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POLYPEPTIDES DERIYES DE JNK3
La présente invention est relative au domaine de la biologie et de la
régulation
des voies de transduction du signal en réponse aux stimuli extracellulaires.
Plus
particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides
dérivés de
la protéine JNK3 humaine, leurs variants, les séquences nucléotidiques
correspondantes, et leurs utilisations.
La protéine JNK (c-jun N-terminal kinase), nommée aussi SAPK (Stress-
Activated Protein Kinase), appartient à la famille des MAP (Mitogen-Activated
Protein) kinases. Elle est impliquée dans les voies de transduction du signal
en
réponse aux stimuli extracellulaires (par exemple cytokines proinflammatoires
ou
stress environnementaux). Son activation nécessite la phosphorylation de la
Thréonine 221 et de la Tyrosine 223 au sein d'un motif tripeptide très
conservé T-P-Y
situé dans le domaine kinase (Dérijard et al. 1994). Les substrats de la JNK
sont des
facteurs de transcription tels que c-Jun (phosphorylé sur la Serine 63 et la
Serine 73),
ATF-2 (phosphorylé sur la Thréonine 69 et la Thréonine 71) et Elk-1.
Les JNK présentent de nombreuses isoformes, et dix isoformes ont été
répertoriées à ce jour. Elles dérivent de trois gènes différents, nommés JNKI,
JNK2 et
JNK3. Les gènes JNKI et JNK2 codent pour deux isoformes a et (3 par épissage
alternatif (Gupta et al. 1996). Pour chaque isoforme a et (3, il existe une
version
courte et une version longue en C-terminal. La version courte est liée à
l'insertion,
lors de l'épissage alternatif, de cinq nucléotides qui apportent un codon de
terminaison.
Les JNK3al et JNK3a2 sont les deux seules isoformes de JNK3 répertoriées
jusqu'à présent. Elles diffèrent des JNKI ou JNK2 entre autre par une
extension en
N-terminal de 38 acides aminés dont la fonction n'a pas encore été établie.
L'homologue JNK3 de rat, nommée SAPK~3, ne présente pas cette particularité.
La répartition tissulaire des isoformes est très dispersée avec des taux
d'expression variables. Cependant, il a été montré que les isoformes JNK3 sont
plus
sélectivement exprimées dans le cerveau (par exemple dans l'hippocampe ou dans
le
cervelet (Mohit et al. 1995)), mais aussi dans le coeur et les testicules.
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Un nombre croissant de résultats souligne l'importance de JNK3 dans les
phénomènes de neurodégénérescence et de mort neuronale par apoptose cependant,
on ne connaît pas à ce jour le mode d'action de JNK3.
Il a été montré que les neurones de la région CA 1 de l'hippocampe de patients
ayant subi une hypoxie ont une forte immunoréactivité JNK3 au niveau nucléaire
alors que dans des échantillons contrôles, l'immunoréactivité JNK3 est diffuse
et
uniquement cytoplasmique (Zhang et al. 1998). De plus, la délétion du gène
JNK3
chez la souris permet la résistance à l'acide kainique, agoniste des
récepteurs au
glutamate participant aux phénomènes d'excitotoxicité. Les auteurs (Yang et
al.
1997) décrivent de façon détaillée la réduction des effets épileptiques et la
prévention
de la mort neuronale par apoptose dans l'hippocampe, après injection d'acide
kainique dans ces souris délétées pour JNK3. Enfin, l'un des substrats
préférentiels de
JNK3 est le facteur de transcription c-Jun, un des composants du complexe AP 1
lui
aussi largement impliqué dans des fonctions de survie et de dégénérescence
neuronale. Le facteur c-Jun semble être porteur d'une double fonction à la
fois dans la
mort cellulaire et dans la protection neuronale (Herdegen et al. 1997). La
suppression
de l'expression de c-Jun ou son inhibition fonctionnelle protègent les
neurones
hippocampiques et sympathiques de la mort cellulaire en culture (Estus et al.
1994,
Ham et al. 1995). Enfin, l'expression de c-Jun est augmentée dans des neurones
apoptotiques en dégénérescence après ischémie, section de nerfs, irradiation
mais
aussi dans des biopsies de malades atteints des pathologies neurodégénératives
telles
que la sclérose multiple, la sclérose amyotrophique latérale, les maladies
d'Alzheimer, Parkinson et Huntington (Anderson et al. 1994, Herdegen et al.
1998,
Martin et al. 1996).
La protéine kinase JNK3 apparaït aujourd'hui comme un des éléments clefs
impliqués dans la dégénérescence neuronale, cependant on ne connaît pas la
nature
précise de son mode d'action. A cet égard l'identification de nouvelles
isoformes
naturelles de JI~TK3 constitue un enjeu majeur pour la compréhension du
mécanisme
d'action de cette protéine dans les phénomènes de dégénérescence neuronale et
pour
l'identification de nouvelles cibles à visée thérapeutique.
La présente invention décrit la mise en évidence, le clonage et la
caractérisation de nouveaux polypeptides dérivés de JNK3.
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La présente invention résulte de la caractérisation de trois nouvelles
isoformes
de JNK3 humaine nommées hJNK3al39, JNK30Nal et JNK30Na2. Elle découle
plus particulièrement de la mise en évidence que deux de ces isoformes
JNK30Na1
et JNK30Na2, sont dépourvues de l'extension N-terminale qui caractérise les
isoformes connues de JNK3 et de la démonstration que ces isoformes JNK30Na1 et
JNK30Na2 présentent des propriétés différentes des isofornes de JNK3 déjà
décrites. Elle découle en outre de la découverte que ces nouvelles isoformes
dépourvues de l'extension N-terminale présentent de manière inattendue des
propriétés communes avec les isoformes JNKI(31 et JNK2al.
L'identification de ces nouvelles isoformes de JNK3 permet d'envisager de
nombreuses applications. Ces applications recouvrent notamment
l'identification de
nouveaux composés neuroprotecteurs capables d'interagir spécifiquement avec
ces
isofonnes. Ces composés peuvent être utilisés pour la prévention et le
traitement de
différentes pathologies causées par une dégénérescence neuronale, parmi
lesquelles
on peut citer la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington et la maladie
de
Parkinson, les démences séniles et celles dûes au SIDA, les traumatismes
crâniens, les
anoxies, hypoxies et oedèmes cérébraux. Ces nouvelles isofornes peuvent
également
être utilisées en modélisation moléculaire pour permettre une meilleure
compréhension de la structure et de la fonction de ces enzymes ainsi que de
leur
implication dans les pathologies mettant en cause une ou plusieurs isofonnes
de
JNK3. Enfin, ces isoformes de JNK3 sont également utiles pour mettre en
évidence
de nouvelles protéines impliquées dans des voies de signalisation
intracellulaire
spécifiques à chacune d'elles. Il est ainsi possible d'identifier de nouvelles
cibles
pertinentes impliquées dans les neuropathologies dégénératives.
Un premier objet de l'invention concerne des polypeptides dérivés des
isoformes JNK3a1 ou JNK3a2 comportant une délétion en N-terminal ou C-
terminal.
Selon un premier mode, il s'agit de dérivés comportant une délétion en N-
terminal
correspondant aux 38 premiers acides aminés de ces isofornes. Selon une autre
variante, il s'agit de dérivés comportant une délétion des acides aminés C-
terminaux à
partir de l'acide aminé 139.
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Préférentiellement, les dérivés selon l'invention sont des polypeptides
choisis
parmi les séquences SEQ ID N°23, SEQ ID N°25, SEQ ID N°27
ou un variant de
celles-ci.
Le terme variant au sens de l'invention désigne tout polypeptide dont la
structure se distingue d'un polypeptide choisi parmi les séquences SEQ ID
N°23 ou
SEQ ID N°25 ou SEQ ID N°27 par une ou plusieurs
modifications de nature
génétique, biochimique et/ou chimique et conservant au moins l'une des
propriétés
biologiques dudit polypeptide. Il peut s'agir en particulier de toute
mutation,
substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus.
De tels
dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment
celui
d'améliorer leur niveau de production, celui d'augmenter leur résistance à des
protéases ou d'améliorer leur passage à travers les membranes cellulaires,
celui
d'augmenter leur efficacité thérapeutique ou de réduire leurs effets
secondaires, celui
d'augmenter l'affinité des polypeptides pour leurs sites d'interaction, ou
celui de lui
conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
Avantageusement, les variants comprennent des délétions ou des mutations
portant
sur des acides aminés dont la présence n'est pas déterminante à l'activité du
dérivé. De
tels acides aminés peuvent être identifiés par exemple par des tests
d'activité cellulaire
comme décrit dans les exemples.
L'invention a également pour objet, un polypeptide tel que défini selon la
séquence SEQ ID N°29 correspondant au fragment 1-38 des des formes
JNK3a1 ou
JNK3 a2.
Un autre objet de la présente invention concerne tout acide nucléique codant
pour un polypeptide dérivé de JNK3 tel que défini ci-avant.
L'acide nucléique selon l'invention peut être un acide ribonucléique (ARN) ou
désoxyribonucléique (ADN). En outre, il peut s'agir d'un ADN génomique (ADNg)
ou
complémentaire (ADNc). Il peut être d'origine humaine, animale, virale,
synthétique
ou semi-synthétique. Il peut être obtenu de différentes manières et notamment
par
synthèse chimique en utilisant les séquences présentées dans la demande et par
exemple un synthétiseur d'acides nucléiques. Il peut également être obtenu par
criblage de banques au moyen de sondes spécifiques, notamment telles que
décrites
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dans la demande. II peut encore être obtenu par des techniques mixtes incluant
la
modification chimique (élongation, délétion, substitution, etc.) de séquences
criblées
à partir de banques. D'une manière générale, les acides nucléiques de
l'invention
peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
Préférentiellement, l'acide nucléique selon l'invention est un ADNc ou un
ARN. L'acide nucléique selon l'invention est avantageusement choisi parmi
(a) tout ou partie de la séquence SEQ ID N°22 ou SEQ ID N°24 ou
SEQ ID
N°26 ou de leur brin complémentaire,
(b) toute séquence hybridant avec les séquences (a) et codant pour un dérivé
selon l'invention,
(c) les variants de (a) et (b) résultant de la dégénérescence du code
génétique.
Les séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent également servir à
la réalisation d'oligonucléotides antisens utilisables pour contrôler
l'expression des
différentes isoformes de JNK3. A cet égard, l'invention concerne également les
I S séquences antisens, dont l'expression dans une cellule cible permet de
contrôler
spécifiquement la traduction d'ARNm cellulaires codant pour JNK30Nal ou
JNK30Na2 ou hJNK3a139 ou encore JNK3al ou JNK3a2 , par hybridation des
oligonucléotides antisens sur les séquences spécifiques aux ARNm
correspondants.
De telles séquences peuvent par exemple être transcrites dans la cellule cible
en ARN
complémentaires des ARNm cellulaires des différentes isoformes de JNK3 et
bloquer
ainsi leur traduction en protéine selon la technique décrite dans le brevet EP
140 308.
De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences
nucléotidiques SEQ ID N°22, 24 ou 26 transcrites dans l'orientation
inverse.
L'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques,
synthétiques ou non, capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques
définies
ci-avant. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de
diagnostic,
pour la détection de l'expression ou surexpression des différentes isoformes
de JNK3,
ou encore pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage,
polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes peuvent également être
utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides
nucléiques
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homologues codant pour des peptides tels que définis précédemment, à partir
d'autres
sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines. Les
sondes
de l'invention comportent généralement au moins 17 bases et avantageusement
moins
de 300 bases, mais elles peuvent également comporter jusqu'à l'intégralité
d'une des
séquences précitées ou de leur brin complémentaire. Préférentiellement, ces
sondes
sont marquées préalablement à leur utilisation. Pour cela, différentes
techniques
connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif,
enzymatique, etc.).
Les sondes nucléotidiques peuvent être utilisées, notamment par PCR,
comme outil de diagnostic pour identifier
- soit les isoformes codant pour les JNK30Nal ou a2 en utilisant un
oligonucléotide
correspondant à la séquence d'insertion de 27 nucléotides spécifique des SEQ
ID
N°22 et 24 située en 5' du codon d'initiation, et d'un oligonucléotide
commun à
toutes les isoformes JNK3 ;
- soit les isoformes codant pour les JNK3 précédemment décrites dans la
littérature en
utilisant un oligonucléotide correspondant à la séquence située de part et
d'autre de la
région d'insertion présente dans la séquence des JNK34N al ou a2, et d'un
oligonucléotide commun à toutes les isoformes de JNK3.
Le diagnostic peut être réalisé également par Northern (Maniatis, T. et
al.1989) pour identifier
- soit les isoformes codant pour les TNK30Nal ou a2 en utilisant une sonde
oligonucléotidique correspondant à la séquence d'insertion de 27 nucléotides
spécifique des SEQ ID N°22 et 24 située en 5' du codon d'initiation ;
- soit les isoformes codant pour les JNK3 précédemment décrites dans la
littérature en
utilisant une sonde oligonucléotidique correspondant à la séquence de JNK3
située de
part et d'autre de la région d'insertion présente dans la séquence des
JNK30Nal ou
a2.
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La présente invention concerne également toute cassette d'expression
comprenant un acide nucléique tel que défini ci-avant, un promoteur permettant
son
expression et un signal de terminaison de la transcription.
Un autre objet de l'invention concerne en outre tout vecteur comprenant une
séquence nucléotidique selon l'invention ou une cassette d'expression telle
que définie
ci-avant. Le vecteur de l'invention peut être par exemple un plasmide, un
cosmide ou
tout ADN non encapsidé par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un
virus
recombinant ete. Il s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus
recombinant.
A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout
particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus, rétrovirus, virus
associés à
l'adénovirus (AAV), virus de l'herpès ou virus de la vaccine. La présente
demande a
également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence
nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention. De tels
vecteurs
sont susceptibles d'être utilisés en thérapie génique pour le traitement de
traumas
périphériques tels que notamment les traumas de la moelle épinière ou les
dégénérescences rétiniennes.
La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées
avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique ou un vecteur
selon
l'invention. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des
polypeptides selon
l'invention sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les
hôtes
eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures,
ou les
champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures
du genre
Saccharomyces, Kluyverornyces, Piclzia, Scl2wanniomnces, ou Hansenula.
S'agissant
de cellules animales, on peut citer les cellules d'insecte Sf~, les cellules
COS, CHO,
2~ CI27, les cellules de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on
peut
citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderrna ssp. Comme hôtes
procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Baczllus, ou
Stf-eptomyces.
Selon un mode préféré, les cellules hôtes sont avantageusement représentées
par des souches de levures recombinantes. Préférentiellement, les cellules
hôtes
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comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les
séquences nucléotidiques SEQ ID N°22 ou SEQ ID N°24 ou SEQ ID
N°26 pour la
production des polypeptides selon l'invention.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de préparation des
polypeptides selon l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant
une
séquence nucléotidique selon l'invention, dans des conditions d'expression de
ladite
séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant
pour
ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux
permettant son
expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs,
terminateurs,
séquence leader de sécrétion, etc.) peut varier en fonction de l'hôte
cellulaire utilisé.
Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie
d'un
vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus
particulièrement, des
vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des
séquences à
réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant de vecteurs intégratifs,
ceux-ci
peuvent être préparés, par exemple, en utilisant des séquences homologues à
certaines
régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue,
l'intégration
du vecteur.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragments
d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que
défini
ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de
l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent ëtre préparés par
immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie
parmi
les séquences SEQ ID N°23 ou SEQ ID N°2~ ou SEQ ID N°27
ou tout fragment ou
dérivé de celles-ci, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces
anticorps
peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les
techniques
connues de l'homme du métier. Les anticorps ou fragments d'anticorps selon
l'invention peuvent notamment être utilisés en diagnostic pour la réalisation
de
Western blot (Maniatis, T. et a1.1989) permettant l'identification des
différentes
isoformes protéiques des JNK3 en fonction de leur poids moléculaire en
utilisant un
anticorps spécifique des JNK3 pour visualiser ces protéines. Ces anticorps
peuvent
aussi ëtre à l'origine de la fabrication de ScFv qui au moyen de vecteurs
appropriés
(adénovirus, AAV, rétrovirus, etc ...) pourront être utilisés en thérapie
génique pour
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inhiber spécifiquement certaines isoformes de JNK3 selon la technique décrite
dans
W094/29446 ou selon la technique décrite par Marasco (Marasco et al, 1997).
Selon un mode préféré, l'invention concerne des anticorps spécifiques des
isoformes JNK3a1 et JNK3a2. Il peut s'agir notamment d'anticorps monoclonaux
capables de reconnaître un épitope situé dans la partie N-terminale des formes
JNK3al et JNK3a2 . De manière avantageuse, il s'agit d'un épitope compris dans
le
fragment délimité entre les acides aminés situés aux positions 1 et 38 des
formes
JNK3a1 et JNK3a2 ; ce fragment est représenté dans la séquence SEQ ID
N°29. De
tels anticorps sont susceptibles d'induire un effet neuroprotecteur en
neutralisant
spécifiquement les formes JNK3a1 et JNK3a2. Ces anticorps sont également
susceptibles de conférer à la protéine des propriétés particulières qui
peuvent modifier
son taux d'expression, sa stabilité, son activité catalytique, sa spécificité
de substrats,
et son affinité pour des protéines qui interviennent dans la modulation de ces
propriétés.
L'invention englobe également les anticorps dérivés des anticorps
monoclonaux définis ci-avant. Au sens de la présente invention, on entend par
anticorps dérivés toute molécule qui comprend l'idiotype des anticorps
monoclonaux
selon l'invention et notamment les anticorps chimériques, les anticorps simple
chaîne
et les fragments Fab. De tels anticorps chimériques peuvent être obtenus selon
les
techniques décrites par Morrison et al., J. Bacteriol. 159 : 870 ( 1984) ;
Neberger et al.,
Nature 312:604-608 ( 1984) ; Takeda et al., Nature 314:452-454 ( 1980,
incorporées à
la présente par référence. Les fragments Fab qui contiennent l'idiotype des
anticorps
selon l'invention peuvent être générés par toute technique connue de l'homme
du
métier. L'invention a également pour objet des anticorps simple chaîne ScFv
dérivés
des anticorps monoclonaux définis ci-avant. De tel anticorps simple chaîne
peuvent
être obtenus selon les techniques décrites dans les brevet US 4,946,778, US
5,132,405
et US 5,476,786.
La présente invention concerne également un procédé d'identification de
composés capables de se lier aux polypeptides selon l'invention. La mise en
évidence
et/ou l'isolement de ces composés, peut-ëtre réalisée selon les étapes
suivantes
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- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes
molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide de l'invention
dans
des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite
molécule dans
le cas où celle-ci possèderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de
l'invention.
Selon un mode particulier, un tel procédé permet d'identifier des molécules
capables de bloquer spécifiquement les isoformes JNK34Nal et JNK30Na2 et de
moduler ainsi les processus de dégénerescence neuronale. Ces molécules sont
susceptibles de posséder une activité neuroprotectrice du fait de l'inhibition
spécifique
de ces isoformes. Selon un autre mode, un tel procédé permet d'identifier des
inhibiteurs spécifiques des isoformes JNK3al et JNK3a2.
La présente invention concerne en outre des procédés d'identification de
composés capables d'inhiber l'activité des dérivés de JNK3 selon l'invention
par
mesure de la croissance de microorganismes transformés avec un acide nucléique
codant pour un polypeptide selon l'invention. La mise en évidence et/ou
l'isolement de
ces composés, peut-être réalisée par un crible négatif de selection de drogue
(la
drogue inhibe la croissance de la levure) et ou par un crible positif (la
drogue restaure
la croissance de la levure) .
Ce dernier évite la sélection d'antifongiques qui faussent les résultats.
Ces deux cribles utilisent un mutant Hogl exprimant une isofonne de JNK3. Le
premier est utilisé en condition hyperosmotique. Le deuxième contient en
supplément
la forme PBS2dd qui hyperstimule la voie Hogl induisant la mort de la levure
en
condition normale. PBS2dd n'est toxique que si Hogl est fonctionel ou remplacé
par
JNK3.
La présente invention est donc relative à un procédé d'identification de
composés
inhibant la croissance de microorganismes transformés avec un acide nucléique
codant pour un polypeptide selon l'invention comprenant les étapes suivantes
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- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes
molécules, éventuellement non-identifiées, avec au moins un microorganisme
transformés avec un acide nucléique codant pour un polypeptide selon
l'invention,
dans des conditions permettant la croissance dudit microorganisme, et
on détecte et/ou isole les molécules inhibant la croissance dudit
microorgamsme.
Elle a en outre pour objet un un procédé d'identification de composés
permettant la
croissance de microorganismes transformés avec un acide nucléique codant pour
un
polypeptide selon l'invention comprenant les étapes suivantes
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes
molécules, éventuellement non-identifiées, avec au moins un microorganisme
transformés avec un acide nucléique codant pour un polypeptide selon
l'invention,
dans des conditions inhibant la croissance dudit microorganisme, et
- on détecte et/ou isole les molécules permettant la croissance dudit
microorganisme.
Ce microorganisme peut être une levure contenant un gène Hogl inactif et
exprimant une des nouvelles isoformes de JNK3 selon l'invention, telle que
celle
décrite dans les exemples qui suivent, ou tout autre microorganisme présentant
des
propriétés équivalentes. Cette levure pousse en condition hyperosmotique. Des
produits inhibiteurs de ces nouvelles isoforme de JNK3 sont suceptibles
d'inhiber ou
de ralentir la croissance de cette souche en conditions hyperosmotiques.
Selon un autre mode de mise en oeuvre on exprime dans la souche indiquée
ci-dessus une forme mutée de PBS2 : PBS2°° (Wurgler-Murphy et
al. 1997) qui a un
effet toxique sur la croissance de la levure. Cette toxicité dépend de
l'activité de la
protéine kinase située en aval, qui selon la présente invention, est une
nouvelle
isofonne de JNK3. Des produits inhibiteurs de ces nouvelles isofonne de JNK3
sont
suceptibles dans ce cas d'inhiber l'effet toxique de PBS2 muté et ainsi
permettre la
retauration de la croissance de cette souche.
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Un autre objet de l'invention concerne des composés ou ligands capables
d'inhiber l'activité des polypeptides selon l'invention et susceptibles d'être
obtenus
en utilisant un de ces microorganimes comme outil de criblage
Un autre objet de l'invention concerne des composés ou ligands capables de se
lier aux polypeptides selon l'invention et susceptibles d'être obtenus selon
l'un des
procédés définis ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un composé ou ligand
identifié et/ou obtenu selon l'un des procédés décrits ci-avant comme
médicament. De
tels composés sont en effet susceptibles d'être utilisés pour la prévention,
l'amélioration ou le traitement de différentes pathologies causées par une
dégénérescence neuronale, parmi lesquelles on peut citer les maladies
d'Alzheimer, la
maladie de Huntington et la maladie de Parkinson, les démences séniles et
celles dûes
au SIDA, les traumatismes crâniens, les anoxies, les hypoxies et les oedèmes
cérébraux.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant
comme principe actif au moins un composé ou ligand tel que défini ci-avant.
Les polypeptides de l'invention sont également utiles pour l'identification
d'autres partenaires intervenant dans les mécanismes de dégénerescence
neuronale ou
dans le domaine de l'ischémie cardiaque par recherche et identification de
molécules
interagissant in vivo avec ces polypeptides. A cet égard, un autre objet de la
présente
invention concerne un procédé d'identification de polypeptides partenaires
spécifiques
des différentes isoformes naturelles de JNK3. I1 peut s'agir de polypeptides
partenaires
spécifiques des formes JNK3alON ou JNK3a20N ou hJNK3a139 ou de
polypeptides partenaires spécifiques des formes JNK3a1 et JNK3a2.
L'identification
des polypeptides partenaires spécifiques des différentes isoformes de JNK3
peut être
réalisée par la technique de clonage en double hybride selon les techniques
décrites
par Fields et al. 1994 ; la protéine appât pouvant notamment être la protéine
entière
JNK3~Nal ou JNK30Na2, ou l'extension N-ternlinale de 38 acides aminés de JNK3
qui est absente dans les isoformes JNK30N.
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D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des
exemples qui
suivent et qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
LÉGENDE DES FIGURES
Figure 1 : comparaison des séquences nucléotidiques entre les différentes
isoformes
de JNK3 humain. Les séquences nucléotidiques de la région 5' des différentes
isoformes de JNK3 ont été alignées les unes par rapport aux autres. Les
différences de
séquence par rapport aux séquences publiées de JNK3a1 et 3a2 sont notées en
gras et
les codons de terminaison apportés sont soulignés.
Figure 2 : comparaison entre les séquences nucléotidiques de la région 5' de
la
JNK3a0N humaine et de la SAPK(3 de rat. Les séquences nucléotidiques de la
région
5' des isoformes humaines de JNK30Nal et ONa2 ont été alignées par rapport à
celle
de rat SAPK(3. Les différences entre les séquences sont indiquées par des
astérisques.
Figure 3 : comparaison entre les séquences polypeptidiques des différentes
JNK3
humaines. Les séquences polypeptidiques des différentes isoformes de JNK3 ont
été
alignées les unes par rapport aux autres montrant une différence dans la
région N-
terminale.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
l ) Microor~anismes utilisés.
S.cef-evisiae W303a : MA Ta , ade2, t~pl, leu?, ura3, his3.
E.coli TGl : F'~ traD 36, lacl'~,4(lacZ) MIS, pnoA+ B+J supE4(hsdrn-f~zcnb~5
(n~-
mK McrB), thi 0 (lac pf~o AB)
2s 2) Milieux de culture
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Milieu YPD (milieu complet pour levures) : Bacto-yeast extract (Difco) 10 g/1
Bacto-peptone (Difco) 20 g/1 , Glucose (Merk) 20 g/l. Ce milieu peut être
solidifié
par addition d'agar (20g/1) et stérilisé par autoclavage à 110°C
pendant 20mn. On
ajoute, si nécessaire, à ce milieu O,SM ou 0,9M de NaCI ou 1 M de Sorbitol
pour être
en condition hyperosmotique.
Milieu YNB (milieu minimum pour levures) : Bacto-yeast nitrogen base w/o
amino acids (Difco) 6,7 g/1 , Glucose (Merk) 20 g/1. Ce milieu peut être
solidifié par
addition d'agar (20g/I) et stérilisé par autoclavage. Les acides aminés ou les
bases
azotées nécessaires à la croissance des levures auxotrophes, préalablement
stérilisés
par filtration, sont ajoutés ensuite à 50 mg/l. De l'ampicilline (100 pg / ml)
peut être
ajoutée à ce milieu pour éviter les contaminations bactériennes.
LB (milieu complet pour bactéries) : Bacto-yeast extract (Difco) Sg/l, Bacto-
tryptone (Difco) lOg/1, NaCI (Difco) Sg/1. Ce milieu peut être solidifié par
addition
d'agar (12 g/1) et stérilisé par autoclavage. L'ampicilline est ajoutée à 100
pg/ml pour
sélectionner les bactéries ayant été transformées par les plasmides portant le
marqueur
de résistance correspondant.
3) Plasmides
pIC20R : le plasmide pIC20R est un plasmide bactérien de 2.7 kb dérivé de
pUC 19. II possède une origine de réplication CoIE I et un gène de résistance
ampicilline. Ce plasmide est utilisé pour cloner la protéine kinase STE 1 I .
Il possède
un site multiple de clonage dans lequel sont insérées les séquences codant
pour les
kinases.
pYX 232 : le plasmide pYX 232 est un plasmide navette de 7.4 kb et 9.5 kb
respectivement, pouvant être propagé et sélectionné dans les bactéries E.coli
aussi
2~ bien que dans les levures. Il possède une origine de réplication CoIE I et
un gène de
résistance à l'ampicilline (propagation et sélection dans E.coli) ainsi qu'une
origine de
réplication 2pm et un gène de sélection TRP1 (sélection chez les levures trpl
déficientes pour la synthèse du tryptophane). Un site multiple de clonage
placé en
aval du promoteur TPI (Triose Phosphate Isomérase) permet d'insérer les
séquences
des gènes à exprimer. Le plasmide pYX232 est utilisé pour exprimer chez la
levure
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les protéines JNKI (31, JNK2al et les différentes isoformes de JNK3 humain.
Les
séquences codant pour ces protéines ont été insérées au site de clonage EcoRI
préalablement rendu bord franc par digestion avec le fragment Klenow de l'ADN
polymérise d'E. coli.
pFA6a-kan MX4 : le plasmide pFA6a-kan MX4 est un plasmide de 2.5 kb
dérivé du plasmide pSP72 (Promega). La construction du plasmide pFA6a et
l'introduction d'un module de sélection kanMX, dérivé du transposon Tn903
d'E.coli,
ont été décrits par Wach (Wach, 1994). Ce plasmide a été utilisé pour réaliser
la
délétion du gène codant pour Hogl dans la souche W303a. La sélection des
transformants est réalisée sur milieu additionné de généticine (G418).
4) Oligonucléotides de synthèse
Les séquences correpondantes aux différentes JNK ont été amplifiées avec des
oligo nucléotides de synthèse et à partir de banques double hybrides d'ADN
génomique de levure ou à partir de plasmides.
Différents oligonucléotides de synthèse ont été générés pour réaliser les
fragments de délétion, pour réaliser le séquençage et pour vérifier la
délétion du gène
Hog 1 chez la levure.
4.1 - Oli~onucléotides utilisés pour amplifier JNK3 humain par PCR
Les oligonucléotides ont été choisis de manière à amplifier uniquement la
phase codante correspondant à JNK3al et 3a2. En gras sont indiqués les codons
d'initiation et de terminaison et en italique les sites de restriction
utilisés pour le
clonage dans les vecteurs appropriés.
- Série d'oligonucléotides utilisés sur la banque d'ADNc de cervelet humain
Oligonucléotide correspondant à la région 5'de JNK3al et 3a2 (SEQ ID
N°1)
5'-GCG GGA TCC TAT GAG CCT CCA TTT CTT ATA CTA CTG CAG TGA
ACC AAC-3'
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Oligonucléotide correspondant à la région 3' de JNK3al (SEQ ID
N°2)
5'-CAC GGT ACC TCA CTG CTG CAC CTG TGC TGA AGG AGA AGG C-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3' de JNK3a2 (SEQ ID
N°3)
5'- GGC GGT ACC TCA CCT GCA ACA ACC CAG GGG TCC TGC CG-3'
- Série d'oligonucléotides utilisés sur la banque d'ADNc de cerveau humain
Oligonucléotide correspondant à la région 5'de JNK3al et 3a2 (SEQ ID
N°4)
5'-TCC CCC GGG ATC CAA AAT GAG CCT CCA TTT CTT ATA CTA C-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3' de JNK3al (SEQ ID
N°5)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TCA CTG CTG CAC CTG TGC TGA-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3'de JNK3a2 (SEQ ID N°6)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TCA CCT GCA ACA ACC CAG GGG-3'
- Série d'oligonucléotides utilisés pour sous cloner les isoformes ON de JNK3
humain
Oligonucléotide correspondant à la région 5' de JNK3~Na1 et ONa2
(SEQ ID N°7)
5'- TCC CCC GGG ATC CAA AAT GAG CAA AAG CAA AGT TGA CAA-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3' de JNK3ANa1 (SEQ ID
N°8)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TCA CTG CTG CAC CTG TGC TGA-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3'de JNK30Na2 (SEQ ID
N°9)
~'-TCC CCC GGG CTC GAG TCA CCT GCA ACA ACC CAG GGG-3'
4.2 - Oli~onucléotides utilisés pour amplifier JNK1~31 et JNK2a1 humain par
PCR
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Les oligonucléotides ont été choisis de manière à amplifier uniquement la
phase codante correspondant à JNK1~31 et JNK2al. En gras sont indiqués les
codons
d'initiation et de terminaison et en italique les sites de restriction
utilisés pour le
clonage dans le vecteur d'expression levure.
- Oligonucléotides pour amplifier JNKI (31
Oligonucléotide correspondant à la région 5'de JNK1~31 (SEQ ID
N°10)
5'-TCC CCC GGG ATC CAA AAT GAG CAG AAG CAA GCG TGA C-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3'de JNK1 (31 (SEQ ID
N°11)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TCA CTG CTG CAC CTG TGC -3'
- Oligonucléotides pour amplifier JNK2al
Oligonucléotide correspondant à la région 5'de JNK2al (SEQ ID
N°12)
5'-TCC CCC GGG ATC CAA AAT GAG CGA CAG TAA ATG TGA C-3'
Oligonucléotide correspondant à la région 3'de JNK2a1 (SEQ ID
N°13)
5'-TCC CCC GGG CTC GAG TTA CTG CTG CAT CTG TGC TGA-3'
4.3 - Oli~onucléotides utilisés pour réaliser et valider la délétion du ~ène
Hogl chez
la levure
- Oligonucléotides utilisés pour réaliser la délétion du gène Hogl chez la
levure
Le premier couple d'oligonucléotides s'hybride au gène de résistance au 6418
et au
gène de levure Hogl en amont du codon d'initiation (SEQ ID N°14) ou en
aval du
codon de terminaison (SEQ ID N°15)
5'-TAGGACACAGATATTCGGTACAGCTGAAGCTTCGTACGC-3' (SEQ
ID N°14)
5'-GACCTTTGTTTCCACCAGCTGCATAGGCCACTAGTGGATCTG -3'
(SEQ ID N°15)
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Le second couple d'oligonucléotides s'hybride au gène de levure Hogl et à la
partie
correspondant à la séquence du gène Hogl du premier couple d'oligonucléotides
(SEQ ID N° 14 ou 15)
5'-ACCACTAACGAGGAATTCATTAGGACACAGATATTCGGTA-3'
(SEQ ID N° 16)
5'-TTTGCAGCTACATGATCGCTGACCTTTGTTTCCACCAGCT-3' (SEQ
ID N° 17)
- Oligonucléotides pour valider la délétion du gène Hogl chez la levure
Oligonucléotides pour amplifier une partie du gène Hogl non délété:
5'-GAG TAG TAA TTA CTT TCT TG-3' (SEQ ID N°18)
5'-CCG TGA CAA AAT ATA TAT CTT CC-3' (SEQ ID N°19)
Oligonucléotides pour amplifier une partie du gène Hogl délété par insertion
du gène de résistance au 6418
5'-GAG TAG TAA TTA CTT TCT TG-3' (SEQ ID N°20)
1 ~ 5'-GGA TCT TGC CAT CCT ATG G-3' (SEQ ID N°21 )
5) Préparation d'ADN~lasmidique
Les préparations en petite ou en grande quantité d'ADN plasmidique ont été
effectuées selon les protocoles décrits par Maniatis et al.(1989).
6) Amplification en chaîne par la polymérase Taq_thermostable (ou PCR)
La PCR permet d'amplifier une séquence d'ADN entre deux régions connues
où peuvent se fixer des oligonucléotides (de 20 nucléotides environ) qui
serviront
d'amorces à une polymérase thermostable. Les réactions sont effectuées dans un
volume final de 100 ml en présence de la matrice d'ADN (50 ng), de dNTP (0,2
mM),
de tampon PCR (TrisHCl pH8,5 IOmM; MgCl2 I,SmM; KC1 SmM; gélatine 0.01%),
2 ~ des deux oligonucléotides (500 ng chacun) et de 2,5 UI d'Ampli Taq DNA
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polymérase. Le mélange est recouvert de 2 gouttes d'huile de paraffine pour
limiter
l'évaporation de l'échantillon. Le programme utilisé comporte 32 cycles : 1
cycle de
dénaturation de la matrice (5 min à 95°C), 30 cycles (1 mn de
dénaturation à 94°C,
lmin d'hybridation des oligonucléotides sur la matrice d'ADN à 50°C,
lmin
d'élongation par la Taq polymérase à 72°C), enfin 1 cycle d'élongation
finale (5 min
à 72°C). La PCR peut être effectuée directement sur des cultures de
bactéries ou de
levures en phase exponentielle de croissance à la place de la matrice d'ADN.
7) Séquençage par fluorescence
La technique de séquençage utilisée est dérivée de la méthode de Sanger et
al.(1977) et adaptée pour le séquençage par fluorescence développé par Applied
Biosystems. Le protocole utilisé est celui décrit par les concepteurs du
système
(Perkin Elmer, 1995).
8 ) Insertion d'un fragment d'ADN dans un plasmid~ar li ation
L'insert provenant d'un ADN plasmidique ou d'une réaction PCR est digéré
1 ~ pendant 1 h par des enzymes de restriction appropriées à 1 U/mg d'ADN dans
leur
tampon respectif (Biolabs). Les fragments issus de la digestion sont séparés
selon leur
taille par électrophorèse sur un gel "préparatif' d'agarose 0.8% préparé dans
un
tampon TBE (Tris 90mM, Borate 90mM, EDTA 2mM PH8) avec O.Spg/ml de Bet.
Du Bleu de dépôt (1/10 de volume) est ajouté aux échantillons avant leur
chargement
sur le gel à coté d'un marqueur de poids moléculaire ( 1 KB Ladder, Gibco
BRL). La
migration s'effectue à 90 volts/cm'' constants dans du tampon TBE. L'ADN est
révélé
sous UV par la fluorescence du Bet qui s'est intercalé entre les bases. Les
morceaux
de gel contenant les fragments d'ADN de tailles voulues (vecteurs et inserts)
sont
découpés au scalpel, introduits dans un boudin de dialyse avec du TBE et
soumis à
une électrophorèse pendant 30min à 90 volts. L'ADN extrait du gel est ensuite
récupéré, traité par un volume de phénol/chloroforme/isoamylate (25/24/1),
précipité
par 3 volumes d'éthanol absolu en présence de NaCI 0.25M, lavé une fois à
l'éthanol
70%, séché, et enfin repris dans 20p1 H~O. Après avoir estimé sur gel les
quantités
respectives de vecteur et d'insert, ces derniers sont mélangés dans un rapport
de 1/1 en
présence de 40UI de T4 DNA ligase, du tampon de ligation 1 X final (Tris, HCl
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50mM PH7.5, MgCl2 IOmM, ATP 1mM) dans un volume total de 20u1. La ligation
s'effectue à 20°C pendant lh au moins.
9) Transformation des bactéries par un plasmide
Méthode dite au "TSB" (Chung et al., 1988): cette méthode consiste à
fragiliser la paroi des bactéries par un traitement au DMSO pour permettre
l'entrée de
l'ADN dans les cellules. Son efficacité est de 106 transformants/gg d'ADN. Les
bactéries sont cultivées dans un milieu LB liquide pendant environ 3h sous
agitation
(jusqu'à A6oo= 0.6). La culture est centrifugée 10 min à 3000 rpm, le culot
est repris
dans 1/10 du volume initial par du TSB (milieu LB, PEG4ooo 10%, DMSO 5%, MgCI
10 mM, MgS04 I 0 mM), et incubé 15min à 4°C. Environ 50 ng d'ADN ( 1
Oul pour le
produit de ligation) sont ajoutés à 100u1 de bactéries compétentes, puis le
mélange est
incubé 30 min à 4°C. Après addition de TSBgIu (TSB, glucose 20 mM) et
incubation
1 h à 37°C, les bactéries sont étalées sur milieu gélosé LB contenant
de l'ampicilline.
10)Transformation de la levure par un vecteur d'expression
Les levures sont rendues compétentes par un traitement au LiAc/PEG d'après
la méthode décrite par Gietz (Gietz et al., 1995).
Les levures sont cultivées sur milieu solide YPD à 28°C pendant
une nuit.
Elles sont ensuite resuspendues dans 1 ml de solution I stérile (LiAc 0.1 M,
Tris,HCL
IOmM, EDTA 1mM pH7.5), centrifugées 1 min à 3000 rpm et reprises à nouveau
dans I ml de solution I. SOL de la suspension sont alors mélangés à 5gg d'ADN
de
sperme de saumon (ADN entraîneur), 1 à 5gg d'ADN plasmidique et 30081 de
solution II stérile (LiAc O.1M, Tris,HCl IOmM, EDTA 1mM PH7.5, PEG4ooo 50%).
Le mélange est incubé 30 min à 28°C puis subit un choc thermique
pendant 20 min à
42°C. Après centrifugation I min à 3000 rpm, les cellules sont lavées
une fois à l'eau
stérile et reprises dans 100 ~I d'eau stérile. Puis, les levures sont étalées
sur milieu
gélosé YNB additionné des acides aminés nécessaires à leur croissance. Pour
permettre la sélection des souches de levure transformées, les acides aminés
et les
bases azotées correspondant aux marqueurs de sélection portés par les
plasmides ne
sont pas ajoutés. Après étalement des cellules de levure, les boîtes incubées
à 28°C
pendant 3 jours.
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11 ) Test en outte:
Ce test permet d'analyser le phénotype d'une souche de levure. Une goutte
(environ 5 pl) d'une suspension de levures légèrement trouble (environ 105
cellules
/ml) est déposée sur différents milieux gélosés hyperosmotiques et non
hyperosmotiques, et la croissance est observée après 2 jours d'incubation à
28°C.
EXEMPLE S
Exemple 1 - clonage d'ADNc codant pour de nouvelles isoformes de JNK3
humaines : JNK30Na1, JNK30Noc2 et JNK3a139.
Le clonage moléculaire de JNK3 humain a été réalisé par PCR à partir d'une
banque d'expression d'ADNc de cervelet humain (Clontech~) ou d'une banque
double hybrides d'ADNc de cerveau humain (Clontech~). Les amorces
nucléotidiques ont été choisies de manière à amplifier par PCR la phase
codante
correspondant à JNK3al et 3a2 (Genbank U34820 et U34819) (voir Matériel et
Méthodes).
I ~ Une première série oligonucléotides utilisée pour amplifier JNK3 à partir
de la
banque de cervelet a permis d'apporter les sites de clonage BamH 1 en 5' et
KpnI en
3' pour pouvoir introduire les fragments amplifiés d'ADN dans des vecteurs de
clonage ou d'expression appropriés (SEQ ID N° 1, SEQ ID N°2 et
SEQ ID N°3).
La deuxième série, utilisée sur la banque deux hybrides d'ADNc de cerveau, a
permis d'introduire les sites SmaI et BamHI en 5' et SmaI et XhoI en 3'(SEQ ID
N° 4,
SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6).
La réaction de PCR a été effectuée avec 1 ~g d'ADN de l'une des deux banques
d'expression et 0,5 pg de chaque oligonucléotides encadrant la région à
amplifier. Les
fragments d'ADN obtenus ont été clonés dans des vecteurs de clonage appropriés
2s pour analyser leur séquence.
II a été constaté que, parmi l'ensemble des fragments isolés, les séquences
correspondant aux JNK3al et 3a2 déjà décrites étaient minoritaires par rapport
à
celles correspondant à trois nouvelles isoformes.
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La comparaison de la séquence des ces isoformes est présentée dans la figure
1.
On observe que deux séquences, appelées JNK3~Nal et JNK30Na2, sont
comparables respectivement à JNK3a1 et 3a2, et présentent une insertion de 27
nucléotides en position +(( par rapport à l'ATG. Cette séquence qui est très
homologue à la séquence 5' non codant de SAPK(3 de rat (figure 2), apporte un
codon
de terminaison qui implique une initiation au deuxième ATG.
La séquence nucléotidique complète de JNK30Na1 est présentée dans la
séquence SEQ ID N°22 et la séquence nucléotidique complète de JNK34Na2
est
présentée dans la séquence SEQ ID N°24. Les séquences polypeptidiques
correspondantes sont présentées respectivement dans la séquence SEQ ID
N°23
(JNK30Na1) etN°25 (JNK3~Na2).
La protéine exprimée à partir de ces séquences présente une délétion de 38
acides aminés correspondant à l'extension N-terminale de JNK3 qui la distingue
des
autres JNK (figure 3).
l~ La troisième séquence correpondant à l'isoforme JNK3a139 est caractérisée
par une substitution du nucléotide C en T, en position 418 de l'ATG, dans la
partie
commune de JNK3al et JNK3a2 (figure I). Cette mutation permet la création d'un
codon de terminaison. La protéine exprimée à partir de cette séquence est
délétée
d'une grande partie de la région C-terminale de JNK3. Ce polypeptide ne
comprend
que les 139 premiers acides aminées communs à JNK3a1 et 3a2 (figure 3) qui
inclus
le site de liaison à l'ATP. La séquence nucléotidique de JNK3al39 est
présentée dans
la séquence SEQ ID N°26 et la séquence polypeptidique correspondante
est présentée
dans la séquence SEQ ID N°27.
Exemple 2 - construction d'une souche de levure mutée dans le gène Hogl
Des études ont montré qu'il était possible de complémenter une levure mutée
dans le gène Hogl homologue aux JNK de mammifère par le gène JNK1 humain
(Galcheva-Garvona et al. 1994) ou p38 de souris (Han et al. 1994). Le gène
Hogl est
impliqué dans une voie de réponse aux stress hyperosmotiques chez la levure
qui
aboutit à une synthèse de glycerol intracellulaire afin de compenser les
différences de
pression osmotique avec le milieu extérieur. Un modèle levure a donc été
retenu pour
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évaluer les propriétés fonctionnelles de isoformes de JNK3 tronquées en N-
terminal
(JNK30Na1, JNK30Na2) et les comparer à celles des autres isoformes connues de
JNK3.
Pour réaliser ce modèle, il est nécessaire d'interrompre la voie de réponse au
stress hyperosmotique chez la levure en introduisant une mutation au niveau du
gène
Hogl. Un tel mutant doit être incapable de pousser sur un milieu contenant de
fortes
concentrations en sel comme du NaCI (0,5M ou 0,9M) ou en sorbitol ( 1 M). Il
est
utilisé pour tester par complémentation si les différentes isoformes de JNK3
humaine
sont capables de restaurer la croissance cellulaire en condition de stress
hyperosmotique.
Délétion du gène Hogl de S.cerevisiae par une cassette de disruption contenant
le
marqueur de résistance au 6418.
La délétion du gène Hogl a été réalisée selon la technique décrite par Wach
(Wach et al. 1994). Cette technique utilise un fragment de délétion d'ADN
obtenu
directement par PCR. Celui-ci correspond à une partie de la séquence du gène à
détruire interrompu par un marqueur de résistance. Pour construire ce
fragment, il a
été utilisé un couple d'oligonucléotides dont la séquence permet d'amplifier
par PCR
le gène de résistance au 6418, tout en générant aux extrémités du fragment
amplifié
les séquences correspondant au gène à détruire. Ce marqueur de résistance est
sous le
contrôle du promoteur et du terminateur d'un gène fortement exprimé, le gène
TEF de
Ashbva gossypü.
Pour réaliser le fragment de délétion du gène Hogl, deux couples
d'oligonucléotides ont été synthétisés. Le premier couple (SEQ ID N° 14
et SEQ ID
N°15) s'hybride aux extrémités terminales du gène de résistance au 6418
porté par le
plasmide pFA6a-kanMX4. Ces oligonucléotides contiennent également une courte
séquence flottante de 20 paires de base chacune correspondant respectivement à
la
région juste en amont de l'ATG et en aval du codon stop de Hogl. Le deuxième
couple d'oligonucléotides (SEQ ID N°16 et SEQ ID N°17) permet de
rallonger de 20
paires de base ces séquences flottantes lors d'une deuxième étape de PCR. Ce
rallongement a pour but d'augmenter la fréquence de crossing-over dans ces
séquences flottantes et, de ce fait, la délétion du gène Hogl .
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Le fragment de délétion a été réalisé en deux étapes de PCR en utilisant dans
la première le plasmide pFA6a-kan MX4 comme matrice et dans la deuxième le
produit de la première PCR. Le fragment a été utilisé pour transformer la
souche
W303a.
Les souches transformées ont d'abord été sélectionnées pour leur résistance au
6418 qui est conférée par le fragment de délétion, puis pour le phénotype
d'osmo-
ssensibilité correspondant à l'inactivation totale de la voie de stress
hyperosmotique
via la délétion du gène Hogl. Sur quatre souches 6418 sélectionnées, deux
souches
présentaient le phénotype d'osmo-sensibilité qui correspond à l'incapacité des
souches à pousser sur milieu complet (YPD) contenant O,SM ou 0,9M de chlorure
de
sodium (NaCI) ou 1M de sorbitol.
Afin de vérifier que le gène Hogl était bien délété dans ces souches, une
amplification par PCR sur leur ADN génomique a été réalisée. Deux couples
d'oligonucléotides permettant d'amplifier respectivement le gène Hogl délété
ou non
délété ont été utilisés (voir Matériel et Méthodes).
Le couple d'oligonucléotides (SEQ ID N°20 et SEQ ID N°21 )
utilisé pour
amplifier la région correspondant au gène Hogl délété a permis d'obtenir un
fragment
de PCR uniquement sur de l'ADN génomique provenant des souches osmo-sensibles,
montrant ainsi que ces souches étaient bien délétées dans le gène Hogl.
Inversement,
l'autre couple d'oligonucléotides (SEQ ID N°18 et SEQ ID N°19)
n'a pu générer de
fragment qu'à partir de l'ADN génomique des souches osmo-résistantes. Ceci
permet
de confirmer que ces souches ne sont pas délétées dans le gène Hogl. La souche
de
levure délétée dans le gène Hogl est appelée yIMI.
Exemple 3 - complémentation de la souche de levure osmo-sensible par les
2~ différentes isoformes de JNK3 humaines.
Cet exemple illustre les propriétés des différents isoformes de JNK3
humaines. Le test de complémentation de la souche osmo-sensible mutée dans le
gène
Hogl (yIM 1 ) a été réalisé avec les différentes isoformes de JNK3. Les
kinases
JNK1 (31 (u35004) et JNK2a1 (u34821 ) ont été utilisées comme contrôle. Dans
ce test
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les kinases ayant une fonction homologue à la kinase HOGl sont capables de
restaurer la croissance de la levure yIM 1 en condition de stress
hyperosmotique.
Çonstruction de vecteurs d'expression pour exprimer les différentes JNK chez
la
levure.
Le vecteur d'expression pYX232 (R&D) qui se réplique à haut nombre de
copies dans la cellule a été choisi pour exprimer les différentes JNK chez la
levure. Il
possède le gène Trpl comme marqueur de sélection et une cassette d'expression
constituée par le promoteur TPI (Triose phosphate isomérase) et une séquence
polyA
séparés par un multisite de clonage. Les différents inserts codant pour JNK 1
(31,
JNK2a1 et les isoformes de JNK3 humaines ont été introduits au niveau du site
EcoRI de ce plasmide, préalablement clivé par l'enzyme de restriction
correspondante
et rendu bord franc par le fragment de Klenow de la ADN polymérase I.
Les fragments JNKl(31, JNK2al, JNK3al, JNK3a2, JNK3~Na1 et
JNK30Na2 ont été obtenus par PCR à partir de plasmides contenant le cDNA
correspondant et des oligonucléotides, décrits dans Matériel et Méthodes (SEQ
ID
N°10 et N°11 pour amplifier le fragment codant pour JNK1~31, SEQ
ID N°12 et N°13
pour amplifier le fragment codant pour JNK2al, SEQ ID N°4 et N°5
pour amplifier
le fragment codant pour JNK3al, SEQ ID N°4 et N°6 pour amplifier
le fragment
codant pour JNK3a2, SEQ ID N°7 et N°8 pour amplifier le fragment
codant pour
JNK30Nal, SEQ ID N°7 et N°9 pour amplifier le fragment
codant pour
JNK30Na2), introduisant chacun un site de restriction SmaI à chaque extrémité.
Ces fragments ont été clivés par l'enzyme SmaI pour pouvoir être introduits
par ligation dans le plasmide pYX232. L'ensemble de ces constructions a été
contrôlé
par séquençage pour vérifier que les inserts étaient introduits aux sites de
restriction
correspondants et qu'ils ne contenaient pas de mutations générées par la
réaction de
PCR.
Test de complémentation de la souche osmo-sensible Ho~l-far les différents
vecteurs d'expression de JNK.
Les différentes constructions permettant l'expression des JNK humaines ainsi
que le plasmide pYX332 sans insert ont été utilisées pour transformer la
levure osmo-
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sensible Hogl-. Les clones contenant les différents plasmides ont été
sélectionnés sur
milieu minimum YNB additionné des acides aminés ou bases azotées nécessaires
pour la croissance de la souche W303a à l'exception du tryptophane. Trois
clones
correspondant à chaque construction ont été analysés par test en goutte sur
milieu
complet contenant 0,5 ou 0,9 M NaCI ou 1 M sorbitol. Les souches sont incubées
trois jours à 30 degrés. Les résultats sont présentés dans le tableau ci
dessous.
YPD YPD + YPD + YPD +
sans NaCII M Sorbitol0,5 M NaCI 0,9 M
NaCI
W303 souche sauva +++ +++ +++ +++
e
yIMI (W303 delete +++ _ _ _
pour
Ho 1 )
IM 1 + JNK 1 1 +++ +++ +++ ++
IM 1 + JNK2a 1 +++ ++ ++ -
IM 1 + JNK3 a 1 +++ _ _ _
IM1 + JNK3a2 +++ _ _ _
IM1 + JNK30Na1 +++ ++ ++ _
IM 1 + JN'K30Na2 +++ ++ ++
Les différentes souches indiquées dans la 1 ère colonne sont testée en culture
sur différents milieux complets (YPD) additionnés ou non de Sorbitol ou de
NaCI
comme indiqué dans les colonnes n°2 à n°5. Le signe + indique
l'aptitude de
croissance, le signe - indique l'absence de croissance.
Les clones transformés par les plasmides codant pour JI~TK 1 X31, JNK2a1 et
deux des isoformes de JNK3 délétées de la région N-terminale (JNK30Na1 et
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JNK30Na2) sont capables de croître sur milieu complet contenant 0,5 M NaCI ou
1 M sorbitol. Les clones exprimant JNKI (31 sont les seuls qui présentent une
légère
croissance sur milieu contenant 0,9 M NaCI.
Par contre, les souches transformées par le plasmide sans insert ou les
plasmides codant pour JNK3al et JNK3a2 ne poussent que dans des conditions de
milieu non hyperosmotiques. Ainsi JNK1(31, JNK2al et deux des isoformes de
JNK3
délétées de leur région N-terminale (JNK30Na1 et JNK30Na2) sont fonctionnelles
dans la levure et sont capables de remplacer la kinase HOG 1.
Ces résultats indiquent que l'absence du fragment correspondant aux 38
premiers acides aminés des isoformes connues de JNK3 (JNK3a et JNK3a2) confère
aux isoformes JNK30Na1 ou JNK30Na2 une fonction homologue à la kinase
HOG1. Cette fonction est retrouvée dans les isoformes JNK1(31, JNK2al qui sont
également dépourvues du fragment correspondant aux 38 premiers acides aminés
de
JNK3a et JIvTK3a2. A l'inverse, la présence du fragment correspondant aux 38
premiers acides aminés des isoformes connues de JNK3 (JNK3a et JNK3a2) est lié
à
l'absence de la fonction homologue à la kinase HOG1 pour ces isoformes.
Ces nouvelles isoformes présentent donc, chez la levure, une activité
différente des deux formes de JNK3 décrites dans la littérature. Cette
différence peut
être liée au processus d'activation de ces kinases chez la levure. Comme pour
JNKI
ou p38, on a montré que les nouvelles isoformes de JNK3 sont activées par la
MapKinase Kinase PBS2 de la levure car une souche de levure double mutante
hogl,
pbs2 complémentée par les nouvelles isoformes de JNK3 est incapable de pousser
dans des conditions hyperosmotiques. De même, il est possible que ces
nouvelles
isoformes présentent une spécificité de substrat différente des JIVK3 déjà
décrites qui
leur permet d'activer la voie de réponse au stress hyperosmotique chez la
levure.
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LISTE DE SEQUENCES
<110> RHONE-POULENC RORER S.A.
<120> Nouvelles isoformes de JNK3 humaine
<130> JNK3
<140>
<141>
<160> 29
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 48
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1
gcgggatcct atgagcctcc atttcttata ctactgcagt gaaccaac 48
<210> 2
<211> 40
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 2
cacggtacct cactgctgca cctgtgctga aggagaaggc 40
<210> 3
<211> 38
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 3
ggcggtacct cacctgcaac aacccagggg tcctgccg 38
<210> 4
<211> 40
<212> ADN '
<213> Homo sapiens
<400> 4
tcccccggga tccaaaatga gcctccattt cttatactac 40
<210> 5
<211> 36
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 5
tcccccgggc tcgagtcact gctgcacctg tgctga 36
<210> 6
<211> 36
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 6
tcccccgggc tcgagtcacc tgcaacaacc cagggg 36
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<210> 7
<211> 39
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 7
tcccccggga tccaaaatga gcaaaagcaa agttgacaa 39
<210> 8
<211> 36
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 8
tcccccgggc tcgagtcact gctgcacctg tgctga 36
<210> 9
<211> 36
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 9
tcccccgggc tcgagtcacc tgcaacaacc cagggg 36
<210> 10
<211> 37
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 10
tcccccggga tccaaaatga gcagaagcaa gcgtgac 37
<210> 11
<211> 33
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 11
tcccccgggc tcgagtcact gctgcacctg tgc 33
<210> 12
<211> 37
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 12
tcccccggga tccaaaatga gcgacagtaa atgtgac 37
<210> 13
<211> 36
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 13
tcccccgggc tcgagttact gctgcatctg tgctga 36
<210> 14
<211> 39
<212> ADN
<213> Homo sapiens
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<400> 14
taggacacag atattcggta cagctgaagc ttcgtacgc 39
<210> 15
<211> 42
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 15
gacctttgtt tccaccagct gcataggcca ctagtggatc tg 42
<210> 16
<211> 40
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 16
accactaacg aggaattcat taggacacag atattcggta 40
<210> 17
<211> 40
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 17
tttgcagcta catgatcgct gacctttgtt tccaccagct 40
<210> 18
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 18
gagtagtaat tactttcttg 20
<210> 19
<211> 23
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 19
ccgtgacaaa atatatatct tcc 23
<210> 20
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 20
gagtagtaat tactttcttg 20
<210> 21
<211> 19
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 21
ggatcttgcc atcctatgg 19
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<210> 22
<211> 1306
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (142)..(1293)
<400> 22
atgagcctcc atttcttata ctactgcagt gaaccaacat tggatgtgaa aattgccttt 60
tgtcaggtgt gtgttcctta caggtaaaac aagggattcg ataaacaagt ggatgtgtca 120
tatattgcca aacattacaa c atg agc aaa agc aaa gtt gac aac cag ttc 171
Met Ser Lys Ser Lys Val Asp Asn Gln Phe
1 5 10
tac agt gtg gaa gtg gga gac tca acc ttc aca gtt ctc aag cgc tac 219
Tyr Ser Val Glu Val Gly Asp Ser Thr Phe Thr Val Leu Lys Arg Tyr
15 20 25
cag aat cta aag cct att ggc tct ggg gct cag ggc ata gtt tgt gcc 267
Gln Asn Leu Lys Pro Ile Gly Ser Gly Ala Gln Gly Ile Val Cys Ala
30 35 40
gcg tat gat gct gtc ctt gac aga aat gtg gcc att aag aag ctc agc 315
Ala Tyr Asp Ala Val Leu Asp Arg Asn Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser
45 50 55
aga ccc ttt cag aac caa aca cat gcc aag aga gcg tac cgg gag ctg 363
Arg Pro Phe Gln Asn Gln Thr His Ala Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Leu
60 65 70
gtc ctc atg aag tgt gtg aac cat aaa aac att att agt tta tta aat 411
Val Leu Met Lys Cys Val Asn His Lys Asn Ile Ile Ser Leu Leu Asn
75 80 85 90
gtc ttc aca ccc cag aaa acg ctg gag gag ttc caa gat gtt tac tta 459
Val Phe Thr Pro Gln Lys Thr Leu Glu Glu Phe Gln Asp Val Tyr Leu
95 100 105
gta atg gaa ctg atg gat gcc aac tta tgt caa gtg att cag atg gaa 507
Val Met Glu Leu Met Asp Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln Met Glu
110 115 120
tta gac cat gag cga atg tct tac ctg ctg tac caa atg ttg tgt ggc 555
Leu Asp His Glu Arg Met Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Leu Cys Gly
125 130 135
att aag cac ctc cat tct gct gga att att cac agg gat tta aaa cca 603
Ile Lys His Leu His Ser Ala Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro
140 145 150
agt aac att gta gtc aag tct gat tgc aca ttg aaa atc ctg gac ttt 651
Ser Asn Ile Val Val Lys Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu Asp Phe
155 160 165 170
gga ctg gcc agg aca gca ggc aca agc ttc atg atg act cca tat gtg 699
Gly Leu Ala Arg Thr Ala Gly Thr Ser Phe Met Met Thr Pro Tyr Val
175 180 185
gtg aca cgt tat tac aga gcc cct gag gtc atc ctg ggg atg ggc tac 747
Val Thr Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met Gly Tyr
190 195 200
aag gag aac gtg gat ata tgg tct gtg gga tgc att atg gga gaa atg 795
Lys Glu Asn Val Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly G1u Met
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205 210 215
gtt cgc cac aaa atc ctc ttt cca gga agg gac tat att gac cag tgg 843
Val Arg His Lys Ile Leu Phe Pro Gly Arg Asp Tyr Ile Asp Gln Trp
220 225 230
aat aag gta att gaa caa cta gga aca cca tgt cca gaa ttc atg aag 891
Asn Lys Val Ile Glu Gln Leu Gly Thr Pro Cys Pro Glu Phe Met Lys
235 240 245 250
aaa ttg caa ccc aca gta aga aac tat gtg gag aat cgg ccc aag tat 939
Lys Leu Gln Pro Thr Val Arg Asn Tyr Val Glu Asn Arg Pro Lys Tyr
255 260 265
gcg gga ctc acc ttc ccc aaa ctc ttc cca gat tcc ctc ttc cca gcg 987
Ala Gly Leu Thr Phe Pro Lys Leu Phe Pro Asp Ser Leu Phe Pro Ala
270 275 280
gac tcc gag cac aat aaa ctc aaa gcc agc caa gcc agg gac ttg ttg 1035
Asp Ser Glu His Asn Lys Leu Lys Ala Ser Gln Ala Arg Asp Leu Leu
285 290 295
tca aag atg cta gtg att gac cca gca aaa aga ata tca gtg gac gac 1083
Ser Lys Met Leu Val Ile Asp Pro Ala Lys Arg Ile Ser Val Asp Asp
300 305 310
gcc tta cag cat ccc tac atc aac gtc tgg tat gac cca gcc gaa gtg 1131
Ala Leu Gln His Pro Tyr Ile Asn Val Trp Tyr Asp Pro Ala Glu Val
315 320 325 330
gag gcg cct cca cct cag ata tat gac aag cag ttg gat gaa aga gaa 1179
Glu Ala Pro Pro Pro Gln Ile Tyr Asp Lys Gln Leu Asp Glu Arg Glu
335 340 345
cac aca att gaa gaa tgg aaa gaa ctt atc tac aag gaa gta atg aat 1227
His Thr Ile Glu Glu Trp Lys Glu Leu Ile Tyr Lys Glu Val Met Asn
350 355 360
tca gaa gaa aag act aaa aat ggt gta gta aaa gga cag cct tct cct 1275
Ser Glu Glu Lys Thr Lys Asn Gly Val Val Lys Gly Gln Pro Ser Pro
365 370 375
tca gca cag gtg cag cag tgaacagcag tga 1306
Ser Ala Gln Val Gln Gln
380
<210> 23
<211> 384
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Ser Lys Ser Lys Val Asp Asn Gln Phe Tyr Ser Val Glu Val Gly
1 5 10 15
Asp Ser Thr Phe Thr Val Leu Lys Arg Tyr Gln Asn Leu Lys Pro Ile
20 25 30
Gly Ser Gly Ala Gln Gly Ile Val Cys Ala Ala Tyr Asp Ala Val Leu
35 40 45
Asp Arg Asn Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Asn Gln
50 55 60
Thr His Ala Lys Arg Ala Tyr Arg G1u Leu Val Leu Met Lys Cys Val
65 70 75 80
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Asn His Lys Asn Ile Ile Ser Leu Leu Asn Val Phe Thr Pro Gln Lys
85 90 95
Thr Leu Glu Glu Phe Gln Asp Val Tyr Leu Val Met Glu Leu Met Asp
100 105 110
Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln Met Glu Leu Asp His Glu Arg Met
115 120 125
Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Leu Cys Gly Ile Lys His Leu His Ser
130 135 140
Ala Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Ile Val Val Lys
145 150 155 160
Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Ala
165 170 175
Gly Thr Ser Phe Met Met Thr Pro Tyr Val Val Thr Arg Tyr Tyr Arg
180 185 190
Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met Gly Tyr Lys Glu Asn Val Asp Ile
195 200 205
Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly Glu Met Val Arg His Lys Ile Leu
210 215 220
Phe Pro Gly Arg Asp Tyr Ile Asp Gln Trp Asn Lys Val Ile Glu Gln
225 230 235 240
Leu Gly Thr Pro Cys Pro Glu Phe Met Lys Lys Leu Gln Pro Thr Val
245 250 255
Arg Asn Tyr Val Glu Asn Arg Pro Lys Tyr Ala Gly Leu Thr Phe Pro
260 265 270
Lys Leu Phe Pro Asp Ser Leu Phe Pro Ala Asp Ser Glu His Asn Lys
275 280 285
Leu Lys Ala Ser Gln Ala Arg Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Val Ile
290 295 300
Asp Pro Ala Lys Arg Ile Ser Val Asp Asp Ala Leu Gln His Pro Tyr
305 310 315 320
Ile Asn Val Trp Tyr Asp Pro Ala Glu Val Glu Ala Pro Pro Pro Gln
325 330 335
Ile Tyr Asp Lys Gln Leu Asp Glu Arg Glu His Thr Ile Glu Glu Trp
340 345 350
Lys Glu Leu Ile Tyr Lys Glu Val Met Asn Ser Glu Glu Lys Thr Lys
355 360 365
Asn Gly Val Val Lys Gly Gln Pro Ser Pro Ser Ala Gln Val Gln Gln
370 375 380
<210> 24
<211> 1422
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (142)..(1419)
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<400> 24
atgagcctcc atttcttata ctactgcagt gaaccaacat tggatgtgaa aattgccttt 60
tgtcaggtgt gtgttcctta caggtaaaac aagggattcg ataaacaagt ggatgtgtca 120
tatattgcca aacattacaa c atg agc aaa agc aaa gtt gac aac cag ttc 171
Met Ser Lys Ser Lys Val Asp Asn Gln Phe
1 5 10
tac agt gtg gaa gtg gga gac tca acc ttc aca gtt ctc aag cgc tac 219
Tyr Ser Val Glu Val Gly Asp Ser Thr Phe Thr Val Leu Lys Arg Tyr
15 20 25
cag aat cta aag cct att ggc tct ggg gct cag ggc ata gtt tgt gcc 267
Gln Asn Leu Lys Pro Ile Gly Ser Gly Ala Gln Gly Ile Val Cys Ala
30 35 40
gcg tat gat gct gtc ctt gac aga aat gtg gcc att aag aag ctc agc 315
Ala Tyr Asp Ala Val Leu Asp Arg Asn Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser
45 50 55
aga ccc ttt cag aac caa aca cat gcc aag aga gcg tac cgg gag ctg 363
Arg Pro Phe Gln Asn Gln Thr His Ala Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Leu
60 65 70
gtc ctc atg aag tgt gtg aac cat aaa aac att att agt tta tta aat 411
Val Leu Met Lys Cys Val Asn His Lys Asn Ile Ile Ser Leu Leu Asn
75 80 85 90
gtc ttc aca ccc cag aaa acg ctg gag gag ttc caa gat gtt tac tta 459
Val Phe Thr Pro Gln Lys Thr Leu Glu Glu Phe Gln Asp Val Tyr Leu
95 100 105
gta atg gaa ctg atg gat gcc aac tta tgt caa gtg att cag atg gaa 507
Val Met Glu Leu Met Asp Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln Met Glu
110 115 120
tta gac cat gag cga atg tct tac ctg ctg tac caa atg ttg tgt ggc 555
Leu Asp His Glu Arg Met Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Leu Cys Gly
125 130 135
att aag cac ctc cat tct gct gga att att cac agg gat tta aaa cca 603
Ile Lys His Leu His Ser Ala Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro
140 145 150
agt aac att gta gtc aag tct gat tgc aca ttg aaa atc ctg gac ttt 651
Ser Asn Ile Val Val Lys Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu Asp Phe
155 160 165 170
gga ctg gcc agg aca gca ggc aca agc ttc atg atg act cca tat gtg 699
Gly Leu Ala Arg Thr Ala Gly Thr Ser Phe Met Met Thr Pro Tyr Val
175 180 185
gtg aca cgt tat tac aga gcc cct gag gtc atc ctg ggg atg ggc tac 747
Val Thr Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met Gly Tyr
190 195 200
aag gag aac gtg gat ata tgg tct gtg gga tgc att atg gga gaa atg 795
Lys Glu Asn Val Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly Glu Met
205 210 215
gtt cgc cac aaa atc ctc ttt cca gga agg gac tat att gac cag tgg 843
Val Arg His Lys Ile Leu Phe Pro Gly Arg Asp Tyr Ile Asp Gln Trp
220 225 230
aat aag gta att gaa caa cta gga aca cca tgt cca gaa ttc atg aag 891
Asn Lys Val Ile Glu Gln Leu Gly Thr Pro Cys Pro Glu Phe Met Lys
235 240 245 250
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aaattgcaacccacagtaaga aactatgtggagaatcggcccaag tat 939
LysLeuGlnProThrValArg AsnTyrValGluAsnArgProLys Tyr
255 260 265
gcgggactcaccttccccaaa ctcttcccagattccctcttccca gcg 987
AlaGlyLeuThrPheProLys LeuPheProAspSerLeuPhePro Ala
270 275 280
gactccgagcacaataaactc aaagccagccaagccagggacttg ttg 1035
AspSerGluHisAsnLysLeu LysAlaSerGlnAlaArgAspLeu Leu
285 290 295
tcaaagatgctagtgattgac ccagcaaaaagaatatcagtggac gac 1083
SerLysMetLeuValIleAsp ProAlaLysArgIleSerValAsp Asp
300 305 310
gccttacagcatccctacatc aacgtctggtatgacccagccgaa gtg 1131
AlaLeuGlnHisProTyrIle AsnValTrpTyrAspProAlaGlu Val
315 320 325 330
gaggcgcctccacctcagata tatgacaagcagttggatgaaaga gaa 1179
GluAlaProProProGlnIle TyrAspLysGlnLeuAspGluArg Glu
335 340 345
cacacaattgaagaatggaaa gaacttatctacaaggaagtaatg aat 1227
HisThrIleGluGluTrpLys GluLeuIleTyrLysGluValMet Asn
350 355 360
tcagaagaaaagactaaaaat ggtgtagtaaaaggacagccttct cct 1275
SerGluGluLysThrLysAsn GlyValValLysGlyGlnProSer Pro
365 370 375
tcaggtgcagcagtgaacagc agtgagagtctccctccatcctcg tct 1323
SerGlyAlaAlaValAsnSer SerGluSerLeuProProSerSer Ser
380 385 390
gtcaatgacatctcctccatg tccaccgaccagaccctggcatct gac 1371
ValAsnAspIleSerSerMet SerThrAspG1nThrLeuAlaSer Asp
395 400 405 410
actgacagcagcctggaagcc tcggcaggacccctgggttgttgc agg 1419
ThrAspSerSerLeuGluAla SerAlaGlyProLeuGlyCysCys Arg
415 420 425
tga 1422
<210> 25
<211> 426
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Met Ser Lys Ser Lys Val Asp Asn Gln Phe Tyr Ser Val Glu Val Gly
1 5 10 15
Asp Ser Thr Phe Thr Val Leu Lys Arg Tyr Gln Asn Leu Lys Pro Ile
20 25 30
Gly Ser Gly Ala Gln Gly Ile Val Cys Ala Ala Tyr Asp Ala Val Leu
35 40 45
Asp Arg Asn Val Ala Ile Lys Lys Leu Ser Arg Pro Phe Gln Asn Gln
50 55 60
Thr His Ala Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Leu Val Leu Met Lys Cys Val
65 70 75 80
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Asn His Lys Asn Ile Ile Ser Leu Leu Asn Val Phe Thr Pro Gln Lys
85 90 95
Thr Leu Glu Glu Phe Gln Asp Val Tyr Leu Val Met Glu Leu Met Asp
100 105 110
Ala Asn Leu Cys Gln Val Ile Gln Met Glu Leu Asp His Glu Arg Met
115 120 125
Ser Tyr Leu Leu Tyr Gln Met Leu Cys Gly Ile Lys His Leu His Ser
130 135 140
Ala Gly Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Ile Val Val Lys
145 150 155 160
Ser Asp Cys Thr Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Ala
165 170 175
Gly Thr Ser Phe Met Met Thr Pro Tyr Val Val Thr Arg Tyr Tyr Arg
180 185 190
Ala Pro Glu Val Ile Leu Gly Met Gly Tyr Lys Glu Asn Val Asp Ile
195 200 205
Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Gly Glu Met Val Arg His Lys Ile Leu
210 215 220
Phe Pro Gly Arg Asp Tyr Ile Asp Gln Trp Asn Lys Val Ile Glu Gln
225 230 235 240
Leu Gly Thr Pro Cys Pro Glu Phe Met Lys Lys Leu Gln Pro Thr Val
245 250 255
Arg Asn Tyr Val Glu Asn Arg Pro Lys Tyr Ala Gly Leu Thr Phe Pro
260 265 270
Lys Leu Phe Pro Asp Ser Leu Phe Pro Ala Asp Ser Glu His Asn Lys
275 280 285
Leu Lys Ala Ser Gln Ala Arg Asp Leu Leu Ser Lys Met Leu Val Ile
290 295 300
Asp Pro Ala Lys Arg Ile Ser Val Asp Asp Ala Leu Gln His Pro Tyr
305 310 315 320
Ile Asn Val Trp Tyr Asp Pro Ala Glu Val Glu Ala Pro Pro Pro Gln
325 330 335
Ile Tyr Asp Lys Gln Leu Asp Glu Arg Glu His Thr Ile Glu Glu Trp
340 345 350
Lys Glu Leu Ile Tyr Lys Glu Val Met Asn Ser Glu Glu Lys Thr Lys
355 360 365
Asn Gly Val Val Lys Gly Gln Pro Ser Pro Ser Gly Ala Ala Val Asn
370 375 380
Ser Ser Glu Ser Leu Pro Pro Ser Ser Ser Val Asn Asp Ile Ser Ser
385 390 395 400
Met Ser Thr Asp Gln Thr Leu Ala Ser Asp Thr Asp Ser Ser Leu Glu
405 410 415
Ala Ser Ala Gly Pro Leu Gly Cys Cys Arg
420 425
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<210>
26
<211> 0
42
<212>
ADN
<213> sapiens
Homo
<220>
<221>
CDS
<222> )..(417)
(1
<400>
26
atg ctccat ttcttatactactgcagtgaa ccaacattggatgtg 48
agc
Met LeuHis PheLeuTyrTyrCysSerGlu ProThrLeuAspVal
Ser
1 5 10 15
aaa gccttt tgtcagggattcgataaacaa gtggatgtgtcatat 96
att
Lys AlaPhe CysGlnGlyPheAspLysGln ValAspValSerTyr
Ile
20 25 30
att aaacat tacaacatgagcaaaagcaaa gttgacaaccagttc 144
gcc
Ile LysHis TyrAsnMetSerLysSerLys ValAspAsnGlnPhe
Ala
35 40 45
tac gtggaa gtgggagactcaaccttcaca gttctcaagcgctac 192
agt
Tyr ValGlu ValGlyAspSerThrPheThr ValLeuLysArgTyr
Ser
50 55 60
cag ctaaag cctattggctctggggctcag ggcatagtttgtgcc 240
aat
Gln LeuLys ProIleGlySerGlyAlaGln GlyIleValCysAla
Asn
65 70 75 80
gcg gatgct gtccttgacagaaatgtggcc attaagaagctcagc 288
tat
Ala AspAla ValLeuAspArgAsnValAla IleLysLysLeuSer
Tyr
85 90 95
aga tttcag aaccaaacacatgccaagaga gcgtaccgggagctg 336
ccc
Arg PheGln AsnGlnThrHisAlaLysArg AlaTyrArgGluLeu
Pro
100 105 110
gtc atgaag tgtgtgaaccataaaaacatt attagtttattaaat 384
ctc
Val MetLys CysValAsnHisLysAsnIle IleSerLeuLeuAsn
Leu
115 120 125
gtc acaccc cagaaaacgctggaggagttc taa 420
ttc
Val ThrPro GlnLysThrLeuGluGluPhe
Phe
130 135
<210> 27
<211> 139
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Ser Leu His Phe Leu Tyr Tyr Cys Ser Glu Pro Thr Leu Asp Val
1 5 10 15
Lys Ile Ala Phe Cys Gln Gly Phe Asp Lys Gln Val Asp Val Ser Tyr
20 25 30
Ile Ala Lys His Tyr Asn Met Ser Lys Ser Lys Val Asp Asn Gln Phe
35 40 45
Tyr Ser Val Glu Val Gly Asp Ser Thr Phe Thr Val Leu Lys Arg Tyr
50 55 60
Gln Asn Leu Lys Pro I1e Gly Ser Gly Ala Gln Gly Ile Val Cys Ala
65 70 75 80
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AlaTyrAspAlaVal LeuAspArgAsnValAla LysLysLeu Ser
Ile
85 90 95
ArgProPheGlnAsn GlnThrHisAlaLysArg TyrArgGlu Leu
Ala
100 105 110
ValLeuMetLysCys ValAsnHisLysAsnIle SerLeuLeu Asn
Ile
115 120 125
ValPheThrProGln LysThrLeuGluG1uPhe
130 135
<210> 28
<211> 114
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(114)
<400> 28
atg agc ctc cat ttc tta tac tac tgc agt gaa cca aca ttg gat gtg 48
Met Ser Leu His Phe Leu Tyr Tyr Cys Ser Glu Pro Thr Leu Asp Val
1 5 10 15
aaa att gcc ttt tgt cag gga ttc gat aaa caa gtg gat gtg tca tat 96
Lys Ile Ala Phe Cys Gln Gly Phe Asp Lys Gln Val Asp Val Ser Tyr
20 25 30
att gcc aaa cat tac aac 114
Ile Ala Lys His Tyr Asn
<210> 29
<211> 38
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Met Ser Leu His Phe Leu Tyr Tyr Cys Ser Glu Pro Thr Leu Asp Val
1 5 10 15
Lys Ile Ala Phe Cys Gln Gly Phe Asp Lys Gln Val Asp Val Ser Tyr
20 25 30
Ile Ala Lys His Tyr Asn
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