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Procédé de détecüon de micro-organismes et snpporE utilisable
dans un teI procédé
DESCRIPTION
La. présente invention concerne un procédé de détection de la présence dans un
échantillon, contenu dans un récipient stérile, d'au moins un micro-organisme,
aérobie
ou anaérobie, l'échantillon étant en contact avec un milieu de croissance.
L'invenüon
concerne également un support pouvant être mis en oeuvre dans un tel procédé.
1o Le document EP A-0.124.93 décrit un procédé de détection de micro-
organismes aérobies et anaérobies. En utilisant un récipient adapté à la
détection des
micro-organismes par changement de pression et un milieu de croissance adapté,
la
détection 'est accélérée.
Par contre, il n'y a pas de support au sein du récipient et cette solution ne
peut
être déduite de ce document.
Il est connu que les micro-organismes aérobies (bactëries, levures) adhérent
et
colonisent la majorité des surfaces qui leur sont offertes. Cette fixation
améliore les
échanges nutrüionnels et donc le niveau de croissance des micro-organismes.
Ainsi, la
présence d'une phase solide influence bon nombre de processus métaboliques,
comme
la fixation d'azote, l'oxydation alcoolique, da nitrification et la
dénitrification, etc. Cette
particularitë est largement utilisée en microbiologie industrielle.
Ainsi, l 'état de la technique peut être dé, fini par le document US A-5,
cS72, 484
qui a pour objet un récipient pour détecter des micro-organismes aérobies
stricts dans
un échantillon, qui comprend une chambre contenant un milieu de culture en son
sein,
et définissant un espace libre au-dessus du milieu. Ce document concerne
également
une méthode de fabrication d'un tel récipient et une méthode de croissance de
micro-
organismes aérobies stricts. Un insert non toxique hydraté avec ledit milieu
de
croissance possède une surface libre qui dëborde au moins partiellement dans
l'espace
libre, afin de permettre l'approvisionnement en oxygène du milieu de
croissance, et
donc augmenter 1 'oxygénation des micro-organismes introduits dans 1
'échantillon, et
FEUILLE MODIFI E
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améliorer de leur processus métabolique. Cet insert est choisi dans de groupe
des
matériaux suivants : éponge, coton, billes de fibres de verre et résine.
Toutefois, cet appareil et ce procédé sont limités à la détection des micro
organismes aérobies stricts. D'ailleurs, et de maniëre très explicite, il est
fait état de la
nécessité d'augmenter les échanges en oxygène entre le support et l'espace
libre et
confiné du rëcipient. Pour ce faire, l'insert est monobloc et assez volumineux
car
occupant de 25 à 80 % de la chambre intérieure. L'objectif de ce document est
de
permettre au maximum les échanges d'oxygène en dehors du contact entre
l'insert et le
milieu de croissance. Toutes ces caractéristiques ne pouvaient que détourner
l'homme
io du métier de l'intérêt d'utiliser, au sein dudit récipient, un support
solide, inerte et
stérile, dans des conditions d'anaérobiose, et même dans des conditions
d'aérobiose
lorsque la quantité de ce support est ajustée de façon à obtenir une couche de
matériau
dont la surface soit sensiblement équivalente à (interface entre l'échantillon
et
l'atmosphére gazeuse du récipient.
~s Les résultats obtenus par la demanderesse lors de ces travaux d'étude
étaient
donc inattendus.
La présente invention cherche à protëger un procédé qui est bien plus
polyvalent, car utilisable avec tous les micro-organismes, quel que soit leur
2o métabolisme respiratoire. De plus, ia disposition des inserts ou supports
au sein du
récipient n'a pas à suivre un cadre aussi contraignant que ce qui est
nécessaire pour le
document de l'état de la technique.
A cet effet, ia présente invention concerne un procédé de détection de la
25 présence dans un échanüllon, contenu dans un récipient stérile, d'au moins
un micro-
organisme, quel que soit son métabolisme respiratoire, l'échantillon étant en
contact
avec un milieu de croissance, caractézisé en ce qu'il consiste à
- ajouter au sein du récipient au moins un support selide, inerte et stérile,
- incuber à une température appropriée, et
so - observer une variation d'au moins une caractéristique liée à la présence
du ou des
micro-organismes à détecter au sein dudit récipient.
FEUILLE MODIFI E
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Préférentiellement, le procédé s'applique aux micro-organismes à métabolisme
anaérobie.
Ce procédé est utilisé dans un contrôle de stérilité
La présente invention concerne également un support solide, inerte et stérile,
utilisé dans le procédé, défini précédemment, qui, dans un second mode de
réalisation,
est caractérisé par le fait qu'il est constitué de matériaux naturels, par
exemple
- billes de silice,
- billes de verre de petite taille (pleines, creuses ou poreuses),
- particules de quartz,
1o = grasns de sable ,
- grains de vermiculite, zéolite et/ou feldspath,
- laine de verre etlou de roche,
- billes d'argile, et
- particules de liège.
Selon un second mode de réalisation, le support solide, inerte et stérile,
utilisé
dans le procédé ci-dessus, est constitué de matériaux artificiels, par exemple
- billes de polystyrène,
- billes de polyéthylène,
- billes de polypropylène,
- billes de polyéthylène de petite taille agglomérées, de porosité et
d'épaisseur variables,
- supports de croissance sous forme de billes de petite taille utilisés en
culture cellulaire,
- billes de latex ,
- billes revêtues de gélatine, et
- grains de résine.
Selon un troisième mode de réalisation, le support solide, inerte et stérile,
utilisé dans le procédé ci-dessus est constitué d'un élément de toute forme en
polyéthylène. Quel que soit le mode de réalisation, ce support est constitué
de billes ou
grains d'un diamètre compris entre 1 pm et 10 mm, et notamment entre 0,1 mm et
5
mm.
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Les figures ci jointes sont données à titre d'exemple explicatif et n'ont
aucun
caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention. Sur
chacune de
ces figures; la courbe 1 correspond à l'insertion d'un support en liège, Ia
courbe 2 à
l'insertion d'un support en polyéthylène, et la courbe 3 à l'absence de
support, servant
ainsi de référence.
La figure 1 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le cas de
Haemophilus infZuenaae.
La figure 2 représente une courbe de la cinétique de croissance dans Ie cas de
Kingella denitrificans.
io La figure 3 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le cas
de
Staphylococcus saprophyticus.
La figure 4 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le cas de
Bacteroides fragilis.
La figure 5 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le cas de
heillonella parvula.
Enfin, la figure 6 représente une courbe de la cinétique de croissance dans le
cas
de Clostridium sporogenes.
La présente invention concerne un procédé de détection de la présence dans un
échantillon, contenu dans un récipient stérile, d'au moins un micro-organisme,
aérobie
ou anaérobie, l'échantillon éiant en contact avec un milieu de croissance.
Cette détection est en fait accélérée par le fait que l'on introduit dans le
récipient
un support solide, inerte et stérile.
La liste ci-dessous regroupe des supports permettant d'accélérer le temps de
détection de micro-organismes présents dans un échantillon. Cette liste n'est
bien
entendu pas limitative.
Dans le cas de supports dits naturels, an peut utiliser ;
- des billes de silice,
- des billes de verre de petite taille qui peuvent être pleines, creuses ou
poreuses,
- des particules de quartz,
- des grains de sable ,
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S
- des grains de vermiculite, zéolite et/ou feldspath,
- de la laine de verre ou de roche,
- des billes d'argile, et
- des particules de liège.
s Dans le cas de supports dits artificiels, on peut utiliser
- des billes de polystyrène,
- des billes de polyéthylène,
- des billes de polypropylène,
- des billes de polyéthylène de petite taille agglomérées, de porosité et
d'épaisseur
lo variables,
- des supports de croissance sous forme de billes, de petite taille, utilisés
en culture
cellulaire de marque déposée CYTODEX de type 1 et 3,
- des billes de latex,
- des billes recouverte de gélatine, et
ls - des grains de résine di-éthyl-amino-éthyle (DEAE) pour les résines
échangeuses
d'anions ou de marque déposée SEPHADEX (CM = Carboxy Méthyl cellulose) pour
les
résines échangeuses de cations.
Bien entendu, les supports ajoutés dans un seul récipient peuvent étre
constitués
d'un mélange d'au moins deux supports artificiels ou naturels, ci-dessus
mentionnés ou
2o bien d'un mélange d'au moins un support artificiel et d'au moins un support
naturel, ci-
dessus mentionnés.
Mise en ae,_ uvre
25 La mise en oeuvre présentée concerne un mode particulier de réalisation, il
existe
bien d'autres possibilités. Cette mise en oeuvre ne peut donc être considérée
comme
limitant la portée de la protection recherchée.
1. Préparation des flacons
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Tous Ies supports ont été stérilisés par un chauffage de 15 minutes (mn) à 120
degrés Celsius (°C). Aprés séchage pendant 24 heures à 37°C, ils
ont été répartis
stérilement dans les flacons. La quantité introduite par flacon dépend du
support utilisé
et est ajustée de façon à obtenir une couche de matériau dont la surface soit
sensiblement équivalente à la section des flacons. Les flacons contenant les
supports
sont â nouveau chauffés 15 mn à 120°C puis reçoivent stérilement 40 ml
de bouillôn
nutritif aérobie VITAL AER (Réf. 52511 de bioMérieux) ou de bouillon nutritif
anaérobie VITAL ANA (Réf. 52512 de bioMérieux) contenant le traceur de
croissance
microbienne ou indicateur, tel que décrit et revendiqué dans le brevet EP-B-
0.424.293
1o de Ia demanderesse.
Les flacons sont ensuite mis sous vide et gazés de manière à reconstituer une
atmosphère adaptée au type de bouillon concerné (aérobie pour VITAL AER ou
anaérobie pour VITAL ANA). Ils sont ensuite bouchonnés et capsulés pour être
prêts à
l'emploi.
Afin de pouvoir comparer les performances de l'adjonction des supports selon
la
présente invention sur des milieux, des flacons VITAL AER et ANA sans support
ont
subi Ie même processus de fabrication, à l'exception de la préparation et de
l'addition du
support.
2. Analyse des échantillons
Les flacons, tels que préparés ci-dessus, reçoivent ensuite stérilement un
échantillon (biologique ou non) dans lequel on veut rechercher la présence de
micro
organismes.
Dans le cas d'une simulation d'hémocultures positives comme cela a été le cas
au
laboratoire, il a été procédé de la façon suivante. Premiérement, les micro-
organismes
étudiés sont préalablement cultivés sur milieu de croissance adapté tel qu'une
gélose,
généralement une gélose Columbia avec 5% de sang de mouton.
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Pour chacun d'eux, une suspension est réalisée en eau distillée en prélevant
une
ou plusieurs colonies. Cette suspension est calibrée à 108 cellules/ml et
diluée au
millionième. A l'aide d'une seringue stérile, un millilitre de cette dilution
est introduit
dans chaque flacon VITAL avec ou sans support préalablement inoculé par 5 ml
de sang
de cheval ou de sang humain. Ainsi, environ cent cellules de micro-organisme
sont
introduites par flacon.
Les flacons, contenant l'échantillon à analyser, sont placés dans le système
de
marque VITAL (réf. : 99105, 99106 ou 99122 de bioMérieux) qui joue le rôle à
Ia fois
d'un incubateur et d'un lecteur. Ce système assure une incubation des flacons
à une
l0 température appropriée. La cinétique de l'indicateur est suivie par une
mesure optique à
travers la paroi en verre transparente des flacons. Si l'échantillon contient
au départ des
micro-organismes, ceux-ci vont se multiplier au cours de l'incubation et la
modification
de l'indicateur, présent dans le milieu réactionnel, traduira ia présence
desdits micro-
organismes dans l'échantillon.
L'efficacité d'un support sera appréciée en comparant les temps de détection
obtenus en utilisant des flacons avec et sans support.
Exemples selon l'invention
Exemple 1 : Détection de micro-organismes à métabolisme aérobie
L'essai a été effectué dans les conditions suivantes
- flacons VITAL AER avec et sans support, préparés selon le processus décrit
dans le
paragraphe "Préparation des flacons",
- supports étudiés : billes de polyéthylène et particules de liège,
- souches testées
~ Haemophilus infZuenzae (réf. bioMérieux : JHI 8006064),
~ Kingella denitrificans (réf. bioMérieux : JKD 8311002), et
~ Staphylococcus saprophyticus (réf. bioMérieux : MSA 54677),
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- milieu d'isolement des souches : gélose Columbia bioMérieux additionnée par
5% de
sang de mouton,
- simulation d'hémocultures positives comme indiqué dans ie paragraphe «
Anaiyse des
échantillons », avec addition stérile d'environ cent micro-organismes et de 5
ml de sang
de cheval par flacon,
- détermination des temps de positivité des flacons par le système VITAL
(marque
déposée), et
- tracé de cinétique de croissance pour chaque flacon.
lo Les résultats obtenus sont bien représentés sur le tableau 1 qui suit.
Flacons Flacons Flacons
Souches sans avec avec
support billes particules
de de
polythylne lige
Haemophilus infZuenzae41,6 heures22,5 45,9 31,2 25
(h) h % h
Kingella denitrificans83 h 52 37,3 28 66,3
h % h
Staphylococcus saprophyticus35,3 h 27,5 22,1 28,2 20,1
h % h
Tableau 1 : Temps de détection en heures et gain de temps en % de
l'utilisation
des flacons avec supports par rapport aux flacons sans support dans le cas de
micro-organismes aërobies, anaérobies facultatifs
Ce tableau 1 ci-dessus indique un gain en temps de détection par rapport aux
flacons sans support compris entre 22,1 à 45,9 % selon les souches en présence
de billes
de polyéthylène. Cette fourchette s'échelonne entre 20,1 à 66,3 % selon les
souches en
2o présence de particules de liège.
L'effet des supports peut être visualisé sur les cinétiques de croissance
présentées
sur la figure 1 dans le cas de Haemophilus influenzae, sur la figure 2 dans le
cas de
Kingella denitrifieans et sur la figure 3 dans le cas de Staphylococcus
saprophyticus.
2$ Exemple 2 : Détection de micro-organismes à métabolisme anaérobie strict
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L'essai a été effectué dans les conditions suivantes
- flacons VITAL ANA avec et sans support, prépaxés selon Ie processus décrit
dans le
paragraphe "Préparation des flacons",
- supports étudiés : billes de polyéthylène et particules de liège,
- souches testées
~ Bacteroides, fragilis {réf. bioMérieux : HBF 358),
~ T~eillonella parvula (réf. bioMérieux : JKD 8311002), et
~ Clostridium sporogenes {réf, bioMérieux : ACO 100651),
lo - milieu d'isolement des souches : gélose Columbia bioMérieux additionnée
par 5% de
sang de mouton incubée en anaérobiose,
- simulation d'hémocultures positives comme indiqué dans le paragraphe
"Analyse des
échantillons", avec addition stérile d'environ cent micro-organismes et de 5
ml de sang
de cheval par flacon,
- déternnination des temps de positivité des flacons par le système VITAL, et
- tracé de cinétique de croissance pour chaque flacon.
Les résultats obtenus sont bien représentés sur Ie tableau 2 qui suit.
Flacons sansFlacons Flacons
avec avec
Souches support billes particules
de de
poiythylne lige
Bacteroides fragilis86,5 h 45 48 62,2 28,1
h % h
heillonella parvula 176,4 h 53,6 69,6 64,5 63,4
h % h
Clostridium sporogenes45,4 h 27,7 39 38 16,3
h % h
Tableau 2 ; Temps de détection en heures et gain de temps en % de
l'utilisation
des flacons avec supports par rapport auz flacons sans support dans le cas de
micro-organismes anaérobies
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Le tableau 2 ci-dessus indique un gain en temps de détection par rapport aux
flacons sans support de 39 à 69,6 % selon les souches, en présence de billes
de
polyéthylène, et de 16,3 à 63,~ % selon les souches, en présence de particules
de liège.
s L'effet des supports peut être visualisé sur les cinétiques de croissance
présentées
sur la figure 4 dans le cas de Bacteroides fragilis, sur la figure 5 dans le
cas de
veillonella parvula et sur la figure 6 dans Ie cas de Clostridium sporogenes.
Que I'on se reporte à l'exemple 1 ou à l'exemple 2, on constate donc une nette
diminution des temps de détection qui traduit la positivité des flacons
contenant un
lo support, qui est le résultat d'un virage plus rapide de l'indicateur, et
cela aussi bien pour
les micro-organismes à métabolisme aérobie qu'à métabolisme anaérobie.
Exemple 3 : Etude complémentaire sur la détection de différents micro-
organismes à métabolisme aérobie, anaérobie facultatif (AAF)
Dans cet exemple, les souches AAF utilisées sont soit des bactéries soit des
levures. De plus, plusieurs analyses ont été réalisées pour chaque espèce
étudiée. Elles
appartiennent aux différentes espèces ou genres suivants
~ Neisseria,
~ Brucelles ,
~ Levures : Candides albieans, Candides parapsilosis, Candides guillermondü,
~ Staphylococcus,
~ Pseudomonas, et
~ Autres souches appartenant à : Haemophilus, Kingella, Eikenella et
Micrococcus.
Les résultats obtenus sont bien représentés sur Ie tableau 3 qui suit. Toutes
les
valeurs exposées correspondent aux temps de détection en présence de supports
exprimés en pourcentage par rapport aux temps de détection obtenus avec des
flacons
3o sans support et considérés comme ayant une valeur de 100 %.
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Espces arobies Nombre de souches Polythylne Polypropyl
par ne
espce
Neisseria 3 77,8 104,3
Brucelles 3 80,4 124,0
Levures 6 70,6 103,6
Staphylococcus 5 83,6 95,9
Pseudomonas 2 74,6 174;3
Autres souches 4 60,8 g5,g
Moyenne (total) 3,8 (23) 74,6 114,7
pour
toutes les espces
Tableau 3 : Influence de la nature des supports sur la détection de plusieurs
micro-organismes aérobies
Ce tableau 3 indique clairement que le support de polyéthylène permet de
réduire
significativement les temps de détection de l'ensemble des espèces ou genres
testés, ces
temps variant de 60,8 % à 83,6 % par rapport aux temps obtenus avec les
flacons sans
support (100 %).
l0 Le support de polypropylène n'offre pas d'intérêt car il ralentit les temps
de
détection dans bon nombre de cas, c'est-à-dire que la valeur est supérieure à
la valeur de
100 % obtenue pour la référence en ce qui concerne les flacons sans support.
Cette
valeur peut même atteindre 174,3 % pour Pseudomonas.
1s Exemple 4 :. Etude de l'influence du support de polyéthylène sur la
détection de micro-organismes à métabolisme anaérobie
Dans cet exemple, les souches utilisées sont des bactéries anaérobies
appartenant
aux genres suivants : * Bacteroides ,
20 * Clostridium,
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* Peptostreptococcus ,
* yeillonella, et
* Fusobacterium.
Les résultats obtenus sont bien représentés sur le tableau 4 qui suit.
Toutes les valeurs exposées sont des pourcentages qui, comme pour le tableau
3,
correspondent aux temps de détection en présence de support, exprimés en
pourcentage
par rapport aux temps de détection sans support rapportés à 100 %.
Espces anarobies Nombre de souches par Po-lythylne
espce
Clostriclium 2 69,0
Bacteroi'cles 7 64, 5
Peptostreptococcus2 97,3
heillonella 2 27, 6
Fusobacterium 1 70,6
Moyenne (total) 2,8 (14) 65,8
pour
toutes les espces
Tableau 4 ; Influence du support sur la détection de plusieurs micro-
organismes
1o anaérobies
Ce tableau 4 ci-dessus indique un gain en temps de détection par rapport aux
flacons sans support compris entre 2,7 et 72,4 % selon ies espèces anaérobies
testées.
Ainsi, comme le montrent les exemples ci-dessus, l'efficacité du procédé est
avérée. Ceci est vrai poux les procédés utilisés dans des hémocultures
(recherche de
micro-organismes dans le sang), mais également pour d'autres applications
basées sur la
culture de micro-organismes.
2o Ce procédé consiste essentiellement en quatre ou cinq étapes successives.
Premièrement, il convient d' aj outer l' échantillon à analyser au sein du
récipient et
un milieu de croissance. Deuxièmement, il faut également ajouter au sein dudit
récipient
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au moins un support solide, inerte et stérile. Troisièmement et
éventuellement, on peut
sceller le récipient. Quatrièmement, on incube à une température appropriée.
Enfin et
cinquiëmement, on observe une variation d'une caractéristique en relation avec
Ia
présence, la croissance et/ou le métabolisme d'un micro-organisme à détecter.
Cette caractéristique peut généralement être de deux natures différentes.
D'une part, il peut s'agir d'un indicateur chimique, par exemple coloré,
fluorescent, chromogène, qui est ajouté dans le récipient avant l'incubation.
D'autre
part, il peut s'agir d'un paramètre physico-chimique ou électrique, qui est
modifié par la
simple croissance des micro-organismes à détecter. Dans ce dernier cas, il
n'est pas
lo nécessaire d'ajouter de substance pour permettre l'établissement d'une
variation de ce
paramètre.Cette observation d'une variation d'une caractéristique peut être
manuelle,
c'est-à-dire visuelle, ou bien automatique. Dans le cas d'une observation
automatique, le
ou les paramètres peuvent être observés par des capteurs qui, par exemple
mesurent la
pression, Ia production de C02, la turbidité, le potentiel d'oxydoréduction ou
le pH.
Cette énumération n'est pas limitative, et elle peut contenir toute
caractéristique
physico-chimique ou électrique pouvant varier avec l'activité métabolique d'un
micro-
organisme.
En ce qui concerne la température d'incubation appropriée, mentionné dans le
2o procédé ci-dessus exposé, celle-ci varie en fonction de la famille, de
l'espèce ou du
genre du micro-organisme testé. Ainsi, cette variation est très large et est
comprise entre
sensiblement 0 et 100 °C selon le micro-organisme. Ces températures
sont toutefois bien
connues de l'homme du métier et/ou ne présentent aucune difficulté à être
déterminée.
Ce procédé peut également être utilisé, en plus de l'analyse des échantillons
dans
lequel on veut mettre en évidence la présence de micro-organismes, dans ia
recherche de
la stérilité (liquides biologiques : sang, liquide céphalo-rachidien, liquides
pleuraux,
urine, etc., échantillons non biologiques tels que l'eau, les produits
alimentaires ou
pharmaceutiques).
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Les résultats présentés dans les exemples ci-dessus permettent de démontrer
l'impact des supports de croissance sur les temps de détection de micro-
organismes
aussi bien aérobies et qu'anaérobie (ces derniers exigeant pour leur
croissance une
atmosphére N2/C02 sans 02). La majorité des temps de détection a été diminuée
de
façon significative.
Les exemples se limitent à l'utilisation de certains supports et à l'étude de
leur
impact sur lâ détection de certains micro-organismes. Mais, des résultats
similaires ont
d'ores et déjà été obtenus avec d'autres supports et en étendant l'étude à
d'autres micro-
organismes. La portée de la présente invention n'est donc pas limitée aux
espéces et aux
supports étudiés.
En conclusion, la présence d'un suppart selon l'invention améliore de façon
significative la rapidité de détection de la présence de micro-organismes dans
un
échantillon, quel que soit son métabolisme, aérobie ou anaérobie. Un tel
résultat a été
obtenu sans avoir à rechercher l'effet d'une meilleure oxygénation ou d'une
meilleure
exposition des micro-organismes à l'oxygène pouvant être présent dans le
milieu.
