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« ODORANT-BINDING >~ PROTEINES HUMAINES FIXANT DES
LIGANDS HYDROPHOBES : POLYPEPTIDES ET
POLYNUCLEOTIDES CODANT LESDITS POLYPEPTIDES ET LEURS
APPLICATIONS ».
La présente invention concerne la mise en évidence de
nouvelles protéines humaines fixant les odeurs, ci-après
dénommées « OBP » (Odorant Binding Proteins) ainsi que leurs
applications, tant au niveau thérapeutique que non thérapeutique.
La présente invention repose sur l'identification d'une
famille de gènes de lipocalines composée de trois gènes et de deux
pseudogènes sur le chromosome humain 9q34 ; les trois gènes
correspondent au gène LCN 1 déjà décrit et à deux nouveaux gènes
faisant l'objet de la présente invention et dënommés hOBPIIa et
hOBPIIb. De plus, l'invention repose sur l'attribution de nouvelles
fonctions à des lipocalines humaines déjà connues par la mise en
évidence de nouveaux territoires d'expression.
Bien qu'un certain nombre d'OBP ait déjà été mis en
évidence (Pelosi et al., 1996), telle l'OBP de rat par exemple (voir
notamment le brevet EP-0 335 654), les OBP selon la présente
invention sont des OBP humaines qui présentent un très grand
nombre d'avantages, comme cela ressortira de la suite du texte, par
rapport aux protéines murines.
Ces protéines OBP de la famille des lipocalines ont, pour
certaines d'entre elles, été mentionnées indirectement dans le
brevet WO 99 07740, mais leur fonction d'OBP n'a jamais été
décrite jusqu'à présent ; il en est ainsi également des protéines
LCN 1, rétinol-binding-protein (RBP) et Apolipoprotéine D (ApoD),
comme cela sera explicité plus complètement ci-après.
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Historiquement, la famille des lipocalines (Pervaiz et Brew,
1987) a été définie à partir de la protéine humaine fixant le rétinol
(RBP) et à partir de 3 autres protéines : la (i-lactoglobuline de boeuf,
l'a2~u-globuline de rat et l'al-microglobuline humaine. A partir de
ces protéines de référence et en utilisant des homologies de
séquence, la famille des lipocalines s'est enrichie pour incorporer
maintenant un grand nombre de protéines, plus d'une centaine,
aussi bien chez les eucaryotes que chez les procaryotes (Flower et
al., 1995, 1996). Cette famille consiste en de petites protéines ( 160-
190 acides aminés) contenant une poche hydrophobe et qui sont
généralement sécrétées (Bocskei et al., 1992 ; Senoo et al., 1990,
Zeng et al., 1996 ; Miller, 1998), bien que dans certains cas il
s'agisse de protéines qui restent associées à la membrane (Nagata
et al., 1991). Chez les vertébrés, les identités de séquence entre les
différentes lipocalines tournent autour de 20%, toutefois, les
identités de séquences sont plus importantes pour les protéines
orthologues, de mème que pour les récents gènes paralogues
décrits (Igarashi et al., 1992 ; Dewald et al., 1992).
La présente invention concerne les polypeptides isolés OBPII
codés par les deux nouveaux gènes humains OBPIIa et OBPIIb
isolés localisés au locus 9q34 ; l'invention concerne également les
séquences polynucléotidiques correspondantes, les ARNm
correspondants, ainsi que les séquences régulatrices promotrices
qui déterminent le profil d'expression dans les différents tissus et
notamment dans les tissus sécréteurs. Ces deux gènes codent pour
au moins sept polypeptides différents étant donné l'existence
d'épissage alternatif des transcrits. Le gène OBPIIa code pour au
moins 4 polypeptides différents dénommés OBPII~,, , OBPII~ ,
OBPIIaY , OBPII~ et le gène OBPIIb code pour trois polypeptides
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différents dénommés OBPIIb«, OBPIIbp, OBPIIbs. Mème si un gène
est principalement exprimé, toutes les formes de messagers sont
retrouvées dans la structure nasale.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide isolé
comprenant une séquence en amino-acides ayant au moins 90%
d'identité avec les séquences en amino-acides SEQ ID N°2, SEQ ID
N°4, SEQ ID N°6, SEQ ID N°8, SEQ ID N° 10,
SEQ ID N° 12 ou SEQ
ID N° 14 et LCN 1, ApoD et RBP.
Il doit être compris que l'invention concerne les polypeptides
obtenus par purification à partir de sources naturelles ou bien
obtenus par les techniques recombinantes, comme cela sera décrit
dans ce qui va suivre; l'invention concerne également les
polypeptides obtenus par synthèse chimique qui peuvent alors
comporter des acides aminés non naturels. Dans la présente
1 S description, on utilisera le terme polypeptide pour désigner
également une protéine ou un peptide.
Par pourcentage d'identité entre les séquences, on entend
désigner le pourcentage d'acides aminés identiques entre les
séquences obtenu avec le meilleur alignement de séquences
possibles. Ce pourcentage étant purement statistique et les
différences entre les polypeptides étant réparties au hasard et sur
toute la longueur.
La présente invention concerne également un polypeptide
isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi
a) un polypeptide de séquence SEQ ID N°2, SEQ ID N°4,
SEQ ID N°6, SEQ ID N°8, SEQ ID N° 10, SEQ ID
N° 12 ou SEQ ID
N°14;
b) un polypeptide variant de polypeptide de séquences
d'acides aminés défini en a) ;
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c) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) ou
b) et comportant au moins 90 % d'identité avec ledit polypeptide de
a) ;
d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs
d'un polypeptide défini en a), b) ou c) ;
e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini
en a), b) ou c).
On entendra par polypeptide variant l'ensemble des
polypeptides mutés pouvant exister naturellement, en particulier
chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des
troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus
d'amino-acides. Les polypeptides variants selon l'invention
conservent au moins un domaine de fixation à un ligand
hydrophobe.
I S Par polypeptide homologue, on entendra désigner les
polypeptides présentant, par rapport aux polypeptides de séquence
SEQ ID N°2, SEQ ID N°4, SEQ ID N°6, SEQ ID
N°8, SEQ ID N° 10,
SEQ ID N° 12 et SEQ ID N° 14, certaines modifications comme
en
particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un
acide aminé, une troncature, un allongement et/ou une fusion
chimérique. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux
dont la séquence d'acides aminés présente au moins 90
d'identité, de préférence 95 %, de manière préférée 97 %, et de
manière encore préférée 99 % d'identité avec les séquences d'acides
aminés des polypeptides selon l'invention. Dans le cas d'une
substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non
consécutifs, sont remplacés par des ~~ acides aminés équivalents ~>.
L'expression « acide aminé équivalent » vise ici à désigner tout acide
aminé susceptible d'étre substitué à l'un des acides aminés de la
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structure de base sans cependant modifier les carâctéristiques ou
propriétés fonctionnelles essentielles des polypeptides
correspondants, leurs activités biologiques, telles par exemple
l'induction in vivo d'anticorps capables de reconnaître le
5 polypeptide dont la séquence d'acides aminés est comprise dans la
séquence d'acides aminés SEQ ID N°2, SEQ ID N°4, SEQ ID
N°6,
SEQ ID N°8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12 ou SEQ ID
N° 14, ou l'un
de ses fragments. Ces acides aminés équivalents peuvent être
déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec
les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur les résultats
des essais d'activité biologique croisée auxquels les différents
polypeptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on
mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'ètre
effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie des
activités biologiques des polypeptides modifiés correspondants, les
remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou
l'isoleucine, de l'acide aspaitique par l'acide glutamique, de la
glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les
substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les
mêmes conditions. Ainsi, on peut envisager d'introduire certaines
modifications comme en particulier une délétion, addition ou
substitution d'au moins un acide aminé au niveau des hélices
alpha de la protéine sans détruire le calice formé par la structure
composée des feuillets beta ; de la même manière, il est possible
d'introduire des amino-acides équivalents qui permettent de
conserver aux feuillets béta le caractère hydrophobe. Il peut
également être intéressant d'introduire des modifications dans la
séquence des polypeptides de l'invention pour générer des
polypeptides homologues dépourvus de sites protéasiques.
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Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en
particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide
selon l'invention présentant au moins une des caractéristiques ou
propriétés fonctionnelles des polypeptides selon l'invention,
notamment en ce que : (i) il est capable d'étre reconnu par un
anticorps spécifique d'un polypeptide selon l'invention ou bien par
des anticorps produits par des patients au cours d'une réaction
immunitaire; (ü) il présente au moins l'un des domaines ou régions
tels que définis ci-après ; (iii) il est capable de lier un ligand
hydrophobe et notamment des molécules odorantes, de préférence
les phéromones ; (iv) il est capable de lier spécifiquement un
récepteur.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un
polypeptide comportant au minimun 15 acides aminés, de
préférence 18 acides aminés, de manière préférée 25 et de manière
encore préférée 50 acides aminés. Les fragments de polypeptide
selon l'invention obtenus par clivage dudit polypeptide par une
enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en
plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font
également partie de l'invention. Lorsque l'on souhaite utiliser une
séquence de 15, 18, 25 ou de 50 amino-acides, il s'agit bien
entendu, de préférence, des parties correspondant à des épitopes
fonctionnels des polypeptides précédents, lesquels pourront être
intégrés dans un polypeptide ayant une structure plus longue sous
forme par exemple de protéine de fusion, ceci dépendra des
applications que l'on souhaite de ces polypeptides.
Selon un mode préféré de réalisation, la présente invention
concerne un polypeptide isolé sélectionné parmi un polypeptide
correspondant à la séquence SEQ ID N°2 et dénommé OBPII~,, , à la
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séquence SEQ ID N°4 et dénommé OBPII~ , à la séquence SEQ ID
N°6 et dénommé OBPIIaY , à la séquence SEQ ID N° 10 et
dénommé
OBPIIb«, à la séquence SEQ ID N° 12 et dénommé OBPIIbp .
Les polypeptides selon l'invention se caractérisent en ce
qu'ils comportent de préférence le domaine Gly-Thr-Trp-Tyr.
L'invention concerne également le polynucléotide isolé
caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide tel que décrit
précédemment. Le polynucléotide selon l'invention est choisi parmi
le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID
N° 5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N° 11 ou
SEQ ID N° 13.
L'invention porte également sur un polynucléotide isolé
caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi
a) un polynucléotide de séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N°
3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N°
11 ou SEQ ID
N° 13 ou dont la séquence est celle de l'ARN correspondant à la
séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID
N°7,
SEQ ID N°9, SEQ ID N° 11 ou SEQ ID N° 13 ;
b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire
de la séquence d'un polynucléotide défini en a),
c) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins
80% d'identité, de préférence 90 %, de manière préférée 95 %, et de
manière encore préférée 97 % d'identité avec un polynucléotide
défini en a) ou b),
d) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte
stringence avec une séquence de polynucléotide défini en a), b) ou
c),
e) un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de
préférence 21 nucléotides consécutifs, et de manière préférée 30
nucléotides consécutifs d'un polynucléotide défini en a), b), c) ou d).
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Dans la présente description, on entendra désigner par
polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide,
séquence nucléotidique ou acide nucléique un fragment d'ADN,
aussi bien un ADN double brin, un ADN simple brin que des
produits de transcription desdits ADN, et/ou un fragment d'ARN,
lesdits fragments naturels isolés, ou de synthèse, comportant ou
non des nucléotides non naturels, désignant un enchamement
précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un
fragment ou une région d'un acide nucléique.
Par polynucléotide de séquence complémentaire, on entend
désigner tout ADN dont les nucléotides sont complémentaires de
ceux de la SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID
N°7,
SEQ ID N°9, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13 ou d'une
partie de la SEQ
ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID
N°7, SEQ ID N°9, SEQ
ID N° 11, SEQ ID N° 13 et dont l'orientation est inversée.
Par pourcentage d'identité au sens de la présente invention,
on entend un pourcentage de bases identiques entre les
polynucléotides obtenus après le meilleur alignement, ce
pourcentage étant purement statistique et les différences entre les
deux polynucléotides étant réparties au hasard et sur toute leur
longueur.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence
signifie au sens de la présente invention, que les conditions de
température et de force ionique sont choisies de telle manière
qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux
fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions
de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les
fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont
avantageusement les suivantes
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L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux
étapes: (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon
phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC ( 1 x SSC correspond
à une solution 0,15 M NaCI + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de
formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhard's, 5
de dextran sulfate et 100 ~g/ml d'ADN de sperme de saumon ;
(2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une
température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une
sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes
à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C
en
0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC
+ 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille >
100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence
décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront
adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille
plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et
al. ( 1989) .
Avantageusement, un fragment nucléotidique répondant à la
définition précédente aura au moins 15 nucléotides consécutifs, de
préférence au moins 21 nucléotides, et encore plus
préférentiellement au moins 30 nucléotides consécutifs de la
séquence dont il est issu.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le
polynucléotide selon l'invention se caractérise en ce qu'il est
marqué directement ou indirectement par un composé radioactif ou
un composé non radioactif. Le polynucléotide selon l'invention est
utilisé en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation
de séquences nucléiques ; l'invention porte également sur
l'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention en tant que sonde
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pour la détection de séquences nucléiques. Selon l'invention, les
fragments de polynucléotides pouvant étre utilisés comme sonde ou
comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de
dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présenteront une
5 taille minimale de 9 bases, de préférence de 18 bases, et de manière
plus préférée 36 bases. Enfin, l'invention porte sur l'utilisation d'un
polynucléotide selon l'invention en tant que oligonucléotide sens ou
antisens pour contrôler l'expression du produit protéique
correspondant en l'occurence un polypeptide selon l'invention.
10 Les séquences de polynucléotides selon l'invention non
marquées peuvent étre utilisées directement comme sonde, amorce
ou oligonucléotide ; cependant les séquences utilisées sont
généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables
pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces, des
sondes, des oligonucléotides selon l'invention est réalisé par des
éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives ; parmi
les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 355, le
3H ou le 1251. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi
les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine,
les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les
agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents,
fluorescents, phosphorescents.
L'invention comprend également une méthode de détection
et/ou de dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un
échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes
suivantes : (i) d'isolement de l'ADN à partir de l'échantillon
biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de
l'échantillon biologique ; (ü) d'amplification spécifique de l'ADN
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codant pour le polypeptide selon l'invention à l'aide d'amorces ; (iii)
d'analyse des produits d'amplification.
L'invention comprend en outre un nécessaire pour la
détection et/ou le dosage d'un acide nucléique selon l'invention,
dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les
éléments suivants . (i) un couple d'amorces nucléiques selon
l'invention, (ü) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction
d'amplification d'ADN, et éventuellement (iii) un composant
permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus
particulièrement une sonde selon l'invention.
L'invention comprend aussi une méthode de détection et/ou
de dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon
biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (i)
de mise en contact d'une sonde selon l'invention avec un
échantillon biologique ; (ü) de détection et/ou de dosage de l'hybride
formé entre ladite sonde et l'ADN de l'échantillon biologique.
L'invention comprend également un nécessaire pour la
détection et/ou le dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans
un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les
éléments suivants : (i) une sonde selon l'invention, (ü) les réactifs
nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation, et le
cas échéant, (iii) un couple d'amorces selon l'invention, ainsi que
les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
L'invention concerne particulièrement les procédés selon
l'invention et décrits ci-dessus, pour la détection et le diagnostic de
cellules d'origine cancéreuse et principalement cancers du sein, de
l'utérus, de l'ovaire, de la prostate et du poumon.
Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être
utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en
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oeuvre notamment la technique PCR (réaction en chaîne à la
polymérase)(Erlich, 1989 ; Innis et al., 1990, et Rolfs et al., 1991).
Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces
oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit étre amplifié. On
peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet
américain U.S. N° 4 683 202. Les fragments amplifiés peuvent étre
identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose
ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique
comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse
l0 d'ions. La spécificité de l'amplification peut étre contrôlée par
hybridation moléculaire en utilisant comme sonde les séquences
nucléotidiques de polynucléotides de l'invention, des plasmides
contenant ces séquences ou leurs produits d'amplification. Les
fragments nucléotidiques amplifiés peuvent ètre utilisés comme
réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence
la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique
cible de sêquence complémentaire à celle desdits fragments
nucléotidiques amplifiés.
L'invention vise également les fragments nucléotidiques
susceptibles d'ètre obtenus par amplification à l'aide d'amorces
selon l'invention.
D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique
cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à
la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences
nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner
toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes
ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans
lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces
techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de
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l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon
d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une
transcription inverse. Il existe actuellement de très nombreux
procédés permettant cette amplification, comme par exemple la
technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique
d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992), la
technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite
par Kwoh et al. en 1989, la technique 3SR (Self Sustained
Sequence Replication) décrite par Guatelli et al. en 1990, la
technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification)
décrite par Kievitis et al. en 1991, la technique TMA (Transcription
Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction)
décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et
al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable, la technique de
RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev en 1992, la
technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. en
1990, la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par
Miele et al. en 1983 et perfectionnée notamment par Chu et al. en
1986 et Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al. ( 1996) ainsi que
par Stone et al. (1996).
Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARN,
par exemple un ARNm, on utilisera avantageusement,
préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à
l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un
procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme
de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de
l'ARN contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira
alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans
le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.
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Les sondes nucléotidiques selon l'invention hybrident
spécifiquement avec une molécule d'ADN ou d'ARN de
polynucléotide selon l'invention, plus particulièrement avec les
séquences SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID
N°7,
S SEQ ID N°9, SEQ ID N° 11 et SEQ ID N° 13, dans des
conditions
d'hybridation de forte stringence telles que données sous forme
d'exemple précédemment.
La technique d'hybridation peut étre réalisée de manières
diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale
consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de
différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tel que la
nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des
conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la
sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les
molécules hybrides formées sont détectées par la méthode
appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de
l'activité enzymatique liée à la sonde).
Selon un autre mode de mise en oeuvre des sondes
nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent étre utilisées
comme sonde de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de
capture », est immobilisée sur un support et sert à capturer par
hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de
l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite
détecté grâce à une seconde sonde, dite <~ sonde de détection »,
marquée par un élément facilement détectable.
Dans un mode préféré de réalisation, l'invention comprend
l'utilisation d'un oligonucléotide sens ou antisens pour contrôler
l'expression du produit protéique correspondant. Parmi les
fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut citer en
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particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la
structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une
inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut
également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec
5 des protêines impliquées dans la régulation de l'expression du
produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une
activation de cette expression. Les oligonucléotides selon l'invention
présentent une taille minimale de 9 bases, de préférence de 18
bases, et de manière plus préférée 36 bases.
10 L'invention concerne un vecteur recombinant de clonage
d'un polynucléotide selon l'invention et/ou d'expression d'un
polypeptide selon l'invention caractérisé en ce qu'il contient un
polynucléotide selon l'invention tel que précédemment décrit. Le
vecteur selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte les
15 éléments permettant l'expression desdites séquences dans une
cellule hôte et éventuellement la sécrétion desdites séquences hors
de la cellule hôte. Par « vecteur d'expression », on entend aussi bien
des vecteurs d'expression à réplication autonome du type plasmide
que des systèmes destinés à assurer l'intégration dans les cellules,
mais ces vecteurs d'expression pourront étre également des
vecteurs d'expression de type viral ou bien méme, lorsque l'on
souhaite réaliser par exemple de la thérapie génique, de l'ADN nu.
Parmi les vecteurs viraux, on préfère ceux dérivés de l'adénovirus,
du virus associé à l'adénovirus (AAV), de rétrovirus, des lentivirus,
et de préférence les dérivés de HIV, des poxvirus, du virus de
l'herpes pour l'expression en système eucaryote. Parmi les vecteurs
non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou
TARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les
chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificiel
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chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes
artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour
l'expression dans les cellules murines et de manière préféré les
chromosomes artificiels d'homme (I-IAC, human artificial
chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
Selon un mode particulier de réalisation, le vecteur selon
l'invention comporte des éléments de contrôle de l'expression des
polypeptides ; ces éléments de contrôle sont choisis de préférence
parmi (i) la séquence promotrice du gène hOBPIIa selon
l'invention qui correspond à la séquence SEQ ID N° 15 et/ou parmi
la séquence promotrice du gène hOBPIIb selon l'invention qui
correspondant à la séquence SEQ ID N° 16 ; (ü) un polynucléotide
dont la séquence est complémentaire à la séquence SEQ ID N° 15 et
SEQ ID N° 16 ; (iii) un polynucléotide dont la séquence comporte
au
moins 80% d'identité avec un polynucléotide défini en (i) ou (ü) ; (iv)
un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte
stringence avec la séquence de polynucléotide définie en (i), (ü), (iii).
Les outils informatiques à la disposition de l'homme du métier lui
permettent aisément d'identifier les boites régulatrices promotrices
nécessaires et suffisantes au contrôle de l'expression génique,
notamment les boites TATA, CCAAT, GC, ainsi que les séquences
régulatrices stimulatrices (« enhancer ») ou inhibitrices (« silencers »)
qui contrôlent en CIS l'expression des gènes selon l'invention ;
parmi ces séquences régulatrices, il convient de citer l'IRE, MRE,
CRE.
Il est également dans l'étendue de l'invention d'utiliser les
éléments ci-dessus définis et choisis parmi la séquence SEQ ID
N° 15 et/ou SEQ ID N° 16 pour contrôler l'expression de
polypeptides hétérologues autres que ceux de l'invention et
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notamment pour diriger l'expression de polypeptides hétérologues
dans les types cellulaires dans lesquels les polypeptides selon
l'invention s'expriment normalement.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes,
notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, caractérisées en
ce qu'elles sont transformées par les vecteurs selon l'invention. De
préférence, les cellules hôtes sont transformées dans des conditions
permettant l'expression d'un polypeptide recombinant selon
l'invention. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi les cellules
bactériennes mais également parmi les cellules de levure, de méme
que parmi les cellules végétales et animales ; de préférence, l'hôte
cellulaire est une cellule de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993),
mais également une cellule d'insectes dans laquelle on peut utiliser
des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple
(Luckow, 1993). Ces cellules peuvent ètre obtenues par
l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique
insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en
culture desdites cellules dans des conditions permettant la
réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique
transfectée.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention porte
également sur un animal ou une plante transgénique qui comporte
des cellules hôtes selon l'invention.
L'invention concerne également une méthode de préparation
d'un polypeptide caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un vecteur
selon l'invention. Plus particulièrement, l'invention porte sur une
méthode de préparation d'un polypeptide recombinant caractérisé
en ce que l'on cultive des cellules transformées selon l'invention
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dans des conditions permettant l'expression dudit polypeptide
recombinant et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Le polypeptide selon l'invention est susceptible d'ètre obtenu
selon un procédé de l'invention et selon les techniques de
production de polypeptides recombinants connues de l'homme du
métier. La présente invention concerne donc le polypeptide
recombinant susceptible d'étre obtenu par la méthode ci-dessus
présentée. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est
placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans
un hôte cellulaire. Un système efficace de production d'un
polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par
exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte
compatible. Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux
d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions
appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être
maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement
posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion du
polypeptide traduit. Ces différents signaux de contrôle sont choisis
en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences
d'acide nucléique selon l'invention peuvent étre insérées dans des
vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des
vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront
préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du
métier, et les clones en résultant peuvent ètre introduits dans un
hôte approprié par des méthodes standards telles par exemple la
transfection par précipitation au phosphate de calcium, la
lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-
dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que
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non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire
naturelle.
Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant
comporter des acides aminés non naturels correspondant auxdits
polypeptides recombinants, sont également compris dans
l'invention. Les peptides selon l'invention peuvent également être
préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la
synthèse des peptides. Cette synthèse peut étre réalisée en solution
homogène ou en phase solide.
Les procédés de purification de polypeptide recombinant
utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide
recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits
cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes
utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le
fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques
d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux
spécifiques, etc. Une variante préférée consiste à produire un
polypeptide recombinant fusionné à une protéine « porteuse »
(protéine chimère). L'avantage de ce système est qu'il permet une
stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit
recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la
renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification
lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand
spécifique.
La présente invention concerne l'utilisation d'un polypeptide
choisi parmi un polypeptide hOBPIIa et hOBPIIb selon l'invention
ou l'un de leur fragment et parmi LCN 1, la <~ rétinol binding
protein » (RBP) et l'apolipoprotéine D (ApoD) comme protéine de
liaison à un ligand hydrophobe, de préférence une molécule
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odorante. En effet, outre les polypeptides OBPII mentionnés
précédemment, la fonction OBP des lipocalines LCN 1, RBP et ApoD
n'a jamais été suggérée. En effet, si la présence de LCN 1 dans le
mucus nasal a été décrite (Redl et al., 1992), c'est en fait une autre
5 fonction qui lui a été attribuée, à savoir une fonction d'anti-
protéase, alors que la fonction principale de la protéine LCN 1
semble bien ètre le transport de ligands hydrophobes, d'ailleurs les
essais réalisés dans le cadre de la présente invention avec une
protéine LCN 1 recombinante n'ont pas permis de mettre en
10 évidence une activité anti-protéase. Il en va de même pour la
« rétinol- binding protein » et l'apolipoprotéine D qui n'ont jamais
été présentées comme ayant une fonction OBP.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un
polypeptide selon l'invention ou l'un de ses fragments, LCN 1, RBP
15 et l'apolipoprotéine D comme inhibiteur compétitif, comme agoniste
ou antagoniste des récepteurs cellulaires aux lipocalines.
L'utilisation d'inhibiteur de liaison des lipocalines à leur récepteur
peut être utilisée dans une stratégie anti-cancéreuse ; en effet, un
certain nombre de tumeurs sont hormono-dépendantes : ainsi les
20 tumeurs du sein sont sensibles aux stéroïdes ; ces stéroïdes étant
transportés par les lipocalines, il est dans l'étendue de l'invention
de fournir des inhibiteurs de liaison aux polypeptides selon
l'invention et LCN 1, OBP ou APO-D pour éviter la fixation des
hormones stéroïdes au niveau des récepteurs des cellules
tumorales.
L'invention concerne également un anticorps monoclonal ou
polyclonal et ses fragments, caractérisés en ce qu'ils lient
spécifiquement un polypeptide selon l'invention. Les anticorps
chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps simple
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chaîne font également partie de l'invention. Les fragments
d'anticorps selon l'invention sont de préférence des fragments Fab
ou F(ab~2.
Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer
des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps
monoclonaux pourront avantageusement étre préparés à partir
d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en
1975. Les anticorps polyclonaux pourront étre préparés, par
exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris,
avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la
réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques
contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne
d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant
servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention
peuvent aussi étre préparés par purification sur une colonne
d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé un
polypeptide selon l'invention.
L'invention porte également sur un anticorps monoclonal
spécifique d'un polypeptide selon l'invention et capable d'inhiber
l'interaction entre ledit polypeptide et le récepteur cellulaire sur
lequel se lie spécifiquement ledit polypeptide. Selon un autre mode
de réalisation, l'anticorps monoclonal selon l'invention est capable
d'inhiber l'interaction entre ledit polypeptide et ses ligands
hydrophobes, de préférence les molécules odorantes et de manière
préférée les phéromones avec lesquelles ledit polypeptide se lie.
Les anticorps de l'invention pourront également étre
marqués de la même manière que décrit précédemment pour les
sondes nucléiques de l'invention et de manière préférée avec un
marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif. De tels
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anticorps marqués pourront être utilisés pour la détection de ces
polypeptides dans un échantillon biologique. De préférence,
l'échantillon biologique est constitué par un fluide par exemple du
sérum, du sang ou des biopsies humaines. Ils constituent ainsi un
moyen d'analyse de l'expression de polypeptide selon l'invention,
par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or,
immunoconjugués enzymatiques.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent étre
avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où
l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit étre observée, et
plus particulièrement en immunocytochimie, en
immunohistochimie ou dans des expériences de ~~ western
blotting », dans les techniques ELISA et RIA. Il est ainsi dans
l'étendue de l'invention de fournir une méthode de détection et/ou
I S de dosage d'un polypeptide selon l'invention, dans un échantillon
biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de
mise en contact de l'échantillon biologique avec des anticorps selon
l'invention puis de mise en évidence du complexe antigène-
anticorps formé.
Entre également dans le cadre de l'invention, un nécessaire
pour la détection et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention
dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les
éléments suivants : (i) un anticorps monoclonal ou polyclonal tel
que décrit précédemment ; (ü) le cas échéant, les réactifs pour la
constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; (iii) les
réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps
produits par la réaction immunologique. Ce nécessaire est
notamment utile à la réalisation d'expériences de Western
Blotting et aux expériences d'immunoprécipitation.
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Les hOBPII selon la présente invention peuvent étre utilisées
dans de nombreuses applications.
Les premières applications des OBP résident dans le
contrôle des odeurs ; ces applications concernent essentiellement
l'hygiène corporelle (parfumerie, cosmétologie, pharmacie) ou
collective.
Elles peuvent étre utilisées dans un procédé pour contrôler
la volatilisation d'une odeur ; un tel procédé se caractérise en ce
qu'il comprend une étape de liaison de ladite odeur avec un
polypeptide selon l'invention ou avec les protéines LCN 1, RBP ou
l'apolipoprotéine D.
Il est également possible de fixer l'odeur sur un support
solide en utilisant une OBPII selon l'invention attachée audit
support, cette fixation pouvant étre aussi bien une fixation
covalente que non covalente, par exemple par adsorption ou par
des fixations de type avidine-biotine, si cela est nécessaire. Dans
ces conditions, on obtient un support parfumé retenant les odeurs
plus longtemps, libérant progressivement les odeurs et pouvant ètre
utilisé aussi bien dans le domaine cosmétique que dans le domaine
des produits d'entretiens en général. Les supports utilisés pourront
être des supports de type plaque ou de type bille par exemple. Bien
entendu, les OBPII selon la présente invention seront plus
particulièrement utilisables dans l'industrie de la parfumerie et de
la cosmétique où les OBP seront utilisées sous forme d'un mélange
liquide destiné à contrôler la volatilisation des odeurs après que la
composition ait été répandue sur la peau humaine. Ceci permet de
prolonger la ~~ tenue » des parfums ou d'entrer dans la composition
des déodorants corporels notamment. Bien entendu, le terme
« parfum » englobe de façon générale les mélanges connus en
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parfumerie, à base d'alcool ou sous forme aqueuse, et contenant
notamment des huiles essentielles. Le polypeptide selon l'invention
peut également entrer dans la composition de crèmes à base de
rétinol en tant qu'agent de transport et de protection dudit rétinol
pour des applications cosmétologiques et notamment pour prévenir,
effacer et traiter les rides, les ridules de la peau, lutter contre le
relachement cutané et/ou sous-cutané.
Parmi les applications concernant l'hygiène collective, le
procédé selon l'invention peut être utilisé dans un dispositif visant
à désodoriser les locaux tels par exemple les animaleries, les
étables. Un tel dispositif peut également être envisagé pour
désodorisé le flux d'air entrant dans un appareil à air conditionné ;
un tel dispositif serait très utile dans les zones géographiques
polluées.
L'invention concerne également un procédé de criblage de
molécule, de préférence les odeurs ou saveurs qui comprend de
passer la molécule sur un substrat qui comprend un polypeptide
selon l'invention ou, LCN 1, RBP et l'apolipoprotéine D lié audit
substrat, ledit polypeptide liant ladite odeur ou saveur et de
récupérer ladite odeur ou saveur depuis le polypeptide si
nécessaire. Les OBP selon l'invention pourraient ainsi permettre
l'isolement d'odeurs ou de parfums en les fixant sur un support tel
que décrit précédemment mais qui, dans ce cas, pourra être par
exemple une colonne de chromatographie, en faisant passer sur
celle-ci le produit sur lequel on souhaite capter les ôdeurs. Il est
bien entendu possible, toujours dans ce même type d'application,
d'effectùer une analyse d'un parfum complexe en utilisant les
différences de rétention des différents produits par les OBP.
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Le procédé d'isolement décrit précêdemment peut également
ètre utilisé pour séparer des <~ odeurs » particulières, notamment les
phéromones humaines.
Les hOBPII selon la présente invention peuvent étre utilisées
5 pour des applications agro-alimentaires ou industrielles.
Les OBP selon la présente invention de part leurs
caractéristiques peuvent permettre de solubiliser certaines
molécules lipophiles en les associant avec lesdits OBP. Ainsi les
polypeptides selon l'invention peuvent ètre utilisés en combinaison
10 avec des acides gras alimentaires à titre d'additif alimentaire. La
présente invention concerne un procédé pour solubiliser des
molécules lipophiles caractérisé en ce qu'il comprend la liaison de
ladite molécule lipophile à un polypeptide selon l'invention, à LCN 1,
RBP ou à l'apoD.
15 Les OBPII, de méme que LCN 1, RBP et ApoD sont
susceptibles d'étre impliquées dans le transport des acides gras et
dans les mécanismes biologiques permettant la détection de la
charge en acides gras de la ration alimentaire, au niveau buccal
notamment. L'invention concerne donc également l'utilisation des
20 polypeptides précédents en association avec des acides gras pour
diminuer la consommation d'acides gras, notamment dans les
hyperlipidémies ou les obésités. Les polypeptides précédents
peuvent dont être utilisés pour le traitement des hyperlipidémies et
de l'obésité. En effet, ces protéines participent à la détection de la
25 teneur en acides gras dans la prise alimentaire (Gilbertson, 1998),
un excès de ces protéines doit conduire à leurrer le système
physiologique détectant la charge en gras d'une ration alimentaire.
Ainsi, une portion alimentaire pauvre en graisse mais
supplémentée en OBP ou ApoD ou RBP ou LCN 1 préalablement
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chargées en acide gras, sera faussement identifiée comme riche en
graisse.
Une autre application est de complémenter un lait non
maternel avec un ou plusieurs des polypeptides décrits
précédemment.
Les OBP selon la présente invention peuvent étre utilisées en
thérapie préventive et curative.
Ainsi, l'absence de détection de ce type de protéines dans un
prélèvement biologique en utilisant un anticorps, une amorce, une
sonde selon l'invention pourrait étre un élément de diagnostic
des anosmies.
De méme, il est possible de prévoir la détection des anticorps
anti-OBPII dans un échantillon biologique d'origine humaine, la
présence ou le dosage de ces anticorps pourrait ètre en rapport
avec certains types d'allergies, notamment chez les asthmatiques.
Dans ce cas, il pourrait étre possible de traiter ce type d'allergie par
administration de fragments de polypeptides tels que décrits, ce qui
diminuerait les réactions immunitaires aux allergies externes.
L'invention concerne donc un procédé de détection d'anticorps
dirigé contre les OBPII humaines (hOBPII) dans le sérum humain
de patient allergique et/ou asthmatique en utilisant un polypeptide
hOBPII selon l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un
procédé de détection d'anticorps dirigé contre les OBPII humaines
(hOBPII) dans un fluide biologique de patient atteint d'un cancer, et
notamment du cancer de la prostate et/ou du cancer du sein et/ou
du cancer de l'utérus et/ou de l'ovaire et/ou du poumon. En effet,
les protéines selon l'invention sont sur-exprimées dans les tumeurs
et notamment dans le cancer de la prostate (US 5804368, WO 97
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10503, CS 84 02898, CS 83 02012, CS 82 08506, CS 82 08215), le
cancer du sein (Stoecz et Gould, 1995 ; Simard et al., 1992), le
cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, le cancer du poumon.
Les OBP selon la présente invention peuvent également être
utilisées dans des compositions pharmaceutiques, ceci notamment
afin de vectoriser certaines drogues.
En effet, les lipocalines sont utilisées par les mammifêres
pour transporter des molécules hydrophobes au sein de fluides
biologiques. Il semble même que ce soit les transporteurs naturels
des xénobiotiques in vivo. Pour exemple, une surcharge
expérimentale en xénobiotiques crée chez le rat mâle des tumeurs
au niveau du tube contourné proximal (TCP) du néphron (Borghoff
et al., 1990). En effet, les protéines MUP, seulement produites chez
le rat màle, sont réabsorbées par les cellules TCP ; après
dégradation lysosomiale, les protéines MUP libèrent les
xénobiotiques qu'elles transportaient. Ceux-ci s'accumulent dans
ces cellules et les conduisent vers une voie tumorale par
mutagenèse. Les lipocalines semblent donc étre la structure idéale
pour piéger en leur calice une molécule utilisée comme
médicament, évitant ainsi une distribution générale de celui-ci.
Ainsi, G. Beste et a1.(1999) et la demande WO 99 16873 décrivent
une stratégie de mutagenèse et de criblage permettant d'identifier
des variants d'une lipocaline ayant une affinité optimale pour un
ligand donné. Il est donc possible de créer une « cage à
médicament » hautement spécifique.
La présente invention concerne donc un polypeptide selon
l'invention en tant qu'agent de ciblage de composé pharmaceutique.
Par agent de ciblage, on entend désigner les polypeptides de
l'invention capables d'assurer le transport et la libération du ligand
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auxquels ils sont liés au niveau de certains tissus ou cellules cibles
qui possèdent à leur surface des récepteurs auxdits polypeptides.
Ainsi, l'invention concerne le transport de médicament au sein de la
cage d'un polypeptide selon l'invention et du ciblage de cellules
grâce à la capacité de l'OBPII à se fixer à un récepteur spécifique.
Il est également dans l'étendue de l'invention de développer
des protéines de fusion ou des protéines chimériques comportant la
cage correspondant aux lipocalines selon l'invention associées à
une protéine permettant un adressage cellulaire spécifique
généralement différent de celui naturel des OBPII. La présente
invention a donc pour objet un polypeptide caractérisé en ce que
ledit polypeptide est exprimé sous la forme d'une protéine de fusion
avec une protéine permettant un adressage cellulaire spécifique.
Parmi les protéines permettant un adressage cellulaire spécifique, il
convient de citer les interleukines, les cytokines, les lymphokines,
les chémokines, les facteurs de croissance, les hormones, les
anticorps mono- ou polyclonal. Les interleukines, cytokines et
lymphokines sont choisies dans un groupe composé de préférence
des interleukines Il-1 à Il-20, des interférons a-IFN, j3-IFN et y-IFN.
Les facteurs de croissance sont de préférence les facteurs
stimulateurs des colonies (colony stimulating factors) G-CSF, GM-
CSF, M-CSF et l'érythropoiétine. Les hormones sont choisies de
préférence parmi les hormones stéroidiennes.
Selon un autre mode de réalisation, le polypeptide selon
l'invention en tant qu'agent de ciblage de composé pharmaceutique
est associé à une molécule permettant un adressage cellulaire
spécifique. Parmi, les molécules permettant un adressage cellulaire
spécifique, il convient de citer le groupe des stéroïdes, des
interleukines, des cytokines, des lymphokines, des interférons, des
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facteurs de croissance, des hormones, des anticorps. De préférence,
la molécule est un stéroide. L'association entre le polypeptide selon
l'invention et ladite molécule est réalisée soit par une liaison non
covalente en utilisant par exemple le système avidine-biotine ou
soit par une liaison covalente en utilisant par exemple des agents
chimiques pontants.
Parmi les composés pharmaceutiques que peut transporter et
cibler le polypeptide selon l'invention, il convient de citer les
médicaments et notamment les agents anticancéreux. Les agents
anti-cancéreux sont sélectionnés parmi le groupe des agents
antiprolifératifs, antinéoplastiques ou cytotoxiques et sont utilisés
pour arrêter le développement des cancers et pour induire une
régression et/ou une élimination de la masse tumorale. Ces agents
anticancéreux sont de préférence des radioisotopes, et de manière
1 S encore préférée des radioisotopes émetteurs de rayons gamma tels
que l'Iodelsy l'yttrium9o, 1'0r199, le Palladiumloo, le Cuivre67, le
Bismuth217 et l'Antimoine2l n Les radioisotopes émetteurs de rayons
beta et alpha peuvent également étre utilisés pour la thérapie. Les
agents anticancéreux non isotopiques liés au polypeptide selon
l'invention sont multiples et variés; on peut citer: (i) les
antimétabolites telles les agents anti-folate, le méthotrexate, (ü) les
analogues des purines et des pyrimidines (mercaptopurine,
fluorouracile, 5-azacytidine), (iii) les antibiotiques, (iv) les lectines
(ricine, abrine) et (iv) les toxines bactériennes (toxine diphtérique) ;
les toxines sont choisies de préférence parmi l'exotoxine A dè
Pseudomonas, la toxine diphtérique, la toxine cholérique, la toxine
anthrox de Bacillus, la toxine Pertussis, la toxine Shiga de Shigella,
la toxine apparentée à la toxine Shiga, les toxines d'Escherichia coli,
la colicine A, la d-endotoxine, l'hémagglutinine d'Haemophilus A.
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L'invention concerne également une composition
pharmaceutique comprenant un composé pharmaceutique lié au
moins à un polypeptide selon l'invention et un véhicule
pharmaceutiquement acceptable. Il est également dans l'étendue de
5 l'invention d'augmenter la capacité de fixation par mutagenèse de
cette méme protéine. L'invention concerne une composition
pharmaceutique telle que définie précédemment pour le traitement
du cancer, et notamment le cancer de la prostate, le cancer du sein,
le cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, le cancer du foie et le
10 carcinome des cellules épithéliales pulmonaires. Etant donné que
l'OBP dénommée hOBPIIb, l'apolipoprotéine D, la RBP et l'a-1-acide
glycoprotéine sont exprimées dans la prostate, la composition
pharmaceutique selon l'invention est destinée au traitement du
cancer de la prostate. De même, étant donné qu'il a été démontré
1 S que l'ARNm des protéines ApoD, RBP et LCN 1 est produit dans la
glande mammaire en plus de la production de hOBPIIb déjà décrit
dans la demande WO 99 07740, la composition pharmaceutique
selon l'invention est destinée au traitement du cancer du sein.
L'invention porte aussi sur un polypeptide selon l'invention
20 en tant que transporteur de composé pharmaceutique. Par
transporteur, on entend désigner des polypeptides selon l'invention
capable de véhiculer dans l'organisme un composé pharmaceutique
sans que ledit composé ne soit libéré à un endroit privilégié dans
l'organisme. Un tel polypeptide constitue un moyen de délivrance
25 dudit composé pharmaceutique dans l'organisme.
La présente invention concerne également une composition
pharmaceutique selon l'invention caractérisé en ce que ledit
polypeptide constitue une forme retard de délivrance dudit composé
pharmaceutique dans l'organisme.
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En effet le composé pharmaceutique d'intérét lié au
polypeptide OBPII selon l'invention diffuse progressivement dans
l'organisme à mesure que ledit polypeptide transporteur est
catabolisé dans l'organisme. L'utilisation des techniques de l'ADN
recombinant permet à l'homme de l'art de modifier la durée de
demi-vie du polypeptide OBPII dans l'organisme en introduisant des
modifications dans ledit polypeptide. Ainsi, il peut étre intéressant
de développer un polypeptide homologue selon l'invention pour
lequel les sites de coupures protéasiques ont été mutés afin
d'augmenter la demi-vie dudit polypeptide dans l'organisme. Il peut
être également intéressant de développer un polypeptide
multimérique, exprimé par exemple sous la forme d'une protéine de
fusion, afin d'éviter une ~~ fuite glomérulaire » (clearance rénale) et
ainsi d'augmenter la demi-vie dudit polypeptide dans l'organisme.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un composé
caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un anticorps, un
polypeptide, un ligand, un polynucléotide, un oligonucléotide ou un
vecteur selon l'invention à titre de médicament et notamment en
tant que principes actifs de médicament ; ces composés seront
préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule
pharmaceutiquement acceptable. Par véhicule
pharmaceutiquement acceptable, on entend désigner tout type de
véhicule employé habituellement dans la préparation de
compositions injectables, c'est-à-dire un diluant, un agent de
suspension tel une solution saline isotonique ou tamponnée. De
préférence, ces composés seront administrés par voie systémique,
en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire,
intradermique ou par voie orale. Leurs modes d'administration,
posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés
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selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement
d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'àge ou le
poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance
au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
L'invention concerne également une composition
pharmaceutique comprenant un vecteur d'expression selon
l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Il est également possible d'utiliser la propriété d'expression
dans des sites particuliers de ces protéines afin d'assurer une
imagerie et/ou un diagnostic de certains types de cancer.
Enfin, compte tenu de la forte expression des polypeptides
selon l'invention dans le placenta (cf. figure 10), la présente
invention présente différentes applications thérapeutiques
destinées à traiter des pathologies de la gestation chez la femme.
Ainsi, un des objéts de la présente invention est d'utiliser le
polypeptide selon l'invention pour la préparation d'un médicament
destiné au transport de composés à travers la barrière placentaire.
Ces composés sont de préférence des molécules lipophiles. Le
polypeptide selon l'invention peut étre utilisé pour réaliser le
transport de composés de la mère gestante vers le foetus ; les
composés pouvant être choisis parmi les molécules d'intérêt
thérapeutique, de préférence lipophiles, les acides gras essentiels,
les hormones, les vitamines, et de manière plus générale, les petites
molécules lipophiles.
En effet, il a été démontré que les cellules des villosités
placentaires sécrètent massivement des polypeptides selon
l'invention, notamment des OBPII. Ces polypeptides se répandent
ensuite dans le sang foetal et vers la circulation sanguine générale
du foetus.
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Également, le polypeptide selon l'invention peut être utilisé
pour réaliser le transport de composé du foetus vers le mère
gestante. En effet, le foetus sécrète au niveau des villosités des
structures nasales des polypeptides selon l'invention qui participent
aux échanges de molécules entre le foetus et la mère au niveau de
la membrane amniotique. C'est donc également un objet de la
présente invention de fournir au foetus des polypeptides selon
l'invention pour permettre le transport de composés présents dans
le foetus, par exemple des xénobiotiques, vers le placenta et/ou vers
la membrane amniotique, pour permettre la détoxification du
foetus.
Selon un autre aspect de l'invention, le polypeptide selon
l'invention peut être utilisé comme marqueur de grossesse. En effet,
le polypeptide selon l'invention est présent dans différents liquides
biologiques de la mère tels l'urine, le sang ; la mesure de sa
concentration et/ou de sa présence constitue un indicateur de
grossesse. A ce titre, ce marqueur pourra être utilisé, avec, ou à la
place du, ou en complément du marqueur de grossesse que
constitue la choriogonadotrophine humaine hCG ; le polypeptide
selon l'invention et la hCG sont en effet des molécules qui sont
sécrétées par les cellules placentaires trophoblastiques.
Enfin, selon un autre aspect de l'invention, le polypeptide
peut être utilisé comme marqueur de pathologies foeto-placentaires.
Il peut constituer un marqueur de la rupture de la membrané de la
poche des eaux.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention
apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les
figures dont les légendes sont représentées ci-après.
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FIGURE 1 : Organisation génomique du locus LCN 1 / hOBPII
La ligne du haut représente la région du chromosome 9q34.
La double flèche indique l'intervalle entre la localisation des
marqueurs polymorphes D9S 1811 et D9S67 ; la position relative
des marqueurs D9S67 et D9S 1826 est incertaine.
Le niveau du milieu indique l'organisation partielle des
cosmides à 3 loci différents : LCNlc, LCNlb-hOBPIIb, LCNl-hOBPita.
Les cosmides (approximativement 40 kb) sont représentés par des
lignes horizontales avec leur nom et les bras des vecteurs T3 ou T7
notés au-dessous de la ligne. Les flèches représentent les différents
gènes ou pseudogènes avec leur orientation respective. Dans les
cosmides, les lignes en pointillés verticales représentent les sites
EcoRI. Le symbole ~ indique une orientation incertaine du locus.
Le niveau inférïeur montre les structures intron/exon des
gènes LCN 1 et hOPBII : les boites noires représentent les exons ; les
flèches représentent le site d'initiation de la transcription ; oll à o15
représentent les sondes d'oligonucléotides utilisées pour cribler les
cosmides ; Alu représente la présence de séquences répétées.
FIGURE 2 : Analyse "Dot Plot" de
(A) séquence locus LCN 1-hOBPIIa ~AC000396+ACXX~~O~)
contre locus LCN lb-hOBPIIb (AC002098) ;
(B~ séquence locus LCN1-hOBPIIa (AC000396+ACXXX~O~)
contre
sêquence locus LCNlc ;
~C) séquence locus LCN 1b-hOPBIIb (AC002098) contre
séquence locus LCNIc (AC002106~.
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Des séquences génomiques ont été filtrées pour les
séquences répétitives à l'aide de « Repeatmasker » (REF), puis
comparées et « dotplotted ~> avec le logiciel gcg en utilisant une taille
de fenétre de 25, et un critère de 20 avec une homologie de 80%.
5
FIGURE 3 : Séquence nucléotidique de gènes hOBPII.
Les lignes supérieures représentent la séquence hOBPIIa et
les lignes inférieures la séquence hOBPIIb pour laquelle seuls les
nucléotides différents sont représentés ; un tiret indique l'absence
10 de séquences correspondantes. Les capitales ombrées sont les
séquences exoniques et les lettres minuscules les séquences
introniques. Les tailles indiquées sur la gauche sont indiquées en
pb. La boîte TATA est en caractères gras et le signal de
polyadénylation est souligné. Les boîtes indiquent les sites
15 acceptéurs d'épissage p~oûr les exons 5, 5b, 5c.
FIGURE 4 : Représentation schématique des deux gènes hOBPII
et de leur ARNm correspondants.
20 Les lignes horizontales représentent l'organisation
exon/intron avec des tailles indiquées en pb. Les boîtes ombrées
numérotées de 1 à 7 sont les séquences exoniques codantes des
principaux transcrits ; les lettres b et c font référence à des exons
surnuméraires. Les différents transcrits sont représentés à l'aide de
25 boîtes assemblées : les premières, hOBPIIaa, et hOBPIIba,
correspondent aux transcrits principaux, les autres correspondent
aux formes issues d'un épissage alternatif. j indique un décalage
du cadre de lecture résultant de l'insertion ou de la délétion d'un
exon et * représente un codon stop. La lettre « a » représente une
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hélice a et « b » des feuilles j3 prédis par le logiciel DSC. Les Lettres
en italique sont des prédictions obtenues avec le logiciel "Predator".
FIGURE 5 : Alignement des séquences des protéines issues des
deux gènes hOPBIIa et hOBPIIb humains (hOBPIIaa -
OBP2aaHOMS, hOBPIIba - OPB2baHOMSA, hOBPIIb(3 -
OPB2bbHOMSA, hOBPIIay - OBP2agHOMSA, hOBPIIa(3 -
OBP2abHOMSA), des lipocalines des larmes humaines
(LCN1 HOMSA), d'OBPII de rat (OBP2 RATNO), de
lactoglobuline bovine BLG (LACB BOSTA), de MUP de souris
(MUP6 MUSMU), de RBP humaine (RBP_HOMSA), d'OBP bovine
(OBP_BOSTA), de MUP de rat (MUP_RATNO), d'OBP porcine
(OPB SUSSC).
Les résidus dans les boîtes gris foncé sont identiques et
ceux dans les boîtes gris claires sont similâ.ires. Les éléments de
structure secondaire prédits avec le programme DSC sont soulignés
et les résidus d'amino-acides sont en italiques. Les feuillets (i et les
hélices a sont numérotées pour hOPBIIa et b. Le site de clivage
prévu du peptide signal est indiqué pax une flèche (AAA.~LS) en
position 15. Des séquences non alignées de formes très divergentes
de gènes épissés, hOPBaB (OPB2adHOMSA) et hOBPby
(OBP2bgHOMSA) ont été ajoutées au bas de l'alignement après
l'analyse.
FIGURE 6 : Analyse RT-PCR
(A) Détection des produits RT-PCR LCN 1, LCN lb, LCN 1c
avec leurs sondes spécifiques, et (B) Détection des produits RT-PCR
hOBPIIa et hOBPIIb avec leurs sondes spécifiques. (C) ARN G3PDH
contrôle. Les tailles sont indiquées en pb.
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FIGURE 7 : Localisation tissulaire des ARNm hOBP
Des sections du méat moyen (A,B), des cornets (C,D), de la
prostate (E,F), des canaux déférents (G,H), des glandes mammaires
(I, J) ont été hybridées à des ribosondes de hOBP marquées à la
digoxigénine-11-UTP. L'hybridation avec une ribosonde hOBP sens
n'a pas révélé de signal (B,D,F,H, J). Un signal d'hybridation
spécifique est obtenu avec une ribosonde antisens (A,C,E,G, I). Les
flèches indiquent des structures différentes : AC : cellules
acineuses, EC : cellules épithéliales, GC : cellules glandulaires, SD
canal sécrétoire et L : lumen (X200).
FIGURE 8 : Arbre de distance phylogénétique des lipocalines
des vertébrés.
Les abréviations usuelles des lipocalines ont été employées.
Après le symbole "_" sônt indiquées les trois premières lettres du
genre suivies des deux premières lettres de l'espèce.
FIGURE 9 : Schéma de l'évolution de la sous-famille de gène
LCN1-OBPII au cours de l'évolution.
Les boîtes indiquent les exons disposés sur une ligne
représentant l'ADN génomique. Les « // » entre les lignes indiquent
que les loci ne sont pas consécutifs, sans qu'il soit possible de
déterminer l'ordre. La large croix sous le symbole « ? » illustre un
événement de duplication partielle ou de complète duplication avec
une délètion génomique ultérieure pour le locus LCN 1c (choix
indiqué par le symbole « * »). La croix plus petite indique
l'élimination du septième exon qui semble être spécifique de
l'homme à cause des nombreuses séquences répétées Alu
présentent dans cette région génomique et parce que le rat a deux
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gênes VEGP. Le symbole « ** » marque l'étape de recrutement
d'exons basée sur les données présentes et celles de la littérature ;
cette étape a pu apparaitre à n'importe qu'elle moment après les
duplications des loci et a pu étre séquentielle.
FIGURE 10 : Analyse par RT-PCR dans la sphère orale et la
sphêre génitale de l'expression des autres lipocalines humaines
connues.
Déimition de nouvelles fonctions OBP et VEGP pour les
protéines RBP (retinol-binding-protein) et ApoD (apoliporotéine D).
FIGURE 11 : Etude de l'anticorps polyclonal dirigé contre les
protêines hOBPII.
La protéine de fusion est déposée dans les puits 1 et 3. Un
échantillon de mucus nasal humain est déposé dans les puits 2 et
4. Les protéines contenues dans les puits 1 et 2 ont été révélées par
coloration au bleu de Coomassie. L'anticorps hybridé sur la
membrane obtenue par Western-blotting révèle spécifiquement la
protéine GST-hOBPIIb entre 30 et 42 kDa (puit 3) et les hOBPIIa et
hOBPIIb (puit 4) de 18 kDa dans le mucus nasal humain.
FIGURE .12 : Immunohistochimie sur les tissus de l'appareil
olfactif.
Une forte immunoréactivité est repérable sur la coupe de
septum (coloration verte, A) sur les deux coupes de cornet (C et D)
et sur la coupe de méat moyen (F). Les témoins négatifs réalisés
pour le septum (B) et pour le cornet (E) et pour le méat moyen (G)
ne montrent aucune réactivité. Les noyaux des cellules sont repérés
par une coloration au DAPI (coloration bleue). Les grossissements
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utilisés sont de X 100 pour les coupes A, B, C, E et G et de X 200
pour les coupes D et F.
FIGURE 13 : immunohistochimie sur tissus de la sphère orale
Ces deux tissus, glandes lacrymales (A, B) et glandes de Von
Ebner (E, F) montrent une forte immunoréactivité en comparaison
des résultats obtenus grâce au sérum pré-immun (C pour les
glandes lacrymales et D pour les glandes de Von Ebner).
Grossissement X200.
FIGURE 14 : Immunohistochimie sur les glandes mammaires et
poumon
Une forte immunoréactivité est visible sur les coupes de
glandes mammaires (A et B) comparé au témoin négatif ( C ) réalisé
grâce au sérum-pré immun. Une forte immunoréactivité est
également observée sur les coupes de poumon (E et F) comparée
toujours au témoin négatif (D). chaque observation est faite à un
grossissement X 100 pour A et C et à un grossissement X 200 pour
B, D, E et F.
Figure 15: Mise en êvidence des protéines hOBPII dans
différentes structures nasales : Cornet (A : 200x, B : 400x),
Septum (C : 300x, D 600x), Méat moyen (E : 400x, F : 600x)
Détection des protéines hOBPII avec un sérum polyclonal de lapin
révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. AC : cellule
acineuse sécrétrice, P : précipité de DAB (détection hOBPII)
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Figure 16 : Mise en évidence de la protêine LCN 1 dans
différentes structures nasales : Cornet (A : 200x, B : 500x),
Septum (C : 100x, D 500x), Mêat moyen (E : 200x, F : 600x)
5 Détection de la protéine LCN 1 avec un sérum polyclonal de lapin
révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. AC : cellules
acineuse sécrétrice, P : précipité de DAB (détection LCN1)
Figure 17: Mise en évidence de la protéine ApoD dans
10 différentes structures nasales : Cornet (A : 500x, B : 700x),
Septum (C : 300x), Méat moyen (D : 400x)
Détection de la protéine ApoD avec un anticorps monoclonal de
souris révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. AC
cellule acineuse sécrétrice, P : précipité de DAB (détection ApoD)
Figure 18: Mise en évidence de la protêine hOBPII dans
différentes structures de la sphère orale : Glande Lacrymale (A
200x, B : 600x), Glandes de Von Ebner (C : 100x, D : 400),
Poumon (E : 200x, 800x)
Détection de la protéine hOBPII avec un serum polyclonal de lapin
révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. AC : cellule
acineuse sécrétrice, P : précipité de DAB (détection hOBPII)
Figure 19: Mise en évidence des protéines hOBPII dans
différentes structures placentaires : villosités choriales (A
300x, B : 800x), Membrane Amniotique (C : 800x), Cordon (D
600x)
Détection des protéines hOBPII avec un serum polyclonal de lapin
révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. L : lacune
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(contient sang maternel), C : capillaire foetal, Am : membrane
amniotique, E : cellules epitheliales dérivées de l'ectoblaste extra-
embryonnaire, MB : membrane basale, M : couche
mesenchymateuse, P : précipité de DAB (détection hOBPII)
Figure 20 : Mise en évidence de la protéine LCN 1 dans
différentes structures placentaires : villosités choriales (A
200x, B : 800x), Membrane Amniotique (C : 600x), Cordon ~D
500x)
Détection de la protéine LCN 1 avec un serum polyclonal de lapin
révélé par une activité peroxidasique détectê par DAB. L : lacune
(contient sang maternel), C : capillaire foetal, Am : membrane
amniotique, E : cellules epitheliales dérivées de l'ectoblaste extra
embryonnaire, MB : membrane basale, M : couche
mesenchymateuse, P : précipité de DAB (détection LCN1)
Figure 21: Mise en évidence de la protéine ApoD dans
différentes structures placentaires : villosités choriales ~A
100x, B : 500x), Membrane Amniotique (C : 400x), Cordon (D
400x~
Détection de la protéine ApoD avec un anticorps monoclonal de
souris révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. L
lacune (contient sang maternel), C : capillaire foetal, Am
membrane amniotique, E : cellules epitheliales dérivées de
l'ectoblaste extra-embryonnaire, MB : membrane basale, M : côuche
mesenchymateuse, P : précipité de DAB (détection ApoD)
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EXEMPLES
EXEMPLE 1 : MATERIELS ET METHODES
1.A. Banque de cosmides du chromosome 9 humain
Une copie de la banque de cosmides spécifiques du
chromosome 9 humain LL09NCOlP construite par le Dr. J.
Allmeman (Biochemical Sciences Division, Lawrence Livermore
National Laboratory, Livermore, CA USA) sous l'égide du National
Gene Library Project supporté financièrement par le département
américain de l'Énergie a été utilisée. Le criblage de la banque et
l'analyse des clones ont été réalisés tel que décrit précédemment
(Lacazette et al., 1997).
1.B. Clonage et analyse de séquence
Une banque Lambda gt 11 d'ADNc de testicules humains
(Clontech) ( 107 p.f.u.) a été amplifiée par 30 cycles de
polymérisation en chaîne (PCR) (94°C 45 sec, 54 °C 45 sec,
72°C
lmin 30 sec) avec l'amorce oIiEST58 CCTGCAGGTACATGAGCTTCC
et des amplimères 5' ou 3' de criblage d'inserts situés sur les bras
du vecteurs Lambda gt 11. Une PCR nichée a ensuite été réalisée
avec oIiEST26 CGCTGTATTTGCCAGGCTCC et des oligonucléotides
spécifiques du bras du vecteur. Les produits PCR ont été sous
clonés dans le vecteur pGEM-T(r), ce qui a permis d'obtenir
l'extrémité 5' des ADNc du gène hOBPII.
Les séquences obtenues en utilisant l'oligonucléotide
standard pGEM-T (r) et en utilisant un mixe réactionnel prêt à
l'emploi de séquençage à base de colorant terminateur (Applied
Biosystems) ont été séparées par électrophorèse en utilisant un
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séquençeur automatique ABI PRISM 377 (Perkin Elmer) puis ont
été analysées avec le logiciel Sequence Navigator 1Ø1. (Perkin
Elmer). Des clones d'ADNc pleine longueur de hOBPIIa (hOBPIIa a,
hOBPIIa (3, hOBPIIa 8, hOBPIIa y) et hOBPIIb (hOBPIIb a, hOBPIIb
a, hOBPIIb y) ont été obtenus à partir de la RT-PCR par purification
des bandes d'intérêt selon les instructions du fabricant (gel
extraction kit de Qiagen) ou en sous-clonant dans un vecteur
pGEM-T(r) les produits de la PCR nichée pour les formes
alternatives faiblement exprimées.
1C. Analyse par RT-PCR
Des échantillons de tissus ont été collectés chez des
individus caucasiens âgés de 45 à 55 ans en accord avec la
réglementation française en vigueur. L'ARN total est extrait selon
une méthode en une seule étape utilisant le réactif ARN NOW°
selon les instructions du fabricant (Biogentex). 5 ~.g d'ARN total ont
été rétro-transcrits dans un volume final de 20 ~1 en utilisant 0,5
ng d'oligonucléotide
GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT avec le système de
préamplification Superscript° (Gibco BRL). Trois ~1 de ces réactions
sont ensuite utilisés pour les PCR suivantes. L'expression des
ARNm spécifiques a êté déterminée par PCR en utilisant : les
amorces TL : CCTCTCCCAGCCCCAGCAAG et AP
GACTCGAGTCGACATCG pour les gènes de type LCN 1 (LCN 1,
LCNlb, LCNlc) et pour les gènes de type hOBPII, les amorces DE
CGCCCAGTGACCTGCCGAGGTC, et FI
CTTTATTTGGAGTCAGGTGGGTG. Comme contrôle de qualité des
ARN, les amorces G3PDH 1 : CTCTGCCCCCTCTGCTGATG et
G3PDH2 : CCTGCTTCACCACCTTCTTG du gène G3PDH ont été
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utilisées ; le gène G3PDH est considéré comme étant
constitutivement exprimé dans tous les types cellulaires. 32 cycles
de PCR (94° C 45 sec., 54° C 45 sec., 72° C 2 min. 30
sec.) ont été
réalisés et les produits d'amplification ont été séparés sur gel
d'agarose à 1%. L'ADN est transféré sur une membrane Hybond
N+~.
Pour la dêtection de l'expression des différents gènes,
plusieurs oligonucléotides spécifiques des gènes respectifs ont été
synthétisés
- oILCN 1 : GACTCAGACTCCGGAGATGA,
- oILCNlb : AACTCAGACACCAGAGATGA,
- oILCN 1c : GACTCAGATCCCGGAGATGA,
- 015 : CCAGGAGGGACCACTACA spécifique du gène hOBPIIb,
- 014 : CCGGGACGGACGACTACG spécifique du gène hOBPIIa,
- G3PDH3 : CTCATGACCACAGTCCATGC,
Les oligonucléotides sont marqués au y32P-ATP en utilisant
de la T4 kinase (Applied Biosystem) ; les hybridations des
oligonucléotides marqués sont réalisées à 42° C. Le lavage final est
réalisé dans une solution de 0,1 X SSC, 0,1% SDS à 48° C pendant
20 min. La spécificité des réactions d'hybridation des
oligonucléotides est contrôlée en utilisant des échantillons d'ADN
cosmidique digéré (p233G2 pour LCN1 et hOBPIIa, P19E7 pour
LCNlb et hOBPIIb, P181A9 pour LCNlc) et chargés sur le gel avec
des produits de RT-PCR.
1.D. Génoty~aage et analyse de liaison
Le génotypage est réalisé par des réactions PCR en utilisant
100 ng d'ADN génomique provenant de 8 familles de référence du
CEPH et utilisant les oligonucléotides oli9
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TGTTCGGGAACGCAGCTT et oli l Obis
TGCCGCTGTCCCCACGTCGG. Les paramètres du thermocycleur
consistent en un cycle initial à 94° C pendant 10 min suivi par 30
cycles à 94° C pendant 30 s, 55° C pendant 30 s et 70° C
pendant
5 45 s puis en une étape d'élongation finale de 10 min à 70° C. Les
produits PCR sont ensuite analysés sur un gel d'agarose à 3%. Les
informations concernant les marqueurs du chromosome 9 peuvent
étre obtenues à l'adresse Internet suivante (hTTP://galton.ucl.ac.uk) ;
les analyses ont été réalisées en utilisant les outils d'études de
10 liaison préalablement décrites dans Lacazette et al. ( 1997). Les
haplotypes sont reconstruits manuellement selon les évènements
de recombinaison préalablement décrits dans la famille 1362
(Attwood et al., 1994).
15 1.E. Prédictions de structures secondaires
Un alignement multiple des protéines lipocalines pour
lesquelles les structures cristallographiques ont déjà été dêcrites
(Monaco et al., 1992 ; Spinelli et al., 1998) avec les protéines
hOBPIIa et hOBPIIb a été obtenu en utilisant le logiciel Clustalx
20 (ftp.infobiogen.fr). Les structures secondaires putatives ont été
déterminées avec le programme DSC (Discrimination of protein
Secondary structure Class) développé par R.D. King et M.J.E.
Sternberg (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/dsc-simple.html). Les
structures secondaires des protéines correspondantes aux formes
25 alternativement épissées sont supposées identiques aux formes
traditionnelles avant le décalage du cadre de lecture; après ce
décalage la prédiction de structure est effectuée avec une seule
séquence et est réalisée en utilisant le logiciel Predator
(http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin).
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1.F. L'analyse phylogénétique
Les protéines lipocalines dont les séquences sont connues
dans leur totalité ont été alignées trois fois consécutivement en
utilisant le logiciel Clustalx (ftp://ftp.inforbiogen.fr). Des distances dans
l'arbre phylogénétique ont été calculées avec Clustalx et dessinées
avec Njplot.
1.G. Hybridation in situ .
Des coupes sériées réalisées au cryostat (8 ~m d'épaisseur)
sont collectées sur des lames SuperFrost° Plus (Menzel Glaner) et
stockées à - 80° C. Des sondes ARN antisens et sens sont obtenues
selon les techniques standard en utilisant la T7 ou la SP6
polymérase à partir d'une matrice obtenue par digestion avec des
enzymes de restriction NcoI ou PstI du clone cDNA de phOBPIIaP2
et en utilisant du DIG-11-UTP (Boehringer Mannheim) (la longueur
de la sonde est approximativement de 150 nucléotides). Les
matrices digérées par PstI et transcrites par l'ARN polymérase de T7
correspondent à la sonde antisens et les matrices digérées par NcoI
transcrites par l'ARN polymérase SP6 correspondent à la sonde
sens. Des sections de tissus sont fixées dans du paraformaldéhyde
4% pendant 15 min puis rincées pendant 5 min dans du PBS 2X.
Après acétylation (2 x 5 min dans un tampon de triéthanolamine
(TEA) pH 8, contenant 0,25% v/v d'anhydride acétique), les sections
tissulaires sont préhybridées à 60° C pendant 15 min dans de la
formamide 50%/ 1X SSC. Les sondes maxquées sont appliquées sur
chacune des sections dans 50 ~1 de tampon d'hybridation (50%
formamide, 1X Denhardt's, 500 ug/ml total d'ARNt, 10% de
Dextran sulfate, 10 mM de dithiotréitol). Les sections sont
recouvertes puis incubées dans des chambres humides à 50° C
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pendant la nuit. Après hybridation, les lames sont immergées-à 55°
C dans un tampon de lavage (50% formamide, 1X SSC) pendant 2
heures. Chaque lame est ensuite rincée 2 fois 5 min dans du 2X
SSC à température ambiante, puis traitée pendant 30 min avec 10
mg/ml de RNase à 37° C, et enfin immergée 2 heures à 55° C dans
une solution de lavage (50% formamide, 2X SSC). Les lames sont
ensuite placées pendant 15 min â 55° C dans du 0,1 X SSC. La
détection immunologique est réalisée en utilisant un anticorps anti-
DIG conjugué à la phosphatase alkaline (fragments Fab) selon le
protocole de Boehringer Mannheim. Les sections sont examinées à
des grossissements différents utilisant un microscope Axiophot
(Zeiss).
1.H. Obtention d'un anticorps polpclonal dirigé contre
les Qrotéines hOBPIi
Deux cent cinquante u1 de protéines de fusion ont été
fournis à la société Agro-Bio pour la production d'anticorps. Des
lapins (New Zealand White SPF) sont injectés aux jours 0, 14, 28 et
42. Les serums sont prélevés aux jours 0, 35, 49 et 63. Afin de
tester l'anticorps, la protéine de fusion est déposée dans les pistes 1
et 3 (Figure 11), alors que du mucus nasal humain est déposé dans
les pistes 2 et 4. Les pistes 1 et 2 ainsi que la piste correspondant à
l'échelle de poids moléculaire, correspondent à une révélation par le
bleu de Coomassie. Les pistes 3 et 4 correspondent à une détection
des protéines reconnues par l'anticorps à l'aide de la technique de
Western blot. Les pistes 1 et 3 montrent la présence d'une série de
protéines recombinantes tronquées entre 30 et 42 kDa issues d'une
synthèse peu efficace due à la présence de nombreux codons raies
chez la bactérie au sein de la sèquence de hOBPIIb. Toutefois cette
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production de protéine recombinante fût suffisante pour produire
un anticorps polyclonal de bonne qualité comme indiqué par la
révélation dans la piste 4 correspondant au mucus nasal, d'une
bande de 18 kDa spécifique des protéines hOBP«.
1.I. immunohistochimie
1.I.1. Des coupes sériées de 8 ~,m de différents tissus sont fixées
au para-formaldéhyde (5min), et rincées trois fois au PBS x 1 ( 15
min) puis incubées 30 min dans une solution 3% de BSA en PBSxl,
. avant d'être incubées durant la nuit en présence de l'anticorps anti-
protéine de fusion en solution PBSxl. Après trois rinçage en PBSxl
( 15 min), un anticorps anti-IgG de lapin couplé au FITC (coloration
verte en fluorescence) en solution de PBSx 1 est placé 3 heures au
contact des lames. Après un rinçage en PBSxl, une solutiôn de
I 5 DAPI ( 100 ng / ~,1 en PBSx 1 ) est appliquée pendant 10 min (contre
coloration des noyaux cellulaires en bleu). Après trois rinçages en
PBSx 1 ( 15 min), les lames sont montées dans de l'eau glycérinée
(50/50). L'analyse est réalisée en présence de filtres DAPI et FITC à
l'aide d'une caméra CDD en utilisant un temps d'intégration entre 4
et 32 ms.
1.L2. Les tissus sont congelés à -80°C en présence d'OCT. Des
coupes sériées de 7micromètres sont réalisées à l'aide d'un
microtome. Les tissus sont ensuite fixés à la Para-Formaldéhyde
4% en PBS. Les lames sont incubées pendant 10 min dans une
solution de méthanol en présence de 4,5% de H2O2 , puis rincées
trois fois en PBS pendant 5 min Après une incubation pendant 30
min dans une solution de 3% d'albumine de sérum de boeuf, le
premier anticorps (dilué au 1/350) est incubé une nuit à
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température ambiante (Anticorps polyclonaux de lapin pour hOBPII
et LCN1, et monoclonal de souris pour ApoD). Puis, après trois
rinçages de 15 min en PBS, le deuxième anticorps (dilué au 1/300)
(anti-lapin pour hOBPII et LCN 1, et anti-souris pour ApoD) est
incubé 3 h à température ambiante. Après trois rinçages en PBS
pendant 15 min, une révélation à la péroxidase par le DAB est
réalisé pendant 2 à 10 min, à l'aide du kit <~ Vector ». Les lames sont
ensuite rincées à l'eau, et contre colorées à l'hématoxyline de Mayer
pendant 2 min. Après deux rinçages à l'eau, les lames sont
déshydratées par bassinage successif dans des solutions d'éthanol
70°, 95°, 100°,100°, et finalement deux bains de
toluène. Les lames
sont ensuite montées en baume du Canada, et observées à l'aide
d'un microscope Zeiss.
EXEMPLE 2 : IDENTIFICATION D'UN GENE HOMOLOGUE A
LCN 1 LOCALISE SUR LE CHROMOSOME 9
HUMAIN
L'identification de l'ADN complémentaire de LCN 1 codant
pour la lipocaline des larmes humaines (Lassagne et Gachon, 1993)
a préalablement été rapportée, ainsi que la localisation du gène sur
.le chromosome 9q34 (Lassagne et al, 1993 ; Lacazette et al, 1997).
Les deux gènes codant pour les protéines des glandes de von Ebner
1 et 2 (Kock et al, 1994) correspondent aux protéines homologues
de LCN 1 chez le rat ; ceci pose la question de savoir s'il existe
d'autres gènes codant pour une protéine LCN 1 dans le génome
humain. Les expériences d'hybridation in situ (Lassagne et al, 1993)
ainsi que les analyses avec des hybrides somatiques (Lassagne et
al, 1995) indiquent que, s'ils existent, ces gènes humains
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additionnels doivent se trouver localisés dans la région
chromosomique 9q34.
Une banque de cosmides spécifiques du chromosome 9
humain (LL09NP01) a été criblée avec la sonde d'ADNc LCN1
5 humaine ; 26 cosmides ont été identifiés ; ceux-ci ont été digérés
par EcoRI ou PvuII, puis hybridés successivement avec l'ADN de
LCN1 et différents oligonucléotides (figure 1).
Les cosmides sont divisés en 3 groupes. Le premier groupe
(clones P32H3, P41B5, P63B6, P92H20, P109C6, P145H6, P1~5B4,
10 P233G2, P233F2, P265D4, et P276H8) correspond aux cosmides
contenant une séquence du gène LCN 1 préalablement isolé
(numéro d'accession : L14927) formé par 7 exons (Holzfeind et Redl,
1994). Le second groupe (clone P19E4, P19E7, P42H9, P98H5 et
P 142H8) correspond à la séquence LCN 1 b homologue à LCN 1 (clone
15 P19E4) (numéro d'accession : Y10826) depuis le promoteur
jusqu'au 6ème exon puis qui diverge ensuite. Un troisième groupe de
cosmides (clone P110C1, P174E4, P174E5, P181A9, P181B6,
P211A7, P238C6 et P291E1) contient une région LCNlc, établi à
partir du séquençage partiel du clone P181A9 (numéro d'accession
20 Y 10827), qui est fortement homogue à LCN 1 seulement à partir du
promoteur jusqu'à l'exon 2. Ainsi, LCN 1 est le seul gène qui
possède le 7eme et dernier exon. De plus, les boites TATA sont
dégénérées dans les promoteurs des gènes LCNlb et LCNlc.
EXEMPLE 3 : IDENTIFICATION DE DUPLICATIONS
GENOMIQUES CONTENANT LES GENES DE
LIPOCALINES ET CARTOGRAPHIE DE LA
REGION CHROMOSOMIQUE 9Q34
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Au cours de la période d'identification de la famille de gène
LCNl, un vaste projet de cartographie physique a conduit à
l'identification de contigs de cosmides couvrant partiellement la
région chromosomique 9q34 (Nahmias et al, 1994, Van
Slegtenhorst et al., 1995, Hornigold et al, 1997) ; le séquençage des
clones correspondants a été réalisé par un groupe du Massachusset
Institute of Technology (Boston, USA).
Des analyses de comparaison de séquences dans les
banques de données de LCN 1, LCN 1 b et LCN 1c ont révélé des
homologies fortes entre le gène LCN 1 préalablement décrit (numéro
d'accession L14927) et les trois séquences cosmides : P161A1 ayant
le numéro d'accession AC002098, P203H 12 avec le numéro
d'accession AC000396 et P161G2 avec le numéro d'accession
AC002106.
Une analyse très fine notamment de la région 3' des gènes
LCN 1 a révélé que la séquence LCN 1c correspondait au clone ayant
le numéro d'accession AC002106, LCNlb au numéro AC002098 et
LCN 1 au numéro AC000396 ; il existe cependant une insertion de
60 paires de base à la position 12360 du clone ayant le numéro
d'accession AC000396 par rapport à celui ayant le numéro L14927.
Des analyses complémentaires ont révélé que ces séquences sont
homologues sur une région beaucoup plus large que les gènes
LCN 1. Comme illustré par les analyses en dot plot (figure 2), ces
trois cosmides correspondent à des régions génomiques dupliquées
; les cosmides P 16 1A 1 (AC002098) et P203H 12 (AC000396) sont
homologues sur la totalité de leurs séquences ; le cosmide P161G2
(AC002106) n'est homologue à la séquence uniquement pour des
séquences situés en amont de l'intron 3 du gène LCN 1.
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Les positions relatives de ces régions dupliquées du
chromosome 9 humain ont été analysées. Les résultats ont été
comparés avec la carte physique établie dans le cadre du projet de
cartographie physique par des analyses de restriction des cosmides
(Hornigold et al, 1997) en utilisant la même banque LLN09NCOlP.
Approximativement les mêmes cosmides ont été trouvés dans les
cieux recherches pour le locus LCN 1c ; la. comparaison de séquence
. . du .cosmide .P181A9 révèle que son extrémité T3 ~contiPnt le gène
Surf 5 (figure 1). De plus, AC002106 est localisé dans un contig de
.10 séquence entre ABO et le locus Surfeit confirmant la localisation de
LCNlc. P161A1 et P203H12 ont des localisations moins précises en
utilisant les données de Hornigold.et de ses collaborateurs à cause
de la limite de la stratégie de cartographie de restriction pour les
régions dupliquées. P203H 12 (AC000396) semble correspondre au
gène LCN 1 qui a été ' préalablement localisé près du marqueur
D9S 1826 (Lacazette et al. 1997) à l'exception d'une insertion de 60
paires de bases. .
Pour tester si P203H-12 peut correspondre à une:4ème région
dupliquée, la région a été testée par PCR sur de l'ADN génomique
de 150 individus non apparentés en. utilisant des amorces
spécifiques pour AC000396 et L14927. Une bande vinique
correspondant à la longueur 'de la séquence AC000396 a été
détectée (donnée non montrée) prouvant ainsi que ~. P203H 12
contient le gène LCN 1 préalablement décrit. Le locus LCN lb n'a pas
été positionné précisément -dans la région comme il est démontré
par le' fait que les extrémités. AC00209$ ainsi que les extrémités des
cosmides contenant LCNlb ne détectent aucune séquence
homologue dans les banques de données.
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L'analyse des séquences a permis d'identifier, un mini-
satellite putatif à la position 3177-3724 du cosmide correspondant
à AC002098 (Figure 1) ; un pôlymorphisme rare a ainsi été mis en
évidence dans une population de 20 individus non apparentés (PIC
- 0,05). Ce nouveau marqueur polymorphe n'est informatif que
dans la seule famille 1362 sur les 8 familles de référence du CEPH
testées.
L'analyse de liaison a révélé des lod-scores à deux points
supérieurs à 3 à téta = 0 pour les marqueurs D9S275 et D9S 1818.
La reconstruction de l'haplotype a confirmé la localisation du gène
LCN 1 b entre les marqueurs D9S 1811 et D9S67 dans le
chromosome 9q34 (Figure 1).
EXEMPLE 4 : IDENTIFICATION DE DEUX NOUVEAUX GENES
DE LIPOCALINE
Les analyses de séquences ont révélé des données nouvelles.
La comparaison de AC002098 à la banque de données a
révélé des similarités entre cette sêquence et les gènes de
lipocalines. En plus de la région 21000 à 27000 qui contient le gène
LCNlb, la région autour de la position de 2150 contient des
séquences présentant des similitudes avec les séquences codant
pour les protéines de liaison aux odeurs de rat de type II, des
lipocalines des larmes ainsi que pour l'EST AA460385.
Parallèlement, la comparaison de la séquence AC000396 à
la banque de données a révélé en plus de la région 11100 à 17100
contenant le gène LCN 1, des similitudes pour le méme groupe de
séquences dans la région 36600 à 37800.
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L'EST AA460385 exprimée dans les testicules humains
correspond à 4 exons du nouveau gène de lipocaline présent dans
le clone P161A1 (AC002098). Un exon putatif de 50 paires de bases
similaire à la séquence EST est également présent à l'extrémité du
clone P203H 12 (AC000396).
Les inventeurs ont donc conclu a l'existence d'un nouveau
gène de lipocaline à une position distale de LCN 1 b. Les inventeurs
ont émis l'hypothèse, que suite à une duplication génomique, un
second gène orthologue au gène codant pour l'EST est présent dans
la région 3' de LCN 1.
Le séquençage du cosmide P233G2 contenant cette région
(Figure 1) avec des oligonucléotides définis à partir d'EST a en effet
révélé la présence d'un autre gène de lipocaline à un locus distant
de 20 kb distal du gène de LCN 1. Pour identifier les premiers exons
des deux nouveaux gènes, des PCR nichées sur des clones cDNA
provenant d'une banque de testicules ont été réalisées entre les
oligonucléotides localisés dans la région 5' de l'EST et les bras du
vecteur. Les produits PCR sont clonés et leur séquence a révélé
trois exons additionnels d'après la séquence génomique (Figure 1).
Une boite TATA est présente en amont du premier exon dans les
deux cas (Figure 3). Les deux ARNm, hOBPIIa correspondant au
gène localisé en aval de LCN 1 et hOBPIIb localisé en aval de LCN lb
(Figures 3 et 4), sont identiques à 97,5% et 63 % à ceux
correspondant au gène LCNl. Les organisations intron/exon de ces
deux gènes sont consistantes avec la famille des lipocalines.
De plus, les séquences protéiques déduites ( 170 amino
acides) confirment l'appartenance à la famille des lipocalines. Les
deux protéines matures putatives hOBPIIa (MW = 17,8 kDa) et
hOBPIIb (MW - 18,0 kDa) sont identiques à 89%. Ces ~ deux
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nouvelles protéines possèdent un peptide signal putatif de 15
amino acides (Figure 5), les résidus conservés GXWY à la position
27 à 30 et deux cystéines susceptibles d'étre impliquées dans un
pont disulfure (position 74 à 166).
5 Cependant, les comparaisons de séquences par paire avec
les autres lipocalines indiquent une faible conservation des résidus
acides aminés (15 à 25%) à l'exception de TL/VEG humain codé par
le gène LCN 1 (valeur moyenne 43 % sur 155 amonoacides) et
l'OBPII de rat (valeur moyenne 45,5 %). Par ailleurs, les points
10 isoélectriques calculés de hOBPIIa et de hOBPIIb sont
respectivement de 7,85 et de 8,72 alors que ceux des lipocâlines
sont acides (aux environs de 4,5) à l'exception de l'OBPII de rat (PI =
9,01). La prédiction des structures secondaires des protéines
hOBPIIa et hOBPIIb avec le logiciel DSC en effectuant des
I S alignements multiples' ~ avec les séquences de lipocalines de
structures connues indique la présence de 8 brins de feuillets (3
antiparallèles pouvant permettre la formation d'un calice suivi par
une hélice a et un feuillet (i final en accord avec les données
connues des structures des lipocalines (Figure 5).
EXEMPLE 5 : ETUDE DE L'EXPRESSION DES GENES DE
LIPOCALINES IDENTIFIES
Pour préciser si LCN lb, LCN 1c, hOBPIIa et hOBPIIb sont
des gènes exprimés, des analyses de RT-PCR ont été réalisées sur
18 tissus humains différents connus pour produire des lipocalines
(Figure 6).
Deux couples d'amorces ont été synthétisés ; l'un reconnaît
les ARNm de type LCN 1 et l'autre les ARNm de type hOBPII.
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L'hybridation des oligonucléotides spécifiques des gènes sur des
membranes sur lesquelles sont immobilisés les produits de RT-PCR
après transfert par la technique de Southern, puis le sous-clonage
des produits hybridés ont révélés que LCNlb et LCNlc ne sont
exprimés dans aucun des produits testés, alors que les ARNm de
LCN 1 sont détectés dans la glande lacrymale, les glandes
sudoripares, les glandes de von Ebner, le septum nasal,
l'épithélium du cornet nasal , tout comme le placenta et les glandes
mammaires (Figure 6A). Ces données et les informations de
séquences qui indiquent que la boite TATA et le dernier exon ont
été perdus permettent d'affirmer que LCNlb et LCNlc sont des
pseudogènes qui ne participent pas à la formation des protéines
LCN 1 humaines.
A l'inverse, les gènes hOBPIIa et hOBPIIb sont exprimés, ce
qui confirme leur détection précédente dans les banques d'ADNc.
De manière surprenante, bien que les deux protéines hOBPIIa et
hOBPIIb soient très similaires sur la totalité de leur séquence y
compris dans la région promotrice de 1,5 kb, leur profil
d'expression sont différents (Figure 6B). La protéine hOBPIIa est
fortement exprimée dans le septum nasal, le méat moyen, le cornet
nasal, les testicules et le placenta et plus faiblement dans les
glandes mammaires, les glandes lacrymales, les glandes
sudoripares, les glandes de von Ebner et le poumon. A l'inverse, la
protéine hOBPIIb est exprimée de manière prédominante dans la
prostate, les testicules et les glandes mammaires et plus faiblement
dans les glandes sous-maxillaires, le septum nasal et le méat
moyen.
De plus, les analyses de RT-PCR ont révélé l'existence
d'un épissage alternatif du produit de transcription du gêne
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hOBPIIa et du gène hOBPIIb qui génère respectivement quatre et
trois ARNm (Figures 3, 4, 5 et 6).
La transcription du gène hOBPIIa génère au moins quatre
ARNm qui codent pour quatre protéines différentes; le premier
ARNm code pour la protéine hOBPIIaa qui correspond à la protéine
hOBPIIa décrite précédemment. Dans le gène hOBPIIa, trois sites
accepteur d'épissage différents ont été identifiés pour l'exon 5
(figure 3 et 4) formant ainsi deux autres variants d'épissage. Un
premier vaxiant d'épissage présente un site accepteur pour l'exon 5
localisé 49 pb avant le précédent (exon 5b) ; ceci génère un ARNm
de 725 nucléotides qui code pour la protéine hOBPIIa)3 de 146
aminoacides. Cette protéine est identique jusqu'au 8eme feuillet (3
putatif puis différente ensuite avec seulement 16 aminoacides
additionnels. Un second variant d'épissage présente un site
accepteur pour l'exon 5 localisé 65 pb avant le précédent (exon 5c) ;
ceci génère un ARNm de 741 nucléotides qui code poux une
protéine hOBPIIay de 228 aminoacides. Cette protéine possède les
huit premiers feuillets a putatifs identiques à ceux de hOBPIIaa
puis est différente dans la région C-terminale (figure 5) à cause
d'un décalage de cadre de lecture généré par cet événement
d'épissage alternatif ; la structure de cette région C-terminale
prédite par le logiciel Predator est une longue région coudée
contenant une Sème feuillet )i.
Dans le cas du gène hOBPIIb, en plus de l'ARNm hOBPIIba
préalablement décrit, un exon surnuméraire de 106 pb (exon 3b)
entre les précédents exons 3 et 4 a été identifié (figure 3). Cet ARNm
plus long (782 nucléotides) code pour une protéine hOBPIIb(i de
165 amino-acides. Du point de vue de la structure protéique,
hOBPIIb(i est identique à hOBPIIba jusqu'au Sème feuillet (i putatif
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puis diffère ensuite à cause d'un décalage du cadre de lecture. Les
prédictions des logiciels informatiques indiquent que le motif
ALWEALAIDTRLK est une hélice a qui est juste derrière le
cinquième feuillet a. Deux feuillets (3 additionnels peuvent être
présents dans la longue partie C-terminale.
Aucun des variants d'épissage alternatifs pour un gène n'est
détecté symétriquement pour l'autre gène bien que les sites
d'épissage accepteur et donneur putatifs puissent ètre présents
(figure 3). En plus de ces motifs protéiques qui conservent la
structure traditionnelle d'une lipocaline, nous avons démontré,
pour les deux gènes hOBPIIa et hOBPIIb, l'existence d'une faible
quantité d'ARNm ayant subi un épissage alternatif et codant pour
des protéines dont la séquence n'est pas directement liée aux
lipocalines. Des ARNm codant pour hOBPIIaB et hOBPIIby
I S auxquels ils manquent la séquence codant pour l'exon 2 et qui
possèdent respectivement l'exon 5b et l'exon 5 codent pour des
protéines putatives sécrétées de 147 et de 85 amino-acides
respectivement (figures 4 et 5) ; ces protéines divergent des
protéines précédentes à partir du 24èllle amino-acide.
Pour identifier les cellules exprimant les gènes hOBPII, les
inventeurs ont hybridé des sondes ribonucléiques sens et anti-sens
marquées à la digoxygénine sur des sections tissulaires (figure 7).
Les ARNm hOBPII sont détectés dans les cellules acineuses du
méat moyen et des cornets nasaux ainsi que des cellules
épithéliales des cornets ; ceci soutient l'idée que les protéines
hOBPII sont impliquées dans la fonction olfactive. En plus de la
production dans la sphère orale, des ARNm codant pour hOBPII ont
été détectés dans la sphère génitale, notamment dans les cellules
glandulaires de la prostate, dans les cellules secrétrices épithéliales
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du canal déférent. Aucun signal n'a été détecté dans les gonades
mâles, ce qui suggère que l'expression des gènes hOBPII mise en
évidence dans les expériences de RT-PCR correspondait à la
présence de canaux additionnels dans la préparation tissulaire (rete
testis et canaux efférents). En combinant ces résultats de la
détection de l'ensemble des ARNm codant pour hOBPII avec ceux
de l'approche RT-PCR, il est apparu que cinq protéines hOBPII
(hOBPIIaa, hOBPIIaj3, hOBPIIay, hOBPIIba, hOBPIIb(i) sont
sécrétées par les cellules épithéliales des canaux des gonades
màles, ainsi que des cellules acineuses du méat moyen et des
cornets nasaux ; dans ces cellules les ARNm codant pour hOBPIIa
sont hautement prédominant. Seules les deux protéines hOBPIIb
(hOBPIIba et hOBPIIb~3) sont sécrétées par les cellules épithélio-
glandulaires de la prostate et des glandes mammaires.
EXEMPLE 6 : ANALYSE PHYLOGENETIQUE ET
CLASSIFICATION DES LIPOCALINES
L'analyse en dotplot (figure 2) ainsi que les duplications
gênomiques que nous avons révélées indiquent une origine
commune des gènes LCN 1 et hOBPII. Pour clarifier les relations
entre les membres de la famille des lipocalines et pour vérifier que
nous avons identifié le gène humain orthologue de OBPII de rat
(Dear et al., 1991), nous avons construit un arbre de distance
phylogénétique avec les lipocalines des vertébrés (figure 8).
Les inventeurs ont mis en évidence neuf groupes principaux
de lipocalines issus d'un précurseur commun
- la famille de l'apolipoprotéine et de la protéine de liaison au
rétinol (RBP) (groupe 1) ;
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- le groupe de la prostaglandine D-synthase et du précurseur
de lipocaline associé à la gélatinase des neutrophiles (groupe
2) ;
- la sous-famille de l'alpha-1-microglobuline/bikunin
5 (protéine HC) (groupe 3) ;
- la sous-famille orosomucoïde (AlAG, AlAH, AlAI) (groupe 4)
- la sous-famille de la sphère orale 1 (OBPII-type
LCN 1 / VEGP, VNSP I et II, LALP, CanF 1 ) (groupe 5) ;
- la sous-famille de la lactoglobuline (groupe 6) ;
10 - la sous-famille des protéines sécrétées par l'épididyme de
lézard (groupe 7) ;
- la sous-famille la . sphère orale 2 (protéines urinaires
majeures (MUP) de souris) (groupe 8) ;
- la sous-famille de la sphère orale 3 (OBP1, OBPII de sburis,
15 Aphrodisine, Probasine, BD20) (groupe 9).
La présente invention concerne plus particulièrement les
groupes 5, 8 et 9.
Le groupe 5 contient les protéines hOBPII qui sont
étroitement liées d'un point de vue évolutif à l'OBPII de rat. Pris
20 dans leur ensemble, les présents résultats indiquent que les gènes
hOBPII humains sont orthologues du gène OBPII de rat. Ce groupe
contient également les protéines LCN 1-VEGP de différentes espèces.
En prenant en considération l'organisation génomique des gènes
hOBPII-LCN 1, les données de l'arbre illustrent l'événement de
25 duplication (flèche) qui donne naissance aux gènes ancestraux
hOBPII et LCN 1 à partir de leur précurseur lipocaline commun
(Figure 9). Plus récemment, les duplications originelles de la région
de 50 kb contenant hOBPII-LCN 1 (flèche) ont généré chez l'homme
les deux gènes hOBPII et le gène LCN 1 et son pseudogène LCN 1 b.
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La duplication additionnelle ayant donné lieu au pseudogène
LCN 1c est partielle dans le génome humain et ne produit pas de
protéine fonctionnelle et est donc absente du présent arbre. De
plus, les deux protéines VEG du rat sont plus étroitement liées
l'une à l'autre dans l'arbre phylogénétique qu'avec la protéine
humaine LCN 1. La situation est identique pour les deux proXéines
humaines OBPII par rapport à la protéine OBPII de rat. Ces
résultats sont en faveur d'un processus de conversion génique pour
au moins certains gènes des lipocalines. Ceci peut également ètre
corrêlé au fait que ces gènes se situent sur le mème bras
chromosomique.
Le groupe 9 correspond à la famille de la sphère orale 3 et
contient des OBP qui ont déjâ été décrites. La protéine Aphrodisine
a déjà été décrite comme un transporteur de phéromone (Henzel et
al., 1988) et apparaît être orthologue à la protéine OBP1 de rat et
de souris, avec deux gènes OBP 1 paralogues. Finalement, les
lipocalines olfactives produites par les glandes de Bowman de rana
piperas (OLFA RANPI) qui sont considérées comme des
transporteurs d'odeurs potentiels dans le mucus de la grenouille,
ne sont liées à aucun groupe d'OBP putatif (groupes 5, 8 et 9)
suggérant ainsi l'existence d'autres catégories d'OBP.
Certaines lipocalines ont été décrites comme allergènes.
L'allergène majeur du chien, la protéine CanFl majoritairement
exprimée dans les glandes de von Ebner (Konieczny et al., 1997),
apparaît dans l'arbre étre la protéine VEG du chien. Ce résultat
montrant que LCN 1 peut être allergénique, pousse les inventeurs à
proposer l'implication des protéines OBPII dans les processus
allergiques. De la mème manière, l'allergène majeur du cheval
EquC 1 exprimé dans le foie, dans les glandes salivaires (Grêgoire et
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al., 1996) apparaît être orthologue à un membre de la protéine MUP
(groupe 3). L'allergène majeure de la vache (BD20 BOSTA) qui est
présent dans la famille de la sphère orale 2 (groupe 4) est
davantage lié à la probasine. CanF2 principalement exprimée dans
la glande parotide (Konieczny et al., 1997) ne semble pas étre
orthologue à une lipocaline préalablement décrite.
La présente invention a permis de révélé l'existence d'une
duplication génomique au locus q34 du chromosome 9 humain qui
recèle une famille de gène du type LCN 1 ; cette famille comporte
outre le gène LCN 1, précédemment décrit, deux pseudogènes ainsi
que deux gènes hOBPII qui sont paralogues à LCN 1. Les inventeurs
ont révélé que la famille hOBPII-LCN 1 résulte d'événements
consécutifs de duplications génomiques. Les séquences ainsi que
l'organisation génomique ont révélé que les gènes LCN 1 et hOBPII
dérivent d'un ancêtre ~ commun et ont été généré au moyen de
duplication en tandem. Les comparaisons de séquences ont
démontré que les protéines hOBPIIaa et hOBPIIba sont les formes
de protéines des hOBPII les plus proches de LCN l; ceci est
corroboré par le fait que la taille de l'exon 5 de LCN 1 est de 1 ~ 1 pb,
ce qui correspond à la taille de l'exon 5a de la protéine hOBPII et
par le fait qu'aucun eXOn 3b n'ait été trouvé dans la protéine LCN 1.
Des résultats similaires sont obtenus lorsque cette comparaison est
effectuée avec les sept autres exons des lipocalines. Ces données
sont . en faveur d'une acquisition de la diversité des protéines
hOBPII à travers l'intégration de d'ADN génomique additionnel
environnant au niveau du site accepteur d'épissage amont pour
l'exon 5 de hOBPIIa ou à travers le recrutement d'un exon
surnuméraire (exon 3b) pour la protéine hOBPIIb. L'hypothèse d'un
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recrutement d'exons plutôt qu'une réduction de la taille des exons
ou qu'une perte d'exons est plus probable.
Les inventeurs ont montré que les gènes hOBPII et LCN 1
codent pour des protéines impliquées dans différentes fonctions,
comme le montre l'expression de ces gènes à la fois dans la sphère
orale et dans la sphère génitale. De plus, les inventeurs ont montré
par l'analyse phylogénétique (exemple 6) que plusieurs protéines
différentes pouvaient participer à la méme fonction d'odorant-
binding protéine ; ainsi trois sous-familles de lipocalines (les
groupes 5, 8 et 9) correspondant à plusieurs protéines sont
retrouvées exprimées dans la sphère orale et notamment dans les
glandes nasales et buccales.
Cette analyse montrant que plusieurs lipocalines participent
à une même fonction physiologique et qu'une méme protéine
pouvait participer à différentes fonctions, a conduit les inventeurs à
analyser l'expression des autres lipocalines humaines dans
l'ensemble des tissus étudiés (Figure 10). Ceci a conduit à montrer
que le gène codant pour l'apolipoprotéine D est exprimé dans les
glandes du cornet nasal et du méat moyen, en faisant ainsi une
potentielle odorant-binding protéine. De méme la rétinol-binding
protéine (RBP) est exprimée par l'épithélium nasal et pourrait aussi
participer à cette fonction.
Les inventeurs proposent donc d'inclure les protéines ApoD
et RBP dans la famille des OBP humaines et les incluent dans
l'ensemble des revendications portant sur ces OBP humaines.
Les inventeurs ont démontré que la transcription des deux
gènes hOBPII génère de nombreux transcrits alternatifs qui codent
pour des protéines distinctes dont la structure est compatible avec
celle d'un transporteur de ligand hydrophobe.
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Les inventeurs ont mis en évidence l'expression des deux
gènes hOBPII dans la sphère orale (glandes nasales, glandes de von
Ebner, glandes sous-maxillaires, glandes lacrymales, poumon). Les
inventeurs ont également démontré que les protéines hOBPII ~ selon
l'invention sont produites pax les cellules de la sphère génitale ; le
gène hOBPII est majoritairement exprimé dans la prostate, le canal
déférent et les glandes mammaires alors que l'expression du gène
hOBPIIa est restreinte au canal déférent. Les analyses in situ ont
révélé que l'ARNm est produit par les cellules - glandulaires de la
prostate et des cellules sécrétrices épithéliales du canal déférent
supportant l'idée d'une sécrétion des protéines correspondantes
dans le fluide séminal. Les protéines selon l'invention sont donc
susceptibles d'être impliquées dans la fonction de reproduction,
mais également dans toutes les autres fonctions habituellement
attribuées aux lipocalinés.
EXEMPLE 7 : FABRICATION D'UNE PROTEINE
RECOMBINANTE HOBPIIBa DANS UN SYSTEME
PROCARYOTE.
Une PCR sur l'ADN plasmidique d'un clone de hOBPIIba à
l'aide des amorces BIIa/b (5' GTC GGA TCC CTG TCC TTC ACC
CTG GAG G 3'), oligonucléotide sens démarrant 45 bases après
l'ATG initiant la protéine, et XIIb ( 5' GTC CTC GAG GTG TTC GGG
AAC GCA GCT TC 3'), oligonucléotide antisens précédant le codon
stop de la protéine hOBPIIba, a permis d'amplifier la totalité de
l'ADN codant pour la protéine hOBPIIba sécrétée. Les sites de
restriction enzymatique BamH I et Xho I situés aux extrémités des
deux oligonucléotides (bases soulignées), furent utilisés pour un
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clonage directionnel dans un vecteur plasmidique d'expression
pGEX-6P 1, suivi d'une transformation par électroporation ( 1800V,
20052, 25~F) dans une souche bactérienne BL21. La synthèse de la
protéine recombinante est obtenue par ajout d'IPTG à raison de 5
S mM final pendant 3 h dans 250 ml de culture de la souche en
milieu LB contenant 100 ~g/ml d'ampicilline préalablement
incubée à 37°C pendant 2 h. Les cultures centrifugées sont reprises
dans 25 ml de tampon TENGN. Le lysat est soniqué et centrifugé à
nouveau. La protéine de fusion est alors purifiée à l'aide de 4 ml de
10 billes fixant de façon covalente du glutathion insoluble (Sigma) pour
25 ml de surnageant. Après 4 h d'incubation, elles sont lavées avec
3 volumes de NaCI 1M puis par 10 volumes de PBS 1X. L'élution
est obtenue par mise en contact des billes pendant 10 min avec une
solution de glutathion (Glutathion réduit 10 mM, Tris-HCl pH 8,0
15 50 mM).
La quantité de protéine recombinante produite est estimée
par migration en gel de polyacrylamide et coloration au bleu de
Coomassie (Figure 11). La spécificité de l'induction d'une protéine
recombinante est testée par Western blot à l'aide d'un anticorps
20 anti-GST de chèvre (Figure 11), révélé avec un anticorps anti-IgG de
chèvre couplé à la peroxydase en utilisant un kit ECL+plus
(Amersham). La séparation de la protéine de fusion en deux
protéines est obtenue par protéolyse de 100 ug de protéine
recombinante préalablement dialysée à l'aide de 2U de
25 preScissionTM protéase (Pharmacia Biotech) dans 10 ~1 final
contenant du tampon de l'enzyme 1X, pendant 4 h à 5°C.
EXEMPLE 8 : DETECTION DES hOBPII DANS DIFFERENTS
TISSUS PAR IMMUNOHISTOCHIMIE.
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La localisation des protéines hOBPII au sein des structures
nasales (figures 12 et 15), des structures buccales et des glandes
lachrymales (figures 13 et 18), des glandes mammaires et des
poumons (figures 14 et 18) est révélée par immunohistochimie.
EXEMPLE 9 : DETECTION DES hOBPII, LCN 1 ET ApoD, AU
SEIN DES STRUCTURES NASALES PAR RT-PCR,
ET PAR IMMUNOHISTOCHIMIE.
Les RT-PCR réalisées à l'aide des jeux d'amorces pour les
hOBPII et pour LCN 1 révèlent la présence des ARNm
correspondants dans au moins une des structures nasales. Les
techniques de détection immunohistochimiques tant par détection
de fluorescence que par révélation à l'aide de péroxidase et de DAB,
révèlent la présence des protéines hOBPII (figure 15) et LCN 1 (figure
16) dans les cellules épithéliales des acini des glandes nasales,
ainsi que dans les lumières des canaux sécréteurs. On peut
également en détecter sur du mucus collé sur les tissus.
Les RT-PCR réalisées à l'aide des jeux d'amorces pour
1'ApolipoprotéineD révèlent la présence des ARNm correspondants
dans au moins une des structures nasales. Les techniques de
détection immunohistochimiques par révélation à l'aide de
péroxidase et de DAB, révèlent la présence de la protéine ApoD
(figure 17) dans les cellules épithéliales des acini des glandes
nasales, ainsi que dans les lumières des canaux sécréteurs, bien
que l'expression semble plus faible et dans moins d'acini que pour
les hOBPII.
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EXEMPLE 10 : DETECTION DES hOBPII, LCN1, ApoD DANS LE
PLACENTA PAR RT-PCR ET - PAR
IMMUNOHISTOCHIMIE.
Les RT-PCR réalisées à l'aide des jeux d'amorces pour les
hOBPII et pour LCN 1 révèlent la présence des ARNm
correspondants dans le placenta. Les techniques de détection
immunohistochimiques par révélation à l'aide de péroxidase et de
DAB, révèlent la présence des protéines hOBPII (figure 19) et LCN 1
(figure 20) très fortement au niveau des lacunes des villosités
10. placentaires et beaucoup plus faiblement et de façon très diffuse au
niveau des cellules épithéliales de la membrane amniotique et de
cellules sous jacentes tant pour la membrane amniotique que pour
le cordon. L'expression des ARNm détectés par RT-PCR au niveau
des villosités placentaires indique que ces protéines hOBPII sont
1 S produites par le placerità pour transférer des molécules lipophiles
(hormones, acides gras, vitamines...) vers le foetus par le biais de la
circulation sanguine foetale. Les protéines détectées au niveau de la
membrane amniotique pourraient correspondre à l'absorption de
ces protéines à partir du liquide amniotique, sachant que les
20 structures nasales du foetus sont baignées par ce liquide
amniotique. Les protéines hOBPII et LCN 1 participeraient ainsi au
transport de substances lipophiliques de petite taille de la. mère
vers le foetus au niveau des villosités choriales par l'intermédiaire
du sang foetal, et du foetus vers la mère par l'intermédiaire du
25 liquide amniotique.
Les RT-PCR réalisées à l'aide des jeux d'amorces pour la
protéine ApoD révèlent la présence des ARNm correspondants dans
le placenta. Les techniques de détection immunohistochimiques par
révélation à l'aide de péroxidase et de DAB, révèlent la présence de
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la protéine ApoD très fortement au niveau des lacunes des villosités
placentaires (figure 21). La protéine ApoD n'est pas détectée au
niveau des cellules de la membrane amniotique et de cellules sous
jacentes tant pour la membrane amniotique que pour le cordon.
L'expression des ARNm détectés par RT-PCR au niveau placentaire
indique que la protéine ApoD est produite par le placenta pour
transférer des molécules lipophiles (hormones, acides gras,
vitamines...) vers le foetus par le biais de la circulation sanguine
foetale. La protéine ApoD peut également étre produite par le foie du
foetus. La protéine ApoD participerait ainsi au transport de
substances lipophiliques de petite taille de la mère vers le foetus au
niveau des villosités choriales par l'intermédiaire du sang foetal.
Plus généralement, l'expression de lipocalines par le
placenta, telles que l'Alphal-acid Glycoprotéine (AlAG), la
prostaglandine D-synthase (PGDS), PP14 et RBP comme révélée par
les techniques de RT-PCR indique que ces protéines aux propriétés
de transporteur de molécules hydrophobes sont massivement
recrutées pour les relations mère-enfant, pour les transports de ces
molécules comme peuvent être des hormones stéroides, des acides
gras, des vitamines ou des xénobiotiques et plus généralement des
produits de détoxification issus du métabolisme.
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1
LISTAGE DE SÉQUENCES
<110> UNIVERSITÉ D'AUVERGNE CLERMONT I
<120> « ODORANT-BINDING » PROTÉINES HUMAINES FIXANTS DES LIGANDS
HYDROPHOBES
POLYPEPTIDES ET POLYNUCLEOTIDES CODANT LESDITS POLYPEPTIDES, ET LEURS
APPLICATIONS
<130> D15947
<160> 16
<170> PatentIn Vers. 2.0
<210> 1
<211> 676
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (43)..(552)
<223> cDNA396 (676) /g1 (hOBPIIa-alpha)
<400> 1
cgcccagtga cctgccgagg tcggcagcâc agagctctgg ag atg aag acc ctg 54
Met Lys Thr Leu
1
ttc ctg ggt gtc acg ctc ggc ctg gcc gct gcc ctg tcc ttc acc ctg 102
Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ser Phe Thr Leu
10 15 20
gag gag gag gat atc aca ggg acc tgg tac gtg aag gcc atg gtg gtc 150
Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys Ala Mét Val Val
25 30 35
gat aag gac ttt ccg gag gac agg agg ccc agg aag gtg tcc cca gtg 198
Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys Val Ser Pro Val
40 45 50
aag gtg aca gcc ctg ggc ggt ggg aac ttg gaa gcc acg ttc acc ttc 246
Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Asn Leu Glu Ala Thr Phe Thr Phe
55 60 65
atg agg gag gat cgg tgc atc cag aag aaa atc ctg atg cgg aag acg 294
Met Arg Glu Asp Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu Met Arg Lys Thr
70 75 80
gag gag cct ggc aaa ttc agc gcc tat ggg ggc agg aag ctc ata tac 342
Glu Glu Pro Gly Lys Phe Ser Ala Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Ile Tyr
85 90 95 100
ctg cag gag ctg ccc ggg acg gac gac tac gtc ttt tac tgc aaa gac 390
Leu Gln Glu Leu Pro Gly Thr Asp Asp Tyr Val Phe Tyr Cys Lys Asp
105 110 115
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2
cag cgc cgt ggg ggc ctg cgc tac atg gga aag ctt gtg ggt agg aat 438
Gln Arg Arg Gly Gly Leu Arg Tyr Met Gly Lys Leu Val Gly Arg Asn
120 125 130
cct aat acc aac ctg gag gcc ctg gaa gaa ttt aag aaa ttg gtg cag 486
Pro Asn Thr Asn Leu Glu Ala Leu Glu Glu Phe Lys Lys Leu Val Gln
135 140 145
cac aag gga ctc tcg gag gag gac att ttc atg ccc ctg cag acg gga 534
His Lys Gly Leu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Met Pro Leu Gln Thr Gly
150 155 160
agc tgc gtt ctc gaa cac taggcagccc ccgggtctgc acctccagag 582
Ser Cys Val Leu Glu His
165 170
cccaccctac caccagacac agagcccgga ccacctggac ctaccctcca gccatgaccc 642
ttccctgctc ccacccacct gactccaaat aaag 676
<210> 2
<211> 170
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Lys Thr Leu Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ser Phe Thr Leu Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys
20 25 30
Ala Met Val Val Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys
35 40 45
Val Ser Pro Val Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Asn Leu Glu Ala
50 55 60
Thr Phe Thr Phe Met Arg Glu Asp Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu
65 70 75 80
Met Arg Lys Thr Glu Glu Pro Gly Lys Phe Ser Ala Tyr Gly Gly Arg
85 90 95
Lys Leu Ile Tyr Leu Gln Glu Leu Pro Gly Thr Asp Asp Tyr Val Phe
100 105 110
Tyr Cys Lys Asp Gln Arg Arg Gly Gly Leu Arg Tyr Met Gly Lys Leu
115 120 125
Val Gly Arg Asn Pro Asn Thr Asn Leu Glu Ala Leu Glu Glu Phe Lys
130 135 140
Lys Leu Val Gln His Lys Gly Leu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Met Pro
145 150 155 160
Leu Gln Thr Gly Ser Cys Val Leu Glu His
CA 02381712 2002-02-11
WO 01/12806 PCT/FR00/02319
3
165 170
<210> 3
<211> 725
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (43)..(480)
<223> cDNA396 (725) /SM12 (hOBPIIa-beta)
<400> 3
cgcccagtga cctgccgagg tcggcagcac agagctctgg ag atg aag acc ctg 54
Met Lys Thr Leu
1
ttc ctg ggt gtc acg ctc ggc ctg gcc gct gcc ctg tcc ttc acc ctg 102
Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ser Phe Thr Leu
10 15 20
gag gag gag gat atc aca ggg acc tgg tac gtg aag gcc atg gtg gtc 150
Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys Ala Met Val Val
25 30 35
gat aag gac ttt ccg gag gac agg agg ccc agg aag gtg tcc cca gtg 198
Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys Val Ser Pro Val
40 45 50
aag gtg aca gcc ctg ggc ggt ggg aac ttg gaa gcc acg ttc acc ttc 296
Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Asn Leu Glu Ala Thr Phe Thr Phe
55 60 65
atg agg gag gat cgg tgc atc cag aag aaa atc ctg atg cgg aag acg 294
Met Arg Glu Asp Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu Met Arg Lys Thr
70 75 80
gag gag cct ggc aaa ttc agc gcc tat ggg ggc agg aag ctc ata tac 342
Glu Glu Pro Gly Lys Phe Ser Ala Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Ile Tyr
85 90 95 100
ctg cag gag ctg ccc ggg acg gac gac tac gtc ttt tac tgc aaa gac 390
Leu Gln Glu Leu Pro Gly Thr Asp Asp Tyr Val Phe Tyr Cys Lys Asp
105 110 115
cag cgc cgt ggg ggc ctg cgc tac atg gga aag ctt gtg ggg ccg tgc 438
Gln Arg Arg Gly Gly Leu Arg Tyr Met Gly Lys Leu Val Gly Pro Cys
120 125 130
cgc tgt ccc cac gtc ggc tca cct ggc cac ctc acc tgc agg 480
Arg Cys Pro His Val Gly Ser Pro Gly His Leu Thr Cys Arg
135 140 145
taggaatcct aataccaacc tggaggccct ggaagaattt aagaaattgg tgcagcacaa 540
gggactctcg gaggaggaca ttttcatgcc cctgcagacg ggaagctgcg ttctcgaaca 600
CA 02381712 2002-02-11
WO 01/12806 PCT/FR00/02319
4
ctaggcagcc cccgggtctg cacctccaga gcccacccta ccaccagaca cagagcccgg 660
accacctgga cctaccctcc agccatgacc cttccctgct cccacccacc tgactccaaa 720
taaag 725
<210> 4
<211> 146
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Lys Thr Leu Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ser Phe Thr Leu Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys
20 25 30
Ala Met Val Val Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys
35 40 45
Val Ser Pro Val Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Asn Leu Glu Ala
50 55 60
Thr Phe Thr Phe Met Arg Glu Asp. Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu
65 70 ~ 75 80
Met Arg Lys Thr Glu Glu Pro Gly Lys Phe Ser Ala Tyr Gly Gly Arg
85 90 95
Lys Leu Ile Tyr Leu Gln Glu Leu Pro Gly Thr Asp Asp Tyr Val Phe
100 105 110
Tyr Cys Lys Asp Gln Arg Arg Gly Gly Leu Arg Tyr Met Gly Lys Leu
115 120 125
Val Gly Pro Cys Arg Cys Pro His Val Gly Ser Pro Gly His Leu Thr
130 135 140
Cys Arg
145
<210> 5
<211> 741
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (43)..(726)
<223> cDNA396 (741) /SM4 (hOBPIIa-gamma)
<400> 5
cgcccagtga cctgccgagg tcggcagcac agagctctgg ag atg aag acc ctg 54
Met Lys Thr Leu
1
CA 02381712 2002-02-11
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ttcctgggtgtc acgctcggc ctggccgct gccctgtcc ttcaccctg 102
PheLeuGlyVal ThrLeuGly LeuAlaAla AlaLeuSer PheThrLeu
5 10 15 20
gaggaggaggat atcacaggg acctggtac gtgaaggcc atggtggtc 150
GluGluGluAsp IleThrGly ThrTrpTyr ValLysAla MetValVal
25 30 35
gataaggacttt ccggaggac aggaggccc aggaaggtg tccccagtg 198
AspLysAspPhe ProGluAsp ArgArgPro ArgLysVal SerProVal
40 45 50
aaggtgacagcc ctgggcggt gggaacttg gaagccacg ttcaccttc 246
LysValThrAla LeuGlyGly GlyAsnLeu GluAlaThr PheThrPhe
55 60 65
atgagggaggat cggtgcatc cagaagaaa atcctgatg cggaagacg 294
MetArgGluAsp ArgCysIle GlnLysLys IleLeuMet ArgLysThr
70 75 80
gaggagcctggc aaattcagc gcctatggg ggcaggaag ctcatatac 342
GluGluProGly LysPheSer AlaTyrGly GlyArgLys LeuIleTyr
85 90 95 100
ctgcaggagctg cccgggacg ga,c.gactac gtcttttac tgcaaagac 390
LeuGlnGluLeu ProGlyThr AspAspTyr ValPheTyr CysLysAsp
105 110 115
cagcgc cgtgggggc ctgcgc tacatggga aagcttgtg gcatctgct 438
GlnArg ArgGlyGly LeuArg TyrMetGly LysLeuVal AlaSerAla
120 125 130
ccctgc agggccgtg ccgctg tccccacgt cggctcacc tggccacct 486
ProCys ArgAlaVal ProLeu SerProArg ArgLeuThr TrpProPro
135 140 145
cacctg caggtagga atccta ataccaacc tggaggccc tggaagaat 534
HisLeu GlnValGly IleLeu IleProThr TrpArgPro TrpLysAsn
150 155 160
ttaaga aattggtgc agcaca agggactct cggaggagg acattttca 582
LeuArg AsnTrpCys SerThr ArgAspSer ArgArgArg ThrPheSer
165 170 175 180
tgcccc tgcagacgg gaagct gcgttctcg aacactagg cagcccccg 630
CysPro CysArgArg GluAla AlaPheSer AsnThrArg GlnProPro
185 190 195
ggtctg cacctccag agccca ccctaccac cagacacag agcccggac 678
GlyLeu HisLeuGln SerPro ProTyrHis GlnThrGln SerProAsp
200 205 210
cacctg gacctaccc tccagc catgaccct tccctgctc ccacccacc 726
HisLeu AspLeuPro SerSer HisAspPro SerLeuLeu ProProThr
215 220 225
tgactccaaa taaag 741
CA 02381712 2002-02-11
WO 01/12806 PCT/FR00/02319
6
<210> 6
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Lys Thr Leu Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ser Phe Thr Leu Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys
20 25 30
Ala Met Val Val Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys
35 40 45
Val Ser Pro Val Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Asn Leu Glu Ala
50 55 60
Thr Phe Thr Phe Met Arg Glu Asp Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu
65 70 75 80
Met Arg Lys Thr Glu Glu Pro Gly Lys Phe Ser Ala Tyr Gly Gly Arg
85 90 95
Lys Leu Ile Tyr Leu Gln Glu Leu Pro Gly Thr Asp Asp Tyr Val Phe
100 105 110
Tyr Cys Lys Asp Gln Arg Arg Gly Gly Leu Arg Tyr Met Gly Lys Leu
115 120 125
Val Ala Ser Ala Pro Cys Arg Ala Val Pro Leu Ser Pro Arg Arg Leu
130 135 140
Thr Trp Pro Pro His Leu Gln Val Gly Ile Leu Ile Pro Thr Trp Arg
145 150 155 160
Pro Trp Lys Asn Leu Arg Asn Trp Cys Ser Thr Arg Asp Ser Arg Arg
165 170 175
Arg Thr Phe Ser Cys Pro Cys Arg Arg Glu Ala Ala Phe Ser Asn Thr
180 185 190
Arg Gln Pro Pro Gly Leu His Leu Gln Ser Pro Pro Tyr His Gln Thr
195 200 205
Gln Ser Pro Asp His Leu Asp Leu Pro Ser Ser His Asp Pro Ser Leu
210 215 220
Leu Pro Pro Thr
225
<210> 7
<211> 607
<212> ADN
<213> Homo sapiens
CA 02381712 2002-02-11
WO 01/12806 PCT/FR00/02319
7
<220>
<221> CDS
<222> (43)..(483)
<223> cDNA396 (607) - forme courte (hOBPIIa-delta)
<400> 7
cgcccagtga cctgccgagg tcggcagcac agagctctgg ag atg aag acc ctg 54
Met Lys Thr Leu
1
ttc ctg ggt gtc acg ctc ggc ctg gcc gct gcc ctg tcc ttc acc ctg 102
Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ser Phe Thr Leu
10 15 20
gag gag gag gat gag gga gaa tcg gtg cat cca gaa gaa aat cct gat 150
Glu Glu Glu Asp Glu Gly Glu Ser Val His Pro Glu Glu Asn Pro Asp
25 30 35
gcg gaa gac gga gga gcc tgg caa att cag cgc cta tgg ggg cag gaa 198
Ala Glu Asp Gly Gly Ala Trp Gln Ile Gln Arg Leu Trp Gly Gln Glu
40 45 50
gct cat ata cct gca gga gct gcc cgg gac gga cga cta cgt ctt tta 246
Ala His Ile Pro Ala Gly Ala Ala Arg Asp Gly Arg Leu Arg Leu Leu
55 60 65
çtg caa aga cca gcg ccg tgg ggg cct gcg cta cat ggg aaa gct tgt 294
Leu Gln Arg Pro Ala Pro Trp Gly Pro Ala Leu His Gly Lys A1a Cys
70 75 80
ggc atc tgc tcc ctg cag ggc cgt gcc gct gtc ccc acc ttg gct cac 342
Gly Ile Cys Ser Leu Gln Gly Arg Ala Ala Val Pro Thr Leu Ala His
85 90 95 100
ctg gcc acc tca cct gca ggt agg aat cct aat acc aac ctg gag gcc 390
Leu Ala Thr Ser Pro Ala Gly Arg Asn Pro Asn Thr Asn Leu Glu Ala
105 110 115
ctg gaa gaa ttt aag aaa ttg gtg cag cgc aag gga ctc tcg gag gag 438
Leu Glu Glu Phe Lys Lys Leu Val Gln Arg Lys Gly Leu Ser Glu Glu
120 125 130
gac att ttc atg ccc ctg cag acg gga agc tgc gtt ctc gaa cac 483
Asp Ile Phe Met Pro Leu Gln Thr Gly Ser Cys Val Leu Glu His
135 140 145
taggcagccc ccgggtctgc acctccagag cccaccctac caccagacac agagcccgga 543
ccacctggac ctaccctcca gccatgaccc ttccctgctc ccacccacct gactccaaat 603
aaag 607
<210> 8
<211> 147
<212> PRT
<213> Homo sapiens
CA 02381712 2002-02-11
WO 01/12806 PCT/FR00/02319
8
<400> 8
Met Lys Thr Leu Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu A1a Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ser Phe Thr Leu Glu Glu Glu Asp Glu Gly Glu Ser Val His Pro Glu
20 25 30
Glu Asn Pro Asp Ala Glu Asp Gly Gly Ala Trp Gln Ile Gln Arg Leu
35 90 45
Trp Gly Gln Glu Ala His Ile Pro Ala Gly Ala Ala Arg Asp Gly Arg
50 55 60
Leu Arg Leu Leu Leu Gln Arg Pro Ala Pro Trp Gly Pro Ala Leu His
65 70 75 80
Gly Lys Ala Cys Gly Ile Cys Ser Leu Gln Gly Arg Ala Ala Val Pro
85 90 95
Thr Leu Ala His Leu Ala Thr Ser Pro Ala Gly Arg Asn Pro Asn Thr
100 105 110
Asn Leu Glu Ala Leu Glu Glu Phe Lys Lys Leu Val Gln Arg Lys Gly
115 120 125
Leu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Met Pro Leu Gln Thr Gly Ser Cys Val
130 135 140
Leu Glu His
145
<210> 9
<211> 676
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (43)..(552)
<223> cDNA2098 (676) - forme classique (hOBPIIb-alpha)
<400> 9
cgcccagtga cctgccgagg tcggcagcac agagctctgg ag atg aag acc ctg 54
Met Lys Thr Leu
1
ttc ctg ggt gtc acg ctc ggc ctg gcc gct gcc ctg tcc ttc acc ctg 102
Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ser Phe Thr Leu
10 15 20
gag gag gag gat atc aca ggg acc tgg tac gtg aag gcc atg gtg gtc 150
Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys Ala Met Val Val
25 30 35
gat aag gac ttt ccg gag gac agg agg ccc agg aag gtg tcc cca gtg 198
Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys Val Ser Pro Val
CA 02381712 2002-02-11
WO 01/12806 PCT/FR00/02319
9
40 45 50
aag gtg aca gcc ctg ggc ggt ggg aag ttg gaa gcc acg ttc acc ttc 246
Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Lys Leu Glu Ala Thr Phe Thr Phe
55 60 65
atg agg gag gat cgg tgc atc cag aag aaa atc ctg atg cgg aag acg 294
Met Arg Glu Asp Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu Met Arg Lys Thr
70 75 80
gag gag cct ggc aaa tac agc gcc tat ggg ggc agg aag ctc atg tac 342
Glu Glu Pro Gly Lys Tyr Ser Ala Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Met Tyr
85 90 95 100
ctg cag gag ctg ccc agg agg gac cac tac atc ttt tac tgc aaa gac 390
Leu Gln Glu Leu Pro Arg Arg Asp His Tyr Ile Phe Tyr Cys Lys Asp
105 110 115
cag cac cat ggg ggc ctg ctc cac atg gga aag ctt gtg ggt agg aat 438
Gln His His Gly Gly Leu Leu His Met Gly Lys Leu Val Gly Arg Asn
120 125 130
tct gat acc aac cgg gag gcc ctg gaa gaa ttt aag aaa ttg gtg cag 486
Ser Asp Thr Asn Arg Glu Ala Leu Glu Glu Phe Lys Lys Leu Val Gln
135 190 145
cgc aag gga ctc tcg gag gag gàc att ttc acg ccc ctg cag acg gga 534
Arg Lys Gly Leu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Thr Pro Leu Gln Thr Gly
150 155 160
agc tgc gtt ccc gaa cac taggcagccc ccgggtctgc acctccagag 582
Ser Cys Val Pro Glu His
165 170
cccaccctac caccagacac agagcccgga ccacctggac ctaccctcca gccatgaccc 642
ttccctgctc ccacccacct gactccaaat aaag 676
<210> 10
<211> 170
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Lys Thr Leu Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ser Phe Thr Leu Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys
20 25 30
Ala Met Val Val Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys
35 40 45
Val Ser Pro Val Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Lys Leu Glu Ala
50 55 60
Thr Phe Thr Phe Met Arg Glu Asp Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu
CA 02381712 2002-02-11
WO 01/12806 PCT/FR00/02319
65 70 75 80
Met Arg Lys Thr Glu Glu Pro Gly Lys Tyr Ser Ala Tyr Gly Gly Arg
85 90 95
Lys Leu Met Tyr Leu Gln Glu Leu Pro Arg Arg Asp His Tyr Ile Phe
100 105 110
Tyr Cys Lys Asp Gln His His Gly Gly Leu Leu His Met Gly Lys Leu
115 120 125
Val Gly Arg Asn Ser Asp Thr Asn Arg Glu Ala Leu Glu Glu Phe Lys
130 135 140
Lys Leu Val Gln Arg Lys Gly Leu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Thr Pro
145 150 155 160
Leu Gln Thr Gly Ser Cys Val Pro Glu His
165 170
<210> 11
<211> 782
<212> ADN
<213> Homo ns
sapie
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(537)
<223> cDNA2098 782)- longue (hOBPIIb-beta)
( forme
<400> 11
cgc cca acctgc cgaggtcggcag cacagagct ctggagatg aag 48
gtg
Arg Pro ThrCys ArgGlyArgGln HisArgAla LeuGluMet Lys
Val
1 5 10 15
acc ctg ctgggt gtcacgctcggc ctggccgct gccctgtcc ttc 96
ttc
Thr Leu LeuGly ValThrLeuGly LeuAlaAla AlaLeuSer Phe
Phe
20 25 30
acc ctg gaggag gatatcacaggg acctggtac gtgaaggcc atg 144
gag
Thr Leu GluGlu AspIleThrGly ThrTrpTyr ValLysAla Met
Glu
35 40 45
gtg gtc aaggac tttccggaggac aggaggccc aggaaggtg tcc 192
gat
Val Val LysAsp PheProGluAsp ArgArgPro ArgLysVal Ser
Asp
50 55 60
cca gtg gtgaca gccctgggcggt gggaagttg gaagccacg ttc 240
aag
Pro Val ValThr AlaLeuGlyGly GlyLysLeu GluAlaThr Phe
Lys
65 70 75 80
acc ttc agggag gatcggtgcatc cagaagaaa atcctgatg cgg 288
atg
Thr Phe ArgGlu AspArgCysIle GlnLysLys IleLeuMet Arg
Met
85 90 95
aag acg gagcct ggcaaatacagc gcctgcttg tccgcagtc gag 336
gag
Lys Thr GluPro GlyLysTyrSer AlaCysLeu SerAlaVal Glu
Glu
CA 02381712 2002-02-11
WO 01/12806 PCT/FR00/02319
11
100 105 110
atggac cagatcacg cctgcc ctctgggaggcc ctagcc attgacaca 384
MetAsp GlnIleThr ProAla LeuTrpGluAla LeuAla IleAspThr
115 120 125
ttgagg aagctgagg attggg acaaggaggcca aggatt agatggggg 432
LeuArg LysLeuArg IleGly ThrArgArgPro ArgIle ArgTrpGly
130 135 140
caggaa gctcatgta cctgca ggagctgcccag gaggga ccactacat 480
GlnGlu AlaHisVal ProAla GlyAlaAlaGln GluGly ProLeuHis
145 150 155 160
ctttta ctgcaaaga ccagca ccatgggggcct gctcca catgggaaa 528
LeuLeu LeuGlnArg ProAla ProTrpGlyPro AlaPro HisGlyLys
165 170 175
gcttgt gggtaggaattct gataccaacc 577
gggaggccct
ggaagaattt
AlaCys Gly
aagaaattgg tgcagcgcaa gggactctcg gaggaggaca ttttcacgcc cctgcagacg 637
ggaagctgcg ttcccgaaca ctaggcagcc cccgggtctg cacctccaga gcccacccta 697
ccaccagaca cagagcccgg accacctgga cctaccctcc agccatgacc cttccctgct 757
cccacccacc tgactccaaa taaag 782
<210> 12
<211> 179
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Arg Pro Val Thr Cys Arg Gly Arg Gln His Arg Ala Leu Glu Met Lys
1 5 10 15
Thr Leu Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ser Phe
20 25 30
Thr Leu Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys Ala Met
35 40 45
Val Val Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys Val Ser
50 55 60
Pro Val Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Lys Leu Glu Ala Thr Phe
65 70 75 80 .
Thr Phe Met Arg Glu Asp Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu Met Arg
85 90 95
Lys Thr Glu Glu Pro Gly Lys Tyr Ser Ala Cys Leu Ser Ala Val Glu
100 105 110
Met Asp Gln Ile Thr Pro Ala Leu Trp Glu Ala Leu Ala Ile Asp Thr
CA 02381712 2002-02-11
WO 01/12806 PCT/FR00/02319
12
115 120 125
LeuArg LysLeu IleGlyThr Arg Pro ArgIle TrpGly
Arg Arg Arg
130 135 140
GlnGlu AlaHis ProAlaGly Ala Gln GluGly LeuHis
Val Ala Pro
145 150 155 160
LeuLeu LeuGln ProAlaPro Trp Pro AlaPro GlyLys
Arg Gly His
165 170 175
AlaCys Gly
<210> 13
<211> 542
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (43)..(297)
<223> cDNA2098 (542) - forme courte (hOBPIIb-gamma)
<400> 13
cgcccagtga cctgccgagg tcggcagcac agagctctgg ag atg aag acc ctg 54
Met Lys Thr Leu
1
ttcctg ggtgtcacg ctcggc ctggccgct gccctgtcc ttcaccctg 102
PheLeu GlyValThr LeuGly LeuAlaAla AlaLeuSer PheThrLeu
10 15 20
gaggag gaggatgag ggagga tcggtgcat ccagaagaa aatcctgat 150
GluGlu GluAspGlu GlyGly SerValHis ProGluGlu AsnProAsp
25 30 35
gcggaa gacggagga gcctgg caaattcag cgcctatgg gggcaggaa 198
AlaGlu AspGlyGly AlaTrp GlnIleGln ArgLeuTrp GlyGlnGlu
40 95 50
gctcat atacctgca ggagct gcccaggag ggaccacta catctttta 246
AlaHis IleProAla GlyAla AlaGlnGlu GlyProLeu HisLeuLeu
55 60 65
ctgcaa agaccagca ccatgg gggcctgct ccacatggg aaagcttgt 294
LeuGln ArgProAla ProTrp GlyProAla ProHisGly LysAlaCys
70 75 80
gggtaggaattct gataccaacc t aagaaattgg 347
gggaggccc ggaagaattt
Gly
85
tgcagcgcaa gggactctcg gaggaggaca ttttcacgcc cctgcagacg ggaagctgcg 407
ttcccgaaca ctaggcagcc cccgggtctg cacctccaga gcccacccta ccaccagaca 467
CA 02381712 2002-02-11
WO 01/12806 PCT/FR00/02319
13
cagagcccgg accacctgga cctaccctcc agccatgacc cttccctgct cccacccacc 527
tgactccaaa taaag 542
<210> 14
<211> 85
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Lys Thr Leu Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ser Phe Thr Leu Glu Glu Glu Asp Glu Gly Gly Ser Val His Pro Glu
20 25 30
Glu Asn Pro Asp Ala Glu Asp Gly Gly Ala Trp Gln Ile Gln Arg Leu
35 40 45
Trp Gly Gln Glu Ala His Ile Pro Ala Gly Ala Ala Gln Glu Gly Pro
50 55 60
Leu His Leu Leu Leu Gln Arg Pro Ala Pro Trp Gly Pro Ala Pro His
65 70 75 80
Gly Lys Ala Cys Gly
<210> 15
<211> 10664
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Gène hOBPIIa
<400> 15
ctctgcttct atattcggcc tccaaatctg tgctcaatgc agcaactgga gtgacccctt 60
aaatacgtaa gtcacagctt gcctttgtca gagctatcca gggtctttca ctcagagcag 120
aagctgaagt cctcgtggtg gtccttaatc cctacatggc cgttccaccc actccccagc 180
ctcatgtgtg gccggtctcc ctggatcatt tgctgtggct gctctgccgt gtgttcccgg 240
aaactgccag cgttctccca cctctgggct ggcactggat gctcctgcca cctggactcc 300
tcttccagct gacgagctca tggcttgctt ccttcatgtc ttaaattcgg tgtttgaatg 360
ccaccttggc gaggctgttc ctcatcaatt catgtaaagg acaaataacc ccttgtctgg 420
ccactcctgt ccaacttgtc cactttgctt tttccatagc actgatcacc atttaaaata 980
atgtatgaac cagtgaccca tcagtgacca gagacagtag attgaacagg tattgcttgc 540
acagtgaaca atcagctcta gaggtttaaa gagaaccaca aagaatggct caggattgca 600
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cgagggcagt taaggaagaa ataaacaggg gtggggatcc tttccacaag tgtgggttca 660
gaccgcatgg gagaaggtgt ggttctccca agggaagctg gagaagtttg ctgggttgtc 720
ccagccacag ctggcccacg gtcagggcag aggccagcag gcagggaaat gtaggctggg 780
tctggcaagc aggaagcctc tcttcccccg caaggcaggt gggctggggc tgggaagcct 840
acaagagtca ctgggaaccc acaggtgcag atgccactga atctcaatag gaagccatct 900
gggggggtcc cctgaattca atgtggtgtg tgccgccaga cgtccccaac ttgtgccact 960
gccatttata caggaagaga aagaaaaagg aagaaatgga agcatctgga accagtcatc 1020
ctggacccat gctaggaggt gcttccccct acgcctcaac caacaaagct tagcattgca 1080
ccaggtgcac aagagaagcg cctgctggct ccagctccat tgcctcggaa ccagccatga 1140
agggtgcgtg tggagctgga ggcaagacat tgatagctgg cactgcaatt cacttattta 1200
ttttgttcat tttaagtccc ctgcacctag aatataagcc ccccaagcac aggacatttg 1260
ttttattgat cgatgtattc cttgtgcccc aaagaatgag aggcatctag aaagtctgca 1320
aaaatcaaac ataaaaatga acctttattc agtcattgtt attttgatgg atatttgagg 1380
catttccaag atttgtaagt aacaattgaa cccttctcct ggttcatgtg tgggagtgta 1440
tctgttcàaa tgatgcttct gagtggagtt gctgagtctt tggctctagg tttttttttt 1500
ttaagcattt atgctcattg tggtttttaa attaaacatt taaccctgag acactgtaga 1560
ttcccatgca attgtaaaaa gccacacaga gctatcatgt gtatcttcac ctggcttgct 1620
ccagccccaa ccccagcaat gacagacctg ttctccactc ctgcaatctg ctcattgcaa 1680
gaatgtcgtc tattgcaatc ataaaattgt gggattggct ttttttttcc tgtgcagcat 1740
cattctctgg agattcatcc tattgttgca tttatcaata gtttattcca ttttacttct 1800
gagtagtgct ctatggtatg gatgtaccac agtctgttta accattcacc tgttggagga 1860
agtctgtgtt tatagatttg ggctatgaca catgtatagg tttttgcatg gacatcagtt 1920
ttcatttccc tgggacaaag gcccaggggt tctattgctg gattctatgc ttgttacagg 1980
gctcattttg ttttgttttg ctttgtttta ttttgttttt aacctgtcaa gccattttcc 2040
agatccagtt tccatgcatc ctcaccaggc ttcagtatga tcactatgat cttatctcag 2100
ccaccttaat aggtatgtac tgatatatca tggcttttat ttgcatttca ctgatgacta 2160
atggtgttga gcatcttttc atgtgtttat ttgccatctg tatatcctct ctagtcaagt 2220
gtcccttcat gtcttttgtt tacgttctat ttttgaaact gttgagtttt gaaaaattct 2280
ttataaagta tagaaactaa ttctttgttg aatatgtagt ttgtcaatat tttctttcag 2340
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tctttggctt gtctttttat tctgttaaca gggtctctta cagagcaaaa ggtttttatt 2400
ttgatgaagt ctattttaac aatttttcct tttatggatc atatttttgg caacaaatct 2460
aaaacctcct gacccagctc catatgtcaa agattttctt gttttctaaa agttttatag 2520
ttttaagttt tatgttgaag tctatgatcc attttgagtt aattttcata cagggtgtga 2580
gaccaaggtt gtggttcttc tttttctttg gtggttttgt ctgtggatgt ccagttgctc 2640
cagcccattt gctacaaaag ctatctttcc tccactgaat tacttttgca tctttgtaaa 2700
aatgtaattg ggtgtatttg tacaggtctg tttgaggatt ctttattgtc tgtcccattg 2760
atctatgcat ctgtccatgt gctagctata taagtcttga aagggtagcc tgtagctggg 2820
tgtggtggcg agagcctgta atcccagcta ttcgggaagt ggaggcagga gaatcgattg 2880
aacccaggag gtggaggttg cagtgagtca agatcgtgcc actgcactcc agcctgggtg 2990
acagagtgaa ctccatataa aaaaataaaa acaaaaataa agtagcgtga tttctcccac 3000
cttattcttt tttaaaaaag ttttagctat tccagttcct ttgcctttcc atataaattt 3060
tagaataatc ttgtctatat ctaccacaat tctttctgga attttgatag aaattttgtt 3120
acatctttat attatttgag agaaatgata tttttactat gttgagtctt ctaatccatg 3180
gatataacgt ctctccattt gtttagatct tctttgattt attttataat cattgcattg 3240
ttttcagcat acaaatccag catatgggtt gttagactta tgcctaggca tctcattttt 3300
ttagccatta taaatagtac tgtgttttta agtttagggt ccattactag tatgtagaca 3360
cacaattgat ctttgtatat ttatcttgtg tcctgcaacc ttgctgaact cacttactag 3420
ttctaggagg tgtattgttt tcttttgttt tgtttttcaa tttcttggga ttttctacag 3480
agataataat gtcatctgca gatgcagttt tcttccttcc tttccaattt gtatgtcttt 3540
aatttccttt ttaaaaaacc tatattactc tgactagaac tttctgtact atgttaaata 3600
caagtggtag agtggacatc cttgccttgt ccctgatgtt aaagagaaag catttgtaac 3660
tgagtatccc agcctcaaaa tgtgcttaaa aacttttttc ctttcttgct ttcagccttg 3720
aaacatactt cgaaactctt tatttctccc tttcccacca ggcacttccg tgagcagtgc 3780
tcgcttatct aattatgtgc ttacttagaa attccagggg ccaattttga aacaaaccag 3840
gcagagagac ccagctgcag aatcctccct cttaggggga gttacaggta gcctaccact 3900
tcccggctga aatcaggatg acgcaaacca gacctccgga cagacgattg atgactcaca 3960
ataaccatca gaacaagatg cagaccaaca tcctcctgca ccattcccac atatttccca 4020
caccttttcc tccttaaacc ccttcgctca gtccagaaaa tctgaatggt cttttaaagg 4080
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catgggtctg gccattcccc aactgccagt atttgaataa agctgctttc cttttaccac 4140
acctcacttc tcatgccttg acttctgagc agcgagcagc tggacttgag ccagttacac 4200
atcagtcttt caccattaga aataatgtag ccataggttt ttttttcgta gatgttcttt 9260
ttcaagttaa agaagttctc ttctattcct atttttctga gaggtgttat cccgaatgag 4320
tgttgaattt tgttaaatac ttttaacaac ccaacaggaa ccaccatcag aagccatcca 4380
gagaaacgca ccaggccaca aagcactggg ggccagggat cttgcccctg ctgtctgcca 4440
tgggttgacc cccagcctcc aaccctacca tcccctgacg gtgtctgcag cagttgaacc 4500
caaccagcat ctaaaagaac acagttggtg aacgagactg ggacacaggg caagatgggt 4560
ggacaatggg aggctcctgg agagcacccg taccagcgag catagaattc atgggggtga 4620
cctgttccct gaagcatctg cgcgtgttgt tccagcattt tcttcaagga ttgagccagc 4680
agcaccagtg tcatacggtg cttaaatcaa tgattcacag ccaaccaatg aaatacaagg 4740
tgccggctgg gcgcggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccgaggcggg 4800
cggatcacga ggtcaggaga tcgagaccat cccggctaaa acggtgaaac cccgtctcta 4860
ctaaaaatac aaaaaaaatt agccgggcgt agtggcgggc gcctgtagtc ccagctactt 4920
gggaggctga ggcaggagaa tggcgtgaac ccgggaggcg gagcttgcag tgagccaaga 4980
tcccgccact gcactccagc ctgggcgaca gagcgagact ccgtctcaaa aaaaaaaaaa 5040
aaaaaaaaaa aaaagaaata caaggtgcct ggggtacagg caacaaaaat ggggaacgga 5100
gaaatcttcc cgttgaggta gagactccag cctgtttgct catctctggt cctgaagagc 5160
ccagtccccg ccctaaggat ggggtttctg ctcggcagca cttgccgtga gaggggtgag 5220
gcactgggtc acgccagccc tttctttata gcccccaggg tttattagag tgtgcattag 5280
tattatttag caagcacttg agggtgtctg atcttgggcc agagaggcac aaagattgtg 5340
tgggcccagc acctgcctgc agagcgtggg tcagccttgg gtcccagggc agatgacgca 5400
ggcccgggaa ctacagggtc caggagggag aaggcaaagt tctggctcag gttggctggg 5460
gatgaggcca gcggagccag gtgcccaagg gagctcagcc acaaactctg agcacaggct 5520
ggcaggtggc tcttgatgct catgccaccc atttatctaa agggatgaga ttcaaggcct 5580
gtcctggtgg ctgggggccg tcgaagctga cgagagaggg gatgtagagt gaatgtatat 5640
tccactctac cacttgtatt taacagggag atggatgatg aacacgtgca ggaggaaaca 5700
ggcaggacaa tccagagaga tcacgtgttc tgaggacagc acagccaggc tccggtacgg 5760
agtgaagcgg ggtggggcag gcggcggggt ccctcatatg gcccgaggag gccgtatata 5820
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tactgacctt gagccacaca atagtgccct tctctgcccc taggaagctc gagtgcaggg 5880
tccaggtggg gaaaatcaat gcagagtggg tcccagagtg ggcggaagct tgggctctag 5940
ggcgtgcggg actcagctgg cagcagcccc acatctctat ggttctaaag cccagtccat 6000
ttctgctcag cagggagatg gccagttccc cagaggactt gcccagggtc ccagccgtgg 6060
ccctgggagg gctcaggggt gagggaggga gaattccgag ccgtgggccc tccctctgtg 6120
gctcggggtg cagacgtgca ctaccctgcc ctgtcctctg gagtcctccg ggctcatcca 6180
agtgggcgca tttgggtgca aaccctggac agcatcgtgt gtcttttctt ctctggctgg 6240
cactgaattg ctgttcacca gatgccagca atgaggacac tccccctccc ggatgcagga 6300
ctggttgcca ccatggggag gggtgcaccg tgccacgtgc tcccaggaca ctggccaggg 6360
ggctataaag aacatctcga gaggagccag cacagccttg ttcagacgcc cagtgacctg 6420
ccgaggtcgg cagcacagag ctctggagat gaagaccctg ttcctgggtg tcacgctcgg 6480
cctggccgct gccctgtcct tcaccctgga ggaggaggat gtgagctggg ttggcgtggg 6540
cggatggagg agccaggtgg actcctgggc agggggcagt gccaggggcc ctgctttagg 6600
aggtgtcact taagcctggg gtggtggtgg aggggtccta ttgttccttc agcagacaat 6660
gctccccatg aggcccaggg ccggagcagg ctcggctcag gggttcctgc tgcactgacg 6720
cctgaagccc gaaggtctcg cagggttggg ccctgtggag ggagggctca cctggtgctg 6780
gggcccgggg gtccatgggg tgcagacatg ccctccttcc actgggggct gggagccctg 6840
agcagggggc tggctctaac tcactccagc tgagctctaa ctaaggtgca ggaacccagc 6900
ctgcctttag gggtggcagc cgggcaccat gggtgtctgg ttatagctgc aggcctgagt 6960
gccagggtca gagtagaatc tgggccaccc atggtgggct cacggccttg gcctgctcca 7020
gatcacaggg acctggtacg tgaaggccat ggtggtcgat aaggactttc cggaggacag 7080
gaggcccagg aaggtgtccc cagtgaaggt gacagccctg ggcggtggga acttggaagc 7140
cacgttcacc ttcatgtgag tgttgcccac tgcagggccc ctcaggccac tttcgctccc 7200
cgccccagac ccacctggtg cccattgccc catccacatt tcgggtgttg ggaagagtca 7260
ccccctgcct tggagggaaa cagccagggc atcctgaagc tcggtggggt gggggggcag 7320
tggaattttc aggttgccgg gtcagggcca tgcaccaggt gagctgagga tgggccaggt 7380
gtgtcctggg agccgctgcc cgcgtgtctc ctgttttcca ggagggagga tcggtgcatc 7440
cagaagaaaa tcctgatgcg gaagacggag gagcctggca aatacagcgc ctgtgagccc 7500
ctccccgacc ccccactccc catgcccaac cccggatgca ccagccccac tgcaggtgga 7560
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gagtgcccag gccacacttc tgccagggtc ccagccctgc ccacctccaa ggaggggctg 7620
gcctctcctt cctggggggc tggtggccct gacatcagac accaggtgtg acaggcttgt 7680
ccacagtaga gatggaccag atcaagcctg ccctctggga ggccctagcc attgacacat 7740
tgaggaatcc gagtgttagg gaccaggagg ccgagggtta gggatgggaa gccaaggctg 7800
agggtttggg atcaggaatc cgagggttag ggacagggaa gtggggcagg agcagctgct 7860
ggagctggga aggccggact ctagtcctgg acgtgctctg gccttgtggc tccattactt 7920
gcattgggac cttccgagag gaggctcctg cctccgtgtc cgggtccatg ctgtgcggag 7980
cagccaggcc tggctcaggc tgtccagggc acctgggtga ccactgaaac attcctgagt 8040
gtttcttcgt gtggtcctga gtgctctctc cgggaatgag ggcactgaag acccatcttc 8100
tctgtcatct acagatgggg gcaggaagct catatacctg caggagctgc ccgggacgga 8160
cgactacgtc ttttactgca aagaccagcg ccgtgggggc ctgcgctaca tgggaaagct 8220
tgtgggtgag gggcccgctg gggcctgcat gtcctgcccc atggtctctg cctccagaag 8280
ccagtggaac caccatcatc acgccctggc acggggggaa aaggaagccc cctgcgccgg 8340
ccttcgtgtg ctaggcacca agcgctgccc tggatggctg gtccaagttc ctgaagtggg 8400
agtggggtgg gccaggcagg gacagacacg gccctcggtg acgtgaacct gccaagggcc 8460
gcttgtgggg tctcaggtgt aggggcctca ccttaagggg gaggtancat cttaacagag 8520
ctcttcatgg ggcagggact ctccagggcg gcagggcagc cagtgcctct gggacacaag 8580
gtccctccag gtgagggttg tgaccctgca gagtggcttt gggagctgcc caggtccccc 8640
tggggttgct gagtggcttg gaccctgcca ctgtcccctt tcctggggac ctctcacctg 8700
ggcggtggcc gtctcctctg tccccagtcc cacccctgag ctcttgtcca ttctcaggcc 8760
tcctctcccc cttgcctggt gctggacagt tgccatctct tctgtcccca gccccacccc 8820
tgagctctga tccactctcg ggcctctccc ccgtcctgat gctgggccgt ggtcgtctcc 8880
ttttagcatc tgctccctgc agggccgtgc cgctgtcccc acgtcggctc acctggccac 8940
ctcacctgca ggtaggaatc ctaataccaa cctggaggcc ctggaagaat ttaagaaatt 9000
ggtgcagcac aagggactct cggaggagga cattttcacg cccctgcaga cgggtgagga 9060
cggctgtgcc cagtaccccg tgttcccctg tgtctctgtg tgatctccag tgtcccatga 9120
ccctcgtgtc ctcccatgtc ccccgcattc cccatgtgcc ccgagtctcc tcgcaggggc 9180
tctgggccct gcttagcatc ctcgtcgttg gagggtctgc actctgggct gcgatggggt 9240
ctggggctcc gcgctctggg ctgcgatgcg gtctggggct ccgcgctctg ggctgcgatg 9300
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gggtctgggg ctccgcgctc tgggctgcga tggggtctgg ggctccgcgc tctgggctgc 9360
gatggggtct ggggctccgc gctctgggct gcgatggggt ctggggctcc gcgctctggg 9420
ctgcgatggg gtctggggct ccgcgctctg ggctgcgatg gggtctgggg ctccgcgctc 9480
tgggctgcga tggggtctgg ggctccgcgc tctgggctgc gatggggtct ggggctctga 9540
gctctgggct gcgatggggt ctgggccctg gtctagggcg ccttctaatc cctgggtttt 9600
tcttggtctc tgcaggaagc tgcgttctcg aacactaggg tgagtgagcc tttaggaggg 9660
cactggacaa gcccagagtc ctgggttccc ggggttcgag ggtacatctg ctctggccct 9720
tcccatccca cacagccagg gagacccccc cagggtcagg cacgaggttg gcacctcaga 9780
gtctgcccac ccaaaattcc tgggacattc gggaagtcct ttgttttacc attcctgcac 9840
ctgccagccc gagtgagggt cctcctcggc ctttccacag cgaggcctcc ctccggctcc 9900
ctcaggtgtc agctcggccc atcgccccct gcacctgtcc ccactcggtc tactcccccc 9960
cacccactca ccaaggatgc tcagaggcct gcccagtcat tggaggagct gaggctgctc 10020
tggagccccg aggctgccca gcagtggccg atgtggaagc tgcagagcct ggggagggag 10080
ctctgggcct ggcctctgcc ctaccctgca gcctccctga cctctgctcc tcttcccagc 10140
acagcagccc ccgggtctgc acctccagag cccaccctac caccagacac agagcccgga 10200
ccacctggac ctaccctcca gccatgaccc ttccctgctc ccacccacct gactccaaat 10260
aaagagcttc tcccccagct ctgggcaggc ctatctgtgg ggacggaggg gctcgcaccg 10320
gctccctggg aggcctgctg ggagggggag ccacaaggga agctggggag atgttggacc 10380
tagcaagggc caaaccacaa gaggcacgat gtccaacagg ctgtggggct gcgtgatgtc 10440
ctggaggggc ctccggaaga gccgccctcg gatctcaggc tcagcttggg acgggcaggg 10500
ctctgggcag gagcacttgg gaagccactg ggagggccgg agtggggaca cggcgtcaga 10560
cctgcatcag tgggtccacc acagggctcc cgccccgggg gtctcagtgg gatcctccga 10620
gcgggtccac tttancatcc tgngctcagt ggcatcactg gata 10664
<210> 16
<211> 13591
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Gène hOBPIIb
<400> 16
tctctgcttc tatattcggc ctccaaatct gtgctcaatg cagcaactgg agtgacccct 60
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taaatacgta agtcacagct tgcctttgtc agagctctcc agggtctttc actcagagca 120
gaagctgaag tcctcgtggt ggtccttaat ccctacatgg cagttccacc cactccccag 180
cctcatgtgt ggccggtctc cctggatcat ttgctgtggc tgctctgctg tgtgttcccg 240
gaaactgcca gcattctccc acctccaggc tggcactgga tgctcctgcc acctggactc 300
ctcttccagc tgacgagctc atggcttgct tccttcatgt cttaaattcg gtgtttgaat 360
gccaccttgg cggggctgtt cctcatcaat tcatttaaag gacaaataac cccttgtcct 420
gacactcctg tccaacttgt ccactttgct ttttccatag cactgatcac catttaaaat 480
aacgtatgaa ccagtgaccc atcaggatcc agagacaata gattgaacag ggattgcttg 540
cacaatgaac aatcagctct agaggtttaa agagaaccac aaagaatggc tcaggattgc 600
acgagggcag ttaaggaaga aataaacagg ggtggggatc ctttccacaa gtctgggttc 660
agacctcatg ggagaaggtg tggttctccc aagggaagct ggagaagttt gctgggttgt 720
cccagccaca gctggcccac ggtcagggca gaggccagca ggcagggaaa tgtaggctgg 780
gtctggcaag caggaagcct ctctccccac ccaaggcagg tgggctgggg ctgggaagcc 840
tgcaagagtc actgagaacc cacaggtgca gatgccactg aatctcaata ggaagccatc 900
tgggggcggt cccctgaatt caatgtggtg tgtgccgcca gacgtccccg acttgtgcca 960
ctgccatttg cataggaaga gaaagaaaaa ggaagaaatg gaagcatctg gaaccagtca 1020
tcctggaccc atgctaggag gcgcttctcc ctacgcctca accaacaaag cttagcattg 1080
caccaggtgc acaagagaag cgcctgcttg ctccagctcc attgcctcgg aaccggccat 1140
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tattgtgttc attttaagtc ccctgcacct agaatataag ccccccgagc acaggacatt 1260
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tctgagtagt gctctatggt atggatgtac cacagtctgt ttaactattc acctgttgga 1860
ggatgtctgt gtttatagat ttgggctatg acacatgtac aggtttttgc atggacatca 1920
gttttcattt ttctgggaca aaggcccagg ggttctattg cggggttcta tgcttgttgc 1980
agggtttttt tttttaaacc tgtcaagcca ttttccagaa actgtccagt ttccatgcat 2040
cctcaccagg cttcagtatg atcactatga tcttatctca gccaccttaa taggtatgta 2100
ctgatatatc atggctttta tttgcatttc actgatgact aatggtgttg agcatctttt 2160
catgtgttta tttgccatct gtatatcctc tctagtcaag tgtcccttca tgtcttttgt 2220
ttacattcta tttttgaaac tgttgagttt tgaaaaattc tttataaagt atagaaacta 2280
attctttgtt gaatatgtag tttgtcaata ttttctttca gtctttggct tgtcttttta 2340
ttctgttaac agggtctctt acagagcaaa aggtttttat tttgatgaag tctattttaa 2400
caatttttcc ttttatggat catatttttg gtgacacatc taaaatctcc tgacccagct 2460
ccatatccca aagattttct ttctgttttc taaagctttt atagttttaa gttttatgtt 2520
taagtctatg atccattttg agttaatttt cttgcagggt gtgagaccaa ggttgtggtt 2580
cttctttttg tttggtggtt ttgtctgtgg atgtccagtt aatccagccc atttgctaca 2640
aaagctatct tccattgaat tgcttttgca tctttgtaaa aacttaactg ggtatatgcg 2700
tgcaggtctg tttgaggatt ctttattgtc tgtcccattg atctatgcat ctgtccatct 2760
gctagctata taatgagtct tgaaagggta gcctgtagct gggtatggtg gtgtgcatct 2820
gtaatcccag ctacttggga ggcggaggca ggagaatcac ttgaatctgg gaggtggagg 2880
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atagcacatc tctccatttg tttagatctt ctttgattta ttttataatc attgcattat 3240
tttcagcata caaatccagc atatgggttg ttaaacttat gcctaggtat ctcttttttt 3300
tagccactat aagtagtatt gtgtttttaa gtttagggtc cgttactagt atgtagacac 3360
acaattgatc tttgtatatt tatcttgtat cctgcaacct tgctgaactc gcttaatagt 3420
tctaggaggt gtattgtttt cttttgtttt gtttttcagt ttcttgggat tttctacaga 3480
gacaatcatg tcatctgcag atgcagacag ttttcttcct tcctttccaa tttgtatgtc 3540
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tttaatttcc tttttaaaaa acctttattg ctctgactag aactttctgt actatgttaa 3600
atacaagtgg tgaaagtgga catccttgcc ttgtccctga tgttaaggag aaagcgtttg 3660
taactgagta tcccagcctc aaaatgtgct taaaaacttt tttcctttct tgctttcagc 3720
cttgaaacat acttcgaaac tctttatttc tccctttccc accaggcact tctgtgagca 3780
gtgctcgctt atctaattat gtgcttactt agaaattcca ggggccaatt ttgaaacaaa 3840
ccaggcagag agacccagct gcagaatcct ccctcttagg gggagttaca ggtagcctac 3900
cacttcccgg ctgaaatcag gatgactcaa accagacctc tggacagacg attaatgact 3960
catgataacc attggaacaa gatgcagacc aacatcctcc tgcaccattc ccacatattt 4020
cccacacctt ttcctcctta aaccccttcg ctcagtccag aaagtttgaa tggtctttta 4080
aaggcatggg gcctggccat tcctctactg ctagcatttg aataatgctg ctttcctttc 4140
accacacttc acttctcatg ccttgacttc tgagcagcga gcagctggac ttgagccagt 4200
tacacatcag tctttcacca tgagaaatga tgttagccat aggttttttg tagatgctct 4260
ttgtcaagtt aaggaggttc tcttctattc ctacttttct gagagttgtt ttcctgaatg 4320
çgtgatgaat ttagtcaagt actttttctg cattgatcga tatgatcatg taatttttct 4380
tcttaacata ttaatatggt tgatttttga gtattgtacc aggtttccat ccctggaata 4440
aactgctttt ggtcatggtg tagaattaat tttatatatt attatttgct aatattttgt 4500
aaaggatttc tgtatctata ttcatgaggt atattgttct gcagctttcc tttttgtgtt 4560
gtcaggtttt ggttgggaga tattctctca tcttctgaga ttatgcagag ttggtgttat 4620
ttatttttta aatggttggt agaattttct aatgaaacca tatggacatg aagaattatt 4680
tttggaagct tttaaaatta aaatgttaac tttaattgtc atagagctat taaagttatc 4740
tatcttatat tggcattgtg ttttttgaga aattggttca tttcacctat gttgtcaaat 4800
atatgtggga aggtctcttc gtagtattcc cttattatcc tttgatgtct gcagggtctg 4860
tagtgatagt ctctgttttg ttccagatgt tggttatttg tgtctttctt tctttttttg 4920
tttgtcagtc tttctagaac tgcctcaatt ttattaattt ttccagagaa ctaacccttg 4980
tttcattgtt tttctctgtt gtttttctgc tttcgatttt ttctgctttc tgcttttgat 5040
ttattaattg ctgctcttat ctttgttatt tcttttcttc ttgctttggg tttattttgc 5100
tcttcttttt ctaggttctt gaagtgggag cttagatagt tgattttgga cttctctttt 5160
ctaatatatg catttaatgc ctctcagcac tgatttagct gtgtctcaca aattttgata 5220
tgtttttgtt tgtttgtttt tgaggtagag tctcgctctg tatcccaggc tggagtgcag 5280
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tggcactatc ttggctcact gcaacctcca cctcctgggt tgaagtaatt ctcctgcttc 5340
agccccctaa gtagctggga ttacaggtat acgccaccat gcccagcaat ttatttattt 5400
atttattttt gtatttttag tagagatgag gttttgtcat gctgtccagg ctggtctcga 5460
actcctgacc tcaagtgatc tgcccacgtg gggctccaaa gcactgagat tataggcata 5520
agccactgtg cccagcctgt ttttgttttt tttgagatgg agtcttgctc tgtcacccag 5580
gctggagtgc agtggcatga tagcccactg caacctccgc ctcccgggtt caagtgattc 5640
tcctgcctca gcctcccgat tagctgggat tacaggcgtg caccaccaca ctcagctagt 5700
ttttgcattt ttggtagaga tgggttttcg ccatgttggc caggctggtc tcgaattcct 5760
gatcgcaagt gatccacccg cctgggcctc ccaaagtgct ggaattatag gcacaagcca 5820
tcacgcccag ctgatatgtt gtattttcat tttcatccag cctagtatat ttttaaattt 5880
accttcaggc ttcctctttg acctgtggat tattcacagg tgtgttgttt ccaagcatct 5940
gaagaaagat tttccattat ctttctggca ttgatttata gttagattcc atgtggtcag 6000
agactaccct ctatatcatt taaattttta aaaatttctt gaggctcatt ttctcatcca 6060
ggatatggtc tatcttggta tatattctgg tgcacttgaa aagaatgtgt gtagtgctgt 6120
tgccaggtgg tgtgttctac aaatgtcaat tcgattatgt taattgatgg gtggccgagt 6180
tctttgatgt ccctgctggt tttctgtcta gttgctctga gagaagggta ttgaagtctc 6240
caactataat tgtggctttt taaatttctc ctttcagttc tgttttgctt cacatattgt 6300
gcagctaatg tttggtgcac acacgtttag gattactatg tcttctttgc agaatggccc 6360
acttattatt gtataatttc cctctctgtt aattagtctt tgttctaaag tctattttac 6420
ctgttattga aataatgctt ctgctttctt ttgattaatg tttatatatc ttttttcatg 6480
tttttacttt caacctgtct ctattgttac atttgaagta agtttcttgt agacggcata 6540
tagttgtata atggctttta attcactttg ccaatcactg tcatttaata tttaaaccat 6600
ttacatttaa tataattatt aacatgctag agtttgtatt atttttatag ggttgctata 6660
acaaaatact accaactggg tggcttagaa caaaaattta ttttctcaca ttctggtggc 6720
cagaagtctg agatcaagtg agatttggaa ggtagaaaaa ccaacaaaat atgttaatga 6780
tgttaccatt gtgggcaact gggactcagt ccttctgagg gccatctgag aaatagggtg 6840
gaaccatatt tgattgttcc acttagaagg aagagtccag accatttatc ccatcagtta 6900
ctatccctac agactgagga tgctgattca cttgcacatc tgggtttcat cagtgtcagg 6960
ggaagcacag aagaaaaggt gcaggcactt aaggtgggaa gctgtgaata cgtccgtgca 7020
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ccaggaacga tctacaactg tggcaggtgg gccgacagcg tgggtcacca gtgccttcag 7080
ccaccccttg cactgcactg acccactcac acagcaaatc aagtccattt tgtaactgat 7140
gcttcagcat ggtggccagc caccgtctct gaaataatta aaataggtgg ttggtggcac 7200
aggcgatggt ccctactgtg cagttggtct tgcagcctta actgagattc atcgtaagct 7260
cccactctgc tccttcttgg cgtgcctcag tcccagccag cacatgctct ggtctaggtg 7320
cttgtttggt ggtgccatct aaaccttctt atgcccaggt gtcgagtaaa gcccagacac 7380
tgtccacttc agtgaagcac ctaggaatta gcagccctga aaagctgtga tcactgtgag 7440
attcaaagaa aagggtcgtg agggaagtgg tgagagagaa agttgtgtgg tagcggcagc 7500
ccaacaggag ccaccatcag aaggaacaca gccatccaga gaagtgcccc aggccacaaa 7560
gcactggggg ccagagatct cacccctcat gtctgccatg ggttgacccc caacctccag 7620
ccctaccatc tcctgacggt gtctgcacca gttgaaccca accagtatct aaaaggacac 7680
agttggcgaa tgagactggg acacagggca agatgggtgg atgatgggag actcctggag 7740
agcacccgtc gcactgagcg tggacctcat gggagagccc tgttctctga agcatctgtg 7800
catgtcgttc cagcattttc ttcaaggatt gagccagcag caccagtgtt gtaaggtgct 7860
tagatcaatg attcacaaac aaccaatgaa atacgaggtg cctggggtac agtcaacaaa 7920
cacagagaac agagaaacct tcccgttgat gtagagactc cagcctgttt gctcatctct 7980
ggtcctgaag agcccaggcc ccattctttc ctgcccgggg ggatgagggt ggggggtttc 8040
tgcttggcag cacttgccgt gggaggggtg agggactggg tcacgccagc ccgttcgtta 8100
cagccccagg gtttattaga gtgtgcatta gtattattga gtaagtactt gagagtgtct 8160
gatcttgggc cagagaggca caaagatgcc attgtgtggg tccagcacct gcctgcagag 8220
cgtgggtcag ccttgggtcc cagggaagat gacacacacc tgggaaatgc agggtccggg 8280
agggagaagg caaagttctg gctcaggttg gctggggatg aggccagcag agccaggtgc 8340
ccaagggacc tcagccacga actctgagca caggctggca ggtgactctt ggtgcctcat 8400
gcgacttgtt tatctaaagg gatgagattc aaggcctgtc ctgggggctg ggggccgtca 8460
aagctgacga gagaggggaa tgtatattct aacagggaga tggtcgatga atacgtgcag 8520
gaagaaatgg acaggacaat ccagagagat cgcgtgttct gaggacagca cagccaggct 8580
ccggtacgga gtgaagcggg gtcggggagg cggcggggtc cctcatatgg cccgaggagg 8640
ccgtatataa actgaccctg agccacaaaa tagtgccctc ctctgcccct aggaagctcg 8700
agtgcagggt ccaggtgggg aaaatcaatg cagagtgggt cccagagtgg gcggaagctt 8760
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gggctctagg gcgtgcggga ctcagctggc agcagcccca cgtctctctg gttctaaagc 8820
ccagtccatt tctgctcagc agggagatgg ccagttcccc agaggacttg cccagggtcc 8880
cagccgtggc cctgggaggg tgcaggggtt ggtgagggag tatcccgagg ctgtgggccc 8940
tgcctctgtg gcttggggtg cagatggaca ccaccctgcc ctgtcctctc gagtcctctg 9000
ggctcatctg agtgggcgcg ttcgggtggt gcaaactctg gatggcatcg tgtgtctttt 9060
cttctctggc tggcactgac ttgctgttca ccagatgcca gcaatgagga cactccccct 9120
cccggatgca ggactggttg ccaccatggg gaggggtgca ccgtgccacg tgctcccagg 9180
acactggcca gggggctata aagaacatct cgagaggagc cagcacagcc ttgttcagac 9240
gcccagtgac ctgccgaggt cggcagcaca gagctctgga gatgaagacc ctgttcctgg 9300
gtgtcacgct cggcctggcc gctgccctgt ccttcaccct ggaggaggag gatgtgagct 9360
gggttggcgt gggcggatgg aggagccagg cggactcctg ggcagggggc agtgccaggg 9420
gccctgcttt aggaggtgtc actgaaggct ggcttctgac cccgtgctcc cagcctgggg 9480
tggtggtgga ggggtcctat tgttcctcca gcagacacgg ccccccgagg cccagggccg 9540
gagcaggctc gtctcagggg ttcctgctgc actgacgcct gaagcccgaa ggtctcgcag 9600
ggttgggccc tgtggaggga gggctcacct ggtgctgggg cccgggggtc catggggtgc 9660
agacatgccc tccttccact gggggctggg agccctgagc agggggctgg ctctaactca 9720
ctccagctga gctctaacta aggtgcagga acacagcctg cctttaaggg cagcagccgg 9780
gcaccatggg tgtctggtta tagctgcagg cctgagtgcc agggtcagag tagaatctgg 9840
gccacccatg gtgggctcac ggccttggcc tgctccagat cacagggacc tggtacgtga 9900
aggccatggt ggtcgataag gactttccgg aggacaggag gcccaggaag gtgtccccag 9960
tgaaggtgac agccctgggc ggtgggaagt tggaagccac gttcaccttc atgtgagtgt 10020
tgcccactgc agggcccctc aggccacttt cgctcccctc cccagaccca cctggtgccc 10080
attgccccat ccacgtttcg ggtgttggga agagtcaccc cctgccttgg agggaaacag 10140
cctgggcatc ctgaagctcg gtggggtggg ggacagtgga attttcaggt tgccgggtca 10200
gggccatgca ccaggtgagc tgaggatggg ccatgggtgt cctgggagcc gctgcccgcg 10260
tgtctcctgt tttccaggag ggaggatcgg tgcatccaga agaaaatcct gatgcggaag 10320
acggaggagc ctggcaaata cagcgcctgt gagcccctcc cccactccca cccccaccct 10380
cccccaccgc caaccccagt gcaccagcct ccacaggtag agagtgccca ggctgccctt 10440
ttgccagggc cccagctctg cccacctcca aggaggggct ggcctctcct tcctgggggg 10500
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ctggtggccc tgacatcaga caccgggtgt gacaggcttg tccgcagtcg agatggacca 10560
gatcacgcct gccctctggg aggccctagc cattgacaca ttgaggaagc tgaggattgg 10620
gacaaggagg ccaaggatta ggtacgggga ggctgagggt tagggatggg gaagctgagg 10680
gttaaggatg gggaagctga gggttaagga tggggaggct gagggttagg gacgggggcc 10740
aagggttagg gatcgggaag ctgagggtta gggatgagga ggccgagggt tagggatggg 10800
gaggccgagg gttagtgctg cggaagctga ggattagaga tggggaggct gagggggaag 10860
atgagggtta gggacaggga agtggggcag gagcagctgc tggagctggg aaggccggac 10920
tctagtcctg gacgtgctct ggccttgtgg ctccattact tgcattggga ccttcctgag 10980
aggaggctcc tgcctccgtg tccgggtcca cactgtgcgg agcagccagg cctggctcag 11040
gctgtccagg gcacctgggt gaccgctgaa acattcccga gtgtttcttc atgtggcccc 11100
gagtgttctc tctgggaatg acccattttc tctgtcatct acagatgggg gcaggaagct 11160
catgtacctg caggagctgc ccaggaggga ccactacatc ttttactgca aagaccagca 11220
ccatgggggc ctgctccaca tgggaaagct tgtgggtgag gggcttgctg gggtctgcgt 11280
gtcctgcccc acggtctctg cctctggaag ccggtggaac cagcaccacc atgccctggc 11340
atgggggaaa aggaagcccc ctgtgccggc tttcatgtgc cgggcaccgc tgggcagccg 11400
gtccaagtac ctgaagtggg aatgggatgg gccaggcagg gacagacatg gccctcagtg 11460
acatgaacct gccaagggcc acttctgggg tctcgggtgt aggagggtca ccttaagggg 11520
gagggtcacc ttaagcgtcc taagagagct cttcatgggg cagggaccct ccagggcagg 11580
agggtggccg gtgcctctgg gagacaaggt ccctccaggt gagggctgtg accctgcagg 11640
gtggcattgg gagctgccca ggtcccctgg ggttgccgag tggcttggag agtccccgcc 11700
actgtccccc ttcctgggga cctctcatct gggcagtgac tgtctcctct gtccccagtc 11760
ccacccctga gctctcatcc attctcaagt ctcctctcct gcttgtccgg tgctgggcta 11820
tggccatctc ttctgtcccc ggccccaccc cagagctctg gtccactctt gggtctctcc 11880
ccttgtcctg gtgctgggca gtggccatct cctctgtccc cagccccacc cccgagctct 11940
gatccactct caggcctctc cccctgtcct ggtgctgggc cgtggtcgtc tcctttcggc 12000
atctgctccc tgcagggccg tgccgctgtc cccacgtcgg ctcacctggc cacctcacct 12060
gcaggtagga attctgatac caaccgggag gccctggaag aatttaagaa attggtgcag 12120
cgcaagggac tctcggagga ggacattttc acgcccctgc agacgggtga ggatggctgt 12180
gcccagtccc ctgtgtccct ctgctgtgtc tgtctgctat CtCCagtgtC CCatgaCCCC 12240
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catgtcctcc catgtccccc gcattcccca tgtgccccga gtctcctcgc aggggctccc 12300
gggccctgtt tagcgtcctc ctcattggag gctctgtgct ctgggctgcg atggggtctg 12360
gggctccgcg ctctgggctg cgatggggtc tggggctccg cactctgggc tgcgatgggg 12420
tctggggctc cgcgctctgg gctgcgatgg gctctggggc tctgagctct gggctgtgat 12480
ggggtctggg ccctggtcta gggcgccttc taatccctgg gtttttcttg gtctctgcag 12540
gaagctgcgt tcccgaacac tagggtgagt gagcctttag gagggcactg gacaagccca 12600
gagtcctggg ttcccggggt tcgagggtac atctgctctg gcccctccca tcccacacag 12660
ccagggagac ccccccaggg tcaggcacga ggttggcacc tcagagtctg cccacccaca 12720
gttcctggga cattcgggaa gtcctttgtt ttatcattcc tgcacctgcc agcccgagtg 12780
agggtcctcc tcggcctttc cacagcgagg cctccctccg gctccctcag gtgtcagctc 12840
agcccatcgc cccctgcacc tgtccccacg cggtccactc cccaccatcc acccaccaag 12900
gatgctcaga ggcctgccca gtcattggag gagctgaggt cgctctggag ccccgaggtt 12960
gcccagcagt ggccgatgtg ggggctgcag agcctgggga gggagctctg gccctggcct 13020
ctgccctacc ctgcagcctc cctgacctct gctcctcttc ccagcacagc agcccccggg 13080
tctgcacctc cagagcccac cctaccacca gacacagagc ccggaccacc tggacctacc 13140
ctccagccat gacccttccc tgctcccacc cacctgactc caaataaagt ccttctcccc 13200
cagctctggg caggcctatc tgtggggaca gaggggcttg cacccgctcc ctgggaggtc 13260
tgctgggagg gggagccaca agggaagctg gggagatgtt ggacctagca agggccaaac 13320
cacaagaggc acgatgtcca acaggcctga ggggctgcgt gatgtcctgg aggggcctcc 13380
ggaagagccg ccctcaggtc tcaggttcag cttaggacag gcagggccct gggcaggagc 13440
gtttggaaag ccactgggga ggacaggagc ggggacacgg cgtcagggct gcagcagtgg 13500
ggccaccgca gggctcccgc ctcaggggtc tcagagggat cctccaagct cccccatttt 13560
agcagcctgg gctcagtggc agcactggag a 13591
