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PROCEDE DE PRODUCTION ET D'EXTRACTION DE COMPOSES
AROMATIQUES.
La présente invention a pour objet des moyens de valorisation de
s résidus de distillation de produits de fermentation et en particulier un
procédé
pour la production de composés d'intérêt économique à partir de ces résidus de
distillation de produits de fermentation. Ce procédé de production comprend
également des étapes adaptées â l'extraction de ces composés.
L'invention concerne en particulier la valorisation des résidus de
to distillation de produits de fermentation issus de l'industrie agro-
alimentaire.
Dans le cadre de l'invention, ces résidus ou sous-produits sont utilisés
comme substrats pour la culture de microorganismes capables de se
développer et de produire des molécules d'intérêt économique ; ces composés
sont en particulier des molécules à haute valeur ajoutée telles que des
arômes,
is des colorants, des enzymes, des acides aminés, des lipides, des glucides,
des
produits biologiquement actifs dans le domaine thérapeutique, agro-alimentaire
ou pour l'agriculture, etc.
Le brevet FR 2 705 971 décrit un procédé de production de R-y-
décalactone comprenant la culture de microorganismes du genre Sporidlobolus
20 ou Fusurium dans un milieu de culture contenant un précurseur de la R-y-
décalactone choisi parmi l'acide ricinoiéique, l'acide lesquérolique ou les
sels
ou les esters avec des alcools en C1 à C3 de ces acides. L'extraction de la R-
y-
décalactone produite est réalisée durant la culture, avec un solvant
d'extraction
non miscible avec l'eau.
2s Les inventeurs ont, dans le cadre de cette invention, observé que des
produits résiduels de la distillation du vin, et en particulier du vin de
Cognac
(ces produits résiduels étant désignés dans ce cas spécifique par l'expression
"vinasse"), sont susceptibles de constituer des substrats appropriés pour la
culture de microorganismes, dans le but de produire des molécules d'intérêt
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économique.
La présente demande de brevet a donc pour objet un procédé de
préparation de composés d'intérêt économique à partir de substrats constitués
par ou comprenant des résidus de distillation de produits de fermentation et
s l'utilisation de microorganismes pour la mise en oeuvre ce de procédé.
La présente demande a égaiement pour objet un procédé d'extraction
des composés produits, ledit procédé étant avantageusement associé au
procédé de production. Ainsi, les étapes d'extraction proposées selon
l'invention peuvent suivre la ou les phases de production des composés ou être
zo intégrées à cette phase. Le cas échéant, ies conditions choisies pour
l'extraction sont déterminées en fonction de leur influence sur la production
des
composés, par exemple sur le rendement de production.
Ainsi l'invention concerne un procédé de préparation de composés
d'intérêt économique (appelés "composés"), comprenant les étapes de
is a) culture dans des conditions de fermentation aérobie, d'au moins un
microorganisme choisi pour sa capacité à synthétiser lesdits composés, en
présence d'un substrat comprenant un résidu issu de la distillation de
produits
de fermentation,
b) récupération des composés produits.
2o L'invention a pour objet en particulier, un procédé pour la production de
composés volatils odorants (ou arômes).
De façon avantageuse, l'invention fournit un procédé qui permet la
formation d'arômes naturels.
Pour l'étape de culture, la fermentation peut être réalisée en milieu
2s aérobie, anaérobie ou mixte. Le substrat mis en oeuvre pour la réalisation
du
procédé comprend par exemple un résidu issu de la distillation de produits de
fermentation d'organes végétaux (racines, tubercules...) ou plus généralement
de parties de plantes.
Selon un premier mode de réalisation du procédé, le substrat mis en
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oeuvre comprend un résidu de la distillation du vin et, à titre d'exemple, un
résidu de la distillation du vin de Cognac ou d'Armagnac. Ce résidu est appelé
"vinasse".
Les vinasses sont le sous-produit liquide obtenu en sortie d'alambic
s après distillation du vin. L'élaboration du Cognac est réalisée sur lies et
génère
de gros volumes de vinasse : environ deux tiers du volume de vin distillé. Les
vinasses ne contiennent plus d'alcool, et quasiment plus de composés
aromatiques, ceux-ci étant passés dans le distillat. Elles contiennent
cependant
un certain nombre de substances, et notamment des quantités non
io négligeables d'acides organiques (7,55 à 10,05 g/l).
La composition moyenne des vinasses de distillerie de Cognac est la suivante
pH 3,5
Matires solubles. 1 g/l
Matires dissoutes 30 g/I
Cendres 3 gll
DCO 30 g/l
DB05 20 g/l
Azote total 0,5 g/l
P205 0,6-0,5 g/l
K20 2-3 g/l
CI 0,03 g/l
Acide tartrique 5-6 g/l
Acide succinique 0,5-1 g/l
Acide lactique 2-3 g/I
Acide citrique et malique0,05 g/l
Total 7,55-10,05 g/l
Glycrol, pour vinasse environ 7g/I
normale
La DCO est la Demande
Chimique en Oxygne,
c'est--dire la quantit
is d'oxygène nécessaire pour oxyder les matières organiques contenues dans les
effluents.
La DB05 est la Demande Biologique en Oxygène nécessaire, pendant 5 jours,
aux microorganismes contenus dans l'eau pour oxyder une partie des matières
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carbonées.
L'acide tartrique des vinasses de distillerie de Cognac est sous forme de
bitartrate de potassium (KHC4Ha06).
Alternativement, selon un autre mode de réalisation de l'invention, le
s substrat est choisi parmi les résidus de distillation de produits de
fermentation
de fruits, de betteraves, de canne à sucre, de céréales, notamment de malt,
d'orge, de blé, de maïs ou de riz.
A titre d'exemple, les résidus de distillation de produits de fermentation
du jus de pomme sont les résidus de distillation du calvados, les résidus de
io distillation de produits de fermentation de la canne à sucre sont les
résidus de
distillation du rhum, etc.
Les substrats ainsi définis, pris isolément ou en mélange, peuvent être
utilisés pour produire différents composés tels que des composés odorants
volatils (ou arômes). Peuvent être produits simultanément à ces arômes
~s obtenus selon l'invention, d'autres composés comme des protéines, des
acides
aminés, des lipides, des glucides, des nucléosides, des alcools ou des dérivés
de ces composés. Les substrats décrits peuvent ainsi, en fonction du
microorganisme choisi pour la mise en oeuvre du procédé, permettre de façon
générale la production de composés biologiquement actifs.
2o Les substrats définis dans le cadre de l'invention peuvent être adaptés
pour la culture de microorganismes variés et en particulier de bactéries, de
levures, ou de champignons.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé défini
est caractérisé en ce que l'étape de culture met en oeuvre au moins une levure
2s du genre Sr~oroboloy~rces odorus capable de produire des arômes, dans des
conditions de culture permettant la croissance de ladite souche S. odoru~ et
la
production d'arômes à partir d'un substrat comprenant de la vinasse.
Sr~orobolom~rces odorus est une souche de levure connue pour sa
capacité à produire des arômes tels que la lactone, en particulier la y-
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s
décalactone.
L'invention a donc pour objet un procédé pour la préparation d'arômes
comprenant les étapes de '
a) culture dans des conditions de fermentation aérobie de
s Shorobolom~rces odorus en présence d'un substrat comprenant de la vinasse,
le pH du milieu étant compris entre 4 et 7, de préférence égal à environ 6, la
température de la réaction étant compatible avec la croissance de ;~_o~~orus,
b) récupération des arômes produits.
Le procédé ainsi défini est avantageusement réalisé sous agitation entre
l0 50 et 1000 rpm, de préférence entre 100 et 700 rpm et avec une aération de
0,10 à 10 vvm, de préférence de 0,10 à 5 vvm.
La température de l'étape de culture peut varier selon la(les) souches de
microorganismes utilisées. Pour Soorobolo~,~rces odorus, la culture est
effectuée à une température comprise entre 10 et 50°C, de préférence
entre 20
is et 40°C, avantageusement voisine de 24°C ; cette température
est régulée
pour être maintenue essentiellement constante.
La récupération des arômes produits peut être réalisée en continu par
extraction solide-liquide.
Les produits obtenus, parmi lesquels des arômes, peuvent être isolés et
2o purifiés par extraction par un solvant, par distillation, par extraction
solide-
liquide, par extraction gaz-liquide couplée à une cryocondensation, par
fluides
supercritiques, par des procédés membrannaires, en particulier la perstraction
et la pervaporation ou par séparation chromatographique, en particulier HPLC,
ainsi que par des combinaisons de ces techniques séparatives.
2s Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape de
récupération des composés produits comprend une étape par laquelle le milieu
constitué par la culture ci-dessus définie réalisée en phase aqueuse, est mis
en
contact avec un milieu en phase lipidique, pendant un temps suffisant pour
permettre l'absorption dans la phase lipidique, de tout ou partie des composés
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produits, le milieu en phase lipidique étant solide à température ambiante.
L'invention propose à cet égard l'utilisation de milieux lipidiques
comprenant ou constitués par des graisses végétales ou des mélanges de
graisses végétales. A titre d'exemples, on citera l'huile de noix de coco
s hydrogénée (HNCH) (Végétaline de Lesieur), le TTT (Fluka Chemie AG)
constitué par un mélange de tripalmitine (40%) tristéarine (40%) et trioléine
(20%). De façon générale, une graisse végétale adaptée pour la réalisation de
l'invention a la propriété d'être inodore, faiblement oxydable notamment pour
éviter la formation de l'odeur de "rance" et insoluble à basse température
io (inférieure à 0°C notamment à -20°C) dans l'éthanol.
L'invention a mis en évidence qu'un système d'extraction approprié, est
avantageusement fondé sur un équilibre de phases entre phase aqueuse et
phase lipidique, afin d'améliorer à la fois la viabilité des microorganismes
et la
production de composés, en particulier d'arômes.
is Les arômes produits se trouvent essentiellement dissous dans le milieu
de culture qui est une phase aqueuse. Leurs coefficients de partage étant plus
favorables pour une phase lipidique, la séparation des , arômes du milieu de
fermentation peut être réalisée par extraction solide-liquide utilisant une
huile
solide à température ambiante (ou graisse végétale). Les arômes produits sont
2o ainsi récupérés et concentrés dans l'huile solide dans laquelle ils sont
absorbés. II est aussi possible d'obtenir les arômes dans un alcoolat, c'est à
dire, en solution dans de l'éthanol. Pour ce faire, l'huile solide contenant
les
composés odorants est solubilisée dans de l'éthanol. Le mélange est ensuite
refroidi avantageusement entre -5 et -20°C par exemple dans de la glace
2s fondante, pour séparer l'huile solide de l'alcoolat qui contient les arômes
en
solution. Ce dernier peut étre ensuite distillé pour purifier les composés
odorants.
La graisse végétale peut être constituée par un mélange de graisses
végétales.
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Le substrat utilisé peut être le cas échéant enrichi pour favoriser la
croissance des souches de microorganismes et/ou pour favoriser la production
des composés recherchés. Par exemple, on aura recours à un enrichissement
en composés glucidiques et notamment en glucose. L'enrichissement pourra
s alternativement ou de façon complémentaire prendre en compte tous
composés participant à la formation d'arômes, tels que des composés
organiques ou minéraux, notamment des métaux; par exemple le zinc, le
magnésium ou le manganèse.
Le procédé peut également comprendre la mise en oeuvre, lors de
io l'étape de culture, d'un précurseur susceptible de favoriser la production
des
composés recherchés, en particulier d'un précurseur utilisé pour la
bioconversion, par le(les) microorganisme(s) utilisé(s).
Ainsi, selon le mode de réalisation particulier de l'invention, le procédé
est caractérisé en ce que l'étape de culture de S~robolomyces odorus est
is réalisée en présence de substrats choisis et d'acide ricinoléique ou de
dérivés
d'acide ricinoléique, par exemple d'un ester, assimilables par le(les)
microorganisme(s).
De façon particulièrement intéressante, lorsque le substrat est la
vinasse, le microorganisme choisi est . r s et le précurseur est un ester
2o d'acide ricinoléique tel que le ricinoléate de méthyle.
Les inventeurs ont observé que la mise en oeuvre du procédé conduit à
un niveau de production des composés recherchés particulièrement élevé,
lorsque l'incorporation du précurseur et en particulier du ricinoléate de
méthyle
dans le milieu de culture est réalisée sous forme fractionnée tout au long de
2s l'étape de culture.
Ce fractionnement permet d'augmenter la production de composés
recherchés présents dans la phase aqueuse.
Le cas échéant, ce fractionnement peut tenir compte d'étapes
d'extraction des composés produits intercalées avec les apports en
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précurseurs.
Par ailleurs, les inventeurs ont constaté qu'un apport de précurseur et en
particulier en ricinoléate de méthyle, dans le cadre de la réalisation du
procédé,
est avantageusement effectué précocément lors de l'étape de culture et de
s préférence dès la mise en culture, cet apport étant avantageusement
reconduit
en quantités, égales ou différentes, à différents moments ultérieurement au
cours de l'étape de culture.
Par exemple, l'apport en précurseur et en particulier en ricinoléate de
méthyle peut être fractionné en quatre apports, lorsque la durée de la culture
to est par exemple voisine de 3 jours.
Le procédé de l'invention est caractérisé dans un mode de réalisation
particulier, en ce que fa quantité de ricinoléate de méthyle introduite au
cours
de chaque apport est comprise entre 0,008 % (v/v) et 5 % (v/v), de préférence
comprise entre 0,008 % (v/v) et 0,2 % (v/v), avantageusement entre 0,03 % et
is 0,10 % (v/v), de préférence voisine de 0,03 % (vlv) ou avantageusement
voisine de 0,18% (VN) quand l'extraction est réalisée avec des graisses
végétales.
La quantité de ricinoléate de méthyle introduite dans la culture peut étre
aménagée en fonction du résultat recherché.
2o Avantageusement, la quantité de ricinoléate de méthyle introduite au
cours de chaque apport est voisine de 0,07 % (v/v) jusqu'à l'obtention d'une
quantité totale ajoutée comprise entre 0,1 % (v/v) et 5 % (v/v),
avantageusement entre 0,03 et 0,7 % {vlv) ou 0,1 % (VN) et 0,7 (VN) en fin de
culture.
2s En particulier, quand l'extraction est réalisée au moyen de graisses
végétales, cette quantité est voisine de 5 % (VN) en fin de culture.
Pour la culture avec Snorobolomyces odorus, on optimisera les
différents paramètres pour la réalisation du procédé en fonction de ia
quantité
de composés que l'on cherche à produire et lorsque ces composés sont des
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arômes tels que la y-décalactone ; ces paramètres peuvent être choisis de
façon à produire entre 50 mg/I et 1 g/I, par exemple entre 50 mgll et 700
mg/l,
notamment entre 50 mg/I et 150 mgll de y-décalactone en phase aqueuse.
De façon générale, la quantité totale et la quantité de chaque fraction de
s précurseur ajouté est déterminée en fonction de son influence sur la
réaction
de bioconversion, de la toxicité éventuelle des composés produits sur le
développement des souches de micro-organismes et en fonction de la durée
de l'étape de culture.
Le procédé de l'invention est ainsi caractérisé en ce que l'étape de
io culture peut être réalisée pendant une durée variable et en particulier
peut ëtre
conduite pendant une durée comprise entre quelques heures et plusieurs jours,
par exemple jusqu'à 10 jours, notamment une durée minimum de 24 h, en
particulier une durée comprise entre 24 et 72 heures.
Avantageusement, pour optimiser les paramètres de la réalisation du
is procédé, on utilise une densité cellulaire (DO à 620 nm) initiale des
microorganismes apportés pour la réalisation de l'étape de culture est
comprise
entre 0,1 et 20, de préférence entre 0,2 et 15 avantageusement entre 1 et 15.
Avantageusement, la densité optique initiale des microorganismes
apportés pour la réalisation de l'étape de culture est comprise entre 5 et 15
ou
2o entre 5 et 10.
D'autres composés peuvent encore être ajoutés au milieu de culture et
en particulier on utilisera avantageusement des tensioactifs tels que le Tween
20~ ou des antimoussants.
Les inventeurs ont observé que la production d'arômes et notamment de
2s y-décalactone est améliorée par l'apport de ces agents tensioactifs ou
antimoussants et que la densité cellulaire initiale (biomasse initiale)
influence
cette amélioration et que la disponibilité du précurseur dans la phase aqueuse
fait varier le niveau de production de la y-décalactone.
Les microorganismes susceptibles d'être cultivés en présence des
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substrats de l'invention peuvent être variés et peuvent notamment être choisis
parmi les souches suivantes, le cas échéant après recombinaison, capables de
donner lieu à la production des composés identifiés ci-après
Souches Produits
s Sporobolomyces odorus arômes, calorants, biomasse
Yarrowia lipolytica arômes, biomasse, polyols
Saccharomyces cerevisiae biomasse, ergostérol (-> vitamine D)
Lenzites betulina arômes
Penicillium sp. analgésiques, arômes
lo Fusarium sp. antihypertenseurs
Fusarium moniliforme substance de croissance végétale,
arômes
Cylindrocarpon radicicola stéroïdes, arômes
Lactococcus lattis arômes
ls Aspergillus enzymes, arômes
Bacillus enzymes, arômes
Claviceps purpurea alcaloïdes, arômes
Streptomyces dimorphogenes inhibiteurs d'enzymes, arômes
2o Une souche Yarrowia lipolytica telle que celle qui figure au catalogue
ATCC sous la référence 8661 est utilisée à titre d'exemple.
De façon avantageuse, pour la réalisation de !'invention, le substrat
utilisé pour la culture des microorganismes est stérilisé par tout moyen
approprié et par exemple en autoclave, préalablement à la mise en culture.
2s t-e cas échéant, le substrat peut être utilisé sans stérilisation
préalable.
Par ailleurs, l'étape de récupération des produits formés peut être
conduite de toute manière appropriée et en particulier les produits obtenus
peuvent être isolés et purifiés par extraction par un solvant, par
distillation, par
extraction solide-liquide, par extraction gaz-liquide couplée à une
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cryocondensation, par fluides supercritiques, par des procédés membranaires,
en particulier la perstraction et la pervaporation ou par séparation
chromatographique, en particulier HPLC, ainsi que par des combinaisons de
ces techniques séparatives.
s La récupération des composés peut être effectuée à l'issue de l'étape de
culture ou à plusieurs reprises, en interrompant l'étape de culture à des
moments détermïnés par exemple en fonction de la quantité produite de
composés et notamment pour tenir compte de la toxicité des composés
produits à l'égard des microorganismes du milieu de culture. Alternativement,
la
lo récupération peut être effectuée in situ, notamment lorsque ies composés
produits peuvent présenter un certain niveau de toxicité par rapport aux
microorganismes utilisés.
Selon l'un ou l'autre des moments de réalisation de l'extraction, cette
derniëre peut être réalisée dans le même compartiment que celui de la
ls production, par exemple dans la même cuve, ou au contraire ces deux étapes
peuvent être séparées spatialement.
Le cas échéant, l'étape d'extraction réalisée en continu avec la
production des composés, peut influencer le rendement de la réaction. Ainsi,
lorsqu'un précurseur est utilisé, en fonction de son coefficient de partage et
de
2o sa concentration dans la phase lipidique, sa disponibilité dans la phase
aqueuse peut étre affectée, diminuant par conséquent son utilisation par
le(les)
microorganisme(s).
L'extraction peut également favoriser la production des composés
puisque l'extraction réalisée en continu ou de façon déterminée en alternance
2s avec la production, diminue l'activité toxique éventuelle des composés
produits
vis à vis du (des) microorganisme(s) du milieu de culture.
Les variantes proposées, de l'étape de récupération des composés
produits sont applicables a priori quelles que soient les conditions de
réalisation
de l'étape de culture nécessaire à la production des composés, en particulier
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quels que soient les microorganismes, substrats et/ou précurseurs mis en
oeuvre.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'extraction des
composés produits par absorption dans la graisse végétale, est suivie d'une
s séparation des composés, notamment des arômes produits au moyen d'un
alcool. Avantageusement, un tel procédé comprend les étapes de
1 ) solubilisation du milieu lipidique solide dans l'éthanol 96° à
raison de
1 V/1 OV,
2) barattage de la solution éthanolique à -20°C pendant une heure,
l0 3) séparation de l'alcool contenant les arômes du milieu lipidique
cristallisé, par exemple par filtration.
L'invention a aussi pour objet le procédé d'extraction d'arômes, mis en
oeuvre indépendamment de l'étape de production des arômes. Ce procédé
d'extraction comprend la mise en contact du milieu en phase aqueuse
ls contenant les arômes, avec un milieu en phase lipidique, pendant un temps
suffisant pour permettre l'absorption de tout ou partie des arômes dans la
phase lipidique, ce procédé étant caractérisé en ce que le milieu en phase
lipidique est un milieu solide à température ambiante.
Les conditions de réalisation de ce procédé générales et spécifiques,
2o décrites dans les pages précédentes sont applicables dans ie cadre de sa
mise
en oeuvre indépendamment des conditions de production des arômes.
Les caractéristiques de l'invention sont également illustrées dans les
exemples et les figures qui suivent
2s Légende des fiaures
Figure 1A. Relation entre la biomasse (exprimée en gll de matière sèche) et la
densité cellulaire (DO à 620 nm).
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Figure 1 B. Relation entre la biomasse (exprimée en g/I de matière sèche) et
le
volume de mycélium.
Figure 2A. Etat de cultures de S. odorus âgées de 77 heures sur différents
s milieux à base de vinasse.
Figure 2B. Cinétique de croissance et de développement de S. odorus sur
MT2-malt.
lo Figure 2C. Cinétique de croissance et de développement de S. odorus sur
MV2-malt.
Figure 3. Evolution de la production de biomasse dans les conditions standards
et sur vinasse non complémentée.
ls
Figure 4. Evolution de la production de lactone dans les conditions standards
et
sur vinasse non cornplérnentée.
Figure 5. Influence d'un ajout de 1,66 % d'huile de ricin sur l'évolution de
la
2o production de biomasse.
Figure 6. Influence d'un ajout de 1,66 % d'huile de ricin sur la production de
lactone.
2s Figure 7. Evolution de la production de biomasse en fonction de la nature
du
composé lipidique ajouté.
Figure 8. Évolution de la production de lactone en fonction de la nature du
composé lipidique ajouté.
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Figure 9. Cinétiques de croissance et de production de r-décalactone chez
S. odorus après additions fractionnées de ricinoléate de méthyle. Le
précurseur
est ajouté à t = 0, 24, 48 et 72 h à raison de 0,06 % (v/v).
s La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.
Figure 10. Croissance, production de y-décalactone et rendement de
bioconversion par S. odorus cultivé après additions fractionnées de
ricinoléate
de méthyle.
lo Le précurseur est ajouté à t = 0, 24, 48 et 72 h à raison de 0,008 % (v/v).
La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.
Figure 11. Croissance de Sporobolomyces odorus en fonction de la quantité de
Y-décalactone présente initialement dans le milieu.
ls
Figure 12. Impact d'un apport simultané de Tween 20 et de RM sur la
croissance de S. odorus.
La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.
2o Figure 13. Impact d'un apport simultané de Tween 20 et de RM sur la
production de y-décalactone.
La flèche indique le moment où le précurseur a été ajouté.
Figure 14.
2s Influence de la quantité de RM apportée sur la cinétique de croissance de ~
odorus en présence de HNCH (5g/flacon).
~ apport de 4x 0,003% de RM
~ apport de 4x0,06% de RM
O apport de 4x0,12% de RM
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ls
x apport de 4x0,18% de RM
~. indique le moment où les ajouts de RM ont été réalisés.
s Figure 15.
influence d'apports supplémentaires de RM, de Tween 20~ et de Struktol~ sur
les cinétiques de biomasse et de production de y-décalactone des cellules de
S. ode ensemencées à une densité initiale de 4 en présence de HNCH
(5g/flacon)
lo
~6 apports de RM: Biomasse
O 4 apports de RM: Biomasse
~6 apports de RM - [g-décalactone]
x 4 apports de RM : [g-décalactone].
ls
~. indique ie moment où les ajouts de RM ont été réalisés.
Figure 16.
Cinétiques de biomasse et de production de y-décalactone lors de la culture de
2o S. odorus ensemencée à une densité initiale de 4 en présence de TïT (5
g/flacon).
o Biomasse
~ [y-décalactone]
zs ~. indique le moment où les ajouts de RM ont été réalisés.
A. Matériel et Méthodes
I. LAS SOUCHES
1.1 LA SOUCHE DE SPOROBOLOMYCES ODORUS
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La souche de Sl~or~bolo~r ~,yces odorus utilisée est la souche déposée
sous la référence CBS 2fi36.
1.2 LA SOUCHE DE LENZITES BETULINA
La souche utilisée est la souche déposée sous la référence MIC 38.
s
II LE;~J~MILIEUX DE CULTURE ET DE SONSERVATION ~F~, DI~FERENTS
lja,ICROORGANISMES
11.1 SPOROBOLOMYCES ODORUS
11.1.1- COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE DES
lo SPOROBOLOMYCES ODORUS
Deux milieux de culture ont été testés, afin de déterminer lequel permet
la meilleure production de y-décalactone. Ces milieux peuvent être utilisés
comme milieux témoins pour le test des substrats.
Le premier de ces milieux a la composition suivante (JOURDAIN, 1985)
ls - 30 gll de glucose
- 3,5 gll de peptone
- 1 g/I d'extrait de malt
- 2g/I de KH2P04
- 0,13g/l de CaCl2, 2H20
20 - 0,01 g/l de FeS04, 7H20
- 3 g/l de MgS04, 7H20
- H2O (milieu MT1 ) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5
minutes à 1 000 g {milieu MV1 ) qsp 1 I.
Le second milieu utilisé (FERON, 1996) est formulé comme suit
2s - 1 g/l de glucose
- 0,5 g/l de bacto tryptone
- 1 g/l d'extrait de levure
- 1 g/l d'extrait de malt
- 2 g/l de casamino acides
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- 2 g/I de KH2P04
- 0,13 g/l de CaCl2, 2H20
- 0,01 g/l de.FeS04, 7H20
- 3 g/l de MgS04, 7H20
s - H20 (milieu MT2) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5
minutes à 1 000 g (milieu MV2) qsp 1 I.
Dans les deux cas, le pH a été ajusté à 6 à l'aide de soude 5 N, puis le
milieu a été réparti à raison de 60 ml dans des erlenmeyers de 250 ml et
autoclavé 20 minutes à 120 °C.
io Au cours des cultures, réalisées en milieu liquide, la température a été
maintenue à 24 °C et l'agitation à 250 rpm (tours par minute).
La souche de Sporobolomyces odorus a été conservée sur boite de pétri
is à 4°C. Dans ce cas, un milieu de type MT2 a été utilisé. 15 g/1
d'agarose ont été
ajoutés (JOURDAIN, 1985). Le milieu ainsi obtenu a été autociavé 20 minutes
à 120 °C.
11.2 LENZITES BETULINA
11.2.1. MILIEU DE CULTURE DF_ I_EN7lTFS RFTIII INA
2o Le milieu de culture utilisé pour ce champignon basidiomycète a la
composition suivante (GALLOIS, 1990)
- 10 g/l de glucose
- 0,5 g/l d'extrait de levure
- 0,2 g/l de KH2P04
2s - 0,032 g/l de CaCl2, 2H20
- H20 (LMT) ou vinasse concentrée trois fois et centrifugée 5 minutes à 1
000 g (LMV) qsp 1 I.
Le pH a été ajusté à 4,8 à l'aide de soude 5 N dans le cas de LMV et de
HCI 1 N dans le cas de LMT.
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Les cultures, réalisées en milieu liquide dans des erlenmeyers de 250 ml
contenant 100 ml de milieu, ont été placées à 24°C sous une agitation
de
180 rpm.
11.2.2 - MILIEU DE CONSERV~]i Il,~j,j2F LENZITES BETULINA
Lenzites betulina a été conservée à 4°C sur des boites de pétri
contenant un milieu préparé de la façon suivante
- dissoudre 39 g/l de potato-dextrose agar, dans de l'eau
- autoclaver la solution obtenue 20 minutes à 120 °C
lo - laisser refroidir jusqu'à 45-50°C
- ajouter 14 ml/l d'acide tartrique à 10%
- répartir ie mélange dans des boîtes de pétri.
1s 111.1 - CAS DE SPOIROBOLOMYCES ODORUS
L'évolution de la quantité de biomasse produite au cours des cultures de
cette levure a été suivie en mesurant ia densité optique (DO) de la suspension
cellulaire à 620 nm. Au spectrophotométre, le 0 était réalisé avec un
échantillon
de milieu vierge.
2o Alternativement, des mesures de matière sèche (MS) produite ont été
réalisées. Pour cela, 30 ml d'une suspension cellulaire ont été prélevés et on
a
mesuré la DO. Après centrifugation 5 minutes à 2 000 g de cette suspension et
élimination du surnageant, le culot a été placé dans une étuve à 37°C
pendant
48 heures, puis pesé.
2s La matière sèche correspondant à différentes valeurs de DO a été pesée
afin de tracer la courbe MS=f(DO) représentée à la figure 1A. Celle-ci permet
de déterminer la quantité de biomasse correspondant à une DO donnée.
Dans le cas de ces champignons, les mycélia forment des "pelets"
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(pelotes) lorsqu'ils sont cultivés en milieu liquide agité. La biomasse
produite a
été évaluée en mesurant le poids de matière sèche (MS). Pour cela, un
échantillon de culture ayant un volume donné a été centrifugé 5 minutes à
2000 g dans un tube gradué. A l'issue de cette centrifugation, le surnageant a
s été éliminé puis le volume (V) de mycélium obtenu mesuré. Ce culot a été
placé à l'étuve à 37°C pendant 48 heures et pesé.
Ces mesures ont permis de tracer la courbe MS=f(V) (figure 1 B). Ainsi,
on a pu déduire directement du volume de mycélia obtenu la quantité de
biomasse sèche correspondante.
lo
IV - ~~OSAGE DES ELEMENTS CONTENUS DANS ~ ES MILIEUX DE
lV.1j EXTRACTION LIQUIDE-LIQUIDE DES COMPOSES j~OLATILS
ER SENIS DANS LA PHASE A UEUSE,
ls Avant d'étre dosés, les composés volatils odorants doivent être extraits
du milieu. Pour cela, la méthode d'extraction liquide-liquide par un solvant
organique a été utilisée avec le pentane (C5H~2). Cette technique repose sur
la
non miscibilité du solvant avec le milieu de culture qui est aqueux, et sur
l'affinité supérieure qu'ont pour lui les molécules aromatiques. Ainsi, les
2o composés volatils libres passent de ia phase aqueuse à la phase organique.
Afin de doser ies composés volatils extraits, la technique dite du
standard interne a été utilisée. Cette méthode est fondée sur l'utilisation de
pentane contenant un composé aromatique pour réaliser l'extraction. Le
composé choisi doit présenter les caractéristiques suivantes
2s - être ajouté à une concentration connue,
- ne pas être présent dans le milieu dont on veut extraire les composés
volatils produits par les microorganismes,
- avoir un comportement chromatographique (temps de rétention, aire de
pic...) proche du ou des composés à extraire.
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Dans le cas des dosages de la lactone produite par Sporobolomyces
odorus, le standard interne utilisé était le géraniol, à une concentration de
30
mg/l.
Le protocole suivi était le suivant
s - centrifuger le milieu 5 minutes à 2 000 g afin d'en éliminer les cellules
en suspension ou les "pelets"
- remplir une fiole de 25 ml avec le surnageant obtenu précédemment
- ajouter 1 ml de pentane contenant le standard interne,
- agiter 1 minute afin de mettre les deux phases en contact et de
io permettre l'extraction des composés volatils de la phase aqueuse,
- laisser les phases se séparer en les laissant environ 30 minutes dans
de la glace,
- prélever la phase organique et la mettre dans un tube Eppendorf. Afin
de destabiliser totalement l'émulsion, il peut s'avérer nécessaire d'ajouter
une
is goutte d'éthanol absolu au mélange.
IV.2. - S~NCENTRATION DES ECHANTILLONS
Les premiers dosages des extraits organiques ont montré que les
quantités de composés volatils présentes étaient insuffisantes pour permettre
2o des mesures fiables.
Afin de remédier à ce problème, les échantillons ont été concentrés
environ 5 fois. Pour cela, un flux d'air sec à très faible débit a été
utilisé. A son
contact, le solvant, très volatil, s'est évaporé alors que les molécules
odorantes
se concentraient dans le volume restant. On considère que les composés
2s produits par les microorganismes ne s'évaporent pas, ou bien qu'ils
s'évaporent
dans les mêmes proportions que le standard interne.
1V 3 - DOSAGE DES COMPOSES CONTENUS DANS LA PHASE AQUEUSI=
PAR ÇHRC?MATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSF,~CPGj
~ Matériel
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Le chromatographe suivant a été utilisé : HEWLETT PACKARD HP 5890
Séries II, muni d'une colonne capillaire en silice fondue imprégnée de
Carbowax 20M (polyéthylène glycol polymérisé) de 25 m de longueur et 0,25
mm de diamètre.
s Les chromatographies ont été réalisées dans les conditions décrites ci-
dessous
- gaz vecteur : azote avec un débit de 75 ml/min
- gaz de combustion : mélange air/hydrogène
- température - de l'injecteur : 200°C
lo - du détecteur : 250°C
- du four -> initiale : 40°C
-> augmentation : 4°C/min
-> finale : 200°C
Le chromatographe est relié à un intégrateur de type HELWETT
ls PACKARD HP 3394A, utilisé dans les conditions suivantes
- atténuation (ATT2A):0
- vitesse du papier (CHT SP): 0,5 cmlmin
- sensibilité (PK WD): 0,04
- discrimination (THRSH): 0
20 ~ Principe de la quantification des composés à l'aide du standard interne
La quantification des composés produits a été établie de la façon
suivante : une CPG à partir d'une solution contenant 30 VIII de standard
interne
et 30 NI/I du composé à doser a été réalisée : la lactone dans le cas des
cultures de Sporobolomyces odorus. Ceci a permis de calculer le rapport
2s existant entre les aires de pic des deux molécules sachant qu'elles sont
présentes à la même concentration. Ainsi on obtient
Concentration~mposé x = (aire~mposé X / a~rG'S~ndard inteme)* coefficient de
réponse
où le coefficient de réponse (CR) a la valeur suivante
CR= 30N1/I*(aires~ndard interne à 30NIn/a~recomposé x ~ ao uin)
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Pour déterminer si la vinasse n'exerce pas une inhibition sur le
développement ou le potentiel de bioproduction de la levure, on a fait croître
S.odorus sur un milieu ayant la même composition que celui utilisé comme
témoin (MT) mais en remplaçant l'eau, qui servait de solvant aux différents
io constituants, par de la vinasse concentrée trois fois et préalablement
centrifugée afin d'éliminer les impuretés en suspension qu'elle contient.
Après
72 heures de culture, ta DO est de 12 {tableau 1 ), c'est-à-dire comparable à
celle obtenue sur le milieu MT2. Ces résultats ajoutés au fait que la présence
de y-décalactone a été détectée montrent que les éléments contenus dans la
is vinasse ne perturbent ni la croissance de la levure, ni la production de
lactone.
Tabïeau 11 : Production de biomasse de S.odorus après 72
heures de culture dans différentes conditions
MV1 MV2
milieu MT1 MT2 MV1 MV2
pH=3,2 pH=3,2
DO
7,0 12,6 10,0 12,0 3,2 6,6
620 nm
lactone +++ ~ +++ ~ ++ ~ ++ ~ -+ ~ _+
1. Évaluation de l'effet du pH de la vinasse sur le développement de la
levure
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La vinasse ayant un pH trés acide (environ 3,2) et tamponné, il faut une
assez grande quantité de soude (environ 6 g/l) pour l'amener au pH optimal de
la levure qui est de 6 (FERON, 1996). On a recherché si de telles quantités de
soude ne perturbent pas le développement de la levure et si le pH initial du
s milieu à base de vinasse ne permettrait pas une croissance et une production
satisfaisante. Pour cela une culture sur un milieu identique à celui
précédemment décrit, sans ajustement de pH a été réalisée
Sporobolomyces odorus se développe beaucoup moins bien (la DO était
de 6,6), et surtout que la production de iactone se trouve très affectée
(tableau
io 2). Ceci permet de dire qu'un pH de 3 ne permet ni un développement correct
de la levure, ni le maintien de son potentiel de production de lactone par
rapport aux essais réalisés sur vinasse à pH6.
2. Recherche d'un milieu standard optimal de développement de
is Sporobolomyces odorus
A l'issue de ces premiers résultats, la composition du milieu utilisé a été
optimisée pour déterminer si la vinasse pouvait servir de substrat pour la
production de lactone.. La formulation du milieu a été modifiée en éliminant
certains composés
20 - milieu vinasse sans extrait de malt
- milieu vinasse sans casamino acides
- milieu vinasse sans glucose.
Après 77 heures de culture, les productions de biomasse et de y-
décalactone ont été évaluées (figure 2A). Ces mesures font apparaître que
2s sans extrait de malt, la croissance de S. odorus est améliorée.
En revanche, le fait d'éliminer les casamino acides du milieu ne semble
avoir aucun effet sur le développement de la levure et sur la production de
lactone puisque les résultats obtenus sont comparables à ceux observés sur le
milieu MV2.
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Enfin, le fait de supprimer le glucose semble avoir un impact négatif sur
la production de lactone, puisque celle-ci est considérablement diminuée.
Le milieu sans malt peut donc être choisi comme milieu de référence
(MT2-malt) pour réaliser des cinétiques de croissance, de production,
s d'évolution du pH et de la concentration en glucose et en lactone sur ce
milieu
contenant ou non de la vinasse (figures 2B et 2C).
3. Production de la Y-décalactone sur de la vinasse non complémentée
Après avoir mis en évidence que tous les éléments contenus dans le
io milieu vinasse standard ne sont pas indispensables au développement de la
levure et à sa production de composés volatils, sa capacité à se développer et
à produire sur de la vinasse non complémentée a été testée.
Pour cela des cinétiques de croissance et de production ont été
réalisées sur de la vinasse pure et concentrée trois fois, Les résultats
obtenus
is montrent que S. odorus est capable de se développer et de bioproduire dans
ces conditions, c'est-à-dire sans aucun apport glucidique (figures 3 et 4). Au
bout de 77 heures, les cultures atteignent une DO de 14,3. Cette DO permet
d'affirmer que la levure se développe de manière satisfaisante, même si la DO
reste inférieure à celle obtenue dans les conditions standards qui est de 18.
En
2o ce qui concerne la concentration de lactone, elle atteint respectivement
1,14 mg/I dans les conditions de référence et 1,02 mg/I sur de la vinasse non
complémentée. II semble donc que les éléments contenus dans la vinasse
suffisent à la croissance de S. odorus et au maintien de sa capacité de
production.
2s Ainsi, aucun apport glucidique ne semble nécessaire à la production de
lactone. Ces résultats sont contradictoires avec ceux précédemment présentés,
mais ils seraient explicables par le fait qu'il devait y avoir, dans le milieu
complémenté, des éléments susceptibles de limiter l'utilisation des acides
organiques de la vinasse dans le métabolisme de synthèse des lactones, soit
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en réagissant avec eux, soit en favorisant par leur seule présence d'autres
voies de synthèse.
4. Utilisation du potentiel endogène de Snorobolo~yrces odorus à oxyder
s l'acide ricinoléique, intermédiaire métabolique de la synthèse de la Y-
décalactone
Afin d'améliorer la production de composés aromatiques, nous avons
voulu tester la voie de la bioconversion. Cette stratégie est basée sur la
capacité de Sporobolomyces odorus à utiliser l'acide ricinoléique comme
io précurseur dans le métabolisme de synthèse de la y-décalactone.
4.1. Impact, sur la production de lactone, d'une addition d'huile de ricin à
la vinasse
La principale source d'acide ricinoléique est l'huile de ricin dans laquelle
is il représente environ 90% des acides gras et se trouve majoritairement sous
forme de triglycérides.
Afin d'étudier l'impact de l'ajout d'huile de ricin sur la production de Y-
décalactone, nous avons réalisé les cultures suivantes:
vinasse + 1,66 % (v/v) d'huile de ricin
20 -- vinasse + 5 g/I de glucose + 1,66 % (v/v) d'huile de ricin
-- vinasse + 10 g/I de glucose + 1,66 % (v/v) d'huile de ricin.
Les résultats obtenus montrent que l'apport d'huile de ricin dans le milieu
ne perturbe pas le développement de S. odorus puisque dans tous les cas, la
DO atteinte au bout de 77 heures de culture est proche de 14 (figure 5).
2s En revanche, la production de p-décalactone est considérablement
améliorée : elle passe de 1,02 mg/l à 6,47 mg/I, soit 6 fois plus (figure 6).
D'autre part, la production est légèrement accélérée sur les milieux
complémentés en glucose mais les concentrations obtenues restent inférieures
à celles atteintes sans glucose exogène (figure 6). II semble donc qu'un
apport
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glucidique ne soit pas nécessaire à une bioconversion efficace de l'acide
ricinoléique contenu dans l'huile de ricin.
4.2. Effet d'un apport de ricinoléate de méthyle sur la production de Y-
s décalactone
Une seconde possibilité consiste à utiliser du ricinoléate de méthyle,
c'est-à-dire l'ester de l'acide ricinoléique.
Afin de tester l'effet d'un apport de ricinoléate de méthyle à des cultures
de S. odorus sur vinasse seule, 1 ml de ce précurseur a été ajouté à des
io suspensions cellulaires de 60 ml âgées de 24 heures. Le suivi de celles-ci
a
montré que si la production de biomasse est réduite (11,06 de DO au bout de
77 heures au lieu de 14,3 sur de la vinasse seule, figure 7) celle de y-
décalactone est considérablement améliorée. En effet, au lieu d'une
concentration finale, au bout de 77 heures, de 1,02 mg/l sur vinasse ou de
6,47
is mg/l dans le cas où nous avions ajouté de l'huile de ricin, nous avons
atteint
des concentrations de 28,23 mgll (figure 8). Ce résultat est explicable par le
fait
que l'enzyme lipolytique intervenant dans la dégradation des triglycérides
n'est
pas synthétisée de manière constitutive chez cette levure. Elle deviendrait
donc
rapidement limitante dans l'obtention d'acide ricinoléique libre à partir
d'huile de
2o ricin. L'ajout de ricinoléate de méthyle directement utilisable remédie à
ce
problème et permet d'améliorer les rendements de production de lactose.
5. Influence du facteur temps sur la production de y-décalactone
Ces résultats étant fort intéressants, nous avons cherché à savoir si les
2s concentrations obtenues seraient augmentées en laissant les cellules se
développer pendant 144 heures. II s'est avéré qu'au bout de 120 heures, le
milieu renferme 36,78 mg/l de lactose et 72,24 mg/l au bout de 144 heures.
Autrement dit, en 1,8 fois plus de temps, la production est multipliée par
2,5.
Cette augmentation de la production coïncide avec l'arrêt de la croissance
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cellulaire qui se produit au bout de 72 à 77 heures de culture, et renforce
l'hypothèse d'un découplage entre la production de lactone et celle de
biomasse.
s 6. Influence de la quantité de ricinoléate de méthyle ajoutée
Afin d'optimiser la quantité de ricinoléate de méthyle apportée, nous
avons réalisé des cultures auxquelles nous avons ajouté au bout de 24 heures
soit 0,83 %, soit 1,66 %, soit 10 % (v/v) de ricinoléate de méthyle. Les
résultats
obtenus (tableau 3) montrent que c'est en apportant 0,83 % (v/v) de cet ester
io que l'on obtient la teneur la plus élevée en y-décalactone dans la phase
aqueuse et ce sans que la production de biomasse ne soit affectée.
Tableau 2 : Influence de la quantité de ricinoléate de
méthyle (RM) apporté à des cultures de 60 ml au bout de 24
is heures. les mesures ont été faites après 77 heures de culture.
Quantité de ~ 0 ml ~ 0,5 ml I 1 ml 1 6 ml
RM ajoutée
DO à 620nm 8,74 8,00 7,94 8,98
Lactone I 1,02 I 32,22 I 27,24 18,78
en mg/l
L'exploitation du potentiel de bioconversion du ricinoléate de méthyle en
2o y-décalactone, sur de la vinasse non complémentée, par Sporobolomyces
odorus présente manifestement un intérêt. En effet, grâce à un apport de
1,66 % (v/v) de ce précurseur, des concentrations de l'ordre de 45 mg/l de
composé odorant sont obtenus en 144 h de culture, dont 16,9 mg/I en 77 h, ce
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qui constituait une nette amélioration de la production. Sans addition de
précurseur la levure ne produisait que 0,95 mg/I d'arôme après 77h de culture.
Cette concentration était portée à 5,7 mg/I en présence de 1,66 % (vlv)
d'huile
de ricin exogène.
s De plus, il a été montré que la production de y-décalactone augmentait
avec l'apport de précurseur. En effet, lorsque l'apport de RM était de 0,83 %,
la
concentration de lactone après 77 h de culture était de 15,1 mg/I et de 32,5
mg/l lorsque l'addition de précurseur était de 10,0 %. L'effet inverse était
observé sur le rendement de bioconversion, lequel diminue avec la quantité
io ajoutée de RM. Ceci est dû à un accroissement de la quantité résiduelle de
RM.
6.1 Optimisation de l'apport de ricinoléate de méthyle
6.1.1. Effet d'un apport précoce de précurseur
is Dans les manipulations réalisées précédemment l'apport du précurseur
était effectué après 24 h de culture. Les cellules devaient alors dans un
premier
temps adapter leur métabolisme à la bioconversion du RM.
Afin de déterminer si la présence précoce du précurseur permet
d'améliorer la production en limitant ce temps d'adaptation, un apport initial
de
2o RM a été réalisé.
Tableau 3 : Influence d'un apport précoce et fractionné de RM sur la
croissance
et la production de y-décalactone par S. odorus après 77 heures de culture.
Apport de RM Tmoin 0,06 % t = 0 h +
(% vlv) 0,83 % t = 24 h 0,83 % t
= 24 h
Biomasse 8,0 8,4
(DO 620 nm)
[y-dcalactone] 15,1 47,7
(m9/l)
2s Les résultats obtenus, présentés dans le tableau 3, démontrent qu'un
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ajout de 0,06 % (v/v) de RM au temps 0, suivi d'une deuxième addition 24 h
plus tard de 0,83 % (v/v), a permis d'améliorer de façon significative la
production de lactone par rapport au témoin. La concentration de y-décalactone
est multipliée par 3 après 77 h de culture.
s
6.1.2 Effet d'un apport fractionné de précurseur
A la suite des résultats précédents, l'optimisation du système a été
entreprise en modifiant d'une part les quantités de RM ajoutées et d'autre
part,
les moments auxquels elles sont apportées au milieu de culture.
io Dans les expériences conduites, les additions de précurseur ont été
réalisées aux instants t=0, 24, 48 et 72 h. Les résultats obtenus sont
représentés sur la figure 9. Leur analyse a montré que ce fractionnement ne
modifiait pas la croissance de la levure par rapport à un témoin mais
favorisait
considérablement les quantités de lactone produites. Au bout de 144 h, 142,7
is mg/I ont été obtenus au lieu de 44,7 mg/ I si l'ajout était fait en une
seule fois.
Cette stratégie a permis d'atteindre des concentrations de 285 mg/I d'arôme au
bout de 216 h.
De plus, ce mode d'apport du RM a permis de minimiser les quantités de
précurseur nécessaires, et d'accroître la quantité de y-décalactone présente
2o dans la phase aqueuse.
6.1.3- Recherche des quantités optimales de précurseur à apporter
Dans l'optique de déterminer la concentration de RM qui permet
d'atteïndre une concentration maximale de y-décalactone dans la phase
2s aqueuse, des quantités variables de RM ont été apportées de manière
fractionnée aux temps t = 0, 24, 48 et 72 h. Les résultats obtenus au bout de
96
h de culture sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 44 : Influence de la quantité de RM apportée sur la production de Y-
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décalactone et le rendement de bioconversion par S, odorus. Les résultats
présentés ont été obtenus après 96 h de culture. Les apports de RM ont été
effectués à t = 0, 24, 48 et 72 h.
Quantit de 0,0080,016 0,032 0,060 0,067 0,083 0;170
prcurseur ajoute
(%
vlv)
Total ajout (% 0,0330,066 0,132 0,240 0,268 0,322 0,680
vlv)
[y-dcaiactone] 59,7 102,0 111,0 96,8 84,2 93,5 53,5
(phase
aq.mg/l)
Rendement apparent19,5 17,5 9,1 4,4 3,5 3,1 0,8
de bioconversion
(%
mlm)*
5
* (masse y-décalactone) phase aqueuse
_~_______________________~._____________________~___ x 100
(masse RM) apportée
io
Le tableau 4 montre que
- le rendement apparent de bioconversion diminue parallèlement à la
teneur en ricinoléate de méthyle,
- les quantités de lactone produites augmentent parallèlement à la
is quantité de ricinoléate de méthyle exogène. Au-delà de 0,032 % (v/v), la
teneur
en y-décalactone diminue.
Ces évolutions peuvent étre expliquées par:
- l'extraction de ia lactone du milieu de culture est favorisée par le RM,
composé dans lequel elle est plus soluble que dans le milieu de culture,
20 - le transfert du RM serait limité par une diminution de la surface
d'échange due à sa coalescence qui augmente avec la quantité apportée,
- la quantité de RM résiduelle augmente avec l'apport de RM, ce qui
abaisse le rendement de bioconversion observé,
- un effet toxique du RM qui augmente avec l'apport,
2s - un défaut dans la composition de la vinasse. En effet, il suffirait d'une
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carence en un oligo-élément pour que la synthèse de la lactone soit bloquée.
La validité de ces hypothèses a été vérifiée et fait l'objet des
paragraphes à venir.
s 6.1.4 - Recherche du potentiel réel de bioconversion du RM en Iactone par
S, odorus
Afin de déterminer avec quelle efficacité S. odorus est capable de
bioconvertir le RM en y-décalactone, des cinétiques de croissance et de
production ont été réalisées en apportant des quantités de précurseur
lo limitantes. En effet, dans ces conditions, il n'y a pas de RM résiduel en
fin de
culture, comme le montrent les analyses chromatographiques, ce qui permet de
déterminer le rendement de bioconversion réel. Les résultats obtenus sont
représentés sur la figure 10. Ils font apparaître que le rendement maximal
obtenu était de 24%, alors que le rendement théorique est de 55 %. li semble
ls donc que tout le RM apporté ne soit pas utilisé uniquement pour la
biosynthèse
de y-décalactone, mais qu'il intervienne également dans d'autres métabolismes
de la cellule.
A ce stade, il apparaît que
20 - l'apport séquencé de RM est préférable à une addition unique pour la
production de y-décalactone,
- un apport de RM en début de culture est également favorable à la production
de lactone,
- ie potentiel réel de bioconversion du RM en lactone par S. odorus est de 24%
2s dans les conditions de culture utilisées.
~.2 - La Y-décalactone est elle toxique ?
Afin de déterminer si la y-décalactone est toxique pour les cellules, des
cinétiques de croissance de la levure sur un milieu vinasse contenant soit 50
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mg/l, soit 250 mg/l de lactone ont été réalisées (figure 11 ). La dose 50 mgll
de
composé odorant n'affectait pas la croissance de la levure pendant les 50
premïéres heures de culture. Au delà, un décalage était observé. En revanche,
en présence de 250 mg/l de lactone, la croissance du microorganisme était
s significativement inférieure. En effet, la DO maximale atteinte était de 4
au lieu
de 15 dans le témoin. Ce même phénomène a déjà été observé par Feron et
col. (1996) qui ont déterminé que la dose compatible avec un taux de
croissance non nul des cellules est comprise entre 100 et 200 mg/l. Ceci
expliquerait en partie pourquoi des concentrations de 250 à 300 mg/l de
io lactone n'ont pas été dépassées dans les conditions expérimentales
retenues.
6.3 - L~e transfert du RM est-il limitant ?
Des cinétiques de croissance et de production de iactone sur un milieu
vinasse ont été réalisées en faisant appel à un tensioactif, le Tween 20 ~,
~s connu pour ses propriétés dispersantes. Celui-ci a été mélangé au RM dans
les
proportions un tiers-deux tiers (v/v). La solution obtenue a été ajoutée à
raison
de 0,09 % {v/v) au milieu vinasse aux temps t = 0, 24, 48 et 72 h.
Les figures 12 et 13 illustrent la production de biomasse et de y
décalactone respectivement. En ce qui concerne ta croissance, celle-ci n'était
2o pas affectée au cours des 48 premières heures de culture par la présence de
Tween 20 ~. Au delà un palier a été obtenu alors que les cellules continuaient
.
de croitre en l'absence de ce tensioactif.
La comparaïson des concentrations de lactone mesurées dans la phase
aqueuse avec et sans Tween 20 ~ permet de mettre en évidence que la
2s présence de cet élément augmente les quantités d'arôme présents dans cette
phase : on mesure 220 mg/I de y-décalactone après 120 h de culture en
présence de Tween 20 C~ et 135 mg/l dans le témoin, ce qui représente une
augmentation de 63 %.
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6.4- La composition du milieu prêsente-t elle des carences ?
Afin de vérifier si le blocage de la synthèse de y-décalactone n'était pas
dû à une carence en un ou plusieurs oligo-éléments, des cultures de 96 h sur
des milieux ayant été complémentés ont été réalisées comme suit
s milieu 0 : vinasse
milieu 1 : vinasse +-0,01 g/I de FeS04
- 0,13 g/l de CaCl2
- 3 g/I de MgS04
milieu 2 : vinasse + 1 g/l d'extrait de levure.
io A ces milieux, du ricinoléate de méthyle (4 fois 0,06 %) a été ajouté aux
instants t = 0, 24, 48 et 72 h.
Les résultats obtenus au bout de 96 h de culture sont rassemblés dans
le tableau 5. Leur observation suggère que la croissance et la production de
lactone ne sont pas fondamentalement modifiées par les apports en sels et
is extraits de levure.
Tableau ~ : Influence de la complémentation du milieu vinasse sur la
croissance et la production de y-décalactone par S. odorus. Les résultats
présentés ont été obtenus après 96 h de culture.
zo
Milieu milieu 0 milieu 1 milieu 2
_ 15,8 ~ 12,1 14,8
Biomasse
(D.O. 620 nm)
[y-dcalactone] 96,1 104,0 114,0
~
(mgll)
A ce stade, il apparaît que
- la composition de la vinasse n'est pas un élément susceptible de limiter la
production de y-décalactone,
2s - l'effet toxique de la y décalactone observé au delà de 250 mg/I pourrait
être à
l'origine de la limitation de sa production par S. odorus,
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- l'effet positif du Tween 20 ~ sur la réaction de bioconversion suggère que
la
dispersion du RM pourrait améliorer la quantité de y-décalactone présente dans
la phase aqueuse.
s ~ - Exemple de production de y-décalactone par Sporobolomyces odorus
à partir de vinasses et de ricinoléate de méthyle en fermenteur
~REPARATION DU SUBSTRAT
Après dissolution par chauffage et agitation des sels précipités, les
particules
io solides contenues dans la vinasse brute sont séparées par centrifugation.
Le
pH de la vinasse est ajusté à 6 avec du NaOH 5 M et de l'antimousse
(Struktol~) est ajouté à raison 0,01 % (v/v).
,$TERILISATION DU SUBSTRAT ET DU FERMENTEUR
is Le substrat ainsi obtenu est introduit dans le fermenteur où il est
stérilisé à
120°C pendant 20 minutes sous 1,4 bars.
CULTURE DISCONTINUE
Le fermenteur est ensemencé à une densité optique de 0,2 (lue à 620 nm) à
2o partir d'une préculture. Du ricinoléate de méthyle stérile est ajouté à
raison de
0,06 % (v/v) à différents temps après finititation de la culture, soit aux
temps
t = 0, 24, 48 et 72 heures. La température est régulée à 24°C,
l'agitation à 500
rpm et l'aération à 0,4 WM.
En variante, la culture peut être réalisée en continu.
2s Les paramètres de la réaction peuvent varier selon les indications
suivantes
données à titre d'exemple
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PARAMETRE INTERVALLE AVANTAGEUSEMENT
Température 10-50°C 20-40°C
Agitation 50-1000 rpm 100-700 rpm
Agitation 0,10-10 WM 0,10-5 WM
Aération 0,01-20% (v/v) 0,01-20 % (v/v)
C. Extraction in situ de la x-déc~lactone
1.1. Choix du syrstème d'extraction
s La concentration de 250 mg/L de y-décalactone n'a pas été dépassée
lors de la production sans extraction de cette molécule odorante par
Sporobolomyces odorus développée sur vinasse. Ceci est lié à la toxicité
qu'exerce cette molécule sur ia levure au-delà de 150 mg/l. Afin d'éviter que
cette concentration seuil soit atteinte au cours de la culture, il est
nécessaire de
io l'extraire de la phase aqueuse au fur et à mesure de sa genèse. La Y-
décalactone étant lipophile, son extraction in situ est réalisable à l'aide de
substances hydrophobes.
Le précurseur utilisé dans la biosynthèse de y-décalactone, le ricinoléate
de méthyle (RM), étant lui aussi liposoluble, il est extrait au même titre que
is l'arôme naturel produit. Lorsque la substance d'extraction utilisée est une
huile,
il s'établit un équilibre entre les phases aqueuses et lipidique. Compte tenu
de
la consommation par les cellules, du RM dans la phase aqueuse, ü se produit
un transfert du précurseur de la phase lipidique vers la phase aqueuse.
Les études suivantes ont été réalisées principalement en utilisant de
20 l'huile de noix de coco hydrogénée (HNCH) et ponctuellement du T1'T comme
graisse solide pour l'extraction in situ de la Y-décalactone.
1.2. a r r '
réalisées en r~résence de HNCH
Le RM étant lipidique, il se solubilise également dans l'HNCH. La
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quantité de précurseur présente dans la phase aqueuse dépend alors de son
coefficient de partage entre les deux phases. Ce paramètre étant largement en
faveur de la phase lipidique, seule une faible quantité du RM apportée reste
dans la phase aqueuse et est donc disponible pour les cellules. II est alors
s probable que le précurseur, devienne limitant à la synthèse de y-
décalactone,
et ce d'autant plus que les cellules ne sont plus soumises à la toxicité de
cette
molécule.
Quatre cultures ont été réalisées, recevant respectivement
~ 4 x 0,03 % (v/v) de RM
to ~ 4 x 0,06 % (v/v) de RM (témoin)
~ 4 x 0,12 % (vlv) de RM
~ 4 x 0,18 % (v/v) de RM
Les apports de RM ont été réalisés aux temps t= 0, 24, 48 et 72 heures.
Ces cultures ont été effectuées dans des Erlenmeyers de 250 ml contenant 5 g
is de HNCH et 60 ml de vinasse ensemencé à une densité cellulaire initiale en
levures de 0,2 unités de D062o (densité optique mesurée à 620 nm).
Les résultats obtenus (figure 14) montrent que la cinétique de croissance
de la levure est identique, que les ajouts de RM soient de 4 x 0,03, 0,06 ou
0,12 % (v/v). De plus, la vitesse de croissance est sensiblement la même pour
2o tous les essais durant les 75 premières heures de culture. Par contre, un
apport de 4 x 0,18 % (v/v) de précurseur améliore nettement la croissance de
S. odorus. Après 150 heures de culture, la D0620 atteint une valeur de 15
contre 8 seulement dans les autres cas.
En ce qui concerne la production de y-décalactone (tableau I), elle
2s augmente avec la dose de précurseur ajoutée et atteint 980 mg/l au bout de
312 heures de culture avec un apport de 4 x 0,18 % (v/v). Cette concentration
en lactone dépasse largement celle de 250 mg/I obtenue antérieurement en
absence de HNCH.
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Tableau I. Production de y-décalactone par S-od,_otus en fonction de la
quantité
de RM apportée et en présence de HNCH (5g/flacon). Les mesures ont été
réalisées après 312 heures de culture.
Quantit de 4 x 0,03 4 x 0,06 4 x 0,12 4 x 0,18
RM % % %
apporte
[y-dcalactone,147 265 370 980
mg/I
s
La graisse solide utilisée (huile de noix de coco hydrogénée) s'avère
donc être un bon système d'extraction de la y-décalactone. En multipliant par
3
la dose de RM apportée, il permet d'augmenter d'un facteur 4 la concentration
de 250 mg/l obtenue lors des cultures réalisées en l'absence de cette "graisse
io d'extraction".
1.3. lnfluencg d'un aRport de Tween 20~ ou de Struktol~' en présence de
HNCH.
L'absorption du ricinoléate de méthyle dans la graisse d'extraction ayant
été constatée lors du dosage chromatographique de la y-décalactone, il nous a
is paru intéressant d'essayer de limiter ce phénomène par l'apport
d'adjuvants,
tels qu'un tensio-actif à une concentration respectueuse de l'intégrité
cellulaire,
le Tween 20~ , ou d'un antimousse, le Struktol~ , pouvant agir également en
tant que vecteur de solubilisation.
20 Les expériences suivantes ont été réalisées
~ 4 apports de 0,18 % (v/v) de RM,
~ 4 apports de 0,18 % (v/v) de rM + 0,01 % (vlv) de Struktol~ ,
~ 4 apports de 0,18 % (v/v) de RM + 0,01 % (v/v) de Tween 20~ .
2s Le RM a été apporté {seul ou mélangé aux adjuvants) aux temps t=0,
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24, 48 et 72 heures.
Dans l'optique d'augmenter la productivité de ce système mettant en
oeuvre une extracdtion in ~u de ia y-décalactone, 2 séries d'essais ont été
réalisées; l'une à une densité cellulaire initiale de 0,2 (témoin), l'autre à
une
s densité cellulaire initiale de 4.
Tableau Il. Influence d'un apport de Tween 20~ [0,01 % (v/v)) ou de Struktol~
[0,01 % (v/v)] lors de la culture de S.S. odorus en présence de HNCH
(5g/flacon)
aux densités cellulaires initiales de 0,2 et de 4. L'évaluation de la biomasse
et
io de la production de y-décalactone a été réalisée après 312 heures de
culture.
Conditions
de culture
Biomasse Paramtres Tmoin Struktol'~ Tween 20'~
initiale
(DO 620
nm)
Biomasse finale 17,54 9,87 9,43
0,2 Production totale810 1400 1180
de y-
dcalactone (mg/L)
Biomasse finale 21,37 11,97 15,38
4 Production totale1110 990 1530
de y-
dcalactone (mg/L)
Les résultats obtenus (tableau II) montrent que, quelle que soit la densité
initiale d'ensemencement, l'apport des adjuvants diminue la concentration
is cellulaire atteinte après 312 heures de culture.
La production totale de lactone (tableau II), quant à elle, est améliorée
par la présence de Struktol~ et dans une moindre mesure par l'apport de
Tween 20~ lorsque la densité cellulaire initiale est de 0,2. L'influence de
ces
adjuvants sur la production totale de y-décalactone diffêre dans les essais
2o réalisés avec un ensemencement cellulaire de 4. En effet, dans ce dernier
cas,
la concentration en lactone obtenue en présence de Struktol'~ (990 mglL) est
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inférieure à celle du témoin (1111 mg/L). Seul le Tween 20~ permet dans les
deux cas d'augmenter la quantité de lactone produite.
II apparaît donc que les conditions permettant la meilleure production
s totale de y-décalactone sont les suivantes
Densité cellulaire initiale de 4,
Apports aux temps t= 0, 24, 48 et 72 heures de 0,18 % (v/v) de RM + 0,01
(v/v) de Tween 20~.
io 1.4. influence d'a~oorts su~olémentaires de précurseur.
Afin de vérifier si la disponiblité du précurseur dans la phase aqueuse
est bien le facteur limitant à la synthèse de lactone au-delà de 150 heures,
une
culture de densité cellulaire initiale de 4 est initiée. Après inoculation, la
suspension est additionnée de
is ~ 0,18 % (v/v) de RM
~ 0,01 % (v/v) de Tween 20~ et
~ 0,01 % (v/v) de Struktol~.
Ces apports sont réalisés aux temps t = 0, 24, 48, 72, 144 et 168 heures.
Ces addititifs sont utilisés dans l'optique, d'une part, de limiter la
production de
2o mousse lors de ia culture (Struktol~) et, d'autre part, pour optimiser le
transfert
du précurseur vers les cellules à travers la membrane cellulaire Tween 20~
~ Les résultats obtenus (figure 15) montrent que si la croissance de la
biomasse n'est pas affectée par les deux apports supplémentaires de RM, il
n'en est pas de même pour la productivité de y-décalactone. Cette dernière
2s est de 5,3 mg/I/h au cours de 150 premières heures de culture, puis elle
reprend avec une vitesse de 19 mg/Ilh à la suite des nouveaux ajouts de
précurseur et se poursuit jusqu'à t=216 heures. La productivité totale sur les
240 heures de culture est alors de 6,66 mg/l/h. L'hypothèse émise
précédemment est donc vérifiée : le transfert du RM de la phase lipidique
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vers la phase aqueuse devient limitant pour la production de lactone au-delà
de 150 heures. Enfin, un nouvel apport de RM et d'adjuvants après 144
heures relance la production de ~y-décalactone avec une vitesse environ 4
fois supérieure.
s ~ A cet stade, il apparaît que : l'apport conjoint de RM, de Tween 20~ et de
Struktol~ permet d'atteindre une productivité totale de 5,3 mg/l/h au cours
des 150 premières heures de culture.La disponibilité du RM dans la phase
aqueuse est rapidement limitante à la production de lactone. Une des
solutions à ce problème pourrait consister en une séparation "spatiale" des
io étapes de conversion du RM et d'extraction de la lactone.
1.5. Cinétique de pl2duction de y-décalactone en présence de,~
Outre l'huile de noix de coco hydrogénée, le mélange de graisses
végétales TTT a été expérimenté comme système d'extraction .'gin situ de la y-
décalactone. A cet effet, une culture de densité cellulaire initiale de 4
pourvue
is en TTT {5g/flacon), est additionnée de 0,18 % (v/v) de RM, 0,01 % (v/v) de
Tween 20~ et de 0,01 (v/v) de Struktol~. Ces apports sont réalisés aux temps
t = 0, 24, 48, 72, 144 et 168 heures.Après stérilisation à 120°C
pendant 20 min,
du mélange TTT (5g) contenu dans un Erlenmeyer de 250m1, ce dernier est à
nouveau fondu par chauffage et réparti sur la surface interne de l'Erlenmeyer
2o jusqu'à hauteur de 5cm (mesurée à partir du fond) par rotation autour de
son
axe vertical incliné à environ 45°C. Une fois la graisse solidifiée,
60m1 de
vinasse préalablement stérilisée et refroidie sont introduits dans
l'Erlemeyer.
L'ensemencement est réalisé après que le RM, le Tween 20 et le Struktol aient
été ajoutés. Les résultats obtenus (figure 16) montrent que ta croissance des
2s levures s'arrête après 72 heures de culture. Au delà, un plateau s'établit
autour
d'une valeur de biomasse sensiblement égale à 11. En ce qui concerne la Y-
décalactone, sa vitesse de production est de 6 mg/I/h au cours de la phase de
croissance. Elle continue d'augmenter ensuite et garde une valeur constante de
7,8 mg/l/h.
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