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EXOSOMES MODIFIES ET UTILISATIONS
La présente invention concerne les domaines de la biologie et de
l'immunologie.
Elle est relative à des vésicules membranaires comportant des molécules,
notamment
antigéniques, de structure prédéterminée, et à leurs utilisations. Elle
concerne plus
particulièrement des vésicules comportant des molécules recombinantes du
complexe
majeur d'histocompatibilité, et leur utilisation comme immunogène ou comme
outil
diagnostique ou thérapeutique. L'invention est également relative à des
méthodes de
production de ces vésicules, des constructions génétiques, cellules et
compositions,
utilisables pour la mise en oeuvre des méthodes de (invention.
La spécificité de la reconnaissance antigénique est une caractéristique
majeure des
cellules du système immunitaire. Les lymphocytes B reconnaissent les antigènes
sous
forme native. Les lymphocytes T reconnaissent les complexes formés par
l'association de
peptides provenant de la dégradation d'antigènes avec des molécules du
Complexe Majeur
d'Histocompatibilité (CMH). Les peptides; dérivés des antigènes synthétisés
par les
cellules de l'organisme (antigènes tumoraux ou viraux), s'associent aux
molécules de
classe I du CMH qui sont reconnues par les lymphocytes T cytotoxiques. Les
peptides
dérivés d'antigènes exogènes s'associent aux molécules de classe II du CMH qui
sont
reconnues par les lymphocytes T auxiliaires. L'identification des peptides
présentés par
les molécules du CMH et reconnus par les lymphocytes T cytotoxiques (CD8) ou
auxiliaires (CD4) a été à l'origine de nouvelles stratégies thérapeutiques et
vaccinales.
Cette évolution des immunothérapies nécessite le développement de techniques
d'évaluation de la réponse immunitaire spécifique d'antigènes.
Les peptides antigéniques s'associent avec les molécules du CMH dans des
compartiments intracellulaires. Pour les molécules de classe II, ceux-ci sont
composés de
vésicules, contenues dans un granule plus large appartenant à la voie
endocytique (Peters
et al., Nature 349 (1991) 669). Leur fusion avec la membrane plasmique
aboutit, d'une
part, à l'expression de complexes peptide-CMH à la surface cellulaire et
d'autre part, à la
sécrétion de ces vésicules appelées exosomes.
Les travaux de Raposo et al. (J. Exp. Med. I 83 ( 1996) 1161 ) ont montré que
les
lymphocytes B sont capables de sécréter des vésicules exosomes, portant des
molécules
de classe II du CMH. En outre, Zitvogel et al. (Nature Medicine 4 ( 1998) 594)
ont mis en
évidence la production de vésicules membranaires particulières par les
cellules
dendritiques (désignées dexosomes), ayant des propriétés avantageuses. Ainsi,
ces
vésicules expriment des molécules des classes I et II du CMH, et sont
capables, après
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sensibilisation aux antigènes correspondants, de stimuler in vivo la
production de
lymphocytes T cytotoxiques et de provoquer la régression totale ou partielle
de tumeurs.
La présente invention concerne de nouvelles méthodes et compositions
utilisables
dans les domaines de la biologie et de (immunologie. Plus particulièrement, la
présente
invention décrit de nouvelles vésicules membranaires dont la composition a été
modifiée
de manière déterminée. En particulier, la présente invention décrit une
nouvelle méthode
permettant la production, à façon, de vésicules exprimant des molécules du
complexe
CMH de composition connue, éventuellement complexées à des peptide
antigéniques de
structure déterminée. La présente invention permet donc de modifier la
composition de
1o vésicules membranaires de façon contrôlée, et donc de créer des produits
particulièrement
avantageux sur le plan thérapeutique, diagnostique ou même expérimental.
Ainsi, les vésicules décrites jusqu'à présent comportent, dans le meilleur des
cas, les
molécules du CMH endogènes, c'est-à-dire les molécules du CMH exprimées par la
cellule dont elles sont issues. De ce fait, ces molécules sont de structure
variée, pas
toujours identifiées, et généralement multiples, selon le type HLA de
l'organisme dont
elles sont issues. Au contraire, la présente invention permet de produire des
vésicules
membranaires portant des molécules du CMH de composition définie. En outre,
les
vésicules de l'invention présentent (avantage d'être très riches en molécules
du CMH ainsi
déterminées, et d'offrir un puissant pouvoir immunogène.
La présente invention concerne notamment des vésicules membranaires comprenant
des molécules de structure prédéterminée, notamment des molécules du CMH de
structure
prédéterminée. La présente invention concerne en particulier des vésicules
membranaires
comprenant des complexes CMHpeptide de structure prédéterminée. La présente
invention concerne également une méthode de modification de la composition
d'une
vésicule membranaire comprenant l'introduction, dans une cellule productrice
d'une telle
vésicule, d'un acide nucléique comprenant une région hybride composée d'une
région
codante fusionnée à une région d'adressage, ou d'un acide nucléique codant
pour une
protéine ou polypeptide qui, seule ou associée à une ou plusieurs protéines,
est
naturellement adressée dans ces vésicules membranaires.
La présente invention concerne également des vésicules membranaires comprenant
des molécules antigéniques définies, ancrées dans la partie membranaire. De
telles
molécules peuvent être exposées à l'extérieur des vésicules ou, au contraire,
renfermées
dans la fraction cytosolique. La présente invention concerne encore des
vésicules
membranaires comprenant des molécules de structure prédéterminée, exposées à
leur
surface, permettant leur purification, notamment par des méthodes d'affinité.
La présente
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invention concerne aussi des vésicules membranaires telles définies ci-dessus
comprenant
en outre un marqueur. Un tel marqueur permet notamment la détection des
vésicules dans
un échantillon, par exemple leur suivi in vivo.
L'invention concerne également un procédé de préparation des vésicules
définies ci
dessus, ainsi que l'utilisation de ces vésicules. Ainsi, ces vésicules peuvent
être utilisées
comme immunogène, pour la préparation d'anticorps. De manière particulièrement
avantageuse, ces vésicules sont utilisées pour produire des anticorps
restreints au CMH,
c'est-à-dire, spécifique d'un complexe peptide-molécule du CMH.
Un premier objet de (invention réside plus particulièrement dans une vésicule
1o membranaire, caractérisée en ce qu'elle comporte une molécule recombinante
du
complexe majeur d'histocompatibilité.
Le terme vésicule membranaire désigne au sens de l'invention notamment toute
vésicule composée d'une bicouche lipidique renfermant une fraction
cytosolique. Ces
vésicules sont généralement produites par relargage, à partir de cellules, et
sont de ce fait
également désignées dans la présente demande par le terme "exosome". Les
vésicules
membranaires (ou exosomes) selon l'invention ont généralement un diamètre de
60 à 80
nm environ. En outre, ces vésicules portent, avantageusement, des protéines
membranaires qui sont dans la même orientation que dans la membrane plasmique
des
cellules dont elles sont issues.
2o La présente invention montre maintenant qu'il est possible de modifier la
composition des exosomes, de manière contrôlée et spécifique. Plus
particulièrement, la
présente invention montre qu'il est possible de produire des vésicules
membranaires
exprimant des complexes moléculaires recombinants de composition
(pré)déterminée.
Comme illustré plus loin dans la présente description, de telles vésicules
présentent des
2s propriétés particulièrement avantageuses, tant sur le plan thérapeutique
que diagnostique
et expérimental.
La présente invention découle tout d'abord de la sélection de populations
cellulaires particulières pour la production des vésicules membranaires. La
présente
invention résulte également de la mise en évidence qu'il est possible
d'introduire dans
30 ces cellules, par voie génétique, des molécules recombinantes, et que ces
molécules sont
ensuite exprimées de manière fonctionnelle et dense dans les exosomes.
L'un des premiers éléments de l'invention réside donc dans la définition et
l'identification de la population cellulaire utilisée pour la production des
vésicules
membranaires. Avantageusement, la cellule utilisée est une cellule comportant
des
3s vésicules internes de sécrétion, cultivable, modifiable génétiquement, et,
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préférentiellement, dont les vésicules internes peuvent être sécrétées sous
(effet d'une
stimulation externe. II s'agit essentiellement de cellules de mammifère, en
particulier de
cellules animales, mais également de cellules d'origine humaine. Par ailleurs,
il peut
s'agir de cultures primaires ou de lignées immortalisées.
De manière particulièrement avantageuse, les cellules de départ sont
essentiellement
dépourvues de molécules du CMH, c'est-à-dire n'expriment pas ou peu de
molécules du
CMH endogène. Cette caractéristique peut s'avérer très importante dans
certaines
applications, comme il sera illustré plus loin.
Différents types de cellules productrices d'exosomes ont été décrits dans la
l0 littérature, tels que par exemple les cellules dendritiques ou les
lymphocytes B.
Néanmoins, ces cellules sont généralement difficiles à transfecter et riches
en molécules
du CMH endogènes. De ce fait, bien qu'elles puissent être utilisées pour la
mise en
oeuvre de (invention, les vésicules de la présente invention sont plus
préférentiellement
susceptibles d'être obtenues à partir de cellules de mastocytes ou dérivées de
mastocytes.
Dans un mode de réalisation particulier, les vésicules membranaires selon
(invention sont préférentiellement préparées à partir de cellules de
mastocytes ou dérivées
de mastocytes.
Les mastocytes regroupent un ensemble de types cellulaires dérivés de
précurseurs
médullaires, résidant, après différenciation, dans des épithélia comme la
peau, le poumon,
l'intestin ou la rate (Smith et Weis, Immunology Today 17 ( 1996) 60). Ces
cellules se
caractérisent essentiellement par le fait que leur cytoplasme est
majoritairement constitué
de granules qui contiennent de (histamine, ainsi que de fhéparine ou des
protéases, et en
ce qu'elles expriment à leur surface des récepteurs de haute affinité pour les
immunoglobulines E (IgE). En outre, un autre avantage de l'utilisation de
mastocytes
selon l'invention réside dans la possibilité de déclencher (en particulier de
stimuler
fortement) fexocytose (i.e., la libération) des exosomes par différents
traitements. Ainsi,
il est possible de réguler la production des vésicules par traitement en
présence d'un
ionophore calcique ou, de manière plus physiologique, par la stimulation des
récepteurs
de haute affinité pour les IgE.
Ces cellules présentent des propriétés particulièrement avantageuses pour la
mise en
oeuvre de la présente invention, à savoir la présence de vésicules internes de
sécrétion, la
possibilité de les cultiver et d'induire une exocytose massive. En outre, il a
maintenant été
montré, comme décrit dans les exemples, que ces cellules peuvent également
être
modifiées génétiquement de manière stable, ce qui représente une propriété
particulièrement avantageuse pour la mise en oeuvre de la présente invention.
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Plus spécifiquement, les vésicules selon (invention ont un diamètre de 60 à 80
nm
environ, et sont produites à partir de cellules de mastocytes ou dérivées de
mastocytes.
Dans un mode préféré, les vésicules membranaires de l'invention sont
essentiellement dépourvues de molécules du CMH endogènes. L'absence de
molécules
5 endogènes du CMH (c'est-à-dire de molécules du CMH de la cellule productrice
des
vésicules) peut être mise en évidence au moyen d'anticorps spécifiques, par
les techniques
classiques. Elle peut également être mise en évidence par la sélectivité des
anticorps
obtenus par immunisation avec les vésicules. Comme indiqué dans les exemples,
les
vésicules de (invention sont, dans un mode particulièrement avantageux,
capables
1o d'induire, chez (animal, une production d'anticorps spécifiques des
molécules
recombinantes définies exprimées par elles, sans détection d'anticorps dirigés
contre les
cellules non modifiées génétîquement. Le terme "essentiellement" dépourvu
désigne le
fait que certaines molécules du CMH peuvent être présentes en quantités très
faibles,
difficilement détectables par les méthodes classiques, et sans interférence
notable sur la
spécificité antigénique des vésicules de (invention.
Des vésicules membranaires particulières selon l'invention sont plus
spécifiquement
caractérisées par les propriétés suivantes:
- elles sont essentiellement dépourvues de molécules du CMH endogènes,
- elles portent une ou des molécules recombinantes de structure définie, par
exemple
des complexes peptide-CMH recombinants, de composition définie.
De telles vésicules de fînvention sont avantageusement produites à partir de
cellules
dérivées de mastocytes, qui sont essentiellement dépourvues de molécules du
CMH
endogènes. A cet égard, il est connu que les mastocytes accumulent dans leur
granules de
sécrétion des molécules de classe II du CMH. En particulier, les mastocytes
sont capables
d'accumuler de manière préférentielle les complexes CMH-II-peptide dans des
compartiments intracellulaires multivésiculaires particuliers, les granules de
sécrétion
(Raposo et al., Mol. Biol. Cell 8 (1997) 2619). Ces cellules, prélevées chez
un
mammifère, comportent donc des molécules du CMH endogènes. De manière
particulièrement avantageuse, on utilise dans le cadre de la présente
invention des lignées
3o de cellules dérivées de mastocytes, essentiellement dépourvues de molécules
du CMH
endogènes. Différentes lignées de cellules mastocytaires ont été décrites dans
la
littérature. La présente demande montre maintenant que certaines de ces
lignées
possèdent des niveaux faibles de molécules du CMH, et sont donc
particulièrement
avantageuses pour la mise en oeuvre de l'invention. A titre illustratif, on
peut citer
notamment des lignées dérivées des cellules RBL (Rat Basophicil Leukemia),
déposées à
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fATCC sous le numéro CRL1378 (Kulczycki et al., J. Exp. Med. 139 (1974) 600),
la
lignée KU-812 (Butterfield et al., Leukemia Res. 12 (1988) 345), ou encore des
cellules
d'une lignée de mastocytes immatures humains, telle que la lignée HMC (Nilsson
et al.,
Scand. J. Immunol. 39 (1994) 489). Un exemple particulier de lignée est la
lignée RBL -
2H3 (Barsumian et al, Eur. J. Immunol. (1 1 (1 981) 317). Il est entendu que
toute autre
cellule présentant les propriétés énoncées ci-dessus peut être mise en oeuvre.
Dans le cadre de la présente invention, (expression "composition définie"
désigne
plus particulièrement le fait que les vésicules de (invention possèdent par
exemple une
grande spécificité antigénique et d'haplotype. Ainsi, les vésicules décrites
dans fart
1o antérieur expriment généralement des molécules du CMH d'haplotypes divers
et
inconnus. Au contraire, les vésicules préférées de (invention expriment des
molécules
recombinantes dont fhaplotype est prédéterminé de manière précise. Le terme
"recombinant" indique que la molécule résulte de l'expression, dans la cellule
productrice
des vésicules, d'un acide nucléique recombinant codant pour cette molécule.
Les
vésicules membranaires selon la présente invention sont donc plus
préférentiellement
produites à partir de cellules, établies en lignées, qui sont modifiées
génétiquement pour
exprimer des constituants de structure prédéterminée.
Comme indiqué ci-avant, les vésicules de l'invention expriment avantageusement
des molécules définies du CMH.
Les molécules du CMH humain se regroupent dans deux classes distinctes, les
molécules du CMH de classe I et les molécules du CMH de classe II.
Dans un mode particulier de réalisation, les vésicules selon l'invention
expriment
une ou plusieurs molécules recombinantes du complexe majeur
d'histocompatibilité de
classe II. A cet égard, les molécules du CMH humain de classe II sont
composées de deux
chaînes, une chaîne a et une chaîne Vii, la chaîne (3 conférant la spécificité
allélique au
complexe.
Dans une variante spécifique, les vésicules selon l'invention expriment plus
particulièrement une chaîne a recombinante d'une molécule du complexe majeur
d'histocompatibilité de classe Il. Dans une autre variante spécifique, les
vésicules selon
l'invention expriment plus particulièrement une chaîne a et une chaîne (3
recombinantes
d'une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II.
Différents types de molécules du CMH II humaines ont été identifiés,
caractérisés et
séquences (voir par exemple Immunogenetics 36 (1992) 135). On peut citer à
titre
préférentiel les molécules de type DR1 à DR13, notamment DR1, DR2, DR3, DR4,
DRS,
DR6 et DR7. L'ADN codant pour les DR humains, en particulier les DR1 à 13,
peut être
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aisément isolé à partir de cellules, banques ou plasmides par les techniques
classiques de
biologie moléculaire. Ces séquences ont notamment été décrites dans Bodmer et
al.
(Tissue antigens 44 (1994) 1). De préférence, les exosomes selon l'invention
expriment
donc une molécule du CMH de classe II comprenant une chaîne a et une chaîne (3
sélectionnées parmi les haplotypes DRl à DR13, encore plus préférentiellement
DR1 à
DR?.
Dans un exemple spécifique, (invention concerne toute vésicule membranaire
comprenant une chaîne a et/ou (3 recombinante d'une molécule du CMH-II
d'haplotype
DR1.
l0 Dans un autre mode de réalisation, les vésicules selon (invention expriment
une ou
plusieurs molécules recombinantes du complexe majeur d'histocompatibilité de
classe I.
Les molécules du CMH classe I sont composées également de deux chaînes, la
chaîne a
transmembranaire et polymorphique, et la (32-microglobuline, qui est constante
et soluble.
Chez (homme, trois locus génétiques codent pour la chaîne a , désignés A, B et
C. Dans
les molécules de CMH-I classiques, chaque locus A, B et C de la chaîne a est
soumis à
une variation allélique. Ainsi, on dénote les allèles Al, A2, A3, etc. A10,
B1, B7, B37,
B54, etc., CW3, CW6, etc. (voir par exemple Bodmer et ai. précitée et
Immunogenetics
36, 1992, précitée).
Préférentiellement, les exosomes de (invention expriment une chaîne a d'une
molécule du CMH-I classique, c'est-à-dire transmembranaire et polymorphique.
Encore
plus préférentiellement, il s'agit d'une chaîne a d'une molécule du CMH-I
d'allèle Al, A2
ou A3.
Dans un mode particulier de mise en oeuvre, les exosomes selon (invention
expriment une chaîne a d'une molécule du CMH-I non-classique, c'est-à-dire non-
polymorphique. En effet, par opposition aux CMH-I dits "classiques", soumis à
un
polymorphisme important, il existe chez l'homme des molécules du CMH-I "non-
classiques", qui sont essentiellement non polymorphiques. De telles molécules
ont par
exemple été décrites dans Bendelac et al. (Ann. Rev. Immunol. (1997) 535). Un
exemple préféré de CMH-1 non-classique selon l'invention est représenté par la
molécule
3o Cd 1.
Il est entendu que tout autre molécule du CMH-I humain peut être exprimée dans
le
cadre de la présente invention.
Dans un exemple spécifique, l'invention concerne donc toute vésicule
membranaire
comprenant une protéine recombinante d'une molécule du CMH-I.
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Dans une variante particulière, les vésicules de l'invention comportent
plusieurs
molécules du CMH de classe I et/ou II. Ainsi, une vésicule avantageuse
comporte par
exemple 2 molécules du CMH-II d'haplotypes différents, ou plus. Toute autre
combinaison de molécules du CMH est bien entendu possible, telle que par
exemple des
CMH-I et CMH-II.
Les vésicules de l'invention exprimant un ou plusieurs complexes du CMH
définis
sont particulièrement avantageuses puisqu'elles permettent de présenter un
peptide
antigénique donné, dans un contexte MHC défini. A cet égard, dans un mode plus
préféré
de (invention, les vésicules membranaires comportent un complexe entre un
peptide
1o défini et la molécule recombinante du complexe majeur d'histocompatibilité.
Les vésicules de (invention peuvent par ailleurs comporter une ou plusieurs
autres
molécules d'intérêt, hétérologues, en plus ou à la place des molécules du CMH
mentionnées ci-dessus. A cet égard, dans une variante particulière,
l'invention concerne
des vésicules membranaires produites à partir de cellules de mastocytes ou
dérivées de
mastocytes, caractérisées en ce qu'elles comportent une ou des molécules
hétérologues
d'intérêt. Le terme cellule "dérivée" de mastocytes désigne des lignées
transformées et/ou
immortalisées et/ou obtenues à partir de cellules de mastocytes ou de
basophiles et
présentant des propriétés de cellules de mastocytes (accumulation de vésicules
internes de
sécrétion). Le terme "hétérologue" indique que la molécule d'intérêt n'est pas
présente,
sous cette forme, dans les exosomes de l'invention à l'état naturel.
Les molécules d'intérêt portées par ou contenues dans les exosomes de
l'invention
peuvent être toute protéine, polypeptide, peptide, acide nucléique, lipide,
ainsi que toute
substance d'intérêt (de nature chimique, biologique ou synthétique). Ces
molécules
peuvent être de nature recombinante, et être introduites dans la cellule
productrice ou
directement dans/sur les exosomes. Des types plus particulièrement préférés de
molécules d'intérêt sont notamment des molécules du CMH, des antigènes
{entiers ou
sous forme de peptides), des ligands de récepteurs, des récepteurs
(spécifiques) de
ligands, des acides nucléiques, des produits pharmacologiques, des marqueurs
ou encore
des peptides ou protéines permettant une purification des vésicules.
3o Comme antigène, on peut citer plus particulièrement toute protéine,
notamment
cytoplasmique, d'origine virale ou tumorale. A titre d'exemples préférés de
protéines
d'origine virale, on peut citer notamment toute protéine cytoplasmique ou
membranaire
exprimée par les virus EBV, CMV, VIH, rougeole, hépatite, etc. Il s'agit plus
préférentiellement des protéines cytoplasmiques, c'est-à-dire essentiellement
invisibles au
système immunitaire dans le processus d'infection classique, et donc
faiblement
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immunogènes dans les conditions naturelles ou également de protéines ou
fragments de
protéines membranaires. A titre d'exemples préférés de protéines d'origine
tumorale, on
peut citer notamment les protéines p53 (sauvage ou toute forme mutée présente
dans une
tumeur), MAGE (notamment MAGE l, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5 et
MAGE 6), MART (notamment MART 1 ), la Gp 100, les protéines ras (p21 sauvage
ou
mutées), etc. Il est entendu que toute autre protéine d'intérêt peut être
exprimée dans ou à
la surface des exosomes de (invention, en suivant l'enseignement de la
présente demande.
A cet égard, les molécules antigéniques recombinantes peuvent être présentes
soit à
la surface des vésicules (exposées), soit à (intérieur des vésicules. En
effet, de manière
lo particulièrement surprenante, les inventeurs ont montré que des vésicules
de (invention
contenant, dans leur cytosol, un antigène recombinant (notamment p53) étaient
capables
d'induire, chez (animal, une production très élevée d'anticorps dirigés contre
cet antigène.
Parmi les récepteurs de ligands, on peut citer, de manière générale, tout
récepteur de
ligand naturel ou issu de manipulations génétiques. En particulier, il peut
s'agir de tout
récepteur d'hormone, facteur de croissance, lymphokine, facteur trophique,
antigène, etc.
On peut citer plus particulièrement les récepteurs des interleukines ILI à
IL15, le
récepteur de l'hormone de croissance, ou le récepteur de facteurs de
stimulation de
colonies de granulocytes et/ou macrophages (G-CSF, GM-CSF, CSF, etc). Un
exemple
particulier de récepteur de ligand est composé d'un anticorps simple-chaîne
(ScFv), qui
permet (interaction avec un ligand spécifique. Un autre exemple
particulièrement
avantageux au sens de (invention est représenté par le récepteur à (antigène
des
lymphocytes T (TcR). Des exosomes de l'invention exprimant à leur surface un
ou
plusieurs TcR définis constituent des outils d'analyse et de diagnostic
particulièrement
avantageux, comme iI sera détaillé plus loin.
Comme produit pharmaceutique, on peut citer toute substance active, de nature
chimique, telle que par exemple des produits pharmaceutiques préparés par les
techniques
de chimie conventionnelles. On peut également citer toute protéine,
polypeptide ou
peptide ayant une activité biologique, tel que par exemple une toxine, une
hormone, une
cytokine, un facteur de croissance, une enzyme, un suppresseur de tumeur, etc.
L'acide nucléique peut être tout ADN ou ARN codant pour une protéine,
polypeptide ou peptide pharmacologique tel que mentionné ci-dessus, ainsi que
tout autre
acide nucléique présentant une propriété particulière (antisens, antigène,
promoteur,
répresseur, site de liaison d'un facteur transcriptionnel, etc.). Il peut
s'agir d'un
oligonucléotide, d'une phase codante, d'un chromosome artificiel, etc.
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t0
Les vésicules de l'invention portant un récepteur de ligand peuvent être
utilisées
pour la détection de toute interaction de type récepteur-ligand, en
particulier de faible
affinité, dans tout échantillon biologique, comme il sera expliqué plus en
détails dans la
suite du texte. D'autre part, de telles vésicules peuvent également être
utilisées pour
véhiculer les substances d'intérêt (protéine, peptide, nucléique acide,
substance chimique,
etc.) vers des cellules. Ainsi, les exosomes de (invention peuvent être
utilisés, de manière
générale, pour le transport et le transfert de toute molécule dans des
cellules, in vitro, ex
vivo ou in vivo. L'invention concerne donc toute vésicule telle que décrite ci-
avant
comprenant une molécule hétérologue d'intérêt, utilisable comme vecteur de
transfert de
ladite molécule dans une cellule.
Dans un mode plus préféré, les exosomes de (invention sont utilisés pour le
transfert orienté de substances d'intérêt vers des populations cellulaires
sélectionnées.
Ainsi, il est possible de préparer des vésicules de l'invention comportant une
substance
d'intérêt (une toxine, une hormone, une cytokine, un acide nucléique
recombinant, etc.) et
exprimant à sa surface un récepteur de ligand ou un ligand de récepteur, et de
mettre en
contact lesdites vésicules avec des cellules exprimant le ligand ou le
récepteur
correspondant. Cette approche permet donc un transfert ciblé et efficace.
A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans une vésicule
telle que
définie ci-avant, caractérisée en ce qu'elle exprime un récepteur de ligand et
en ce qu'elle
2o comporte une molécule hétérologue d'intérêt.
Les vésicules de l'invention peuvent en outre comporter un peptide ou une
protéine
recombinant permettant une purification des vésicules. Ainsi, (invention
décrit en effet la
possibilité de modifier génétiquement la composition des exosomes, et donc de
Leur faire
exprimer une molécule "étiquette" particulière, permettant sa purification. En
particulier,
il est possible d'obtenir un exosome exposant un peptide de structure
particulière, qui peut
être aisément détecté et capté par une molécule réceptrice. Dans un exemple
particulier,
un exosome est produit comportant, dans sa structure, une molécule peptidique
comprenant le motif His6 (i.e., 6 résidus histidine consécutifs). La présence
d'un tel
résidu à Ia surface des exosomes permet leur purification aisée sur support
fonctionnalisé
avec du nickel. D'autres peptides recombinants de ce type peuvent être
utilisés, comme
par exemple le tag c-myc, VSV ou HA.
Enfin, dans une variante particulière, les vésicule selon l'invention
comportent en
outre un marqueur. Le marqueur peut être de nature différente (enzymatique,
fluorescent,
radioactif, etc.) et présent dans la vésicule ou à sa surface. Un marquage
préféré est non-
radioactif, comme par exemple un marquage fluorescent. Plus
préférentiellement, le
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marquage utilisé est un fluorochrome ou une enzyme à substrat chromogénique.
Le
marquage peut être réalisé directement sur la cellule productrice, ou bien sur
les exosomes
produits.
L'invention concerne également toute composition comprenant une ou plusieurs
vésicules membranaires telles que définies ci-dessus. Les compositions de
(invention
peuvent en outre comprendre une pluralité de vésicules membranaires telles que
définies
ci-dessus, portant des molécules recombinantes différentes. En particulier,
une
composition selon (invention peut comprendre des vésicules membranaires telles
que
définies ci-dessus, portant des molécules recombinantes du CMH d'haplotypes
différents
1o en association avec un même peptide antigénique. Il peut s'agir également
de
compositions comprenant des vésicules membranaires telles que définies ci-
dessus,
portant des molécules recombinantes du CMH d'un même haplotype, associées à
différents peptides antigéniques, par exemple. D'autres combinaisons de
vésicules selon
finventîon sont bien entendu possibles.
Les compositions de l'invention comprennent généralement un véhicule tel
qu'une
solution tampon, saline, physiologique, etc., permettant de préserver la
structure des
vésicules. Elles peuvent en outre comprendre tout agent stabilisant, tensio-
actif, etc., de
préférence compatible avec un usage biologique (in vitro ou in vivo). Ces
compositions
peuvent être conditionnées dans tout dispositif approprié, tel que tube,
flacon, ampoule,
2o flasque, poche, etc, et stockées à 4°C ou à -20°C, par
exemple. Des compositions
typiques selon l'invention comprennent de 5 à SOOpg d'exosomes, par exemple de
5 à
200 pg.
Les vésicules de l'invention sont obtenues à partir de cellules génétiquement
modifiées. Comme indiqué plus haut, la présente invention résulte en effet de
la mise en
évidence qu'il est possible d'introduire dans certaines cellules, par voie
génétique, des
molécules recombinantes, et que ces molécules sont ensuite exprimées de
manière
fonctionnelle et dense dans les exosomes.
Pour la production des vésicules de l'invention portant des molécules
recombinantes
de composition déterminée, un première étape consiste donc à introduire, dans
une cellule
productrice de vésicules, telle que définie ci-dessus, les constructions
génétiques
permettant l'expression de la (ou des) molécules) recombinantes
sélectionnée(s).
Les constructions génétiques utilisées pour la production des cellules peuvent
comprendre, de manière générale, une région codante placée sous le contrôle
d'un
promoteur fonctionnel dans la cellule utilisée (cassette d'expression).
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Généralement, le promoteur utilisé est donc un promoteur fonctionnel dans les
cellules mammifères. Il peut s'agir d'un promoteur viral, cellulaire ou
bactérien, par
exemple. Il peut s'agir d'un promoteur constitutif ou régulé, de préférence
permettant une
expression à des niveaux élevés de protéine dans la cellule. Parmi les
promoteurs
utilisables, on peut citer à titre d'exemple le promoteur précoce immédiat du
cytomégalovirus (CMV), le promoteur du SV40, le promoteur du gène de la
thymidine
kinase, notamment HSV-1 TK, le promoteur du LTR d'un rétrovirus, notamment LTR
RSV, ou encore un promoteur endogène fort des cellules de mastocytes. Un mode
de
réalisation particulièrement préféré comprend l'utilisation du promoteur SRa,
tel que
i0 décrit plus en détails dans les exemples.
La région codante utilisée est généralement composée d'un ADN, complémentaire,
génomique ou synthétique (par exemple modifié pour comporter certains introns
ou pour
avoir un usage de codons préférentiel). Plus généralement, il s'agit d'un
ADNc. Cet acide
nucléique peut être obtenu par toutes les techniques connues de la biologie
moléculaire, et
notamment par criblage de banque, amplification, synthèse, coupures et
ligatures
enzymatiques, etc.
Selon le type de région codante utilisée, certaines modifications peuvent par
ailleurs
être apportées à la construction. Ainsi, il peut être particulièrement
avantageux dans
certains cas d'introduire dans la région codante une séquence de
signalisation, permettant
d'adresser le produit d'expression dans un compartiment particulier de la
cellule, en
particulier vers un compartiment membranaire (interne, plasmique, etc.). Ce
signal
d'adressage peut être positionné en amont (5'), en aval (3') ou à l'intérieur
de la région
codante. Préférentiellement, le signal d'adressage est positionné en 3' de la
région
codante, plus particulièrement dans sa région cytoplasmique, et en phase de
lecture avec
la région codante. L'emploi d'un signal d'adressage peut être particulièrement
utile pour
favoriser l'accumulation du produit d'expression dans ou à la surface d'un
compartiment
intracellulaire donné, notamment dans ou à la surface des vésicules de
sécrétion. Ce
mode de mise en oeuvre est particulièrement adapté à l'expression d'une
molécule telle
qu'un peptide étiquette, un antigène, une molécule du CMH-I ou encore un
ligand de
récepteur. En revanche, de manière particulièrement avantageuse, la présente
demande
montre que des molécules du CMH-II humaines peuvent être exprimées
directement, sans
ajout de signal particulier, dans des vésicules sécrétrices de cellules de
mastocytes, même
xénogéniques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est possible en
particulier
d'utiliser comme signal d'adressage un fragment d'acide nucléique ayant la
séquence d'une
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partie des gènes suivants : Lampl, CD63, LIMPII, Cdlc, FcyR. Ces gènes
comportent en
effet des régions codant pour des signaux d'adressage de la protéine vers les
compartiments de fendosome des cellules (Sandoval et Bakke, Trends in Cell
Biol. 4
(1994) 292). Un signal d'adressage utilisable dans la présente invention
répond par
exemple à la formule G-Y-X-X-I, dans laquelle X représente tout résidu d'acide
aminé.
Un signal d'adressage particulièrement adapté à la présente invention est
composé du
peptide signal de la protéine LAMP 1 de séquence SHAGYQTI. Un autre type de
signai
permettant l'adressage vers les compartiments membranaires, comprend tout ou
une partie
d'une région transmembranaire de protéine.
L'adressage du produit d'expression vers les compartiments cellulaires
permettant
la présence de ce produit dans les exosomes peut également être réalisé en
fusionnant la
région codante à tout ou partie d'une région codant une protéine membranaire
ou trans-
membranaire, notamment une protéine membranaire ou trans-membranaire exprimée
dans les exosomes. Dans ce contexte, un mode particulier de réalisation de
l'invention
comprend l'introduction d'un produit recombinant dans un exosome par
expression de ce
produit dans la cellule productrice, sous forme d'une fusion avec une protéine
membranaire ou trans-membranaire. Un exemple particulier de telle protéine est
par
exemple la protéine recombinante du CMH introduite dans la cellule
productrice,
notamment une chaîne beta, de préférence une chaîne béta du CMH de classe II.
Ainsi,
les résultats présentés dans les exemples montrent qu'une telle fusion permet
d'accumuler efficacement tout polypeptide d'intérêt dans un exosome, sans
altérer ses
propriétés ni celles de la molécule du CMH. Cet aspect de la présente
invention constitue
un nouveau concept de vectorisation de produits recombinants dans un exosome,
et peut
être appliqué à tout produit recombinant, introduit dans tout type d'exosome.
A cet égard,
l'invention concerne donc tout exosome comprenant une molécule recombinante de
fusion entre un polypeptide d'intérêt et un signal d'adressage. Il peut s'agir
d'un exosome
produit à partir d'une cellule de mastocyte, dendritique, tumorale ou
également d'un
lymphocyte B, par exemple. Le polypeptide d'intérêt peut être un antigène (ou
fragment
d'antigène) ou tout autre produit biologique d'intérêt. Le signal d'adressage
peut être tout
3o peptide, polypeptide ou protéine ayant la propriété de diriger le produit
de fusion vers un
comparüment membranaire, notamment intracellulaire, tel que défini ci-avant.
Il s'agit
avantageusement d'une chaîne d'une molécule du CMH.
Dans un mode particulier de l'invention, ces vésicules sont produites par
introduction dans la cellule productrice d'un acide nucléique chimère, codant
une
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protéine de fusion comprenant le produit recombinant lié à l'extrémité C-
terminale d'une
chaîne béta d'une molécule du CMH, de préférence du CMH de classe II.
Dans les constructions utilisées, la région codante est liée de manière
fonctionnelle
au promoteur, de manière à permettre son expression dans les cellules.
Par ailleurs, les constructions de (invention peuvent avantageusement
comprendre
une région, placée en 3' de la région codante, qui spécifie un signal de fin
de transcription
(région polyA par exemple).
Les cassettes d'expression selon (invention font avantageusement partie d'un
vecteur, de type plasmidique, viral, épisomal, chromosome artificiel, etc. A
cet égard, un
l0 tel vecteur comprend avantageusement un système permettant la sélection des
cellules le
contenant. En particulier, les vecteurs comprennent avantageusement un gène
codant
pour un produit conférant une résistance à un agent, par exemple à un
antibiotique
(ampicilline, hygromycine, généticine, néomycine, zéocine, etc.). Dans un mode
particulier de mise en oeuvre, chaque vecteur comporte une seule cassette
d'expression
telle que décrite ci-avant. Dans ce mode de réalisation, les cellules sont
donc modifiées
par introduction de plusieurs vecteurs, lorsque plusieurs molécules sont à
exprimer dans
les vésicules (par exemple une chaîne a et une chaîne (3 de CMH-II). Dans ce
mode de
réalisation chaque type de vecteur utilisé comprend avantageusement un système
de
sélection différent, permettant de sélectionner aisément de multiples
transfectants.
Dans un autre mode de réalisation, un vecteur peut comprendre plusieurs
cassettes
d'expression telles que définies ci-avant, par exemple l'une codant une chaîne
a et l'autre,
une chaîne (3 de CMH-II.
Les vecteurs utilisés sont préférentiellement de type plasmidique, et
comportent par
exemple une origine de réplication bactérienne permettant leur manipulation et
leur
production aisées in vitro. De tels vecteurs peuvent notamment être construits
à partir de
plasmides de type pBR322, pUC, pBS, pSR, etc.
Pour la production d'exosomes selon l'invention, des cellules modifiées
génétiquement sont donc mises en oeuvre, exprimant les molécules
sélectionnées. Ces
cellules modifiées génétiquement sont préparées par introduction, dans des
cellules
choisies comme défini ci-dessus, des constructions génétiques définies ci-
avant.
L'introduction des constructions génétiques peut être réalisée de différentes
façons,
essentiellement selon le type de cellule utilisé. Ainsi, le transfert des
acides nucléiques
peut être réalisé par toute technique connue telle que électroporation,
précipitation au
phosphate de calcium, agent chimique (peptide cationique, polymères, lipides,
etc.),
balistique, etc. Dans le cas de vecteurs viraux, le transfert est généralement
obtenu par
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simple infection des cellules. Les quantités de vecteur utilisées peuvent par
ailleurs être
adaptées par (homme du métier en fonction du type de transfert et des cellules
utilisées.
A cet égard, une méthode particulièrement efficace pour l'introduction des
acides
nucléiques dans les mastocytes comprend félectroporation des vecteurs.
5 D'autre part, lorsque plusieurs constructions (vecteurs) doivent être
introduites dans
les cellules, celles-ci peuvent être transférées simultanément ou de manière
séquentielle.
Après transfert, les cellules ayant effectivement incorporé les acides
nucléiques sont
sélectionnées et clonées sur la base de leur résistance à un composé (e.g.,
antibiotique)
grâce au gène de résistance présent dans l'ADN ayant été transféré. Ces
cellules peuvent
lo être utilisées extemporanément pour la production d'exosomes de (invention,
ou bien être
stockées en vue d'une utilisation ultérieure. A cet égard, les cellules
peuvent être
conservées à 4°C dans un milieu de conditionnement usuel pendant une
période suffisante
pour permettre différents lots de production d'exosomes. Les cellules peuvent
également
être conservées sous forme congelée (par exemple dans f azote), en vue
d'utilisations
15 ultérieures. A cet égard, il est ainsi possible selon la présente invention
de constituer des
banques de cellules productrices d'exosomes ayant des propriétés
particulières. En
particulier, il est possible selon (invention de constituer des banques de
cellules
exprimant les principaux types HLA des molécules de classe II du CMH. De ce
fait, il est
alors possible, selon les applications envisagées et selon le type HLA du
sujet, de choisir
2o dans la banque les cellules productrices des molécules du CMH
correspondant, sans
devoir reconstruire ces cellules au cas par cas.
A cet égard, un objet particulier de l'invention réside dans une cellule
productrice
d'exosomes telle que définie ci-avant, en particulier une cellule de
mastocyte,
caractérisée en ce qu'elle comporte un acide nucléique recombinant codant pour
une
molécule du complexe majeur d'histocompatibilité. L'invention concerne aussi
toute
cellule productrice d'exosomes telle que définie ci-avant, en particulier une
cellule de
mastocyte, caractérisée en ce qu'elle comporte un acide nucléique recombinant
codant
pour une chaîne invariante li, notamment modifiée pour comprendre un peptide
antigénique à la place de la région CLIP, ou pour un peptide permettant la
purification
de fexosome.
Plus particulièrement, il s'agit d'une cellule mammifère, notamment d'origine
animale, en particulier de rongeur. Il peut également s'agir d'une cellule
d'origine
humaine. Dans un mode plus particulier, il s'agit d'une lignée cellulaire
dérivée d'un
mastocyte, telle que notamment une lignée mastocytaire d'une leucémie à
basophile. A
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titre d'exemple particulier, on peut citer les cellules de la lignée RBL,
notamment RBL-
2H3, les cellules de la lignée KU-812 ou HMC-1.
Préférentiellement, (acide nucléique recombinant code pour une chaîne a et/ou
~i
d'une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classe Il et/ou pour
une
molécule du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I. Dans un autre
mode de
réalisation, la cellule comprend plusieurs acides nucléiques codant
respectivement pour
une chaîne a et une chaîne ~i d'une molécule du complexe majeur
d'histocompatibilité de
classe II.
La présente invention permet de produire, de manière simple et reproductible,
des
quantités importantes d'exosomes de composition connue. Pour la production des
exosomes, les cellules modifiées génétiquement décrites ci-dessus sont
cultivées dans un
milieu approprié, et les exosomes sont récupérés.
Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans un procédé de production
d'un
exosome comportant une molécule recombinante définie, comprenant les étapes
1s suivantes:
a) la culture d'une cellule de mastocyte ou dérivée de mastocyte comportant un
acide nucléique recombinant codant pour ladite molécule recombinante définie,
c) la récupération des exosomes produits par lesdites cellules, ces exosomes
comprenant ladite molécule recombinante définie.
Avantageusement, le procédé selon (invention comprend en outre une étape
intermédiaire b) au cours de laquelle les cellules sont stimulées pour induire
et/ou
augmenter la sécrétion des exosomes.
D'autre part, le procédé de (invention permet la production de vésicules dans
lesquelles la molécule recombinante définie est exposée à l'extérieur de
fexosome, ou
est incluse, en partie ou en totalité, dans la fraction cytosolique de
fexosome.
Comme indiqué ci-avant, dans le procédé de l'invention, la molécule
recombinante
peut être, par exemple, une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité,
une
molécule antigénique, un ligand de récepteur, un récepteur de ligand ou un
peptide de
purification, ou tout autre polypeptide d'intérêt. En outre, comme expliqué ci-
avant,
3o dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique utilisé dans le
procédé comprend en
outre une région codant pour un signal d'adressage vers les compartiments
membranaires, notamment les vésicules internes de sécrétion, du mastocyte.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans un procédé de production
d'une
vésicule membranaire, comprenant
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- la culture d'une cellule productrice d'exosomes, comprenant un acide
nucléique
recombinant codant pour une molécule recombinante du CMH, en particulier de
classe I
ou II, notamment humaine, et
- la récupération des exosomes produits, le cas échéant après stimulation de
fexocytose.
A cet égard, (invention concerne également un procédé de préparation d'un
exosome comportant un complexe peptide-CMH de composition définie, caractérisé
en
ce qu'il comprend:
- la culture d'une celiule productrice d'exosomes comportant un ou plusieurs
acides
lo nucléiques recombinants codant pour une molécule recombinante définie du
CMH,
- la stimulation des cellules pour induire une libération des exosomes,
- la récupération des exosomes produits par lesdites cellules, ces exosomes
exprimant à leur surface ladite molécule recornbinante définie du CMH, et,
- la mise en contact des exosomes avec le ou les peptides.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, le ou les peptides utilisés peuvent
être des
peptides de synthèse, des mélanges de peptides, des extraits cellulaires, par
exemple un
mélange de peptides extrait de cellules tumorales. Le ou les peptides peuvent
être sous
forme isolée, ou purifiée ou, comme indiqué cidessus, de mélange. Par
ailleurs, après
mise en contact des exosomes avec les peptides, les exosomes peuvent être
isolés ou
purifiés selon les méthodes conventionnelles.
Dans une autre variante, l'invention concerne un procédé de préparation d'un
exosome comportant un complexe peptide-CMH de composition définie, caractérisé
en
ce qu'il comprend:
- la culture d'une cellule productrice d'exosomes comportant un ou plusieurs
acides
nucléiques recombinants codant pour une molécule recombinante définie du CMH
et un
acide nucléique comprenant une région codant pour un peptide recombinant
défini,
- la stimulation des cellules pour induire une libération des exosomes,
- la récupération des exosomes prôduits par lesdites cellules, ces exosomes
exprimant à leur surface ladite molécule recombinante définie du CMH associée
audit
3o peptlde recombinant.
Plus particulièrement, dans ce procédé, l'acide nucléique comprenant une
région
codant pour le peptide recombinant code pour un dérivé de la chaîne invariante
li, dans
laquelle la région CLIP a été délétée et substituée par ledit peptide. Ce mode
de
réalisation assure une grande spécificité dans la formation du complexe
peptide-CMH.
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Dans une autre variante, l'acide nucléique comprend une région codant pour le
peptide et une région d'adressage vers les compartiments intracellulaires. En
outre,
(acide nucléique peut comprendre plusieurs régions codant pour un même ou pour
des
peptides antigéniques différents.
Préférentiellement, les cellules productrices utilisées dans le procédé sont
des
cellules de mastocyte ou dérivées de mastocyte. Dans ce mode de réalisation,
la
stimulation des cellules pour induire une libération des exosomes est
préférentiellement
réalisée au moyen d'un ou plusieurs ionophores calciques, ou par des IgE.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les cellules
productrices
lo utilisées dans le procédé sont essentiellement dépourvues de molécules du
CMH
endogène.
Un autre objet de (invention concerne un procédé de modification de la
composition d'un exosome, comprenant
- l'introduction dans une cellule productrice d'exosomes d'un acide nucléique
codant
pour une molécule définie, liée à un signal d'adressage dans les compartiments
membranaires, et
- la production d'exosomes à partir de ladite cellule.
Ce procédé permet avantageusement de produire des exosomes exprimant des
molécules recombinantes définies et variées.
Les exosomes de (invention peuvent être utilisés dans de nombreuses
applications,
telles que par exemple comme outils d'analyse, de diagnostique, thérapeutique
ou
expérimental. Ainsi, ils peuvent être utilisés pour l'analyse de la réponse T
antigène
spécifique ; pour l'étude des interactions récepteur/ligand de faible affinité
où une
multimérisation des différents partenaires est nécessaire afin d'augmenter
l'avidité de ces
complexes moléculaires, dépassant ainsi le champs des applications
immunologiques ;
sur le plan diagnostique ou thérapeutique, ainsi que pour la production
d'anticorps
particuliers, notamment d'anticorps restreints au MHC. Ces différentes
applications et
d'autres sont illustrées ci-après.
a) Utilisation pour la production d'anticorps
L'une des premières applications des exosomes de l'invention réside dans la
production d'anticorps. En effet, en raison de la composition définie des
exosomes de
(invention, il est possible de produire des anticorps de spécificité
déterminée. En outre,
comme le montrent les exemples, les exosomes de l'invention ont des propriétés
immunogènes très fortes, notamment en raison de la densité élevée des
complexes
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CMH-peptide à leur surface, de leur fonctionnalité, et de leur présentation
efficace au
système immunitaire.
Les anticorps ainsi produits peuvent être des polyclonaux ou des monoclonaux.
Ils
peuvent être préparés par les techniques classiques de l'immunologie,
comprenant
(immunisation d'animaux, et le prélèvement des sérums (anticorps polygonaux)
et/ou la
fusion des lymphocytes spléniques avec des cellules de myélomes non
productrices
d'immunoglobulines (pour générer des hybridomes producteurs de monoclonaux).
Un autre objet de l'invention concerne donc des anticorps ou fragments
d'anticorps
produits par immunisation avec des exosomes tels que décrits ci-avant. Les
fragments
d'anticorps peuvent être par exemple des Fab, (Fab')2 , ScFv, etc., et, plus
généralement,
tout fragment conservant la spécificité de l'anticorps. En particulier,
(invention
concerne un procédé de préparation d'anticorps, comprenant l'immunisation d'un
animal
avec un exosome tel que décrit ci-avant, portant un complexe peptide-CMH
défini et la
récupération des anticorps et/ou des cellules produisant des anticorps ou
impliquées dans
la réponse immunitaire. Avantageusement, le procédé de (invention permet la
production d'anticorps monoclonaux, notamment restreints au CMH, c'est-à-dire
spécifiques de (association CMH-peptide. De préférence, dans le procédé de
l'invention, on utilise des exosomes essentiellement dépourvus de molécules
CMH
endogènes, qui expriment des complexes recombinants CMH-peptide, et qui sont
produits à partir d'une cellule autologue vis-à-vis de l'animal chez lequel
l'immunisation
est réalisée. Ainsi, comme montré dans les exemples, cette méthode permet
d'obtenir,
sans besoin d'adjuvant, des anticorps puissants dirigés contre le peptide,
notamment des
anticorps restreints au CMH, c'est-à-dire spécifiques du peptide dans sa
conformation
associée à la molécule définie du CMH. De tels anticorps sont particulièrement
avantageux sur le plan expérimental, diagnostique et thérapeutique. En outre,
les
anticorps selon l'invention peuvent être marqués par toute technique connue
(enzymatique, fluorescente, radioactive, etc), selon les méthodes connues de
(homme du
Métier.
b) Applications diagnostiques
Les exosomes et anticorps de l'invention possèdent des propriétés avantageuses
pour une utilisation diagnostique.
Ainsi, les anticorps ou fragments d'anticorps obtenus selon l'invention
peuvent être
utilisés dans toute application diagnostique, pour la détection, dans un
échantillon
biologique, de la présence d'antigènes spécifiques correspondants, grâce à
l'emploi de
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wo aonsoo~ Pc'r~99ioi69~
différentes techniques classiques, telles que la cytométrie de flux,
fimmunohistochimie
ou fimmunofluorescence, par exemple. Dans le cas particulier des anticorps
restreints
au MHC, ils permettent avantageusement la détection des complexes CMH-peptides
correspondants, et donc le diagnostique de pathologies correspondantes. Ces
anticorps
5 peuvent notamment être appliqués au diagnostic de pathologies impliquant un
défaut de
réponse ou une réponse inappropriée du système immunitaire afin de déterminer
(expression d'un antigène, préalablement défini, sous une forme reconnaissable
par des
lymphocytes T. Par exemple et de manière non exhaustive, on peut envisager le
diagnostic:
lo - de pathologies tumorales où la détection sur les prélèvements tumoraux de
différents peptides issus de protéines comme p53, Her2, MAGE, BAGE, Mart, GP
100
associées aux molécules de classe I du CMH peut permettre le phénotypage de la
tumeur
et faciliter le choix d'une thérapeutique ;
- de maladies virales à un stade préinfectieux ou latent, où le virion ne peut
être
15 détecté (hépatite, les infection par le VIH, le CMV et d'autres virus)
- de maladies autoimmunes comme la Sclérose en plaque, le Diabète autoimmun,
la
Thyroidite autoimmune, la Polyarthrite rhumatdide, le Lupus érythémateux
disséminé,
où la détection de molécules du CMH présentant des peptides dérivés d'auto-
antigènes
peut constituer le signe avant coureur d'une poussée évolutive de la maladie.
20 Les exosomes selon (invention sont également utilisables pour la détection
de
partenaires spécifiques d'une molécule protéique dans un échantillon
biologique. Ainsi,
les exosomes de l'invention portant des complexes CMH-peptides sont
utilisables pour
détecter des lymphocytes T spécifiques de ces complexes dans des échantillons
biologiques, par exemple dans différentes situations pathologiques, notamment
dans les
pathologies décrites ci-dessus. A cet égard, les exosomes peuvent être marqués
par tout
systéme de marquage connu de (homme du métier (enzymatique, fluorecent,
radioactif,
etc.) pour permettre leur détection dans des échantillons biologiques.
Dans un mode particulier, (invention réside donc dans (utilisation d'exosomes
marqués, notamment fluorescents, tels que décrits ci-avant, pour la détection
de
lymphocytes T spécifiques de complexes peptide antigénique -CMH dans un
échantillon
biologique. L'échantillon biologique peut être tout échantillon de sang,
sérum, tissu,
tumeur, biopsie, peau, urine, etc. En outre, l'échantillon biologique peut
être prétraité
par exemple pour dissocier les cellules, amplifier les cellules en culture,
préparer des
fractions membranaires, etc. Avantageusement, (échantillon biologique provient
d'un
organisme humain. A cet effet, l'invention concerne également une méthode pour
la
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détection de la présence de lymphocytes T spécifiques de complexes antigène-
CMH
dans un échantillon biologique, comprenant la mise en contact dudit
échantillon avec un
exosome marqué tel que défini ci-avant, comportant ledit complexe antigéne-
CMH, et la
mise en évidence du marquage de lymphocytes T dans ledit échantillon.
De plus, la détection de ces lymphocytes T permet non seulement la détection
et
donc le diagnostic d'un état physiopathologique, mais également de suivre par
exemple
l'efficacité de protocoles d'immunisation et l'état de la réponse immunitaire
à différents
stades de la maladie et d'évaluer ainsi l'efficacité des thérapeutiques
entreprises.
Dans une application particulière, les exosomes de (invention portant un
récepteur
1o TcR sont utilisés pour la détection de complexes peptide-CMH spécifiques de
ce
récepteur dans un échantillon biologique.
Par ailleurs, les exosomes fluorescents selon l'invention portant n'importe
quel type
de protéine de composition définie représentent également des sondes
fluorescentes
permettant la détection de récepteurs potentiels. Le champs nouveau des
exosomes est
ainsi généralisable à la mise en évidence, in vivo, de toute interaction
protéine/protéine
de faible affinité. L'invention a donc également pour objet (utilisation
d'exosomes, de
préférence marqués, notamment fluorescents, tels que décrits ci-avant,
- pour la détection de récepteurs spécifiques d'une molécule protéique dans un
échantillon biologique. Dans ce mode de mise en oeuvre, les exosomes utilisés
2o comportent donc, à leur surface, ladite molécule biologique de structure
définie.
- pour la détection de la présence d'un ligand dans un échantillon biologique.
Dans
ce mode de mise en oeuvre, les exosomes utilisés comportent donc, à leur
surface, un
récepteur spécifique dudit ligand.
c) Applications thérapeutiques
Les anticorps restreints ou des fragments de ces derniers sont potentiellement
capables d'inhiber (interaction entre le récepteur d'un lymphocytes T et le
complexe
CMH-peptide pour lequel il est spécifique. De façon parallèle, les exosomes
portant à
leur surface un seul type de complexe CMH-peptide peuvent, en interagissant
avec les
lymphocytes T spécifiques de ces complexes, entrer en compétition avec leurs
ligands
naturels, les lymphocytes T et entraîner leur inactivation.
Les anticorps restreints et les exosomes peuvent donc être employés dans
toutes les
situations où l'on souhaite réduire ou supprimer une réponse immunitaire
médiée par des
lymphocytes T qui s'avère délétère pour (organisme comme c'est le cas par
exemple
dans:
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- les transplantations d'organes ou les greffes de moelles dans lesquelles on
cherche
à neutraliser la réponse de (hôte contre le greffon, généralement au moyen de
fortes
doses d'agents immunosuppresseurs ;
- les maladies auto-immunes ou les pathologies virales pendant lesquelles la
réponse
immunitaire T CD8 ou CD4 aboutit de manière chronique à la destruction des
tissus;
- les allergies et (asthme.
Dans ce type de pathologies, les exosornes de (invention exprimant à leur
surface
un complexe défini peptide-MHC, dont (implication est connue dans le
développement
de la situation pathologique, peuvent donc être utilisés pour bloquer le
développement
lo de la réponse immune et donc le développement de la réponse pathologique.
Les exosomes de l'invention portant des complexes CMH-peptides peuvent
également être utilisés pour l'amplification ((expansion) de population de
lymphocytes
T cytotoxiques ex vivo. Utilisés directement à partir de prélèvement sanguins,
ils
peuvent ainsi être la base de thérapies cellulaires contre différentes cibles
cellulaires.
Ainsi les exosomes peuvent servir à trier des cellules T spécifiques de
combinaisons
variées de complexes exprimés par des cellules qui représentent une cible
thérapeutique,
comme les cellules tumorales ou infectées par un virus. Un autre objet de
(invention
réside donc dans (utilisation des exosomes décrits ci-avant pour
l'amplification clonale
et/ou la stimulation de lymphocytes T cytotoxiques et/ou auxiliaires.
L'invention
2o concerne également une méthode pour l'amplification (ou (expansion) clonale
ex vivo
de lymphocytes T, notamment cytotoxiques, comprenant la mise en contact d'un
échantillon biologique comprenant des lymphocytes T avec des exosomes tels que
décrits ci-avant, comportant un complexe peptide-CMH défini, la récupération
des
lymphocytes T spécifiques et leur amplification. Cette méthode est tout
particulièrement avantageuse pour l'amplification clonale de lymphocytes T
cytotoxiques spécifiques de complexes entre des molécules CMH et des peptides
d'antigènes tumoraux ou viraux.
Une autre application particulièrement intéressante des vésicules selon
l'invention
réside dans le transfert des molécules vers les cellules. En effet, de part
leur
3o composition, les vésicules de (invention sont capables de jouer le rôle de
vecteur de
transfert de molécules vers les cellules, in vitro, ex vivo et in vivo. A cet
égard,
(invention concerne l'utilisation des exosomes tels que décrits ci-avant,
comportant une
substance d'intérêt, pour la préparation d'une composition destinée au
transfert de ladite
substance dans une cellule. Avantageusement, il s'agit d'un exosome comportant
un
récepteur de ligand ou un ligand de récepteur à sa surface, permettant ainsi
d'orienter le
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transfert vers une ou des populations cellulaires choisies. L'invention
concerne
également une méthode pour le transfert d'une substance dans une cellule, in
vitro, ex
vivo ou in vivo, comprenant la mise en contact de ladite cellule avec une
vésicule selon
(invention comportant ladite substance. Plus préférentiellement, la vésicule
utilisée
exprime en outre un récepteur de ligand et la méthode de (invention permet un
transfert
orienté de la substance vers des cellules exprimant le ligand correspondant.
Pour une
mise en oeuvre in vivo, les vésicules de (invention sont administrées à un
sujet (de
préférence un mammifère, notamment l'homme), par toute voie d'administration
classique (injection intraveineuse, intraarterielle, intramusculaire, sous-
cutanée, etc.).
1o Pour une utilisation in vitro ou ex vivo, les cellules sont contactées par
incubation dans
un dispositif approprié (boite, flasque, poche, ampoule, etc.), de préférence
en
conditions stériles. Les paramètres de l'étape de mise en contact (quantité de
vésicule,
durée de contact, température, milieu, etc.) peuvent être aisément ajustés par
(homme du
métier en fonction des buts poursuivis et de (enseignement de la présente
demande.
d) Applications dans le domaine de la recherche
Elles concernent bien entendu toutes les applications évoquées plus haut dans
(analyse des mécanismes moléculaires de la présentation antigénique par
(utilisation
d'anticorps permettant de détecter et d'analyser les différentes étapes de la
formation de
2o complexes CMH-peptides dans différentes situations normales ou
pathologiques.
Par ailleurs, elles concernent aussi l'analyse et la caractérisation
moléculaire des
populations de lymphocytes T capables de reconnaître un complexe CMH-peptide
déterminé par (utilisation des exosomes fluorescents dans leur capacité à
détecter de
manière de récepteurs T aux complexes CMH-peptide.
Dans ces différentes applications (diagnostiques, thérapeutiques,
expérimentales,
production de lymphocytes T, etc.), les exosomes de l'invention peuvent être
mis en
oeuvre soit tels quels, soit sous forme immobilisée sur un support. Ainsi, les
résultats
présentés dans les exemples montrent en effet qu'il est possible de fixer les
exosomes sur
des supports, sans altérer leurs propriétés fonctionnelles, notamment leurs
spécificité
3o antigénique par exemple. A cet égard, un objet particulier de la présente
invention réside
dans une composition comprenant des exosomes immobilisés sur un support. Le
support
est préférentiellement un support solide ou semi-solide, de type bille, filtre
ou analogues.
Il s'agit préférentiellement d'un support en matière plastique, de type
polymère, par
exemple des billes de latex, ou de billes magnétiques. Il est entendu que tout
autre
matériel synthétique ou biologique peut être utilisé, dès lors qu'il n'induit
pas d'altération
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substantielle des qualités des exosomes ou des cellules. Avantageusement, on
utilise des
billes d'un diamétre de 1 à 10 pm, par exemple de 2 à 5 pm. L'immobilisation
des
exosomes sur les supports est avantageusement obtenue par liaison covalente,
par
exemple par activation par un aldéhyde, ou tout autre réactif de couplage
chimique.
D'une maniére générale, l'immobilisation des exosomes est réalisée par
incubation des
exosomes avec le support en solution, dans les conditions permettant la
fixation, puis les
supports sont récupérés par centrifugation. Les supports fonctionnalisés ainsi
obtenus
peuvent être utilisés pour caractériser les exosomes ou pour détecter ou
amplifier in vitro
des lymphocytes T, comme il sera décrit en détails dans la section
expérimentale.
lo D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la
lecture des
exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non
limitatifs.
En outre, toutes les publications citées dans la demande sont incorporées à la
présente
par référence.
Légendes des figures
Figure.l . Production de complexes CMH-peptide DR1-HA fonctionnels dans la
lignée RBL2H3.
A. Analyse de l'expression de surface par cytométrie de flux des molécules du
CMH
Il humaine DR1 avant (gauche) et après (droite) transfection des ADNc codant
pour les
chaînes a et (3 de DR1 dans la lignée RBL 2H3. Les molécules DRI sont
détectées par
l'anticorps L243 (trait noir) lui-même révélé par un sérum de chèvre anti-IgG
de souris
couplé au FITC.
B. Expression de surface de DR1 dans la lignée exprimant une chaîne invariante
(IiHA) où le peptide CLIP a été remplacé par le peptide 308-319 issu de
fhémagglutinine du virus de la grippe. Les molécules DR1 sont détectées sur la
lignée
RBL DR1 IiHA et un lymphocyte B transformé par fEBV (Hom2) de même haplotype
par (anticorps L243 (trait noir).
C. Stimulation de lymphocytes T spécifiques du complexe DR1 -HA par la lignée
3o RBL exprimant ce complexe ou des B-EBV de même haplotype. Les lignées RBL
DRIIiHA et B-EBV Hom2 étaient diluées dans des plaques de culture avec un
lymphocyte T spécifique du complexe DR1 HA. La lignée B-EBV Hom2 était aussi
incubée en présence de concentration saturante ( 10 mM) du peptide HA. La
production
d'IL2 dans les surnageants de culture permet d'évaluer la stimulation des
lymphocytes
THA (lymphocytes T spécifiques du peptide HA). L'IL2 est mesurée par
l'intermédiaire
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d'un test d'incorporation de thymidine tritiée de la lignée CTLL2 dont la
prolifération est
IL2-dépendante.
D. Analyse de la saturation en peptide HA de la lignée RBL DR1 IiHA. Les
cellules Hom2 et RBL DR1 IiHA étaient incubées (100 cellules par puits) en
présence
5 de concentrations croissantes du peptide HA et des lymphocytes THA. La
stimulation
des lymphocytes a été évaluée comme précédemment.
Figure 2 : Accumulation des molécules DRI dans un compartiment de sécrétion de
RBL2H3.
10 A. Analyse du site intracellulaire d'accumulation des molécules DRl dans
RBL
2H3. Les cellules RBL DRLHA ont été fixées avec 0,5% glutaraldéhyde puis
perméabilisées avec 0,05% Saponine. Les molécules DR1 et la chaîne invariante
ont été
détectées respectivement avec les anticorps L243 et PIN 1 puis un sérum d'âne
anti-IgG
de souris couplé au FITC. La sérotonine a été détectée grace à un sérum de
lapin
15 spécifique révélé avec un sérum d'âne anti-IgG de lapin couplé au Texas
red. Les
images ont été obtenues par microscopie confocale (Leica). L'épaisseur des
plans de
coupe étaient de 0,5 micron.
B. Purification des exosomes de RBL DRIIiHA. Après lavage dans du DMEM, les
cellules ont été incubées pendant 30 minutes en présence de 1 mM de ionomycine
à
20 37°C. Les exosomes ont été purifiés par ultracentrifugation
différentielle à partir du
surnageant des cellules. Le culot d'exosomes, remis en suspension dans du PBS,
a été
séparé (5 mg ) par SDS-PAGE puis transféré sur une membrane de Nylon. La
chaîne ~i
de DR1 a été détectée avec l'anticorps monoclonal IBS dans la préparation
d'exosome et
en contrôle dans les lysats des cellules RBLDRLHA et Hom2 (équivalent de l Os
cellules
25 par puits) migrés dans les mêmes conditions.
Figure 3 : Utilisation des exosomes pour la production d'anticorps antiDRI HA
A. Des dilutions croissantes des sérums des souris immunisées avec les
exosomes
ont été incubées avec les cellules RBL exprimant (droite) ou non (gauche) les
molécules
DRl HA. Le marquage, ainsi obtenu, a été analysé par cytométrie de flux.
B. Les sérums des rats (dilués au 1 /1 00) immunisés avec les exosomes ont été
incubés avec les cellules RBL exprimant ou non (gauche) les molécules DR1 HA.
A
droite, les cellules exprimant DR1 ont été préalablement incubées ou non
pendant deux
heures à 37°C avec 10 mM du peptide HA puis avec la même dilution du
sérum des rats
immuns.
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C. La rate du rat immun a été fusionnée avec la lignée X63A8 dans des
conditions
classiques de fabrication d'anticorps monoclonaux. Le surnageant des
différents
hybridomes a été testé par immunofluvrescence sur les cellules RBL2H3
exprimant ou
non les molécules DR1 ou DR1 HA. Les clones a40, b82 et a15 sont des exemples
représentatifs des anticorps obtenus.
Figure 4 - Utilisation des exosomes pour la détection des lymphocytes T
spécifiques du complexe DR1 HA
A. Les cellules RBL DR1 IiHA ont été incubées en présence de SmM de « Green
1o Tracker » (lipide fluorescent s'accumulant dans les compartiments
lysosomaux des
cellules) pendant 30 minutes à 37°C puis lavées et réincubées pendant
une heure à
37°C en absence de marqueur fluorescent. Les cellules ont été fixées
(3%
paraformaldéhyde), puis analysées par microscopie confocale.
B. En parallèle, les exosomes DRl HA ont été purifiés à partir des cellules
décrites
en A. La fluorescence présente dans les échantillons a été quantifiée à (aide
d'un
fluorimètre et visualisée directement par microscopie confocale.
C.D. Les exosomes fluorescents DR1 HA ont été incubés à SOmg/ml avec des
lymphocytes THA spécifiques du complexe DRl HA ou des lymphocytes TH30
spécifiques d'un autre complexe (D) pendant deux heures à 37"C en présence
d'azide
2o pour bloquer (internalisation. La fluorescence des cellules a été évaluée
par cytométrie
de flux.
Figure 5 : Production d'exosomes portant des molécules de classe II du CMH
A L'expression de molécules de classe II IAb est détectée par (anticorps
monoclonal Y3P et analysée par cytométrie de flux. Les transfectants obtenus
dans la
cellule RBL2H3 expriment des niveaux similaires de molécules de classe II
reconnues
par Y3P qu'un lymphome B contrôle B414.
B Analyse par western blot de (expression de la molécule IAb dans RBL. 10 mg
d'un lysat cellulaire et d'une préparation d'exosomes provenant de la cellule
RBL IAbIi
ont été analysés par western blot avec un sérum de lapin spécifique de la
région
cytoplasmique de la chaîne a de la molécule IA.
C Analyse par cytométrie de flux de la composition des exosomes. Des billes de
latex ont été recouvertes soit de sérum de veau foetal (FCS) soit d'exosomes
provenant de
la cellules RBL 2H3 (exos RBL) soit de transfectant de cette cellule avec les
molécules
de classe II marines IAbIi (Exos IAbIi) ou humaine DRIIiHA (exos DRIIiHA). La
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molécule CD63 du rat est détectée avec l'anticorps AD1, les molécules IAb avec
(anticorps Y3P tandis que les molécules DR1 sont détectée par (anticorps L243.
Ces
différents anticorps sont révélés par des anticorps secondaires couplés à la
phycoéryrhrine.
Figure 6 : Caractérisation morphologique des exosomes produit par RBL-2H3:
A Les cellules RBL-2H3 transfectées avec HLA-DR1 ont été fixées avec de la
paraformaldéhyde. Des coupes congelées ultrafines ont été préparées et
immunomarquées
avec des anticorps polyclonaux dirigés contre les molécules HLA-DR. Ces
anticorps sont
visualisés avec de la protéine A couplée à des particules d'or colloïdal de 10
nm. Les
molécules de classe II sont détectées essentiellement dans des compartiments
remplis de
membranes d'aspect vésiculaire. Barre : 250 nm.
B C. Caractérisation morphologique des exosomes sécrétés par les cellules RBL-
2H3 Les exosomes sont fixés avec de la paraformaldéhyde 2% dans du tampon
phosphate
0.2M pH 7.4. (tampon PB) et déposés sur des grilles de microscopie
électronique
recouvertes d'un film de formvar carboné. Les exosomes sont soit contrastés et
enrobés
dans une solution d'acétate d'uranyle 4% et du méthylcellulose (b) soit
immunomarqués
avec des anticorps dirigés contre les molécules de classe II avant l'enrobage
(c). Comme
dans la figure (a), les anticorps sont visualisés avec de la protéine A
couplée a des
particules d'or colloïdal de 10 nm. Barres : 250 nm.
Figure 7 : Manipulation de la composition interne des exosomes, introduction
d'une protéine recombinante.
A L'expression de molécules de classe II DR1 est détectée par (anticorps
monoclonal L243 et analysée par cytométrie de flux. La transfection de
molécules dans la
cellule RBL2H3 induit l'expression de niveaux similaires de classe II reconnu
par Y3P
qu'un lymphome B contrôle B414.
B Analyse par western blot de (expression de la molécule DR1 GFP dans RBL. IO
p.g d'un lysat cellulaire et 20 ~,g d'une préparation d'exosomes provenant de
la cellule
RBL DR1 GFP ont été analysés par western blot un couple d'anticorps
monoclonaux
spécifique de la GFP.
C Analyse par cytométrie de flux de la composition des exosomes. Des billes de
latex ont été recouvertes soit de sérum de veau foetal (FCS) soit d'exosomes
provenant de
la cellules RBL DR1GFP. Les molécules DR1 sont détectées par (anticorps L243
et des
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anticorps secondaires couplés à la phycoerythrine tandis que la présence la
GFP est
détectée directement dans le canal FL1.
Figure 8
A Liaisons d'exosomes fluorescents par des cellules T spécifiques. Des
exosomes
produits à partir de cellules RBL DRl IiHA marquées au green cell tracker ont
été
incubés en présence de deux types de cellules T: des THA qui possèdent un TCR
spécifique des complexes HLA-DR1/HA et des T Jurkat sauvages dépourvues d'un
tel
récepteur. Les exosomes fluorescents ont été incubés pendant 3 heures à
37°C avec les
1o deux lignées de lymphocytes T puis le marquage résultant était analysé au
FACS.
B Acquisition d'un marqueur d'exosomes par les cellules T spécifiquement
marquées. Les mêmes de marquages qu'en A ont été réalisés mais la liaison des
exosomes
(non marqué au green cell tracker) aux cellules T était détectée avec un
anticorps
monoclonal de souris AD 1 anti CD63 de rat, révélé ensuite par des anticorps
d'âne anti
IgG de souris marqués à la phycoérythrine (Jackson Immuno Research, West
Grove, PA).
Le même marquage a été réalisé en parallèle sur les cellules T n'ayant pas été
exposées à
des exosomes.
C Stimulation des Lymphocytes par des exosomes. Les exosomes purifiés à partir
des cellules DR1GFP ont été crosslinkés sur des billes de latex préparées de
la même
2o façon que pour la cytofluorométrie de flux mais lavées en milieu complet.
Chaque culot
de billes a été repris dans 100 ~,L, SO~,L déposé dans le premier puits d'une
plaque 96
puits et SOp.L dilué de deux en deux. Les cellules T (T Jurkat et THA1.7) ont
été ajustées
à 106 cellules/mL et SOpL ont été déposés par puits en présence ou en absence
du peptide
HA307-319 à S~tM. La plaque de culture a été placée dans (incubateur
(37°C, S% C02,
H20) pendant 20 heures puis le surnageant a été prélevé et la concentration
d'IL2 a été
évaluée par un test CTL.L2.
Figure 9 : Caractérisation des cellules et des exosomes HMC-1
A analyse des cellules HMC-1 par cytofluorométrie de flux, trait plein foncé
:cellules seules; trait plein clair : anticorps anti-souris-FITC seul;
pointillés serrés
anticorps spécifique + anti-souris-FITC.
B analyse des exosomes HMC-1 collés sur des billes de latex par
cytofluorométrie
de flux, trait plein foncé : billes latex-exosomes HMC-I seules; trait plein
clair : anticorps
anti-souris-FITC seul; pointillés serrés : billes témoins latex-SVF +
anticorps spécifique
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+ anti-souris-FITC; pointillés lâches : billes latex-exosomes + anticorps
spécifique + anti-
souris-FITC
C analyse par Western-blot d'un lysat de cellules HMC-1 comparé à leurs
exosomes; 10 ou 3pg de protéines par put; HC10: surnageant au 1/IOe ; 1B5:
surnageant
au 1/l0e ; CD63: 5~.g/mL; Lampl: 2~,g/mL; H68.4: surnageant au 1/10e. Les
exosomes
semblent enrichis en CD63, Lampl, TfR. L'absence de CMH de classe II tant dans
le
lysat que dans les exosomes confirme l'analyse par cytofluorométrie. La
proportion de
CMH de classe I semble identique pour le lysat cellulaire et les exosomes.
1o Matériels et Méthodes
Cellules
Les cellules utilisées pour la production d'exosomes dans la partie
expérimentale
sont des cellules de mastocytes marins ou humains. Plus particulièrement, une
lignée
tumorale de basophiles au phénotype de mastocytes muqueux, désignée RBL-2H3, a
été
utilisée (Barsumian et al, Eur. J. lmmunol. (1 1 (1 981) 317}, ainsi qu'une
lignée de
mastocytes immatures humains (HMC-1). D'autres cellules de mastocytes, en
particulier
établies en lignée, peuvent être utilisées, telles que des lignées dérivées
des cellules RBL
(Rat Basophicil Leukemia), déposées à fATCC sous le numéro CRLI378 (Kulczycki
et
2o al., J. Exp. Med. 139 (1974) 600).
Des lignées lymphocytaires T capables de reconnaître un antigène particulier
dans
un contexte CMH Il humain (DR1) ont également été utilisées. En particulier,
la lignée
Jurkatt transfectée avec fADNc codant le récepteur des cellules T ("T-HA")
spécifique
du peptide 306-318 de fHémagglutinine du virus de l'influenza en association
avec
HLA-DRI (Sidhu et al., J. Exp. Med. 176 (1 992) 875). La lignée de cellules B
humaines transformées par le virus d'Epstein Barn (lignée Hom-2) a été
utilisée comme
contrôle pour la réponse restreinte à HLA-DRl.
Les cellules ont été cultivées en milieu DMEM (Gibco BRL), RPMI, ou "CLICK"
milieu RPMI supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (Sigma), 1 mg/ml de
3o pénicilline-streptomycine, 1 mg/ml de glutamine, 5 mM de pyruvate de sodium
et 50
~tM de b-mercaptoéthanol. Tout autre milieu adapté à la culture de cellules
eucaryotes,
notamment mammifères, peut bien entendu être utilisé.
Les cellules ont été principalement cultivées en flacon de culture de 25 ou 15
cm3.
Les cellules RBL-2H3 étant des cellules adhérentes, elles sont décollées du
support
grace à l'action de la Trypsine-EDTA (Seromed). Afin de produire ces dernières
en
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grandes quantités, il est également possible de les cultiver en "spinner", à
la densité de
106 cellules/ml.
Plasmides
5 Pour modifier génétiquement les cellules de mastocytes, les constructions
génétiques suivantes ont été réalisées.
Les ADNc codant pour la chaîne HLA-DRIa humaine (Larhammer et al., Ceil 30
(1982) 153), la chaîne HLA-DRI (3 humaine (Bell et al., PNAS 82 (1985) 3405)
et la
chaîne invariante humaine p33 li (Ciaesson et al., PNAS 80 (1983) 7395) ont
été isolés.
l0 L'ADNc codant pour la chaîne invariante p331i a ensuite été modifié par PCR
pour
remplacer la région codant pour le peptide CLIP (résidus 87-102) par un site
de
restriction. Cet ADNc permet ainsi d'insérer, en lieu et place du peptide
CLIP, tout
fragment d'ADNc d'intérêt codant pour un peptide antigénique (Stumptner et
al., EMBO
J. 16 (1997) 5807). Dans un exemple précis, un fragment d'ADN codant pour le
peptide
15 HA308-319 de fhémagglutinine du virus de la grippe a été inséré dans cet
ADNc,
codant pour un polypeptide chimère li(HA308-319).
Les acides nucléiques décrits ci-dessus ont ensuite été clonés, séparément,
dans le
plasmide pSRa sous le contrôle du promoteur SRa (Takebe et al., Mol. Cell Bio.
8
(1988) 466). Chacun des plasmides a ensuite été modifié de manière à
incorporer un
20 gène de résistance différent, permettant une sélection pour chacun des
plasmides, et
donc pour chacune des chaînes ; la chaîne a avec le gène de résistance à la
néomycine ;
la chaîne ~i avec le gène de résistance à fhygromycine, et la chaîne
invariante avec le
gène de résistance à la zéocine.
25 Transfections
Pour introduire les différents acides nucléiques dans les cellules de
mastocytes, les
vecteurs plasmidiques correspondants ont été linéarisés par l'enzyme de
restriction Scal.
50pg de chaque plasmide ont été linéarisés puis précipités à féthanol, et les
culots ont
été resuspendus en présence de cellules RBL-2H3 à une concentration de 1.10'
3o cellules/ml. Des transformants stables ont été obtenus par électroporation
de 5.106
cellules au moyen d'un « gene pulser » (Bio-Rad, Richmond, CA) dans les
conditions
suivantes : 260V, 960 pF. 72 heures après l'electroporation, les transfectants
sont
sélectionnés par culture en milieu de sélection comprenant 250 pg:ml de 6418
(Généticine, Gibco) lmg/ml d'hygromycine et 500 ~.g/ml de zéocine. Après 8
jours de
culture en milieu de sélection, 60 à 90% des cellules présentes sont
transfectées. Les
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31
transfectants ont ensuite été ensemencés sur boite de petri en milieu de
sélection à une
concentration permettant (apparition de colonies adhérentes individualisées.
Les clones
ainsi obtenus ont été prélevés et mis en culture séparément. Ces clones
peuvent être
conservés sous forme congelée, en vue d'une utilisation ultérieure.
Anticorps
Y3P (MHC II (IA)) est un anticorps monoclonal de souris reconnaissant le
complexe IAb af3 (Janeway et al., 1984).L'anti IA a est un sérum de lapin
dirigé contre la
partie cytoplasmique de la chaîne a de IA. L'anti-GFP est un mélange de deux
anticorps
1o monoclonaux (clones 7.1 and 13.1) dirigé contre la "green fluorescent
protein" vendu par
Boehringer Mannheim. Dans les expériences de cytofluorométrie de flux, les
seconds
anticorps utilisés sont des fragments F(ab')2 couplés à la (-Phycoérythrine,
produits chez
(âne et dirigés contre les IgG (H+L} de souris (Jackson Immunoresearch
Laboratories).
Billes
Les billes latex : Surfactant-free white aldehyde/sulfate latex, D : 3,9p,m,
Interfacial
Dynamics Corp., Portland, Or. USA
Microscopie électronigue
Les cellules RBL-2H3 transfectées avec HLA-DR1 ont été fixées avec de la
parafonmaldéhyde 2% dans du tampon phosphate 0.2M pH 7.4. (tampon PB) Après
fixation les cellules ont été lavées avec du tampon PB -glycine SOmM puis
enrobées dans
de la gélatine 10%. Après solidification des blocs ont été préparés , infusés
dans le
sucrose 2.3M et congelés dans l'azote liquide. Des coupes congelée ultrafines
ont été
préparées et immunomarquées avec des anticorps polyclonaux dirigés contre les
molécules HLA-DR. Ces anticorps sont visualisés avec de la protéine A couplée
a des
particules d'or colloïdal de 10 nm.
Les exosomes sont fixées avec de la paraforrnaldéhyde 2% dans du tampon
phosphate 0.2M pH 7.4. (tampon PB) et déposés sur des grilles de microscopie
électronique recouvertes d'un film de formvar carboné.
Les exosomes sont soit contrastés et enrobés dans une solution d'acétate
d'uranyle
4% et du méthylcellulose soit immunomarqués avec des anticorps dirigés contre
les
molécules de classe II avant l'enrobage. Les anticorps sont visualisés avec de
la protéine
A couplée a des particules d'or colloïdal de 10 nm.
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Résultats
1 -Production d'exosomes DR1 HA
1.1. Construction et caractérisation de cellules productrices génétiquement
modifiées
Afin de produire, de manière contrôlée, des exosomes portant des complexes CMH-
peptide de composition définie, les chaînes a et b des molécules de classe II
du CMH,
DR1, ont été exprimées dans la lignée lo mastocytaire RBL2H3, issue d'une
leucémie à
basophile du Rat. Pour cela, deux vecteurs portant respectivement un acide
nucléique
codant pour chaque chaîne, sous contrôle du promoteur SRa ont été transfectés
simultanément dans les cellules (voir matériels et méthodes). Les résultats
obtenus par
cytométrie de flux montrent que les cellules transfectées expriment bien les
molécules
DR1 (Figure lA).
Ces cellules RBL-2H3 DRI ont ensuite été sensibilisées à un peptide donné, de
composition précise, afin de générer des complexes CMH-peptide de composition
définie. Pour cela, différentes techniques peuvent être envisagées. Dans un
mode de
réalisation simple, le peptide peut être incubé directement avec les exosomes.
Dans une
2o autre variante, un acide nucléique codant pour le peptide peut être
introduit dans les
cellules, de manière à exprimer également ce peptide. Dans cet exemple
particulier de
mise en oeuvre, pour fabriquer une cellule présentatrice comportant une seule
spécificité
antigénique, le peptide antigénique choisi a été introduit dans les cellules
sous forme
d'une fusion génétique avec la chaîne invariante humaine li. Plus
particulièrement, le
peptide CLIP de la chaîne invariante a été remplacé par la séquence du peptide
choisi,
issu de fhémagglutinine (HA 308-319) du virus de la grippe, connu pour se lier
avec la
molécule DR1. Cette construction (IiHA) a été transfectée dans les cellules
dans les
conditions décrites dans les Matériels et Méthodes. La chaîne hybride exprimée
dans les
cellules RBL-2H3 DR1, a permis construire des cellules qui expriment des
molécules
DR1 reconnues par (anticorps L243 à un niveau similaire qu'une lignée B-EBV
(Hom2)
contrôle d'haplotype DR1 (Figure 1B). Ces résultats montrent donc que les
cellules de
mastocytes de l'invention expriment bien un complexe peptide-CMH humain
fonctionnel, de composition prédéterminée et contrôlée.
Le caractère fonctionnel des complexes peptide-CMH exprimé par les cellules de
(invention a été confirmé dans un test de stimulation de lymphocytes T
spécifiques de la
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combinaison DR1-HA portée par les cellules. Pour cela, les cellules de
l'invention ont
été incubées en présence de lymphocytes THA, et la stimulation a été
déterminée par
mesure de finterleukine-2 libérée dans le surnageant, par un test de
croissance d'une
lignée cellulaire IL-2-dépendante. Comme contrôle, une lignée de lymphocytes B
transformée par fEBV (Hom-2), d'haplotype DR1, pulsée par une concentration
saturante (IOmM) du peptide HA a été utilisée.
Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 1 C et 1 D. Ils montrent
que les
cellules de mastocyte de l'invention expriment un complexe DR1-HA, capable de
stimuler un lymphocyte T spécifique de cette combinaison. Ils montrent
également que
l0 la stimulation obtenue en présence des cellules de l'invention est plus
efficace que celle
produite par les cellules contrôle (B-EBV d'haplotype DR1) pulsées par une
concentration saturante (IOmM) du peptide HA. Enfin, les résultats obtenus
montrent
que les molécules DR1 semblent ne présenter que le peptide HA puisque
l'addition d'une
concentration saturante de peptide n'augmente pas de manière significative la
capacité
des cellules RBL DR1 IiHA à stimuler un lymphocyte T HA (Figure 1 D).
L'ensemble de ces résultats démontre donc le caractère fonctionnel des
complexes
peptide-CMH produits. Ils illustrent également le caractère spécifique des
cellules
obtenues, et donc le caractère spécifique du procédé de (invention qui permet
d'obtenir
des cellules (et des exosomes) portant des molécules de composition définie et
contrôlée.
1.2. Production des exosomes fonctionnalisés
Une étude par immunofluorescence a permis de montrer que les complexes
recombinants CMH-peptide (DRl HA) s'accumulent dans les granules de sécrétion
de la
lignée cellulaire RBL-2H3. La Figure 2A témoigne en effet de la colocalisation
des
molécules DR1 avec la sérotonine dans des structures intracellulaires
vésiculaires.
La possibilité que des exosomes fonctionnels puissent être relargués par ces
cellules
a donc été étudiée. Pour cela, les cellules ont été cultivées en présence d'un
ionophore
calcique, et la production de vésicules membranaire a été suivie. Plus
particulièrement,
les cellules ont été centrifugées à 300 g pendant 5 minutes à température
ambiante. Sur
chaque culot cellulaire, une solution de ionophore calcique (lonomycine 1 mM)
a été
ajoutée (environ 300 ~1) et l'incubation a été poursuivie pendant 30 minutes à
37°C.
L'exocytose a été stoppée par refroidissement rapide dans la glace et ajout de
300 ~1
d'une solution froide PBS-EGTA 1 mM. Les cellules ont ensuite été centrifugées
à 300g
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à 4°C pendant 5 minutes. Les surnageants ont été récupérés est
recentrifugés, tout
d'abord 5 minutes à 1200 g, puis 5 minutes à 10 000 g, puis enfin 1 heure à 70
000 g.
Après cette centrifugation différentîelle, les culots (comprenant les
exosomes) sont
repris et solubilisés dans une solution tampon (30p.1 de tampon de Laemmlî-DDT
(1X ou
2X)). Une fraction des culots est également solubilisée dans un tampon de lyse
pour
déterminer la concentration protéique. Les solutions d'exosomes peuvent être
séparées
par migration sur gel (mirai-gel 12% de polyacrylamide) à 20mA puis
transférées sur
linmobilon. L'analyse des exosomes est ensuite réalisée par western blotting
avec des
anticorps spécifiques des différentes chaînes des molécules de classe IIdu
CMH.
1o Les résultats obtenus montrent que des exosomes peuvent être relargués de
la lignée
RBL-2H3, de manière importante, après stimulation par un agent approprié. Ces
exosomes peuvent être isolés et purifiés par exemple par ultracentrifugation
différentielle pour la préparation de composition d'exosomes. Enfin, les
résultats
présentés sur la Figure 2B démontrent que ces exosomes sont fonctionnels. En
effet, les
analyses par western blotting montrent que les exosomes obtenus expriment Ies
différentes chaînes recombinantes des molécules de classe IIdu CMH. En outre,
ces
résultats montrent également la forte densité des complexes peptide-CMH à la
surface
des exosomes de l'invention.
Les exemples qui suivent illustrent notamment l'utilisation des exosomes DRl
HA
pour la production d'anticorps spécifiques de cette combinaison et la capacité
des
exosomes DRl HA à lier des lymphocytes T spécifiques de cette même
combinaison.
2 - Génération d'anticorps spécifipues du complexe DRl HA
Cet exemple illustre (utilisation des exosomes de (invention pour la
production
d'anticorps, en particulier d'anticorps dits "restreints", c'est-à-dire
spécifiques du peptide
antigénique en association avec la molécule du CMH. Cet exemple illustre
notamment
le pouvoir immunogène très important des exosomes de l'invention, puisqu'ils
permettent la production d'anticorps en l'absence de tout adjuvant.
Les exosomes purifiés à partir du surnageant des cellules RBL DRI HA (exemple
1)
ont été remis en suspension dans du PBS. Ces exosomes ont ensuite été utilisés
pour
immuniser des souris Balb/c ou des rats LOU en absence de tout adjuvant, selon
les
protocoles suivants
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- Les souris ont été injectées par voie sous cutanée avec l Opg d'exosomes,
deux fois
à trois semaines d'intervalle, puis 30p.g par voie intrapéritonéale et enfin
30 pg par voie
intraveineuse 3 jours avant le prélèvement des sérums.
- Les rats ont été injectés avec des exosomes par voie intrapéritonéale
(lOp.g), par
5 deux reprises à trois semaines d'intervalle, puis par voie intraveineuse
(SOp,g) trois jours
avant le prélèvement des sérums.
Comme le montre la Figure 3A, les sérums prélevés chez les souris immunisées
présentaient une très forte réactivité contre la lignée RBL exprimant ou non
le complexe
DRl HA mais qui était détectable jusqu'à une dilution au trente millième des
sérums
1o seulement dans le cas de la cellule DRl HA.
Comme le montre la Figure 3B, les sérums des rats ainsi immunisés, montraient,
de
manière surprenante, une réactivité contre la lignée RBL exprimant le complexe
DR1
HA alors que les mêmes sérums réagissaient avec une plus faible intensité avec
la lignée
initiale RBL-2H3. En outre, l'addition du peptide HA à des cellules exprimant
DR1
15 (RBL-2H3 DRl) augmente de manière significative la réactivité des
antisérums ainsi
produits (Figure 3B).
Ces résultats montrent donc que les exosomes de la lignée RBL sont capables
d'induire une réponse anticorps qui, de manière inattendue, est principalement
dirigée
chez le rat contre les complexes DR1 HA.
2o Les rates des rats immuns ont été fusionnées avec des cellules de la lignée
X63A8.
Les hybridomes ainsi obtenus ont été triés par dilution clonale, selon les
techniques
classiques d'immunologie, puis sélectionnés par immunofluorescence pour la
spécificité
des anticorps monoclonaux produits. Différents anticorps monoclonaux ont ainsi
été
obtenus, pour certains dirigés contre des protéines de la lignée RBL, pour
d'autres,
25 contre des déterminants monomorphiques des molécules de classe II humaine
d'haplotype DRl et enfin contre le complexe constitué par les molécules DR1
associées
au peptide issu de la protéine HA du virus de la grippe (Figure 3C). Ces
deniers
anticorps monoclonaux constituent des anticorps restreints, et possèdent donc
des
propriétés particulièrement avantageuses pour des applications diagnostiques
ou
3o thérapeutiques.
3 - Détection de lymphocees T spécifigues du complexe DR1 HA
Cet exemple illustre l'utilisation des exosomes de l'invention pour la
détection de
35 lymphocytes T spécifiques dans un échantillon biologique. Cet exemple
montre
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également comment les exosomes peuvent être utilisés pour sélectionner et
amplifier
une population de lymphocytes T particuliers, en vue notamment de leur
réinjection à un
sujet (thérapie cellulaire). Cette approche peut bien entendu être étendue à
l'utilisation
des anticorps restreints décrits dans (exemple 2, ainsi qu'à la détection de
tout récepteur
spécifique d'un ligand.
Pour la mise en oeuvre de cette application, des exosomes marqués ont été
produits.
Pour cela, avant purification des exosomes de la lignée DRl HA, celle-ci a été
incubée
avec un traceur fluorescent s'accumulant très fortement dans les exosomes
contenus dans
les granules de sécrétion. La marqueur utilisé, "Green Tracker', est un lipide
fluorescent
qui s'accumule dans les lysosomes des cellules. L'analyse en microscopie
confocale des
cellules, après fixation, montre la présence du marquage fluorescent dans les
granules de
sécrétion des cellules (Figure 4A). Les exosomes fluorescents ont ensuite été
produits et
purifiés à partir de ces cellules, dans les conditions décrites dans l'exemple
1. Rendus
ainsi fluorescents, ces exosomes (Figure 4B) ont été utilisés pour détecter,
dans un
échantillon biologique, la présence de lymphocytes T spécifiques de la
combinaison
DRI HA (lymphocytes THA). Il est entendu que tout autre marquage peut être
utilisé
dans le cadre de (invention, appliqué soit sur les cellules productrices, soit
sur les
exosomes produits.
Pour cela, les exosomes ont été incubés en présence d'un échantillon de
lymphocytes THA et de lymphocytes TH30, spécifiques d'un autre complexe. Les
résultats obtenus par cytofluorométrie de flux montrent que les exosomes
exprimant les
DRLHA se lient, de manière spécifique, aux lymphocytes THA (Figure 4C) alors
que
ces mêmes exosomes sont incapables de reconnaître des lymphocytes possédant
une
autre spécificité (Figure 4D). Ces résultats démontrent la capacité unique et
inattendue
des exosomes produits par la lignée mastocytaire selon (invention de détecter
des
lymphocytes T spécifiques de ce même complexe. Cette application peut être
mise en
oeuvre à partir de tout type d'échantillon biologique.
En outre, cette technologie peut être appliquée de la même façon à la
fabrication et à
(utilisation d'exosomes exprimant des complexes CMHI-peptide. La présente
invention
permet ainsi de détecter, à la surface de cellules présentatrices, voire de
cellules
tumorales, la présentation, par les molécules de classe I et de classe II du
CMH, de
peptides issus d'antigènes exprimés par les tumeurs. La présente invention
permet
également de détecter voire de purifier les lymphocytes T capables de
reconnaître ces
mêmes complexes. Ils peuvent ainsi permettre d'amplifier une population de
lymphocytes T spécifiques d'un complexe peptide-CMH particulier, par exemple
une
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wo oor~soai pcr,~~ioz69~
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population de lymphocytes CTL, en vue de leur utilisation thérapeutique. En
effet,
différentes approches d'immunothérapies de cancers ou d'infections virales,
par exemple,
ont été développées, basées sur le prélèvement, chez un sujet, de lymphocytes
et sur
l'expansion ex vivo de clones particuliers de lymphocytes T spécifiques d'un
antigène
impliqué dans la pathologie (antigène tumoral ou viral, par exemple). Ces
clones
amplifiés sont ensuite réadministrés au sujet, comme agent thérapeutique. La
présente
invention permet de faciliter grandement la sélection et l'amplification des
clones
spécifiques de lymphocytes T, et donc le potentiel et la mise en oeuvre de ces
approches
thérapeutiques.
lo
4- Production d'exosomes portant des molécules de classe II du CMH marines
(Figures 5A, 5B).
Les ADN complémentaires codant les chaînes a et (3 des molécules de classe II
marine d'haplotype IAb ainsi que la chaîne invariante marine ont été
introduits dans les
vecteurs d'expression eucaryotes NT dans lesquels la transcription de fADNc
est sous le
contrôle d'un promoteur SR alpha. Chacun des plasmides, en outre, porte un
gène de
résistance à fhygromycine (pour la chaîne a IAb), à la néomycine (pour IAb ~i
chaîne),
ou à la zéocine (pour la chaîne invariante). Après transfection des cellules
RBL2H3 par
2o électroporation (matériels et méthodes), les cellules ont été sélectionnées
sur la base de
leur résistance aux trois antibiotiques puis, les cellules résistantes ont été
clonées par
dilution limite et caractérisées pour l'expression des molécules IAb par
cytométrie de flux
en utilisant l'anticorps spécifique Y3P.
La figure 5 montre quelques uns des résultats ainsi obtenus. L'analyse par
cytométrie de flux montre que la cellule RBL IAbIi est reconnue par
l'anticorps Y3P
(spécifique des molécules IAb) de manière équivalente à la lignée
lymphocytaire B B4
14, alors qu'aucun marquage n'est détectable sur la lignée RBL d'origine
(Figure 5A).
L'analyse morphologique par microscopie ayant établi que les molécules de
classe II IAb
marines sont, comme les molécules humaines DR1, accumulées dans les granules
de
sécrétion de la cellule (non montré), ceci nous a amené à rechercher leur
localisation dans
les exosomes. L'exocytose des cellules étant déclenchée par l'addition de 1 mM
de
ionomycine, les exosomes ainsi obtenus ont été purifiés par
ultracentrifugation
différentielle (Cf exemple 1.2). L'analyse par western blot de ces
préparations d'exosomes
montre qu'elles contiennent des molécules marines de classe II du CMH
identiques à
celles détectées dans un lysat cellulaire contrôle (Figure SB).
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Ces résultats établissent que des molécules de classe II humaines (DR1) mais
aussi
marines (IAb) peuvent être exprimées et s'accumuler dans les exosomes des
lignées RBL
2H3 correspondantes.
S-Caractérisation morphologigue des exosomes produits par RBL 2H3 (Figure 6)
Les observations en microscopie électronique sur coupe congelée immunomarquée
des cellules RBL révèlent la présence de nombreux compartiments
intracellulaires
remplis de membranes. La majeure partie de ces membranes correspondent à des
l0 vésicules qui remplissent le lumen des compartiments (Figure 6A). Les
molécules de
classe II une fois transfectées dans ces cellules s'accumulent dans les
compartiments
possédant des vésicules internes et sont visualisées en particulier, en
association avec la
membrane de ces vésicules (Figure 6A).
Lorsque les cellules RBL sont stimulées de façon à induire leur dégranulation
(IgE
Antigène ou ionomycine), les compartiments intracellulaires fusionnent avec la
membrane plasmique. Les vésicules internes auxquelles sont associées les
molécules de
classe II sont relarguées dans le milieu extracellulaire. Ces vésicules sont
alors appellées
exosomes.
La méthode de choix en microscopie électronique pour étudier la morphologie
des
2o exosomes ainsi que leur contenu protéique est la méthode de " whole mount
". Cette
technique permet de visualiser des exosomes entiers dépourvus de tout autre
contenu
cellulaire. Cette méthode permet également de détecter ,avec une grande
efficacité, des
molécules associées à la membrane des exosomes. En utilisant cette technique
nous
avons observé que les exosomes sécrétés par les cellules RBL ont une taille
hétérogène
de 30 à 120 nm et une densitée aux électrons variable (Figure 6B). Les
molécules de
classe II sont abondantes dans la population de vésicules possédant une taille
de 80 à100
nm ayant une densité moyenne aux électrons. La grande majorité de ces
vésicules
enrichies en molécules de classe II ont une forme en assiette (Figure 6C).
6- Immobilisation des exosomes sur des supports (Figure SC).
Cet exemple décrit la fixation d'exosomes sur des supports solides, et montre
que
les exosomes ainsi fixés conservent leurs propriétés fonctionnelles. Ces
nouveaux
produits (supports-exosomes) peuvent être utilisés pour caractériser et
analyser les
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exosomes ; ou comme produits diagnostique ou réactifs pour détecter edou
stimuler in
vitro des lymphocytes T, par exemple.
Différentes préparations d'exosomes produits par des cellules RBL exprimant ou
non des molécules de classe II humaines ou marines ont été incubées avec des
billes de
latex de 4 microns activées par de (aldéhyde sulfate. Plus particulièrement,
les exosomes,
purifiés à partir de surnageants de dégranulation de RBL 2H3 ont été lavés en
PBS
(centrifugation à SOOOOrpm sur TLA 100.4 pendant 30 minutes). 30g.g d'exosomes
sont
mélangés avec 10 pL de billes Latex prélevées stérilement, homogénéisés puis
incubés
pendant 10 min à 1 S min à température ambiante. Le volume de bille est
ensuite complété
lo à 1 mL avec du PBS lx puis incubé sur roue à température ambiante pendant
2h. Ensuite
les billes " crosslinkés " avec des exosomes sont:
-Saturées en ajoutant de la glycine 100 mM final (30 min à température
ambiante),
-Centrifugées à 2200xg pendant 2 min à 4°C puis le culot de billes est
repris dans 1
mL de PBSIx SVF3% NaN3 0,01%
Pour utiliser les billes en cytofluorométrie,
-Laver deux à trois fois le culot de billes en PBSlx SVF3% NaN3 0,01%.
-Reprendre dans 1 mL de PBS 1 x NaN3 0,01 % .
-Utiliser entre SpL et 20pL par point et incuber classiquement dans le premier
puis
le second anticorps. La lecture se fait sur Facscalibur (Becton Dickinson).
Cette technique a permis de recouvrir la surface de ces billes de latex avec
des
exosomes, tout en préservant leur structure.
Lorsque les exosomes sont sur les billes, leur manipulation est plus aisée. En
effet,
ils peuvent être centrifugés à basse vitesse et détectés par des techniques de
cytometrie de
flux classique. La figure 5 C montre quelques exemples de détection, par
cytométrie de
flux, de différentes protéines entrant dans la composition des exosornes. Des
billes de
latex activées à l'aldéhyde sulfate ont ainsi été incubées soit avec des
exosomes produits
par les cellules RBL 2H3 non transfectées, soit avec des exosomes de cellules
RBL 2H3
exprimant les molécules de classe II humaines DR1 et la construction IiHA ou
ies
molécules de classe II marine IAb , soit avec du sérum de veau foetal (FCS) en
contrôle.
Les billes de latex ainsi préparées ont été ensuite incubées avec différents
anticorps
monoclonaux; ADl reconnaissant la molécule CD63 du rat présente dans les
granules de
sécrétion de RBL 2H3, Y3P anticorps spécifique des molécules IAb, et L243
anticorps
spécifique des molécules DR1. Ces différents anticorps étaient révélés par des
anticorps
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secondaires couplés à la phycoerythrine puis les marquages obtenus étaient
analysés par
cytométrie de flux grâce à un FACScalibur (Beckman).
On observe ainsi que la molécule CD63 est bien-sûr présente sur tous les
exosomes
issus de la cellule RBL exprimant ou non des molécules de classe II, alors que
des billes
5 de latex recouvertes d'exosomes IAb sont spécifiquement reconnues par Y3P et
non par
L243 tandis qu'à (opposé, les exosomes DRIiHA sont reconnus par L243 et non
par Y3P.
Aucun de ces anticorps ne reconnait des billes de latex recouvertes de Sérum
de veau
foetal (Figure SC).
Ces résultats montrent que cette technique permet de détecter de manière
sensible
l0 et spécifique (expression de différentes protéines rentrant dans la
composition des
exosomes. L'exemple 8 montre par ailleurs que des tels produits (exosomes-
support)
permettent également de détecter ou de stimuler la prolifération de
lymphocytes T
spécifiques.
15 7-Manipulation de la composition des exosomes (Fi~ure7)
Les exosomes sont des vésicules délimitées par une bicouche lipidique dans
laquelle sont insérés un grand nombre de molécules comme les molécules de
classe II du
CMH ou CD63 citées précédemment. A (intérieur de ces vésicules, on trouve les
régions
20 cytoplasmiques des molécules transmembranaires précédentes mais aussi des
protéines
solubles issues du cytosol des cellules. Pour démontrer qu'il est possible de
modifier à
volonté le contenu de ces vésicules, nous avons utilisé comme traceur la Green
Fluorescent Protein (GFP).
L'ADNc codant la GFP a été fusionné a l'extrémité COOH terminale de la chaîne
25 beta de la molécule DRl humaine. Cette construction, insérée dans les
vecteurs
d'expression NT portant le gène de résistance à fhygromycine, a été
cotransfectée dans la
cellule RBL 2H3 avec un vecteur portant la chaîne alpha de DR1 et le gène de
résistance
à la néomycine. Des cellules résistantes à ces deux antibiotiques ont été
sélectionnées
puis triées positivement pour l'expression de la GFP.
30 Plus particulièrement, nous avons réalisé une construction liant la partie
cytoplasmique de la chaîne DR(3 (en C-ter) à l'extrémité N-ter de la GFP.
L'ADNc de
DR(3 possède un site PstI en position 565. Un fragment de 200 paires de bases
environ du
coté 3' de cet ADNc a été amplifié par PCR à partir du vecteur pcDNA3/RSV/DRa
au
moyen de 2 oligonucléotides incluant le site PstI pour le 5' et le site NcoI
pour le 3' qui de
35 plus éliminait le codon stop. Le fragment de PCR obtenu a été digéré par
PstI et NcoI et
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cloné dans les mêmes sites du vecteur pEGFP N 1 (Clontech). Le plasmide
résultant,
digéré par PstI et XbaI, a permis de libérer un fragment correspondant aux
derniers 30
acides aminés de DRa suivi de la GFP. En parallèle, le plasmide pcDNA3/RSV a
été
digéré par EcoRVlPstI, libérant ainsi un fragment correspondant au reste de la
chaîne
DRa (du début jusqu'au site PstI). Les deux fragments ont ensuite été
assemblés puis
clonés dans pcDNA3/CMV entre EcoRV et XbaI.
L'analyse de ces cellules (DR1 GFP) par cytométrie de flux montre que les
cellules
reconnues par (anticorps L243, spécifique des molécules DR1, émettent aussi
une
fluorescence verte détectée dans le canal FL1 alors que des cellules
transfectées avec les
chaînes alpha et beta de DR1 ne comportant pas de GFP n'émettent aucune
fluorescence
dans le canal FL1 (Figure 7A).
Afin de montrer que la GFP est réellement contenue dans les exosomes de la
cellule RBL 2H3, des exosomes issus des cellules RBL DR1 GFP ont été préparés
par
ultracentrifugation différentielle puis analysés par western blot (Figure 7B)
et cytométrie
de flux après " crosslinking " sur des billes de latex (Figure 7C). Un
anticorps spécifique
de la GFP détecte, par western blot, dans la cellule DR1 GFP et dans ses
exosomes une
protéine de 65 kDa correspondant au poids moléculaire de la chaîne beta de DR1
fusionnée avec la GFP (Figure 7 B) alors qu'aucun signal n'est détecté dans
les lysats
cellulaires de la cellule RBL2H3 exprimant ou non la molécule DR1 seule. Par
comparaison entre des billes de latex " crosslinkées " avec du sérum de veau
foetal ou des
exosomes issus de la cellule DR1 GFP, on observe que seules les billes
recouvertes
d'exosomes induisent une fluorescence dans le canal FL 1 (FITC) et sont
reconnues par
(anticorps L243, spécifique de DR1, détecté par un anticorps secondaire couplé
à la
phycoerythrine.
Ces résultats démontrent donc qu'il est possible d'introduire une protéine
exogène à
l'intérieur des exosomes produits par la cellule RBL 2H3. Ces résultats
montrent aussi
qu'il est possible de diriger une protéine dans un exosome par expression,
dans la cellule
productrice, sous forme de fusion avec une molécule transmembranaire, telle
qu'une
molécule du CMH.
8-Caractérisation fonctionnelle des exosomes (Figure 8)
Cet exemple montre que les exosomes produits par la cellule RBL2H3, portant
des
molécules de classe II du CMH, sont capables de lier un peptide antigénique et
de
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stimuler un lymphocyte T exprimant un récepteur spécifique de ce complexe
peptide-
CMH classe II.
Des exosomes produits à partir de cellules RBL DR1 IiHA marquées au green cell
tracker ont été incubés en présence de deux types de cellules T : des THA qui
possèdent
un TCR spécifique des complexes HLA-DRl/HA et des T Jurkat sauvages dépourvues
d'un tel récepteur. Les expériences de liaisons sont réalisées en plaque 96
trous à fond
rond, en milieu RPMI 1640 complémenté par 10% de sérum de veau foetal,
tamponné par
IOmM Hépès à raison de SOpI final par puits, 105 cellules T par puits et des
quantités
variables d'exosomes fluorescents pendant 3 heures à 37°C. Ensuite,
deux lavages sont
l0 effectués dans le même milieu avant d'analyser les cellules reprises dans
400 ~,I de PBS
au FACS.
Une gamme effet dose a été réalisée montrant que l'intensité du marquage des
THA
était proportionnelle à la quantité d'exosomes employée. 10g cellules RBL DR1
IiHA ont
donné 700 wl d'exosomes. Des doses allant de 32 à 2 p,l d'exosomes par puits
ont été
testées. Le marquage obtenu avec 16 pl par point a été retenu, ce qui
correspond à la
production d'exosomes effectuée par 2,3 millions de cellules (résultats non
exposés).
Les résultats obtenus montrent que la population THA est marquée par les
exosomes fluorescents ce qui donne une fluorescence détectable en FL1 par
cytofluorimétrie, tandis que les Jurkats sauvages ne sont pas modifiées
(figure 8A).
Le même type de marquage a été réalisé, mais après la liaison des exosomes,
les
cellules T ont été incubées avec un anticorps monoclonal de souris AD 1 anti
CD63 de rat,
révélé ensuite par des anticorps d'âne anti IgG de souris marqués à la
phycoérythrine
(Jackson Immuno Research, West Grove, PA). Le même marquage a été réalisé en
parallèle sur les cellules T n'ayant pas été exposées à des exosomes. On
observe (figure
8B) que seules les cellules THA ayant liés des exosomes comme (atteste leur
fluorescence en FL1, sont aussi marquées en FL2 ce qui indique la nouvelle
présence de
CD63 de rat à leur surface.
Nos résultats montrent donc que les exosomes fluorescents sont utilisables
pour
visualiser par cytométrie de flux des populations de lymphocytes T spécifiques
de
complexes HLA-DR/peptide antigénique portés par les exosomes.
Pour évaluer la capacité des exosomes à stimuler un lymphocyte T de manière
dépendante de la présence d'un peptide, les exosomes obtenus à partir de la
cellule DRl
GFP ont été crosslinkés sur des billes de latex puis incubés en présence de
cellule de la
lignée lymphocytaire T Jurkat exprimant ou non un récepteur T spécifique du
complexe
DR1-peptide HA 307-319.
CA 02349679 2001-05-02
WO 00/28001 PCT/FR99/02691
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Les billes de latex ont été préparées de la même façon que pour la
cytofluorométrie
de flux mais lavées en milieu complet (RPMI, 10% sérum de veau foetal,
Penicilline-
Streptomycine-Glutamine 1 %, l3mercaptoethanol 0,1 %, Sodium Pyruvate 4%).
Pour la
stimulation des lymphocytes T, chaque culot de billes a été repris dans 100
pL, SOpL
déposé dans le premier puits d'une plaque 96 puits et SOp.L dilué de deux en
deux. Un
contrôle a été fait en procédant de la même façon avec des billes incubées
dans du sérum
de veau foetal. Les cellules T (T Jurkat Pasteur et THA1.7) ont été ajustées à
106
cellules/mL et SOp.L ont été déposés par puits. Le peptide dilué à lSp.M dans
du milieu
complet a été ajouté également à raison de SOpL par puits. Dans les séries
dépourvues de
lo peptide, SOwL de milieu complet ont été ajoutés par puits. La plaque de
culture a été
placée dans l'incubateur (37°C, 5% C02, H20) pendant 20 heures puis le
surnageant a
été prélevé et la concentration d'IL2 a été évaluée par un test CTL.L2.
On observe ainsi que l'addition du peptide HA (SmM) induit spécifiquement la
stimulation de la cellule T Jurkat exprimant le récepteur du complexe DR1-HA
(THA)
alors qu'il n'a aucun effet sur le lymphocyte T contrôle (T Jurkat). Par
ailleurs, des
exosomes sont incapables de stimuler le THA en absence de peptide HA (Figure
8C).
9-Exosomes de la lunée mastocytaire humaine HMC 1 (Figure 9)
Cet exemple montre que des exosomes modifiés selon l'invention peuvent être
produits à partir d'autres cellules, notamment humaines. En particulier, les
résultats que
nous avons obtenus démontrent que la lignée mastocytaire d'origine humaine HMC
1 est
capable de produire des exosomes sous (impulsion d'une augmentation de calcium
intracellulaire et dans des conditions identiques à celles qui induisent la
sécrétion
d'exosomes par la lignée de rat RBL 2H3.
La caractérisation de la lignée HMC 1 par cytométrie de flux indique que la
surface
de ces cellules exprime des molécules de classe I du CMH (W6.32) mais pas de
molécules de classe II (L243). Par ailleurs, elles sont positives pour les
molécules CD9,
CD63 et CD81 mais négatives pour les molécules Lampl et Lamp 2 (Figure 9 A).
3o Des exosomes ont été produits à parür de la lignée HMC 1 par l'addition de
Ionomycine (1mM) puis purifiés à partir des surnageants par
ultracentrifugation
différentielle. Leur composition a été analysée par cytométrie de flux après "
crosslinking
" sur des billes de latex et par western blot.
L'analyse des exosomes par la méthode utilisant les billes latex montre qu'ils
portent les molécules Lampl, CD9, CD63, CD81 et les molécules de classe I du
CMH
CA 02349679 2001-05-02
WO 00/28001 PCT/FR99/02691
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mais pas de molécules de classe II ni la molécule Lamp2 (Figure 9B). Par
ailleurs, Ia
morphologie observée par microscopie électronique de ces exosomes est
identique à ceux
produits par la lignée RBL 2H3. Enfin la composition protéique observée par
western
blot confirme ces résultats puisque nous avons trouvé par cette technique les
molécules
CD63, Lampl, CMH de classe I alors que Lamp2, CMH de classe II restent
négatifs
(Figure 9C).
En conclusion, la lignée HMC 1 semble (homologue humaine de la lignée de rat
RBL-2H3 de part sa capacité, après une augmentation de calcium
intracellulaire, à
produire des exosomes qui ont les mêmes caractéristiques structurelles et
moléculaires.
Ces cellules permettent donc de produire des exosomes humains recombinants
exprimant
des molécules de classe II du CMH ou toute autre molécule qui y serait
spécifiquement
adressée.
