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CA 02364465 2001-08-17
WO 00/53317 PCT/FR00/00577
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Procédé et appareil de transfert d'un fluide par plusieurs centrifugations
DESCRIPTION
La présente invention concerne un procédé et un appareil de transfert d'un
fluide
et plus particulièrement d'un liquide, depuis un compartiment de départ vers
un
compartiment d'arrivée, via un canal de transfert, le transfert s'effectuant
sous l'action
de la force centrifuge
L'état de la technique est constitué par le document FR-A-2.678.379 a pour
objet le transfert d'un liquide dans un dispositif de prélèvement et de
restitution d'une
l0 quantité prédéterminée de liquide. Ce dispositif est de forme tubulaire qui
contient au
voisinage de sa périphérie un canal hélicoidal borgne qui comporte l 'axe de
centrifugation comme axe de symétrie. Lorsque le dispositif est placé avec
l'ouverture
de son canal interne au contact d'un liquide, selon un sens de rotation, le
liquide monte
dans le dispositif, alors que dans le sens inverse, il en sort.
Ce dispositif ne permet que le prélèvement et la distribution d'un liquide
prélevé. Il n'y a aucune possibilité d'orientation du liquide en interne. La
polyvalence
de ce système est très limitée, et ce d'autant plus que pour que le
prélèvement reste dans
le dispositif, il convient de maintenir la centrifugation.
Selon une autre forme de réalisation, la centrifugation peut être plus
2o polyvalente et donc être intégrée dans un appareil permettant de mener des
réactions
biologiques multiples. Ainsi, de nombreux documents qui sont assez proches les
uns des
autres. C'est par exemple le cas des brevets US-A-3, 744, 975, US-A-4,123,173
et US-A-
4, 225, 558, qui proposent un appareil de forme plate et cylindrique, dont le
centre est
occupé par un axe de rotation. Cet axe permet donc de transférer les liquides,
que cet
appareil contient, du centre dudit appareil vers sa périphérie, sous l'action
de la force
centrifuge.
Toutefois, il n'est pas envisageable d'effectuer un transfert dans le sens
inverse,
c'est-à-dire selon la force centripète. L'orientation des liquides ne peut
donc s'effectuer
que selon la force centrifuge.
3o Les documents US-A-4, 812, 294, EP-A-D. 297. 394 et US-A-4, 788,1 ~4
décrivent
des appareils et des procédés, qui permettent des déplacements de liquides
selon
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plusieurs directions, en fonction de la force centrifuge exercée par plusieurs
axes de
centrifugation.
Néanmoins, aucun de ces documents ne concerne une configuration particulière
entre l'axe selon lequel s'applique la force centrifuge et la disposition,
d'une part, du
compartiment de départ ou intermédiaire, dans un premier temps, et du
compartiment
intermédiaire ou d'arrivée, dans un second temps, et d'autre part, du canal
entre ces
compartiments. De plus, l'invention selon la demanderesse permet de répartir
des
liquides dans des proportions établies en fonction de la configuration et de
la présence
d'au moins deux compartiments intermédiaires pour un compartiment de départ,
et/ou
lo d'au moins deux compartiments d'arrivée pour un compartiment intermédiaire.
Conformément à la présente invention, il est proposé un procédé dont la mise
en
oeuvre est encore plus polyvalente, permet des mouvements dans tous les
compartiments de l'appareil en s'affranchissant des effets d'une
centrifugation unique,
et une répartition des liquides dans des proportions établies.
L'invention concerne également un procédé mettant en oeuvre un tel appareil.
A cet effet, la présente invention concerne un procédé de transfert d'un
fluide
depuis au moins un compartiment de départ vers au moins un compartiment
d'arrivée,
via au moins un canal de transfert, le transfert s'effectuant sous l'action de
la force
2o centrifuge, le procédé consiste à
- effectuer une première centrifugation, dite primaire, pour transférer le
fluide de son
compartiment de départ vers un compartiment intermédiaire, via un canal de
transfert
primaire, et
- effectuer au moins une seconde centrifugation, dite secondaire, dont l'axe
de
centrifugation est différent de celui de la première centrifugation, pour
transférer le
fluide du compartiment intermédiaire vers le compartiment d'arrivée, via un
canal de
transfert secondaire,
il est caractérisé en ce que le compartiment intermédiaire est associé à au
moins deux
compartiments d'arrivée, chaque compartiment d'arrivée étant relié au
compartiment
3o intermédiaire par un canal de transfert secondaire, et qu'il consiste à
effectuer au moins
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une centrifugation secondaire, permettant l'orientation du fluide présent dans
ledit
compartiment intermédiaire vers les au moins deux compartiments d'arrivée.
L'invention concerne également un appareil de transfert d'un fluide constitué
d'un corps qui comporte au moins un compartiment de départ, au moins un
s compartiment d'arrivée et au moins un canal de transfert, cet appareil
comporte
également au moins deux axes de centrifugation, un axe primaire, pour
transférer le
fluide de son compartiment de départ vers un compartiment intermédiaire, via
un canal
de transfert primaire, et au moins un axe secondaire, différent de l'axe
primaire, pour
transférer ledit fluide du compartiment intermédiaire vers le compartiment
d'arrivée,
lo via un canal de transfert secondaire. Cet appareil est caractérisé par le
fait que chaque
axe de centrifugation coupe sensiblement perpendiculairement un axe imaginaire
passant par le compartiment, où le fluide est présent, et par le compartiment,
où le
fluide doit être envoyé sous l'action de la centrifugation selon l'axe de
centrifugation
concerné, et positionné entre ledit compartiment, où le fluide est présent, et
le bord
15 dudit appareil.
Selon une variante de réalisation, chaque canal de transfert entre deux
compartiments est sensiblement positionné le long de l'axe imaginaire passant
par les
deux compartiments, de part et d'autre du canal concerné.
Selon une autre variante de réalisation, chaque canal de transfert entre deux
2o compartiments est associé à un axe de centrifugation.
Selon encore une variante de réalisation, chaque canal de transfert est
rectiligne
et passe par le centre de gravité des deux compartiments, situés de part et
d'autre dudit
canal de transfert concerné.
Toujours selon une variante de réalisation, chaque canal de transfert comporte
25 un moyen de blocage, tel qu'une vanne à bille, qui empêche le passage d'un
fluide
transféré ou à transférer.
Selon une autre variante de réalisation, le compartiment intermédiaire est
associé à au moins deux compartiments d'arrivée adjacents, chaque compartiment
d'arrivée étant relié au compartiment intermédiaire par un canal de transfert
secondaire,
3o et ces compartiments d'arrivée sont associés à un seul axe de
centrifugation qui permet
la répartition entre les compartiments d'arrivée adjacents.
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Selon une variante différente de réalisation, le compartiment intermédiaire
comporte, au niveau des zones d'intersection avec les canaux de transfert
secondaires,
qui correspondent aux compartiments d'arrivée adjacents, des configurations
qui
permettent, sous l'action de la centrifugation, l'orientation du fluide de
départ au niveau
desdits canaux et une répartition équitable entre lesdits compartiments
d'arrivée
adj acents.
Un tel appareil est utilisable pour l'analyse d'un ou plusieurs échantillons
liquides différents dans lequel on cherche à identifier un ou plusieurs
analytes, selon
l0 tous les processus simples ou complexes d'analyse mettant en jeu un ou
plusieurs
réactifs différents selon la nature chimique, physique ou biologique du ou des
analytes
recherchés. Les principes techniques définis ci-après ne sont pas limités à un
analyte
particulier, la seule condition requise étant que l'analyte soit distribué
dans l'échantillon
à analyser en suspension ou en solution. En particulier, le processus
d'analyse mis en
aeuvre peut être effectué, sous forme homogène ou hétérogène ou mixte.
Un mode particulier, non limitatif d'un tel appareil, concerne l'analyse
biologique, d'un ou plusieurs ligands, nécessitant pour leur détection et/ou
leur
quantification l'utilisation d'un ou plusieurs anti-ligands. Par ligand, on
entend toute
espèce biologique comme par exemple, un antigène, un fragment d'antigène, un
2o peptide, un anticorps, un fragment d'anticorps, un haptène, un acide
nucléique, un
fragment d'acide nucléique, une hormone, une vitamine. Un exemple
d'application des
techniques d'analyse concerne les immunoessais, quelque soit leur format, par
analyse
directe ou par compétition. Un autre exemple d'application concerne la
détection et/ou
la quantification d'acides nucléiques comprenant l'ensemble des opérations
nécessaires
à cette détection et/ou cette quantification à partir d'un prélèvement
quelconque
contenant les acides nucléiques cibles. Parmi ces différentes opérations on
peut citer la
lyse, la fluidification, la concentration, les étapes d'amplification
enzymatique des
acides nucléiques, les étapes de détection incorporant une étape d'hybridation
utilisant
par exemple une puce à ADN ou une sonde marquée. La demande de brevet WO-A-
3o 97/02357 explicite différentes étapes nécessaires dans le cas d'analyse
d'acides
nucléiques.
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Les figures ci jointes sont données à titre d'exemple explicatif et n'ont
aucun
caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention.
La figure 1 représente une vue en élévation d'un premier mode de réalisation
de
5 la présente invention, avant la première centrifugation.
La figure 2 représente une vue en élévation d'un premier mode de réalisation
de
la présente invention, après la première centrifugation et avant la seconde
centrifugation.
La figure 3 représente une vue en élévation d'un premier mode de réalisation
de
lo la présente invention, après la seconde centrifugation.
La figure 4 représente une vue en élévation d'un deuxième mode de réalisation
de la présente invention.
Enfin, la figure 5 représente une vue en élévation d'un troisième mode de
réalisation de la présente invention.
La présente invention concerne un nouveau procédé de transfert d'un liquide 2
dans un appareil de transfert 1 constitué d'un corps 3. Comme on le remarque
sur les
figures, l'appareil 1 a la forme sensiblement d'un parallélépipède même si on
ne voit
que la face supérieure de cet appareil ou carte 1.
2o En terme de réalisation, cette carte est obtenue par usinage d'une matière
plastique technique comme par exemple le polystyrène choc référence R540E de
la
société GOODFELLOW, compatible avec les liquides traités. Dans un mode de
réalisation industriel, la carte pourrait être obtenu par moulage de
précision, mais toutes
autres méthodes de fabrication et notamment celles utilisées dans les
techniques de
semi-conducteur comme celles décrites dans la demande de brevet WO-A-97/02357
sont utilisables pour la fabrication de ladite carte.
Sur les figures 1 à 3, un premier mode de réalisation est représenté.
L'objectif de
ce procédé est de permettre le transfert de l'échantillon 2, contenu dans un
3o compartiment de départ 4, vers quatre compartiments d'arrivée référencés 6.
Cet
appareil 1 comporte donc un premier compartiment de départ 4 situé sur la
gauche de
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l'ensemble de ces figures. Il est possible de passer par un compartiment
intermédiaire 5
qui a une forme sensiblement de « haricot », ce compartiment intermédiaire S
étant
situé en position médiane, du point de vue du transit, entre le compartiment
de départ 4
et les compartiments d'arnvée 6 qui sont au nombre de quatre sur ces figures.
Néanmoins les compartiments 6 ne sont pas positionnés sur la droite de
l'ensemble des
figures, cette position étant occupée par le compartiment intermédiaire S. La
position
physique des compartiments sera développée plus loin en relation avec les
différentes
étapes du procédé de transfert.
Bien entendu, des canaux sont présents pour permettre le transfert de
lo compartiment à compartiment. Il y a tout d'abord un canal de transfert
primaire 9 qui
relie le compartiment de départ 4 au compartiment intermédiaire 5 et enfin,
des canaux
de transfert secondaire 10 qui relient le compartiment intermédiaire 5 avec
Ies
compartiments d'arrivée 6.
Sur le mode de réalisation des figures 1 à 3, il y a un canal de transfert
secondaire 10 pour chaque compartiment d'arrivée 6, l'ensemble canal 10,
compartiment 6 étant indépendant pour chaque compartiment d'arrivée 6.
On remarque que la disposition générale des compartiments est telle que le
compartiment de départ 4 est situé sur la gauche, que le compartiment
intermédiaire 5
2o est situé vers la droite et que les compartiments d'arrivée 6 sont situés
entre ces deux
compartiments 4 et 5. Le transfert n'est donc possible que si l'on réalise une
centrifugation multiple. C'est ce qui est bien expliqué sur l'ensemble de ces
figures 1 à
3.
Ainsi, sur la figure l, l'échantillon liquide 2 est présent uniquement au
niveau
du compartiment de départ 4. Dans cette position, l'échantillon liquide 2 est
en fait dans
sa position initiale soit parce qu'il vient d'être mise en place dans ce
compartiment 4,
soit parce qu'un canal de transfert indépendant l'a transporté jusqu'à ce
compartiment 4.
Un tel canal de transfert n'est pas représenté sur les figures.
Selon la figure 2, on effectue une première centrifugation selon C 1 autour de
l'axe primaire de centrifugation 7. Dans ce cas, le liquide 2 va selon la
flèche F1 être
transporté dans le compartiment intermédiaire 5 via le canal de transfert
primaire 9.
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Comme cela est bien représenté sur cette figure, le liquide 2 se trouve dans
la position
la plus éloignée possible de l'axe 7 au niveau de ce compartiment
intermédiaire 5.
Selon la figure 3, on effectue une deuxième centrifugation selon C2 au niveau
d'un axe secondaire de centrifugation 8. Lorsque l'on fait tourner l'ensemble
de
l'appareil 1, selon C2, il est aisé de comprendre que le liquide 2 va alors
être transféré
dans les compartiments d'arrivée 6 via les canaux de transfert secondaire 10.
Ce
mouvement s'effectue selon F2 de la figure 3. Là encore, les échantillons
liquides 2 qui
se sont répartis dans les compartiments d'arrivée 6 sont situés dans une
position la plus
éloignée possible par rapport à l'axe de centrifugation 8.
1 o Afin que l' échantillon liquide 2, qui est présent au niveau du
compartiment
intermédiaire 5, ne revienne pas vers le compartiment de départ 4, la forme du
compartiment intermédiaire est tout à fait particulière au niveau du point
d'implantation
des canaux de transfert secondaire 10. Ainsi, comme il a été indiqué
précédemment, le
compartiment intermédiaire 5 a une forme sensiblement de « haricot » de sorte
qu'il
existe deux lobes sur un des côtés dudit compartiment 5. Ces deux lobes
encadrent le
point d'intersection du compartiment intermédiaire 5 avec le canal 9. Chaque
lobe est
associé à deux canaux 10, la forme du compartiment 5 facilitant alors
l'orientation et le
transfert du liquide lors de la seconde centrifugation selon C2 vers les
compartiments
d'arrivée 6 en empêchant, ou du moins en minimisant, le passage du liquide
dans le
2o canal 9. Bien entendu une vanne, non représentée sur la figure, peut être
positionnée sur
le canal 9 pour bloquer si nécessaire le retour de liquide. Pour minimiser, ce
retour de
liquide dans le canal 9, le volume de liquide contenu dans le lobe inférieur
du
compartiment 5 doit être supérieur au volume de liquide que l'on souhaite
déplacer
dans les deux compartiments 6 positionnés en dessous du canal 9 sur les
figures 1 à 3.
Le volume du lobe du compartiment 5 est bien délimité d'un coté par une demi-
droite
perpendiculaire au canal 9 et positionnée à l'extrémité de ce canal 9 et de
l'autre coté
par l'intersection entre les canaux 10 et ce même compartiment 5. La même
règle
s'applique pour le lobe supérieur. Préférentiellement, pour éviter une
communication
fluidique entre les deux compartiments 6, le volume du lobe doit aussi être
inférieur au
3o volume total des deux compartiments 6 et des deux canaux 10 associés audits
compartiments. Dans un mode de réalisation, les deux lobes ont le même volume.
Dans
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un autre mode de réalisation les deux lobes ont des volumes différents. Dans
un mode
de réalisation, les volumes des compartiments d'arrivée sont identiques. La
forme et les
dimensions des canaux 10 sont choisies par l'homme du métier pour réaliser une
répartition homogène du liquide dans les différents compartiments d'arrivée.
Dans un
autre mode de réalisation, les volumes des compartiments d'arrivée sont
différents
Le volume total de liquide transférable par ce dispositif peut varier de 0,5 à
5000 microlitres, avantageusement de 2 à 2000 microlitres et
préférentiellement de 5 à
1000 microlitres. Le volume du compartiment de départ varie dans les mêmes
proportions ou peut être sensiblement plus important que le volume total à
transférer.
l0 A titre d'exemple, dans le mode de réalisation des figures 1 à 3, le
compartiment
4 a un volume compris entre 0,1 et 0,5 ml pour un transfert de liquide de 100
microlitres vers le compartiment intermédiaire 5 d'un volume sensiblement
équivalent
à celui du compartiment 4. Lors de la deuxième centrifugation selon l'axe C2,
25
microlitres sont répartis dans chaque compartiment d'arrivée 6 avec une
précision
inférieure à S%
Bien entendu, ces formes ainsi que le nombre de canaux et de compartiments ne
sont absolument pas limitatifs et il est tout à fait envisageable d'avoir
d'autres
configurations de carte 1 ainsi qu'un nombre différent de compartiments et de
canaux.
C'est ce qui est représenté par exemple sur la figure 4 où la carte 11 a une
forme
sensiblement carré en vue de dessus.
Il y a alors un compartiment de départ 14 présent au centre du corps 13, ce
compartiment 14 étant relié via quatre canaux de transfert primaire 19 à
quatre
compartiments intermédiaires 15. Pour faciliter le fonctionnement des
centrifugations et
la répartition des liquides en fonction du choix de l'utilisateur, les quatre
compartiments intermédiaires sont situés de façon symétrique les uns par
rapport aux
autres.
On remarque également qu'il y a comme précédemment un axe primaire de
centrifugation 17, un axe secondaire de centrifugation 18 mais également deux
autres
axes de centrifugation 12. L'ensemble de ces axes a une position bien
particulière.
Ainsi, si l'on prend le centre du compartiment de départ 14, et que l'on trace
une demi
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droite depuis ce centre vers chaque centre de gravité des compartiments
intermédiaires
15, chaque axe de centrifugation 17, 18 ou 12 est placé sur cette demi droite
dans une
position située entre le compartiment intermédiaire 15 et le bord de la carte
ou appareil
de transfert 11.
De même, il existe également des compartiments d'arrivée 16 qui sont reliés au
compartiment intermédiaire 15 par des canaux de transfert secondaire 20. On
remarque
immédiatement que ces canaux de transfert secondaires 20 ont un point
d'intersection
avec le compartiment intermédiaire 15, par lequel on peut faire passer une
droite
passant par le centre de gravité du compartiment intermédiaire 15. Cette
droite est en
l0 fait sensiblement perpendiculaire par rapport à la demi droite allant du
centre de gravité
du compartiment de départ 14 au centre de gravité du compartiment
intermédiaire 15.
On peut maintenant aisément comprendre qu'à partir d'un échantillon liquide
situé au
centre, c'est-à-dire au niveau du compartiment de départ 14, il est possible
de choisir le
compartiment intermédiaire où l'on veut transférer tout ou partie du liquide
2, non
représenté sur la figure 4. Ainsi, si l'on fait tourner l'appareil 11 selon
l'axe de
centrifugation 17, le liquide 2 sera transféré vers le compartiment
intermédiaire 15 situé
à gauche de la figure 4. Une fois que le liquide 2 sera en position, il sera
possible de
faire une centrifugation soit selon l'axe de centrifugation 18 afin de
transférer ledit
liquide 2 depuis le compartiment intermédiaire 15 vers le compartiment
d'arrivée 16
2o situé en position supérieure. Si par contre on souhaite transférer le
liquide vers le
compartiment d'arrivée 16 inférieur, il sera alors nécessaire de créer une
centrifugation
par rapport à l'axe de centrifugation 12 situé en position supérieure. Il est
également
tout à fait envisageable de vouloir transférer de nouveau le liquide 2 vers le
compartiment de départ 14, voire même vers le compartiment intermédiaire 15
situé à
droite. Dans ce cas, il faudra faire une centrifugation selon l'axe 12 situé
sur la gauche
de la figure. On comprend donc aisément la polyvalence d'un tel système et le
nombre
très important de possibilités de déplacement au sein d'une même carte.
Selon la figure 5, un troisième et dernier mode de réalisation d'un appareil
21
3o est représenté. Il est sensiblement identique à celui de la figure 4, mais
on remarque
qu'il y a une autre possibilité de centrifugation une fois que le liquide est
arrivé au
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niveau d'un des compartiments d'arrivée 26. Ainsi, chaque compartiment
d'arrivée 26
est associé à deux canaux de transfert terminaux 32 qui le relie vers deux
compartiments terminaux 31. Pour obtenir un liquide 2 présent dans le
compartiment
terminal 31 repéré sur la figure 5, il sera nécessaire de déposer
l'échantillon dans le
5 compartiment de départ 24 situé au centre du corps 23 de l'appareil 21, puis
d'effectuer
une centrifugation selon 27 afin de transférer l'échantillon 2 vers le
compartiment
intermédiaire 25 situé à gauche de cette figure puis d'effectuer une
centrifugation selon
28 afm de transférer ledit échantillon depuis le compartiment intermédiaire 25
vers le
compartiment d'arrivée 26 et enfin, de continuer à effectuer une
centrifugation selon 28
l0 afin de permettre le transfert du liquide 2 dans ce compartiment terminal
31.
Bien entendu, au niveau de chaque canal, il est envisageable d'utiliser des
moyens d'arrêt du liquide afin de mieux contrôler le mouvement des liquides 2
qui
peuvent être introduits. Ainsi, il est possible de jouer sur la capillarité de
ces canaux,
mais il est également possible d'installer à leur niveau des vannes qui
peuvent
permettre de bloquer ou non ledit canal concerné. De telles vannes sont bien
décrites
dans la demande de brevet déposée par la demanderesse le 9 septembre 1998 sous
le
numéro FR98/11383, et intitulée « Dispositif permettant des réactions, système
de
transfert entre dispositifs et procédé de mise en oeuvre d'un tel système ».
2o De même, et bien que cela n'apparaisse pas sur les figures 1 à 4, des
entrées
et/ou des sorties de fluide équipent l'appareil décrit dans la présente
invention afin d'en
assurer le bon fonctionnement.
Afin que les centrifugations soient efficaces, il n'est pas nécessaire
qu'elles
soient trop rapides. Un centrifugation comprise entre 2 et 10 g (symbole de
l'accélération de la pesanteur), et préférentiellement entre 3 et 5 g, est
tout à fait
suffisante pour les liquides biologiques non visqueux. Pour des liquides
visqueux, une
force comprise entre 10 et 200 g est applicable.
Pour rendre les centrifugations les plus efficaces possibles, il est possible
3o d'avoir autant d'axes de centrifugation que de canaux de transfert entre
deux
compartiments adjacents entre lesquels on veut transférer un liquide. Ainsi,
sur les
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figures 4 et 5, il y a que quatre axes 27, 28 et 22. Il serait également
possible d'en
envisager au niveau des angles de chaque appareil 11 ou 21 et ce, afin de
faciliter le
transfert vers les compartiments d'arrivée 16 ou 26, voire vers les
compartiments
terminaux 31. De plus, et toujours pour améliorer l'efficacité de ces
centrifugation, ces
canaux sont préférentiellement rectilignes.
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REFERENCES
1. Appareil de transfert selon un premier mode de réalisation
2. Fluide ou liquide
s 3. Corps
4. Compartiment de départ
5. Compartiment intermédiaire
6. Compartiment d'arrivée
7. Axe primaire de centrifugation
l0 8. Axe secondaire de centrifugation
9. Canal de transfert primaire
10. Canal de transfert secondaire
11. Appareil de transfert selon un deuxième mode de réalisation
12. Autres axes de centrifugation
15 13. Corps
14. Compartiment de départ
1 S. Compartiment intermédiaire
16. Compartiment d'arrivée
17. Axe primaire de centrifugation
20 18. Axe secondaire de centrifugation
19. Canal de transfert primaire
20. Canal de transfert secondaire
21. Appareil de transfert
22. Autres axes de centrifugation
2s 23. Corps
24. Compartiment de départ
25. Compartiment intermédiaire
26. Compartiment d'arrivée
27. Axe primaire de centrifugation
30 28. Axe secondaire de centrifugation
29. Canal de transfert primaire
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30. Canal de transfert secondaire
31. Compartiment terminal
32. Canal de transfert terminal
C1. Mouvement de rotation de l'appareil 1 entraînant la première
centrifugation
C2. Mouvement de rotation de l'appareil 1 entraînant la seconde centrifugation
F1. Déplacement du liquide 2 sous l'action de la première centrifugation
F2. Déplacement du liquide 2 sous l'action de la seconde centrifugation
