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PRODUITS COMPRENANT UN SUPPORT SUR LEQUEL SONT FIXES DES
ACIDES NUCLEIQUES ET LEUR UTILISATION COMME PUCE A ADN.
La présente invention se rapporte à des produits comprenant un
support sur lequel sont fixés des acides nucléiques, à leur procédé de
préparation et à
leur utilisation comme puce à ADN. La présente invention se rapporte également
à des
supports fonctionnalisés, à des oligonucléotides et à des ADN modifiés en
position 5',
ainsi qu'à leurs procédés de préparation. La présente invention se rapporte,
en outre, à
un procédé de fixation d'un acide nucléique sur un support.
La fixation d'un ensemble d'ADN de séquences connues sur un
support, dans un ordre bien précis, permet l'obtention de puces à ADN qui, par
hybridation des ADN immobilisés sur le support avec des acides nucléiques ou
des
oligonucléotides cibles, permettent de déterminer la séquence de ces molécules
cibles
ou de suivre l'expression de gènes. Les applications sont nombreuses :
découverte de
nouveaux gènes, de nouveaux médicaments, réalisation de diagnostics, études de
toxicité, etc.
Le procédé d'obtention de puces à ADN qui met en oeuvre la
fixation d'ADN sur une lame de verre fait intervenir principalement des étapes
de
préparation de la lame de verre (traitement de sa surface par de la soude,
puis
adsorption de polylysine ou de polyéthylèneimine sur la surface via des
interactions
ioniques ; BURNS, N.L., Langmuir, 1995, 11, 2768-2776), de dépôt de l'ADN sur
les
lames de verre ainsi préparées, puis de traitement thermique et d'irradiation
UV pour
lier, de façon covalente, l'ADN à la surface de verre.
L'utilisation d'ADN permet normalement d'obtenir des hybridations
très spécifiques et de haute affinité par rapport à ce que l'on obtient avec
des
oligonucléotides relativement courts. Or, comme indiqué par LOCKHART, D.J.
dans
Natacre Biotechnology, 1996, 14, 1675-1680, cela n'est pas le cas. Le mode de
fabrication des lames peut expliquer ce phénomène. En effet, les ADN
interagissent
avec la polylysine ou la polyéthylèneimine par des interactions ioniques
faisant
intervenir les groupements phosphodiesters chargés négativement des acides
nucléiques : ce mode de dépôt limite ainsi la liberté conformationnelle de
l'ADN et
son accessibilité. D'autre part, le traitement thermique appliqué avant
l'irradiation UV
dégrade l'ADN. En outre, l'irradiation IJV elle-même modifie les bases
pyrimidiniques (formation d'hydrates ou liaison à la surface via les fonctions
silanol
du verre, dimérisation entre plusieurs pyrimidines) alors que ces bases sont
importantes pour l'hybridation.
Il apparaît ainsi que le procédé de liaison d'ADN sur une lame de
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verre décrit ci-dessus est complexe et sujet à un manque de reproductibilité.
Les
avantages liés à l'utilisation d'ADN au lieu d'oligonucléotides sont perdus du
fait du
mode de traitement des dépôts. Enfin, le lien ADN-surface de verre n'est pas
stable
les lames de verre ne peuvent pas être utilisées plus de 2 ou 3 fois dans des
réactions
d'hybridation.
Une autre méthode d'immobilisation d'ADN ou d'oligonucléotides
sur des lames de verre a été décrite par BEIR, M. (Nzccleic Acids Research,
1999, 27,
1970-1977). Elle consiste en la formation d'une liaison amide entre l'ADN ou
l'oligonucléotide et le support. A cet effet, des lames de verre silanisées
avec de
l'aminopropyl-triméthoxysilane sont dérivatisées avec un agent de couplage
bifonctionnel apportant une fonction acide carboxylique activée. Des agents de
couplages utilisables sont par exemple le phénylène düsothiocyanate, le
disuccinimidylcarbonate, le disuccinimidyloxalate ou le diméthylsuberimidate
décrits
par HERMANSON, G.T. dans Bioconjugate Techniques, 1996, Academic Press (San
Diego, Californie). Les ADN ou oligonucléotides, modifiés en position 5' par
une
fonction amine, sont déposés en conditions basi4ues sur les lames de verre
fonctionnalisées. Les lames obtenues semblent assez stables au recyclage.
Toutefois, cette méthode comporte plusieurs inconvénients : tout
d'abord, l'utilisation d'un agent bifonctionnel sur le support peut conduire à
une
réticulation de cet agent sur la surface, et donc à une perte partielle de
charge de la
surface. L'utilisation d'isothiocyanate ou d'esters de N-hydroxysuccinimide
conduit à
un risque d'hydrolyse de ces fonctions lors du stockage des lames ou pendant
la
fixation, en conditions basiques, de l'ADN ou de l'oligonucléotide au support,
c'est-à-
dire, encore une fois, à une perte de charge de la surface. Enfin, les auteurs
précisent
qu'il faut bloquer les fonctions réactives du support après la fixation de
l'ADN ou des
oligonucléotides : clairement, toutes les fonctions réactives n'ont pas réagi.
Ceci peut
s'expliquer par la lenteur de la cinétique de couplage, qui conduit à un taux
de fixation
faible et à une hydrolyse partielle des fonctions réactives.
D'autres techniques consistent à utiliser un gel de polyacrylamide en
tant que support et à y immobiliser des oligonucléotides par le biais d'une
liaison
hydrazone (GUSCHIN, D. et al., Anal. Biochenz., 1997, 250, 203-211). Une telle
immobilisation fait intervenir la synthèse d'un oligonucléotide fonctionnalisé
en 3' par
une 3-méthyluridine, son oxydation periodique pour transformer le diol de
l'uridine en
dialdéhyde, l'activation du gel de polyacrylamide par de l'hydrazine afin de
créer des
fonctions hydrazides, puis le dépôt de l'oligonucléotide oxydé sur le gel
activé.
Cette méthode, qui ne s'applique pas à des ADN, est complexe et
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fait intervenir une oxydation periodique d'un ribose en position 3' ; les
produits ainsi
formés sont connus pour ne pas ëtre stables (ADAMS, R.L.P. et al., The
Biochemistry
of the nucleic acids, tenth edition , 1986, Chapman and Hall, New-York).
GUSCHIN,
D. et al. (ibic~ précisent d'ailleurs que les oligonucléotides oxydés ne
peuvent être
conservés qu'une semaine à 4°C.
En ce qui concerne l'immobilisation d'ADN, ces mêmes auteurs
(GUSCHIN, D. et al., ibidJ décrivent des étapes de dépurination de l'ADN dans
l'acide formique, de précipitation dans l'acétone puis de dépôt sur un gel de
polyacrylamide activé à l'hydrazine. Dans ce procédé, la structure initiale de
l'ADN
est donc dénaturée pour permettre son immobilisation, ce qui affecte ses
capacités
ultérieures d'hybridation. En outre, la dépurination de l'ADN en milieu acide
conduit
à des régions de polypentose-phosphate-diesters liant des régions
d'oligonucléotides
pyrimidiniques : or, les liaisons phosphate-diesters sont fragiles, donnant
facilement
une ~-élimination en présence de bases. L'ADN ainsi immobilisé est donc peu
stable.
Outre des gels de polyacrylamide, il a également été proposé
d'immobiliser de l'ADN sur des gels d'agarose. A cet effet, GILLES, P.N.
(Nature
Biotechnology, 1999, 17, 365-370) procède à la préparation d'un gel de
glycosal
agarose avec de la streptavidine, à sa réduction avec du cyanoborohydrure de
sodium,
à la synthèse d'ADN portant une biotine en position 5', puis à leur dépôt sur
le gel. Un
inconvénient majeur de cette méthode est la nature non covalente de la liaison
ADN-
support.
Dans un autre domaine technique, le Brevet US 4 874 813 décrit la
fixation de glycoprotéines sur un support solide par une liaison hydrazone, le
support
étant fonctionnalisé par un hydrazide et la glycoprotéine portant une fonction
aldéhyde, introduite par oxydation de la partie carbohydrate de la
glycoprotéine,
porteuse d'une fonction diol-1,2. Cette technique n'est toutefois pas
extrapolable à des
ADN, qui sont naturellement dépourvus de fonctions diol-1,2, ni à des acides
nucléiques quels qu'ils soient. En effet, si les glycoprotéines utilisées dans
le Brevet
US 4 874 813 sont obtenues avec de quantités de l'ordre de la dizaine de
milligramme,
les acides nucléiques quant à eux sont manipulés à l'échelle du microgramme.
Il est
donc nécessaire de compenser ce facteur de dilution par l'utilisation de
groupements
fonctionnels plus réactifs que les aldéhydes obtenus par oxydation de sucres.
Enfin, un
acide nucléique portant une fonction aldéhyde à son extrémité est peu stable,
notamment sujet à des réactions d'oxydation en présence d'air, et donne
facilement
lieu à la formation d'imines lorsqu'il est mis en présence d'enzymes, par
exemple lors
de réactions d'amplification.
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Ainsi, les Inventeurs se sont donnés pour but de pallier les
inconvénients de l'Art antérieur et de pourvoir à un procédé de fixation
d'acides
nucléiques, notamment d'ADN ou d'oligonucléotides, sur un support qui réponde
notamment aux critères suivants
- le procédé est simple au niveau expérimental, reproductible et non
coûteux,
- il permet la liaison de l'acide nucléique à un support par
l'intermédiaire de liaisons covalentes,
il permet une liaison acide nucléique-support très stable dans les
conditions d'hybridation et de lavage, limitant la désorption de l'acide
nucléique et
permettant l'obtention, lorsque l'acide nucléique est de l'ADN, de puces à ADN
réutilisables dans de nombreux cycles d'hybridation,
- il met en oeuvre un acide nucléique modifié qui est stable et dont
l'obtention est simple,
- il met en oeuvre un support dérivatisé par une fonction stable, non
hydrolysable,
- il fait intervenir, lors de la liaison entre l'acide nucléique et le
support, des fonctions très réactives, compensant la faible concentration des
partenaires,
- il n'implique aucune dénaturation de la structure de l'acide
nucléique, cette dernière restant optimale pour des réactions ultérieures
d'hybridation.
La présente invention a pour objet un produit de formule (I)
SP[A;(Y;-Z-CO-M)n]m (I)
dans laquelle
Z représente un groupement de formule
~S~
- CH /CH
NH
ou un groupement -X-N=CH-, X représentant un groupement
-CHI-O-, -CHZ-NH- ou -NH-,
i est égal à 0 ou à l,
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n est compris entre 1 et 16, n étant égal à 1 lorsque i est égal
à 0,
m est supérieur ou égal à 1,
SP représente un support,
5 . A représente un bras espaceur,
Y représente une fonction assurant la liaison entre A et Z,
et
M représente un acide nucléique lié au groupement -CO-
adjacent par son extrémité ~' ou 3'.
On entend par « acide nucléique », au sens de la présente invention,
un ADN, un ARN ou un oligonucléotide, ce dernier correspondant à un
enchaînement
de 1 à 50 bases environ, ledit acide nucléique comportant des nucléosides
naturels (A,
C, G, T ou U) ou modifiés au niveau de la base (hétérocycle), du sucre et/ou
de la
liaison phosphodiester. Ledit acide nucléique peut donc également consister en
un
PNA (Peptide Nucleic Acid).
Dans la formule (I) ci-dessus, lorsque Z représente un groupement -
-X-N=CH-, ce dernier représente une liaison oxime quand X est un groupement
-CHI-O- et une liaison hydrazone quand X est un groupement -CHz-NH- ou -I~TH-.
Le
produit de formule (I) peut également comprendre une liaison thiazolidine
lorsque Z
représente un groupement de formule
~S~
- CH /CH
NH
Selon la nature du groupement Z, le produit de formule (I) selon la
présente invention peut donc correspondre aux produits de formules (Ia) et
(Ib)
représentées ci-dessous, dans lesquelles SP, A, Y, X, M, i, n et m sont tels
que
précédemment décrits
SP ~ A; ( Y; -X-N=CH-CO-M )~ ) r" (Ia)
'S\
SP Ai ( Yi - CH/ \CH- CO -M )n (~)
~m
NH
Le produit de formule (I) selon la présente invention est tel que la
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liaison entre l'acide nucléique M et le support SP est très stable.
Dans la formule (I), n est avantageusement égal à 1 et A représente
de préférence une chaîne carbonée linéaire ou ramifiée comprenant de 2 à 100
atomes
de carbone, de préférence de 5 à 50 atomes de carbone, et comprenant
éventuellement
de 1 à 35 atomes d'oxygène ou d'azote et de 1 à S atomes de silicium, de
soufre ou de
phosphore.
SP représente avantageusement un support solide, de préférence en
verre, en silicium ou en polymère synthétique, tel que le nylon, le
polypropylène et le
polycarbonate. SP peut également, de façon avantageuse, représenter un support
non
solide, tel qu'un polymère naturel (par exemple un polysaccharide tel que la
cellulose
ou le mannane, ou encore un polypeptide), un polymère synthétique (par exemple
un
copolymère de N-vinylpyrrolidone et de dérivés de l'acide acrylique), un
liposome ou
un lipide. SP peut avantageusement représenter un vecteur de transfection,
c'est-à-dire
un composé organique (lipide ou peptide par exemple) perméable au niveau de la
membrane cellulaire.
Selon un mode de réalisation avantageux du produit de formule (I)
selon la présente invention, SP est un support solide, i est égal à l, n est
égal à 1 et M
est un ADN, ledit produit constituant une puce à ADN.
Dans une telle puce à ADN, les m molécules M présentes dans la
puce peuvent être identiques, mais sont de préférence différentes entre elles.
Les puces
à ADN selon la présente invention sont réutilisables dans de nombreux cycles
d'hybridation, la liaison entre l'ADN et le support étant très stable dans les
conditions
d'hybridation et de lavage, ce qui limite considérablement les possibilités de
désorption de l'ADN.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du produit de
formule (I) selon la présente invention, SP représente un support en verre, i
est égal à
1, n est égal à 1, A représente un bras espaceur de formule -Si-(CH,)3- et Y
représente
une fonction amide -NH-CO-.
La présente invention a également pour objet l'utilisation du produit
de formule (I) ci-dessus, quand SP est un support solide, comme puce à acides
nucléiques, telle qu'une puce à ADN ou à oligonucléotides.
La présente invention a également pour objet un procédé de
préparation du produit de formule (I) ci-dessus, qui comprend la réaction de n
x m
molécules de formule M-CO-CHO avec un produit de formule
SP [ A; ( Y; - B - NHZ ) ~ ] m , SP, A, Y, i, n, m et M étant tels que définis
ci-avant et B
représentant un groupement -CHz-O-, -CHZ-NH-, -NH- ou -CH(CH~SH)-.
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Les molécules de formule M-CO-CHO correspondent à des acides
nucléiques portant une fonction a-oxoaldéhyde (-CO-CHO) à leur extrémité 5' ou
3'.
La présente invention a également pour objet un procédé de fixation,
par liaison covalente, d'au moins un acide nucléique M sur un support SP, pour
l'obtention d'un produit de formule (I) tel que précédemment décrit,
caractérisé en ce
qu'il comprend les étapes suivantes
i) introduction d'une fonction a-oxoaldéhyde en une extrémité
extrémité 5' ou 3') dudit acide nucléique, et
ü) réaction de l'acide nucléique fonctionnalisé obtenu à l'étape i)
avec un support modifié par une fonction sélectionnée dans le groupe constitué
par les
fonctions hydrazine, dérivées d'hydrazine, hydroxylamine et (3-aminothiol.
En tant que fonction dérivée d'hydrazine, on peut citer par exemple
les fonctions hydrazides, c'est-à-dire une hydrazine substituée par au moins
un
groupement acyle ou carbonyle.
L'étape ü) ci-dessus résulte en la formation d'une liaison hydrazone
(cas où le support porte une fonction hydrazine ou dérivée d'hydrazine), oxime
(cas
où le support porte une fonction hydroxylamine) ou thiazolidine (cas où le
support
porte une fonction (3-aminothiol) entre l'acide nucléique et le support.
De façon particulièrement avantageuse, le procédé selon la présente
invention met en oeuvre un support modifié par une fonction stable dans une
large
gamme de pH. Les fonctions qui interviennent lors de la liaison, à savoir la
fonction
a-oxoaldéhyde portée par l'acide nucléique et la fonction portée par le
support, sont
très réactives. En outre, le procédé selon la présente invention n'implique
aucune
dénaturation de la structure de l'acide nucléique, qui reste optimale pour des
réactions
ultérieures d'hybridation, dans le cas où le produit de formule (I) obtenu par
le
procédé selon la présente invention est utilisé comme puce à ADN.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon la
présente invention, l'introduction d'une fonction a-oxoaldéhyde en une
extrémité
dudit acide nucléique est effectuée par les étapes suivantes
a) introduction d'un groupement sélectionné dans le groupe
constitué par l'acide tartrique, la sérine, la thréonine et leurs dérivés à
l'une des
extrémités d'un oligonucléotide,
b) hybridation de l'oligonucléotide obtenu à l'étape a) avec ledit
acide nucléique,
c) élongation dudit oligonucléotide,
d) réitération des étapes b) et c) au moins une fois,
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e) oxydation periodique de l'acide nucléique obtenu à l'étape d),
modifié à l'une de ses extrémités par un groupement sélectionné dans le groupe
constitué par l'acide tartrique, la sérine, la thréonine et leurs dérivés, et
f) isolement d'un acide nucléique modifié à l'une de ses extrémités
par une fonction a-oxoaldéhyde.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé selon
la présente invention, l'introduction d'une fonction a-oxoaldéhyde en une
extrémité
dudit acide nucléique est effectuée par les étapes suivantes
a) introduction d'un groupement sélectionné dans le Groupe
constitué par l'acide tartrique, la sérine, la thréonine et leurs dérivés à
l'une des
extrémités d'un oligonucléotide,
b) oxydation periodique de l'oligonucléotide obtenu à l'étape a),
c) hybridation de l'oligonucléotide obtenu à l'étape b), portant une
fonction a-oxoaldéhyde à l'une de ses extrémités, avec ledit acide nucléique,
d) élongation dudit oligonucléotide,
e) réitération des étapes c) et d) au moins une fois, et
f) isolement d'un acide nucléique modifié à l'une de ses extrémités
par une fonction a-oxoaldéhyde.
Dans les procédés ci-dessus, il est bien entendu que l'étape
d'hybridation de l'oligonucléotide avec l'acide nucléique s'effectue après une
étape de
dénaturation dudit acide nucléique, comme connu de l'Homme de l'art.
Les étapes d'hybridation entre un oligonucléotide et un acide
nucléique, d'élongation dudit oligonucléotide et de réitération de ces étapes
constituent des cycles d'amplification de l'acide nucléique, l'oligonucléotide
servant
d'amorce à ces amplifications, qui peuvent être réalisées par la technique
dite PCR
(Polymerase Chain Reaction) bien connue de l'Homme du métier, décrite par
exemple
dans Molecular Clonin~, second edition. J. SAMBROOK. E.F. FRITSCH et
T. MANIATIS (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
L'étape d'élongation de l'oligonucléotide, après son hybridation
avec l'acide nucléique, est réalisée dans un milieu tampon convenable, en
présence
des bases nucléotidiques requises pour la formation d'acide nucléique.
A titre d'exemples de dérivés de l'acide tartrique utilisables dans les
procédés décrits ci-dessus, on peut citer l'acide di-acétyl-tartrique, l'acide
di para
toluyl-tartrique, l'acide métatartrique, le tartrate de diméthyle, le tartrate
de
dissuccinimidyle, l'anhydride tartrique et l'anhydride di-acétyl-tartrique.
De façon avantageuse, l'introduction d'un groupement sélectionné
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dans le-groupe constitué par l'acide tartrique, la sérine, la thréonine et
leurs dérivés à
l'une des extrémités d'un oligonucléotide (étape a) des procédés décrits ci-
dessus) est
effectuée via une liaison amide. Le groupement sélectionné dans le groupe
constitué
par l'acide tartrique, la sérine, la thréonine et leurs dérivés est de
préférence lié à
l'oligonucléotide via un bras espaceur lié, par l'une de ses extrémités, audit
oligonucléotide et portant, à l'autre de ses extrémités, une fonction amine.
Dans le procédé de fixation d'un acide nucléique M à un support SP
décrit ci-dessus, l'acide nucléique est de préférence un ADN. Dans ce cas,
l'oligonucléotide qui s'hybride avec cet acide nucléique est une amorce
oligodésoxynucléotidique, qui peut être spécifique ou universelle. L'ADN peut
être
obtenu par amplification d'ADN génomique ou par amplification d'ADN inséré
dans
un vecteur, par exemple le phage M13. Dans le cas d'ADN obtenu par
amplification
d'ADN génomique, une première amplification avec une série d'amorces
spécifiques
peut être suivie d'une amplification à l'aide d'amorces universelles (voir par
exemple
I S POLLACK, J.R. dans Nature Genetics, 1999, 2~, 41-46). Dans ce cas, deux
amorces
permettent d'amplifier un nombre important d'ADN différents. Il est
particulièrement
avantageux de modifier ces amorces universelles par un groupement choisi parmi
l'acide tartrique, la sérine, la thréonine, leurs dérivés ou le produit
d'oxydation de ces
groupements, à savoir une fonction a-oxoaldéhyde. Dans le cas d'ADN obtenu par
amplification d'ADN inséré dans un vecteur, ici aussi un nombre important
d'ADN
différents peuvent être amplifiés grâce à l'utilisation d'amorces universelles
fonctionnalisées par un groupement choisi parmi l'acide tartrique, la sérine,
la
thréonine, leurs dérivés ou le produit d'oxydation de ces groupements.
La présente invention a également pour objet un oligonucléotide
modifié en position 5' par un groupement sélectionné dans le groupe constitué
par
l'acide tartrique, la sérine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement a-
oxoaldéhyde.
Un tel oligonucléotide peut avantageusement ëtre utilisé en tant
qu'amorce dans des réactions d'élongation ou d'amplification d'acides
nucléiques,
afin d'obtenir des acides nucléiques modifiés en position 5' par les
groupements
portés par ledit oligonucléotide.
La présente invention a également pour objet un procédé de
préparation d'un tel oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il comprend une
étape
d'introduction d'un groupement sélectionné dans le groupe constitué par
l'acide
tartrique, la sérine, la thréonine et leurs dérivés en position 5' dudit
oligonucléotide,
cette étape étant suivie, dans le cas où ledit oligonucléotide est modifié par
un
groupement a-oxoaldéhyde, d'une oxydation periodique dudit oligonucléotide.
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La présente invention a également pour objet un ADN modifié en
position 5' par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide
tartrique, la sérine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement a-
oxoaldéhyde.
Un tel ADN peut avantageusement être utilisé dans le procédé selon
5 la présente invention permettant la fixation, par liaison covalente, d'au
moins un acide
nucléique M sur un support SP, tel que décrit précédemment.
En effet, les groupements acide tartrique, sérine et thréonine peuvent
facilement être convertis en fonction a-oxoaldéhyde par une réaction
d'oxydation
periodique. Il est particulièrement intéressant d'utiliser un ADN modifié par
une
10 fonction a-oxoaldéhyde, car cette fonction est très stable et très
réactive, en tout état
de cause bien plus stable et réactive qu'une fonction aldéhyde. Ces
considérations
s'appliquent aussi aux oligonucléotides selon la présente invention, modifiés
par une
fonction a-oxoaldéhyde. Ainsi, les acides nucléiques quels qu'ils soient
(notamment
les ADN ou les oligonucléotides) peuvent être conservés sans s'oxyder ni se
dégrader,
en particulier en présence d'air (indépendamment de la position de leur
fonctionnalisation à l'extrémité 3' ou S'). Ils donnent lieu à des liaisons
très stables
avec des supports portant des fonctions réactives correspondantes, comme
décrit ci-
avant. En outre, et contrairement à des acides nucléiques fonctionnalisés par
un
aldéhyde, ils n'induisent pas de formation d'imine avec les enzymes présentes
lors de
réactions d'élongation ou d'amplification d'acides nucléiques et, dans le cas
d'une
amplification PCR à l'aide de la Taq polymérase, ils n'interagissent pas avec
le
dithiothreitol, agent de conservation de l'enzyme.
La présente invention a également pour objet un procédé de
préparation d'un ADN modifié en position 5' par un groupement sélectionné dans
le
groupe constitué par l'acide tartrique, la sérine, la thréonine, leurs dérivés
et le
groupement a-oxoaldéhyde, tel que décrit ci-dessus, caractérisé en ce qu'il
comprend
les étapes suivantes
a) introduction d'un groupement sélectionné dans le groupe
constitué par l'acide tartrique, la sérine, la thréonine et leurs dérivés en
position 5'
d'un oligonucléotide,
b) hybridation de l'oligonucléotide obtenu à l'étape a) avec un ADN,
c) élongation dudit oligonucléotide,
d) réitération des étapes b) et c) au moins une fois,
ou dans le cas où ledit ADN est modifié par un groupement
a-oxoaldéhyde, les étapes a) à f) des procédés précédemment décrits en rapport
avec
le procédé selon la présente invention ayant trait à l'introduction d'une
fonction
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a-oxoaldéhyde à l'une des extrémités d'un acide nucléique.
L'étape d'élongation de l'oligonucléotide, après son hybridation
avec l'ADN, est réalisée dans un milieu tampon convenable, en présence des
bases
désoxynucléotidiques requises pour la formation d'ADN.
La présente invention a également pour objet un support
fonctionnalisé de formule (II)
SP[A;(Y;-B-NHZ)o]m (II)
dans laquelle SP, A, Y, B, i, n et m sont tels que définis
précédemment.
Un tel support porte une fonction hydrazine (cas où B représente un
groupement -CHI-NH- ou -NH-), hydroxylamine (cas où B représente un groupement
-CHI-O-) ou (3-aminothiol (cas où B représente un groupement -CH(CHzSH)-).
Le support fonctionnalisé de formule (II) peut avantageusement être
utilisé dans le procédé selon la présente invention permettant la fixation,
par liaison
covalente, d'au moins un acide nucléique M à un support SP, tel que décrit
précédemment.
La présente invention a également pour objet un procédé de
préparation du support fonctionnalisé de formule (II), dans lequel i est égal
à l, n est
égal à 1 et SP représente un support en verre, caractérisé en ce qu'il
comprend les
étapes suivantes
silanisation du support en verre,
greffage, sur ledit support en verre silanisé, d'une fonction
sélectionnée dans le groupe constitué par les fonctions hydrazine, dérivées
d'hydrazine, hydroxylamine et (3-aminothiol.
L'étape de silanisation du support est de préférence effectuée à
l'aide d'aminopropyl-triméthoxysilane.
De façon particulièrement avantageuse, ledit greffage d'une fonction
hydrazine est effectué à l'aide d'acide hydrazinoacétique, ledit greffage
d'une
fonction dérivée d'hydrazine est effectué à l'aide de triphosgène et
d'hydrazine, ledit
greffage d'une fonction hydroxylamine est effectué à l'aide d'acide
aminooxyacétique
et ledit greffage d'une fonction (3-aminothiol est effectué à l'aide d'acide a-
amino
~3-mercaptopropionique.
L'invention a également pour objet un procédé de contrôle de la
qualité du support de formule (II) tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce
qu'il
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comprend les étapes suivantes
- mise en contact du support avec une sonde fluorescente, par
exemple la rhodamine, dérivatisée par une fonction a-oxoaldéhyde,
- lavage du support obtenu à l'issue de l'étape précédente, et
- analyse de la fluorescence de ce support.
Ce procédé permet d'analyser l'homogénéité de la fonctionnalisation
du support, à savoir la distribution spatiale des groupements terminaux -B-NH~
(cf. formule (II) ci-dessus).
L'invention a également pour objet un procédé de quantification de
la fonctionnalité du support de formule (II) tel que défini ci-dessus,
caractérisé en ce
qu'il comprend les étapes suivantes
- mise en contact du support avec une sonde fluorescente, par
exemple la rhodamine, dérivatisée par une fonction a-oxoaldéhyde,
- lavage du support obtenu à l'issue de l'étape précédente,
- hydrolyse du lien entre le support et la sonde fluorescente, en
milieu acide fort ou par hydrolyse enzymatique (nucléase, protéase, ...), et
- mesure de la quantité de fluorescence libérée en solution à l'issue
de cette hydrolyse.
Ce procédé permet de quantifier le nombre de sites fonctionnels
accessibles à la sonde fluorescente, sur le support de formule (II) ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un kit de préparation
d'une puce à ADN telle que décrite ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend
les
éléments suivants
- au moins un support fonctionnalisé de formule (II) selon la
présente invention,
- une pluralité d'amorces oligodésoxynucléotidiques qui sont
modifiées soit en position 3', soit en position 5', soit en position 3' pour
une partie
desdites amorces et en position 5' pour l'autre partie desdites amorces, par
l'acide
tartrique, la sérine, la thréonine, leurs dérivés et le groupement a-
oxoaldéhyde,
- des réactifs et tampons aptes à la mise en ouvre de réactions
d'élongation et/ou d'amplification dudit ADN, et
- dans le cas où lesdites amorces oligodésoxynucléotidiques sont
modifiées par un groupement sélectionné dans le groupe constitué par l'acide
tartrique, la sérine, la thréonine et leurs dérivés, des réactifs aptes à la
mise en a.uvre
d'une réaction d'oxydation periodique.
L'invention a également pour objet l'utilisation de la puce à ADN
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telle que définie précédemment dans les domaines d'application suivants
- en chimie combinatoire, notamment pour le criblage de molécules
à haut débit. Il peut s'agir par exemple du criblage de souches bactériennes,
de
l'identification de contaminants ou encore de l'identification de gènes ;
- en tant qu'outil de diagnostic ; et
pour le tri de molécules.
L'invention a, en outre, pour objet un procédé de tri de molécules
qui met en ceuvre la puce à ADN telle que définie précédemment, ainsi que les
molécules triées susceptibles d'être obtenues par ce procédé.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore
d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se
réfère à des
exemples de mise en oeuvre des procédés objets de la présente invention, ainsi
qu'aux
figures annexées, dans lesquelles
- les figures 1 et 10 représentent la déprotection du groupe MMT
porté, respectivement, par l'oligonucléotide préparé conformément à l'exemple
1 et
par l'oligonucléotide préparé conformément à l'exemple 2,
- les figures 2, 5 et 7 représentent, respectivement, le couplage d'un
oligonucléotide avec de l'anhydride (+)-diacétyl-L-tartrique, du tartrate de
dissuccinimidyle et de la trifluoroacétyl-sérine, conformément à l'exemple l,
- les figures 3, 6 et 8 représentent des réactions d'aminolyse d'un
oligonucléotide immobilisé sur un support solide, conformément à l'exemple l,
les figures 4 et 9 représentent des réactions d'oxydation periodique,
conformément à l' exemple 1,
- la figure 11 représente le couplage de l'amorce 1 avec de
l'anhydride (+)-diacétyl-L-tartrique,
- la figure 12 représente la réaction d'aminolyse de l'amorce 1
immobilisée sur un support solide, conformément à l'exemple 2,
- la figure 13 représente la réaction d'oxydation periodique de
l'amorce 1, conformément à l'exemple 2,
- la figure 14 représente le couplage d'un oligonucléotide avec du
tartrate de dissuccinimidyle, conformément à l'exemple 3,
- la figure 15 représente la synthèse d'une surface de verre
fonctionnalisée par une fonction hydrazide, conformément à l'exemple 5,
- la figure 16 représente la ligation d'une sonde fluorescente (sonde
rhodaminée) à une surface de verre fonctionnalisée par un groupement
hydrazide,
pour le contrôle de la qualité de cette surface, conformément à l'exemple 5,
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- la figure 17 représente la synthèse d'un peptide rhodaminé
fonctionnalisé par un groupe a-oxoaldéhyde, conformément à l'exemple 5, et
- la figure 18 représente la préparation d'un support solide
fonctionnalisé adapté à la synthèse d'oligonucléotides portant, à leur
extrémité 3', une
fonction a-oxoaldéhyde, conformément à l'exemple 4.
Sur les figures l, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10, 11 et 12, lorsque
l'oligonucléotide immobilisé sur le support est protégé, la protection (3-
cyanoéthyle du
lien phosphodiester est omise pour plus de clarté.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés
uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne
constituent en
aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Obtention, par une chimie en phase solide, d'oligonucléotides
modifiés en position 5' par une fonction a-oxoaldéhyde.
Dans cet exemple, les oligonucléotides présentent tous la séquence
suivante : ATCGATCG.
1) Synthèse de l'oligonucléotide.
Un oligonucléotide de séquence ATCGATCG est synthétisé en
phase solide, par exemple sur un support CPG (Controled Pore Glass), suivant
la
technique décrite dans « Oligonucleotide Synthesis : a practical approach »,
édition
M.J. GAIT, IRL Press, Oxford, 1984, ou dans « Protocole for oligonaccleotides
and
analogs : svnthesis ans properties », édition S. AGRAWAL, Humana Press, Totowa
NJ 1993, ou encore par ELLINGTON, A. et POLLARD, J.D. dans « Current
Protocole in Nloleczdar Biolo~.~ », 1998, 2.1 1.l-2.11.25, John Wiley & Sons
Inc.,
New York. La synthèse suit une stratégie classique (hydroxyles en 5' protégés
par des
groupements diméthoxytrityles, chimie des cyanoéthoxyphosphoramidites). Les
bases
sont protégées par des groupements acyles, qui seront labiles en fin de
synthèse lors
de l'aminolyse.
Une fois l'oligonucléotide synthétisé, l'hydroxyle en 5' est
déprotégé et est couplé avec un bras espaceur aminé de formule CizH24-OPOZ-,
protégé par un groupement monométhoxytrityle (MMT). Le groupement MMT sera
éliminé au dernier moment, juste avant le couplage avec un dérivé de l'acide
tartrique,
selon le schéma réactionnel représenté sur la figure l, dans laquelle le
groupement P
représente le groupement protecteur des bases nucléotidiques (benzoyle pour
les bases
A et C, isobutyryle pour la base G). A cette fin, 0.8 qmoles d'oligonucléotide
sur
support, sur le synthétiseur d'oligonucléotides, sont mis en présence avec de
l'acide
trichloroacétique à 3% dans le dichlorométhane, pendant 5 minutes 30, en
effectuant
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deux lavages intermédiaires au CH3CN (acétonitrile) afin d'éliminer la
coloration
jaune. L'oligonucléotide « supporté » (c'est-à-dire l'oligonucléotide
immobilisé sur le
support) est ensuite lavé par CH3CN et séché sous argon, puis à l'air
comprimé.
2) Introduction de la fonction a-oxoaldéh~par l'utilisation de
5 l'anhydride +)-diacétyl-L-tartrique.
a) Coacplage de 1 'anhydride (+)-diacétyl-L-tartrique ~gure 2).
Cette réaction est représentée sur la figure 2, dans laquelle Ac
représentent des groupes acétyles. 0.4 pmol d'oligonucléotide sur support sont
transférés dans une colonne de synthèse d'oligonucléotides vide comprenant, à
ses
10 deux extrémités, deux seringues étanches au gaz. 4 ~l (85.86 eq) de 2,6-
lutidine
dissous dans 80 ~l de THF (tétrahydrofurane) sont introduits dans la colonne
par l'une
des deux seringues. On laisse l'oligonucléotide au contact de cette solution
le temps
de dissoudre 4.012 mg (46.4 eq) d'anhydride (+)-diacétyl-L-tartrique (ci-après
désigné
« anhydride tartrique ») dans 80 ~1 de THF. Cette dernière solution est
introduite à
15 son tour dans la colonne et on agite manuellement pendant 5 minutes.
L'oligonucléotide supporté est ensuite lavé plusieurs fois (6 cycles) avec du
THF sur
le synthétiseur. Il est séché à l'argon et à l'air comprimé avant de subir un
deuxième
couplage de 10 minutes dans les mêmes conditions. Enfin, il est de nouveau
lavé avec
du THF au synthétiseur et séché à l'argon, puis à l'air comprimé.
b) Aminolyse ~o cre 3).
On place 2 seringues en plastique aux 2 extrémités de la colonne
dans laquelle se trouve l'oligonucléotide sur support. Dans la première, on
place 1 ml
de NH.~OH (ammoniaque) à 32% dans l'eau. Un système mécanique permet de
pousser le piston de cette seringue afin de délivrer 250 ~l d'ammoniaque
fraîche
toutes les 15 minutes. L'oligonucléotide en solution est ainsi récupéré dans
l'autre
seringue à l'autre extrémité. Cette solution est ensuite transférée dans un
eppendorf à
vis et placé dans une étuve à 55°C pendant une nuit. La solution est
ensuite refroidie
et 10 ~l sont prélevés afin de doser l'oligonucléotide obtenu (22.9 OD dans
1000 Vil).
La solution ammoniacale est évaporée et le résidu est repris dans 400 p1
d'eau.
c) Analyses et purification par RP-HPLC.
Pour la RP-HPLC analytique, 10 q1 de la solution mère sont mis de
côté (0.57 OD, soit 18.90 ~.g d'oligonucléotide), lyophilisés et repris dans
400 ~l
d'eau. 83.5 q1 de cette dernière solution sont injectés sur C18 hypersil 250 x
4.6 mm
(30°C, détection à 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA dans l'eau
pH=6.5/CH3CN
99/1 en volume, tampon B : CH3CN/H20 95/5 en volume, gradient 1 à 40% de B en
28 minutes, débit 1 ml/min). On observe un pic largement majoritaire de pureté
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(74.75°%a).
Pour la RP-HPLC préparative, le reste de la solution mère est purifié
sur la colonne SP 250/10 Nucleosil 300/5 C18 (température ambiante, détection
à
254 nm, tampon A : TEAA 10 mM dans l'eau, tampon B : CH3CN, gradient 5 à 40%
de B en 20 minutes, débit 5.5 ml/min). On isole les fractions correspondant au
produit
majoritaire. Les fractions sont rassemblées et évaporées à l'évaporateur
rotatif,
reprises dans H~O, congelées et lyophilisées.
d) Quantification, analyses par RP-HPLC et par spectrométrie de
masse par électro-nébulisation.
Le résidu est repris dans 1000 p.1 d'eau. Le dosage à 260 nm permet
de calculer une quantité d'oligonucléotide de 256.28 pg. Analyse par RP-HPLC :
51
p1 de la solution mère sont injectés sur C18 hypersil 250 x 4.6 mm dans les
mêmes
conditions d'analyse que précédemment. On obtient un produit pur à 99.14%.
Analyse
par spectrométrie de masse par électro-nébulisation : S p1 de
l'oligonucléotide en
solution dans H20/i-PrOH 20%/TEA 1% sont injectés à une concentration de 10
pmol/p 1. Analyse par spectrométrie de masse par électro-nébulisation : on
infuse en
continu du tampon i-PrOH 20% dans H~O. 5 ~l de l'oligonucléotide en solution
dans
Hz0/i-PrOH 20%/TEA 1% est injecté à une concentration de 10 pmol/p.l. On
travaille
en mode d'ionisation négative et le cône est de SOV. Le débit est de 10 pl/min
et la
température de 70°C. On obtient un oligonucléotide correspondant à la
formule
suivante, dont la masse observée est de 2803.0
HO O
HO
HN-C iZHz:~-OPO,-ATCGATCG
O
HO
e) Oxydation periodique ~gure 4).
La réaction a été réalisée sur 181.5 pg d'oligonucléotide modifié.
1.29 mg de NaI04 (periodate de sodium, M=213.89) sont dissous dans 1206.73 p1
de
tampon acétate de sodium 100 mM pH=4.04. On prélève 100 ~l de cette dernière
solution (soit 0.1069 mg de NaI04) que l'on dépose sur le résidu
d'oligonucléotide. La
concentration finale en oligonucléotide est de 0.65 mM, celle en NaIOa est de
5 mM,
soit 7.7 eq de NaI04 par rapport à l'oligonucléotide. Le milieu est agité à
température
ambiante pendant 1h30 min (suivi RP-HPLC : 4 p1 du milieu réactionnel sont
prélevés
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et dilués avec 96 p.1 d'eau ; colonne C18 hypersil 250 x 4.6 mm ; 30°C
; détection
tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B : CH3CN/Hz0
95/5, gradient 1 à 40 % de B en 28 minutes, 1 ml/min). 1 heure 30 plus tard,
l'excès
de NaIOa est consommé avec 2 eq d'acide tartrique par rapport à NaIO.~, soit
10 p.1
S d'une solution contenant 0.9 mg d'acide tartrique dissous dans 60 p1 d'eau.
Le milieu
réactionnel est congelé à -30°C, avant d'être purifié par RP-HPLC.
~ Purification dzi produit oxydé par RP-HPLC.
Le milieu réactionnel est repris dans 2 ml d'eau et le tube ayant
contenu le milieu réactionnel est encore rincé par 2 ml d'eau et injecté sur
une C18
hyperprep (30°C, détection 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN
99/1
en volume, tampon B : CH3CN/Hz0 95/5 en volume, gradient 0 à 40% de B en 86
minutes, 3 ml/min, détection à 260 nm). Le produit est congelé et lyophilisé.
Le résidu
est repris dans 3 ml d'eau. Le dosage à 260 nm donne 112.6 pg
d'oligonucléotide, soit
un rendement d'oxydation periodique de 63.77%. Analyse par spectrométrie de
masse
par électro-nébulisation : on infuse en continu du tampon i-PrOH 20% dans HzO.
5 p1
de l'oligonucléotide en solution dans H20/i-PrOH 20%/TEA 1% est injecté à une
concentration de 10 pmol/pl. On travaille en mode d'ionisation négative et le
cône est
de SOV. Le débit est de 10 ul/min et la température de 70°C. Résultats
: [M-3H]3'
908.4, [M-4H]4- 681.1, [M-SH]5' 544.7. On obtient un oligonucléotide
correspondant à
la formule suivante
O O
H HN-C,,H2~_OPO,-ATCGATCG
5' 3'
3) Introduction de la fonction a-oxoaldéh,~par l'utilisation du
tartrate de dissuccinimidyle.
a) Couplage du tartrate de dissuccinimidyle figure S).
0.4 pmol d'oligonucléotide sur support sont transférés dans une
colonne de synthèse d'oligonucléotide vide comprenant, à ses deux extrémités,
deux
seringues étanches au gaz. 4 u1 (85.86 eq) de 2,6-lutidine dissous dans 80 p.1
de THF
sont introduits dans la colonne par l'une des deux seringues. On laisse
foligonucléotide au contact de cette solution le temps de dissoudre 6.38 mg
(46.4 eq)
de tartrate de dissuccinimidyle dans 80 p1 de THF. Cette dernière solution est
introduite à son tour dans la colonne et on agite manuellement pendant 5
minutes.
L'oligonucléotide supporté est ensuite lavé plusieurs fois (6 cycles) avec du
THF sur
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le synthétiseur. Il est séché à l'argon et à l'air comprimé avant de subir un
deuxième
couplage de 10 minutes dans les mêmes conditions. Enfin, il est de nouveau
lavé avec
du THF au synthétiseur et séché à l'argon, puis à l'air comprimé.
b) Aminolvse ~gure 6).
On place 2 seringues en plastique aux 2 extrémités de la colonne
dans laquelle se trouve l'oligonucléotide sur support. Dans la première, on
place 1 ml
de NH40H à 32% dans l'eau. Un système mécanique permet de pousser le piston de
cette seringue afin de délivrer 250 p1 d'ammoniaque fraïche toutes les 15
minutes.
L'oligonucléotide en solution est ainsi récupéré dans l'autre seringue, à
l'autre
extrémité. Cette solution est ensuite transférée dans un eppendorf à vis et
placée dans
une étuve à 55°C pendant une nuit. La solution est ensuite refroidie et
10 ~l sont
prélevés afin de doser l'oligonucléotide obtenu (26.9 OD dans 1000 ~1). La
solution
ammoniacale est évaporée et le résidu est repris dans 400 cul d'eau.
c) Analyse et purification par RP-HPLC.
Le brut est analysé par RP-HPLC analytique dans les mêmes
conditions que précédemment. On obtient 1 pic majoritaire de pureté 30.1%.
d) Analyse par spectrométrie de masse par électro-nébulisation
En utilisant les conditions habituelles d'analyse, le produit est pur à
97%. M observée : 2803.5 (ES-MS).
e) Oxydation periodique.
On procède comme indiqué précédemment.
4) Introduction de la fonction a-oxoaldéhyde par l'utilisation de la
trifluoroacétvl-sérine.
Dans cet exemple est décrit la couplage d'un oligonucléotide avec
un dérivé de la sérine, afin d'introduire une fonction a-oxoaldéhyde à
l'extrémité
dudit oligonucléotide. De façon générale, un dérivé de la thréonine pourrait
également
convenir, ainsi que tout /3-aminoalcool portant une fonction carbonyle en a.
a) Synthèse de la trifluoroacétvl-sérine.
~ Synthèse de CF3-CO-Ser(tBu)-OtBu
Dans un ballon de 250 ml, sous agitation et à 0°C, on dissout 3 g
de
H-Ser(tBu)-OtBu (13,8 mmol, 1 eq) dans 50 ml de DCM (dichlorométhane)
fraîchement distillé sur de l'hydrure de calcium. On additionne 15 ml de
pyridine
fraîchement distillée sur de l'hydrure de calcium (0,185 mmol, 13 eq) puis 4,3
ml
d'anhydride trifluoroacétique (4,3 ml, 2,2 eq). Après 15 minutes, le brut
réactionnel
est concentré sous pression réduite puis est repris par 50 ml d'acétate
d'éthyle. La
phase organique obtenue est lavée par une solution saturée de NaCI (2 fois 40
ml) puis
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séchée .sur sulfate de sodium anhydre, filtrée et concentrée sous vide. Le
brut
réactionnel est alors repris par du toluène (30 ml) puis lavé par une solution
saturée de
sulfate de cuivre (3 fois 30 ml) et à nouveau avec une solution saturée de
NaCI (2 fois
40 ml). La phase organique est alors séchée sur sulfate de sodium anhydre,
filtrée puis
S concentrée sous vide. On obtient ainsi une huile jaune (4,038, rendement de
93%).
Rf= 0,47 (AcOEt/Hexane 1/9) ; RMN 'H (300 MHz, DMSO) 8 (ppm): 1,2 (s, 9H,
tBu), 1,5 (s, 9H, tBu), 3,5-4 (m, 2H, CHZ(3), 4,5 (m, 1H, CHa).
~ Synthèse de CF3-CO-Ser-OH
Dans un ballon de 100 ml, on introduit du CF3-CO-Ser(tBu)-OtBu
(2 g, 6,39 mmol), puis 10 ml d'un mélange anhydride trifluoroacétique
(TFA)/eau
(7,5/2,5). Au bout de trois heures on additionne 10 ml de TFA. Après 2 heures
de
déprotection supplémentaire le TFA et l'eau sont concentrés sous pression
réduite.
Rf= 0,46 (CHzCl2/MeOH/AcOH 77,5/15/7,5) ; RMN'H (300 MHz, DMSO) 8 (ppm):
3,8 (m, 2H, CH2~3), 4,2 (m, 2H, CHa), 9,5 (massif, 1H, NH).
b) Couplage de la trifluoroacétvl-sérine sur l'oligonucléotide
~gure 7).
Le couplage a été réalisée sur des lots de 1 umol d'oligonucléotide.
La fonction amine primaire de l'aminolink en S' est conservée protégée par le
groupement protecteur monométhoxytrityle (MMT) et déprotégée au dernier
moment,
juste avant le couplage avec la trifluoroacétyl-sérine, comme décrit
précédemment.
Deux solutions sont préparées indépendamment, à savoir le tube A
49,5 p.1 de lutidine (85 eq), 46 mg de CF3-CO-Ser-OH (46 eq) solubilisés dans
0,5 ml
de DMF, et le tube B : 120 mg de PyBop (46 eq) solubilisés dans 0,5 ml de DMF
(diméthylformamide).
Le support contenant foligonucléotide est préalablement conditionné
pendant 3 minutes par une solution de 49,5 p1 de lutidine dans 1 ml de DMF.
Après
avoir éliminé la solution de conditionnement par filtration, on aspire à la
seringue le
tube A puis le tube B, puis on agite manuellement pendant S minutes. Après
élimination des réactifs par filtration, la résine est lavée au DMF (3 fois 2
minutes), au
DCM (2 fois 2 minutes), puis est séchée à l'argon.
Sur la figure 7, les groupements protecteurs P des nucléotides sont le
benzoyle pour les bases A et C et l'isobutyryle pour la base G.
c) Aminolyse figure 8).
La résine est mise en présence de 250 p1 de NH~OH 32% pendant 15
minutes. La solution d'aminolyse est récupérée. Cette opération est répétée 3
fois. Les
solutions ammoniacales obtenues ainsi qu'1 ml de solution de rinçage du
support par
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de l'ammoniaque à 32 % sont transvasés dans un tube en verre propre et
pyrolisé. Le
tube est refermé hermétiquement et laissé sous agitation, à 60°C,
pendant une nuit. Le
lendemain, le tube est refroidi dans un bain de glace. La solution
d'oligonucléotide est
transférée dans un tube à hémolyse. Le tube en verre est rincé par 1 ml d'eau
et cette
5 solution aqueuse est transvasée dans le même tube à hémolyse que
précédemment. On
évapore ensuite la solution sous pression réduite.
d) Quantification, analyses et purification par RP-HPLC.
Le résidu brut est repris dans 2500 p1 d'eau. Le dosage à 260 nm
donne 2347.95 ~.g d'oligonucléotide brut. Analyse du brut par RP-HPLC : on
purifie
10 le milieu réactionnel brut sur une colonne C18 hyperprep (30°C,
détection à 260 nm,
tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B : CH3CN/HZO
95/5 en volume, gradient : 0 à 40% de B en 86 minutes, débit : 3 ml/min). Les
fractions correspondant au produit sont congelées et lyophilisées.
e) Quantification, analyses par RP-HPLC et spectrométrie de
15 masse par électro-nébulisation.
Le résidu est repris dans 1 ml d'eau. Le dosage à 260 nm donne
175.3 ~g d'oligonucléotide. Analyse par RP-HPLC : 35 p1 de la solution sont
dilués
avec 25 ~.l d'eau. 30 ~1 de ces solutions sont alors injectés sur une colonne
C18
hypersil 250 x 4.6 mm dans les mêmes conditions d'analyse que précédemment. Le
20 produit est pur à 99%. Analyse par spectrométrie de masse à électro-
nébulisation : on
infuse en continu du tampon i-PrOH 20% dans H20. 10 ~l des oligonucléotides en
solution dans H20/i-PrOH 20%/TEA 1% sont injectés à une concentration de
10 pmol/pl. On travaille en mode d'ionisation négative et le cône est de SOV.
Le débit
est de 10 ul/min et la température 70°C. La masse molaire observée pour
le produit de
formule suivante est de 2758.0
O
HO HN-Ci,Hz4_OPOz-ATCGATCG
5' 3'
~z
j~ Oxydation periodique ~gure 9).
46.1 ~g d'oligonucléotide sont repris dans 25.6 q1 de tampon
phosphate 100 mM pH=6.92. 0.98 mg de NaIOc sont dissous dans 416.3 ~l d'eau.
On
prélève 2.56 ~.l de cette solution (soit 6.03 gg de NaI04) que l'on dépose sur
l'oligonucléotide en solution. 35 minutes plus tard, l'excès de NaIO~ est
consommé
avec 2 eq d'acide tartrique par rapport à NaI04, soit 2.82 u1 d'une solution
contenant
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0.81 mg d'acide tartrique dans 270 p1 d'eau. Le milieu réactionnel est agité
quelques
instants et 4 ~l du milieu réactionnel sont prélevés afin de réaliser une RP-
HPLC.
Pour cela, 4 cul du milieu réactionnel sont prélevés et dilués avec 96 q1
d'eau. On
réalise ainsi une RP-HPLC sur colonne C 18 hypersil 250 x 4.6 mm (30°C,
détection à
260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 9911 en volume, tampon B
CH3CN/H20 mQ 95/5 en volume, gradient 1 à 40% de B en 28 minutes, volume
injecté 70 ~1, débit 1 ml/min). La réaction est totale.
g) Purification du produit oxydé par RP-HPLC.
Le milieu réactionnel est injecté sur une colonne C18 hyperprep
(30°C, détection à 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en
volume, tampon B : CH3CN/HZO 95/5 en volume, gradient 0 à 40% de B en 86
minutes, débit 3 ml/min). Les fractions correspondant au produit sont
rassemblées,
congelées et lyophilisées.
h) Quantification et spectrométrie de masse par électro-
nébulisation.
Le résidu est repris dans 1000 ~1 d'eau. Le dosage à 260 nm donne
19.87 q.g d'oligonucléotide. ES-MS : le produit est analysé dans les
conditions
habituelles. La masse observée est de 2728Ø
EXEMPLE 2 : Autre exemple d'obtention, par une chimie en phase solide,
d'oligonucléotides modifiés en position 5' par une fonction a-oxoaldéhyde.
1) Synthèse des oligonucléotides.
Dans cet exemple, les oligonucléotides présentent des séquences de
taille plus importante que celle des oligonucléotides selon l'exemple
précédent. Ces
oligonucléotides seront appelés, dans ce qui suit, amorces 1 et 2 et
présentent
respectivement les séquences suivantes
Amorce 1 : HZN-C~H,z-bras espaceur-GTC CAA GCT CAG CTA ATT
Amorce 2 : HZN-C6H, 2-bras espaceur-GCA GGA CTC TAG AGG ATC
Comme décrit dans l'exemple précédent, la fonction amine primaire
de l'aminolink en position 5' de l'oligonucléotide est conservée protégée par
le
groupement protecteur MMT et déprotégée au dernier moment, juste avant le
couplage avec l'anhydride tartrique. Cette réaction est schématisée sur la
figure 10 qui
représente l'amorce l, dans laquelle les groupements protecteurs P des
nucléotides
sont le benzoyle pour les bases A et C et l'isobutyryle pour la base G. Pour
les
amorces 1 et 2, le bras espaceur a la formule suivante
_ -OPOZ-(OCHZCH2)~OPOZ-(OCHZCHZ)~-OPOZ-
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2) Modification des amorces 1 et 2 en position 5' par une fonction
a-oxoaldéh,Le.
a) Couplage des amorces avec de I 'anhydride (+)-diacétyl-L
tartrigue figure 1l, dans laguelle est représentée I 'amorce I), puis réaction
d 'aminolyse figure 12, dans laguelle est représentée 1 'amorce 1).
On procède comme décrit dans l'exemple 1.
b) Analyses et purification par RP-HPLC.
Pour chacune des amorces, à 1 ~ l de la solution mère, on ajoute
99 ~l d'eau. 70 p1 de cette solution sont alors injectés sur une colonne C18
hypersil
250 x 4.6 mm (30°C, détection 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA
pH=6.5/CH3CN
99/1 en volume, tampon B CH3CN/Hz0 95/5 en volume, gradient 1 à 100% de B en
65 minutes pour l'amorce 1, gradient 1 à 40% de B en 28 minutes pour l'amorce
2,
débit lml/min). L'amorce 1 est pure à 72.1%, l'amorce 2 à 59.5%. Les 2 amorces
sont
de nouveau lyophilisées puis reprises dans 2000 g1 et 3000 ~l d'eau,
respectivement.
Ces solutions sont purifiées sur une colonne C 18 hyperprep (30°C,
détection 260 nm,
tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en volume, tampon B : CH3CN/H20
95/5 en volume, gradient 0 à 40% de B en 86 minutes, débit 3 ml/min). Les
fractions
correspondant au produit sont congelées et lyophilisées.
c) Quantification, analyses par RP-HPLC et spectrométrie de masse
par électronébulisation.
Les amorces sont reprises chacune dans 1000 ~l d'eau.
Le dosage à 260 nm donne 1605.12 ~g d'amorce 1 et 1771.44 ~g
d'amorce 2.
Analyse par RP-HPLC : pour chacune des amorces, à 5 g1 de la
solution mère, on ajoute 60 ~.l d'eau. 35 ~.l de cette solution sont alors
injectés sur une
colonne C18 hypersil 250 x 4.6 mm dans les mêmes conditions d'analyse que
précédemment. Amorce 1 : pureté > 99% ; amorce 2 : pureté de 98.6%.
Analyse par spectrométrie de masse par électronébulisation : on
infuse en continu du tampon i-PrOH 20% dans H20. 10 ~l des amorces en solution
dans H20/i-PrOH 20%/TEA 1% sont injectés à une concentration de 10 pmol/~l. On
travaille en mode d'ionisation négative et le cône est de SOV. le débit est de
10~.1/min
et la température 70°C.
Amorce 1, représentée ci-dessous : M attendue 6458.48, obtenue
6454.5.
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O
-C6H~2-bras espaceur-GTC CAA GCT CAG CTA ATT
5. 3.
HO
Amorce 2, représentée ci-dessous : M attendue 6548.533, obtenue
6544Ø
0
-C~H12-bras espaceur-GCA GGA CTC TAG AGG ATC
5. 3.
HO
Ho
d) Oxydation periodique ~gacre 13, dans laquelle est représentée
1 'amorce 1).
On procède comme décrit dans l'exemple 1, à la différence près que
la réaction d'oxydation est effectuée à un pH de 6.56. La concentration du
NaI04 est
de 1 mM dans le cas de l'amorce 1, et de 1 mM ou de 5 mM dans le cas de
l'amorce 2
(séparée en deux lots).
e) Purification du produit oxydé par RP-HPLC.
Le milieu réactionnel est dilué avec de l'eau et injecté sur une C18
hyperprep dans les mêmes conditions que précédemment. Dans chaque cas, le
produit
est congelé et lyophilisé.
~ Quantification, analyse RP-HPLC et analyse par spectrométrie de
masse.
Les résidus sont repris dans 1000 p1 d'eau. Le dosage à 260 nm
donne les résultats suivants : 785.4 ug d'amorce 1, 500.3 pg d'amorce 2 (pour
le lot
oxydé avec 1 mM de NaI04) et 521.4 pg d'amorce 2 (pour le lot oxydé avec S mM
de
NaI04).
Pour chacun des trois lots d'amorces (amorce 1, amorce 2 oxydée
avec 1 mM de NaI04 et amorce 2 oxydée avec 5 mM de NaI04), respectivement à
7 p1, 11 p1 et 10 p1 de la solution mère, on ajoute respectivement 53 p1, 49
p1 et 50 p1
d'eau. 30 p1 de ces solutions sont alors injectés sur une colonne C18 hypersil
250 x 4.6
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mm (30°C, détection 260 nm, tampon A : 100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1 en
volume, tampon B : CH3CN/Hz0 95/5 en volume, gradient 1 à 40 % de B en 28
minutes, débit 1 ml/min). La pureté des amorces dans chacun des lots est
respectivement de 81,6%, 90,4% et 95,2%.
Analyse par spectrométrie de masse à électro-nébullisation : on
réalise les analyses dans les mêmes conditions que précédemment. Amorce 1 : M
+
H20 (hydrate) attendue 6400.4, observée 6397Ø Amorce 2 : M + H20 (hydrate)
attendue 6490.4, observée 6487Ø
g) Échange de contre-ions.
Les contre-ions triéthylammonium provenant des RP-HPLC ont été
échangés contre des ammonium. Ceci se réalise sur une petite colonne
échangeuse
remplie de résine AG SOW-x8, 200-400 Mesh de chez BIO-RAD, dont les H+ ont été
au préalable échangés contre des NH~+. Les amorces sont déposées dans l'eau et
éluées également à l'eau. On recueille directement les amorces dans des pots à
pénicilline, la colonne étant reliée à un détecteur W. Les solutions sont
congelées et
lyophilisées.
h) Quantification et analvse RP-HPLC
Les amorces sont reprises chacune dans 1000 ~l d'eau. Le dosage à
260 nm donne les résultats suivants. Amorce 1 ( 1 mM de NaIO~) : 781.4 p g
d'oligonucléotide. Amorce 2 (1 mM de NaI04) : 500.9 ug d'oligonucléotide.
Amorce
2 (5 mM de NaIOa) : 505.6 pg d'oligonucléotide.
Pour l'analyse RP-HPLC, on procède comme en ~ ci-dessus. On
obtient les pourcentage de pureté suivants : 80.2% pour l'amorce 1, 91.6% pour
l'amorce 2 (1 mM de NaIOa), et 92.7% pour l'amorce 2 (5 mM de NaIOa).
EXEMPLE 3 : Obtention, par une chimie en phase homogène, d'oligonucléotides
modifiés en position 5' par une fonction a-oxoaldéhyde.
1) Cou~laQe de l'oli~onucléotide avec le tartrate de dissuccinimidyle
fi ure 14 .
Comme dans l'exemple 1, l'oligonucléotide utilisé dans le présent
exemple présente la séquence suivante : ATCGATCG. Il est fourni par Genset
Paris
(référence : L00032077, oligo nr 1289153). Il est repris dans 1 ml d'eau
désionisée et
dosé (19.8 OD dans 1000 q1 d'eau ). 100 ~1 (65.34 ug d'oligonucléotide) de la
solution mère sont ensuite évaporés sous pression réduite. Le résidu est
repris dans
100 ~l d'une solution bicarbonate de sodium 100 mM pH=8.51. Après agitation, 1
mg
(115 eq) de tartrate de dissuccinimidyle, dissous dans 100 ~1 de THF stabilisé
avec
0.025 % de BHT, sont ajoutés sur l'oligonucléotide en solution.
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La réaction est suivie en injectant un échantillon du milieu
réactionnel sur une colonne échangeuse d'ions. Pour cela, S cul du milieu
réactionnel
sont prélevés, dilués avec 65 q1 d'eau et injectés sur colonne ET 125/4
Nucleogen
DEAE 60/7 (50°C, détection 260 nm, tampon A : 20 mM KHZPOa/K~HPOa
5 pH=7.21/CH3CN 80/20 en volume, tampon B : 20 mM KH~PO:~/KzHPO~ 1M KC1
pH=6.67/CH~CN 80/20 en volume, gradient 0 à 30% de B en S minutes puis 30 à
100% de B en 42 minutes, volume injecté 70 ~1, débit 1 ml/min).
Après 6 heures, la réaction est terminée. 2 cul de NHaOH 32 % sont
ajoutés au milieu réactionnel pour consommer l'excès d'ester de N-hydroxy
10 succinimide. Après 24 heures, le milieu réactionnel est repris avec 2210 ~l
d'eau et
purifié sur la même colonne échangeuse d'ions en utilisant les mêmes
conditions
d'élution. Le produit est congelé et lyophilisé.
2) Dessalage.
Le résidu est repris dans 200 ~l de tampon A de dessalage (5 mM
15 TEAA pH=7.04). Une seringue de 10 ml est placée au-dessus d'une cartouche
de
dessalage (Sep Pak Plus C18 Cartridge). On y fait passer 7 ml de CH30H 95%
dans
l'eau puis 3 fois 7 ml de tampon A. Les 200 ~.l de la solution
d'oligonucléotide sont
ensuite déposés sur la cartouche. Les sels sont élués avec 7 ml de tampon A.
On élue
enfin l'oligonucléotide avec 3 fois 3 ml de tampon B (~ mM TEAA pH=7.04/CH30H
20 50/50) et on suit l'élution par dosage UV à 260 nm. La fraction contenant
l'oligonucléotide est concentrée sous pression réduite.
3) Quantification. analyses par échange d'ions et spectrométrie de
masse.
Le résidu est repris dans 1 ml d'eau. Le dosage à 260 nm donne
25 15.32 qg d'oligonucléotide. Analyse par spectrométrie de masse par électro-
nébulisation : 5 q1 de l'oligonucléotide en solution dans HZO/i-PrOH 20%/TEA
1%
sont injectés à une concentration de 2.8 pmol/pl. On travaille toujours dans
les mêmes
conditions que précédemment. On obtient un oligonucléotide correspondant à la
formule suivante, avec M 2720,0 ; (M-H+Na) 2742,0 ; (M-H+K) 2757.0
HO O
HO
HN-C ~,H,.~-OPO,-ATCGATCG
HO
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4) Oxydation periodique.
On procède comme décrit dans les exemples 1 et 2.
EXEMPLE 4: Obtention d'oligonucléotides modifiés en position 3' par une
fonction a-oxoaldéhyde.
Des oligonucléotides modifiés en position 3' par une fonction
a-oxoaldéhyde, aptes à être immobilisés sur un support convenablement
fonctionnalisé pour préparer une biopuce conforme à la présente invention,
peuvent
être obtenus à l'aide du support solide fonctionnalisé décrit dans la Demande
internationale PCT publiée sous le numéro WO 00/64843 et dans l'article de
J.S. FRUCHART et al. paru dans Tetrahedron Letters, 1999, 40, 6225-6228.
1) Préparation d'un support solide fonctionnalisé (figure 181.
~ Couplage de la propanolamine sur l 'anhydride diacétyl-
tartrique.
Dans un ballon de 10 ml à 0°C sous agitation et sous pression
d'argon, on solubilise 1,297 g d'anhydride-(+)-diacétyl-L-tartrique (6 mmoles)
dans
2 ml de DMF. On additionne 0,459 ml de propanolamine (6 mmoles) puis 0,843 ml
de
triéthylamine (6 mmoles). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation
pendant
5 minutes.
~ Couplage de I 'acide 2, 3-diacétoxy-N (3-hydroxy propyl)-
szcccinamiqtze szcr une résine Argog e1 ~-NHa.
On conditionne dans une seringue 263,18 mg (0,1 mmoles) de résine
Argogel"-NHZ de charge 0,38 mmol/g par 3 lavages successifs de 3 minutes dans
le
DMF. On additionne 1,6 ml de la solution d'acide 2,3-diacétoxy-N-(3-hydroxy-
propyl)-succinamique synthétisée précédemment, puis 1,56 g de PyBOP (immoles)
solubilisés dans 1 ml de DMF. Après 15 minutes d'agitation, l'excès de
réactifs est
éliminé par filtration puis la résine est lavée par des lavages successifs au
DMF (3 fois
3 minutes) et au DCM (2 fois 3 minutes) avant d'être séchée sous vide. Un test
de
Kaiser positif montre l'absence d'amine libre sur la résine en fin de
réaction.
RMN HR-MAS (avec filtre de diffusion) (8 ppm) : 1,7 (s, 2H, CH~~zCH2), 2,1 (s,
6H, 2 x ,CH3 CO), 4,2 (m, 2H, ~HZOH), 5,7 (s, 2H, 2 x CH tartrate), 6,5-7,2
(m, PS
résine), 7,9 (m, 1H, NH), 8,2 (m, 1H, NH).
Il est bien entendu qu'en variante, d'autres supports solides que la
résine Argogel"-NHZ pourraient être utilisés, tels que des supports CPG
(Controlled
Pore Glass beads).
~ Protection de la fonction hydroxyle libre par le DMT.
On conditionne la résine précédemment fonctionnalisée par 3
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lavages successifs de 3 minutes dans la pyridine. On additionne 1 g de
chlorure de
4,4'-diméthoxytrityle (immoles) solubilisés dans 5 ml de pyridine. Après 1
heure
d'agitation, l'excès de réactifs est éliminé par filtration puis la résine est
lavée par des
lavages successifs à la pyridine (5 fois 3 minutes), à la triéthylamine à 3%
dans le
DCM (3 fois 3 minutes) avant d'être séchée sous vide. RMN HR-MAS (avec filtre
de
diffusion) (8 ppm) : 1,8 (s, 6H, 2 x ~H3C0), 2-2,5 (m, 2H, CH2~?CHz), 3-3,6
(m,
PEG résine), 3,7 (s, 6H, -O-CH3 DMT), 5,4 (s, 2H, 2*CH tartrate), 6,5-7,2 (m,
PS
résine et aromatiques du DMT), 7,7 (m, 1H, NH), 8,3 (m, 1H, NH)
2) Obtention d'un oli~,onucléotidique portant. en position 3'. une
fonction a-oxoaldéhvde. à l'aide du support solide obtenu ci-dessus.
La synthèse de (T)~-POZ-O-(CHz)3-NH-CO-CHO est effectuée
comme détaillé ci-dessous.
Après la synthèse oligonucléotidique sur le support solide préparé en
1) ci-dessus, conformément aux méthodes connues de l'Homme de l'art, 1 qmol
d'oligonucléotide déprotégé en 5' (élimination du groupement DMT) sont
introduits
dans un eppendorf muni d'un joint résistant à la pression en présence d' 1 ml
d'ammoniaque à 32% dans l'eau. Après une nuit à 60°C, le mélange
réactionnel est
refroidi puis est transvasé dans une seringue. La solution ammoniacale est
éliminée
par filtration, puis la résine est lavée par des lavages successifs à
l'ammoniaque à 32%
(2 fois 3 minutes), puis à l'eau jusqu'à ce que la solution de lavage soit
neutre par
mesure au papier pH. La résine est ensuite séchée sous vide.
L'oxydation périodique est ensuite réalisée par les étapes suivantes.
On conditionne la résine précédemment fonctionnalisée par 3 lavages successifs
de 3
minutes dans un tampon phosphate 0,1 M à pH=6,4. On additionne 1/l0è"'e d'une
solution constituée de 36,3 mg (170 mol) de periodate de sodium solubilisé
dans un
mélange d'eau (0,1 ml) et de tampon phosphate 0,1 M à pH=6,4 (5 ml). Après 1
heure
d'agitation, on additionne 5,1 mg d'acide tartrique (34 mol) solubilisés dans
500 ~l
d'eau. Après 2 minutes, la solution d'oxydation est récupérée dans un tube par
filtration. La résine est lavée par 2 lavages successifs à l'eau, les eaux de
filtrations
étant associées à la solution d'oxydation précédente (volume total = 3,63 ml).
Le produit oxydé est purifié par RP-HPLC et lyophilisé. Pour la RP-
HPLC, le milieu réactionnel est directement injecté sur une C18 hyperprep
(t°=30°C,
260 nm, tampon A=100 mM TEAA pH=6.5/CH3CN 99/1, tampon B=CH3CN/HZO
95/5, gradient=0 à 40% de B en 86 minutes, volume injecté=3,53 ml, débit=3
ml/min).
On isole le produit majoritaire : 213,93 ~g d'oligonucléotides (rendement de
11%) par
mesure quantitative de la DO. Lyophilisation en présence de 1426,9 ~g de
mannitol et
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de 0,189 p.1 de tri-N-butyl-triphénylphosphine.
EXEMPLE 5: Préparation de surfaces de verre fonctionnalisées par un
groupement hydrazide (figure 15)
Afin de pouvoir se lier aux acides nucléiques portant une fonction
a-oxoaldéhyde à leur extrémité 3' ou 5', conformément au procédé conforme à
l'invention, la surface des lames de verre nécessite d'être convenablement
aménagée
au préalable. En particulier, la présence d'un bras espaceur peut être utile
pour
éloigner la sonde de la surface et obtenir une hydridation optimale, ainsi que
pour
contrôler en partie les propriétés physico-chimiques de la surface
(hydrophilie,
hydrophobie, charge). La surface peut également être aménagée pour augmenter
le
nombre de sites fonctionnels par unité de surface, par exemple par la synthèse
de
structures dendrimériques sur le verre (BEIER, M. et al., Nucleic Acids
Research,
1999, 27, 1970-1977) ou par le couplage de polyamines. La stratégie de
synthèse
envisagée est représentée sur la figure 15.
Pour déterminer la qualité des lames hydrazides synthétisées, on
utilise la même réaction que celle qui sera utilisée pour fixer les
oligonucléotides,
c'est à dire une réaction de ligation avec un composé fonctionnalisé par un
groupe
a-oxoaldéhyde (cf. figure 16). Une sonde permettant de caractériser les lames
avec
une grande sensibilité a été choisie : il s'agit d'un peptide fluorescent
fonctionnalisé
par un groupe a-oxoaldéhyde.
1) synthèse d'une sonde fluorescente fonctionnalisée par un groupe
a-oxoaldéhlrde.
Un peptide rhodaminé fonctionnalisé par un groupe a-oxoaldéhyde
de séquence (5)-6-carboxytetraméthylrhodamine-Lys-Arg-NH-(CH~)3-NH-CO-CHO a
été synthétisé à partir du support dénommé IPT (2,3-O-isopropylidène-D-
tartrate)
décrit par J.S. FRUCHART et al. dans Tet. Letters, 1999, 40, 6225-6228 et dans
la
Demande internationale PCT publiée sous le numéro WO 00/64843. La synthèse est
résumée sur la figure 17. 500 mg de résine IPT (0,23 mmol/g) sont utilisés
dans un
cycle de synthèse en phase solide selon une stratégie Fmoc/t-Bu dans du NMP
(N-méthylpyrrolidone) avec les réactifs et les quantités suivantes
- Fmoc-Arg(Pbf)-OH (0,298 g, 4 eq), HBTU (0,174 g, 4 eq), HOBt
(62 mg, 4 eq), DIEA (240 p1, 12 eq) pendant 1 heure. Déprotection
NMP/pipéridine
(80/20) 30 minutes,
- Fmoc-Lys(Boc)-OH (0,215 g, 4 eq), HBTU (0,174 ~, 4 eq), HOBt
(62 mg, 4 eq), DIEA (240 p.1, 12 eq) pendant 1 heure. Déprotection
NMP/pipéridine
(80/20) 30 minutes,
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- (5)-6-carboxytétraméthylrhodamine (99 mg, 2 eq), HBTU
(0,087 g, 2 eq), HOBt (31 mg, 2 eq), DIEA (120 p,1, 6 eq) pendant 1 heure.
La résine est lavée par du NMP (2 x 2min), puis par du DCM (2 x
2min). Les protections des chaînes latérales et le groupe isopropylidène sont
déproté8és par 5 ml de TFA en présence scaven8ers (375 mg de phénol, 125 mg
d'éthanedithiol, 250 y1 de thioanisole et 250 p1 d'eau). La résine est alors
conditionnée dans 5 ml d'acide acétique à 33% pendant 2 minutes. Le peptide
est
alors clivé du support par addition de periodate de sodium (0,1478, 6 eq)
dilué dans
1 ml d'eau sous agitation pendant 5 minutes. La résine est filtrée puis est
lavée par
10 ml d'eau (3 fois 1 minute). Les solutions de clivages sont combinées et
additionnées à 21 p1 d'éthanolamine (3 eq) avant d'être purifiées
immédiatement sur
une colonne C18 RP-HPLC Hyperprep (15 x 300mm). On obtient ainsi 8 mg de
peptide.
Après que les peptides rhodaminés auront été fixés sur les lames
hydrazides, les lames seront lavées pour éliminer l'adsorption non covalente,
selon les
différentes protocoles suivants. Protocole 1 : les lames sont plongées pendant
2 heures
aux ultrasons dans une solution de K~HPOa à 5% dans l'eau. Les lames sont
rincées
successivement par bains de 3 minutes dans de l'eau (2 fois) et enfin dans du
méthanol (1 fois). Les lames sont ensuite séchées dans un dessiccateur sous
vide.
Protocole 2: les lames sont lavées avec un tampon tris(hydroxyméthyl)-
aminométhane-acétate 100 mM pH 5,5 contenant 0.1 % en masse de Tween 20
pendant 15 min.
2) Fonetionnalisation des lames de verre par un groupement
hydrazide (fonction dérivée d'hydrazine~.
a) Étapes de lavage, de décapage et de silanisation des lames
commerciales.
Des lames porte-objets (Esco) pré-nettoyées, à bords rodés et à
marge dépolie sont plongées dans un bain de soude à 10% dans l'eau, d'abord
aux
ultrasons pendant 10 minutes puis une nuit sans ultrasons. Après avoir rincé
ces lames
par trois bains successifs de 3 minutes dans de l'eau, elles sont plongées
pendant 4
heures dans une solution d'acide chlorhydrique à 3,7% dans l'eau. Des rinçages
préalables de trois minutes sont effectués par de l'eau (3 fois) puis par du
méthanol (1
fois), avant de plonger les lames dans un bain à 3% d'aminopropyl-
triméthoxysilane
dans du méthanol à 95% pendant 30 minutes aux ultrasons. Les lames sont
rincées
successivement par des bains de 3 minutes dans du méthanol (1 fois), de l'eau
(2 fois)
et enfin du méthanol (1 fois). Les lames sont ensuite égouttées pendant
quelques
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minutes, séchées 15 minutes dans une étuve à 110°C puis stockées dans
un
dessiccateur sous vide.
b) Fonctionnalisation des lames silanisées par réaction d 'un dérivé
de 1 'hydrazine sur acn isocyanate.
5 ~ Formation de l'isocyanate.
Pour la formation de l'isocyanate, le triphosgène et le
carbonyldümidazole ont été testés. Mais de nombreux autres réactifs pourraient
être
utilisés. Différents solvants ont également été testés : dichlorométhane, DMF,
tBu-
OMe, toluène et dichloroéthane. Les lames précédemment silanisées sont
plongées
10 pendant 2 heures dans une solution de dichloroéthane contenant du
triphosgène (100
mmol/1) et de la DIEA (800 mmol/1). Ces lames sont ensuite rapidement
égouttées
avant d'être directement plongées dans la solution contenant le dérivé
d'hydrazine.
~ Réaction de l'isocyanate avec l'hydrazine ou un dérivé.
Synthèse de Fmoc-NH-NHZ : dans un ballon de 1 litre on introduit
15 10 ml d'hydrazine hydrate sous agitation. On additionne par une ampoule à
brome 1 g
de Fmoc-C1 dissous dans 250 ml d'acétonitrile. Le mélange réactionnel est
agité
pendant 30 minutes à température ambiante puis est concentré sous vide. Le
brut
obtenu est recristallisé dans 200 ml d'éthanol absolu puis est filtré sur
fritté. Les
cristaux blancs sont lavés par de l'éthanol absolu puis sont séchés sous vide
(m =
20 0,65 g, Rendement = 65%). Rf = 0,74 (CHzCI?/TEA 9,5/0,0; T°f--162-
16~°C ; RMN
~H (300 MHz, DMSO) 8 (ppm): 4 (massif, 2H, NH~), 4-4,1 (m, 3H, CHZ et CH
(Fmoc)) ; 7,2-7,9 (m, 8H (Fmoc)), 8,3 (massif, 1H, NH).
Les lames fonctionnalisées par un groupe isocyanate sont plongées
pendant 2 heures aux ultrasons dans une solution de Fmoc-NH-NHZ (22mmo1/1)
dans
25 du DMF. Les lames sont alors rincées successivement par des bains de 3
minutes dans
du DMF (1 fois), par de l'eau (2 fois) et enfin par du méthanol (1 fois) avant
d'être
séchées et stockées dans un dessiccateur sous vide. Alternativement, on
pourrait faire
réagir les lamès fonctionnalisées par un groupement isocyanate avec de
l'hydrazine
( 1 % en volume) dans le DMF.
30 ~ Déprotection.
Le procédé correspondant aux meilleures conditions testées est le
suivant : les lames précédemment obtenues sont plongées dans une solution de
DMF
contenant de la pipéridine (0,2% en volume) et du diazabicyclo-undecène (DBU,
2%
en volume) pendant 30 minutes. Les lames sont alors rincées successivement par
des
bains de 3 minutes dans du DMF (1 fois), par de l'eau (2 fois) et enfin par du
méthanol (1 fois) avant d'être séchées et stockées dans un dessiccateur sous
vide.
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D'autres systèmes de déprotection pourraient consister, par exemple, en des
mélanges
DMF/pipéridine (80/20) ou DMF/pipéridine/DBU (96/2/2), les temps de contact
avec
les lames étant alors respectivement de 30 minutes ou compris entre 2 et 30
minutes.
3) Révélation. contrôle de la dualité des lames.
Les lames obtenues sont révélées (contrôle de leur qualité) avec le
peptide rhodaminé a-oxoaldéhyde précédemment synthétisé : les lames
fonctionnalisées par un groupe hydrazide sont trempées pendant 1 heure à 37
°C dans
un bain du peptide rhodaminé fonctionnalisé par un groupe a-oxoaldéhyde
(64 p.mol/1) en présence de tampon acétate (100 mM, pH=5,5). Le peptide non
fixé de
façon covalente, mais adsorbé sur la lame est éliminé par trempage pendant 2
heures
aux ultrasons dans une solution de KzHPOa à 5% dans l'eau. Les lames sont
rincées
successivement par des bains de 3 minutes d'eau (2 fois) et de méthanol (1
fois). Les
lames sont ensuite séchées dans un dessiccateur sous vide puis passées au
scanner. La
même expérience peut être réalisée avec un peptide rhodaminé non porteur d'une
fonction a-oxo-aldéhyde (contrôle négatif). Séquence du peptide : rhodamine-
Lys-
Arg_NHz.
EXEMPLE 6: Préparation de surfaces de verre fonctionnalisées par un
groupement hydrazine, hydroxylamine ou (3-aminothiol.
Les procédés décrits ci-dessous permettent d'obtenir des surfaces de
verre convenablement fonctionnalisées en vue de la fixation d'acides
nucléiques
modifiés en position 5' ou 3' par une fonction a-oxoaldéhyde.
a) Silanisation des lames de verre.
La silanisation des lames de verre est effectuée comme décrit par
BEIER, M. et al. dans Nucleic Acids Research, 1999, 27, 1970-1977 et par
BURNS,
N. L. et al. dans Langmuir, 1995, 11, 2768-2776. Les lames sont traitées avec
une
solution aqueuse de soude (10%) pendant une nuit, lavées à l'eau, à l'acide
chlorhydrique à 1% dans l'eau, de nouveau à l'eau et enfin au méthanol. Après
une
sonication pendant 15 minutes dans du méthanol à 95% contenant 3% en volume
d'aminopropyltriméthoxysilane, les lames sont lavées au méthanol, puis à
l'eau, et
séchées sous un flux d'azote. Elles sont chauffées pendant 1 minutes à
110°C. Après
refroidissement, elles sont stockées sous azote.
b) Fonctionnalisation des lames de verre.
~ Par une fonction hydrazine.
L'acide Fmoc-hydrazinoacétique (Fmoc : 9-fluorènylméthoxy
carbonyle) de formule Fmoc-NH-NH-CHz-COOH est synthétisé à partir du
chlorhydrate de l'a-hydrazinoacétate d'éthyle (ALDRICH) par saponification de
la
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fonction ester dans de la soude suivie d'une protection de la fonction
hydrazine, selon
le protocole décrit par ATHERTON, E. dans The Peptides, 1987, 9_, part C,
Udenfriend S. et Meienhofer J. Eds., Academic Press, San Diego, Californie.
Les
lames de verre silanisées sont mises en contact avec l'acide Fmoc-
hydrazinoacétique
(100 mM) en présence de BOP (100 mM) et de DIEA (düsopropyléthylamine ;
200 mM) dans le diméthylformamide (DMF), pendant 1 heure. Les lames sont
ensuite
lavées au DMF, traitées avec de la pipéridine à 20% en volume dans le DMF
pendant
minutes (départ des groupes Fmoc protecteurs des fonctions hydrazines), puis
lavées
au DMF, au méthanol, et séchées sous azote.
~ Par une fonction hydroxvlamine.
Les lames de verre silanisées sont traitées par l'acide Fmoc-
aminooxyacétique de formule Fmoc-NH-O-CHI-COOH (SENN CHEMICALS ;
100 mM) en présence de BOP (100 mM) et de DIEA (200 mM) dans le DMF, pendant
1 heure. Elles sont lavées au DMF et traitées, pendant 5 minutes, par de la
pipéridine à
20% en volume dans le DMF (départ des groupes Fmoc protecteurs des fonctions
hydroxylamines). Elles sont ensuite lavées au DMF, au méthanol et séchées sous
azote.
~ Par une fonction /3-aminothiol.
Les lames de verre silanisées sont traitées, en présence de
BOP (100 mM), de DIEA (200 mM) et dans le DMF, pendant 1 heure, par l'acide
Fmoc-Cys(StBu)-OH (acide de formule Fmoc-NH-CH(CH~SStBu)-COOH,
correspondant à l'acide a-amino-~i-mercaptopropionique dont les fonctions
thiol et
amine sont respectmement protégées par des groupes Stl3u et rmoc ;
NOVABIOCHEM, 100 mM). Après un lavage au DMF, elles sont traitées avec de la
2~ pipéridine à 20% dans le DMF pendant S minutes (départ des groupes Fmoc
protecteurs des fonctions amines). Elles sont ensuite lavées au DMF, au
méthanol, et
traitées avec une solution aqueuse de chlorhydrate de tris-
(carboxyéthyl)phosphine
(TCEP) 100 mM dans un tampon phosphate de pH 7.0, pendant 30 minutes (départ
des groupes StBu protecteurs des groupes thiols). Elles sont ensuite lavées au
DMF,
au méthanol et séchées sous azote.
EXEMPLE 7: Ligation d'acides nucléiques fonctionnalisés par un groupe
a-oxoaldéhyde à un support fonctionnalisé par des groupements hydrazides,
pour l'obtention de puces à ADN ou à oligonucléotides conformes à la présente
invention.
La ligation d'acides nucléiques fonctionnalisés en position 5' par
une fonction a-oxoaldéhyde sur une lame de verre fonctionnalisée par une
fonction
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hydrazide est décrite ci-dessous. La fixation des acides nucléiques à la lame
de verre
se traduit par la formation de liaisons hydrazones (liens semicarbazones).
L'efficacité
de la ligation sur ces lames a été évaluée par hybridation d'oligonucléotides
complémentaires marqués en 5' par une molécule de cyanine-3 (Cy-3). La même
expérience de ligation a été réalisée avec succès en utilisant des
oligonucléotides
fonctionnalisés en position 3' par une fonction a-oxoaldéhyde, et des mélanges
d'oligonucléotides fonctionnalisés en position 3' ou 5'.
1 ) Matériel et méthodes.
~ Matériel de dépôt et de lecture.
Le dépôt des oligonucléotides a été fait sur lames de verre en
utilisant un robot Affymetrix~ 417 Arrayer (Affymetrix Inc., 3380 Central
Exwy,
Santa Clara, CA 95051) équipé d'une tête de prélèvement à mécanismes «
aiguille - et
- anneau » (4 aiguilles). Les aiguilles ont un diamètre de 125 qm et font un
dépôt de
forme circulaire d'environ 150-170 pm de diamètre pour un volume d'environ 30-
50 p1 (volume annoncé par le fournisseur). Les dépôts ont été espacés de 375
~m de
centre à centre. La détection de la sonde d'hybridation fluorescente est
obtenue en
utilisant un scanner AffymetrixJ 418 Array Scanner équipé de 2 lasers-diodes
permettant une lecture à des longueurs d'ondes d'excitation de 532 et 635 nm.
La
fluorescence émise par les fluorochromes après excitation est détectée par un
tube
photo-multiplicateur (PMT). Le résultat est obtenu sous forme d'un fichier
image
16-bit avec une résolution de 10 qm/pixel. L'analyse informatique des fichiers
images
et la quantification de l'intensité de fluorescence a été faite en utilisant
le freeware
« ScanAlyze » développé par M. EISEN, de l'université de Stanford.
~ Réactifs.
On utilise les solutions commerciales suivantes : 20x SSC (NaCI
3M, Na Citrate 0,3M ; Quantum Bioprobe, Quantum Biotechnologies Inc.), NaBH4
(Sigma), PBS (Phosphate buffered saline ; Gibco Life Technology).
Les oligonucléotides porteurs d'une fonction a-oxoaldéhyde en
position 5' sont tels qu'obtenus dans l'exemple 2 ci-avant. Les
oligonucléotides
utilisés dans le présent protocole de ligation répondent aux formules
suivantes
(« a-oxo » indique la présence d'une fonction a-oxoaldéhyde)
Pl-a-oxo = S'-a-oxo-GTC CAA GCT CAG CTA ATT-3' ;
P2-a -oxo = 5'-a -oxo-GCA GGA CTC TAG AGG ATC-3' ;
P 1-diol = S'-diol-GTC CAA GCT CAG CTA ATT-3' ;
P1-tartrate = 5'-tartrate-GTC CAA GCT CAG CTA ATT-3'.
Les séquences des oligonucléotides complémentaires marqués au
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Cy3 sort les suivantes
Complémentaire P1-Cy3 = 5'-Cy3-AAT TAG CTG AGC TTG GAC-3'
Complémentaire P2-Cy3 = 5'-Cy3-GAT CCT CTA GAG TCC TGC-3'
Les oligonucléotides fonctionnalisés sont dilués dans de l'eau et
gardés à -20°C jusqu'à utilisation. La quantité nécessaire pour les
dépôts est prélevée
de ce stock et lyophilisée avant d'être remise en suspension dans la solution
de dépôt.
~ Dépôt des oligonatcléotides sur les lames de verre.
Les lames de verre utilisées sont fonctionnalisées par un groupement
hydrazide et sont telles qu'obtenues dans l'exemple 5 ci-avant. Des quantités
différentes d'oligonucléotides lyophilisés ont été remises en suspension dans
20 p.1 de
solution afin d'obtenir des concentrations de 0,1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM et
0,001 mM. Différentes solutions de resuspension ont été essayées afin
d'obtenir le
meilleur aspect de spot possible. Les dépôts ont été réalisés à 375 ~m les uns
des
autres, à une température de 20°C et dans une atmosphère à 70 % (~ 5 %)
d'humidité
relative. Après dépôt, les lames ont été incubées dans une enceinte saturée en
humidité
(proche de 100 d'humidité relative) à 37°C pendant 14 à 16 h. Les lames
ont ensuite
été lavées dans une solution à 0,1 % SDS pendant 5 minutes à température
ambiante
afin d'éliminer les oligonucléotides n'ayant pas réagi avec la lame. Cette
étape de
lavage a été optimisée afin d'éliminer le maximum d'adsorption aspécifique
entre
l'oligonucléotide et le verre. Après lavage les lames sont séchées par
centrifugation
(5 minutes ; 30 xg ; 20°C) en position verticale.
~ Préhybridation, hybridation et lavage.
Les hybridations se font dans des « CMT-Hybridization Chambers »
(Corning). Lâ zone de dépôt est préhybridée par 15 ~l de tampon de
préhybridisation
(50% formamide, 4x SSC, 0,5% SDS ; 2,5x Denhardt) à 50°C pendant 1h30.
La
solution de préhybridation est placée entre lame et lamelle. La lame est
placée dans la
chambre d'hybridation qui contient 2 réservoirs recevant environ 15 cul de
tampon de
préhybridation pour saturer en humidité l'atmosphère à l'intérieur de la
chambre. La
chambre est fermée hermétiquement et plongée dans un bain-marie à 50°C.
Après préhybridation, la chambre est ouverte, la lamelle est retirée et
le tampon de préhybridation est éliminé en inclinant la lame sur un papier
absorbant.
15 p1 de tampon d'hybridation (50% formamide ; 6x SSC ; 0.4% SDS ; 4x Denhardt
;
0,01 mM d'oligonucléotide complémentaire) sont préparés et incubés 5 min à 95
°C
avant d'être placés sur la zone de dépôt. La lame est recouverte de la lamelle
et placée
dans la chambre d'hybridation pour être incubée à 50°C pendant 14 à 16
h. Ce
processus doit être réalisé le plus rapidement possible afin d'éviter tout
séchage après
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avoir retiré la lamelle.
Après hybridation, la lame est plongée dans 50 ml de 2x SSC en
position verticale afin de décoller la lamelle. Après décollement, la lame est
successivement lavée dans 50 ml de 0,1 % SDS, 0,1 x SSC pendant 5 min ; 50 ml
de
5 O,lx SSC pendant 5 min ; 50 ml de 0,1 x SSC pendant 5 min. Ces lavages se
font dans
des tubes Falcon 50 ml, à température ambiante. L'agitation est assurée par
retournement du tube 1 x toutes les minutes. Après le dernier lavage les lames
sont
rincées sous un jet d'eau stérile et séchées immédiatement par centrifizgation
(5 minutes ; 30 xg ; 20°C).
10 ~ Lectacre des lames au scanner.
Les lames sont scannées à 532 nm de longueur d'onde (Cy-3),
immédiatement après lavage. La lecture se fait à différents réglages de la
puissance du
laser et de l'ouverture du tube PMT. Un réglage standard (35% de puissance
laser,
50% d'ouverture du PMT) a été choisi et utilisé systématiquement pour toutes
les
15 lectures afin de pouvoir comparer visuellement les résultats entre eux.
Lorsqu'une
quantification de l'intensité de fluorescence est souhaitée le réglage L/PMT
est
modifié pour obtenir tous les signaux fluorescents en dessous du seuil de
saturation.
~ Synthèse de produits PCR, dépôts et hybridation.
Les oligonucléotides P1-tartrate et P2 ont été engagés dans une PCR
20 sur le plasmide pFus II comprenant un fragment du gène S 1 de bordetella
pertussis
pFus II + S 1 (la partie amplifiée correspond au fragment de gène inséré). La
PCR a été
faite en utilisant l'AmpliTaq Gold~ de Perkin Elmer et dans les conditions
recommandées par le fournisseur. Les cycles d'amplification sont les suivants
: 1x
(94°C, 10 min) ; 35x(94°C, 45 sec / 55°C, 45 sec /
72°C, 45 sec) ; 1x (72°C, 10 min).
25 Après PCR les produits obtenus ont été répartis dans 4 puits d'une
plaque Multiscreen PCR (Millipore) et traités de la façon suivante. Le liquide
réactionnel a été filtré au travers de la membrane par aspiration. L'ADN fixé
sur la
membrane a été lavé 3 fois par 100 q1 de tampon 3x SSC pH 5,5. L'ADN a été
resuspendu dans 50 ~1 de 6x SSC et la fonction tarnate a été oxydée par 50 p1
30 de périodate de sodium (2 mM dans l'eau). Les différents puits ont subi
différents
temps d'oxydation : Oh (contrôle négatif non oxydé), 30min, 1h et 3h. Après
oxydation la réaction a été stoppée par 100 ~l d'acide tartrique (dans du 3x
SSC)
pendant 10 min. Les produits ont été ensuite lavés 3 fois avec du 3x SSC avant
d'être
repris dans de l'eau, évaporés et remis en suspension dans la solution de
dépôt (3x
35 SSC). Les concentrations obtenues étaient de 0,3 à 0,4 pg/pl. Deux
contrôles (oxydé
et non oxydé) ont été ajoutés à l'expérience : ils correspondent à la même
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amplifiEation PCR obtenue avec le couple d'oligonucléotide P1-P2.
Le dépôt et la ligation de ces produits PCR ont été réalisés dans les
mêmes conditions qu'en 3) ci-dessus. L'hybridation a été réalisée comme
indiqué en
4) ci-dessus en utilisant une sonde synthétisée par PCR unidirectionnelle sur
le
plasmide pFus II + Sl et en utilisant l'oligonucléotide P2 pour initier la
synthèse.
Après hybridation les lames ont été lavées et analysées comme décrit en 4) et
5)
ci-dessus.
2) Résultats.
~ Aspect du dépôt et adsorption aspécifique.
Différentes solutions de dépôt, à différentes concentrations et
différents pH ont été testées. La qualité du résultat a été estimée en
déposant
directement l' oligonucléotide complémentaire P 1 à une concentration de 0,1
ou
0,01 mM. La forme, l'intensité et l'homogénéité du point ont été évalués
visuellement
et en quantifiant l'intensité de fluorescence. Les meilleurs résultats ont été
obtenus en
utilisant du 3x SSC pH 5,5. Des résultats acceptables ont été aussi obtenus en
faisant
les dépôts dans une solution de Tris Acétate 1mM pH 5,5 + 450 mM NaCI. Ces
deux
solutions ont été utilisées pour déposer du P1-a-oxo sur les lames hydrazides
afin de
quantifier le taux d'hybridation. Le lavage des oligonucléotides non fixés à
la lame a
été optimisé afin d'obtenir une adsorption aspécifique minimale. Le meilleur
protocole de lavage permet d'éliminer 90% des oligonucléotides non fixés.
~ Hybridation sur lames fonctionnalisées par un groupement
hvdrazide.
Le dépôt de Pl-a-oxo sur lame hydrazide, ainsi que les hybridations
avec le complémentaire Pl, ont été réalisés comme détaillé ci-dessus. Les
résultats de
l'hybridation sont présentés dans les tableaux 1 et 2. Les dépôts ont été
faits en
3x SSC pH 5,5 (tableau 1) et en tris-acétate pH 5,5 + 450 mM NaCI (tableau 2).
Les
valeurs des intensités de fluorescence présentées dans les tableaux 1 et 2 ont
été
mesurées en utilisant le programme ScanAlyze. Les réglages de laser et PMT ont
d'abord été modifiés pour obtenir une image ne présentant aucune saturation
(30%
laser et 35% PMT). Les valeurs moyennes de 6 repliquats pour chaque dépôt et
un
écart type de ces valeurs sont reportés dans les tableaux 1 et 2.
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Tableau I : Intensité de fluorescence d'oligonucléotides déposés, dans un
milieu
tampon 3x SSC pH 5,5, sur une lame hydrazide et hybridés avec des séquences
complémentaires marquées au Cy3.
Type
d'oligonuclotide
P1-a-oxoPI-a-oxoPl-a-oxoPI-a-oxoP1-diol
Concentration de 0,1 0,5 0,01 0,001 0,1
l'oligonuclotide
(mM)
Moyenne de l'intensit10871 8497 1496 162 441
de
fluorescence
Ecart type (sur 6 692 634 ~ 72 8 74
mesures) ~
10
Tableau 2 ~ Intensité de fluorescence d'oligonucléotides déposés, dans un
milieu
tampon tris-acétate pH 5,5 + 450 mM NaCI, sur une lame hydrazide et hybridés
avec
des séquences complémentaires marquées au Cy3.
Type
d'oligonuclotide
Pl-a-oxoP1-a-oxoP1-a-oxoP1-a-oxoPl-diol
Concentration de 0,1 0,5 0,01 0,001 0,1
l'oligonuclotide
(mM)
Moyenne de l'intensit2856 2061 977 164 228
de
fluorescence
Ecart type (sur 6 214 240 88 15 20
mesures)
Une hybridation importante est détectable au niveau des dépôts
(tableaux 1 et 2) alors qu'une lame non hybridée possède une fluorescence très
faible
(intensité de fluorescence : 50-70). L'intensité de fluorescence la plus forte
est
obtenue pour un dépôt à 0,1 mM en oligonucléotide P1-a-oxo et dans le tampon
3 x SSC pH5,5. L'intensité de fluorescence décroît avec la concentration en
oligonucléotide déposé. A 0,001 mM, le signal devient a peine détectable.
Un contrôle d'adsorption aspecifique est obtenu en déposant un
oligonucléotide de même séquence nucléotidique que P1-a-oxo mais dont la
fonctionnalisation n'est pas complète (arrêt à l'étape diol) et qui n'a donc
pas la
possibilité de réagir avec les fonctions semicarbazides du support. Cet
oligonucléotide
est déposé à une concentration de 0,1 mM et présente une intensité de
fluorescence
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beaucoixp plus faible que l'équivalent P1-a-oxo. Les valeurs résumées dans le
tableau
1 permettent d'estimer l'intensité de fixation aspécifique comme représentant
seulement environ 4 % du signal ( 10871 de 0,1 mM P 1-a-oxo par rapport à 441
pour
0,1 mM P 1-diol).
D'une manière générale les dépôts en tampon tris-acétate (tableau 2)
présentent les mêmes caractéristiques qu'en 3x SSC (tableau 1), mais avec des
intensités de fluorescence moindres. Les protocoles de dépôts (en 3x SSC) et
d'hybridation détaillés ci-dessus ont été répétés plusieurs fois dans les mëme
conditions et des résultats identiques ont été obtenus.
La même gamme de concentration a été préparée et déposée en
utilisant un oligonucléotide de séquence différente : P2-a-oxo. Le dépôt et la
fixation
sur lame hydrazide ont été faits dans les mêmes conditions que pour P1-a-oxo.
L'hybridation a été faite en utilisant un oligonucléotide marqué par un Cy3 en
5' et
complémentaire à P2. Après hybridation, les mesures de fluorescence sont très
comparables à celles obtenues avec P1-a-oxo, prouvant que les résultats
obtenus avec
P1-a-oxo sont vérifiés avec des paires d'oligonucléotides de séquences
différentes.
~ Réutilisation des lames (déshybridation - réhvbridation).
Des essais de déshybridation puis réhybridation ont été menés sur un
dépôt de 0,1 mM en P 1-a-oxo sur lame hydrazide. Après la première hybridation
(avec 0,01 mM en complémentaire P 1 ) et la lecture des résultats, les lames
ont été
plongées dans de l'eau à 95°C pendant S minutes. Les lames ont ensuite
été séchées et
le signal fluorescent encore présent au niveau des dépôts a été évalué par une
nouvelle
lecture au scanner. Après trois cycles d'hybridations/déshybridations
successives, les
résultats obtenus montrent que l'ADN déposé a été déshybridé presque
complètement
puis réhybridé pour atteindre un niveau de fluorescence comparable à
l'hybridation
initiale. Ces essais montrent que les oligonucléotides fixés aux lames
hydrazides
résistent aux conditions de déshybridation et restent accessibles pour subir
des
hybridations successives.
~ Résultats d'hybridation sur produits PCR.
Dans cet essai, on engage les oligonucléotides P1-tartrate dans une
réaction de PCR. On les soumet ensuite à une réaction de peroxydation (temps
de
réaction : 30 minutes, 1 h ou 3 h) et on dépose les oligonucléotides ainsi
oxydés sur la
lame hydrazide. On observe une augmentation du signal fluorescent en fonction
du
temps d'oxydation, montrant que la fonction tartrate est bien transformée en
fonction
a-oxoaldéhyde et qu'il y a donc de plus en plus de produits PCR disponibles
pour la
ligation.
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3) Conclusion.
Les résultats présentés dans cet exemple montrent qu'on peut fixer
des oligonucléotides fonctionnalisés en 5' par une fonction a-oxoaldéhyde sur
une
lame hydrazide et que les oligonucléotides, une fois fixés, restent
accessibles pour des
S hybridations avec des oligonucléotides complémentaires. I1 est également
possible de
déshybrider, par chauffage à 95°C, les oligonucléotides fixés à la lame
et de réutiliser
cette lame dans une nouvelle hybridation. Quant à l'oligonucléotide portant, à
son
extrémité 5', un groupement tartrate, il peut être engagé dans une réaction de
PCR
puis oxydé avant d'être déposé sur la lame hydrazide. Une fois fixé sur la
lame, le
produit de la PCR peut être hybridé avec une séquence nucléotidique
complémentaire.
EXEMPLE 8 : Dépôt d'oligonucléotides modifiés en position 5' par une fonction
a-oxoaldéhyde sur des lames de verre fonctionnalisées par des groupements
hydrazine, hydroxylamnine ou (3-aminothiol.
a) Cas des lames de verre fonctionnalisées par des groupements
hydrazine ou hydroxylamine.
Les oligonucléotides modifiés en position 5' par une fonction
a-oxoaldéhyde, tels qu'obtenus dans les exemples précédents, sont repris en
solution
dans un tampon phosphate de pH 6.0, puis déposés manuellement ou à l'aide d'un
robot sur les lames de verre obtenues dans l'exemple 6. Le dépôt s'accompagne
de
l'immobilisation des oligonucléotides sur la surface par la formation de
liaisons
hydrazones (dans le cas où la surface porte une fonction hydrazine) ou oximes
(dans le
cas où la surface porte une fonction hydroxylamine).
Les lames sont incubées dans une chambre humide pendant une nuit
à 37°C. Elles ont lavées à l'eau, puis subissent un traitement de «
stripping » par du
phosphate de disodium (NaZHPO~ ; 2,5 mM) et 0,1% en volume de SDS (sel de
sodium de l'ester du sulfate de dodécyle) à 95°C et pendant 30
secondes. Après des
lavages à l'eau, les lames sont séchées sous flux d'azote et stockées sous
atmosphère
inerte.
b) Cas des lames de verre fonctionnalisées par des a oupements
(3-aminothiol.
Les oligonucléotides modifiés en position ~' par une fonction
a-oxoaldéhyde, tels qu'obtenus dans les exemples précédents, sont repris en
solution
dans un tampon phosphate de pH 6.0 contenant 1 mM de TCEP (chlorhydrate de
tris-
(carboxyéthyl)phosphine), puis déposés manuellement ou à l'aide d'un robot sur
les
lames de verre obtenues dans l'exemple 6. L'immobilisation des
oligonucléotides sur
la lame de verre s'accompagne de la formation de liaisons thiazolidines. Les
lames
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sont incubées et traitées comme décrit en a).
Les protocoles décrits en a) et b) ci-dessus pourraient également
mettre en oeuvre des oligonucléotides modifiés en position 3' par une fonction
a-oxoaldéhyde, ou des acides nucléiques de plus grande taille, tels que des
ADN.
5 EXEMPLE 9 : Ligation entre un peptide possédant une fonction hydrazine en
position N-terminale et un oligonucléotide possédant une fonction a-
oxoaldéhyde
en position 5'.
Cet exemple illustre la ligation d'un oligonucléotide conforme à
l'invention à un support non solide de nature peptidique.
10 1 ) Synthèse du peptide de formule HZN-GRYL-NH2.
La synthèse peptidique a été réalisée suivant la stratégie Fmoc/t-Bu
sur un synthétiseur Applied Biosystems 431A, sur 0.25 mmole de résine MBHA
Rink
Amide" chargée à 0.74 mmol/g. Les acides aminés sont activés en utilisant un
mélange HBTU/HOBt/DIEA (acide aminé/HBTU/HOBt/DIEA : 4 eq/4 eq/4 eq/8 eq)
15 dans le NMP. Les chaînes latérales sont protégées comme suit : Arg(Pbf),
Tyr(t-Bu).
A la fin de la synthèse, la résine est divisée en 2 lots. Sur une moitié
(0.125 mmol), on déprotège manuellement le Fmoc par un mélange pipéridine/NMP
20/80 et on couple la triBocGlycineHydrazine en utilisant aussi HBTU, HOBt et
DIEA (4 eq/4 eq/4 eq/8 eq). Après contrôle du couplage par un test de Kaiser,
la
20 résine est séchée et clivée pendant 1h30 avec 2.75 ml d'un mélange
phénol/EDT/thioanisole/H20/TFA (0.3 a/0.1 m1/0.2 m1/0.2 ml/qsp 4 ml). Le
peptide
est précipité dans 200 ml d'un mélange Et~O/pentane 50/50. Après
lyophilisation, on
obtient 42.5 mg de peptide brut (soit un rendement de couplage de 45.4%).
Après purification par RP-HPLC sur une colonne C 18 nucléosil
25 (t°=60°C, ~.=225 nm, tampon A=HZO/TFA 0.05%, tampon B=n-
propanol 40%/HZO
60%/TFA 0.05%, gradient de 0 à 20% de B en 30 minutes, débit de 4 ml/min),
congélation et lyophilisation, on obtient 16.4 mg de produit pur (soit un
rendement
final de 17.5%). Analyse par MALDI-TOF : [M+H~+ calculé 522, observée 522.3.
2) Synthèse de l'oli~,onucléotide de formule HCO-CO-HN-C~ Hz4_
30 ATCGATCG.
Cet oligonucléotide a été obtenu dans les conditions classiques
d'oxydation periodique (tampon phosphate 100 mM pH=6.56, 35 minutes de
réaction
avec NaI04 lmM, puis arrêt de la réaction avec 2 équivalents d'acide tartrique
par
rapport à NaI04), purifié dans les conditions habituelles, isolé, congelé et
lyophilisé en
35 ajoutant du mannitol (6.67 pg de mannitol/pg d'oligonucléotide) et de la
tri-n-butyl-
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phosphine (0.005% en volume). La masse de cet oligonucléotide a été contrôlée
par
spectrométrie de masse par électronébulisation dans les conditions
habituelles.
3) Réaction de lieation entre l'oli~onucléotide et le peptide.
On engage la réaction de ligation entre 6.3 qg d'oligonucléotide
dissous dans 6 ~l de tampon citrate 50 mM pH=5.33 et 3.5 ~.g (2 eq)
d'hydrazinopeptide dissous dans 4 q1 d'eau. L'eppendorf contenant le milieu
réactionnel, entouré de parafilm afin de limiter l'évaporation, est placé dans
un bain à
37°C. L'eppendorf est retiré du bain thermostaté et 10 ~l de tampon
citrate sont
ajoutés 1h plus tard. Le milieu réactionnel est laissé à température ambiante
et congelé
à -30°C après 27h. Après décongélation, 5 ~I du milieu réactionnel sont
prélevés et on
y ajoute 55 ~l d'eau. On réalise une RP-HPLC analytique sur une colonne C18
hypersil 250 x 4.6 mm (t°=30°C, 7~=260 nm, tampon A=TEAA 100 mM
pH=6.5/CH3CN 99/l, tampon B=CH3CN/H20 95/S, gradient de 1 à 40% de B en 28
minutes, volume injecté=30 Vil, débit=1 ml/min). Un produit nouveau est
effectivement apparu. Le milieu réactionnel est de nouveau congelé en
attendant de le
purifier.
Après décongélation, on dilue le milieu réactionnel avec 300 ~l
d'eau et on injecte 270 ~.1 sur une colonne C18 hypersil 250 x 4.6 mm
(t°=30°C,
7~=260 nm, tampon A=TEAA 100 mM pH=6.5/CH3CN 99/l, tampon B=CH3CN/HZO
mQ 95I5, gradient de 1 à 40% de B en 28 minutes, volume injecté=30 ~1, débit=1
ml/min). On recueille le produit majoritaire. Le produit est congelé et
lyophilisé. Il est
repris dans 250 ~l d'eau et dosé : 0.022 OD/250 ~l soit 0.726 pg
d'oligonucléotide.
Ce produit est analysé par MALDI-TOF. [M+H]+ calculé 3233.6, observée 3233.5.
II
présente la formule suivante
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42
NH2
OH ~~~~ N
~N ~ .- I
;~ O I N.,
Ö
-T C G A T C G-5'
Ö._.
j ;,
\'~ NH
%'
O ; ~ ~ OH
N~N~/O I
H NH~H ô N~NHZ
~N NH
N Hz
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite
nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et
d'application qui
viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au
contraire toutes les
variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans
s'écarter du
cadre, ni de la portée, de la présente invention.
En particulier, il est entendu que dans les formules (I) et (II) des
produits et des supports selon la présente invention, ainsi que dans le
procédé de
fixation d'un acide nucléique M sur un support SP selon la présente invention,
le
support SP peut consister en un polymère arborescent de type polyacrylamide ;
dans
ce cas de figure, il sera intéressant de fixer, par liaison covalente, des
oligonucléotides
sur ce polymère arborescent, en utilisant le procédé selon la présente
invention.
