Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
1
IDENTIFICATION DES LIGANDS D'UN RECEPTEUR CAPABLE DE S'INTERNALISER
La présente invention a pour objet un procédé de criblage
s applicable à l'identification de ligands potentiels pour un récepteur
capable de
s' internaliser.
L'invention concerne plus particulièrement, mais non
exclusivement les récepteurs appartenant à la famille des récepteurs à 7
io domaines transmembranaires couplés aux protéines G ainsi que ceux de la
famille des récepteurs tyrosine kinase à un seul domaine transmembranaire.
A ce jour, environ 800 récepteurs à 7 domaines
transmembranaires couplés aux protéines G (GPCR) ont été clonés de
différentes espèces eucaryotes. Chez l'homme, 240 GPCRs ont été isolés.
is Pour seulement 140 d'entre eux le ligand endogène est connu, pour les 100
autres restants qui constituent le pool des récepteurs orphelins, ils sont à
identifier.
Parallèlement, plusieurs centaines de nouveaux médicaments
agissant sur les GPCRs ont été enregistrés, au cours de ces vingt dernières
2o années.
En conséquence, les récepteurs orphelins nouvellement clonés
sont d'un grand intérêt pour la recherche pharmaceutique dans la mesure où ils
sont susceptibles de représenter des cibles thérapeutiques potentielles.
Toutefois, leur valorisation sur un plan thérapeutique implique au préalable
2s d'isoler leur ligand endogène et, par tà même, d'élucider leur fonction.
Sur l'ensemble de ces récepteurs orphelins couplés aux protéines
G, seuls 5 ligands endogènes ont à ce jour été isolés, tous appartenant à des
familles de peptides nouveaux : les orexines / hypocrétines, la nociceptine /
orphanine, le PrRP, peptide libérant la prolactine, l'apeline et le peptide de
type
30 leucokinin (leucokinin-like).
Pour les identifier, les auteurs ont criblé dans tous les cas des
fractions de tissus purifiées sur différents tests.
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
2
Pour le choix des tests, ils ont mis à profit le fait que lorsque
l'agoniste se fixe sur son récepteur, il y a formation d'un second messager
qui
va produire, suivant la voie de signalisation utilisée par le récepteur,
différents
produits et qui va dans tous les cas aboutir à un changement de pH
s intracellulaire.
Dans le cas de la nociceptine, les auteurs ont mesuré
l'accumulation d'AMPc, résultant de la stimulation de l'adénylate cyclase.
Dans le cas des orexines, les auteurs ont mesuré l'accumulation
de Ca2+ intracytoplasmique résultant de la stimulation de la phospholipase C.
lo Dans le cas du PrRP, les auteurs ont mesuré la formation d'acide
arachidonique résultant de la stimulation de la phospholipase A2.
Dans le cas de l'apeline, ils ont mesuré les modifications de
l'acidification du milieu extracellulaire à l'aide d'un "cytosenseur" .
is Toutefois, l'ensemble de ces voies d'identification n'est pas
totalement satisfaisant pour les raisons suivantes
La démarche d'identification consistant à évaluer la production de
seconds messagers nécessite de connaître la voie de signalisation du
récepteur. En présence d'un récepteur orphelin, n'ayant aucune idée de la voie
2o mise en jeu, il s'avère nécessaire de tester l'ensemble des voies de
signalisation connues avec l'espoir que le récepteur d'intérét ne soit pas
couplé
à une voie encore inconnue. Ceci nécessite donc de disposer d'une quantité
d'échantillon importante. Cette démarche implique également que le récepteur
d'intérêt soit couplé à une cascade de seconds messagers dans les systèmes
2s de transfection hétérologues dans lesquels ils sont exprimés, ce qui n'est
pas
nécessairement le cas.
Quant à l'approche consistant à mesurer l'acidification du milieu
extracellulaire, suite à la production de protons par la cellule activée, elle
se
heurte au problème suivant : si l'on met en présence des banques de peptides
30 ou des fractions purifiées d'extraits de tissus avec un récepteur orphelin
exprimé à la surFace d'une cellule, on mesure une modification de pH
extracellulaire qui résulte de la stimulation non seulement du récepteur
orphelin
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
3
mais aussi de tous les récepteurs endogènes présents. On ne peut donc pas
délimiter facilement le ligand responsable de l'activation du récepteur
orphelin.
La présente invention a précisément pour objet de proposer une
s nouvelle méthode pour détecter et/ou identifier les ligands de récepteurs
orphelins qui s'avère plus fiable que celles évoquées ci-dessus, réalisable
sur
des échantillons de faibles volumes et exploitable en présence d'autres
récepteurs endogènes et d'un nombre important de ligands, peptidiques ou non
peptidiques, pour ces récepteurs endogènes annexes.
lo La méthode développée dans le cadre de la présente invention
met à profit les propriétés qu'ont les récepteurs à sept domaines
transmembranaires, couplés aux protéines G, ou les récepteurs à tyrosine
kinase, de s'internaliser dans les cellules qui les expriment sous l'action de
ligands agonistes. L'internalisation est un phénomène assez universel qui
is touche un grand nombre de récepteurs. Cette internalisation peut ainsi être
visualisée en microscopie confocale, optique ou même électronique lorsque le
ligand est marqué avec une molécule fluorescente ou un marqueur épitopique.
Les complexes ligand-récepteurs suivent alors un cheminement intracellulaire
caractéristique, qui a déjà été bien étudié. Par exemple, cette technique de
2o marquage fluorescent ou épitopique a déjà été préconisée pour suivre le
trafic
intracellulaire soit
- d'un ligand marqué, complexé à son récepteur respectif, ledit
récepteur subissant une internalisation induite par son activation,
- d'une protéine impliquée dans la transduction du signal, en
2s l'occurrence la protéine kinase C marquée,
- soit encore d'une protéine impliquée dans la désensibilisation
d'un récepteur après l'activation de celui-ci, en l'occurrence la (3-arestine
2
marquée.
Toutefois, l'option consistant à marquer soit un ligand soit une
3o protéine impliquée dans la transduction du signal ou encore dans la
désensibilisation d'un récepteur après l'activation de celui-ci, comme la f3-
arestine 2 marquée n'est pas totalement fiable. II peut en effet demeurer une
ambigu'ité sur l'identité du récepteur dont l'internalisation a été suivie. De
plus
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
4
des données récentes suggèrent que des protéines différentes peuvent être
impliquées dans les mécanismes d'internalisation et de désensibilisation de
divers récepteurs. La ~i-arestine 2, en particulier, ne semble pas jouer un
rôle
universel.
s Par exemple, lorsque l'on suit la mobilisation de la f3-arestine
couplée à l'EGFP, Lors de la stimulation du récepteur orphelin par son ligand,
il
y a phosphorylation du récepteur qui peut alors fixer la f3-arestine2-GFP
mobilisée du cytoplasme à la membrane. II y a ensuite séquestration du
récepteur et internalisation. Or, dans le cas de la recherche d'un ligand
io endogène d'un récepteur orphelin surexprimé à la surface de cellules
eucaryotes, la mise en contact avec une banque de peptides ou de fractions
purifiées de tissu résulte en l'activation non seulement du récepteur orphelin
mais aussi de tous les récepteurs endogènes couplés aux protéines G. II en
résulte donc une mobilisation de Ia (3-arestine 2-GFP non seulement par le
is récepteur orphelin mais aussi par les récepteurs endogènes. Ceci ne permet
donc pas d'identifier le ligand responsable de l'activation du récepteur
orphelin.
De même, dans le cas d'une banque de peptides ou de fractions
de tissus purifiées contenant le ligand endogène recherché, si tous les
peptides
sont marqués de façon homogène on ne peut pas identifier celui que l'on
2o recherche.
Le procédé de criblage revendiqué a précisément pour avantage
de lever cette indétermination.
Plus précisément, la présente invention concerne un procédé utile
2s pour détecter et/ou identifier dans une banque de composés peptidiques,
pseudopeptidiques ou non-peptidiques, un extrait biologique et/ou une fraction
purifiée d'un extrait de tissus, un ligand d'un récepteur d'intérêt et capable
de
subir une internalisation induite par la fixation dudit ligand, caractérisé en
ce
qu' il comprend au moins les étapes consistant à
30 - exprimer ledit récepteur sous une forme marquée à la surface
d'une cellule,
- mettre en présence ladite cellule avec ladite banque, l'extrait
biologique et/ou une fraction purifiée d'un extrait de tissus et contenant au
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
moins un composé peptidique, pseudopeptidique ou non peptidique susceptible
d'être un ligand dudit récepteur, dans des conditions suffisantes pour
permettre
une internalisation cellulaire dudit complexe récepteur-ligand et
- visualiser cette internalisation via la détection du marqueur lié
s audit récepteur.
La présente invention implique donc le marquage du récepteur
orphelin pour lequel notamment sont recherchés des agonistes potentiels.
Le fait de marquer en soit le récepteur orphelin est nettement
lo avantageux au regard des techniques de détection évoquées ci-dessus. En
effet, cette approche offre la possibilité de visualiser directement la cible
étudiée. Lors de la mise en contact du récepteur avec le ligand endogène,
c'est
le complexe ligand-récepteur-marqueur qui est internalisé. II n'y a pas
d'ambigu'ité sur l'identité du récepteur internalisé.
is De plus, dans le procédé revendiqué, la cellule surexprime
constitutivement le récepteur marqué. Le marquage est intracellulaire, sur la
queue cytoplasmique du récepteur et a donc pour avantage de ne pas gêner la
fixation du ligand.
En ce qui concerne les marqueurs convenant à l'invention, il peut
2o s'agir soit d'une protéine autofluorescente soit d'un marqueur épitopique
susceptible d'être détecté par immunohistochimie.
Les protéines fluorescentes pouvant être mises en oeuvre dans le
procédé revendiqué appartiennent de préférence à la famille de la protéine
fluorescente sauvage GFP et ses mutants (Ex : EGFP, EBFP et EYFP). Wang
2s S. & Halzelrigg T. (1994) Nature, 369:400-403 ; Yang TT et al. (1996)
Nucleic
Acid Res, 24: 4592-4593 ; Heim R & Tsien RY (1994) Curr. Biol., 6:1, 178-182;
Ormê M et al., (1996) Science, 273:1392-1395.
A titre illustratif des marqueurs non fluorescents susceptibles
d'être également mis en oeuvre selon l'invention, on peut tout
particulièrement
3o citer l'hémaglutinine, la polyhistidine, les protéines myc et flag et les
épitoges
viraux. II existe déjà pour tous ces composés fortement immunogènes des
anticorps sélectifs hautement affins dans le commerce (ex : anticorps
monoclonaux antimyc, Clontech; anticorps antihémaglutinine influenza,
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
6
Boehringer; anticorps anti-virus de la somatostatite vésiculaire, Clontech;
anticorps anti-polyhistidine, In Vitrogen). Leur détection implique une
reconnaissance du groupement antigénique par l'un de ces anticorps (dits
primaires), suivi d'une visualisation de l'anticorps primaire par un anticorps
s secondaire provenant d'une autre espèce et marqué soit par un fluorophore,
soit par la peroxydase du raifort que l'on fera consécutivement réagir avec un
substrat approprié.
Ce type de marquage est particulièrement intéressant dans la
mesure où il permet une sensibilité de mesure élevée qui se traduit par la
lo détection d'une concentration de ligand de l'ordre de 10-8 M c'est-à-dire
100 fmoles dans 10 pl. L'internalisation du complexe est visible en
microscopie
confocale voire méme optique lorsque le récepteur est fortement exprimé et si
le ligand est en concentration suffisante (minimum 10-8 M).
Cette internalisation est de préférence détectée par microscopie
Is confocale et/ou optique.
Enfin, avantageusement, les autres récepteurs endogènes, non
marqués, présents à la surface des cellules hôtes, méme s'ils sont également
internalisés, ne sont pas visibles et n'interfèrent pas au niveau de la
mesure. II
n'est donc noté aucun bruit de fond ce qui est particulièrement intéressant au
2o regard de la grande sensibilité de la méthode de mesure.
De manière générale, le procédé revendiqué s'avère posséder
une sensibilité suffisante pour permettre la visualisation d'une
internalisation
d'un conjugué récepteur-ligand au sein de la fraction testée nonobstant la
présence d'autres récepteurs endogènes et d'un grand nombre de ligands,
2s peptidiques ou non peptidiques pour ces récepteurs endogènes annexes.
Avantageusement, le procédé de criblage revendiqué s'avère
adpaté à l'étude de tout récepteur à condition que celui-ci possède la
capacité
de s' internaliser.
3o Selon un mode privilégié de l'invention, le récepteur d'intérêt est
couplé à une protéine G.
Le procédé revendiqué est particulièrement intéressant pour
caractériser des ligands de récepteurs appartenant à la famille des récepteurs
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
7
à 7 domaines transmembranaires couplés à la protéine G, les GPCRs, à la
famille des récepteurs tyrosine kinase à un seul domaine transmembranaire ou
à la famille des récepteurs des cytokines.
Dans le cas des GPCRs, l'étiquetage des récepteurs en C-
s terminal présente les avantages suivants
- la maturation post-traductionelle du récepteur n'est pas modifiée,
- la liaison des agonistes et des antagonistes ainsi que la
signalisation intracellulaire sont les mêmes qu'avec le récepteur natif,
- l'internalisation des complexes ligand-récepteurs n'est pas
lo modifiée et
- la méthode de détection de l'expression est rapide et peut étre
effectuée sur des cellules vivantes non fixées.
Le récepteur à étudier est couplé à un marqueur puis exprimé à la
Is surface d'une cellule-hôte. En ce qui concerne ces deux opérations, à
savoir le
marquage et l'expression dudit récepteur au niveau d'une cellule-hôte, elles
relèvent bien entendu toutes deux des compétences de l'homme de l'art.
Généralement, on opère de la manière suivante
La séquence de la partie codante du récepteur d'intérét est
2o insérée en phase, dans un vecteur d'expression, en amont ou en aval de la
séquence codante de la protéine fluorescente (GFP, EGFP, EBFP, EYFP) ou
d'un marqueur épitopique. Ces vecteurs d'expression (de type pGFP-N1 ou
pGFP-C1, N1 ou C1 indiquent la position du récepteur par rapport à la protéine
soit en N-terminal, soit en C-terminal) contiennent déjà la séquence de ces
2s marqueurs. Les cellules sont transfectées par une méthode classique (tels
que
la méthode des liposomes, phosphate de calcium), puis sélectionnées pour leur
résistance à un antibiotique. Dans le cas des protéines de la famille GFP, il
est
possible d'effectuer un tri des cellules exprimant le récepteur couplé à la
protéine fluorescente par cytométrie de flux.
30 En ce qui concerne les cellules transformées il s'agit de cellules
eucaryotes comme par exemple les cellules épithéliales de reins de singe
COS-7 ; d'ovaires de hamster : CHO ; et les cellules humaines embryonnaires
de rein : HEK 293).
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
8
Dans une variante du procédé revendiqué, on peut envisager
d'exprimer à la surface d'une cellule, deux ou plusieurs récepteurs distincts
marqués respectivement par des marqueurs différents. Les deux récepteurs
sont bien entendu capables de s' internaliser. Cette option offre ainsi la
s possibilité de cribler sur un même échantillon et simultanément des ligands
potentiels pour plusieurs récepteurs.
Conformément au procédé revendiqué, les cellules hôtes sont
mises en présence d'un ligand potentiel. Pour ce faire, on met donc en contact
lesdites cellules avec soit une banque de composés peptidiques, pseudo-
lo peptidiques ou non-peptidiques, un extrait biologique ou encore des
fractions
purifiées d'un extrait de tissus.
Cette mise en contact est effectuée dans des conditions
suffisantes pour permettre l'internalisation cellulaire du ou des complexes
récepteur-marqueur-ligand. Ces conditions suffisantes sont bien entendu
is appréciées par l'homme du métier, en termes de température, de durée et de
concentration. II peut également être nécessaire de procéder à des
expériences répétées.
En règle générale, l'internalisation de complexes ligand-récepteur
dans les cellules des mammifères est optimale à 37°C. La demi-vie
moyenne
2o du processus d'internalisation (temps requis pour que 50 % des récepteurs
de
surface occupés soient internalisés) est de l'ordre de 10 minutes. Ainsi, des
expositions au ligand de 20 à 40 minutes sont habituellement optimales pour le
repérage des récepteurs internalisés, les concentrations de ligand optimales
sont de l'ordre de 10 à 20 fois l'affinité du ligand pour son récepteur (Kd).
2s On suit par microscopie confocale ou dans le cas d'une forte
expression de ce récepteur marqué, par microscopie optique, l'internalisation
du complexe ligand-récepteur qui se concrétise par le déplacement du
marquage (fluorescent ou immunohistochimique) de la membrane de la cellule
(dont l'intensité de marquage diminue) vers l'intérieur de celle-ci sous forme
de
3o vésicules.
Dans le cas d'un récepteur marqué avec une étiquette
fluorescente, la visualisation s'effectue directement en observant le
déplacement de la fluorescence.
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
9
Dans le cas où le récepteur est marqué avec un antigène non-
fluorescent, l'internalisation est visualisée en microscopie confocale après
fixation des cellules et détection des épitoges antigéniques par des anticorps
secondaires couplés à un fluorophore. Alternativement, les épitoges
s antigéniques peuvent être révélés par une réaction enzymatique, ou à l'aide
d'un anticorps radioactif qui se concrétise dans les deux cas par
l'accumulation
de dépôts opaques visibles aussi bien en microscopie photonique
qu'électronique.
lo Comme évoqué précédemment, l' internalisation peut être
visualisée sur une dizaine de cellules et pour un volume d'incubation très
faible
à savoir de l'ordre du NI. Ces deux qualités sont particulièrement précieuses
lorsque l'on ne dispose que d'une très faible quantité d'échantillon.
ls En conséquence, le procédé revendiqué s'avère tout
particulièrement avantageux pour détecter et/ou identifier le ou les ligands
endogènes d'un récepteur orphelin ou encore identifier de nouveaux agonistes
ou antagonistes pour un récepteur connu, c'est-à-dire dont on connaît le
ligand
endogène.
2o Etant basé sur l'observation directe d'un phénomène biologique
qui touche la plupart des récepteurs GPCR ou tyrosine kinase, à savoir
l'internalisation, cette méthode s'avère particulièrement utile pour la
recherche
des ligands des récepteurs orphelins et plus particulièrement des récepteurs
des peptides, en utilisant des préparations biologiques telles que des
extraits
2s de tissu.
On peut également envisager d'utiliser le procédé revendiqué
avec un récepteur marqué, déjà identifié et caractérisé, comme un
"biosenseur", qui permettrait de détecter dans un liquide biologique la
présence même à l'état de traces d'une substance toxique ou non capable de
3o se lier sur ce récepteur.
La présente invention s'étend également à tout ligand d'un
récepteur d'intérêt, identifié à l'aide du procédé revendiqué.
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
Les exemples et figures soumis ci-après sont présentés à titre
illustratif et non limitatif de la présente invention.
FIGURES
s Figures 1
figure 1a : Visualisation par microscopie confocale du récepteur
de la neurotensine de type 1 couplé à la protéine fluorescente EGFP (NTR1-
EGFP) à la surface de cellules CHO, incubées avec du tampon seul ou avec
une concentration faible (1 nM) de neurotensine de rat ou de grenouille
lo n'induisant pas d'internalisation.
figure 1 b : Visualisation de l'internalisation du récepteur NTR1-
EGFP caractérisée par la formation de nombreuses vésicules fluorescentes
cytoplasmique de 0,6 pm de diamètre à l'intérieur de cellules CHO incubées
avec des concentrations de neurotensine de 10 et 100 nM.
ls Figures 2: Visualisation de l'internalisation du récepteur NTR1-
EGFP avec ou sans lavage acide, en présence de : 10 nM de neurotensine
(figure 2a) ou d'une fraction purifiée d'extrait de cerveaux de grenouille
(figure
2b). Les conditions sont les mémes qu'en figure 1, et comprennent en outre un
lavage acide du ligand endogène encore lié à la surface des cellules à la fin
de
la période de charge.
Figure 3 : Internalisation du récepteur NTR1-EGFP en présence
de 10 fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille.
Figure 4 : Dosage radioimmunologique des fractions prépurifiées
d'un extrait de cerveaux de grenouille en utilisant un anticorps dirigé contre
la
as région conservée de la neurotensine:
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
11
Matériels et méthodes
1) Construction du récepteur NTR1-EGFP
s La séquence codante entière du récepteur NT1 (K. Tanaka, M.
Masu and S. Nakanishi (1990) Structure and functional expression of the
cloned rat neurotensin receptor. Neuron 4: 847-54) a été amplifiée par PCR en
utilisant deux amorces dirigées contre les extrémités 5' et 3' de la séquence
codante de cet ADNc et contenant également des sites de restriction Hindlll ou
lo BamH1 5'-CTT AAG CTT ATG CAC CTC AAC AGC TCC GTG-3' (SEQ ID
N°1 ) et 5'-TTT GGA TCC GCG TAC AGG GTC TCC CGG GT-3' (SEQ ID
N°2).
Après digestion par les enzymes Hindlll et BamH1 et purification, la séquence
amplifiée a été insérée dans le vecteur d'expression pEGFP-N1 (Clontech) au
niveau des sites Hindlll et BamH1. La construction a été vérifiée sur un
ls séquenceur automatique AbiPrism 377 (Perkin-Elmer) en utilisant des ddNTP
fluorescents.
2) Transfection stable dans les cellules CHO
Les cellules CHO-K1 (American Type Culture Collection : ATCC)
20 ont été cultivées en atmosphère humide à C02 5%, dans du milieu F12
supplémenté avec 7,5% de sérum de veau foetal, 1 mM de glutamine, 100
unitésiml de pénicilline et 100 unitésiml de streptomycine (Boehringer
Mannheim). Pour établir la lignée stable exprimant ce récepteur, les cellules
CHO-K1 (environ 2,6x106 cellules) ont été transfectées avec 8 Ng de plasmide
2s en utilisant des liposomes cationiques (Dosper, Boehringer). Les cellules
transfectées sont sélectionnées pour leur résistance à la généticine. Les
clones
obtenus ont été triés en utilisant la cytométrie en flux qui prend en compte
l'intensité de la fluorescence de chaque cellule. Une deuxième sélection a été
effectuée à l'aide d'un microscope à fluorescence, en observant le niveau de
30 l'expression du récepteur NTR1-EGFP fluorescent, localisée à la surface
membranaire des cellules de chacun des clones.
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
12
3) Prépurification de l'extrait de cerveaux de grenouille
- Collection des tissus
2541 cerveaux de grenouille verte mâle (espèce Rana ridibunda),
s correspondant à un poids de tissu frais de 215 g, ont été collectés au
laboratoire sur des animaux fraichement sacrifiés. Les cerveaux ont été
congelés sur de la carboglace immédiatement après avoir été prélevés et
conservés à -80°C.
lo - Extraction des tissus
Les cerveaux ont été plongés pendant 15 min dans l'acide
acétique bouillant 0,5 M (2 litres), puis homogénéisés au mixeur. L'homogénat
a été centrifugé à 4000 x g pendant 30 min à 4°C. Le surnageant a
ensuite été
préfiltré sur un assemblage de 10 colonnes de Sep-Pak C18 (Waters
ls Associates, Milford, MA) montées en série à un débit de 2 ml/min. Le
matériel
fixé sur les colonnes de Sep-Pak a été élué avec 20 ml d'une solution
d'acétonitrile à 70%. Cette opération a été répétée 2 fois.
- Purification de l'extrait de cerveaux de Grenouille par HPLC semi-
2o préa~arative
Le matériel élué des colonnes de Sep-Pak a été partiellement
évaporé afin d'éliminer l'acétonitrile, puis centrifugé à 13000 x g pendant 5
min.
Le surnageant a été prélevé et divisé en 2. Chacun des 2 pools a ensuite été
injecté sur une colonne semi-préparative Vydac C18 218TP1010 (1 x 25 cm)
2s (The Separations Group, Hesperia, CA) équilibrée avec une solution
d'eaulacide trifluoroacétique (99,9:0,1; vol:vol) à un débit de 2 ml/min. Le
matériel peptidique fixé à la matrice a été élué en utilisant un gradient
d'acétonitrile s'élevant de 14 à 42% en 40 min à un débit de 2 ml/min, puis
montant de 42 à 56 % pendant 60 min à un débit de 1 ml/min. L'éluat a été
3o collecté par fraction de 1 min et l'absorbance mesurée à 215 et 280 nm. Les
fractions d'élution ont été conservées à -20°C. Avant les expériences
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
13
d'internalisation, chacune des fractions a été diluée avec de l'eau,
partiellement
évaporée afin d'éliminer l'acétonitrile, et complétée à un volume final de 50
NI.
4)Internalisation
s Les cellules sont distribuées (50 % de confluence, 20 000 cellules
par puit) puis cultivées pour la nuit sur des lames multi-puits (LabTek, Nunc)
prétraitées avec de la polyallylamine (0,1 mg/ml, Aldrich). Sur ces lames, le
volume des incubations (sauf pour la période de charge) et des lavages est de
250 pl par puits. 90 min avant le début de l'expérience, le milieu des
cellules
lo est changé pour un milieu supplémenté avec de la cycloheximide (70 pM,
Sigma). Les cellules sont ensuite préincubées pendant 15 min sur la glace
dans du tampon Earle's froid (pH 7,4, contenant 140 mM NaCI, 5 mM KCI,
1,8 mM CaCl2, 3;6 mM MgCl2, 0,1 % albumine sérique bovine, 0,01 % glucose
et 0,8 mM 1,10-phénanthroline). Puis les cellules sont incubées pendant
ls 30 min avec le ligand dilué dans 50 pl du tampon Earle's à 4°C
(période de
charge). A ce stade, un lot de cellules est soumis à un lavage acide
hypertonique (0,2 M d'acide acétique et 0,5 mM de NaCI dans le tampon
Earle's, pH 4 pendant 2 min à 4°C) afin de dissocier le ligand de ses
récepteurs
de surface. L'internalisation est provoquée par remplacement du milieu par du
zo tampon Earle's à 37°C et incubation des lames à 37°C pendant
20 à 30 min
(période de chasse). A la fin de l'incubation, les cellules sont rincées avec
du
tampon Earle's froid, fixées avec du paraformaldéhyde 4 % dissout dans du
tampon phosphate 0,1 M à pH 7,4, rincées de nouveau dans du tampon Earle's
froid puis montées en utilisant du Vectashield (Vector).
2s
5) Microscopie confocale
Les cellules sont examinées avec un microscope confocal Leica
TCS NT configuré avec un microscope inversé (Leica DM IRBE) équipé avec
un laser argon/krypton avec des filtres d'excitation et d'émission
3o respectivement de 488 et 530-600 nm. Des images de 1024-1024 pixels de
cellules individuelles sont obtenues en utilisant un objectif 63x à immersion
à
huile.
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
14
6) Dosage radioimmunologique de la neurotensine sur des
fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille
Un volume de 5 pl de chaque fraction collectée en sortie d'HPLC
semi-préparative est soumis à un dosage radioimmunologique de la
s neurotensine. Le dosage de la neurotensine a été effectué à l'aide d'un
anticorps dirigé contre le fragment C-terminal de la neurotensine de porc
(Marcos et al., Peptides 1996, 17: 139-146).
L'anticorps est utilisé à une dilution finale de 1:50 000, et la
sensibilité du dosage est de 10 pg. Le dosage radioimmunologique est effectué
lo à 4°C dans un tampon véronal 0,02 M (pH 8,6) contenant 4% d'albumine
sérique bovine et 7000 cpm de (3-[1251] iodotyrosyl) neurotensine (Amersham,
Buckingamshire, UK). Les échantillons et l'anticorps ont été incubés à
4°C
pendant 48 h. La séparation de la fraction de traceur liée à l'anticorps a été
réalisée par précipitation en ajoutant à chaque échantillon une solution de
ls y-globulines (1 % dans du tampon véronal 0,02 M) et une solution de
polyéthylène glycol (20 % dans un tampon véronal 0,02 M contenant 0,1
d'albumine sérique bovine et 0,1 % de triton X-100). Après une incubation de
20 min à température ambiante, les échantillons sont centrifugés (3 000 x g,
30 min) et les culots comptés dans un compteur gamma.
EXEMPLE 1 : Internalisation du récepteur NTR1-EGFP en présence de
neurotensine de grenouille ou de rat
1) Caractérisation du récepteur NTR1-EGFP
2s Le récepteur NTR1-EGFP est exprimé de façon stable dans la
lignée cellulaire CHO et ses propriétés de liaison et de transmission du
signal
intracellulaire ont été déterminées. L'affinité de la neurotensine s'est
révélée du
même ordre (0,3 nM) pour le récepteur NTR1-EGFP et le récepteur NT1
sauvage. De la même façon, le récepteur marqué conduit à la production
3o d'inositols phosphates avec une EC50 (1 nM) identique à celle obtenue pour
le
récepteur NT1 sauvage (résultats non présentés).
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
2) Internalisation du récepteur NTR9-EGFP en présence de
neurotensine de grenouille ou de rat
Les cellules incubées avec du tampon seul ou avec des
concentrations faibles (concentrations inférieures à 1 nM) de neurotensine de
s rat ou de grenouille présentent une fluorescence marquée du récepteur NTR1-
EGFP localisée à la membrane des cellules (Fig. 1 a).
L'incubation des cellules CHO-NTR1-EGFP avec des
concentrations croissantes de neurotensine (gamme commençant à 10 nM)
entraîne une internalisation des récepteurs NTR1-EGFP, indiquée par une
lo diminution du marquage fluorescent membranaire et par la formation de
nombreuses vésicules fluorescentes intracytoplasmiques de 0,6 pm de
diamètre (Fig. 1 b). Ce type de marquage n'est pas détecté lorsque le ligand
est
préalablement dissocié des récepteurs de surface suite à un lavage acide
effectué à la fin de la période de charge (Fig. 2a). Ces résultats indiquent
que
ls l'internalisation observée résulte de la fixation de la neurotensine sur
les
récepteurs membranaires pendant la période de charge.
EXEMPLE 2 : Internalisation du récepteur NTR1-EGFP en présence de
fractions prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille
Dans une première série d'expériences, 0,5 pl de chacune des
120 fractions d'élution d'un extrait de cerveaux de grenouille (prépurifié sur
une
colonne semi-préparative) ont été poolées par 10, donnant naissance à 12
pools de 10 fractions, chacun complété à 50 pl avec du tampon d'Earle's. Seul
2s le pool 2 contenant les fractions 11 à 20 entraine l'internalisation du
récepteur
NTR1-EGFP.
Dans une seconde série d'expériences, les fractions du pool 2,
c'est à dire les fractions 11 à 20 (0,5 NI de volume de fraction originale
dilué à
50 pl avec du tampon d'Earle's) ont été testées individuellement. Seules les
3o fractions 15,16,17,18 entraînent l'internalisation du récepteur NTR1-EGFP
(Fig.
3). Cette internalisation n'est pas détectée si les cellules sont soumises à
un
lavage acide à la fin de la période de charge (Fig. 2b) indiquant que
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
16
l'internalisation observée est le résultat de la fixation d'un ligand
spécifique sur
les récepteurs NTR1-EGFP pendant la période de charge.
EXEMPLE 3 : Dosage radioimmunologique de la neurotensine sur les fractions
s prépurifiées d'un extrait de cerveaux de grenouille
Le dosage radioimmunologique des fractions prépurifiées d'un
extrait de cerveaux de grenouille utilisant un anticorps dirigé contre la
région
conservée de la neurotensine montre que le matériel immunoréactif est
lo exclusivement contenu dans les fractions 15,16,17,18 (Fig. 4). La quantité
totale apparente de neurotensine mesurée dans les fractions d'élution de
l'HPLC semi-préparative est de 894 ng dans 16 ml, ce qui correspond à une
valeur de 352 pg de peptide par cerveau de grenouille. Par conséquent, le
matériel provoquant l'internalisation du récepteur NTR1-EGFP, contenu dans
ls les fractions 15,16,17,18 correspond à la neurotensine endogène du cerveau
de grenouille.
En conclusion, le procédé d'internalisation décrit ci-dessus est un
moyen direct, simple, spécifique et fiable, permettant de détecter à partir de
l'observation d'une seule cellule une quantité de neurotensine aussi faible
que
20 500 fmoles dans 50 NI. II apparaît que cette mesure est réalisable aussi
bien
sur une solution pure de neurotensine que sur une fraction d'extrait de tissu
contenant non seulement la neurotensine mais aussi un grand nombre d'autres
neuropeptides (le nombre minimum estimé par fraction étant de 50 peptides),
avec une sensibilité similaire puisque l'on arrive à détecter, d'après le
dosage
2s RIA, environ 250 fmoles.
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANTS:
(A) NOM: INSERM
(B) RUE: 101 rue de Tolbiac
(C) VILLE: Paris
(E) PAYS: France
(F) CODE POSTAL: 75013
(G) TELEPHONE: 0144236000
(H) TELECOPIE: 0145856856
(A) NOM: UNIVERSITE McGILL
(B) RUE: 3550, rue University
(C) VILLE: Montréal
(E) PAYS: QUEBEC
(F) CODE POSTAL: H3A 2A7
(G) TELEPHONE: (514)3984200
(H) TELECOPIE: (514)3988479
(ü) TITRE DE L'INVENTION: Procédé de criblage utile pour identifier des
ligands potentiels
pour un récepteur capable de s'internaliser.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de base
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: ADN
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: non pertinent
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEO ID NO: 1:
CTT AAG CTT ATG CAC CTC AAC AGC TCC GTG 30
(2) INFORMATION POUR LA SEO ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 paires de base
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
CA 02359213 2001-07-18
WO 00/43779 PCT/FR00/00113
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ü) TYPE DE MOLECULE: ADN
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: non pertinent
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
TTT GGA TCC GCG TAC AGG GTC TCC CGG GT 30
