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PROCEDE DE TRAITEMENT D'UN FLUX AQUEUX PAR
ELECTROPULSATION A CHAMP PARALLELE A L'ECOULEMENT,
CHAMBRE DE PULSATION ET APPLICATIONS.
La présente invention concerne un procédé de traitement d'un flux
aqueux colonisé par des cellules par l'application d'un champ électrique
parallèle à l'écoulement du flux, une chambre d'écoulement et
d'électropulsation ainsi que leur application au traitement cellulaire,
notamment la destruction, le transfert transmembranaire de molécules, la
fusion membranaire et l'insertion de protéines membranaires.
II est connu d'appliquer un champ électrique à des cellules
lorsque l'on place une cellule dans un champ électrique, les lignes de
champ sont déviées par celle-ci, ce qui provoque une accumulation des
charges à la surface de la cellule. Ainsi, il en résulte une différence de
potentiel transmembranaire induite 0V qui se superpose à la différence
native D~o [Bernardt J. et Pauly H. (1973):(1 )].
La formule la plus complète retenue dans le cas d'un champ à
cinétique en vague carrée et d'une cellule sphérique en suspension est la
suivante [Kinosita et Tsong (1979) (2)]
OV(t) = fg(~,) r E(t) cos 8 (1-e-"tP) éq 1
L'expression de cette différence de potentiel induite en un point M
au temps t est fonction de
E : l'intensité du champ électrique appliqué,
f : le facteur forme de la cellule (1,5 dans le cas d'une sphère),
g (7~) : est un facteur (de la perméabilité membranaire ~,) lié aux
conductivités des milieux externe et interne et à celle de la
membrane,
r : le rayon de la cellule,
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0 : l'angle entre le vecteur champ électrique macroscopique et
la normale au plan de la membrane au point considéré M,
TP : est le temps de charge de la capacité membranaire (de
l'ordre de la microseconde).
t : temps d'application du champ.
Lorsque la durée des impulsions est très supérieure au temps de
charge de la membrane (t » TP), le terme (1-e-UTP) devient très proche de 1,
on retrouve alors, à l'état stationnaire la formulation classique
OV(t) = fg(~,) r E(t) cos 8 éq 2
Le terme en cos 8 indique que pour une valeur de champ donnée,
l'amplitude de cette différence de potentiel n'est pas identique en tout point
de la cellule. Elle est maximale aux points faisant face aux électrodes
(pôles) et diminue le long de la surface cellulaire pour s'annuler à
l'équateur.
Cette différence de potentiel généré par le champ s'ajoute à la
différence de potentiel de repos 0'l'0. II en résulte une différence de
potentiel résultante ~Vr.
OVr = ~~I'o + 0V éq 3
Au niveau de l'hémisphère cellulaire situé face à l'anode, les
valeurs numériques de D~o et de OV s'additionnent pour tenir compte de la
vectorialité de l'effet du champ, ce qui entraîne une hyperpolarisation de la
membrane. En revanche, au niveau de l'hémisphère situé face à la
cathode, les valeurs numériques de ~~'o et de 0V se retranchent, et la
membrane subit une dépolarisation.
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Lorsque cette différence de potentiel membranaire résultante
devient supérieure à une valeur seuil estimée à 200-250 mV [Teissié et
Tsong (1981 ):(3)], il y a induction d'un phénomène de perméabilisation [Ho
et Mittal (1996):(4)].
La structure membranaire responsable de cette perméabilité
membranaire est inconnue à ce jour, et on emploie préférentiellement le
terme de structure transitoire de perméabilisation (STP), ce qui est exprimé
de façon usuelle par le terme de "pores".
Si les conditions d'électroperméabilisation sont contrôlées, ce
phénomène de perméabilisation est transitoire et réversible, et affecte peu
ou pas la viabilité cellulaire. Cette propriété induite par le champ permet
d'avoir un accès direct au contenu cytoplasmique [Mir et al. (1988):(5) ;
Tsong (1991 ):(6) ; Hapala, (1997):(7)]. Ceci permet de faire pénétrer dans
la cellule des molécules étrangères et naturellement non perméantes et de
modifier ainsi son contenu de façon soit transitoire, soit permanente
(électrochargement, électrotransformation, électroinsertion).
En revanche, dans des conditions d'électropulsation particulières
drastiques, l'électroperméabilisation est un phénomène irréversible qui
conduit à la mort cellulaire ou électromortalité [Hamilton et Sale (1967):(8)
;
Sale et Hamilton (1967):(9), (1968):(10), Hulsheger et al., (1981 ):(11 ),
(1983):(12) ; Mizuno et Hori (1988):(13) ; Kekez et al. (1996):(14), Grahl et
Màrkl (1996):(15)]. Cette propriété a été utilisée soit pour lyser des
cellules
afin de récupérer un métabolite d'intérêt, non excrété naturellement par la
cellule, soit pour éradiquer des cellules en environnement (désinfection) ou
dans les fluides alimentaires (stérilisation non thermique) [Jayaram et al.
(1992):(16), Knorr et al. (1994):(17) ; Qin et al. (1996):(18) ; Qin et al.
(1998):(19)].
II existe dans l'art antérieur deux systèmes moyens d'appliquer un
champ électrique pulsé à un milieu liquide, et le choix dépend notamment
du volume de milieu liquide à traiter. Ainsi, des systèmes de pulsation à lit
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fixe, encore appelé batch ont été décrits. Ces installations (chambres) et
procédés ne permettent toutefois de traiter que de faibles volumes de
l'ordre de la fraction de ml. La limite technique est associée à la puissance
disponible sur les générateurs d'impulsions électriques pour un coût
raisonnable. Outre les travaux de recherche, cette approche permet en
milieu industriel l'obtention d'organismes génétiquement modifiés (OGM).
Par ailleurs, on a décrit l'application d'un champ électrique pulsé à
un flux, qui permet de traiter une suspension cellulaire en écoulement.
Pour le processus en écoulement ou flux, deux stratégies ont été décrites
le flux continu et le flux séquentiel.
Dans le second modèle dit à flux séquentiel, la chambre de
pulsation est remplie, le flux est arrêté, le champ est ensuite appliqué puis
la chambre est vidée, puis elle est remplie à nouveau. Les cellules sont
immobiles pendant l'application du champ. II n'y a donc pas de contraintes
hydrodynamiques. Les conditions de travail sont donc identiques à celles
décrites pour des expériences à lit fixe. Le débit est limité par la nécessité
des temps d'arrêt présents lors de l'application des impulsions. II est
cependant possible de travailler sur des volumes importants mais pour des
durées longues.
L'avantage du système en flux est en effet de pouvoir traiter des
volumes importants. Le flux consiste en un écoulement sans interruption
dans la chambre et en une synchronisation des trains d'impulsions avec le
débit de l'écoulement. II est alors possible d'appliquer un nombre bien
défini d'impulsions sur les cellules lors de leur temps de résidence dans la
chambre de pulsation. Les cellules sont alors en déplacement et soumises
à des contraintes hydrodynamiques de déformation et d'orientation. Le
débit peut être très élevé n'étant limité que par la fréquence des
impulsions. Cette approche permet donc de travailler sur des volumes
importants dans des temps courts.
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Ainsi, pour réaliser certains traitements de flux séquentiel et/ou
continu et notamment pour traiter certains flux colonisés, il est connu
d'utiliser des systèmes en flux en appliquant un champ perpendiculaire à
l'écoulement [Teissié et Conte (1988):(20) ; Teissié et Rols, (1988):(21 ) ;
5 Sixou et Teissié, (1990):(22) ; Teissié et al. (1992):(23), Rols et al.
(1992):(24) ; Bruggeman et al. (1995):(25) ; Qin et al. (1996):(18)].
On a également proposé des systèmes où le flux et les électrodes
sont coaxiaux, systèmes avec lesquels on applique un champ non
uniforme mais toujours perpendiculaire à l'écoulement [Qin et al.
(1996):(18) ; Qin et al. (1998):(19)]. Dans toutes les descriptions
antérieures, le champ est appliqué de façon perpendiculaire à
l'écoulement.
D'après Bruggeman et al. (1995):(25), pour une valeur de champ
électrique donnée, la technique en flux résulte toutefois en une moins
bonne efficacité que celle obtenue en batch, comme cela a été constaté
pour l'électrochargement d'inositol hexaphosphate sur des globules rouges.
Ainsi, selon ce procédé, une augmentation de l'intensité du champ
électrique de 10% est nécessaire pour obtenir avec un flux continu des
résultats similaires à ceux obtenus en batch. II y a alors nécessité de
travailler à intensité de champ plus intense, donc avec des coûts
d'utilisation plus élevés. En termes d'efficacité de chargement, l'approche
par écoulement permet de traiter un volume beaucoup plus considérable.
On a maintenant mis en évidence que l'application d'un champ
électrique de façon sensiblement parallèle au flux peut permettre d'obtenir
un meilleure efficacité des procédés de traitement en flux continu.
Avec certaines espèces, dans le cas de l'électromortalité, le
procédé de l'invention permet une éradication totale de la population, alors
que celle-ci, que ce soit en flux à champ perpendiculaire ou en lit fixe,
n'est
pas possible avec les procédés et installations connus.
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De plus, la perméabilisation totale de la population de cellules
sphériques déformables est possible, alors qu'un effet partiel est obtenu
avec les procédés et installations connus.
En outre, selon l'invention, il est possible de travailler avec des
champs plus faibles, donc dans des conditions économiques de coût de
fonctionnement plus rentables, par comparaison avec la technique batch
(lit fixe).
Enfin, cette configuration peut également être intéressante pour les
systèmes cellulaires non sphériques, par exemple les systèmes cellulaires
en bâtonnet qui subissent l'orientation forcée liée à la contrainte de
l'écoulement.
Ainsi, selon un premier objet de l'invention, celle-ci concerne un
procédé de traitement d'un flux aqueux colonisé par des cellules par un
champ électrique pulsé appliqué au flux caractérisé en ce que le champ
électrique est appliqué sensiblement parallèlement à l'écoulement.
Un autre objet de l'invention concerne une chambre d'écoulement
et de pulsation. Des dispositifs de traitement des flux aqueux par un champ
sont connus. Selon l'invention, la chambre comporte au moins deux
électrodes susceptibles de créer un champ uniforme sensiblement parallèle
au flux s'écoulant entre elles.
Un moyen de créer une telle configuration du champ consiste à
prévoir comme électrodes susceptibles de créer un champ uniforme
parallèle au flux s'écoulant entre elles, par exemple des électrodes au
travers desquelles le flux s'écoule. De telles électrodes peuvent être des
plaques trouées, des grilles, des toiles ou des barreaux par exemple.
La section transversale de la chambre de pulsation peut avoir la
forme notamment d'un cercle ou d'un polygone ou encore une forme
elliptique. Lorsqu'elles sont de type grille ou barreau, les électrodes sont
parallèles. Toutefois, d'autres configurations sont envisageables qui
permettent de créer un champ uniforme parallèle au flux.
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Par ailleurs, la section longitudinale n'est pas nécessairement à
bords parallèles. Ainsi, le flux colonisé peut être soumis à une contrainte
hydrodynamique avant, après ou pendant son passage dans la chambre. II
peut être envisagé des géométries plus complexes en particulier des
venturi où une contrainte hydrodynamique sera appliquée lors du passage
dans la chambre. De telles contraintes peuvent être appliquées de façon
connue par le choix de la configuration des conduites d'amenée et de
sortie du flux de la chambre, ainsi que du flux vers la chambre, et la
configuration de la chambre elle-même.
Parmi les applications du procédé et des chambres selon
l'invention, on peut citer la destruction cellulaire des cellules indésirables
présentes dans un milieu aqueux colonisé et l'extraction de métaboliques
cytoplasmiques par perméabilisation des membranes, ainsi que la
modification du contenu cytoplasmique par transfert de petites molécules
ou de macromolécules (peptides, protéines, acides nucléiques
oligonucléotides, ARN, ADN), la fusion de cellules et l'insertion de
protéines transmembranaires.
De plus, l'invention concerne un procédé de destruction cellulaire
où l'on soumet un flux aqueux colonisé à un champ électrique
sensiblement parallèle à son écoulement. Elle concerne aussi un procédé
de perméabilisation membranaire de cellules d'un flux aqueux colonisé, par
application d'un champ électrique sensiblement parallèle au flux.
Enfin, la présente invention concerne l'application du procédé de
traitement au transfert d'acides nucléiques (ARN, ADN, oligonucléotides)
dans les cellules, au transfert de protéines dans les cellules, à l'extraction
de molécules et de macromolécules cytoplasmiques contenues dans les
cellules, à la fusion cellulaire et la production d'hybrides et/ou à
l'insertion
de protéines membranaires.
Par flux colonisé, on entend tout flux de milieu aqueux domestique,
naturel, alimentaire ou utilitaire comportant des cellules indésirables. Ces
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cellules ou microorganismes peuvent être de façon générale tout
organisme monocellulaire se développant ou vivant dans le flux aqueux.
Dans certains cas, il y a lieu de les éradiquer pour des raisons de santé ou
d'hygiène publique, d'écologie ou d'entretien d'équipements industriels.
Ainsi, certaines cellules prolifèrent dans certains milieux et leur présence
ou leur multiplication dans les eaux et liquides à traiter est néfaste au
fonctionnement des installations ou à. la santé ou au bien-être. Le flux
colonisé peut être un milieu aqueux contenant des cellules ou
microorganismes producteurs de molécules d'intérêt dont on souhaite
récupérer le contenu ou introduire des molécules ou macromolécules
effectrices sur son activité (modification génétique par exemple).
II peut s'agir de cellules sphériques déformables mais également
de tout système cellulaire sensible au champ électrique, en vue de
l'électromortalité, et des autres applications des procédés de l'invention, et
notamment des systèmes cellulaires ayant d'autres configurations, comme
des bâtonnets, des bactéries ou des levures peuvent être traités.
La présente invention sera mieux comprise au vu de la description
détaillée et des dessins annexés.
La figure 1 illustre, pour des amibes, les résultats en terme de
pourcentage de viabilité des cellules, par l'application de champ électrique
pulsé où le champ est appliqué respectivement de façon parallèle à un
écoulement (1-noir), de façon perpendiculaire à un écoulement (2-grisé) et
de façon discontinue (batch - blanc).
Les figure 2A et 2B illustrent, en terme de pourcentage de
perméabilisation de la membrane cellulaire d'amibes, l'efficacité d'un
champ appliqué à intensité E (kV/cm) de façon perpendiculaire à
l'écoulement (flux -~- 2A) et celle d'un champ appliqué de façon parallèle à
l'écoulement (flux -~- 2B), comparées à celle d'un champ appliqué de façon
discontinue (batch : -o- 2A et 2B).
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La figure 3 représente une vue schématique d'une cellule utilisable
selon l'invention.
Selon l'invention, de préférence, le flux est continu. Toutefois, le
procédé de l'invention peut également être mis en oeuvre avec un flux
séquentiel.
Les valeurs définissant le champ électrique appliqué dépendent de
l'installation et de l'application prévue pour le procédé. Ainsi la différence
de potentiel électrique appliquée entre les deux électrodes est une fonction
de l'utilisation envisagée. Elle est souvent sous le contrôle de la distance
entre les deux électrodes. Elle doit permettre de couvrir des gammes de
champ électrique comprises entre quelques V/cm et des dizaines de
kV/cm. L'intensité du champ électrique appliqué peut étre choisie entre 0,1
et 100 kV/cm. Le profil des impulsions est optimisé pour le type
d'application. II peut être de type vague carrée, trapèze, sinusoide; triangle
ou à déclin exponentiel. Les impulsions peuvent être unipolaires ou
bipolaires.
La fréquence des impulsions est optimisée pour le type
d'applications mais reste de préférence inférieure au MHz.
Le système de pulsation mis au point au laboratoire pour mettre en
oeuvre le procédé de l'invention comporte les différents éléments suivants
un réservoir de cellules doté notamment d'un agitateur, une pompe
péristaltique, une chambre de pulsation et une décharge du flux traité
permettant de récupérer les cellules, et des moyens de convoyer le flux du
réservoir à la chambre et de la chambre à la décharge. Un exemple de
réalisation de la chambre sera décrit plus loin en détail.
La pompe péristaltique (pompe, minipuls 3, Gilson) assure une
surpression dans le réservoir de cellules, ce qui permet d'entraîner la
suspension cellulaire vers la chambre d'électropulsation, sans passage
entre les galets de la pompe. Celle-ci est dotée d'un système débimétrique
qui permet de régler le débit de manière précise.
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Le débit Q utilisé est basé sur la notion de temps de résidence de
sorte que chaque cellule qui rentre dans la chambre de pulsation subisse
les mémes conditions électriques. II est défini par la fréquence (F), le
nombre (N) des impulsions et par le volume (V) de la chambre de pulsation
5 par la relation suivante
fréquence (Hz) x 60 x Volume de la chambre (ml)
Q(ml/minute) _
nombre d'impulsions appliquées
Selon l'invention, le débit peut être optimisé pour le type
d'applications. Le débit est de l'ordre de 0,5 ml/min à plusieurs m3/s.
Les électrodes dans les deux systèmes sont connectées à un
générateur de haute tension impulsionel (1,5 kV/cm, 8 Amp, durée des
impulsions programmables de 5 ~,s à 24 ms, fréquence de 0,1 à 10 et
jusqu'à 2000 Hz en pilotage externe) relié à un oscilloscope (Enertec)
permettant ainsi de visualiser les paramètres électriques délivrés. Le profil
cinétique des impulsions délivrées par le générateur est dit en vague
carrée, l'intensité du champ demeurant constante durant toute la durée des
impulsions (T). La flexibilité de l'électropulsateur permet de moduler la
tension, la durée, le nombre et la fréquence des impulsions.
Exemple
Méthode de mesure
Les expériences ont été réalisées sur des amibes, sous forme
végétative (Naegleria lovaniensis Ar9M1). La taille des cellules est de
18,2 ~m (8,5 ~m - 31,5 pm) x 10,9 pm (4 ~m - 21 gym). Elles sont cultivées
en condition axénique sur des boîtes plastiques à 37°C et en utilisant
le
milieu de culture de Chang. Le milieu de pulsation utilisé est de l'eau de
rivière filtrée et ayant une conductance de l'ordre de 200 ~S/cm.
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La viabilité est évaluée 24 heures après le traitement électrique par
la technique de coloration au crystal violet.
La perméabilisation des cellules est quantifiée en cytométrie de
flux par l'utilisation d'un marqueur fluorescent naturellement non perméant,
l'iodure de propidium.
1 ) Descriptif du système de pulsation à lit fixe
La chambre de pulsation est constituée de deux électrodes à
lames en acier inoxydable planes maintenues parallèles par des cales
isolantes. La distance interélectrode est de 0,4. cm.
2) Descriptif des électrodes en écoulement pour un champ
perpendiculaire à l'écoulement (comparatif).
Les électrodes en acier inoxydable sont constituées par deux
lames parallèles séparées par une distance interélectrode de 0,4 cm. Le
volume de la chambre de forme parallélépipédique de pulsation est de 0,2
ml.
3) Descriptif des électrodes en écoulement pour un champ
parallèle
Les électrodes utilisées en acier sont des grilles constituées d'un
maillage (80 ~m x 100 pm) au travers duquel les cellules transitent. La
distance interélectrode est de 0,93 cm et le volume de la chambre de
pulsation est de 0,117 ml.
Dans les deux cas, le milieu aqueux colonisé est pompé à partir
d'un réservoir agité.
Le flux aqueux créé est ainsi entraîné dans une conduite. La
chambre de pulsation délimitée par les deux électrodes quel que soit
l'orientation du champ est constituée par une portion de la conduite
délimitée par deux électrodes. Les électrodes sont en forme de grillage et
laissent passer le flux dans le cas du champ parallèle. Les électrodes sont
reliées à un électropulsateur. Les deux chambres de pulsation en flux ont
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des volumes différents, ce qui explique pourquoi les débits utilisés pour
avoir les mêmes conditions d'électropulsation sont différents. Le débit dans
le cas où le champ est perpendiculaire à l'écoulement est de 1,2 ml/min et
celui de la configuration du champ parallèle à l'écoulement est de 0,71
ml/min.
Le liquide amené par une connectique reliée à une pompe
d'alimentation passe à travers la première électrode, traverse la chambre,
puis la seconde électrode avant d'être récupéré.
1 - Le corps
Un trou cylindrique (diamètre de l'ordre des millimètres) est percé
dans une plaque de plexiglas (épaisseur de 1 à 10 mm).
Matériau : plexiglas, qui est un isolant électrique, tout autre
matériau isolant peut être envisagé, en particulier ceux qui sont aptes à
être moulés.
La section transverse a été choisie pour une commodité de
réalisation (un coup de foret).
La section longitudinale est à bords parallèles, ce qui assure un
critère de bonne homogénéité du champ donc de traitement des cellules.
2 - Les électrodes
De la toile métallique en acier (grille) ou des aiguilles en acier
inoxydable (barreau) ont été utilisées. Pour la toile, la maille a été choisie
avec un pas fin pour assurer une bonne conformité du champ. Cela permet
de traiter de façon plus homogène les cellules.
Tout matériau conducteur de l'électricité peut constituer les
électrodes.
Les électrodes sont reliées au générateur d'impulsions électriques.
Les électrodes sont placées contre le corps de la chambre.
L'étanchéité est obtenue par des joints toriques et un dépôt de
silicone.
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3 - Connecteurs d'alimentation en fluide
Ils sont insérés dans des plaques de plexiglas maintenues en
contact intime avec les électrodes. Des joints toriques et un dépôt de
silicone assurent l'étanchéité.
A la figure 3 apparaît le tuyau d'amenée du flux raccordé par un
raccord 6 à un porte-raccord 5. Entre un joint torique externe 4 et un joint
torique interne 3 se trouve maintenue l'électrode 2. Le joint torique interne
3 assure l'étanchéité avec le corps 1.
Un autre joint torique interne 3' assure l'étanchéité avec le corps 1
et maintient la seconde électrode 2'. Sur le trajet du flux, des éléments 4',
5', 6', 7' homologues des éléments 4, 5, 6 ,7 ci-dessus conduisent le flux
vers la sortie du dispositif.
Les électrodes 2, 2' sont connectées au générateur d'impulsion
électrique (non représenté).
Résultats
Pour les trois techniques d'électropulsation (batch, champ parallèle
au flux, champ perpendiculaire au flux) on a mesuré l'efficacité pour la
destruction des amibes. Les cellules ont été électropulsées, dans tous les
cas, par dix impulsions de 10 ms délivrées avec une fréquence d'1 Hz. Les
résultats concernant l'évolution de la viabilité avec l'intensité du champ
électrique sont présentés sur la figure 1.
On obtient dans la configuration en flux avec le champ parallèle à
l'écoulement, un profil de chute de la viabilité, où la viabilité est d'autant
plus affectée que l'intensité du champ électrique augmente.
L'utilisation en flux d'un champ parallèle à l'écoulement donne les
plus faibles taux de viabilité pour chaque intensité du champ électrique
étudiée, et s'avère donc être une technique très efficace pour éradiquer
des amibes. Pour une valeur de champ de 1,5 kV/cm, on observe une
élimination totale des amibes.
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Par ailleurs, les résultats obtenus avec un champ perpendiculaire à
l'écoulement montrent que dans ce type de configuration, pour des valeurs
de champ élevées (= 1 kV/cm), l'augmentation de l'intensité du champ
électrique ne se traduit pas par un accroissement du taux de mortalité.
25% de la population n'est pas affecté par l'effet lytique du champ.
Les figures 2A et 2B comparent les profils obtenus de
perméabilisation en fonction de l'intensité du champ électrique pour les
deux techniques en flux par rapport au profil de perméabilisation obtenu en
batch. Les cellules, dans les trois cas, sont électropulsées par dix
impulsions de 10 ms délivrées avec une fréquence de 1 Hz.
Dans la configuration où le champ est perpendiculaire à
l'écoulement (2A), sur une gamme d'intensité de champ électrique allant de
0 à 0,75 kV/cm, l'augmentation de l'intensité du champ électrique se traduit
par une augmentation du taux de perméabilisation. L'augmentation de
l'intensité du champ n'entraîne pas un accroissement du nombre de
cellules perméabilisées. Un plateau de seulement 40% est obtenu.
Dans le cas où le champ est parallèle à l'écoulement (2B), sur
toutes les valeurs de champ utilisées, l'augmentation de l'intensité du
champ électrique est corrélée à une augmentation du taux de
perméabilisation. En terme d'efficacité de perméabilisation en flux,
l'utilisation d'un champ parallèle à l'écoulement donne les meilleurs
résultats. L'augmentation de l'intensité du champ permet de perméabiliser
plus de 90% de la population.
Par ailleurs, la perméabilisation en flux, avec champ parallèle à
l'écoulement, est déclenchée pour des valeurs inférieures à la valeur
critique en batch (0,25 kV/cm).
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REFERENCES
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