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Identification de gènes associés à un locus QTL de digestibilité du mais
La présente invention concerne l'identification de gènes associés
à des loci QTL de quantité de lignine et de digestibilité du mais.
De nombreux caractères phénotypiques manifestent une variation
continue dans les populations, variation qui peut être quantifiée. Parmi de
tels
caractères, on peut citer par exemple le nombre de ramifications, la
précocité,
la résistance à des insectes, le pourcentage de protéines dans le grain, etc.
II
1o est admis que cette distribution continue peut s'expliquer en supposant que
plusieurs locus en ségrégation influencent la variation du caractère, à
laquelle
des effets de milieu peuvent également contribuer (de Vienne et al, 1998).
Depuis le début des années 80, on a coutume d'appeler çes locus, en anglais
comme en français, des QTL (pour « Quantitative Trait Loci »). Des différences
is d'effets entre allèles sauvages seraient responsables de la variation des
caractères quantitatifs ( Helentjaris 1987, Beavis et al. 1991 ).
Les auteurs de la présente invention se sont intéressés, parmi
ces caractères quantitatifs, à la digestibilité du mais. La qualité nutritive
des
mais d'ensilage dépend, en plus du stade de récolte, (évalué par le
?o pourcentage de matière sèche qui doit être compris entre 30 et 35%), des
quantités respectives des grains et des tiges et des digestibilité propre à
chacune de ces deux parties.
La valeur de digestibilité du mais est difficile à évaluer. La
digestibilité de la tige dépend principalement de la digestibilité des parois
des
2s cellules. Les parois des cellules sont constituées principalement de
cellulose,
d'hémicellulose et de lignine. La lignine contrairement aux autres
constituants
n'est pas digérée par les animaux polygastriques et elle est donc considérée
limitante pour la valeur de digestibilité des fourrages. Des corrélations
entre
quantité de lignine et digestibilité ont été publiées, mais les résultats sont
~o contradictoires. Une corrélation négative est généralement observée lorsque
différents stades de maturité sont comparés alors que la corrélation est moins
évidente lorsqu'un seul stade de maturité est considéré (Jung and Allen,
1995).
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Ceci témoigne du fait que la lignine n'explique qu'en partie la variation
globale
de la digestibilité.
A l'origine, les mesures de digestibilité du maïs ensilage sont
réalisées en mesurant le gain énergétique de ruminants nourris à partir de cet
a ensilage. Ces tests in vivo sont cependant coûteux et nécessitent de grandes
quantités de matériel végétal. Aussi, des méthodes indirectes ont donc été
développées : - mesure de digestibilité in vitro dans du jus de rumen (Menke
et
al, 1979) ; - mesure de digestibilité in vitro enzymatique (Aufrere and
Demarquilly, 1989). Des mesures chimiques sont également utilisées pour
1o quantifier les constituants de paroi (Van Soest, 1963). Une autre méthode
d'évaluation de la digestibilité passe par l'utilisation de spectrométrie dans
le
proche infra-rouge (Ronsin et Femenias, 1990). Cette technique permet de
prédire différents paramètres de digestibilité ou de quantité de constituants
de
paroi.
1s Les auteurs de la présente invention sont maintenant parvenus à
établir une co-localisation entre QTL de digestibilité du maïs et certains
gènes,
connus comme étant impliqués dans les voies de synthèse de la lignine, co-
localisation susceptible d'étre mise à profit notamment pour produire des maïs
plus digestibles.
Zo
Pour cela, ils ont mis en oeuvre une méthode comprenant
i) la détermination, pour plusieurs individus d'une
descendance de mais en ségrégation, du génotype d'un ensemble de locus
marqueurs distribués tout le long du génome ;
2s ii) la mesure de la digestibilité pour chacun des individus
étudiés ;
la corrélation entre le génotype des locus marqueurs et la
digestibilité, permettant la localisation des QTL de digestibilité ;
iv) !a corrélation entre le QTL de digestibilité ainsi localisé et
3o au moins un gène, ledit gène ayant été préalablement cartographié, sur les
mémes individus ou d'autres individus de la même espèce, dans la région
desdits locus marqueurs corrélés audit QTL de digestibilité.
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Par « locus marqueur», on entend un locus identifié par un
marqueur polymor phe qui renseigne sur le génotype à ce locus et en partie aux
locus voisins du fait de la liaison génétique. Parmi les marqueurs courants,
on
peut citer les marqueurs RFLP (« restriction fragment length polymorphism »)
s RAPD (« random-amplified polymorphic DNA »), AFLP(« amplification fragment
length polymorphism » ou SSR (« simple sequence repeats »).
Par « descendance en ségrégation », on entend une population
de plantes génétiquement hétérogènes de même dérivation génétique et étant
par conséquent apparentées. Des exemples de descendance en ségrégation
1o incluent des populations obtenues par rétrocroisement, des lignées
recombinantes ou des populations de lignées F2.
Les mesures de digestibilité telles que mentionnées à l'étape (ü)
ci-dessus ont été réalisées par spectrométrie dans le proche infrarouge (ou
NIRS en anglais). Un appareil de type monochromateur (NIRS system 5000 -
is FOSS) a été utilisé. Les teneurs en paroi et en lignine (pourcentage par
rapport
aux parois) et une mesure de digestibilité enzymatique des parois selon
Aufrere (Aufrere et Demarquilly, 1989) ont ainsi été prédites.
La corrélation entre le génotype des locus marqueurs et la
2o digestibilité, qui permet la localisation des QTL de digestibilité comme
mentionné à l'étape (iii) ci-dessus, peut être effectuée par des méthodes
biométriques connues de l'homme du métier (de Vienne, 1998). Ces méthodes
biométriques peuvent s'appuyer sur des analyses marqueur par marqueur
(Tanskley et al, 1982) ou en prenant en compte conjointement deux ou
2s plusieurs marqueurs (Landen et Botstein, 1989). Au moyen de cette méthode,
décrite plus précisément dans les exemples ci-après, les auteurs de la
présente invention sont parvenus à identifier plusieurs réaions
chromôsomiques comme étant des loci OTL de digestibilité du mais.
La présente invention a plus particulièrement pour objet une
~o région chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité
du
mais, caractérisée en ce qu'elle est délimitée par les marqueurs UMC67 et
UMC 128 sur le chromosome 1 du mais, comme indiqué à la figure 1.
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Ces marqueurs sont connus de l'homme du métier, et sont par
exemple accessibles via la "Maize Genome Database" de l'Université du
Missouri (http : //www.agron.missouri.edu).
La contribution de cette région chromosomique est de l'ordre de
s 15 % de la variance phénotypique de la teneur en lignine, et de l'ordre de
15
également pour la digestibilité enzymatique.
La région chromosomique d'intérêt est plus particulièrement
délimitée par les marqueurs UMC 67, ou de préférence UMC 58 à une
extrémité et par le marqueur UMC 128 à l'autre extrémité.
1o En application de !'étape (iv) de la méthode décrite ci-dessus, les
auteurs de la présente invention ont mis en évidence que cette région
chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du mais,
comprenait le gène 4CL2 codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 2 et le
gène CCR codant pour l'enzyme Cynnamoyl CoA réductase, localisés entre les
Is marqueurs UMC 58 et UMC 128.
Ces marqueurs peuvent notamment servir pour préparer des
amorces pour des réactions d'amplification de type PCR (réaction en chaîne
par polymérase), appliquées à de l'ADN de mais ou pour préparer des sondes
pour des hybridations Southern.
L'invention a donc pour objet une région chromosomique
identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du maîs, caractérisée en
ce qu'elle est comprise entre les marqueurs UMC 67 et UMC 128 sur le
chromosome 1 du maîs et qu'elle comprend le gène 4CL2 codant pour
2~ l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 2 et le gène CCR codant pour l'enzyme
Cynnamoyl CoA réductase.
La séquence SEQ ID n°1 annexée correspond à un ADNc de
pleine longueur codant pour la 4CL2 de mais.
La demande de brevet US 866 791 décrit par ailleurs un ADN
3o recombinant codant pour l'enzyme CCR de mais, également décrit dans
l'article de Civardi et_al, 1998 et accessible sur la base de données GenBank
(n° d'accès Y13734).
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Les auteurs de la présente invention ont également mis en
évidence une autre région chromosomique, identifiée comme étant un locus
QTL de digestibilité du mais. Cette région est caractérisée en ce qu'elle est
délimitée par les marqueurs bnlg 1046 et bnlg 609 sur le chromosome 5 du
mais, comme indiqué à la figure 2.
Ces marqueurs sont connus de l'homme du métier, et sont par
exemple donnés par le "Maize Genome Database" de l'Université du Missouri.
La contribution de cette région chromosomique par rapport à la
teneur en lignine est de l'ordre de 10 % de la variance phénotypique.
1o La région chromosomique d'intérêt est plus particulièrement
délimitée par le marqueur UMC 27a à une extrémité et par le marqueur bnl
7.71 à l'autre extrémité.
En application de l'étape (iv) de la méthode décrite ci-dessus, les
auteurs de la présente invention ont mis en évidence que cette région
1s chromosomique identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du mais,
comprenait le gène 4CL1 codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 1, le
gène CAD codant pour l'enzyme cinnamyl alcool deshydrogénase et le gène
F5H codant pour l'enzyme ferulate 5-hydroxylase localisés entre les marqueurs
UMC 27a et bnl 7.71.
2o Ces marqueurs peuvent notamment servir pour préparer des
amorces pour des réactions d'amplification de type PCR (réaction en chaîne
par polymérase), appliquées à de l'ADN de mais ou pour préparer des sondes
pour des hybridations (Southern).
2s L'invention a donc pour objet une région chromosomique
identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité du mais, caractérisée en
ce qu'elle est comprise entre les marqueurs bnlg 1046 et bnlg 609 sur le
chromosome 5 du mais et qu'elle comprend le gène 4CL1 codant pour
l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 1, le gène CAD codant pour l'enzyme
~o cinnamyl alcool deshydrogénase, et le gène F5H codant pour une ferulate-5-
hydroxylase.
La séquence d'ADNc de pleine longueur codant pour l'enzyme
4CL1 est présentés dans la liste de séquences annexée, SEQ ID n° 2.
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L'enzyme CAD et son gène sont décrits dans Civardi et al, 1998
et sur la base de données Genbank (N° d'accès Y13733)
La séquence SEQ ID n° 3 annexée correspond à l'ADNc codant
pour la F5H de mais.
s
L'identification de QTL de digestibilité et la mise en évidence des
marqueurs et des gènes associés à ces QTL conformément à l'invention ouvre
la voie à un certain nombre d'applications.
Des sondes nucléiques ou des amorces permettant une
1o amplification par PCR peuvent être construites à partir de tout ou partie
des
régions chromosomiques décrites plus haut ou bordant celles-ci. II peut
notamment s'agir de sondes obtenues à partir des séquences codant pour les
enzymes CCR, 4CL2, CAD et/ou 4CL1 et FSH.
Des programmes de sélection assistée par marqueurs peuvent
1s être mis en oeuvre en utilisant ces sondes comme marqueurs, de manière à
introgresser des segments chromosomiques dans des variétés de mais pour
augmenter la valeur dé digestibilité de ces variétés. La présente invention a
donc pour objet l'utilisation d'au moins une sonde ou une amorce nucléique
obtenue à partir de tout ou partie des régions chromosomiques telles que
2o définies précédemment ou bordant celles-ci, pour le suivi de
l'introgression du
QTL de digestibilité du mais, dans un programme de sélection de mais
assistée par marqueurs.
Par exemple ces sondes peuvent être marquées selon les
techniques classiques connues de l'homme du métier, par exemple par un
2s isotope radioactif et utilisées pour repérer les QTL de digestibilité chez
le mais
grâce à la technique du Southern par exemple. Pour cela, au moins une sonde
marquée est mise en contact avec de l'ADN génomique d'un mais,
préalablement digéré par des enzymes de restriction, dans des conditions
d'hybridation appropriées, puis on détermine la taille du fragment de
restriction
3o qui hybride avec la sonde. Des amorces construites à partir de tout ou
partie
des régions chromosomiques décrites plus haut ou bordant ces régions
peuvent également être utilisées pour caractériser ces régions, selon des
techniques de type PCR classique (à l'aide de deux amorces flanquantes), ou
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de PCR quantitative (à l'aide de deux amorces flanquantes et d'une amorce
spécifique de l'allèle favorable), ou encore au moyen d'une technique
n'utilisant
pas la PCR, comme celle décrite et commercialisée par Third Wave
Tecflnology (Madison, WI 53719.1256, USA), dénommée InvaderT~ .
s
La présente invention a également pour objet une méthode de
détermination d'une corrélation entre l'haplotype des régions chromosomiques
identifiées comme étant un locus QTL de digestibilité d'un mais et sa valeur
de
digestibilité, comprenant
1o a) l'haplotypage de tout ou partie de la région chromosomique
identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité, cette étape
d'haplotypage
étant réalisée sur des individus appartenant à la descendance des maïs sur
lesquels les régions chromosomiques telles que définies précédemment ont
été identifiées comme étant un locus QTL de digestibilité du mais ; et/ou
is b) l'haplotypage de tout ou partie de la région
chromosomique du locus QTL de digestibilité telle que définie précédemment,
cette étape d'haplotypage étant réalisée sur des individus qui ne sont pas
apparentés auxdits individus de l'étape (a) ;
c) la détermination de la valeur de digestibilité de l'ensemble
2o desdits individus ;
d) l'établissement d'une corrélation entre la valeur de
digestibilité et les profils haplotypiques obtenus.
L'haplotypage consiste à rechercher les assortiments d'allèles
aux différents marqueurs du locus QTL de digestibilité. L'haplotypage
2s comprend de manière classique la mise en évidence des haplotypes par le
séquençage de tout ou partie des régions chromosomiques définies
précédemment et le typage ou identification de l'haplotype aux positions de
séquences identifiées comme polymorphes, au moyen de sondes ou amorces
nucléotiques obtenues à partir de tout ou partie d'une des régions
~o chromosomiques définies précédemment, à l'aide de techniques classiques
d'hybridation ou d'amplification.
Les populations soumises à un haplotypage peuvent étre
constituées d'individus en descendance d'un croisement utilisé pour étudier
les
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locus QTL, pour lesquels les allèles favorables à une digestibilité élevée
sont
connus. II peut en outre s'agir d'individus non apparentés, c'est-à-dire
d'individus qui n'ont pas d'ascendants directs communs.
Une corrélation entre l'haplotype et la valeur de digestibilité est
établie en répartissant la population selon les haplotypes en présence. Une
corrélation ou association est observée si les moyennes pour tes valeurs de
digestibilité varient significativement entre les populations triées selon le
polymorphisme moléculaire.
Une fois que ces polymorphismes moléculaires liés au caractère
to de digestibilité sont identifiés, une sélection des individus de
digestibilité
inconnue peut être réalisée, à partir de l'haplotypage du locus QTL de
digestibilité.
La présente invention a donc également pour objet une méthode
de détermination prédictive de la valeur de digestibilité d'un mais,
comprenant
is a) l'haplotypage de tout ou partie de la région chromosomique
identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité ;
b) la détermination prédictive de la valeur de digestibilité dudit
mais, au moyen de la corrélation établie précédemment.
Par suite, la sélection de mais à digestibilité élevée est alors
2o avantageuse, et peut être effectuée par une méthode comprenant
- l'haplotypage de tout ou partie de la région chromosomique
identifiée comme étant un locus QTL de digestibilité,
- la sélection parmi ces individus des plantes qui présentent
une valeur prédictive de digestibilité élevée déterminée par la méthode
décrite
2s ci-dessus.
Cette méthode complète de manière intéressante les méthodes
de sélection de mais ayant un degré de digestibilité élevée, dans lesquelles
on
met en oeuvre
- le génotypage d'individus au moyen de sondes ou
~o d'amorces nucléiques obtenues à partir de tout ou partie d'une région
chromosomique telle que définie précédemment ou bordant celle-ci ;
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- la sélection parmi ces individus des plantes qui
comprennent une fréquence élevée d'allèles favorables associés à la
digestibilité.
s L'ensemble de ces méthodes permet en effet la détermination de
la valeur de digestibilité d'individus quelconques, non apparentés au matériel
génétique utilisé pour la recherche de QTL. Ces méthodes de sélection
permettent plus particulièrement le criblage de mais représentant des
ressources génétiques différentes de celles habituellement utilisées en
1o sélection, et par ce biais la sélection de nouvelles lignées ou populations
à
degré de digestibilité élevée. Elles permettent également d'obtenir des
plantes
de maïs améliorées, à degré de digestibilité élevée, par transfert (sous forme
d'introgression notamment) des allèles ou haplotypes liés à une digestibilité
désirée.
is
L'invention porte en outre sur une méthode d'obtention de maïs
génétiquement transformé ayant une digestibilité élevée, ladite méthode
comprenant
(i) la transformation d'une cellule de plant de mais avec au moins
2o deux séquences nucléotidiques codant pour des enzymes différentes l'une de
l'autre, lesdites séquences étant choisies parmi une séquence d'un allèle
favorable à une digestibilité élevée codant pour la CCR, une séquence d'un
allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la 4CL2, une séquence
d'un allèle favorable à une digestibilité élevée pour la 4CL1, une séquence
d'un
2s allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la CAD, et une
séquence
d'un allèle favorable à une digestibilité élevée codant pour la FSH, lesdites
séquences étant portées par un ou plusieurs acides nucléiques ; et
(ü) la régénération d'une plante transgénique à partir de la cellule
ainsi transformée.
~o
La présente invention s'étend par ailleurs à un acide nucléique
codant pour l'enzyme 4-coumarate CoA ligase 2 (4CL2), comprenant la
séquence nucléotidique SEQ ID n°1.
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L'invention couvre également un acide nucléique codant pour
l'enzyme 4-coumarate CoA ligase (4CL1 ), comprenant la séquence SEQ ID
n°
2.
L'invention a en outre pour objet un acide nucléique codant pour
l'enzyme ferulate-5-hydroxylase (F5H), comprenant la séquence SEQ ID
n°3.
L'invention concerne également un vecteur comprenant l'un au
moins des acides nucléiques cités ci-dessus, en association avec des
séquences opérantes permettant son expression. Est en outre comprise dans
l'invention une méthode d'obtention d'un mais génétiquement modifié,
1o comprenant la transformation d'une cellule de plant de mais par cet acide
nucléique ou ce vecteur et la régénération d'une plante transgénique à partir
de
la cellule ainsi transformée. L'invention concerne enfin une plante de maîs
transgénique ou partie de cette plante, telle que graine, feuille, cellule, ou
autres, susceptible d'être obtenue par ladite méthode.
1~
Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en
limiter la portée d'une quelconque manière.
LEGENDE DES FIGURES
2o La figure 1 représente la carte consensus des marqueurs SSR du
chromosome 1 du mais, accessible sur le site de l'Internet
(http://www.agron.missouri.edu/cai-bin/sybgw mdb/mdb3/f~lap/145822).
La figure 2 représente le consensus des marqueurs SSR du
chromosome 5 du mais, accessible sur le site de l'Internet
2~ (http://www.aqron.missouri.edu/cqi-bin/sybqw mdb/mdb3/Map/145826).
EXEMPLES
Exemple 1
~o Localisation des QTL de digestibilité
A. Mesure de la digestibilité
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Le matériel végétal utilisé se compose de deux populations de
mais F2 (de 220 et 140 individus respectivement) obtenus par croisement entre
lignées cornées pour l'une et lignées dentées pour l'autre. Les lignées
parentales propres à un même croisement ont été choisies pour leur différence
s de digestibilité de paroi et de teneur en paroi. Les familles F3 ont été
évaluées
par NIR (« Near Infrared Reflectance ») sur deux lieux de culture pour
différents paramètres de digestibilité (teneur en paroi, en lignine, et
digestibilité
enzymatique de la matière organique totale).
1o B. Etudes biométriques
La liaison entre le génotype des locus marqueurs et les variables
quantitatives de digestibilité a été réalisée par la méthode basée sur un
algorithme de recherche de QTL par "interval mapping" (logiciel
Mapmaker/QTL version 1.1, Lincoln et al, 1993). Un QTL a été déclaré
1s significatif lorsque le Lod score était supérieur à 2.5. Un intervalle de
confiance
a été défini pour chaque QTL en prenant pour chaque extrémité le Lod Score
maximum - 1.5.
Après cartographie des familles F3, des QTL ont été obtenus
notamment sur les chromosomes 1 et 5. L'intervalle de confiance (=Lod score
2o maximum - 1.5) du QTL sur le chromosome 1 est compris entre les marqueurs
UfvlC 67 et UMC 128 et ce QTL présente pour la teneur en lignine un Lod score
de 6.3 pour une population et un lieu de culture et de 2.8 pour l'autre
population sur le même lieu de culture. Les coefficients de détermination (R2)
donnés par le logiciel mapmaker/ QTL sont de 20 % et 10 % respectivement de
2s la variance phénotypique totale. Avec le même intervalle de confiance un
QTL
de digestibilité enzymatique de la matière organique est montré pour un lieu
de
culture et une population. Ce QTL présente un Lod score de 4.5 et un RZ de 13
de la variance phénotypique totale.
Le QTL obtenu sur le chromosome 5 présente un intervalle de
~o confiance compris entre les marqueurs bnlg 1046 et bnlg 609. Ce QTL est
retrouvé pour les deux lieux de culture d'une des deux populations avec un Lod
score de 3,1 et 2,8 et un RZ de 12% et 10% respectivement suivant le lieu de
culture.
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Exemple 2
Colocalisation des gènes 4CL2 et CCR
Deux ADNc codant l'un pour la 4CL2, l'autre pour la CCR ont été
cartographiés à partir d'une population en ségrégation, et une distance de 1,7
de recombinaison a été observée entre ces deux ADNc (1 individu
recombiné sur 60). Cette région est située sur le chromosome 1 entre les
marqueurs UMC 58 et UMC 128.
Les ADNc correspondants à ces gènes sont cartographiés par
1o hybridation sur des transferts ("blots") d'ADN de population d'individus en
ségrégation, digéré par des enzymes de restriction. Les cartes génétiques de
ces populations sont saturées avec au moins un marqueur en moyenne tous
les 4 cM. Le logiciel Mapmaker/Exp version 3.0 est utilisé pour cartographier
les ADNc par rapport aux marqueurs ancres de ces cartes génétiques.
Exemple 3
Colocalisation des gènes CAD, 4CL1 et F5H
Le protocole est similaire à celui suivi pour la co-localisation des
gènes 4CL2 et CCR. La région où se cartographient CAD, 4CL1 et F5H se
2o situe sur le chromosome 5 entre les marqueurs UMC 27a et bnl 7.71.
Exemple 4
Obtention de lignées plus digestibles
A. Par sélection assistée par marqueurs
De multiples utilisations des marqueurs en sélection sont
envisageables : on peut citer l'évaluation et la gestion des ressources
génétiques (Song. et al., 1988), le transfert de gènes par rétrocroisement
(Young et Tanksley, 1989), la construction de nouveaux génotypes (Lefort-
Buson et al., 1990), l'haplotypage et la recherche d'association phénotype-
~o haplotype pour une utilisation plus large de l'information issue de l'étude
des
QTL (criblage des ressources génétiques).
De manière générale, les marqueurs génétiques bordant la région
chromosomique ou compris dans la région chromosomique caractérisée selon
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l'invention peuvent ainsi étre utilisés dans un programme de sélection
assistée
par marqueurs pour prédire le génotype au locus du trait de caractère en vertu
de la liaison entre le locus marqueur génétique et le locus QTL de
digestibilité
maïs d'une part et de la co-localisation mise en évidence entre ce locus QTL
et
s les gènes codant pour des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la
lignine d'autre part. On peut donc également utiliser comme marqueurs, des
séquences comprises dans ces régions chromosomiques comprenant tout ou
partie des séquences 4CL1 et 2, CCR, CAD, FSH.
Dans une première étape, l'effet sur la digestibilité de l'allèle au
1o QTL doit être évalué en relation avec les allèles des marqueurs
moléculaires
de la zone chromosomique comprenant un des deux QTL ci-dessus décrits.
Ainsi une population de variétés de maïs ou d'hybrides peut être
génotypée à partir d'un jeu de marqueurs cartographiés au préalable sur une
des zones chromosomiques ci-dessus décrites. Pour chaque jeu de
1s marqueurs, chaque combinaison d'allèles de marqueurs est associée à un
allèle au QTL et une évaluation de l'effet de l'allèle sur la digestibilité
peut être
réalisée par analyse de variance de la valeur de digestibilité des variétés en
utilisant comme modalité du facteur l'allèle au QTL.
L'autre possibilité pour évaluer l'effet des allèles au OTL est
~o l'approche par croisement: - soit par croisement entre deux lignées ou
variétés;
- soit par utilisation d'une série de croisements apparentés ou diallèle. Le
principe est toutefois le même pour ces deux types de croisements puisque
l'effet de l'allèle au QTL est évalué par comparaison de la valeur de
digestibilité
des descendants des croisements.
2s Dans une deuxième étape, deux variétés (ou deux individus issus
de descendance), ayant respectivement un allèle favorable à une bonne valeur
de digestibilité pour le QTL du chromosome 1 et pour le QTL du chromosome
5, sont croisées en vue d'obtenir un individu issu de la descendancE de ce
nouveau croisement qui contienne ces deux allèles. Des marqueurs
~o moléculaires appartenant à ces deux zones chromosomiques sont alors
utilisés
pour identifier cet . individu. Cet individu peut alors étre fixé par
autofécondations successives en s'assurant de ne pas perdre les deux allèles
grâce aux marqueurs moléculaires. A partir de cet individu ou à partir des
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lignées parentales de cet individu, les deux allèles peuvent également être
introgressés dans une lignée ou variété présentant une bonne valeur
agronomique, et cette introgression est suivie par des marqueurs moléculaires
bordant la zone des QTL que l'on veut introgresser.
B. Par transgénèse
On peut également obtenir des plantes plus digestibles par voie
de transgénèse, en jouant sur le niveau d'expression des gènes codant pour
des enzymes impliquées dans la biosynthèse de la lignine (surexpression de la
1o F8H et sous-expression des autres par exemple) ou en introduisant une ou
plusieurs séquences de gènes intervenant dans la biosynthèse de la lignine,
séquences qui correspondront à des allèles associés à des valeurs de
digestibilité fortes. Des cassettes d'expression sont construites à partir des
séquences localisées dans les régions chromosomiques définies selon la
1s présente invention, liées génétiquement à des séquences régulatrices de
type
promotrices (promoteurs forts ou spécifiques de tissus à forte lignification)
et
terminatrices (poly A nos par exemple). Ces cassettes sont ensuite intégrées
dans des vecteurs d'expression contenant également des marqueurs de
sélection pour la transformation, suivant les techniques standards décrites
par
2o exemple dans Sambrook et al. (1989). Ces vecteurs sont enfin utilisés pour
transformer les cellules végétales selon les techniques connues de l'homme du
métier. On peut citer notamment la transformation par canon à particules et la
transformation par Agrobacterium, décrites ci-dessous.
II est envisageable d'utiliser des promoteurs tissus ou organes
2s spécifiques qui permettent l'expression des transgènes et donc
l'amélioration
de la digestibilité dans une partie seulement de la plantes. Sachant que
l'augmentation de digestibilité liée à la diminution de la quantité de lignine
est
accompagnées dans certain cas par une augmentation de la sensibilité à la
verse (mutant bm3 = mutant du gène CAOMT), il est avantageux d'augmenter
~o la digestibilité par expression des transgènes dans toute la plante sauf
dans la
tige.
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IJ
B-1 Canon à particules
La méthode utilisée repose sur l'utilisation d'un canon à particules
identique à celui décrit par J. Finer (1992). Les cellules cibles sont des
cellules
indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la
s régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal
embryogène (dit de type II) de mais. Ces cals sont obtenus à partir d'embryons
immatures de génotype Hill selon la méthode et sur les milieux décrits par
Armstrong (Maize Handbook ; 1994 M. Freeling, V. Walbot Eds ; pp.665-671 ).
Ces fragments des cals d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4h
1o avant bombardement, à raison de 16 fragments par boite au centre d'une
boîte
de Petri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation,
additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Des plasmides porteurs
des gènes à introduire, en l'occurrence 4CL1, 4CL2, CAD, CCR et/ou FSH,
sont purifiés sur colonne QiagenR en suivant les instructions du fabricant.
Ils
is sont ensuite précipités sur des particules de tungstène (M10) en suivant le
protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées sont
projetées
vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrits par
J.
Finer (1992). Les boîtes de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à
l'aide de ScellofraisR puis cultivées à l'obscurité à 27°C. Le premier
repiquage
zo a lieu 24h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu
identique
au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. On obtient après 3 mois
ou
parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent
sélectif, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de
la
division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou
2s plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels
cals est
d'environ 0,8 cal par boite bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de
façon à régénérer des plantules, en modifiant l'équilibre hormonal et
osmotique
des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989). Ces plantes sont
~o ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées pour
l'obtention
d'hybrides ou autofécondées.
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B-2. Transformation par Agrobacterium
Une autre technique de transformation utilisable dans le cadre de
l'invention utilise Agrobacterium tumefaciens, selon le protocole décrit par
Ishida et al (1996), notamment à partir d'embryons immatures de 10 jours
s après la fécondation. Tous les milieux utilisés sont référencés dans la
référence citée. La transformation débute avec une phase de co-culture où les
embryons immatures des plantes de mais sont mis en contact pendant au
moins 5 minutes avec Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 contenant les
vecteurs superbinaires. Le plasmide superbinaire est le résultat d'une
1o recombinaison homologue entre un vecteur intermédiaire porteur de l'ADN-T
contenant le gène d'intérêt (en l'occurrence 4CL1, 4CL2, CAD, CCR et/ou
F5H), et le vecteur pSB1 de Japan Tobacco (EP 672 752) qui contient : les
gènes vira et vire du plasmide pTiBo542 présent dans la souche
supervirulente A281 d'Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) et une région
1~ homologue retrouvée dans le vecteur intermédiaire permettant cette
recombinaison homologue. Les embryons sont ensuite placés sur milieu LSAs
pendant 3 jours à l'obscurité et à 25°C. Une première sélection est
effectuée
sur les cals transformés : les cals embryogènes sont transférés sur milieu
LSD5 contenant de la phosphinotricine à 5 mg/I et de la céfotaxime à 250 mg/l
20 (élimination ou limitation de la contamination par Agrobacterium
tumefaciens).
Cette étape est menée 2 semaines à l'obscurité et à 25°C. La
deuxième étape
de sélection est réalisée par transfert des embryons qui se sont développés
sur
milieu LSDS, sur milieu LSD10 (phosphinotricine à 10 mg/I) en présence de
céfotaxime, pendant 3 semaines dans les mêmes conditions que
zs précédemment. La troisième étape de sélection consiste à exciser les cals
de
type I (fragments de 1 à 2 mm) et à les transférer 3 semaines à l'obscurité et
à
25°C sur milieu LSD 10 en présence de céfotaxime.
La régénération des plantules est effectuée en excisant les cals
de type I qui ont proliféré et en les transférant sur milieu LSZ en présence
de
~o phosphinotricine à 5 mg/I et de céfotaxime pendant 2 semaines à 22°C
et sous
lumière continue.
Les plantules ayant régénéré sont transférées sur milieu RM + G2
contenant 100mg/I d'Augmentin pendant 2 semaines à 22°C et sous
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illumination continue pour l'étape de développement. Les plantes obtenues
sont alors transférées au phytotron en vue de leur acclimatation.
Exemple 5
Utilisation de la population issue de l'hybride Symphony~.
De façon analogue, l'invention peut être réalisée en utilisant
comme matériel végétal de départ une population issue de l'hybride
Symphony.
1o
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1s
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<210> 1
<211> 1986
<212> ADN
<213> Zea mays
<40C> î
cagcagttgg aaacotgcca tatacatcca tccttgcaca tagctccgat ccaggtccag 60
ctccaccaac ccggccggaa gcagcaagcc tcttgtctcc tgcacgtaac tccagcctcc 120
agcgccacac gtacacctcc gccggatcgg aagaagatgg tgtcgcctac ggagccgcag 180
gccgagacaa cggtgttccg ctcgacgctt ccggacatcg ccatcccgga ccacctcccg 240
ctccacgact acgtcctgga gcgcctggcg gagcgccgcg accgcgcgtg cctcatcgac 300
ggcgccacgg gcgaaacgct caccttcggc gacgtggacc gcctgtcacg acgcgtcgcg 360
gccgggatgc gcgcctgcct cggcgtccgc agcgggggca cggtgatgct gcttctccca 420
aactccgtgg agttcgcact cgcgttcctc gcgtgctccc gcctcggcgc cgccgccacc 480
acggccaacc cgctccacac cccgcccgag atcgccaagc aggcggcggc ctccggcgcc 540
accgtcgtca tcaccgagcc ggcgttcgtc ggcaaggtgc gggggctcgc cggcgtcgcc 600
gtcgtcgcca cgggcgacgg cgcagagggc tgcgtctcgt tctccgacct cgcttcctcc 660
gccgacgatg gctcggcggc gctgcctgag gcggcggcgg ccatcgacgt ggcgaacgac 720
gtggtcgcgc tgccgtactc gtccggcacg acggggctgc ccaagggggt gatgctgtcg 780
caccgtgggc tggtaaccag cgtggcgcag ctcgtcgacg gcgacaaccc gaacctccac 840
ttccgggagg acgacgtcgt cctctgcgtg ctgcccatgt tccacgtgta ctcgctgcac 900
tccatcctgc tgtgcgggat gcgcgccggc gcggcgctcg tgatcatgaa gcgcttcgac 960
actctccgca tgttcgagct ggtgaagagg cacggcatca cgatcgtgcc gctcgtgctg 1020
cccatcgcgg tggagatggt caagagcgac gccatcgacc gccacgacct ctcgtcggtg 1080
cgcatggtca tctcgggggc cgcgcccatg ggcaaggagc tgcaggacct gctgcgcgcc 1140
aagctccctc gcgccgtgct cggacagggt tatgggatga cagaggcagg cccggtgctc 1200
tcgatgtgca tggcgtttgc caaggagccg ttaccggtga agtccggtgc ctgcggcacg 1260
gtggtgagga atgccgagct aaagatcatc gacccggaga ccgggctgtc cctccaccgc 1320
aaccagcccg gggagatttg catcaggggc aagcagttga tgaaagggta cctcaacaac 1380
ccggaggcaa cggcgaagac catcgactcg gaggggtggc tgcacaccgg agacattggg 1440
tacgtcgacg acggcgacga gatcttcatc gtcgaccggc tcaaggagct catcaagtac 1500
aaggggttcc aagtcgctcc ggcggagctc gaggccatgc tcatcgccca ccccagcatc 1560
gtcgacgccg ccgtcgtcca aatgaaggat gactcctgcg gcgagatccc ggtggcgttc 1620
gtcgtggcgt ccggcggctc cgggatcacc gaggacgaga tcaagcagta cgtggcgaaa 1680
caggtggtgt tctacaagag gctgcacaag atcttcttcg tggaggccat ccccaaggcg 1740
ccatccggca agattttaag gaaggatctg agagcaaagc tggcgtctgg attctccaac 1800
gggtcatcgt gttgatgccc ctgagttctt tctatgcgaa aacgaccccg attttagtaa 1860
atttttttat gctgaacaag ctaaaaaaga tatatataca gaaaacggtg taaacaagaa 1920
gcagtcaacc atgtacaaga catgttatct agataaatga aagttcaggt ttgagtaaaa 1980
aaaaaa 1986
<210> 2
<211> 2006
<212> ADN
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<213> Zea mays
<400> 2
ccgcaccagc catcgtctcc ttccttcctt cctatactac catccaacca gctgcccagc 60
gcaacgttac ctgcccgaca tccgacaagc cagtccatcc ggcagcgagc aaaggtctga 120
gatgggztcc gtagacgcgg cgatcgcggt gccggtgccg gcggcggagg agaaggcggt 180
ggaggagaag gcggtggtgt tccggtccaa gctccccgac atcgagatcg acagcagcat 240
ggcgctgcac acctactgct tcgggaagat gggtgaggtg gcggagcggg cgtgcctggt 300
cgacgggctg acgggcgcgt cgtacacgta cgcggaggtg gagtccctgt cccggcgcgc 360
cgcgtcgggg ctgcgcgcca tgggggtggg caagggcgac gtggtgatga gcctgctccg 420
caactgcccc gagttcgcct tcaccttcct gggcgccgcc cgcctgggcg ccgccaccac 480
cacggccaac ccgttctaca ccccgcacga ggtgcaccgc caggcggagg cggccggcgc 540
ccggctcatc gtgaccgagg cctgcgccgt ggagaaggtg cgggagttcg cggcggagcg 600
gggcatcccc gtggtcaccg tcgacgggcg cttcgacggc tgcgtggagt tcgccgagct 660
gatcgcggcc gaggagctgg aggccgacgc cgacatccac cccgacgacg tcgtcgcgct 720
gccctactcc tccggcacca ccgggctgcc caagggcgtc atgctcaccc accgcagcct 780
catcaccagc gtcgcgcagc aggttgatgg cgagaacccg aacctgtact tccgcaagga 840
cgacgtggtg ctgtgcctgc tgccgctgtt ccacatctac tcgctgaact cggtgctgct 900
ggccggcctg cgcgcgggct ccaccatcgt gatcatgcgc aagttcgacc tgggcgcgct 960
ggtggacctg gtgcgcaggt acgtgatcac catcgcgccc ttcgtgccgc ccatcgtggt 1020
ggagatcgcc aagagccccc gcgtgaccgc cggcgacctc gcgtccatcc gcatggtcat 1080
gtccggcgcc gcgcccatgg gcaaggagct ccaggacgcc ttcatggcca agattcccaa 1140
tgccgtgctc gggcaggggt acgggatgac ggaggcaggc cccgtgctgg cgatgtgcct 1200
ggccttcgcc aaggagccgt acccggtcaa gtccgggtcg tgcggcaccg tggtgcggaa 1260
cgcggagctg aagatcgtcg accccgacac cggcgccgcc ctcggccgga accagcccgg 1320
cgagatctgc atccgcgggg agcagatcat gaaaggttac ctgaacgacc ccgagtcgac 1380
gaagaacacc atcgacaagg acggctggct gcacaccgga gacatcggct acgtggacga 1440
cgacgacgag atcttcatcg tcgacaggct caaggagatc atcaagtaca agggcttcca 1500
ggtgccgccg gcggagctgg aggcgctcct catcacgcac ccggagatca aggacgccgc 1560
cgtcgtatca atgaacgatg accttgctgg tgaaatcccg gtcgccttca tcgtgcggac 1620
cgaaggttct caagtcaccg aggatgagat caagcaattc gtcgccaagg aggtggtttt 1680
ctacaagaag atccacaagg tcttcttcac cgaatccatc cccaagaacc cgtcgggcaa 1740
gatcctgagg aaggacttga gagccaggct cgccgccggt gttcactgag gcccgtatgc 1800
agcttcttct cggacgggca ccacgctgct gcgaaaaaaa aggcgatgta atggcggtaa 1860
cactactatt catgaactgg caacagaagg gacacgtatt cctgtggaac acatgttgcc 1920
agaaagaggt tttagttgtc ctgtttgttg gccctgtgtg taatgttcaa taaaccgata 1980
tagacgtcgt ctctaaaaaa aaaaaa 2006
<210> 3
<211> 1360
<212> ADN
<213> Zea mavs
<400> 3
ctccaccgcg gtggcggccg ctctagaact agtggatccc ccgggctgca ggaattcggc 60
acgaggcgcg gcgctggtcc gcgccgtggc gtccggcggc ggcggcggcg gcgaggccgt 120
gaacctgggc gagctcatct tcaacctgac caagaacgtg acgttccgcg ccgccttcgg 180
cacccgcgac ggcgaggacc aggaggagtt catcgccatc ctgcaggagt tctcgaagct 240
gttcggcgcc ttcaacgtcg tcgacttcct gccgtggctg agctggatgg acctgcaggg 300
catcaaccgc cgcctccgcg ccgcacgatc cgcgctggac cggttcatcg acaagatcat 360
cgacgagcac gtgaggcggg ggaagaaccc cgacgacgcc gacgccgaca tggtcgacga 420
catgctcgcc ttcttcgccg aggccaagcc gcccaagaag gggcccgccg ccgccgcgga 480
cggtgacgac ctgcacaaca ccctccggct cacgcgcgac aatatcaagg ctatcatcat 540
ggacgtgatg tttggcggga cggagacggt ggcgtcggcg atcgagtggg cgatggcgga 600
gatgatgcac agccccgacg acctgcgccg gctgcagcag gagctcgccg acgtcgtggg 660
cctggaccgg aacgtgaacg agtcggacct ggacaagctc cccttcctca agtgcgtcat 720
caaggagacg ctccggctgc acccgccgat cccgctgctc ctgcacgaga ccgccggcga 780
ctgcgtcgtg ggcggctact ccgtgcccag gggctcccgc gtcatggtca acgtgtgggc 840
catcggccgc caccgcgcct cgtggaagga cgccgacgcg ttccggccgt cgcgcttcac 900
gcccgagggc gaggccgcgg ggctcgactt caagggcggc tgcttcgagt tcctgccctt 960
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cggctccggc cgccgctcgt gccccggcac ggcgctgggc ctgtacgcgc tggagctcgc 1020
cgtcgcccag ctcgcgcacg gcttcaactg gtcgctgccc gacggcatga- agccctcgga 1080
gctggacatg ggcgacgtct tcggcctcac cgcgccgcgc gccacgaggc tctacgccgt 1140
gcctacgccc cggctcaact gccccttgta ctgacgccat gcgcgggcga ctgccattac 1200
catcgtcccc tcgggtgggt gtggggtacg ggggtaggag tttggtgcct ttctctgtcg 1260
tcttttttcc ctttaaaaaa catgcctggt cgatgttgta gggtgtgttg tagacagcca 1320
ttatcaattt tttttattct caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1360
