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PROCEDE DE MULTIPLICATION DE CELLULES SOUCHES
La présente invention a pour objet un procédé de multiplication de cellules
souches. L'invention a notamment pour objet un procédé permettant à la fois de
multiplier rapidement lesdites cellules souches et de les maintenir dans un
état
indifférencié.
Les cultures actuelles qui permettent le maintien des cellules souches dans un
état
indifférencié, et notamment des cellules souches hématopoïétiques, et/ou les
multipliant, sont des cultures à long terme dans lesquelles les cellules se
divisent très
1o lentement. Plus particulièrement, les cultures permettant par exemple un
autorenouvellement (une multiplication à l'identique) de cellules souches,
notamment de
cellules souches hématopoïétiques, sont uniquement des cultures sur stroma
médullaire,
ou des cultures à multiplication lente, en l'absence de stroma médullaire.
S'agissant plus particulièrement des cultures à long terme sur stroma
médullaire,
on peut citer les cultures de type Dexter, dans lesquelles les cellules
souches,
notamment les cellules souches hématopoïétiques, se développent sur un stroma
médullaire, ce qui permet de n'utiliser que peu de cytokines mais entraîne une
division
lente des cellules (et donc une multiplication lente des cellules) en présence
d'un
mélange de progéniteurs avec des cellules matures hématopoïétiques et
stromales.
De plus, contrairement à ce qui se passe chez la souris, il n'y a pas de
maintien à
long terme chez l'homme de cellules souches sur stroma.
S'agissant des cultures à long terme, en l'absence de stroma médullaire, on
peut
mentionner le système de culture de Piacibello. Dans ce système de culture
(Piacibello
et al. 1997 Blood), les cellules CD34+ contenant des cellules souches
hématopoiétiques
sont ensemencées à 20000 cellules par ml, et chaque semaine la moitié de la
culture est
prélevée et remplacée par du milieu frais. Après deux semaines, le nombre de
cellules
double à un rythme de une fois par semaine, sur plusieurs mois. Pendant les
deux
premières semaines de la culture de Piacibello, il y a une forte perte des
cellules CD34+
qui se stabilisent à moins de 2%.
3o Ainsi, les cultures actuelles sont peu compatibles avec une production à
des fins
cliniques ou biotechnologiques de cellules souches maintenant leur caractère
indifférencié et multipotent.
Par ailleurs, à ce jour on ne connaît pas d'inhibiteur de la différenciation
de
cellules souches permettant un autorenouvellement continu satisfaisant.
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L'un des principaux buts de l'invention est de proposer un procédé de culture
de
cellules souches permettant d'obtenir, rapidement et en quantité importante,
des cellules
souches humaines dans un état indifférencié.
L'un des buts de l'invention est de proposer un procédé rapide de culture de
cellules souches, sans stroma médullaire, et permettant de réduire les volumes
de
culture.
L'un des autres buts de l'invention est d'utiliser les cellules souches ainsi
obtenues pour reconstituer des tissus et des organes à transplanter.
L'invention a pour objet l'utilisation d'un inhibiteur du développement
cellulaire
1o de façon contrôlée pour maintenir l'état indifférencié de cellules souches,
notamment de
cellules souches humaines, tout en permettant leur division cellulaire.
La présente invention découle de la découverte faite par les Inventeurs que,
dans
certaines conditions, un inhibiteur du développement cellulaire peut être
également un
inhibiteur de la différenciation cellulaire de cellules souches. A ce titre,
le TGF-[3
(« transforming growth factor » (facteur de croissance transformant)),
préalablement
connu comme un inhibiteur du développement cellulaire de cellules souches, et
notamment de cellules souches hématopoiétiques ou progéniteurs primitifs
hématopoiétiques se révèle être, selon l'invention, un inhibiteur de la
différenciation
cellulaire.
2o L'expression « inhibiteur du développement cellulaire » englobe à la fois
toute
substance inhibant la prolifération cellulaire et/ou la croissance cellulaire,
et/ou la
différenciation cellulaire.
L'expression « inhibiteur de la prolifération cellulaire » signifie également
inhibiteur de la division cellulaire, ou inhibiteur du cycle cellulaire.
L'expression « utilisation d'un inhibiteur du développement cellulaire de
façon
contrôlée » signifie que l'inhibiteur du développement cellulaire est utilisé
de façon
modulable afin de permettre
(a) la division cellulaire des cellules souches lorsque celle-ci est
souhaitée, tout en
maintenant l'état indifférencié desdites cellules souches au cours ou à la fin
de la
3o division cellulaire, ou,
(b) l'inhibition du développement cellulaire des cellules souches lorsque
celui-ci
est nécessaire pour inhiber la différenciation cellulaire desdites cellules
souches.
L'expression « utilisation d'un inhibiteur du développement cellulaire de
façon
contrôlée » signifie, en d'autres termes, que l'inhibiteur du développement
cellulaire
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peut être utilisé dans des conditions telles que les cellules souches sont
sorties de leur
état de repos afin de se diviser, dans des conditions contrôlées empêchant la
différenciation.
L'expression « cellules souches » signifie cellules immatures, ou bien
cellules non
différenciées (ou indifférenciées), ou bien cellules primitives, ou bien
cellules
pluripotentes ou cellules multipotentes.
Les cellules souches avantageusement utilisées selon l'invention sont des
cellules
souches humaines choisies dans le groupe constitué par les cellules souches
embryonnaires à l'origine des cellules souches somatiques, et/ou les cellules
1o souches/progéniteurs somatiques élles/eux mêmes à l'origine du sang et/ou
de différents
tissus solides tels que la peau, le foie, le pancréas, le coeur, le rein,
l'os, ou du tissu
nerveux.
L'expression « cellules souches embryonnaires à l'origine des cellules souches
somatiques » est définie par exemple comme une cellule pouvant donner
naissance à
l'une quelconque des cellules souches somatiques.
L'expression « cellules souches somatiques » est définie par exemple comme une
cellule pouvant donner naissance à un tissu spécifique.
Les cellules souches selon l'invention sont notamment les cellules souches
somatiques humaines hématopoïétiques, encore appelées progéniteurs primitifs
hématopoïétiques.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'inhibiteur du développement
cellulaire
utilisé avantageusement selon l'invention est choisi dans le groupe constitué
par les
produits de gènes contrôlant le développement cellulaire vis-à-vis de la
différenciation
cellulaire et/ou de la division cellulaire, les inhibiteurs des kinases
cyclines
dépendantes, les facteurs contrôlant l'apoptose ou le vieillissement, et les
cytokines (tels
que les interférons, le TGF-(3). Par le terme "cytokines", on désigne tous les
facteurs de
croissance, même si ces facteurs peuvent agir également comme des inhibiteurs
de la
croissance dans certaines conditions.
Comme produits de gènes contrôlant le développement cellulaire vis-à-vis de la
3o différenciation cellulaire et/ou de la division cellulaire, on peut
notamment citer les
facteurs de croissance, les cytokines, le produit de gènes contrôlant la
différenciation, le
vieillissement ou fapoptose.
Comme inhibiteurs des kinases cyclines dépendantes on peut notamment citer le
gène du rétinoblastome, les gènes P 15, P 16, P21, P27.
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Le gène du rétinoblastome est un gène suppresseur de tumeur (anti-oncogène).
Les gènes P15, P16, P21, P27 inhibent le cycle cellulaire.
Comme facteur contrôlant l'apoptose, on peut notamment citer les gènes bcl-2,
bar, fas.
Comme facteur contrôlant le vieillissement, on peut notamment citer la
télomerase.
Comme cytokines pouvant être des inhibiteurs du développement cellulaire, on
peut notamment citer les interférons et en particulier le TGF-Vii.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet
l'utilisation
1o d'un inhibiteur du développement cellulaire tel que défini ci-dessus, en
association
séquentielle avec un anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire, pour
déclencher un
nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100, notamment de 1 à
environ 10,
et notamment pour déclencher une seule division cellulaire, tout en maintenant
l'état
indifférencié des cellules souches, notamment des cellules souches humaines.
L'expression « association séquentielle » signifie que l'ami-inhibiteur de la
prolifération cellulaire n'est pas utilisé de façon simultanée avec
l'inhibiteur du
développement cellulaire.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet un procédé
de
multiplication de cellules souches dans un milieu de culture, notamment de
cellules
2o souches humaines, caractérisé en ce qu'il comprend
- une étape dans laquelle les cellules souches, notamment les cellules souches
humaines, à l'état de repos sont sorties de leur état de repos par la
neutralisation de
l'effet d'un inhibiteur du développement cellulaire, et notamment d'un
inhibiteur de la
prolifération cellulaire, produit par les cellules et/ou présent dans le
milieu de culture,
de telle sorte qu'il y ait déclenchement d'un nombre de divisions cellulaires
allant de 1 à
environ 100, notamment de 1 à environ 10, et notamment d'une seule division
cellulaire,
- et, une étape dans laquelle les cellules souches, notamment les cellules
souches
humaines, obtenues à l'étape précédente sont inhibées dans leur
différenciation, à l'aide
d'un inhibiteur du développement cellulaire.
L'invention a également pour objet un procédé de multiplication de cellules
souches dans un milieu de culture, notamment de cellules souches humaines,
caractérisé
en ce qu'il comprend
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- une étape selon laquelle les cellules souches, notamment les cellules
souches
humaines, à l'état de division sont empêchées d'entrer dans un état de
différenciation, à
l'aide d'un inhibiteur du développement cellulaire,
- et, une étape selon laquelle les cellules souches, notamment les cellules
souches
humaines, obtenues à l'étape précédente sont remises dans leur état de
division, par la
neutralisation de l'effet d'un inhibiteur du développement cellulaire, et
notamment d'un
inhibiteur de la prolifération cellulaire, de telle sorte qu'il y ait
déclenchement d'un
nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100, notamment de 1 à
environ 10,
et notamment d'une seule division cellulaire.
1o Le procédé de multiplication selon l'invention est caractérisé en ce que,
au cours
et à l'issue dudit procédé, les cellules souches ainsi multipliées sont
maintenues dans un
état indifférencié.
Selon l'invention, l'expression « cellules souches multipliées » a la même
signification que l'expression « cellules souches amplifiées ». De même
l'expression
. « procédé de multiplication » a la même signification que l' expression «
procédé
d'amplification ».
L'état de repos des cellules signifie que les cellules ne se différencient pas
et ne se
divisent pas.
Selon un mode de réalisation avantageux, les cellules souches multipliées
selon le
2o procédé de multiplication de l'invention, sont des cellules souches
humaines choisies
dans le groupe constitué par les cellules souches embryonnaires à l'origine
des cellules
souches somatiques, et les cellules somatiques elles-mêmes à l'origine du sang
et/ou des
différents tissus solides tels que la peau, le foie, le pancréas, le cceur, le
rein, l'os, ou du
tissu nerveux.
Le procédé de multiplication selon l'invention est caractérisé en ce que les
cellules souches, notamment les cellules humaines, sont présentes à une
concentration
cellulaire d'environ 1 à environ 101° cellules par ml, et notamment à
une concentration
allant d'environ 103 à environ 101° cellules par ml, et plus
particulièrement d'environ
104 à environ 109 cellules par ml.
3o Il faut noter que la présente invention s'applique aussi bien aux cellules
humaines
qu'aux cellules animales.
Dans le procédé de multiplication de l'invention, l'inhibiteur du
développement
cellulaire est synthétisé par les cellules souches, notamment les cellules
souches
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humaines, et/ou est ajouté dans le milieu de culture contenant les cellules
souches,
notamment les cellules souches humaines.
Ledit inhibiteur du développement cellulaire est synthétisé par les cellules
souches
et/ou est ajouté dans le milieu de culture
(a) avant la première division cellulaire, et
(b) au cours ou à la fin d'un cycle de division (lorsque lesdites cellules se
trouvent
préalablement en état de division).
Lorsque l'inhibiteur du développement cellulaire est synthétisé par les
cellules
souches, il peut être sécrété ou non.
1o La quantité d'inhibiteur du développement cellulaire synthétisée par les
cellules
souches, ou ajoutée dans le milieu de culture, doit être suffisante de façon à
ce que
lesdites cellules (a) soient maintenues dans leur état de repos avant la
première division
cellulaire, et (b) soient placées à l'état de repos lorsqu'elles se trouvaient
préalablement
en état de division.
La quantité d'inhibiteur du développement cellulaire synthétisée par les
cellules
souches peut varier de 0,01 pg à 1 mg/ml dans le milieu de culture, et
notamment de 0,1
pg à 10 ng/ml.
La quantité d'inhibiteur du développement cellulaire ajoutée dans le milieu de
culture peut varier de 0,1 pg à 1 mg/ml dans le milieu de culture, et
notamment de 1 pg
2o à 10 ng/ml.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de multiplication selon
l'invention est caractérisé en ce que l'inhibiteur du développement cellulaire
est choisi
dans le groupe constitué par les produits de gènes contrôlant le développement
cellulaire vis-à-vis de la différenciation cellulaire et/ou de la division
cellulaire, les
inhibiteurs des kinases cyclines dépendantes, les facteurs contrôlant
l'apoptose ou le
vieillissement, et les cytokines (tels que les interférons, le TGF(3).
Les produits de gènes contrôlant le développement cellulaire vis-à-vis de la
différenciation cellulaire et/ou de la division cellulaire, les inhibiteurs
des kinases
cyclines dépendantes, les facteurs contrôlant l'apoptose ou le vieillissement,
ainsi que
les cytokines sont notamment ceux décrits ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'inhibiteur du développement
cellulaire
est présent à une faible concentration dans le milieu de culture contenant les
cellules
souches, et notamment à une concentration allant d'environ 101° mg/ml à
1 mg/ml.
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Le procédé de multiplication selon l'invention est caractérisé en ce que la
neutralisation de l'effet de l'inhibiteur du développement cellulaire, et
notamment de
l'inhibiteur de la prolifération cellulaire, présent dans le milieu de
culture, est effectuée
par
- l'addition dans le milieu de culture d'un anti-inhibiteur de la
prolifération
cellulaire, et/ou
- le retrait du milieu de culture de l'inhibiteur du développement cellulaire,
et
notamment de l'inhibiteur de la prolifération cellulaire.
La neutralisation de l'effet de l'inhibiteur du développement cellulaire
permet aux
1o cellules souches de sortir de leur état de repos et de déclencher au moins
une division.
De préférence, lorsque l'inhibiteur du développement cellulaire est synthétisé
sans
être secrété par les cellules souches, l'effet dudit inhibiteur est neutralisé
par addition
dans le milieu de culture d'un anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire,
qui peut
pénétrer dans la cellule, tel qu'un oligonucléotide antisens.
Cependant, lorsque l'inhibiteur du développement cellulaire est secrété par
les
cellules souches, ou lorsque ledit inhibiteur est ajouté dans le milieu de
culture, l'effet
dudit inhibiteur est neutralisé soit par addition dans le milieu de culture
d'un anti-
inhibiteur de la prolifération cellulaire, soit par retrait du milieu de
culture de
l'inhibiteur du développement cellulaire.
2o Le retrait de l'inhibiteur du développement cellulaire du milieu de culture
peut
notamment être effectué à l'aide d'anticorps bloquants ou par lavage afm de
neutraliser
ledit inhibiteur.
La quantité d'inhibiteur du développement cellulaire retirée du milieu de
culture
contenant les cellules souches doit être suffisante de telle sorte qu'il y ait
déclenchement
d'un nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100, notamment de 1
à
environ 10, et notamment d'une seule division cellulaire.
La quantité d'inhibiteur du développement cellulaire retirée du milieu de
culture
varie de 0,01 pg à 1 ng/ml, et notamment de 0,1 pg à 10 ng/ml.
L'inhibiteur du développement cellulaire retiré du milieu de culture
appartient
notamment au groupe des cytokines, des oligonucléotides antisens bloquant
l'expression
de gènes du développement.
La quantité d'ami-inhibiteur de la prolifération cellulaire ajoutée dans le
milieu de
culture contenant les cellules souches doit être suffisante de telle sorte
qu'il y ait
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déclenchement d'un nombre de divisions cellulaires allant de 1 à environ 100,
notamment de 1 à environ 10, et notamment d'une seule division cellulaire.
La quantité d'ami-inhibiteur de la prolifération cellulaire ajoutée dans le
milieu de
culture varie de 0,1 p,g à 10 mg/ml pour les anticorps bloquants ou de 0,01
p,M à 1 mM
d'oligonucléotide antisens dans le milieu de culture, et notamment de 1 p,g à
100 p,g/ml
pour les anticorps bloquants ou de 0,1 q,M à 100 q,M d'oligonucléotides
antisens.
L'anti-inhibiteur de la prolifération cellulaire est choisi dans le groupe
constitué
par des oligonucléotides antisens ou des anticorps bloquants et notamment par
l'anti-
TGF-(3.
1o Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de multiplication selon
l'invention est caractérisé en ce que l'ami-inhibiteur de la prolifération
cellulaire est
présent en une concentration allant d'environ 10-18 à environ 10-3 g/ml,
notamment 0,1 à
20 q g/ml, et notamment 4.10-6 g/ml (4 q,g/ml).
Le procédé de multiplication selon l'invention des cellules souches, notamment
des cellules souches humaines, est caractérisé en ce qu'il comporte, afin
d'obtenir un
nombre suffisant de cellules souches maintenues à l'état indifférencié, un
nombre total
de cycles de divisions (ou d'états de division) compris entre 1 à 100 cycles,
notamment
entre 5 à 20 cycles, et notamment 10 cycles.
Selon un mode de réalisation avantageux, la durée totale de l'ensemble des
états
2o de repos du procédé de multiplication selon l'invention varie de 1 heure à
3 ans,
notamment de 20 heures à 200 heures, et la durée totale de l'ensemble des
cycles de
division du procédé de multiplication selon l'invention varie de 10 heures à 3
ans et
notamment de 20 heures à 200 heures.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de multiplication selon
l'invention est caractérisé en ce que la durée d'un seul état de repos
s'échelonne
d' environ 1 heure à 3 ans, et est notamment d' environ 6 heures à 72 heures,
et en ce que
la durée d'un seul cycle de division s'échelonne d'environ 6 heures à 3 ans,
et est
notamment d'environ 6 heures à 24 heures.
La durée totale du procédé de multiplication selon l'invention comprenant
l'ensemble des états de repos et de division s'échelonne de 1 jour à 3 ans, et
est
notamment de 1 j our à 15 j ours.
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Selon un mode de réalisation avantageux, l'ensemble des cycles de repos et de
division d'un procédé de multiplication dure de 1 à 15 jours, et les
applications
envisagées sont la thérapie cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation, l'ensemble des cycles de repos et de
division
d'un procédé de multiplication dure de 1 jour à 3 ans, et les applications
envisagées sont
d'ordre expérimental.
Un procédé qui dure 3 ans permet par exemple des expériences de longue durée
pour étudier la sénescence.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé de multiplication des
cellules
souches selon l'invention, et notamment des cellules souches somatiques
humaines,
permet d'obtenir une amplification des cellules souches d'un facteur compris
d'environ
2 à environ 1012, et notamment d'environ 2 à environ 104.
Ainsi, le procédé de multiplication selon l'invention permet d'obtenir un
nombre
de cellules souches amplifiées et maintenues à l'état indifférencié, de 2 à
1012 fois plus
important que le nombre initial de cellules souches non différenciées.
Selon un mode de réalisation avantageux, le milieu de culture du procédé de
multiplication selon l'invention, contient des cellules souches
hématopoiétiques et
comprend une ou plusieurs cytokines (ajoutées dans le milieu de culture)
choisies dans
le groupe constitué par les interleukines et les CSF, lesdites cytokines étant
présentes à
2o une concentration allant d'environ 10-g ~,g/ml à environ 1 mg/ml, et
notamment
d'environ 10-5 ~g/ml à 0,1 ~g/ml, et éventuellement d'autres facteurs de
croissance.
Comme cytokines pouvant être ajoutées dans le milieu de culture, on citera
notamment les interleukines telles que fIL 1 à fIL 16, les CSF (« colony-
stimulating
factor » (facteurs stimulant les colonies)) tels que le GM-CSF (facteur
stimulant les
colonies granulocytaires et monocytaires), GCSF (facteur stimulant les
colonies
granulocytaires), MCSF (facteur stimulant les colonies monocytaires), SF
(Steel factor),
la TPO (thrombopoïétine) ou le FL (Flt-3 ligand).
Des facteurs de croissance autres que les interleukines et les CSF peuvent
être
utilisés.
Le procédé de multiplication selon l'invention des cellules souches, et
notamment
des cellules souches somatiques humaines, est plus particulièrement
caractérisé en ce
qu'il comprend les étapes suivantes
a) l'initiation d'un premier cycle de division de cellules souches
embryonnaires
ou somatiques non différenciées dans un milieu de culture, et notamment de
cellules
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souches somatiques hématopoïétiques, par ensemencement desdites cellules
souches
non différenciées à l'état de repos, à une forte concentration cellulaire
initiale,
notamment à une concentration allant de 103 à 101° cellules par ml, en
présence d'une
ou de plusieurs cytokines, et par la neutralisation de l'effet de l'inhibiteur
du
5 développement cellulaire, et notamment de l'inhibiteur de la prolifération
cellulaire,
présent dans le milieu de culture, de telle sorte que les susdites cellules
sortent de leur
état de repos par le déclenchement d'une première division cellulaire,
b) le retour au repos des cellules souches embryonnaires ou somatiques non
différenciées obtenues à l'étape précédente, à l'aide d'un inhibiteur du
développement
l0 cellulaire, ledit inhibiteur étant synthétisé par lesdites cellules
souches, ou étant ajouté
dans le milieu de culture,
c) le lavage éventuel des cellules souches embryonnaires ou somatiques non
différenciées obtenues à l'étape précédente, afin d'éliminer les catabolites
et l'inhibiteur
du développement cellulaire, et notamment l'inhibiteur de la prolifération
cellulaire
éventuellement présents dans le milieu de culture,
d) la dilution éventuelle des cellules souches embryonnaires ou somatiques non
différenciées obtenues à l'étape précédente afin de maintenir une
concentration
cellulaire optimale allant d'environ 100 à 101° cellules par ml,
e) la répétition successive des cycles de division et de repos décrits ci-
dessus
2o jusqu'à ce que le facteur d'amplification des cellules soit suffisant pour
obtenir le
nombre de cellules souches souhaitées, et notamment soit de 2 fois à environ
1012 fois le
nombre de cellules souches embryonnaires ou somatiques non différenciées
initiales, ce
qui correspond à une durée totale du procédé de multiplication d'environ 1
jour à 3 ans,
et notamment de 1 j our à 15 j ours,
f) l'arrêt de la multiplication des cellules souches embryonnaires ou
somatiques
non différenciées pour les stocker, les utiliser ou les faire se différencier
ira vitro.
Les modalités des différentes étapes du procédé de multiplication des cellules
souches selon l'invention sont celles déjà décrites ci-dessus.
Ainsi, la quantité d'ami-inhibiteur de la prolifération cellulaire ajoutée
dans le
milieu de culture, ou la quantité d'inhibiteur du développement cellulaire
retirée du
milieu de culture contenant les cellules souches, doit être suffisante afin
qu'il y ait
déclenchement d'une première division cellulaire.
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Selon un mode de réalisation préféré, l'inhibiteur du développement cellulaire
est
le TGF-(3 ; le TGF-(3 est synthétisé par les cellules souches somatiques
hématopoiétiques elles-mêmes en une quantité allant de 0,01 pg à 1 ng/ml.
Le TGF-(3 est ensuite neutralisé par l'ajout dans le milieu de culture d'un
anti-
inhibiteur de la prolifération cellulaire : l'ami-TGF-~3. L'anti-TGF-(3 est
ajouté en une
quantité allant de 0,1 p.g à 100 p.g/ml d'anticorps ou 0,1 pM à 10 ~M
d'oligonucléotides.
Le retour au repos des cellules souches somatiques hématopoiétiques, notamment
décrit dans l'étape b) ci-dessus, est obtenu par le TGF-(3 synthétisé par
lesdites cellules
souches elles-mêmes (ou d'autres inhibiteurs ajoutés).
1o L'étape de lavage D décrite ci-dessus permet notamment de neutraliser
l'inhibiteur TGF-(3 formé au cours ou à la fin d'un cycle de division
précédent afin de
permettre la division suivante.
L'étape de dilution (d) décrite ci-dessus, maintenant une concentration
cellulaire
optimale permet à la fois
- le retour rapide à l'état de repos des cellules souches, dû à une synthèse
rapide
desdites cellules de l'inhibiteur du développement cellulaire, notamment du
TGF-(3,
- une division non moins rapide des cellules souches après chaque état de
repos,
en présence d'ami-inhibiteur de la prolifération cellulaire, notamment d'ami-
TGF-[3.
Le TGF-(3 ralentit le processus de différenciation des cellules souches tout
au long
2o du procédé de multiplication, à savoir au cours et à la fin des différents
cycles de repos
et de division.
L'étape d'arrêt f) décrite ci-dessus peut être effectuée en lavant lesdites
cellules
souches ainsi multipliées, en les congelant, ou en les mettant dans un milieu
de
différenciation.
Le milieu de différenciation dans lequel sont mises les cellules souches ainsi
multipliées et maintenues dans un état indifférencié selon le procédé de la
présente
invention, est choisi en fonction du tissu ou de l'organe que l'on cherche à
reconstituer.
Par exemple, si fon veut obtenir des cellules érythroïdes, on utilisera un
milieu de
culture contenant de férythropoiétine (EPO).
Le procédé de multiplication selon l'invention permet d'obtenir des
productions
importantes de cellules souches, lesdites cellules souches étant maintenues
dans un état
indifférencié au cours des différents cycles de repos et de division dudit
procédé. On
obtient ainsi des productions importantes de cellules immatures sous un volume
réduit.
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La présente invention a pour objet l'utilisation des cellules souches humaines
non
différenciées et amplifiées telles qu'obtenues selon le procédé de l'invention
décrit ci-
dessus, pour reconstituer du sang humain et/ou des tissus solides ou organes
humains.
Ainsi, les cellules souches humaines non différenciées et amplifiées telles
qu'obtenues selon le procédé de l'invention, peuvent notamment être utilisées
pour
amplifier des prélèvements insuffisants de sang de cordon ombilical, de moëlle
osseuse
ou de sang périphérique, ou pour la transplantation de cellules souches
hématopoïétiques.
Les cellules souches humaines non différenciées et amplifiées telles
qu'obtenues
1o selon le procédé de l'invention, peuvent également servir pour des études
sur le génome
humain (expression et fonction des gènes du développement humain).
Légende des figures
Les figures 1A et 1B représentent l'effet du TGF-[3 sur le maintien de l'état
indifférencié des cellules CD34+.
Le colorant PKH26 qui se fixe à la membrane des cellules permet de déterminer
le
nombre de divisions que la cellule a effectué : après un doublement de la
cellule,
l'intensité du colorant est divisée par 2, après 2 doublements par 4 etc. . .
On obtient ainsi
différentes populations se déplaçant vers la droite.
En conditions de culture sans TGF-(3 (20 000 cellules par ml) (Fig. 1A), les
2o cellules se divisent et après 3 jours, les cellules qui se sont divisées
plus d'une fois ne
contiennent que 1.1 % de cellules CD34+f°n.
En conditions de culture selon (invention, la concentration de TGF-[3 étant
plus
élevée (30 pg/ml de TGF-(3) (Fig. 1B), on observe un pourcentage plus élevé de
cellules
CD34+t'oTt
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EXEMPLE : PROCEDE DE MULTIPLICATION DE CELLULES SOUCHES
HEMATOPOòETIQUES
Matériels et méthodes
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Les cellules souches utilisées dans l'exemple ci-dessous sont plus
particulièrement des cellules souches somatiques humaines hématopoïétiques
provenant
de sang de cordon ombilical et caractérisées par le marqueur de membrane
CD34+.
Dans ce qui suit, lesdites cellules seront dénommées « cellules CD34+ ».
1) Marquage des cellules CD34+
Les cellules CD34+ sont diluées dans PBS (phosphate buffer saline) / BSA
(bovine serum albumine) (0,2%) et incubées avec des anticorps anti-CD34+
conjugués à
du FITC (fluoroisothiocyanate)(clone 8612; Becton Dickinson, San José, CA)
pendant
30 minutes à 4°C puis lavées 2 fois en PBSBSA. Le contrôle est
constitué par des
cellules incubées avec des IgGl non spécifiques conjuguées au FITC.
Pour détecter le colorant permettant de suivre la prolifération des cellules,
les
CD34+ sont marquées avec le colorant PKH26 (Sigma, France) selon les
instructions du
fabricant.
Les cellules avec une intensité moyenne de PKH26 sont triées dans une fenêtre
représentant environ 10% de la largeur complète. Ceci correspond environ à 20%
des
cellules CD34+. Quatre aliquots de 400 cellules sont utilisées en test HPP-Q.
Le reste
des cellules au repos et des cellules qui prolifèrent sont triées et cultivées
en milieu
semi-solide. Des billes calibrées (Coulter-Beckman) sont utilisées pour
standardiser les
2o analyses entre le jour 0 et le jour 3.
Description du test HPP-O (High Proliferative Potentiel-Quiescent Cell)
Le test HPP-Q permet de vérifier que l'inhibiteur du développement cellulaire,
notamment le TGF-(3, maintient les cellules souches, notamment
hématopoïétiques, au
repos.
Plus particulièrement, le test HPP-Q consiste à déterminer le degré de
maturité de
cellules souches, notamment hématopoïétiques, et est caractérisé en ce qu'il
comprend
les étapes suivantes
- on effectue la culture d'un premier ensemble de cellules souches, notamment
hématopoïétiques, dans un milieu approprié à leur culture, ledit milieu ne
contenant pas
de moyens de blocage d'au moins un inhibiteur du développement cellulaire tel
le TGF-
(3, pendant environ 14 à environ 28 jours, de préférence 18 jours,
- on effectue la culture d'un deuxième ensemble de cellules souches, notamment
hématopoïétiques, de même nature et de même degré de maturité que celles
mentionnées ci-dessus, dans un milieu approprié contenant des moyens de
blocage d'au
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moins un inhibiteur du développement cellulaire, ces moyens de blocage étant
présents,
dans le milieu de culture à une concentration efficace,
- on compare, 18 jours après la mise en culture de chacun des deux ensembles
de
cellules souches, le nombre et la nature des colonies, la différence des
sommes des
colonies à haut potentiel prolifératif (HPP-CFC = progéniteur formant une
colonie à
haut potentiel prolifératif, HPP-MEG = progéniteur mégacaryocytaire à haut
potentiel
prolifératif, HPP-GEMM = progéniteur granulocytaire érythrocytaire monocytaire
mégacaryocytaire à haut potentiel prolifératif) respectivement dans celle du
deuxième
ensemble et celle du premier ensemble.
1o L'évaluation de la maturité ou de l'immaturité de cellules souches
correspond à
l'observation suivante.
Après 18 jours, on observe au microscope le nombre et la nature des colonies :
on
compte le nombre de colonies mixtes constituées de cellules de la lignée rouge
et d'un
ou de plusieurs types de la lignée blanche. Le nombre de colonies mixtes est
plus élevé
lorsque la population cellulaire mise en culture est immature, c'est-à-dire
constituée de
cellules plus jeunes dont certaines sont au repos. D'autre part, plus la
cellule qui a
donné naissance à la colonie est immature, voire au repos, plus son potentiel
de
prolifération est grand, donc la colonie provenant de cette cellule une fois
activée sera
plus importante en taille.
2) Culture des cellules CD34+
Les cellules CD34+ ont été ensemencées à une concentration cellulaire de 106
cellules par ml dans des plaques de culture de 24 puits à raison de 1 ml par
puits au jour
~0. Lesdites cellules ont été ensemencées dans un milieu sans sérum, contenant
des
cytokines et un inhibiteur du TGF-(3 (anti TGF-(3).
« Milieu »
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SBA (milieu sans sérum avec albumine) +
SF(« Steel Factor ») 10 ng/ml
TPO (Thrombopoiétine) 10 ng/ml
FL (Ligand FLt3) 50 ng/ml
IL6 (Interleukine 6) 10 ng/ml
Anti-TGF[3 4 ~,g/ml
Les cellules CD34+ sont incubées à 37°C dans une atmosphère avec 5%
de C02
et une saturation d'humidité à 97%.
1o Tous les 2 jours, le volume de la culture est mesuré, le nombre de cellules
CD34+
est compté, et la viabilité desdites cellules est déterminée.
Après avoir compté le nombre de cellules CD34+ contenues dans la culture, on
enlève le volume nécessaire pour ne laisser que 106 cellules par puits.
On réajuste le milieu en volume, en cytokines ou facteurs de croissance et en
inhibiteur du TGF-(3.
Tous les 8 jours, un tri est effectué pour évaluer les cellules CD34+ et CD38~
et la
capacité proliférative des cellules CD34+ est évaluée en test HPP-Q.
Régulièrement, les résultats du test HPP-Q sont confirmés par un test en
souris
immunodéficientes (SC>D-NOD).
2o Le protocole du procédé selon l'invention permet de cultiver les cellules
dans un
microbioréacteur qui maintient les conditions de milieux constantes pour ce
qui est des
catabolites et anabolites (cytokines et inhibiteurs exclus).
L'ensemencement des cellules CD34+ à une forte concentration cellulaire permet
de créer un bioréacteur à forte concentration cellulaire, et ainsi de réduire
les volumes
de culture.
Principe du bioréacteur ou microbioréacteur
Le microbioréacteur est constitué d'une chambre de culture, de taille adaptée
au
nombre de cellules et à leur densité cellulaire (1 à 100 ml), séparée d'une
chambre de
dialyse par une membrane, et éventuellement d'une chambre gazeuse par une
autre
3o membrane, pour maintenir constants les constituants du milieu.
Des micro détecteurs permettent de contrôler différents paramètres dans la
chambre de culture : pH, COZ, O2, glucose, lactate, etc.
Des entrées et des sorties permettent de renouveler ou de modifier les milieux
de
cultures, ou d'ajouter ou de retirer des cellules.
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L'ensemble du microbioréacteur peut être automatisé par des pompes et des
programmateurs informatisés.
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