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PROCEDE ET TROUSSE POUR LA DETEC7~ION D'UN DESEQUILIBRE
INTRACHROMOSOMIQUE DANS DES NOYAUX INTERPHASIQUES ET
LEURS APPLICATIONS
La présente Invention se rapporte à un procédé pour détecter un
déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, à
une
trousse propre à permettre la mise en ceuvre de ce procédé ainsi qu'aux
applications de
ce procédé et de cette trousse, notamment pour la détection de cellules
cancéreuses au
sein d'un échantillon biologique et le diagnostic de pathologies cancéreuses.
L'étude cytogénétique des cellules tumorales a montré (existence,
io dans ces cellules, de nombreux remaniements chromosomiques consistant
notamment
en des pertes et des gains de matériel génétique, pouvant conduire jusqu'à la
disparition de bras chromosomiques, ou, au contraire, à la présence de bras
chromosomiques surnuméraires et se traduisant ainsi par des modifications du
rapport
normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court de certains
chromosomes que fon désignera ci-après sous le: terme de déséquilibres inira-
chromosomiques.
Ainsi, par exemple, DUTRILL.!~UX et al. (Cancer Genet.
Cytogenet., 1990, 4~, 203-2I7) ont mis en évidence, à partir de 30 cas, la
survenue
dans les cancers du sein de multiples réarrangements affectant, à une
fréquence
2o particulièrement élevée, les chromosomes 1 et 16 et se manifestant
principalement par
un gain du bras long du chromosome 1 et une perte du bras Iong du chromosome
16,
et, à une fréquence moindre, les chromosomes 4, 6, 8, 9, 11, 13 et I7. De
maniëre
similaire, TESTA et SIEGFRIED (Cancer Research, 1992, ~2,, 2702s-2706s) ont
montrë, également à partir de 30 cas, la présence, dans les cancers du poumon
non à
petites cellules, de nombreux réarrangements affectant de manière
préférentielle le
chromosome 7 (principalement sous la forme d'une polysomie 7 ou d'un gain de
tout
ou partie du bras court de ce chromosome), mais aussi les chromosomes 1, 3, 6,
7, 11,
13, 15, 17 et i9.
En fait, il est maintenant bien. établi que le processus de
3o cancérogenèse est un événement multi-étapes, nécessitant des modifications
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génétiques successivés dont l'accumulation au cours du, temps va conduire à
des
cellules au potentiel transformant qui sera de plus en plus agressif,
conduisant à une
tumeur cliniquement détectable et éventuellement métastasiante. Aussi, une
dëfinition
précise des paramètres cytogénétiques caractéristiques de la tumorogénèse
apparaît
constituer une étape capitale, tant dans (élaboration dru diagnostic positif
que de celle
du diagnostic évolutif des tumeurs, permettant ainsi une mise en oeuvre des
thérapeutiques les plus adaptées.
Actuellement, Ies cytogénéticiens disposent principalement de deux
approches dans l'investigation du génome et de ses anomalies
- d'une part, la cytogénétique classique, qui permet d'avoir accës au
caryotype détaillë d'une cellule et d'appréhender les anomalies de structure
et de
nombre de l'ensemble des chromosomes qu'elle comporte et qui consiste, après
une
période de culture ih vitro des cellules dont la durée varie avec le type de
cellules
étudiées, à bloquer ces cellules en métaphase et à traiter les chromosomes
selon
différentes méthodes permettant l'observation au microscope otique de bandes
s'étendant sur quelques mégabases, d'oü le fait qu'on la désigne généralement
par le
nom anglo-saxon de banding. Après photographie, les chromosomes sont appariés
et
ordonnés selon leur longueur, la position du centromère et la topographie des
bandes,
et ce classement aboutit à l'élaboration du caryotype.
2o Cette approche dont l'intérêt majeur est de conduire à une "image"
globale du génome, trouve un certain nombre de limites. La première tient au
fait
qu'elle nécessite une mise en culture préalable des cellules étudiées, de
manière à
obtenir un nombre suffisant de cellules en métaphase. nr, il est maintenant
bien acquis
que, dans le cas d'une population polyclonalé, la réalisation d'une culture
cellulaire est
susceptible d'introduire des biais importants dans les résultats d'une .
analyse
cytogénétique, en raison de ce que seules Ies cellulles adaptées aux
conditions de
culture se divisent et donnent des métaphases. Une autre limite réside dans le
pouvoir
de résolution de la cytogénétique classique qui ne permet d'appréhender que
partiellement les remaniements chromosomiques souvent relativement complexes
3o dans les tumeurs solides, lesquelles représentent la majorité des cancers.
Enfin, de par
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son principe, cette approche se heurte à toute possibilité d'un dépistagé
automatisé des
anomalies chromosomiques complexes et/ou multiples.
- d'autre part, l'hybridation in situ en fluorescence (FISH), qui
permet de repérer une séquence d'ADN chromosomique au moyen d'une sonde de
séquence spécifique homologue à celle qui est étudiée.. Fondée sur la
complémentarité
existant entre les nucléotides (adénine-thymine, adénine-uridine, cytosine-
guanine),
elle consiste à hybrider l'ADN cible avec une sonde marquée, soit directement,
sait
indirectement par un fluorochrome, et à utiliser la fluorescence émise par ce
dernier
comme témoin de l'hybridation.
l0 L'hybridation ih situ en fluorescence peut être mise en oeuvre sur
des chromosomes métaphasiques, auquel cas elle utilise des sondes spécifiques
d'un
chromosome, d'un bras, d'une région chromosomique, voire d'un locus donné. La
révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par une visualisation au
microscope des sites fluorescents correspondant aux sites de l'ADN cible
s'étant
hybridés avec les sondes. Toutefois, en analyse pathologique de routine,
l'hybridation
in situ en fluorescence est mise en oeuvre sur des noyaux interphasiques et
elle utilise
alors des sondes spécifiques des régions centromériques des chromosomes. La
révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par un comptage des spots
fluorescents, soit manuellement au microscope, soit de manière automatisée au
moyen
d'un cytamétre d'image, le nombre des spots étatxt dans tous les cas supposé
correspondre au nombre de copies des chromosomes étudiés.
Si le développement des techniques de la FISH a incontestablement
amélioré le pouvoir de résolution de Ia cytogénétique {jusqu'à l'ordre de
quelques
kilobases), permettant ainsi de mieux cerner les gains et pertes en matériel
chromosomique et les anomalies de structure des chromosomes, ces techniques
telles
qu'elles existent aujourd'hui, ne sont toutefois pas totalement
satisfaisantes.
En effet, s'agissant de ia FISH sur chromosomes métaphasiques, une
étape préalable de culture in vitro des cellules est indispensable, comme dans
Ie cas de
ia cytogénétique classique, pour obtenir un nombre suffisant de cellules en
métaphase
avec Ies inconvénients précités que cela implique.
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Quant à la FISH sur noyaux interphasiques, si elle présente
l'avantage d'éviter (étape de culture et, partant, la s-élection potentielle
de certaines
cellules au cours de cette culture, elle présente l'inconvénient que le
comptage manuel
des spots ne peut être effectué que sur un nombre restreint de cellules et est
à l'origine
d'erreurs importantes lorsqu'il est appliqué à une petité population de
cellules
anormales (IüBBELAAR et al., Cytametry, 1993, 14, 7I6-724), tandis que le
comptage automatisé demeure à ce jour très imparfait:, en dépit des efforts
qui ont été
tentés pour améliorer la qualité de l'hybridation, la qualité des signaux
qu'elle génère
et la sensibilité des caméras dont sont équipés les cy~tomètres d'image
(TRUONG et
al., Anal. Cell Path., 1997, ~,,3_, 137-146). Au surplus;, il s'avère qu'un
certain nombre
d'anomalies chromosomiques n'affectent pas les régions centramériques des
chromosomes, mais leurs bras, et échappent à toute possibilité de détection
par cette
technique.
Les Inventeurs se sont, donc, fixés poux but de fournir un procédé
propre à permettre la détection d'un déséquilibre intrac;hromosomique dans les
cellules
d'un échantillon biologique, et qui soit exempt, d'une manière générale, de
tous les
inconvénients des procédés de (état antérieur de Ia technique.
Plus spécifiquement, les Inventeurs ;>e sont fixés pour but de fournir
un procédé de détection d'un déséquilibre intrachrc>mosomique qui; tout en
étant
2o sensible, spécifique et reproductible de manière à. garantir la fiabilité
de cette
détection, puisse
- d'une part, être mis en oeuvre sur des cellules en interphase pour
s'affranchir de la nécessité de soumettre préalablement les cellules devant
être étudiées
à une culture in vitro,
- d'autre part, s'appliquer non seulement à une population cellulaire
monoclonale, mais également à une population cellulaire polyclanale afin de
permettre la détection de la présence éventuelle, au sein de cette population,
de clones
cellulaires anormaux même lorsque ceux-ci sont minoritaires, et
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- en outre, être au moins partiellement, automatisé afin de rendre
possible, pour un coût raisonnable, le traitement d'une quantité importante
d'échantillons biologiques tout en limitant les risques d'erreurs dans ce
traitement.
Ces buts sont atteints selon la présente Invention par un procédé de
5 détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires
en
interphase, qui est caractérisé en ce qu'il comprend
(a) l'hybridation in situ du chromosome présent dans lesdits noyaux
et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre au moyen de deux sondes
marquées par
deux fluorochromes différents, la première sonde étant spécifique du bras long
de ce
1o chromosome tandis que la deuxième sonde est spécifique du bras court de ce
même
chromosome ;
(b) la mesure de (intensité de la fluorescence émise dans lesdits
noyaux aux bandes de iongueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des
deux
fluorochromes ;
(c) le calcul du rapport entre les deux valeurs d'intensité de
fluorescence ainsi mesurées ; et
{d) la comparaison de ia valeur du rapport ainsi obtenue avec au
moins une valeur de référence.
Au sens de la présente Invention., on entend par "déséquilibre
2o intrachromosomique", toute modification du rapport normal entre le nombre
etlou la
longueur des bras long et court d'un chromosome, résultant d'une perte ou d'un
gain de
matériel génétique tels qu'une délétion ou, au contraire, une duplication de
tout ou
partie d'un bras chromosomique.
Par ailleurs, pour des raisons de commodité, on appelle dans ce qui
suit "chromosome cible", le chromosome suspecté d'être affecté par un
déséquilibre tel
que ci-avant défini et dont on cherche à vérifier s'il présente effectivement
ce
déséquilibre.
Conformément à (Invention, les deux sondes utilisées pour
(hybridation in situ du chromosome cible sont constituées par un ensemble de
sondes
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non répétées recouvrant tout ou partie du bras long ou du bras court dudit
chromosome.
De manière préférée, ces sondes sor.~t constituées par un ensemble de
sondes recouvrant la totalité du bras long ou du bras court du chromosome
cible.
De telles sondes, que fon désignE; communément par le nom de
peinture chromosomique, peuvent être préparées spécialement pour les besoins
de la
mise en oeuvre du procédé de détection conforme à (Invention.
Ainsi, par exemple, ces sondes sort susceptibles d'être préparées à
partir de cellules connues pour présenter, au niveau du même chromosome que le
i0 chromosome cible, une anomalie (délétion, isochromosome, ...) du bras court
ou du
bras long telle que ce chromosome altéré correspond<; sensiblement à fun des
bras du
chromosome cible, en triant les chromosomes de ces cellules, par exemple par
cytométrie de flux, de manière à ne conserver que les chromosomes propres à
servir à
la préparation des sondes, puis en soumettant ces derniers à une
amplification, par
exemple par la technique de polymérisation en chaîne PARM-PCR telle que
décrite
par MILAN et al. (Mammalian Genome, 1996, 7, 19~E-199), suivie d'un marquage
des
produits résultant de cette amplification par un fluoroc;hrome.
En variante, elles peuvent aussi ên-e préparées à partir de cellules
exemptes de toute anomalie chromosomique, par micro-dissection au laser ou par
aiguille du chromosome de ces cellules correspondant au chromosome cible de
manière à en individualiser le bras long etJou le bras court, suivie d'une
amplification
du ou des bras chromosomiques ainsi obtenus, puis d'un marquage des produits
.résultant de cette amplification par un fluorochrome,, comme décrit par
exemple par
GUAN et al: (Hum. Molec. Genet., 1993, ~, 1117-I 121).
Il est, bien entendu, également possible de recourir, pour la mise en
oeuvre du procédé de détection conforme à Flnventüon, à des sondes
commerciales
prêtes à (emploi. Ainsi, par exemple, des sondes spécifiques des bras courts
et longs
des différents chromosomes humains et marquées par de la biotine sont
disponibles
auprès de la Société ALTECHNOLOGIES (USA).
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Par ailleurs, bien que les sondes utilisées pour l'h~bridation in situ
du chromosome cible puissent être des sondes directement couplées à un
fluorochrome, ces sondes sont, de préférence, des sondes à marquage
fluorescent
indirect, les Inventeurs ayant en effet constaté que ce type de marquage
conduit à des
résultats particulièrement satisfaisants.
Aussi, selon une disposition préférée de mise en oeuvre du procédé
conforme à (Invention, le marquage des sondes utilisées pour l'hybridation in
situ du
chromosome cible est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène,
et par
une réaction d'affinité entre cet haptène et un ligand apte à se lier spécif
quement audit
haptène et qui est soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par
réaction
avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome.
A titre d'exemples d'haptènes susceptibles d'êtres employés pour un
marquage indirect des sondes utiles dans la présente Invention, on peut
notamment
citer
- la digoxigénine, le dinitrophénol et Ie 2-acétylaminofluorène,
auquel cas la réaction d'affinité haptènelligand est avantageusennent réalisée
au moyen
d'anticorps dirigés contre ces composés et conjugués à un fluorochrome ;
- la biotine, auquel cas la réaction d'aff nité haptène/ligand est
avantageusement réalisée au moyen d'avidine conjuguée à un fluorochrome, ou en
2o utilisant des anticorps anti-biotine, puis des anticorps cfirigés contre
ces derniers et qui
sont conjugués à un fluorochrome.
De préférence, fane des sondes est couplée à de la digoxigénine
tandis que (autre sonde est couplée à de la biotine.
Quel que soit le type de marquage des sondes (direct ou indirect),
celles-ci sont marquées, conformément à l'Invention; par deux fluorochromes
différents destinés à permettre, par l'émission de; deux lumières de couleurs
différentes, une révélation des bras longs d'une part, e1: des bras courts
d'autre part, du
chromosome cible s'étant hybridés avec les sondes qui Leur sont respectivement
spécifiques.
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Ces fluorochromes peuvent être indifféremment choisis parmi les
différents composés fluorescents utilisés pour le marG~uage de sondes
nucléiques tels
que l'isothiocyanate de fluorescéine {FITC), les dénués de la rhodamine comme
fisothiocyanate de rhodamine b et le chlorure de sulfonate de suiforhodamine
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{Texas red°), le Cascade blué ou encore Ie Bopidy FL, à condition
toutefois de
veiller à ce qu'ils présentent des maxima de longueurs d'onde d'émission
situées dans
des bandes qui ne se recouvrent pas.
Ainsi, par exemple, dans le cas où l'u,ne des sondes sera marquée par
du FITC dont la longueur d'onde maximale d'émission se situe à 543 nm, l'autre
sonde
io sera avantageusement marquée par de l'isothiocyanate de rhodamine b dont Ia
longueur d'onde maximale d'émission se situe à 590 nm ou, mieux encore, par du
Texas red~ qui présente une longueur d'onde maximale d'émission encore plus
éloignée (604 nm) de celle du FITC.
De préférence, l'un des deux fluorocl':zromes est du FITC, tandis que
i s l'autre est du Texas red~.
Selon encore une autre disposition préférée de mise en oeuvre du
procédé de détection conforme à l'Invention, celui-ci comprend, de plus, une
contre-
coloration des noyaux destinée à permettre leur révélation préalablement à la
mesure
de f intensité de la fluorescence émise dans . ces noyaux aux bandes de
longueurs
20 d'onde d'émission des deux fluorochromes couplés aux sondes. Cette contre-
coloration
est donc réalisée avant de procéder à cette mesure, au moyen d'un fluorochrome
différent de ceux utilisés pour le marquage des sondes, tel que Ie 4',6-
diamidino-2-
phénylindole (DAPI) ou le 4',6-bis-2' imidazolinyl 4H-5H {DIPI}.
Comme précédemment indiqué, le procédé de détection comprend
25 une étape visant à mesurer f intensité de la fluorescence émise dans les
noyaux aux
bandes de longueur d'onde d'émission correspondant à chacun des deux
fluorochromes
couplés aux sondes.
Ainsi, par exemple, si (hybridation in situ du chromosome cible a
été réalisée en utilisant une sonde spécifique du bras long de ce chromosome
marquée
3o par du FITC qui émet une lumière verte, et une sonde; spéci$que du bras
court de ce
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chromosome marquée par du Texas red~ qui émet une .lumière rouge, on mesure
successivement (intensité de la fluorescence verte; émise par les noyaux, puis
(intensité de la fluorescence rouge émise par ces mêmes noyaux. On obtient de
la
sorte deux valeurs d'intensité de fluorescence qui sont fonction
respectivement du
nombre de bras Longs et du nombre de bras courts du chromosome cible s'étant
hybridés avec les sondes qui leur sont spécifiques.
Conformément à (Invention, on calcule ensuite le rapport (R°)
entre
les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi nnesurées. Avantageusement,
ce
rapport est calculé par l'une et/ou (autre des méthodes suivantes
- une première méthode consistant à déterminer, pour chaque
fluorescence, la moyenne des valeurs d'intensité de cette fluorescence telles
que
mesurées pour (ensemble des noyaux analysés, et à calculer le rapport entre
les deux
moyennes ainsi obtenues ; et
- une seconde méthode consistant à calculer, pour chaque noyau
analysé, le rapport entre les valeurs d'intensité mesurées pour chacune des
deux
fluorescentes, et à déterminer la moyenne des valeurs de ce rapport telles
qu'obtenues
pour (ensemble des noyaux analysés.
Puis, on compare la vaieur du rapport (R~,) ainsi obtenue avec au
mains une valeur de référence.
De manière préférée, cette valeur de référence correspond au rapport
(R~) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées pour des
noyaux de
cellules témoins traités exactement dans les mêmes conditions que les noyaux
analysés.
Avantageusement, les cellules témoins sont des cellules exemptes de
toute anomalie chromosomique, comme par exemple des lymphocytes provenant de
sujets sains. Ainsi, une différence significative (c'est-à-dire en pratique,
au moins
égale à 20%) entre les valeurs des rapports (Rrt) et (Rt) respectivement
obtenues pour
les noyaux analysés et les noyaux des ceilules témoins traduit l'existence,
dans au
mains un certain nombre des noyaux analysës, du déséquilibre
intrachromosomique
3o recherché.
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Il est, toutefois, possible d'utilise.r également comme cellules
témoins, des cellules affectées par le déséquilibre intrachromosomique que fon
souhaite détecter telles que des cellules d'une lignée cellulaire connues pour
présenter
de manière constante ce déséquilibre intrachromosomidue.
Selon encore une autre disposition préférée du procédé de détection
conforme à (Invention, celui-ci comprend, en outre, unie étape consistant à
déterminer,
pour les noyaux analysés, un indice (I) de déséquilibre. Là également, cet
indice de
déséquilibre peut avantageusement être établi par fane et/ou (autre des
méthodes
suivantes
~ une premiëre méthode consistant à calculer le ratio entre les
valeurs des rapports (R~) et (R~) respectivement obtenues poux l'ensemble des
noyaux
analysés et (ensemble des noyaux des cellules témoins. ; et
- une seconde méthode consistant à calculer, pour chaque noyau
analysé, Ie ratio entre les valeurs des rapports (R~) et (R~), et à retenir,
par exemple à
partir d'un histogramme représentant le nombre de noyaux analysés en fonction
du
ratio R~IRt, Ia valeur de ce ratio correspondant au plus grand nombre de
noyaux
analysés.
Selon encore une autre disposition préférée de mise en oeuvre du
procédé de détection conforme à (Invention, les étapes b), c), d)
correspondant à la
2o mesure des intensités de fluorescence, au calcul du rapport entre ces
intensités de
fluorescence et à la comparaison de la valeur de ce rapport avec une valeur de
référence, ainsi que l'étape de détermination de (indice (~ de déséquilibre
des noyaux
analysés sont réalisées au moyen d'un appareillage qui comprend
- une source de lumière susceptible de fournir de Ia lumière dans
trois bandes de longueurs d'onde différentes, ladite source pouvant être soit
une source
polychromatique munie de filtres, soit une source constituée par une pluralité
de
sources monochromatiques,
- des moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence émise par
des fluorochromes dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, et
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- des moyens de traitement et d'analyse dés intensités de
fluorescence ainsi mesurées.
A titre d'exemple d'appareillage susceptible de convenir à la mise en
oeuvre desdites étapes, on peut citer l'analyseur automatique d'images
commercialisé
par la Société BECTON DICIüNSON IMAGE CY'TOMETRY SYSTEMS sous la
marque enregistrée DISCOVERY.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de détection
conforme à l'Invention, le déséquilibre intrachronnosomique que fon cherche à
détecter résulte d'une duplication du bras long du chromosome 1 humain et/ou
d'une
1o délétion du bras court de ce chromosome.
La présente Invention a, également, pour obj et une trousse pour la
mise en couvre du procédé de détection d'un déséqttilibre intrachromosomique
dans
des noyaux intracellulaires en interphase tel que précédemment défini, qui est
caractérisée en ce qu'elle comprend
- une quantité appropriée d'une première sonde marquée par un
premier fluorochrome, ladite sonde étant spécifique; du bras Iong du
chromosome
présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre,
- une quantité appropriée d'une deuxième sonde marquée par un
deuxième fluorochrome, ladite sonde étant, spécifique du bras court de ce même
chromosome,
- un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire exempte
de toute anomalie chromosomique et, éventuellement,
- un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire constituée
en partie ou en totalité par des cellules présentant ie déséquilibre que l'on
souhaite
détecter.
Selon une premiére disposition avantageuse de la trousse conforme à
l'Invention, les échantillons de cellules témoins se présentent sous la forme
d'étalements sur lames prêts à être soumis à une hybridation in situ.
Selon une autre disposition avantageuse de la trousse conforme à
3o flnvention, les sondes sont des sondes couplées à un haptène, et la trousse
comprend;
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pour chaque sonde; une quantité appropriée d'un lig<~nd dirigé spécifiquement
contre
cet hapténe et qui est conjugué à un fluorochrome ou susceptible d'être rendu
fluorescent par une réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome,
auquel
cas la trousse contient, de plus, une quantité appropriÉ:e dudit contre-
ligand.
Selon encore une autre disposition avantageuse de cette trousse, elle
comprend en outre
- une quantité appropriée d'un ou plusieurs réactifs pour la fixation
des cellules ; et/ou
- une quantité appropriée d'un troisiéme fluorochrome propre à
lo permettre une contre-coloration des noyaux cellulaires ; etlou
- une quantité appropriée de réactifs (ARNase, pepsine, ..:) et de
solutions tampons (tampons d'hybridation, tampons de rinçage, ...) propres à
perinettre
(hybridation ih situ du chromosome par les sondes.
La présente Invention a, également, pour objet (application du
procédé de détection d'un dëséquilibre intrachromosomique dans des noyaux
cellulaires en interphase et de la trousse propre à permettre ia mise en ouvre
de ce
procédé tels que précédemment définis, à la détection de cellules cancéreuses
dans un
échantillon biologique tel qu'une cytoponction, wn épanchement séreux
(pleural,
péritonéal, ...), une tumorectomie ou encore une aspiration bronchique.
2o En effet, le procédé de détection conforme à (Invention présente un
intérêt tout à fait particulier dans le domaine de l.a cancérologie humaïne
et, plus
spécialement, pour l'établissement du diagnostic positif et/ou du diagnostic
évolutif
des pathoiogies cancéreuses dans lesquelles on observe de manière récurrente
un
certain nombre de remaniements chromosomiques se traduisant par des
déséquilibres
du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court de
certains
chromosomes, tels que la duplication du bras long des chromosomes 1 et 8; la
délétion
du bras court des chromosomes 1 et 3 ou encore Ia délétion du bras long du
chromosome 6.
Ce procédé est également susceptible de trouver des applications
dans des domaines autres que 1a cancérologie, et notamment dans (établissement
du
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diagnostic positif de pathôlogies humaines innées ou acquises liées à une
anomalie
chromosomique comme, par exemple, la maladie dite; du cri du chat qui se
caractérise
par une délétion d'une partie du bras court du chromosome 5.
Outre Ies dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore
d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui suit, qui se
iréfere à un
exemple de mise en oeuvre et d'application du procédé de détection conforme à
l'Invention ainsi qu'à la Figur 1 â~nexée qui illustre;, sous la forme
d'histogrammes,
les répartitions du nombre de noyaux en fonction des. intensités de
fluorescence telles
que mesurées pour le bras long (lq) d'une part, et lE; bras court (lp) d'autre
part, du
lo chromosome 1 par la mise en oeuvre dudit procédé sur des cellules provenant
d'un
prélévement tumoral.
I1 doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple est donné
uniquement à titre d'illustration de l'objet de I'inverEtion et n'en constitue
en aucune
manière une limitation.
EXE .,MPLE : DETECTION D'UN DESEQUILIBItE ENTRE LES BRAS LONG
ET COURT DU CHROMOSOME I DANS DE;> CELLULES DE CANCERS
DU SEIN
Le procédé de détection conforme à (Invention et (intérêt de son
utilisation à des fins diagnostiques ont été validés par une série
d'expérimentations
2o visant à appliquer ce procédé à la recherche du déséquilibre entre le bras
long (ci-après
"bras lq") et Ie bras court (ci-après "bras lp") du chromosome 1 fréquemment
observé
dans les cas de cancers du sein, et à comparer les résultats obtenus avec ceux
observés
en mettant en ceuvre deux techniques classiquement utilisées en cytogénétique,
à
savoir la technique du R-banding d'une part, et la technique d'hybridation in
situ en
fluorescence (FISH) sur chromosomes rnétaphasiques d'autre part.
1) Matériel biolo~iaue
Les expérimentations ont été réalisées sur 2 types de cellules de
cancers du sein
- d'une part, des cellules tumorales appartenant à 3 lignées
cellulaires : ZR 75, BT 20 et H 466 et provenant respectivement des souches
déposées
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auprès de l'ATCC {AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION) sous les n° CRL-
I500, HTB-19 et HTB-171 ; et
- d'autre part, des cellules tumorales provenant de prélèvements
biologiques effectués chez 16 patientes d'âge compris entre 33 et 73 ans, et
correspondant à 13 tumeurs et 6 cytoponctions, 2 patientes âyant fait l'objet
à ia fois
d'une cytoponction, puis d'une tumorectomie, et I patiente ayant fait (objet
de 2
tumorectomies (sein droit et sein gauche).
Parmi ces prélèvements biologiques, 3 se sont révélés correspondre à
des tumeurs de stade I, 4 à des tumeurs de stade IIA, 8 à des tumeurs de stade
IB, 1 à
1 o une tumeur de stade IIIA et 1 à une tumeur de stade IIIB, selon le
groupement par
stade de fAMERICAN JOINT COMMITTEE OF t:ANCER (AJCC). Par ailleurs,
l'histologie a permis de montrer qu'il s'agissait dans :l0 cas de carcinomes
canalaires
infiltrants, dans 3 cas de carcinomes lobulaires infiltrants, et dans 3 autres
cas d'un
carcinome indifférencié, d'un carcinome colloïde et. d'un carcinome
intracanalaire
Selon la méthode du grade de SCARFF-BLOOM-RIt~HARDSON (SBR), 3 tumeurs
étaient de grade II tandis que 5 étaient de grade III.
Z) Pré~arat~,on des lamg~ de cellules tumorales
Les lignées cellulaires ont été cultivées dans des conditions standard.
Elles ont été fixées soit par du liquide de CARNOY, soit par du
paraformaldéhyde à
0,5% dans du tampon PBS avec, dans ce dernier cas, t;Gne post-fixation par de
féthanol
à 70%, puis étalées sur lames.
Les tumeurs et la moitié des cytoporictions ont été mises en cultures
de courte durée (72 heures) comme décrit par MLTLEF:IS et al. (Genes,
Chromosomes
& Cancer, 1994, IQ, 160-170). Puis, les cellules provenant de ces cultures ont
été
fixées par du liquide de CARNOY et étalées sur lames.
Les autres cytoponctions, après dilution (10 fois) dans du milieu
dissociant n° C 1419 (SIGMA), ont été fixées par du paraformaldéhyde à
0,5% dans
du tampon PBS, post-fixées par de féthanol à 70''%, puis étalées sur lames par
centrifugation au moyen d'une centrifugeuse Cytospïn~~ 3 {SHANDON).
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3) ~ré~aration des lames de cellules témoins
Des lames de cellules témoins ont été préparées par étalement de
cellules lymphocytaires dénuées de toute anomalie chromosomique, après
fixation de
ces cellules pour une partie de ces lames, par du liquide de CARNOY et pour
l'autre
5 partie, par du paraformaldéhyde à 0,5% dans du tampon PBS, suivie dans ce
dernier
cas d'une post-fixation par de I'éthanol à 70%.
4) Préparation des sondes
Pour (obtention des sondes spécifiques du bras lq et du bras lp, des
suspensions chromosomiques des lignées cellulaires H 466 et DU 145 (souche
10 disponible auprès de l'ATCC sous le n° HTB-8l), se caractérisant
respectivement par
un réarrangement chromosomique iso(lq) et par un réarrangement chromosomique
del( 1 )(q10-qter}, ont été préparées selon la technique décrite par VAN DEN
ENGH et
al. (Cytometry, 1984, ,~, 108-117).
Un total de 300 chromosomes correspondant soit à des iso(Iq), soit à
15 des del(I)(q10-qter) ont été triés par cytométrie en flux. Puis, ces
chromosomes ont
été amplifiés par Ia technique de polymérisation e:n chaîne PARM-PCR à l'aide
d'amorces (GAG)7 et marqués selon Ies protocoles décrits par MILAN et al.
(Mammalian Genome, 1996, 7, 194-199), en utili:>ant comme marqueurs, de Ia
digoxigénine-11-dUTP (BOEHRINGER MANNF-IEIM) pour les chromosomes
2o destinés à servir de sondes pour le bras lq et de la biotine-11-dUTP
{SIGMA) pour Ies
chromosomes destinés à servir de sondes pour Ie bras llp.
S) ~Iy~ridation i~ situ
L'hybridation in situ a été conduite ~en apportant au protocole décrit
par TRUONG et al. {Anal. Cell Path., 1997, ~, 137-146) quelques modifications
mineures. En pratique, après un traitement par l'ARN2~se (I00 p,g/ml, SIGMA) à
37°C
pendant une heure, suivi de deux rinçages dans du tampon 2 x SSC et un rinçage
dans
du tampon PBS, les lames de cellules turnôraies et de <:ellules témoins ont
été incubées
à 37°C, pendant 10 minutes, en présence de pepsine (SIGMA) à une
concentration de
4 lZg/ml dans de l'HCI 0,01M. Puis, elles ont été rincées 2 fois dans du
tampon PBS,
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pendant S minutes et à la température ambiante, post-fixées dans du liquide de
CA.RNOY et séchées à l'air.
L'ADN des chromosomes destinés à aervir de sondes a été dénaturé à
70°C pendant 10 minutes dans un tampon d'hybridation classique. L'ADN
cible, c'est-
à-dire fADN des lames de cellules tumorales et d.e cellules témoins, a été,
lui,
dénaturé à 70°C pendant 3 minutes dans du tampon 2 x SSC comprenant 70%
de
formamide (FLLTKA), pH 7. Les lames ont été ensuite rincées dans du tampon
2 x SSC, puis déshydratées en utilisant des concentrations croissantes
d'éthanol et
séchées à Pair.
L'hybridation a été conduite à 37°C pendant' toute une nuit, puis
les
lames d'échantillons ont été soumises à des rinçages post-hybridation dans du
tampon
2 x SSC, pendant 5 minutes et à 72°C.
6) Mes_nre dg~ intensités de uorescence et détermin 'on du
rapuort entre les valeurs ~ ces intensités
is Pour permettre une révélation des bras 1 q et lp des chromosomes 1
des cellules tumorales et des cellules témoins s'étant hybridés avec Ies
sondes, les
lames ont été incubées
~ d'une part, avec des anticorps anti-digoxigénine marqué par du
FITC (BOEHRINGER MANNHEIM) qui émet une fluorescence de couleur verte, et
~ d'autre part, avec des anticorps de souris anti-biotine, puis des
anticorps anti-immunoglobulines de souris manqués par du Texas Red°
(MOLECULAR PROBES), ce dernier émettant une fluorescence de couleur rouge.
Les lames ont été ensuite contre-colorées par du DAPI (1 ~g/ml,
MOLECULAR PROBES), puis montées dans de la p-I>henylène-diamine.
La mesure des intensités des iEluorescences verte et rouge
correspondant respectivement aux bras I q et l p des chromosomes 1 s'étant
hybridés
avec les sondes a été réalisée en utilisant un analyseur automatique d'images
DISCOVERY° (BECTON DICKINSON IMAGE CYTOMETRY SYSTEMS)
comprenant
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- une source lumineuse constituée par une larripe à vapeur de
mercure d'une puissance de 100 W (OSRA1V~,
- un microscope AUTOPLAN° (LEITZ) muni d'un objectif à
immersion dans l'huile et de grossissement 40 (ouverh~re numérique : 1,3),
= une caméra CCD noir et blanc XILLIX° 1400 munie d'un
obturateur permettânt de faire varier le temps d'intégration de l'exposition à
ia lumière
entre 30 msec et 10 sec,
- une carte d'acquisition d'images propre à assurer la numérisation
dtz signal délivré par la caméra, et
t o - relié à cette carte, un micro-ordinateur comportant une unité
centrale commercialisée par la Société ïN'TEL sous la référence 486 et muni du
logiciel de traitement d'images DISCOVERY~.
Pour chaque lame, le contre-coiora~nt DAPI a été dans un premier
temps excité à la longueur d'onde de 330 nm de mani~,re à révéler les zones de
(image
formée par le système optique sur le capteur de la caméra, occupées par les
noyaux et
à définir la mise au point optimale de cette image. Puis, les intensités des
fluorescences verte et rouge émises dans ces noyaux ont été mesurées
successivement,
en utilisant comme zones pertinentes de ces fluorescences, les zones de
l'image ayant
été détectées comme correspondant à des zones occupc;es par des noyaux.
2o Le temps d'intégration optimum a c;té déterminé pour chacune des
fluorescences par rapport à une lame de cellules témoins et a été ensuite
utilisé pour
toutes les lames de cellules tumorales devant être analysées.
Par lame, 500 à 700 noyaux ont été s~omptés et une seule mesure des
fluorescences a été réalisëe. Les artefacts, les zones d'image n'ayant pas été
reconnues
comme correspondant à des zones occupées par un noyau et les noyaux dénués de
toute fluorescence verte et rouge ont été éliminés p;ar un opérateur. La
quantité de
noyaux ainsi exclus pouvant dans certains cas atteindre 20% en fonction de la
qualité
de l'hybridation, des résultats analysables ont pu être obtenus pour un
minimum de
400 noyaux pour chaque lame.
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Le logiciel d'analyse d'images DISCOVERY° a permis d'obtenir une
analyse de ces résultats sous Ia forme d'histogrammes. A titre d'illustration,
la Figure 1
montre les histogrammes obtenus pour une lame correspondant à l'un des
prélèvements biologiques (prélèvement 94T) et représentant le nombre de noyaux
en
fonction des intensités de fluorescence telles que mesurées pour ie bras lq
d'une part,
et le bras lp d'autre part.
Dans le cas des lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466, le rapport
(R~) entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras
1 q et au
bras lp a été calculé par deux méthodes différentes
t0 - une première méthode (ci-après "méthode 1") consistant à
déterminer pour chaque lame, au moyen du logiciel d'analyse d'images
DISCOVERY°, la moyenne des intensités de fluorescence verte (bras
1q) et la
moyenne des intensités de fluorescence rouge (bras lp) émises dans les noyaux
et à
calculer le rapport entre les moyennes ainsi obtenues ; et
- une deuxième méthode (ci-aprf;s "méthode 2") consistant à
déterminer le rapport entre (intensité de fluorescence verte (bras lq) et
(intensité de
fluorescence rouge (bras lp) émise dans chaque noyaui, à établir au moyen du
logiciel
EXCEL° commercialisé par la Société MICROSOFT', (histogramme
représentant Ie
nombre de noyaux en fonction de Ia valeur des rapports ainsi obtenus pour
l'ensemble
d'une lame et à calculer, à partir de cet histogramme, la. moyenne de ces
rapports.
Dans ie cas des prélëvements biologiques (tumeurs et
cytoponctions), seule la deuxième méthode de calcul .a été utilisée dans la
mesure où
les deux méthodes de calcul s'étant révélées conduire à des résultats
comparables
comme il sera démontré ci-après, cette deuxième méthode permet d'obtenir des
résultats plus rapidement.
Dans tous les cas, (existence d'un dé;>équilibre entre les bras lq et lp
dans les cellules tumorales analysées a été apprécié en caractérisant ces
cellules par un
indice de déséquilibre {I;) calculé comme suit
R
j~ ~ ________
Rr
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R~ représentant entre les intensités de fluorescence correspondant
réspectivement au
bras lq et au bras lp obtenu pour des lames de celllules lymphocytaires
traitées et
analysées exactement dans les mêmes conditions.
7) Mesure du bruit e fond
L'importance du bruit de fond a été appréciée en analysant des lames
de cellules tumorales n'ayant été soumises à aucune hybridation et en
comparant les
résultats obtenus avec ceux observés pour des lames de cellules tumorales
ayant fait
l'objet d'une hybridation in situ dans Ies conditions précédemment décrites.
Il a pu
ainsi être vérifié que le bruit de fond représente en moyenne moins de 20% des
1o signaux spécifiques et que, de ce fait, il n'interf'ere pas de manière
significative avec
les mesures de fluorescence.
8) Analyses cytogénéti~, ues de contrôle
A chaque fois qu'il a été possible d'obtenir, à partir des lignées
cellulaires ZR 75, BT 20 et H 4b6, et des prélèvf;ments biologiques, des lames
comprenant un nombre suffisant de cellule en métaphase, ces lames ont été
également
soumises à deux analyses cytogénétiques destinées à servir de contrôles : une
analyse
cytogénétique classique par la technique du R-banding d'une part, et une
analyse
cytogénétique moléculaire par la technique de la FISH sur chromosomes
métaphasiques d'autre part.
2o L'analyse cytogénétique classique a été réalisée conformément aux
méthodes décrites par DUTRILLAUX et COUTURIER (La Pratique de l'Analyse
Chromosomique, 1981, MASSON, ~?, 7-$7) tandis que (analyse cytogénétique
moléculaire a été, elle, réalisée selon le protocole décrit par MULERIS et al.
(Oncogene, 1994, ~, 2717-2722).
Ces analyses ont permis d'obsc;rver un certain nombre de
remaniements affectant les chromosomes 1 des cellules analysées - qui ne sont
pas
rapportés ici -, et d'établir pour chaque population cellulaire, à partir de
ces
observations, un indice de déséquilibre (.Im) calculé comme suit
Quantité de copies du bras lq (couleur verte)
jm - ________________________________________..___________________
Quantité de copies du bras Ip (c;ouleur rouge)
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9) Résu ts
a) Cellules tumorales des lignées ~ ell 'res
Les lignées cellulaires ZR 75, BT' 20 et H 466 représentent des
populations de cellules tumorales qui présentent le double avantage d'être
très
5 homogènes puisqu'issues d'un même clone, et de fournir, dans la mesure où on
les
maintient par une culture permanente, un nombre su;Ffisant de cellules en
métaphase
pour permettre un contrôle systématique des résulta ts obtenus avec le procédé
de
détection objet de l'Invention par les techniques de R-banding et de FISH sur
chromosomes métaphasiques.
1o C'est la raison pour laquelle les Inventeurs ont choisi d'utiliser ces
lignées cellulaires pour vérifier la fiabilité du procédé de détection
conforme à
l'Invention et tester l'influence, sur les résultats obtenus, du mode de
fixation des
cellules devant être analysées ainsi que de la méthode de calcul du rapport
entre les
intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras
lp.
is Le Tableau 1 ci-après présente
- d'une part, les indices de déséquilibre (I;) entre les bras Iq et ip
tels qu'obtenus pour les 3 lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466 par le
procédé de
détection conforme à flnvention et ce, en fonction du type de fixateur
[liquide de
CARNOY ou paraformaldéhyde (PBA)] utilisé lors de; la préparation des lames,
et en
2o fonction de la méthode [méthode 1 ou méthode 2] utilisée pour le calcul du
rapport
entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq
et au bras
lp, et
- d'autre part, les indices de déséquülibre (Im) entre les bras lq et lp
tels qu'obtenus pour ces mêmes lignées cellulaires par les techniques du R-
banding et
de FISH sur noyaux métaphasiques.
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TABLEAU l,
~t
Lignes
cellulaires
Fixation R-bahding
Mthode . FISH
1 Mthode
2
ZR 75 CARNOY 2,2 1,8 2 2
CARNOY 2,3 2,2
PFA 1,8 2,2
PFA 2 2,2
BT 20 CARNOY 1 I 1,5 1
CARNOY 1 l;l
PFA I 1
PFA 0,9 l,I
H 466 CARNOY 1,5 2 2 2
CARNOY 1,8 1,9
Ces résultats montrent que les indices de déséquilibre entre Ies bras
lq et lp obtenus par Ie procédé de détection confornie à l'Invention sont tout
à fait
concordants à ceux déterminés par les techniques de R-banding et de FISH sur
chromosomes métaphasiques et ce, indépendamment d.u mode de f xation des
cellules
analysées et de la méthode de calcul du rapport entrE: les intensités de
fluorescence
correspondant respectivement au bras 1q et au bras 1p.
lo b) Celllxles tumor,~~~s des prélèvements biologiaues
Le Tableau 2 ci-aprés présente
- d'une part, les indices de déséquilibre (I;) entre les bras 1q et lp
tels qu'obtenus pour Ies 13 tumeurs et les 6 ponctions par le procédé conforme
à
l'Invention, et
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- d'autre part, les indices de déséquilibre (jm) entre les bras lq et lp
tels que déterminés pour ces prélèvements biologiques par les techniques du
R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasidues, lorsqu'il a été possible
de
mettre en oeuvre ces deux techniques.
s TABLEAU 2
j; jm
Prlvements
biologiques
R-banding
FISH
84T 3,3 3 3
86T 2,1 1,5 ---
94T 1,8 2; 2
I SZT 1,4 1,3 ---
221 T 2,2 2'. 2
230T 1 1,3 ---
1007TR 1,3 1,5 1,5
1007TL 1,5 1,5 ---
IOIST 1,6 1,5 i,5
1024T 1 i ---
1040T 1,5 1,5 1,5
1 F 1 ~ __- __
2F 1,7 -__ ___
252T 1 1,3 ---
252F 1,1 ---
253F 1 1,.5 ---
256F i,5 >1 ---
I039T 1,3 1-1,5 ---
1039F 1,3 --_ ---
T = tumeur ; TR = tumeur du sein droit ; TL = tumeur du sein' gauche
F = cytoponction
Ces résultats mettent en évidence unE; excellente corrélation (r = 0,89
déterminé par méthode de régression linéaire au moyen du logiciel
STATVIEW°
commercialisé par la Société MICROSOFT) entre les indices de déséquilibre
obtenus
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par le procédé de détection conforme à flnvention et ceux .déterminés par la
technique
du R-banding sauf dans 4 cas (86T, 230T, 252T et Z:i3F) dans lesquels cette
dernière
technique apparaît ne pas avoir permis de détecter tous les bras lq et lp
présents en
raison de la complexité des caryotypes.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, /'invention ne se limite
nullement à ceux de ces modes de mise en oeuvre, de réalisation et
d'application qui
viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au
contraire toutes les
variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans
s'écarter du
cadre, ni de la portée, de la présente invention.
