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CA 02384437 2002-03-08
WO 01/19395 PCT/FR00/02494
COMPOSITIONS ACELLULAIRES IMMUNOGENES ET COMPOSITIONS
ACELLULAIRES VACCINALES CONTRE BACILLUSANTHRACIS
La présente invention concerne des compositions acellulaires
immunogènes ainsi que des compositions acellulaires vaccinales contre Bacillus
anthracis, et leurs applications en médecine humaine et en médecine
vétérinaire.
Bacillus anthracis (B. anthracis), agent responsable de l'anthrax ou
charbon est une bactérie Gram-positive, aérobie et formant des spores.
Cet agent induit une infection soit par inoculation intradermique,
soit par ingestion ou inhalation des spores (Klein F. et al., (1966), J.
Infect. Dis., 116,
1213-138 ; Friedlander A.M. et al., (1993), J. Infect. Dis., 167, 1239-1242),
dont la
transformation en cellules végétatives, formes encapsulées et toxinogènes,
permet à la
bactérie de proliférer et de synthétiser ses facteurs de virulence.
Les Inventeurs ont récemment montré dans un modèle murin d'une
infection pulmonaire par B. anthracis, que les macrophages alvéolaires sont le
site
primaire de la germination, qui est rapidement suivie par l'expression des
gènes des
toxines, confirmant que la rencontre de la spore avec l'hôte est cruciale pour
la patho-
génicité de B. anthracis (Guidi-Rontani E ; et al., Molecular Biology, (1999),
31, 9-
17).
Les principaux facteurs de virulence sont :
- la capsule anti-phagocytique constituée d'acide poly-y-D-
glutamique (Avakyan A. A. et al. (1965), J. ofBacteriology, 90, 1082-1095) et
- trois facteurs protéiques agissant en combinaison par deux. La
toxine oedématogène (PA-EF) induit un oedème après une injection sous-cutanée
alors que la toxine létale (PA-LF) est responsable de la mort des animaux
après injec-
tion intraveineuse (J. W. Ezzell et al., (1984), Infect. Immun., 45, 761-767.
Le facteur
présent dans les deux combinaisons est l'antigène protecteur (PA) qui
intervient dans
la fixation des toxines sur les cellules cibles. Les deux autres facteurs, le
facteur
oedématogène (EF) et le facteur létal (LF) sont responsables de la
manifestation de
l'effet toxique.
La production simultanée de la capsule et des toxines est indispen-
sable pour la manifestation du pouvoir pathogène..
Les gènes codant pour les enzymes synthétisant la capsule sont
portés par le plasmide pXO2 (Green B. D. et al., (1985), Infect. Immun., 49,
291-297;
Uchida I. et al., (1985), J. Gen. Microbiol., 131, 363-367) et les trois gènes
pag, cya,
et lef, codant respectivement pour les facteurs PA, EF et LF sont portés par
le
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plasmide pXO1, qui a été décrit par Mikesell P. et al. (Infect. Immun, (1983),
39, 371-
376).
Alors que de nombreux travaux ont montré que PA est le principal
antigène responsable de la protection dans le cadre d'une immunisation
naturelle ou
acquise par vaccination, les Inventeurs ont montré que LF est également un
immuno-
gène puissant (Mock M. Annales de l Institut Pasteur décembre 1990).
Afin de clarifier le rôle des composants des toxines dans la toxicité
de B. anthracis, les Inventeurs ont construit divers mutants. Ainsi, ils ont
caractérisé
une souche dépourvue du plasmide pXO2 et dépourvue de PA par modification du
plasmide pXO1. Du fait de l'absence de PA, cette souche ne présente plus de
caractère
létal (Cataldi A. et al. (1990), Molecular Microbiology, 4, 1111-1117).
Pour rechercher les éléments susceptibles d'intervenir dans
l'immunisation contre l'infection par B. anthracis, les Inventeurs ont
construit des
mutants, dépourvus d'au moins l'un des facteurs de toxicité responsable de la
patho-
génicité, c'est-à-dire déficient en PA, en EF ou en LF, voire dépourvus du
plasmide
pXOI et dépourvus en plus du plasmide pXO2. Bien que dépourvus de toxicité ou
présentant une toxicité atténuée, les mutants simples, notamment RP9 (EF)
(Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut
Pasteur
sous le numéro I-1094 en date du 2 mai 1991) et RP 10 (LF) (Collection
Nationale de
Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-
1095 en
date du 2 mai 1991), et le double mutant RP 42 (Collection Nationale de
Cultures et
de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en date
du 28
juillet 1999), se sont révélés aptes à produire des anticorps
immunoprotecteurs contre
une infection par une souche Sterne sauvage. Ces mutants sont décrits dans la
demande Internationale n 92/19720, et dans les articles de Pezard C. et al.,
(Infection
and Immunity, (1991), 59, 3472-3477 et J. General Microbiology, (1993), 139,
2459-
2463).
Actuellement, le vaccin vétérinaire commercialisé (Mérial ) est un
vaccin vivant composé d'une suspension de spores de la souche Sterne de B.
anthracis. Son efficacité protectrice chez l'animal varie selon les lots, sans
que les
causes de ces variations puissent être déterminées.
Cette efficacité aléatoire, des effets secondaires ainsi que le risque de
dissémination potentielle de germes vivants dans l'environnement rendent son
utilisa-
tion chez l'homme impossible.
En médecine humaine, deux vaccins contre la maladie du charbon,
essentiellement développés en Angleterre et aux Etats-Unis sont utilisés. Il
s'agit de
vaccins acellulaires constitués principalement de l'antigène protecteur (PA),
préparé à
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partir de surnageants de culture de la souche toxinogène Sterne de B.
anthracis et d'un
adjuvant pouvant être utilisé en médecine humaine, l'hydroxyde d'alumine.
Des étude récentes sur ces deux vaccins ont montré que le 'vaccin
anglais, contenant des traces de EF et de LF induisant une réponse anticorps
en
ELISA, était plus efficace sur le cobaye que le vaccin américain, apparemment
dépourvu de ces deux composants (Turnbull P.C. et al. (1991), Vaccine, 9, 533-
539).
Toutefois ces deux vaccins présentent un certain nombre
d'inconvénients :
- le protocole de vaccination est contraignant, car il nécessite six
injections en dix-huit mois, suivies d'un rappel par an,
- ils induisent des effets secondaires néfastes qui rendent leur utili-
sation limitée,
- la protection induite par ces vaccins acellulaires chez l'animal,
envers un test d'épreuve avec une souche virulente, n'est jamais totale,
contrairement
à celle obtenue avec le vaccin vivant.
Compte tenu de l'importance des infections causées par B.
anthracis, de nombreux travaux sont actuellement consacrés à l'amélioration du
.
vaccin afin qu'il ne présente pas les inconvénients exposés ci-dessus, tout en
présen-
tant la même protection que le vaccin vivant.
Dans ce cadre, les Inventeurs se sont donné pour but de pourvoir à
un vaccin acellulaire fiable, efficace, dépourvu d'effets secondaires qui
pallie les
inconvénients des vaccins existants et dont les propriétés vaccinales soient
faciles à
contrôler.
La présente invention a en conséquence pour objet une composition
immunogène acellulaire, apte à induire une réponse immunitaire contre les
infections à
B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA),
- des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues soit à partir
de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations
choisies parmi
les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine
responsable
d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis
dépourvues d'au moins un des plasmides pXOI et pXO2,
associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
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La présente invention a pour objet une composition immunogène
acellulaire, apte à induire une réponse immunitaire contre les infections à B.
anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA),
- des spores tuées et purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes
de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les
mutations au
niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet
toxique
chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis
dépourvues d'au
moins un des plasmides pXO1 et pXO2,
associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite
composition immunogène acellulaire est apte à produire des anticorps contre B.
anthracis.
La présente invention a également pour objet une composition
vaccinale acellulaire contre B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend
:
- un antigène protecteur (PA),
- des spores tuées et éventuellement purifiées, obtenues soit à partir
de souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations
choisies parmi
les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine
responsable
d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis
dépourvues d'au moins un des plasmides pXOI et pXO2,
associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et à au moins un
adjuvant.
La présente invention a pour objet une composition vaccinale
acellulaire contre B. anthracis, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- un antigène protecteur (PA),
- des spores tuées et purifiées, obtenues soit à partir de souches mutantes
de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies parmi les
mutations au
niveau d'au moins un gène codant pour une protéine responsable d'un effet
toxique
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4a
chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B. anthracis
dépourvues d'au
moins un des plasmides pXO1 et pXO2,
associés au moins à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et à au moins un
adjuvant.
La présente invention a pour objet une souche RPLC2 déposée auprès
de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par
l'Institut
Pasteur sous le numéro 1-2270 en date du 28 juillet 1999.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un sérum polyclonal
dirigé contre des spores tuées dérivées de souches obtenues, soit à partir de
souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies
parmi
les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine
responsable
d'un effet toxique, sélectionnées dans le groupe constitué par un facteur
létal (LF) et
un facteur oedématogène (EF) chez B. anthracis, soit à partir de souches
mutantes
de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2, pour la
fabrication d'un médicament apte à induire une immunisation passive.
La présente invention a pour objet des préparations antigéniques
purifiées, caractérisées en ce qu'elles :
- sont obtenues par sélection des protéines de poids moléculaires respectifs
15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa reconnues par un sérum
polyclonal
de souris obtenu par immunisation desdites souris avec des spores tuées de
souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies
parmi
les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine
responsable
d'un effet toxique, sélectionnées dans le groupe constitué par un facteur
létal (LF) et
un facteur oedématogène (EF) chez B. anthracis, soit à partir de souches
mutantes
de B. anthracis dépourvues d'au moins un des plasmides pXO1 et pXO2,
- consistent essentiellement en les exoantigènes de poids moléculaires
respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et supérieur à 200 kDa.
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La présente invention a pour objet des anticorps spécifiques dirigés contre
les
préparations antigéniques selon l'invention.
Au sens de la présente invention, le terme acellulaire signifie que la
composition immunogène ou vaccinale ne contient plus de cellules viables
(spores
tuées).
Les adjuvants utilisés sont des adjuvants classiquement utilisés et
seront notamment, soit la saponine dans le cas du vaccin vétérinaire, soit
avantageu-
sement choisis dans le groupe constitué par l'hydroxyde d'alumine et le
squalène,
dans le cas du vaccin humain.
Dans le cadre de la présente invention, les spores peuvent être tuées
par tout moyen physique ou chimique conduisant à leur inactivation. A titre
d'exemple
on peut citer le traitement au formaldéhyde ou l'irradiation.
Au sens de la présente invention, on entend par mutation une délé-
tion, une modification ou une addition au niveau du gène concerné, qui résulte
soit en
un gène dépourvu de sa capacité à produire la protéine correspondante, soit
apte à
produire une protéine inactive.
Selon un mode de réalisation particulier de l'Invention, les compo-
sitions immunogènes et les compositions vaccinales peuvent comprendre en outre
au
moins une exotoxine détoxifiée choisie notamment dans le groupe constitué par
le
facteur létal (LF) et le facteur oedématogène (EF) détoxifiés, c'est-à-dire
ayant perdu
leurs propriétés toxiques.
Ces facteurs protéiques inactivés peuvent notamment être obtenus
par expression des gènes mutés au niveau de la séquence codant pour le site
actif
desdits facteurs protéiques (cya ou lei).
Les compositions immunogènes et vaccinales selon
l'Invention possèdent, de manière surprenante, un fort pouvoir protecteur, de
l'ordre
de 100 %, nettement supérieur à celui obtenu avec le PA seul ou les spores
tuées
seules, ce qui permet d'avoir une immunisation complète avec une seule
injection
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dans les conditions du vaccin vétérinaire et deux injections dans les
conditions du
vaccin à usage humain.
Selon un autre mode de réalisation avantageux des compositions
immunogènes et vaccinales selon l'invention, les spores sont issues d'une
souche de
5 B. anthracis choisie dans le groupe constitué par les souches suivantes :
Sterne 7702
(M. Sterne J. Vet. Sci. Anima. Indust., (1939), 13, 315-317), RPLC2
(Collection
Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous
le
numéro I-2270 en date du 28 juillet 1999) et RP42 (Collection Nationale de
Cultures
et de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en
date du
28 juillet 1999).
Dans un autre mode de réalisation avantageux des compositions
immunogènes et vaccinales selon l'invention, l'antigène protecteur est choisi
dans le
groupe constitué par les antigènes protecteurs purifiés, issus de n'importe
quelle
souche Sterne sauvage ou mutée de B. anthracis, et les antigènes protecteurs
recombi-
nants, notamment celui produit par B. subtilis.
De manière avantageuse, l'antigène protecteur est issu de la souche
RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue par
l'Institut
Pasteur sous le numéro I-2271 en date du 28 juillet 1999).
La présente invention a également pour objet la souche RPLC2
déposée auprès de la Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes
tenue
par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du 28 juillet 1999.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins
un anticorps dirigé contre les spores issues de souches, obtenues soit à
partir de
souches mutantes de B. anthracis portant une ou plusieurs mutations choisies
parmi
les mutations au niveau d'au moins un gène codant pour une protéine
responsable
d'un effet toxique chez B. anthracis, soit à partir de souches mutantes de B.
anthracis
dépourvues d'au moins un des plasmides pXOI et pX02, pour la fabrication d'un
médicament apte à induire une immunisation passive. En effet les antibiotiques
sont le
seul traitement actuel contre le charbon et doivent être administrés
précocement, avant
l'apparition du choc toxique. En conséquence une sérothérapie visant à la fois
les
toxines et la germination des spores serait un bon complément.
Les anticorps peuvent être des anticorps polyclonaux obtenus par
immunisation d'un animal approprié avec les spores issues de souches utilisées
pour la
préparation des compositions selon l'invention, dans des conditions
habituelles de
préparation de tels anticorps.
Les anticorps peuvent être des anticorps monoclonaux obtenus de
manière connue en soi, notamment par fusion des cellules spléniques de souris
immu-
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nisées avec un antigène consistant en des spores issues de souches utilisées
pour la
préparation des compositions selon l'invention.
La présente invention a également pour objet des préparations anti-
géniques purifiées, caractérisées en ce qu'elles sont issues de spores de B.
anthracis, et
comprennent par exemple un ou plusieurs des exoantigènes (protéines de spores
et de
l'exosporium) de poids moléculaires respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa, et
supérieur à
200 kDa, lesdits poids moléculaires étant déterminés par l'utilisation de la
trousse
AMERSHAM LMW Electrophoresis Calibration Kit.
Conformément à l'invention, ces compositions antigéniques sont
obtenues par des techniques classiques connues de l'homme du métier.
La présente invention a de plus pour objet les anticorps polyclonaux
ou monoclonaux dirigés contre lesdites compositions antigèniques.
Les compositions immunogènes et vaccinales selon l'invention
peuvent être administrées, seules ou en combinaison avec d'autres vaccins, par
injec-
tion ou par toute voie habituellement utilisée pour la vaccination.
Les dose à administrer seront déterminées en fonction de l'animal ou
de la personne que l'on cherche à protéger.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent
dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans
lesquelles :
- la figure 1 représente l'analyse par immunoblot des protéines de la
spore selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 5,
- la figure 2 représente l'analyse par immunoblot des protéines de
l'exosporium (A) révélation par un anticorps polyclonal et un anticorps
monoclonal
(35B8) (B) analyse selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 5,
- la figure 3 représente les différentes souches de B. anthracis utili-
sées pour préparer la souche RPLC2. La souche RPLC2 produit les composants des
toxines inactivés par mutations ponctuelles dans les sites actifs des
protéines LF
(LF686 ; H686-*A) et EF (EF346/353 ; K346->Q et K353->Q). Dans cette figure,
les
nombres qui suivent à indiquent les nucléotides auxquels les délétions
commencent et
finissent ; Erm, Kan et Sps indiquent l'insertion de cassettes de résistance à
l'érythromycine, à la kanamycine et à la spectinomycine ; 0 correspond à un
orga-
nisme qui ne présente pas de résistance à ces antibiotiques.
EXEMPLE 1 : Matériel et méthode pour la préparation des compositions selon
l'invention.
1.1. Construction de la souche RPLC2
La souche RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et de
Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du
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juillet 1999) est construite à partir des souches indiquées dans la figure 3,
selon les
principes opératoires décrits par Pezard C. et al. (1993) (référence citée).
1.2. Préparation du PA
La protéine PA est préparée à partir de la souche mutante de B.
anthracis RP42 (Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes tenue
par
l'Institut Pasteur sous le numéro I-2271 en date du 28 juillet 1999).
Les surnageants de culture en milieu R (Ristroph J. D. et al. (1983),
Infection and Immunity, 39, 483-486) sont filtrés puis concentrés sur un
système
Minitan (membrane Millipore PLGC OMP).
L'antigène PA est ensuite purifié par chromatographie ultra-rapide
(FPLC) sur colonne monoQ selon le protocole décrit par Pezard C. et al.
(1993)
(référence citée).
1.3. Préparation et inactivation des spores
Les spores sont préparées à partir de la souche Sterne 7702 selon le
mode opératoire décrit par Guidi-Rontani E et al. (1999) (référence citée).
Les spores sont préparées sur un milieu solide NBY, puis lavées à
l'eau distillée. Elles sont inactivées par traitement au formol, à une
concentration
finale de 4 %, pendant 3 heures à 37 C.
Après lavage par centrifugation, les spores sont reprises dans le
volume initial de sérum physiologique (concentration finale de 109 spores/ml).
Cette suspension est utilisée pour réaliser l'immunisation.
Si nécessaire, notamment lorsque l'on veut préparer un vaccin à
usage humain, les spores peuvent être purifiées avant le traitement au formol
sur un
gradient de Radioselectran (Schering S.A.) de 50 % à 76 %.
1.4. Préparation des compositions vaccinales
Les compositions sont préparées soit à partir de spores tuées seules
préparées selon le mode opératoire décrit en 1.3, soit à partir d'un mélange
de PA (à
une concentration telle qu'on injectel0 gg par souris) et de spores tuées (10e
spores
par souris), auxquels on ajoute comme adjuvant soit de l'hydroxyde d'alumine à
une
concentration finale de 0,3 %, soit de la saponine à une concentration finale
de 0,05 %.
1.5. Protocole de traitement des souris
On utilise des souris Swiss femelles de six semaines fournies par la
Société Iffa-Credo (BP0102 - 69592 L'ARBRESLE-Cedex).
Les animaux sont répartis en groupe de six et nourris ad libitum.
Les injections sont faites par voie sous-cutanée au niveau de l'aine
sous un volume de 200 l.
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1.6. Mesure des taux d'anticorps
Les taux d'anticorps sont mesurés par un test ELISA classique.
EXEMPLE 2: Effet de deux immunisations dans les conditions du vaccin
acellulaire humain (protocole n 1)
2.1. Traitement des animaux
Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections de compositions vaccinales préparées comme indi-
qué au point 1.4. ou d'adjuvant (hydroxyde d'alumine) sont réalisées à 28
jours
d'intervalles et
- une injection d'épreuve est réalisée au 43 sème jour avec la souche
virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n 2) fournie par
la
Société Rhône-Mérieux.
Quatre groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole
comme suit :
- le premier groupe reçoit l'hydroxyde d'alumine seule (groupe
témoin),
- le second groupe reçoit une dose de PA de 10 gg par souris,
- le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores
par souris et
- le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de
manière à avoir 10 g de PA et 108 spores par souris.
Tous les groupes reçoivent au 431Cme jour, comme précisé ci-dessus,
une dose d'épreuve correspondant à 30 fois la DL50, soit 1,5 x 10 spores par
souris.
2.2. Résultats
Les taux de survie sont donnés dans le Tableau I ci-dessous.
TABLEAU I
Traitement Nombre de morts au Pourcentage de survie
43 sème jour au 431tme jour
Adjuvant seul 6/6 0%
PA seul 3/6 50%
Spores tuées seules 2/6 33 %
PA + spores tuées 0/6 100 %
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Ces résultats montrent clairement que seules les compositions vacci-
nales selon l'invention sont aptes à permettre une protection complète.
EXEMPLE 3: Effet de deux immunisations dans les conditions du vaccin à usage
humain (protocole n 2)
3.1. Traitement des animaux
Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections de compositions vaccinales préparées comme indi-
qué au point 1.4. ou d'adjuvant (hydroxyde d'alumine) sont réalisées à 21
jours
d'intervalles et
- une injection d'épreuve est réalisée au 32 "me jour avec la souche
virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n 2) fournie par
la
Société Rhône-Mérieux.
Quatre groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole
comme suit :
- le premier groupe reçoit l'hydroxyde d'alumine seule,
- le second groupe reçoit une dose de PA de 10 g par souris,
- le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores
par souris et
- le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de
manière à avoir 10 g de PA et 108 spores par souris.
Tous les groupes reçoivent, au 32"e jour, comme précisé ci-dessus,
une dose d'épreuve correspondant à 100 fois la DL50, soit 1,5 x 104 spores par
souris.
3.2. Résultats
3.2.1. Taux de survie
Les résultats sont donnés dans le Tableau II ci-dessous.
TABLEAU II
Traitement Nombre de morts au Pourcentage de survie
32 'eme jour au 32 "me jour
Adjuvant seul 6/6 0%
PA seul 1/6 83%
Spores tuées seules 1/7 85 %
PA + spores tuées 0/6 100 %
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Ces résultats montrent clairement que seules les compositions vacci-
nales selon l'invention sont aptes à permettre une protection complète.
3.2.2. Taux d'anticorps
Les taux d'anticorps dirigés contre les spores sont élevés, de l'ordre
5 de 10 000 à 15 000, et identiques dans les deux groupes qui les ont reçues,
que ces
spores soient seules ou associées à PA.
Ces résultats confirment l'effet de synergie des compositions selon
l'invention, qui, avec un taux d'anticorps identique à celui obtenu par
injection des
spores tuées seules, permettent une protection complète.
10 EXEMPLE 4 : Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon
l'invention avec le vaccin vivant Sterne dans les conditions du vaccin à usage
vétérinaire (une seule injection en utilisant la saponine comme adjuvant) :
épreuve avec souche 17JB.
4.1. Traitement des animaux
Le protocole d'injections pour chaque groupe est le suivant :
- une injection de compositions vaccinales préparées comme indiqué
au point 1.4. ou de saponine est réalisée à JO et
- une injection d'épreuve est réalisée au 321Cme jour avec la souche
virulente 17JB de B. anthracis (souche de référence Pasteur n 2) fournie par
la
Société Rhône-Mérieux.
Cinq groupes d'animaux sont immunisés selon ce protocole comme
suit
- le premier groupe reçoit la saponine seule (groupe témoin),
- le second groupe reçoit une dose de PA de 10 g par souris,
- le troisième groupe reçoit les spores seules à raison de 108 spores
par souris,
- le quatrième groupe reçoit le mélange PA + spores tuées de
manière à avoir 10 g de PA et 10$ spores par souris et
- le cinquième groupe reçoit le vaccin vivant Sterne préparé à
l'Institut Pasteur.
Tous les groupes reçoivent une dose d'épreuve correspondant à 100
fois la DL50, soit 105 spores au 32 sème jour
4.2. Résultats
Ils sont donnés dans le Tableau III ci-dessous.
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TABLEAU III
Traitement Nombre de morts au Pourcentage de survie
32 ième jour au 32 ième jour
Adjuvant seul 6/6 00/0
PA seul 1/6 83 %
Spores vivantes 0/6 10011/0
Spores tuées seules 4/6 33 %
PA + spores tuées 0/6 100 %
Ces résultats montrent clairement que les compositions vaccinales
selon l'invention sont aussi efficaces que le vaccin vivant et pourraient par
conséquent
être avantageusement utilisées comme vaccin vétérinaire.
EXEMPLE 5: Analyse par immunoblot des protéines de spores de B. anthracis
5.1. Matériel et méthode
5.1.1. Préparation des anticorps polyclonaux et monoclonaux.
Un sérum polyclonal de souris immunisées avec des spores tuées
issues, par exemple, de la souche RPLC2 (Collection Nationale de Cultures et
de
Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur sous le numéro I-2270 en date du
28
juillet 1999) est préparé selon des techniques classiques et connues de
l'homme du
métier.
L'anticorps monoclonal spécifique de la surface de la spore (35B8)
est préparé selon la technique décrite par Kohler et al., (1975), Nature, 296,
495-497.
5.1.2. Extraction des spores
Les protéines de la spore sont solubilisées par traitement des spores
avec un tampon Tris-HCI à pH 9,8 contenant 8 M d'urée et 2 % de SDS ou avec un
tampon Tris10 mM à pH 9,5 contenant 10 mM d'EDTA et 1 % de SDS, selon la
technique décrite par Garcia-Patrone, (1995), Molecular and Cellular Biochem.,
145,
29-37).
5.2. Résultats
Ils sont illustrés à la figure 1 et à la figure 2.
Le sérum polyclonal de souris reconnaît 3 espèces protéiques de
poids moléculaire respectifs 15 kDa, 30 kDa, 55 kDa et une espèce protéique de
poids
moléculaire supérieur à 200 kDa. (Figure 1).
L'espèce la plus lourde est également reconnue par l'anticorps
monoclonal 35B8 et semble appartenir à l'exosporium (Figure 2A).
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En effet l'analyse par immunoblot des protéines de l'exosporium
montre que les différents anticorps monoclonaux utilisés, dont 35B8,
reconnaissent
une espèce protéique de poids moléculaire supérieur à 200 kDa (Figure 2A).
Il ressort de ce qui précède que les compositions vaccinales selon
l'invention sont aptes à permettre une protection complète aussi bien dans les
condi-
tions du vaccin humain que du vaccin vétérinaire.
EXEMPLE 6: Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon
l'invention administrées selon le protocole n 1 de l'Exemple 2, avec
l'antigène
PA seul, chez la souris ou chez le cobaye : épreuve avec la souche 9602.
A. Souris Swiss
6.1. Traitement des animaux :
Le protocole d'injection pour chaque groupe est le suivant :
- deux injections des compositions vaccinales préparées comme
indiqué au point 1.4 dans l'exemple 1 sont réalisées à 15 jours d'intervalle
(JO et J15),
et
- une injection d'épreuve est réalisée au 35ème jour avec le souche
virulente 9602 (M. Berthier et al., Lancet, 1996, 347, 9004:828) isolée à
partir d'un
cas mortel de charbon humain et dont la virulence est dix fois supérieure à
celle de la
souche 17JB utilisée dans les exemples précédents ; ladite souche est injectée
en sous-
cutanée.
4 groupes d'animaux tels que définis à l'exemple 2 sont immunisés
selon ce protocole.
Tous les groupes reçoivent au 35ème jour, comme précisé ci-dessus,
une dose d'épreuve correspondant à 30 fois la DL50, soit 1,5 x 104 spores par
souris.
6.2. Résultats
Les expériences ont été répétées 3 fois, avec des préparations diffé-
rentes, sur des lots de 6 à 8 souris par point (pour raison de confinement
P3).
Les taux de survie sont illustrés dans le Tableau IV ci-après.
TABLEAU IV
Traitement Pourcentage de survie au
35è` jour et jusqu'au 43ème jour
Adjuvant seul 0%
PA seul 0%
Spores tuées seules 0%
PA + spores tuées 100 %
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B. Cobayes.
Les expériences ont été réalisées 2 fois, sur des lots de 5 cobayes. Le
protocole est similaire à celui utilisé chez la souris, à l'exception des
points suivants
- les doses de PA sont de 40 g par animal,
- l'injection d'épreuve est réalisée par voie intramusculaire.
On obtient 100 % de survivants pour la combinaison selon
l'invention, spores tuées + PA, contre 40 % chez les animaux recevant PA seul,
composition du vaccin classique.
6.3. Taux d'anticorps.
Ces expériences (souris et cobayes) ont été accompagnées du suivi
de la réponse en anticorps par ELISA sur des échantillons de sérum de souris
et de
cobayes. Les titres en anticorps envers PA sont élevés (> 5000) ; une réponse
du
même ordre est détectée envers des antigènes spécifiques de la spore.
EXEMPLE 7: Comparaison de l'efficacité des compositions vaccinales selon
l'invention avec le vaccin vivant Sterne dans les conditions du vaccin à usage
vétérinaire telles que décrites à l'Exemple 4 (épreuve avec souche 9602).
Le test a été réalisé sur souris Swiss (dans les conditions décrites à
l'Exemple 4). L'injection d'épreuve est réalisée avec la souche 9602 (M.
Berthier et
al., précité) chez des souris ayant reçu une seule injection, soit de spores
vivantes
(RPLC2), soit de la combinaison selon l'invention, spores tuées + PA.
L'efficacité de
protection, de 83 %, est identique pour les deux lots.
Ces résultats montrent clairement qu'il est possible de protéger à
100 % des souris et des cobayes avec une combinaison vaccinale comportant des
spores tuées et de l'antigène PA.
