquide à haute pression
3 = chimère oligonucléotide-peptide GA~9-NLS ( 1 pg) après purification
4 = chimère oligonucléotide-peptide GA19-NLS après digestion par la trypsine (
1 ~tg).
Fitxure 9 : Représentation graphique de la cinétique de formation des triples
hélices (%
de sites de triples hélices occupé en fonction du temps) entre le plasmide
pXL2813 et
la chimère GA~9-NLS.
2o F_iRure 10 : Caractérisation de la partie peptidique de la chimère
oligonucléotide-
peptide GAl9-NLS par interaction avec l'importine 60-GST.
1 = chimère oligonucléotide-peptide GA~9-NLS,
2 = oligo GA,9,
3 - surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes
d'importines 60 et de la chimère oligonucléotide-peptide GAIS-NLS, et
séparation du
culot de billes (contenant les éléments interagissant avec les importines) du
surnageant,
4 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes
d'importines 60
et de la chimère oligonucléotide-peptide GA19-NLS, et séparation du culot de
billes
(contenant les éléments interagissant avec ies importines) du surnageant,
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- surnageant récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes
d'importines 60 et de l'oligonucléotide GA,9 et séparation du culot de billes
(contenant tes éléments interagissant avec les importines) du surnageant,
6 = culot récupéré après incubation des billes-glutathion recouvertes
d'importines 60
5 et de l'oligonucléotide GA,9, et séparation du culot de billes (contenant
les éléments
interagissant avec ies importines) du surnageant.
Figuure 1 I : représentation schématique du plasmide pXL,2997.
Figure 12 : Représentation graphique de la cinétique de formation des triples
hélices
(% de sites de triples hélices occupé en fonction du temps) entre le plasmide
pXL2997
et la chimëre pim-NLS.
Figure 13 : histogramme représentant l'activité ~3-galactosidase in vivo dans
des
tumeurs pulmonaires humaines H1299 des plasmides pXI,2813 (indiqué Bgal sur la
figure) et pXL,2813-Pso-GA,9-NLS (indiqué NLS-Bgal sur la figure) en RLU
(« Relative Light Unit ») par tumeur.
La transfection a été faite en utilisant les techniques d'électrotransfert
telles que
décrites dans les demandes W099/01157 et WO 99/01158.
MATERIEL ET METAODES
1. Couplage des oligonucléotides et des peptides
Les olitxonucléotides
2o Les oligonucléotides utilisés sont soit la séquence 5'
AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (SEQ m N°4) d'une longueur de 19 bases et
référencée sous le nom de « GA,9 » dans la suite du texte, soit la séquence 5'
GGGGAGGGGGAGG-3' (SEQ )D N°15) d'une longueur de 13 bases et
référencée
sous le nom « pim » dans la suite du texte (car il s'agit de la séquence du
protooncogène pim-1).
Les oligonucléotides notés GA,9-SH ou pim-SH ont les mêmes séquences que GA,9
et
pim respectivement et un groupement thiol à l'extrémité 5', avec un espaceur
de six
carbones entre le tlliol et le phosphate de l'extrémité 5'. Les
oligonucléotides notés
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Pso-GA19-SH ont un groupement thiol à l'extrémité 3' (SH), et en plus, un
psoraiène à
l'extrémité 5' (Pso), avec un espaceur de six carbones entre le psoralène et
le
phosphate de l'extrémité 5'. Les oligonucléotides notés Pso-GA,9 n'ont pas de
groupement thiol.
La nomenclature utilisée est résumée dans le tableau I ci-dessous
nom de l'oligonuclotidemodification de l'extrmitmodification de l'extrmit
3' 5'
GA,9 aucune aucune
Pim aucune aucune
GA,9-SH aucune ~ groupement thiol
pim-SH aucune groupement thiol
Pso-GA,9 aucune psoralne
Pso-GA~9-SH groupement thiol psoralne
Tableau I
Ces oligonucléotides lyophilisés sont repris dans un tampon acétate de
triéthylammonium 100 mM, pH = 7.
Les peptides
lo Les peptides utilisés pour les couplages sont synthétisés par un automate
en phase
solide. Ils contiennent
- soit la séquence de localisation nucléaire de l'antigène T de SV40
(PKICKRKV, SEQ
ID N°11),
- soit la même séquence mutée (PK1VICRKV, SEQ l'D N° 14) qui ne permet
ni ie
ciblage ni le transport nucléaire (du fait de la mutation).
Ces peptides portent également un espaceur de quatre acides aminés à
l'extrémité N-
terminale : KGAG. La lysine N-terminale est modifiée chimiquement: elle
contient un
groupement maléimide sur le carbone E et un groupement protecteur 9-
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fluorenylméthyloxycarbonyl (Fmoc) sur l'amine du carbone a. Ce groupement Fmoc
absorbe à 260 nm ce qui permet de suivre le peptide par chromatographie
liquide à
haute pression en phase inverse. Le groupement C-terminal est également
protégé
(groupement CONHZ), la protection étant ajoutée en fin de synthèse peptidique.
La représentation des peptides est indiquée dans le tableau II ci-dessous
nom du peptide squence et modifications
malimide-~GAGPKKKRK~-CONHz
malimide-NL
S
FF''
moc
malimide- KGAGPKNKRKV~--CONHz
malimide-NLSmut '
~
Fmoc
Tableau II
Les peptides lyophilisés sont repris dans un tampon acétate de
triéthylammonium 100
mM, pH = 7. La concentration est de 0,4 mglml.
Les coula es
Pour le couplage avec les oligonucléotides, la stratégie utilisée consiste à
faire réagir le
groupement thiol porté par l'oligonucléotide et le groupement maléimide porté
par le
peptide [Eritja, R., et al., Synthesis of defrned peptide-oligonucleotide
hybrids
containing a nuclear transport signal sequence, Tetrahedron, 1991, 47(24), pp.
4113-
4120].
L'oligonucléotide est ajouté à la solution de peptide de façon équimolaire et
le milieu
réactionnel est laissé deux heures à température ambiante. La chimère
oligonucléotide-
peptide est purifiée par chromatographie liquide à haute pression en phase
inverse, sur
colonne Vydac C8 contenant de la silice sphéroïdale de diamètre 5 pm et de
porosité
300 A. On utilise un tampon acétate de triéthylammonium (TEAA) 0,1 M et un
2o gradient d'acétonitrile passant de 5 % à 50 % en 35 minutes. Les produits
sont
détectés à 260 nm.
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Analyse des chimères par digestion à la trv,_psine
Les conjugués oligonucléotide-peptide sont soumis à l'action protéolytique de
la
trypsine qui permet de mettre en évidence la partie peptidique de la chimère
[Reed,
M.W. et al, Synthesis and eraluation of nuclear targeting peptide-antisens
5 oligodeoxynucleotide conjugales, Bioconjugate Chemistry, 1995, 6, pp.101-
108J. Des
solutions contenant 1 pg d'oligonucléotide-peptide dans 7 111 de tampon de
purification tréthylammonium (TEAA) 0,1 M sont mélangés à 1 pl d'une solution
de
trypsine (5 mg/ml). On y ajoute 1 pl de tampon Tris 100 mM, HCl pH = 9, et 1
pl
d'EDTA 500 mM. Après une digestion d'une heure, les échantillons sont déposés
dans
10 les puits d'un gel de polyacrylamide à 15 %, urée 7 M. L'électrophorèse est
faite en
tampon Tris 100 mM, acide borique 90 mM, EDTA 1 mM, pH = 8,3. Les acides
nucléiques sont révélés par une coloration à l'argent grâce à un kit Biorad.
2 . Formation de triples hélices avec les chimères
Le plasmide
15 Le plasmide utilisé pour étudier la formation de triples hélices avec les
chimères GA,9-
peptide est appelé pXi,2813 (7257 pb, voir figure 3). Ce plasmide exprime le
gène de
Ia (3-galactosidase sous contrôle du promoteur fort des gènes précoces du
Cytomégalovirus (CMV), ainsi que le gène de résistance à l'Ampicilline.
En amont du promoteur, entre les positions 7238 et 7256, la séquence GA19 (5'-
2o AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3', SEQ ID N°4) a été clonée selon les méthodes
classiques de biologie moléculaire.
Elle a été clonée dans le plasmide pXL2652 (de 7391 pb et dont la
représentation est
schématisée dans la figure 4) qui exprime le gène de la [3-Galactosidase sous
contrôle
du promoteur fort des gènes précoces du Cytomégalovirus (CMV), ainsi que le
gène
25 de résistance à l'Ampicilline. Ce promoteur provient de pCDNA3, le gène
LacZ et son
polyA proviennent de pCH110, et le reste provient de pGL2.
Les séquences ont été clonées en amont du promoteur entre les sites uniques de
coupure des enzymes Muni et XmaI. Pour cela, les deux oligonucléotides
complémentaires contenant la séquence à cloner 6651 (5'-
3o AATTGATTCCTCTCCTCCCTCCCTTAC-3') et 6652 (3'-
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CTAAGGAGAGGAGGGAGGGAATGGG-5') ont été chauffés pendant 5 minutes à
95°C, puis hybridés en laissant la température redescendre lentement.
Le plasmide
pXL2652 a ensuite été digéré par les enzymes Muni et XmaI, pendant 2 heures à
37°C, et les produits de cette double digestion ont été séparés par
électrophorèse sur
gel d'agarose à 1 % et coloration au bromure d'éthidium.
Le fragment d'intérêt pour la suite du clonage a été élué selon le protocole
Jetsorb
(Genomed) et 200 ng de ce fragment ont été reliés à 10 ng du mélange
d'oligonucléotides hybridés par la T4 ligase, pendant 16 heures à 16°C.
Des bactéries E.Coli, compétentes, de souche DHSoc ont été transformées par
électroporation avec Ie produit de la réaction, étalées sur des boîtes de
Pétri contenant
du milieu LB et de l'Ampicilline. Les clones résistants à l'Ampicilline ont
été
sélectionnés et l'ADN a été extrait par lyse alcaline et analysé sur gel
d'agarose à 1 %.
Un clone correspondant, en taille, au produit attendu a été séquencé.
Dans les cas où l'oligonucléotide est pim, le plasmide utilisé pour étudier la
formation
de priple hélice est pXL2997 représenté à la figure 11. Ce plasmide exprime le
gène de
la (3-galactosidase sous contrôle du promoteur fort des gènes précoces du
Cytomégalovin.~s (CM~, ainsi que le gène de résistance à l'Ampicilline.
En amont du promoteur, la séquence pim (SEQ ID N°15) a été clonée
selon les
méthodes classiques de biologie moléculaire.
zo Formation des triples hélices
La formation des triples hélices s'effectue par mélange du plasmide pXL2813 (3
pmol
de plasmide soit encore 15 pg) ou pXL2997 selon les cas et de quantités
variables
d'oügonucléotides ou de chimères dans un tampon Tris 100 mM, HCl pH = 7,5 , et
MgCl2 I 00 mM.
2s La nhotoactivation des triples hélices
Après une nuit d'incubation, le mélange est irradié, dans la glace, pendant 15
minutes,
en utilisant une lampe monochromatique de longueur d'onde 365 nm (Biorad). Le
produit de la photoactivation est digéré par les enzymes de restriction MfeI
et SpeI et
analysé sur un gel de polyacrylamide 15 %, urée 7 M avec un tampon de
migration
3o Tris 100 mM, acide borique 90 mM, EDTA 1 mM, et pH = 8,3. Les acides
nucléiques
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sont révélés par une coloration à l'argent grâce à un kit Biorad [Musso, M.,
J.C.
Wang, and M. W. V. Dyke, Ilt VIVO persistence of DNA triple helices containi»g
psoraleu-col jugated oligodeoxyribonucleotides, Nucleic Acid Research, 1996,
24(24), pp.4924-4932].
La méthode d'étude des triple hélices
Cette méthode est basée sur le principe de chromatographie d'exclusion de
solutions
contenant le plasmide et l'oligonucléotide susceptibles de former une triple
hélice. Les
colonnes d'exclusion utilisées (Columns, Linkers 6, Boehringer Mannheim) sont
composées de billes de sépharose et ont pour limite d'exclusion 194 paires de
bases ce
qui permet de retenir dans la colonne les oligonucléotides non appariés aux
plasmides.
Dans un premier temps, les oligonucléotides sont marqués radioactivement en
leur
extrémité 3' par la Terminal Transferase à l'aide de dATPa35S. Le protocole
utilisé
provient d'Amersham : 10 pmol d'oligonucléotides sont incubés pendant 2 heures
à
37°C, avec 50 pCi de dATPa35S en présence de 10 unités de Terminal
Transferase,
dans un volume de 50 ui de tampon contenant du cacodylate de sodium. Le
pourcentage d'oligonucléotides marqués est évalué selon la méthode suivante :
1111
d'un échantillon dilué au 1/100 de la solution après marquage est déposé sur
papier
Whatman DE81, en double. L'un des deux papiers est lavé deux fois pendant 5
minutes avec du 2xSSC, pendant 30 secondes avec de l'eau et pendant 2 minutes
avec
2o de l'éthanol. Les radioactivités des deux papiers sont comparées. La
radioactivité du
papier lavé correspond au 35S effectivement incorporé.
La formation des triple hélices se fait dans un volume de 35 ul. Les
concentrations de
plasmides (40 nM) et d'oligonucléotides (20 nNn, ie tampon utilisé (100 mM de
Tris
HCI pH = 7,5, 50 mM de MgCl2) et la température (37°C) sont fixes
tandis que le
temps d'incubation varie de 1 à 24 heures. Les colonnes de sépharose sont
équilibrées,
avant utilisation, avec le tampon de réaction et centrifugées à 2200 tr/min
pendant 4
minutes, pour les tasser. 25 pl du milieu réactionnel sont déposés sur ies
colonnes et
celles-ci sont centrifugées dans les mêmes conditions que précédemment. 25 pl
du
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tampon de réaction sont ensuite déposés sur ies colonnes qui sont à nouveau
centrifugées. L'éluat est récupéré.
La radioactivité contenue dans 5 pl du milieu réactionnel, notée cpm(dépôt),
et celle
contenue dans l'éluat, notée cpm(éluat), sont évaluées ce qui permet d'estimer
le
pourcentage d'oligonucléotides élués
d'oligonucléotides élués = cpm(éluat) / [5 x cpm(dépôt}]x100.
Le pourcentage de plasmides qui sont effectivement élués au cours des
expériences est
évalué en estimant la densité optique à 260 nm de l'éluat et celle du dépôt,
ce qui
permet de calculer le pourcentage d'oligonucléotides fixés sur la totalité des
plasmides
d'oligonucléotides fixés = [% oligonucléotides élués / % plasmides élués]x100.
Ce paramètre permet d'évaluer le pourcentage de sites de formation de triples
hélices
(il en existe un par plasnûde pXL2813 ou pXL2997) qui sont effectivement
occupés
en tenant compte des concentrations de plasmides (notée [plasmide]) et
d'oligonucléotides (notée [oligo]) utilisés lors de ia réaction de formation
des triple
hélices
sites triple hélice occupés = % d'oligonucléotides fixés x [oligo] /
[plasmide].
3. Interaction avec les imnortines
Les protéines recombinantes
2o La sous-unité importine 60 utilisée pour étudier l'interaction avec les
conjugués
oligonuciéotide-peptide (NLS ou NLSmuté) est d'origine murine et fusionnée à
la
Glutathion S-Transferase (GST). La séquence de l'importine 60 a été clonée
dans un
vecteur pGEX-2T pour la fusionner à la GST. La protéine recombinante a été
produite
dans Escherichia coli [Imamoto, N. et al., In vivo evidence for involvement of
a 58kDa
composent of nuclearpore-targeting complex in rruclear protein import, The
EMBO
Journal, 1995, 14(15), pp. 3617-3626].
Les interactions avec les protéines recombinantes
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Toutes les expériences d'interaction sont menées dans le tampon de fixation
(HEPES
20 mM, pH = 6,8, acétate de potassium 150 mM, acétate de magnésium 2 mM, DTT
2 mM, et BSA 100 pg/ml).
Dans un premier temps, les protéines recombinantes sont incubées en présence
de
billes de sépharose recouvertes de groupements glutathion (Pharmacie Biotech)
1 ug
de protéine recombinante est utilisé pour 10 pl de billes. Après une
incubation de 30
minutes, à température ambiante, dans 500 ul de tampon de fixation, le mélange
est
centrifugé à 2000 G pendant 30 secondes, et le surnageant est enlevé. Les
billes sont
lavées cinq fois par resuspension dans 500 pl de tampon de fixation et
centrifi.~gation,
to comme décrit ci-avant. Les billes sont resuspendues dans du tampon de
fixation pour
obtenir une suspension contenant SO % de billes recouvertes de protéines
recombinantes.
Dans un second temps, 60 pl de la suspension contenant 50 % de billes
recouvertes de
protéines recombinantes sont incubés avec 2 ug d'oligonucléotide ou
d'oligonucléotide-peptide, dans un volume de 500 pl de tampon de fixation.
Après une
incubation de 30 minutes, à température ambiante, le mélange est centrifugé à
20006
pendant 30 secondes, et le surnageant est enlevé. 30 pl du surnageant sont
collectés
pour analyser la fraction non fixée sur les billes. Les billes sont lavées
cinq fois par
resuspension dans 500 ul de tampon de fixation et centrifugation, comme décrit
ci-
2o avant. Les billes sont resuspendues dans 15 pl de tampon de charge (bleu de
bromophénol 0,05 %, saccharose 40 %, EDTA 0,1 M, pH = 8, sodium lauryl sulfate
0,5 %) et chauffées 10 minutes à 90°C. Le contenu du surnageant et du
culot est
analysé sur un gel de polyacrylamide à 15 %, urée 7 M, avec un tampon de
migration
Tris 100 mM, acide borique 90 mM, EDTA I mM, pH = 8,3. Les acides nucléiques
sont révélés par une coloration à l'argent grâce à un kit Biorad [Rexach, M.
and G.
Blobel, Protein import into nuclei : association a~:d dissociation reactions
involving
transport substrate, transport factors, and nucleoporins, Cell, 1995, 83, pp.
683-692).
4. Transfection de cellules
Culture cellulaire
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Le type cellulaire utilisé est NIH3T3 (ATCC CRL-1658). Il s'agit de
fibroblastes de
souris. Ces cellules sont cultivées dans un milieu Dulbecco modifié, avec du
glucose
4,5 g/1 (DMEM - Gibco), de la glutamine 2 mM, de la pénicilline (I00 U/ml) et
de la
streptomycine ( 100 pg/ml), et 10 % de sérum de veau foetal (Gibco). Elles
sont
5 incubées à 37°C dans une étuve à 5 % de COz.
La transfection
Un jour avant ia transfection, les puits d'une plaque de 24 puits sont
ensemencés avec
50000 cellules par puit. Les vecteurs sont dilués dans du NaCI 1 SO mM et
mélangés à
un lipide cationique (le composé de formule condensée
1o H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)~~CH3]2 décrit dans la
demande brevet WO 97/18185 sous le numéro (6)), dilué dans dù NaCI 150 mM. Le
mélange se fait avec 6 nmol de lipide par microgramme de plasmide. Ce mélange
est
dilué au 1/10 dans du milieu de culture sans sérum et déposé sur les cellules.
Après
une incubation à 37°C dans une étuve à 5 % de COz pendant deux heures,
on ajoute
15 I O % de sérum de veau foetal.
La quantification de la (3-galactosidase
Après une incubation de 48 heures, les cellules sont lavées deux fois avec du
PBS et
lysées avec 250 111 de tampon de lyse (Promega). La (3-galactosidase est
quantifiée
selon le protocole « Lumigal (i-Galactosidase genetic reporter system »
(Clontech).
2o L'activité est mesurée sur un luminomètre Lumat LB9501 (Berthold). La
quantité de
protéines est mesurée avec le kit BCA (Pierre).
EXEMPLES
Exemple 1
Cet exemple illustre la possibilité de coupler l'oligonucléotide Pso-GA19-SH
au
25 peptide maléimide-NLS.
L'oligonucléotide Pso-GA,9-SH, de séquence 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3',
avec un groupement thiol à l'extrémité 3', a été couplé au peptide NLS qui
porte un
groupement maléimide à son extrémité N-terminale selon la méthode décrite
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précédemment dans la partie "Matériel et Méthodes" sous la section "couplage
des
oligonucléotides et des peptides".
Le couplage est suivi par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en
phase
inverse. II s'effectue avec une stoechiométrie équimolaire : en deux heures,
le
couplage est total, et la chimère est purifiée par CLHP.
Le schéma réactionnel du couplage est représenté à la figure 1.
La chimère oligonucléotide-peptide (Pso-GA,9-NLS) a été analysée par
électrophorèse
en gel de polyacrylamide après action protéolytique de la trypsine qui permet
de mettre
en évidence la présence de la partie peptidique de la chimère, après migration
sur gel
1o de polyacrylamide dénaturant et coloration des acides nucléiques par
l'argent (comme
indiqué dans la partie "Matériel et méthodes" sous la section "Analyse des
chimères
par digestion à ia trypsine").
La chimère Pso-GA~9-IVI,S présente une migration électrophorétique retardée
par
rapport à l'oligonucléotide Pso-GA19-SH, et le produit de la digestion
protéolytique
est visualisé à un niveau intermédiaire entre les niveaux de migration de Pso-
GAI9-
NLS et de Pso-GA,9-SH, comme cela apparaît sur la figure 2.
La chimère Pso-GA19-NLS contient donc une partie peptidique accessible à la
trypsine. Ces résultats montrent clairement que le couplage entre
l'oIigonucléotide et le
peptide s'est opéré, et le rendement du couplage est important.
2o Exemple 2
Cet exemple illustre la formation de triples hélices entre le plasmide pXL2813
et ia
chimère Pso-GA19-NLS qui est modifiée par un agent alkylant photoactivable.
Cet
exemple indique également quelle est la proportion de plasmides modifiés selon
l'excès
en molarité d'oligonucléotides par rapport au plasmide:
Le plasmide pXL2813, représenté à la figure 3, comporte la séquence
homopurique
complémentaire de GA19 qui est susceptible de former une triple hélice avec
les
oligonucléotides GA,9, Pso-GA19, Pso-GA~9-SH ou Pso-GA,9-NLS. Les cations
divalents, tel que Mg2', stabilisent ces triples hélices. L'oligonucléotide
Pso-GA,9-NLS
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et le plasmide sont mélangés dans un tampon contenant 100 mM de MgCl2. L'excès
en
molarité d'oligonucléotide par rapport au plasmide varie de 0 à 200.
Après incubation pendant 12 heures à 37°C, le mélange est photoactivé
pendant 1 S
minutes (comme indiqué dans la partie "matériel et méthodes" sous la section
"Photoactivation des triples hélices"), puis digéré par les deux enzymes de
restriction
MfeI et SpeI qui coupent le plasmide de part et d'autre de la région de
formation des
triples hélices. On libère ainsi un fragment d'acides nucléiques qui contient
70 paires
de bases après digestion du plasmide pXL2813 non modifié. Le fragment obtenu
avec
le plasmide et l'oligonucléotide formant une triple hélice lié covalemment à
la double
to hélice compte 70 paires de bases plus 19 bases de l'oligonucléotide. Par
migration sur
un gel de polyacrylamide dénaturant, on peut ainsi séparer ces fragments de
taille
différente: les fragments provenant de plasmides modifiés par une triple
hélice ont une
distance de migration plus courte que les fragments provenant de plasmides non
modifié. On peut donc, par électrophorèse sur gel de polyacrylamide
dénaturant,
quantifier la proportion de plasmides modifiés selon l'excès en molarité
d'oligonucléotide par rapport au plasmide.
Les résultats sont indiqués à la figure 5. Pour un excès en molarité
d'oligonucléotide
par rapport au plasmide supérieur à 50, tous les plasmides sont modifiés et
sont
associés à un oligonucléotide Pso-GA,9-NLS. Sans photoactivation, on perd le
2o retardement du fragment de digestion en gel dénaturant.
II apparaît ainsi que les triples hélices formées avec les oligonucléotides
Pso-GA,9-SH
ou Pso-GA,9-NLS sont donc bien liées covalemment à la double hélice après
photoactivation.
Par ailleurs, en digérant le reste du squelette plasmidique et en l'analysant
comme
précédemment, on peut vérifier que la photoactivation n'entraîne pas de
liaison
covalente non spécifique de l'oligonucléotide Pso-GA,9-NLS en dehors de la
région
contenant la séquence susceptible de former une triple hélice.
Ces résultats mettent clairement en évidence les conditions permettant
d'associer
spécifiquement et covalemment une séquence peptidique à un plasmide, et ce en
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dehors du promoteur régulant l'expression du transgène, ce qui évite que
l'expression
du transgène n'en soit affectée.
Exemple 3
Cet exemple illustre la capacité du transgène à être exprimé in vitro bien que
le
plasmide soit modifié.
L'expression de la /3-galactosidase par les plasmides pXL2813 non modifiés ou
associés à un oligonucléotide Pso-GA,9-NLS a ainsi été comparée par
transfection de
cellules lVIFi3T3.
Les résultats sont reportés dans la figure 6, et les moyennes des valeurs
obtenues
(~ écart type) sont rassemblées dans le tableau III suivant
expression du transgne
plasmide
(en RLU/pg de protine)
pXL2813 253759 48545
pXL2813-Pso-GA19-NLS473984 111476
sans plasmide 129 85
Tableau III
On constate que l'expression du transgène augmente suite à la modification
apportée
par la fixation covalente d'une triple hélice en amont du promoteur.
Ces résultats mettent clairement en évidence que la formation des triples
hélices
n'affecte pas l'expression du transgène in vitro. Au contraire, grâce à
l'adressage
nucléaire du plasmide du fait de son couplage à la séquence de ciblage NLS,
davantage
de plasmides ont atteint le noyau, et il en résulte une augmentation de
l'efficacité de
transfection.
Exemple 4
2o Get exemple a pour but de vérifier que l'expression in vivo n'est pas
inhibée par la
présence d'un signal de ciblage associé au plasmide via une triple hélice.
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34
L'expérience consiste à transfecter pXL2813 et pXI,2813-Pso-GA19-NLS dans des
tumeurs pulmonaires humaines H1299 en utilisant les techniques
d'électrotransfert
décrites dans les demandes WO 99/01157 et WO 99/01158. L'expérience a été
réalisée chez la souris nude femelle de 18 à 20 g.
Les souris sont implantées monolatéralement avec des greffons de tumeurs H1299
de
20 mm3. Les tumeurs se développent pour atteindre un volume de 200 à 300 mm3.
Les
souris sont triées en fonction de leur tailles tumorales et réparties en lots
homogènes.
Puis les souris sont anesthésiées avec un mélange Kétamine/Xylazine
(disponible
commercialement). La solution de plasmide (8 pg d'ADN/40 pl de chlorure de
sodium
lo I50 mM) est injectée longitudinalement en périphérie de la tumeur à l'aide
d'une
seringue Hamilton.
Les faces latérales de la tumeur sont enduites de gel conducteur et la tumeur
est placée
entre deux électrodes plates en acier inoxydable distante de 0,45 à 0,7 em.
Les
impulsions électriques sont appliquées à l'aide d'un générateur d'impulsions
carrées du
commerce (Electro-puisateur PS 15, Jouan, France) 20 à 30 secondes après
l'injection.
Un oscilloscope permet de contrôler l'intensité en volts, la durée en
millisecondes et la
fréquence en hertz des impulsions qui doivent ëtre délivrées à 500 V/cm
pendant 20
millisecondes et à 1 hertz.
Pour l'évaluation de la transfection tumorale, 10 et 7 souris respectivement
pour le
plasmide pXL,2813 et pXL2813-Pso-GAl9-NLS sont euthanasiées 2 jours après
l'injection du plasmide. Les tumeurs sont prélevées, pesées et boyées dans un
tampon
de lyse (Promega) additionné d'antiprotéases (Complete, Boehringer). La
suspension
obtenue est centrifugée afin d'obtenir un surnageant clair. Après avoir incubé
10 ltl de
ce surnageant avec 250 pl de tampon de réaction (Clontech) pendant 1 heure à
l'obscurité, l'activité ~i-galactosidase est mesurée à l'aide d'un luminomètre
du
commerce. Les résultats sont exprimés en RLU (« Relative Light Unit ») totaux
par
tumeur.
On constate que le plasmide pXL2813-Pso- GA,9-NLS exprime le transgène in vivo
à
un niveau supérieur ou égal à celui obtenu avec ie plasmide pXL2813 non-
modifié
(voir figure 13).
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Exemple 5
Cet exemple illustre la caractérisation de la partie peptidique des conjugués
Pso-GA~9-
NLS, c'est-à-dire la vérification des propriétés de ciblage du peptide NLS
associé aux
constructions selon l'invention.
5 La séquence peptidique utilisée, ie signal NLS de l'antigène T de SV40, est
reconnue
par des récepteurs de la famille des karyophérines a. L'équivalent murin,
appelé
importine 60, fusionné à un groupement glutathion S-transferase, a été utilisé
pour
caractériser les conjugués oligonucléotide-peptide. Il a été opéré selon la
méthode
décrite dans la partie "Matériel et Méthodes" sous la section "Interactions
avec les
10 importines".
Les interactions entre des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et
les
oligonucléotides GA,9-NLS ou Pso-GA19-NLS ont été étudiées. Après une
incubation
de 30 minutes à température ambiante, on sépare le culot de billes (contenant
les
éléments interagissant avec les importines) du surnageant
15 Le résultat de cette caractérisation est reporté à la figure 7. Cette
figure indique que
l'oligonucléotide Pso-GA,9-NLS est associé aux billes de glutathion, tandis
que
l'oligonucléotide Pso-GA,9 reste dans le surnageant.
Ceci montre clairement la capacité de l'oligonucléotide Pso-GA,9-NLS à
interagir avec
l'importine a. La partie peptidique des chimères oligonucléotide-peptide est
donc bien
2o reconnue par son récepteur, ce qui signifie que le peptide remplit
effectivement son
rôle de signal de ciblage.
Exemple 6
Cet exemple illustre la possibilité de coupler l'oligonucléotide GA19-SH au
peptide
maléimide-NLS. Contrairement à l'exemple 1, Ia chimère n'est pas modifiée par
un
25 agent alkylant photoactivable.
L'oligonucléotide GA,9-SH, de séquence 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3'
(SEQ m N° 4), avec un groupement thiol à l'extrémité 5', a été couplé
au peptide
maléimide-NLS qui possède un groupement maléimide à son extrémité N-terminale
dans les mêmes conditions que pour l'oligonucléotide Pso-GA,9-SH (voir exemple
1),
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Le couplage est suivi par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en
phase
inverse. Il s'effectue avec une stoechiométrie équimolaire : en deux heures,
le
couplage est total. La chimère est ensuite purifiée par CLHP.
La chimère oligonucléotide-peptide a été analysée par action protéolytique de
la
trypsine comme décrit dans la partie "Matériel et méthodes".
Le résultat est représenté sur la Figure 8. Il est comparable à celui obtenu
avec
l'oligonucléotide Pso-GAt9-SH.
Exemple 7
Cet exemple illustre la possibilité de former des triples hélices entre le
plasmide
l0 pXL2813 et la chimère GA,9-NLS en l'absence d'agent alkylant.
Une cinétique de formation de triples hélices entre le plasmide pXL,2813 et la
chimère
GA,9-NLS obtenue comme décrit dans l'exemple 5, a été menée et étudiée selon
la
technique décrite dans la partie"Matériel et Méthodes", sous la section
"Formation des
triples hélices avec la chimère".
La figure 9 représente la cinétique de formation des triples hélices.
Il apparaît que dans les conditions de concentrations en plasmide de 40 nM et
en
oligonucléotide de 20 nM, on forme une triple hélice stable.
Exemple 8
Cet exemple illustre ia caractérisation de la partie peptidique de la chimère
GAl9-NLS.
2o La séquence peptidique utilisée, le signal IVLS de l'antigène T de SV40,
est reconnue
par des récepteurs de la famille des karyophérines a, comme cela a déjà été
mentionné
à i'exemple 4. L'équivalent murin, appelé importine 60, fusionné à un
groupement
glutathion S-transferase, a été utilisé pour caractériser les conjugués
oligonucléotide
peptide. Il a été opéré comme décrit dans "Matériel et Méthodes" sous la
section
"Interactions avec les importines".
Les interactions entre des billes-glutathion recouvertes d'importines 60 et
les
oligonucléotides GA,9 ou GA,9-NLS ont été étudiées. Après une incubation de 30
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minutes à température ambiante, on sépare le culot de billes (contenant ies
éléments
interagissant avec Ies importines) du surnageant.
Les résultats sont indiqués sur la figure 10. II aparait que l'oligonucléotide
GA~9-NLS
est associé aux billes de glutathion, tandis que l'oligonucléotide GA19 reste
dans le
surnageant.
Ceci montre clairement la capacité de l'oligonucléotide GA~9-NLS à interagir
avec
l'importine a. La partie peptidique des chimères oligonucléotide-peptide est
donc bien
reconnue par son récepteur, et remplie là encore son rôle de signal de
ciblage.
Exemple 9
lo Cet exemple illustre la possibilité de coupler l'oligonucléotide' pim-SH au
peptide
maléimide-NLS.
L'oligonucléotide pim-SH, de séquence 5'-GGGGAGGGGGAGG-3' (SEQ ID
N°15),
avec un groupement thiol à l'extrémité 5', a été couplé au peptide maléimide-
NLS qui
possède un groupement maléimide à son extrémité N-terminale dans les mêmes
conditions que pour l'oligonucléotide GAIS-SH (voir exemple 5).
Le couplage est suivi par chromatographie liquide à haute pression (CLHP) en
phase
inverse. Il s'effectue avec une stoechiométrie équimolaire : en deux heures,
le
couplage est total. La chimère est ensuite purifiée par CLHP.
Exem,- ple 10
2o Cet exemple illustre la possibilité de former des triples hélices entre le
plasmide
pXL2997 et la chimère pim-NLS en l'absence d'agent allrylant.
Une cinétique de formation de triples hélices entre le plasmide pXL2997 et la
chimère
pim-NLS (formation obtenue comme décrit dans l'exemple 8), a été menée et
étudiée
selon la technique décrite dans la partie "Matériel et Méthodes", sous la
section
2s "Formation des triples hélices avec la chimère".
La figure 12 représente la cinétique de formation des triples hélices.
Il apparaît que dans les conditions de concentrations en plasmide de 40 nM et
en
oligonucléotide de 20 rtM, on forme une triple hélice stable.
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L'invention étant à présent complètement décrite, il est évident que de
nombreuses
modifications peuvent être apportées à la présente invention sans pour autant
s'écarter
de l'esprit de l'invention et de la portée des revendications qui suivent.
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1
LISTE DE SÉQUENCES
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
( i. ) DÉPOSANT:
in) NOM: RHONE POULENC ROBER
(D) RUE: 20 AVENUE RAYMOND ARON
(C) VILLE: ANTONY CEDEX
( E) PAYS : FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TÉLÉPHONE: Oï.55.71.73.26
(H) TÉLÉCOPIE: 01.55.71.72.91
(ü ) TITRE DE L'INVENTION: VECTEURS DE TRANSFERT D'ACIDES NUCLÉIQUES,
COMPOSITIONS LES CONTENANT, ET LEURS UTILISATIOlJS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES:15
(iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible '
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Pater.tIn Release I(1.0, Version N1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR IA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 25 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOhIBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGUR.~TION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(ai) DESCRIPTIOl4 DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 1:
GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:
CTTCTTCTTC TTCTTCTTCTT 21
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26)
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2
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(CI NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 3:
AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: A:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 4:
AAGGAGAGGA GGGAGGGAA . 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 5:
TTGGTGTGGT GGGTGGGTT lg
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERTSTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGIE 26)
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WO 99!49067 PCT/FR99/00643
3
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 6:
CTTCCCGAAG GGAGAAAGG 19
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 21 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 7:
GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 21
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 8:
GAAAAAGGAA GAG 13
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 9:
AAGAAAAAAA AGHA 14
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26)
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WO 99/49067 PCT/FR99/00643
4
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 10:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 17 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 10:
AAAAAAGGGA ATAAGGG 17
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11:
(1) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 7 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 11:
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 19 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 12:
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Leu Asp Lys
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 13:
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGLÉ 26)
CA 02323831 2000-09-18
WO 99/49067 PCT/FR99/00643
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 38 acides aminés
(B1 TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 13:
Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly
1 5 10 15
Azg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro
20 25 30
Arg Asn Gln Gly Gly Tyr
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 14:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 7 acides aminés
fB) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 14:
Pro Lys Asn Lys Arg Lys Val
1 5
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 15:
fi) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 13 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID N0: 15:
GGGGAGGGGG AGG 13
FEUILLE DE REMPLACEMENT (RÉGIE 26)
