Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
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Procédé de détection et de quantification d'adénovirus.
La présente invention est relative à un procédé de détection et de
quantification
dans divers milieux biologiques d'acides nucléiques d'adénovirus par la mesure
en
temps réel de l'amplification en chaîne par polymérase (PCR). Elle a en outre
pour objet
des oligonucléotides pour la mise en oeuvre de ce procédé.
La thérapie Qénique connaît actuellement un développement important. Les
adénovirus, qui sont naturellement responsables d'infection généralement
bénignes,
figurent parmi les vecteurs utilisés du fait de leurs nombreux avantages.
L'extension du développement clinique de ces vecteurs adénoviraux, à des
phases tardives II et III aux fins d'enregistrement et d'autorisation de mise
sur le
marché, rend nécessaire le développement, la validation et la mise en oeuvre
de
techniques spécifiques et sensibles permettant la mesure de la biodistribution
quantitative et qualitative des adénovecteurs dans les divers compartiments
biologiques
et la détection de l'émergence à faible charge virale d'infection par des
contaminants de
la production d'adénovecteurs (en particulier adénovecteurs recombinant
compétents
pour la réplication). Il est en outre nécessaire de détecter les infections
intercurrentes
adénovirales dues à des virus sauvages de différents sérotypes, responsables
de la vaste
majorité de l'incidence de ces infections naturelles, que ces infections
soient florides ou
latentes cliniquement. et de déterminer la cinétique virologique de ces
infections
sauvages, et la signification clinique dans diverses situations, au sein de la
population
générale ou chez des patients à risques (patients souffrant de cancer,
transplantés,
immunosupprimés ou immunodéprimés, etc.).
La présence d'un adénovirus en culture cellulaire permissive est visualisée,
dans les techniques de détection utilisées jusqu'à présent en routine, par un
effet
cytopathique dans la couche cellulaire. Pour démontrer que cet effet
cytopathique est
bien dù à un adénovirus, on détecte par méthode ELISA un antigène spécifique
de
l'adénovirus.
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2
Des techniques d'amplification d'acides nucléiques extraits d'adénovirus par
PCR
ont été en outre décrites. Ainsi la demande de brevet japonais JP 07327700
décrit une
méthode de type PCR dans laquelle des parties de l'ADN codant pour l'hexon,
une
protéine de la capside des adénovirus, sont amplifiées. Les produits
d'amplification sont
mis en « dot blot » puis hybridés avec des sondes spécifiques de chaques
sérotypes.
Cette méthode est donc destinée à identifier les sous groupes et les sérotypes
et non à
détecter et à quantifier l'ensemble des adénovirus présents dans un
échantillon. En outre
la sensibilité de cette méthode est faible et donc peu adaptée à des dosages
précis, tels
que ceux requis lors du suivi de patients traités par thérapie génique.
Pring-Akerblom et al. (Journal of Medical Virology, 1999, Vol. 58 , pp. 87-92)
ont également décrit une méthode mettant en oeuvre six couples d'amorces dans
une
même réaction PCR (PCR dite multiplex). L'identification du sous-groupe est
faite en
déposant les produits de PCR sur gel d'électrophorèse puis en déterminant la
taille des
produits de PCR.
Crawford-Miksza et al. (Journal of Clinical Microbiology 1999, Vol. 37, pp.
1107-1112) ont décrit une PCR hexon détectant spécifiquement les adénovirus de
types
4, 7 et 21 utilisant des amorces consensus comprenant de l'inosine comme base
nucléique en cas de mésappariement sur certaine position variable. Dans ce
document
neuf amorces distinctes sont décrites.
Ces techniques antérieures mettent en oeuvre une PCR standard et une méthode
d'analyse classique généralement sur gel d'électrophorèse avec ou sans
hybridation.
Aucune de ces techniques ne permet à la fois de détecter de façon large les
adénovirus provenant de la majorité des sérotypes connus et d'en quantifier
les charges
virales avec une sensibilité en adéquation avec les besoins de la thérapie
génique
notamment.
La présente invention a donc pour but de résoudre ces problèmes en fournissant
une technique sensible et permettant de détecter la majorité des sérotypes
d'adénovirus.
Les demandeurs ont montré de manière surprenante que de tels avantages sont
obtenus en amplifiant en temps réel une séquence déterminée de l'ADN codant
pour
l'hexon, à l'aide d'amorces présentant une dégénérescence limitée, et en
mettant en
évidence le produit d'amplification à l'aide d'une sonde non dégénérée.
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3
La présente invention est tout d'abord relative à un procédé de détection et /
ou
de quantification d'acides nucléiques d'adénovirus dans un échantillon
biologique dans
lequel
- une séquence nucléotidique d'adénovirus est amplifié par PCR en temps réel à
l'aide
d'un couple d'amorces sens et anti-sens dégénérées, constituées de mélanges
d'oligonucléotides présentant une homologie d'au moins 80% avec une séquence
comprise entre les nucléotides 21000 et 22000 de la séquence de l'adénovirus
de type 5,
correspondant à la séquence SEQ ID N°4, ou avec sa séquence
complémentaire, et
- le produit de la réaction d'amplification est détecté à l'aide d'une sonde
non
dégénérée, constituée d'un ou plusieurs oligonucléotides présentant une
homologie d'au
moins 80% avec une séquence comprise entre les nucléotides 21000 et 22000 de
la
séquence de l'adénovirus de type 5, correspondant à la séquence SEQ ID
N°4, ou avec
sa séquence complémentaire, durant un nombre de cycles suffisant pour
permettre
l'obtention d'une quantité mesurable de produit d'amplification.
On entend par « PCR en temps réel » toute technique d'amplification permettant
de suivre l'évolution de la réaction d'amplification en cours.
Avantageusement les séquences des amorces et/ou de la sonde présentent
une homologie d'au moins 80% avec une séquence comprise entre les nucléotides
540
et 780 de la séquence SEQ ID N°4, ou avec sa séquence complémentaire.
Les deux
amorces sont respectivement choisies sur les brins sens et anti-sens, et de
manière à
permettre l'amplification d'un fragment d'ADN. La sonde est quant à elle
choisie de
manière à s'hybrider avec le fragment d'ADN résultant de l'amplification. Les
amorces
de PCR conformes à la présente invention utilisées pour amplifier l'acide
nucléique
d'adénovirus cible d'un échantillon se situent dans une zone constante pour le
gène
hexon des adénovirus humains et le site d'hybridation de la sonde conforme à
la
présente invention se situe entre les deux amorces. Préférentiellement les
adénovirus
sont à tropisme humain.
De manière avantageuse lesdits oligonucléotides comprennent au moins 15
nucléotides et la sonde présente une température de fusion Tm théorique
supérieure
d'environ 10°C ~ 0,5 aux Tm théoriques des amorces.
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Un tel procédé est appelée méthode PCR hexon en abrégé dans la suite du texte.
Il
comprend en substance une répétition du cycle comprenant les étapes suivantes
- séparation des brins à amplifier par chauffage de l'ADN extrait de
l'échantillon,
- hybridation de la sonde,
- hybridation avec des amorces telles que définies ci-dessus, et
- élongation avec une polymérase.
Il est préférentiellement mis en oeuvre à l'aide des amorces sens et anti-sens
HEX1
et HEX2 décrites ci -dessous et le produit d'amplification est
préférentiellement
hybridé à la sonde HEX décrite ci -dessous.
La présente invention a notamment pour objet un oligonucléotide caractérisé en
ce qu'il comprend au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID
N°1
suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80
%, et
préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec
ladite
séquence:
5' - YCC CAT GGA YGA GCC CAC MCT - 3'
dans laquelle Y représente C ou T et M représente A ou C.
De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 15 et 30
nucléotides.
La présente invention a en outre pour objet une amorce sens HEX1 constituée
par
un mélange d'oligonucléotides répondant à cette définition. Ainsi l'amorce
HEX1
présente trois dégénérescences en position 1, 10 et 19 permettant de couvrir
la
majorité des sérotypes.
La présente invention a encore pour objet un deuxième oligonucléotide
caractérisé
en ce qu'il comprend au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID
N°2
suivante ou d'une séquence présentant une homologie de séquence d'au moins 80
%, et
préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de 95 %, avec
ladite
séquence:
5' - GAG AAS GGB GTG CGC AGG TAS AC - 3'
dans laquelle S représente G ou C et B représente C, G ou T.
De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 15 et 30
nucléotides.
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La présente invention a en outre pour objet une amorce anti-sens HEX2
constituée
par un mélange d'oligonucléotides répondant à cette définition. Ainsi l'amorce
HEX2
présente trois dégénérescences en position 6, 9 et 21 permettant de couvrir la
majorité
des sérotypes séquencés.
Préférentiellement lesdites amorces comprennent au moins deux
oligonucléotides, et encore plus préférentiellement trois ou quatre
oligonucléotides.
Les positions des séquences SEQ ID N° 1 et 2, localisées dans la
partie 3' de
l'ORF codant la protéine Hexon, sont, en prenant comme référence la séquence
complète
de l'adénovirus de type 5 (n° de dépôt M73260), respectivement 21565
(HEX1) et 21656
(HEX2). Elles correspondent aux positions 21048 et 21139 de la séquence
AdSCMVp53
(longueur 35308 pb).
Les demandeurs ont montré que la concentration des amorces est un paramètre
critique de la PCR en temps réel. En conséquence, la dégénérescence des
amorces HEX1
et HEX2 a été limitée.
La présente invention a en outre pour objet un troisième oligonucléotide
caractérisé en ce qu'il comprend au moins 10 nucléotides consécutifs de la
séquence
SEQ ID N°3 suivante ou d'une séquence présentant une homologie de
séquence d'au
moins 80 %, et préférentiellement de 90 % et encore plus préférentiellement de
95 %,
avec ladite séquence, ou avec une séquence complémentaire de ladite séquence
~' - CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA - 3'.
De manière préférentielle ledit oligonucléotide comprend entre 20 et 35
nucléotides.
La présente invention a en outre pour objet une sonde HEX comprenant au moins
un oligonucléotide présentant cette séquence.
Elle est en outre relative à des oligonucléotides présentant une séquence
complémentaire de celles des oligonucléotides mentionnés ci dessus.
Selon un mode de mise en oeuvre préférentiel de la présente invention la sonde
comporte une molécule ou un système de molécules révélateur. Ledit système
révélateur
est constitué de préférence par un colorant reporteur et un colorant
extincteur de
fluorescence, respectivement fixés aux extrémités 5' et 3'de la sonde. Selon
un mode de
mise en oeuvre avantageux le système révélateur est constitué par la paire o
reporter /
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quencher » représentée par la 6-carboxyfluorescéine (FAM) et la 6-
carboxytétraméthylrhodamine (TAMRA) respectivement fixé en 5' et en 3' de la
sonde.
L'une des amorces peut être marquée de cette manière et avoir le rôle de
sonde.
Une sonde particulièrement préférée selon l'invention est constituée par
5' FAM- CAC CAG CCA CAC CGC GGC GTC ATC GA -TAMRA 3'.
Un tel système révélateur peut aussi être un système révélateur dit de «
tailing ». Le
« tailing » consiste à inclure à une des extrémités de la sonde une queue
(tail) qui peut
s'autoapparier. Cet autoappariement est mis en évidence à l'aide d'un marqueur
qui se
fixe spécifiquement sur la séquence dans cette configuration. En présence de
cible il y a
désappariement et un signal est émis. En absence de cible le signal n'est pas
émis.
D'autres systémes révélateur peuvent aussi être utilisés.
En variante, les amorces sens et anti-sens peuvent comporter une molécule ou
un
système de molécules révélateur.
Le produit de PCR obtenu par le procédé objet de la présente invention en
utilisant
les amorces de séquences SEQ ID N° 1 et SEQ ID N°2 a
préférentiellement une taille de
114 pb et présente un %GC d'environ 58.8 %.
La polymérise préférentiellement utilisée dans la présente invention est la
Taq
polymérise, mais elle peut étre toute autre enzyme présentant une activité
polymérise et
utilisable dans les conditions opératoires de la PCR.
La présente invention a encore pour objet un kit de réactifs pour réaction
d'amplification de type PCR en temps réel pour détection d'adénovirus
caractérisé en ce
qu'il comprend une paire d'amorces sens et anti-sens et une sonde telles que
décrites ci-
dessus. Ledit kit comprend avantageusement en outre deux témoins négatifs et
deux
témoins positifs.
La présente invention a en outre pour objet une méthode PCR pour la détection
et
ou la quantification d'adénovirus dans un échantillon à doser susceptible d'en
contenir
caractérisée en ce qu'elle consiste en une PCR en temps réel mettant en oeuvre
un kit
selon l'invention.
Selon un aspect particulièrement avantageux de la méthode selon l'invention,
lesdits deux témoins positifs sont extraits en parallèle à une série
d'échantillons à doser
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et consistent en un standard constitué d'une solution d'adénovirus purifiée et
titrée et un
calibrateur adapté au type d'échantillon à doser.
La méthode conforme à l'invention trouve une application avantageuse à la
détection et / ou à la quantification d'adénovirus présents dans les
échantillons de type
suspension ou surnageant de culture, plasma, urines, lavages oropharyngés,
lymphocytes, liquides séminaux, biopsies tumorales ou non, écouvillons
rectaux, feces,
ascites.
La présente invention a également trait à une méthode de sélection
d'adénovirus
utiles comme candidats vecteurs par évaluation des performances réplicatives
des
adénovirus par application d'une méthode de détection et / ou de
quantification selon
l'invention au suivi de cinétiques de multiplication adénovirale.
La présente invention a également trait à une méthode de diagnostic du
sérotype
d'adénovirus présents dans un échantillon à tester consistant à mettre en
oeuvre une
méthode de l'invention puis à séquencer le produit PCR obtenu.
Les séquences nucléotidiques des différents sérotypes codant la protéine Hexon
ont
été obtenues à partir de banques de données ou ont été séquencées. Les
sérotypes Ad3,
Ad7, Ad 12, Ad 14, Ad 16 et Ad21 présentent en position 9 de la sonde HEX un
résidu A.
Les sérotypes AdS, Adl, Ad2, Ad6, Adl3, Ad40 et Ad48 présentent à cette mëme
position un résidu G alors que les sérotypes Ad4 et Ad41 présentent un résidu
C. La
séquence présentant un résidu A a été choisie, car la séquence de type G, à
l'opposé des
séquences de type A ou de type C, présente une structure secondaire de très
haute
stabilité (DG = -7.1 kcal/mol) susceptible de perturber son hybridation et/ou
son
déplacement et/ou sa dégradation lors de la polymérisation. D'autre part, la
séquence de
type A est plus fréquente que la séquence de type C.
Les mésappariements A/C (AdSCMVp53 et sérotypes 5, l, 2, 6, 13, 40 et 48) ou
A/G (sérotypes 4 et 41 ) se traduisent par une diminution du delta Rn sans
modification
significative du Ct (delta Rn est la différence de fluorescence détectée entre
la
fluorescence mesurée du bruit de fond et la fluorescence détectée de
l'échantillon à tester
Ct est défini comme le nombre de cycles fractionnels dans lequel la
fluorescence
générée par clivage de la sonde dépasse significativement - en général de 10
fois - le
bruit de fond).
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Les sérotypes AdS, Ad4, Adl2 et Adl4 et l'AdSCMVp53 présentent des
différences supplémentaires en position
0 5 pour le sérotype Ad5 et l'AdSCMVp53
0 24 pour les sérotypes Ad4 et Adl2
0 3, 12 et 19 pour le sérotype Adl4
Malgré ces différences il est possible, de manière surprenante, de détecter
les
séquences nucléotidiques codant pour les protéines hexons de ces sérotypes.
L'un des avantages de la présente méthode de détection et / ou de
quantification
d'adénovirus humains par rapport aux méthodes décrites dans l'état de la
technique est
une sensibilité de détection remarquable avec un seuil de détection de 10
particules ou 1
pfu (unité formant plage) par réaction PCR.
Un autre avantage réside dans l'universalité de la méthode puisque 17
sérotypes
différents d'adénovirus humains, représentatifs de l'ensemble des sous-groupes
A à F,
ont pu être détectés et quantifiés.
En outre l'analyse des produits de PCR se fait directement à la fin des cycles
de
PCR par la lecture de la fluorescence obtenue au cours des cycles. Il n'est
donc pas
nécessaire de travailler avec les produits de PCR qui sont à risque de
contamination
pour les analyses ultérieures.
De plus la traçabilité des données brutes est totale. En effet, chaque analyse
PCR
est conservée dans des fichiers informatiques que l'on peut archiver sur une
longue
période sans altération. Les données brutes peuvent être à tout moment ré-
analysées si
les critères d'analyses évoluent. La conservation des données brutes est
essentielle
lorsqu'on doit travailler aux normes de Bonnes Pratiques de Laboratoire.
En outre la quantification du nombre de cibles mis au départ dans la réaction
est
très fiable et reproductible. La détection du produit de PCR se fait au cours
des cycles
PCR à l'aide d'une sonde fluorescente. Celle-ci est nécessaire pour détecter
le produit
de PCR et a lieu en pleine phase exponentielle de PCR et non en point final ;
ce principe
de détection est donc plus sensible et plus spécifique.
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Un autre avantage réside dans le fait que les amplifications non spécifiques
sont
évitées, grâce au principe du « hot start », la PCR en temps réel étant
réalisée en
présence d'une ADN polymérase thermostable s'activant à la première
dénaturation.
Pour mettre en oeuvre la présente invention on peut éventuellement se référer
à
une revue générale des techniques PCR, et en particulier à la notice
explicative intitulée
« Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection » publiée par Perkin
Elmer Applied Biosystems (1999) et au PCR Protocols (Academic Press New-York
1989).
La présente invention est illustrée par des exemples non limitatifs et en
référence
à la figure annexée qui reprësente une courbe standard d'une méthode PCR hexon
conforme à l'invention.
Matériel et méthodes
Collection d'adénovirus, surnageants de culture et lignées cellulaires
~ La plupart des surnageants de culture de différents sérotypes d'adénovirus
humains
proviennent du laboratoire du Pr. Freymuth (service de Virologie, CHU, Caen).
~ Certains adénovirus sauvages titrés (Ad2 et Ad5) proviennent de l'UMR
n° 1592
(Emmanuelle Vigne, Unité de Vectorologie et de Transfert de Gènes, Institut
Gustave-Roussy).
~ L'AdSCMVp53 titré provient de l'Unité de Production de RPR Gencell, Vitry
(Didier
Faucher). Les titres sont fournis en nombre de pfu (« plaque forming unit »,
unités
formant plages). Cette unité restera l'unité de référence pour la
quantification.
~ La lignée cellulaire 293 provient de l'ATCC (CRL 1573).
~ La lignée cellulaire A~49 (ATCC: CCL 185) a aimablement été fournie par E.
Vigne
et A. Fallourd, RPR Gencell.
~ La lignée cellulaire MRCS provient de chez bioMérieux (réf. 84002, France).
Échantillons cliniques
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~ Les échantillons cliniques (plasma, urines, lavages oropharyngés, feces)
proviennent
soit de volontaires sains, soit de patients hospitalisés à l'Institut Gustave-
Roussy.
~ Certains plasmas proviennent du Centre de Transfusion, soit par l'achat
d'une poche
provenant d'environ 200 donneurs, soit des poches ne pouvant plus être
utilisées pour
un usage médical.
Conditions de stockage
~ Les collections d'adénovirus et les prélèvements cliniques sont transportés
en
carboglace et, dès réception, stockés à -80°C.
~ Les différentes étapes de réception, d'aliquotage et d'analyse nécessitent
un certain
nombre de congélations et décongélations (adénovirus ou prélèvements
cliniques).
Pour être dans les mêmes conditions, les témoins (standard et calibrateurs)
subissent
le même nombre de congélations et décongélations que les prélèvements
cliniques à
diagnostiquer.
Témoins et standard
~ Il y a deux types de témoins négatifs
Un témoin négatif PCR ou NTC ("non template control") qui est constitué du
tampon
PCR avec de l'eau distillée (sans cible). La valeur de Ct doit être de 50
puisque l'on
fait 50 cycles PCR.
Le deuxième type de témoin négatif est le témoin négatif d'extraction qui est
mis en
place dès l'étape d'extraction. En général, il est constitué de 200 u1 d'eau
physiologique et il est extrait en parallèle avec une série d'extractions (en
général 1
pour 10). La valeur de Ct doit également être de 50.
~ Il y a deux types de "témoins" positifs
Le standard qui est constitué d'une solution d'adénovirus purifiée et titrée
(~ 5.10
pfu), est extrait en parallèle à une série d'échantillons à doser. L'extrait
d'acides
nucléiques est dilué (en général de 10 en 10) pour constituer les différents
points de
standard pour la construction de la courbe standard (Figure).
Le deuxième type de témoins positifs est le calibrateur. Il existe différents
types
de calibrateurs suivant le type d'échantillons à diagnostiquer. Il est
constitué de 200 p1
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de milieu le plus proche de l'échantillon et d'une quantité connue
d'adénovirus se
situant au milieu de la gamme standard (en général 5.10' pfu). Les milieux
utilisés
pour la fabrication des calibrateurs sont de l'eau physiologique pour les
lavages
oropharyngés, d'un "pool" de plasma de 200 donneurs sains pour les plasmas,
d'urines
de sujets sains pour les urines et du milieu de culture frais pour les
surnageants de
culture. Ces calibrateurs vérifient que la technique d'extraction est
correcte. La valeur
de quantification par rapport à la valeur théorique attendue va permettre, par
simple
règle de trois, de réajuster la quantification finale obtenue avec les
échantillons à
tester.
Appareil et quantification
Toutes les réactions PCR sont faites à l'aide de l'appareil ABI Prism 7700
(Perkin-
Elmer Applied Biosystem) lequel détecte le signal à l'aide d'une sonde
fluorescente
(Sonde TaqManTM) pendant les cycles PCR.
Le système 7700 est un thermocycleur où chaque puits (n = 96) est relié à une
fibre
optique laquelle est connectée à un laser. Une caméra CDD collecte les
émissions de
fluorescence à peu près toutes les 6 secondes pour chaque puits. Le logiciel
S.D.S.
(Sequence Detector SystemTM) analyse les données de fluorescence et détermine
le
nombre de copies de cible dans un échantillon.
La quantification est basée sur le principe de la PCR en temps réel ("real-
time
PCR"). En effet, le produit de PCR est caractérisé par le moment de cycle PCR
où
l'amplification est détectable par la dégradation de la sonde liée à
l'accumulation de
produits de PCR. Plus le nombre de copies de départ de cible est élevé, moins
il faudra
de cycles PCR pour détecter une élévation significative de fluorescence.
Le nombre de copies de cible d'un échantillon est quantifié en mesurant la
valeur
de Ct et en utilisant une courbe standard (Figure ). En théorie, si la PCR
fonctionne à
100%, il faut 3,22 cycles PCR (Ct) pour multiplier par 10 le nombre de cibles.
En
général, un facteur 10 du nombre de cibles donne une différence de valeurs de
Ct entre
3,4 à 3,6.
Le deuxième paramètre (Delta Rn) est important à vérifier pour confirmer la
positivité du signal PCR. Le delta de Rn est la différence de fluorescence
détectée entre
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la fluorescence mesurée du bruit de fond (en général mesurée entre le cycle 3
et le cycle
15 de la PCR sur la totalité de la plaque) et la fluorescence détectée de
l'échantillon à
analyser.
EXEMPLES
Exemple 1 : Détection d'adénovirus provenant d'un échantillon d'urines
1.1. Préparation de l'échantillon d'urines à tester.
Tous les réactifs utilisés pour cette préparation proviennent de la trousse
dénommée High Pure RNA Isolation Kit, et commercialisée par Boehringer /
Roche.
Pour préparer cet échantillon procéder comme suit
A 200 p1 d'urines préalablement chauffées 10 min. à 37 °C ainsi que sur
chacun
des témoins (d'un volume de 200 ~.~1), ajouter 400 p1 du tampon de lyse.
Vortexer immédiatement. Incuber 15 min. à température ambiante.
Placer chaque colonne sur un tube de 2,0 ml et déposer la totalité de la
préparation au
centre de la colonne. Centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min. (Eppendorf 5417R)
à
20°C.
Placer la colonne sur un deuxième tube de 2,0 ml.
Ajouter 500 p1 du tampon de lavage I et centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min.
(Eppendorf ~417R) à 20°C.
Placer la colonne sur un troisième tube de 2,0 ml.
Ajouter X00 p1 du tampon de lavage II et centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min.
(Eppendorf ~417R) à 20°C.
Placer la colonne sur un quatrième tube de 2,0 ml.
Ajouter 200 p1 du tampon de lavage II et centrifuger 3 min. à 14.000 tours/min
(Eppendorf ~417R) à 20°C.
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Placer la colonne sur tube Eppendorf de 1,5 ml (cinquième tube) et identifier
le tube
Eppendorf qui va collecter l'éluat final d'extraction d'acides nucléiques.
Ajouter SO u1 d'eau distillée préchauffée.
Incuber 3 min. à 70°C (bain sec).
Centrifuger 1 min. à 8.000 tours/min. (Eppendorf 5417R) à 20°C.
Les extraits d'acide nucléique sont conservés à 4°C jusqu'à l'étape
de PCR.
Les « témoins » et « standard » sont préparés comme décrit ci-dessus (section
« matériel et méthodes »).
Pour la préparation d'autres types d'échantillons, se reporter au tableau
n° 1 illustrant
les techniques d'extraction optimisées pour la détection d'adénovirus
provenant de
différents types d'échantillons dont celui du présent exemple.
1.2. Conditions de détection selon la méthode PCR hexon conforme à l'invention
Les concentrations de l'ensemble des réactifs mis en oeuvre dans les réactions
d'amplification notamment les concentrations d'amorces sens « HEX1 », anti-
sens
« HEX2 », de sonde « HEX », et de MgCI, et autres réactifs du TaqManT"' PCR
Core
Reagents Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) sont données dans le tableau 2.
1.3 Résultats
La courbe standard d'une méthode de détection PCR conforme à l'invention est
représentée sur la figure.
Exemple 2 : Spécificité de la méthode conforme à l'invention
Une des applications de la méthode PCR hexon selon l'invention est la
détection
d'adénovirus dans les surnageants de culture.
Selon les techniques de l'art antérieur, la présence d'un adénovirus en
culture
cellulaire (permissive) est classiquement visualisée par un effet cytopathique
dans la
couche cellulaire. Pour démontrer que cet effet cytopathique est bien dû à un
adénovirus
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WO 01/59163 14 PCT/FRO1/00362
on détecte un antigène spécifique de l'adénovirus (par ELISA, ex. Réf. K6021,
Dako
Diagnostic LTD, Denmark House, Angleterre).
Des extraits d'acides nucléiques provenant des principales lignées cellulaires
(Hep2, MRCS, 293 et A549, décrites ci-dessus dans la section « matériel et
méthodes »)
utilisés pour le diagnostic cellulaire des adénovirus humains ont été testés
pour vérifier
la négativité en PCR hexon selon la présente invention. Tous les extraits
d'ADN évalués
ont été négatifs démontrant la spécificité de détection.
Pour la méthode PCR hexon de l'invention, il est très important de démontrer
le
caractère "universel" de la détection avec différents sérotypes d'adénovirus
humains.
17 sérotypes différents ont été évalués (tableau n° 3), tous les sous
groupes (A, B 1,
B2, C, D, E, F) sont représentés.
La collection de 17 sérotypes a été testée sur deux lignées cellulaires MRCS
(réf.
84002, bioMérieux, France) et A549 (ATCC: CCL 185) donnant des résultats
similaires.
Les résultats obtenus sur A549 sont présentés dans le tableau 3. On peut
observer que les
valeurs de Ct sont similaires excepté pour les sérotypes 12, 18 et 40. Ces 3
sérotypes
correspondent aux adénovirus ayant les titres les plus faibles. Mais cette
grande
différence de Ct est surtout due au choix des amorces et de la sonde TaqManT'~
conformes à la présente invention. En effet, l'Adl2 présente deux
mésappariements pour
l'amorce sens HEX1 de l'invention et un mésappariement pour la sonde HEX de
l'invention. De même, l'Ad40 présente un désappariement pour l'amorce anti-
sens HEX2
de l'invention et un désappariement pour la sonde HEX de l'invention. La
séquence du
gène hexon pour le sérotype 18 n'est pas disponible. Il est probable que ces
résultats
obtenus avec l'Ad 18 sont dus également à des mésappariements.
Il est à noter que malgré ces désappariements (deux ou trois) de séquences
nucléotidiques, les surnageants de culture restent largement positifs.
Ces résultats confirment bien le caractère "universel" de la PCR hexon si l'on
considère que les 17 sérotypes testés sont représentatifs de l'ensemble des 51
sérotypes
connus.
Exemple 3 : Sensibilité de la méthode conforme à l'invention
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3.1. Estimation du seuil de détection en nombre de particules.
Le tableau 3 présente les résultats des 17 sérotypes d'adénovirus avec des
valeurs
de Ct obtenues en fonction du nombre de particules par ml mesurées par la
technique
HPLC. A l'exception des 3 sérotypes ayant des titres faibles (Adl2, Adl8 et
Ad40), les
valeurs de Ct sont dans une fourchette de 8,1 à 9,1 pour un nombre de
particules de 1,1 à
8,5.10'°/ml.
Si on considère que la valeur de Ct pour la limite de positivité est aux
environs de
40 et que l'on prend une différence de 3,5 Ct pour un facteur 10 du nombre de
cibles,
cela représente un écart possible de la valeur de Ct de 31 unités. Cet écart
représente
environ 9 logarithmes de base 10. Par conséquent, suivant les sérotypes, le
seuil de
détection peut être estimé de 10 à 80 particules par réaction PCR.
3.2 : Bilan de 101 gammes standard.
Sur une période de 18 mois, 101 gammes standards ont été testées à l'aide de
101
extractions indépendantes d'un standard contenant 5.105 pfu d'AdSCMVp~3 dans
200 Nl.
Le volume final d'élution est de 50 ~1. 10 p.1 d'extrait de ce standard avec
une gamme de
dilution de 10 en 10 (pur, 10-', 10--, 10-', 10~', 10-') sont analysés pour
construire une
gamme standard. La dernière dilution testée correspond en théorie à 1 pfu
d'AdSCMVp53 dans le tube PCR. Tous les points de gamme sont testés en double
en
PCR (Ct 1 et Ct2, tableau 5).
Les valeurs Ct obtenues avec tous les points contenant 1 pfu d'AdSCMVp53 sont
présentées dans le tableau 5. Sur 202 réactions PCR, 8 réactions sont
négatives (Ct = 50)
ce qui ne représente que 4%. Dans la grande majorité des cas, la quantité de 1
pfu
d'AdSCMVp53 est positive en PCR hexon.
Ces résultats confirment bien la bonne sensibilité de détection. Suivant les
lots de
fabrication d'AdSCMVp53, l'équivalent 1 pfu correspond à 10 à 40 particules
virales (~
cible) ce qui confirme le seuil de détection estimé à l'aide de la collection
d'adénovirus
sauvages.
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Exemple 4 : Cinétigue de culture adénovirale
Deux expériences ont démontré qu'il était possible de suivre une cinétique de
multiplication adénovirale à l'aide de la méthode PCR hexon de l'invention.
Ces deux
expériences ont utilisé soit de fAdS sur la lignée MRCS, soit de l'Ad2 sur la
lignée A549
(tableau n° 4). Les résultats obtenus pour les deux expériences étaient
similaires.
Des flacons de culture de 25 cm' de cellules ont été infectés avec des
dilutions
d'adénovirus comprises entre 10' et 1 pfu. Le milieu de culture (5 ml) a été
retiré, les
cellules ont été infectées avec différentes concentrations de virus sous un
volume de 2 ml
pendant 2 heures (à 37°C). Au bout des deux heures, le milieu a été
changé. Après
l'infection, tous les jours (J0 à J 11 ), les flacons de culture ont été
prélevés : 250 p1 pour
le test ELISA (détection d'antigène Hexon) et 200 u1 pour la détection PCR
selon
l'invention. 450 u1 de milieu frais étaient réintroduits dans la flacon de
culture.
L'apparition de l'ECP (effet cytopathique) (tableau n°4), est comprise
entre 4 jours
pour le point 10' et 8 jours pour le point 10 pfu. Il existe une relation
entre la quantité de
virus inoculée dans la flacon de culture et le délai de positivité. Le seuil
de positivité est
de 10 pfu/flacon de culture.
L'apparition de l'ECP est simultanée à celle de l'antigène Hexon (Test ELISA).
Pour aucune des dilutions étudiées, la positivité de l'ELISA ne précède celle
de l'ECP.
Pour la PCR hexon (tableau n° 4), les valeurs de Ct pour les témoins
négatifs (T)
sont légèrement positifs (37,6-37,8). Ce résultat peut s'expliquer, soit par
une légère
contamination par aérosols au moment de l'inoculation des flacons de culture,
soit par
une légère contamination au moment de l'extraction. La première hypothèse
semble être
plus probable puisque à J10, les valeurs de Ct sont passées à 31,2 (différence
de 6,5 Ct)
ce qui représente une augmentation d'un facteur 100 du nombre de copies
d'adénovirus.
La méthode PCR hexon de l'invention montre l'existence d'une multiplication
virale
(diminution significative du Ct) en l'absence d'ECP et de détection de
l'antigène Hexon.
Suivant les dilutions testées, la méthode PCR hexon de l'invention met en
évidence de manière tout à fait surprenante de 2 à 4 "vagues" de
multiplication virale.
Clairement ces résultats démontrent que la méthode PCR hexon de l'invention se
positive plus tôt que l'ECP ou l'ELISA hexon. Aussi, la méthode PCR hexon
conforme à
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la présente invention est au minimum 10 fois plus sensible que les tests de
culture
cellulaire classiques (culture de 10 jours + test ELISA).
Ces résultats pour le moins inattendus obtenus avec la méthode PCR hexon de
l'invention peuvent être mis à profit notamment pour connaître de manière
aisée et
rapide le temps d'un cycle viral et son niveau d'amplification. Ces deux
derniers
paramètres sont très importants pour évaluer les performances réplicatives
d'un virus.
En conséquence, la méthode PCR hexon selon l'invention peut contribuer
avantageusement à la sélection de candidats vecteurs en vue d'applications
biotechnologiques, notamment dans l'expression et / ou la thérapie génique.
Exemple 5 : Répétabilité et reproductibilité de la méthode selon l'invention.
Les résultats des 101 standards évalués en PCR hexon (tableau n° 5)
permet de
déterminer à la fois la répétabilité (répétition intra-tests) et la
reproductibilité (répétition
inter-tests). La moyenne des valeurs Ct pour 1 pfu est de 37,2 ~ 1,8. Ce
niveau de
variation est relativement faible surtout qu'il est le résultat de la
variation de deux
étapes : l'extraction et la PCR hexon.
Pour les valeurs de Ct pour 10 pfu (non montrées) la moyenne est de 33,7 ~
1,7. Le
niveau de variation est très similaire puisque les écarts obtenus sont très
proches. On
peut noter que la différence de Ct entre les 2 moyennes obtenues avec 1 pfu et
10 pfu est
de 3,~ Ct. Cette différence correspond effectivement à un écart d'un facteur
10 en
nombre de cibles.
Exemple 6 : Prélèvements cliniques
Des prélèvements cliniques ont été testés, avec des extractions indépendantes
et
dans des séries de PCR hexon différentes. Les résultats de la PCR hexon
(valeurs Ct) de
8 plasmas et 20 urines sont présentés dans le tableau n° 6.
En général lorsque les valeurs de Ct sont inférieures ou égales à 36, les
variations
de Ct pour un même extrait d'acides nucléiques (Ctl et Ct2) dépassent rarement
la valeur
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de 1 Ct (facteur 2 pour la quantification). C'est pour cette raison que tous
les
prélèvements avec des valeurs de Ct _< à 36 sont considérés comme
quantifiables (statut
« positif quantifiable) et entre 36 et 43 les prélèvements sont considérés
comme positifs
mais non quantifiables (statut positif détectable).
Pour les plasmas (tableau n° 6), au sein d'un même extrait d'acides
nucléiques, il y
a rarement un écart de plus de 1 Ct excepté pour l'extrait n° 1 du
plasma n° 3289 et
l'extrait n° 3 du plasma n° 3579. Dans ce dernier cas, la valeur
de 44,6 pour le Ctl est
aberrante. Bien entendu, au sein des différents extraits d'acides nucléiques,
la variation
de Ct est plus importante mais dépasse rarement une valeur de 2 Ct (facteur 4
pour la
quantification).
Pour les urines (tableau n° 6), au sein d'un même extrait d'acides
nucléiques, il n'y
a pas plus de 1 Ct d'écart excepté lorsque les valeurs de Ct sont supérieures
à 36. En
effet, pour des valeurs de Ct supérieures à 36, le niveau de positivité est
assez faible ce
qui explique un niveau de variation plus élevé.
Au sein des différents extraits d'acides nucléiques, la variation de Ct est
également
plus importante ne dépassant que rarement une valeur de 2 Ct entre deux
extraits
différents excepté pour l'urine n° 2403 qui a une différence de 3 Ct
(facteur 8 en
quantification). Bien entendu, certaines urines (n° 2029, 2626, 3736,
3763, 3765 et
5399) ont des valeurs de Ct très élevées (en général > à 40) démontrant une
très faible
positivité. Dans ces derniers cas, on comprend qu'il est possible de passer
facilement
d'un signal positif à un signal négatif (Ct = 50).
Globalement, les résultats sur les prélèvements cliniques de la méthode de
détection PCR hexon conforme à l'invention, montrent une très bonne
reproductibilité
(pour les valeurs de Ct) lorsque la positivité est assez élevée (Ct S à 36,
statut « positif
quantifiable »). Pour les valeurs de Ct > à 36 et jusqu'à 43, on peut
considérer que la
cible est bien présente (positive) mais le niveau de variation est trop élevé
pour donner
une valeur de quantification fiable.
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Exemple 7 : Linéarité de la cLuantification
La courbe standard est générée habituellement à l'aide de 12 points de 1 à 105
pfu
par réaction PCR testés en double. Pour chaque répétition, les courbes
d'amplification et
les valeurs de cycle PCR sont très reproductibles (voir figure). Par contre,
en point final,
les signaux de fluorescence sont très variables (jusqu'à un facteur 10), d'où
l'intérêt
d'analyser les produits de PCR au moment de l'apparition du signal (cycle PCR:
Ct) et
non en point final comme en PCR "classique".
La courbe standard obtenue avec ces points standards est présentée sur la
figure.
Le coefficient de corrélation de 0,999 indique une excellente linéarité. Dans
l'immense
majorité des cas, ce coefficiént se situe entre 0,98 et 1. Des manipulations
utilisant une
gamme standard plus large (0,5 à 106 pfu) ont montré des coefficients de
corrélation
similaires (non montrés) confirmant ainsi les informations du fournisseur
décrivant une
linéarité de quantification sur plus de 6 logarithmes.
La valeur "Y-intercept" représente le nombre de cycles PCR déduit par la
courbe
standard pour détecter un pfu d'AdSCMVp53. Suivant les courbes standards,
cette valeur
Ct se trouve entre 3~ et 39.
La valeur de la pente (Slope) est en liaison avec le rendement de la PCR. On
rappelle que pour une PCR à 100% de rendement, cette valeur doit ëtre de -
3,22. Pour la
méthode PCR hexon conforme à l'invention, la valeur de la pente se situe entre
- 3,4 à
3,9 représentant un rendement moyen de 90%.
Exemple 8 : Quantification su~rélèvements clinigues
Les exemples de quantification obtenue avec la PCR hexon sur les prélèvements
cliniques (tableau 7) ont été sélectionnés sur deux principaux critères. Le
premier critère
est que le prélèvement a été analysé par deux extractions en série de PCR
totalement
indépendantes (voir tableau 6). Le deuxième critère est que les résultats de
PCR ont des
valeurs de Ct inférieures ou égales à 36 correspondant bien à un statut
quantifiable pour
le prélèvement.
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Six prélèvements cliniques répondent à ces deux critères (tableau 7). Les
résultats de
quantification sont très reproductibles et le niveau de variation dépasse
rarement un
facteur 2 pour un même prélèvement (tableau 7). Il est particulièrement
intéressant de
noter pour l'urine n° 2403 qu'une différence de 3 Ct (en théorie cela
représente un facteur
8 pour la quantification) entre les deux extractions ne se répercute
pratiquement pas sur
les valeurs de quantification déterminées par la PCR hexon. Cet exemple
démontre
l'intérêt des calibrateurs extraits en parallèle qui permettent de réajuster
la quantification
en fonction des petites fluctuations des PCR (seuil de détection légèrement
différent,
conditions d'extraction légèrement différentes...).
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Tableau n° 1 : Techniques d'extraction optimisées pour la détection
d'adénovirus
provenant de différents types d'échantillons.
Type d'chantillonKit utilis Commentaires
Suspension High Pure RNA Isolation> 200 p1 de solution extrait.
d'adnovirus Kit (Boehringer/Roche)> Sans tape de DNase.
ou
suma eant de > 50 1 d'eau distille
culture strile lution .
Plasma High Pure RNA Isolation> 200 p1 de solution extrait.
Kit (Boehringer/Roche)> Sans tape de DNase.
> 50 1 d'eau distille
strile lution .
Urines High Pure RNA Isolation> Les urines sont pralablement
Kit (Boehringer/Roche)chauffes 10 minutes 37C.
> 200 u1 de solution extrait.
Sans tape de DNase.
50 1 d'eau distille strile
lution .
Lavages oropharyngsHigh Pure RNA Isolation> 200 p1 de solution extrait.
Kit (Boehringer/Roche)> Sans tape de DNase.
> 50 1 d'eau distille
strile (lution .
Lymphocytes High Pure PCR Template> Les culots lymphocytaires
(~ 2.10
Preparation Kit cellules) sont resuspendus
(Boehringer/Roche)pralablement dans 200
p1 d'eau
physiologique (NaCI 9/0
.
> Une tape de centrifugation
suppl-
mentaire a t ajoute avant
l'lution
finale.
Liquides sminauxQIAmp Tissue Kit > 100 ~tl de liquides
sminaux sont
(Qiagen~ lyss avec 100 ~tl de tampon
SP et
40 Itl de protinase K
(pendant 1 h
55C).
L'lution finale se fait
avec 60 Itl
d'eau distille.
Biopsies (tumoralesQIAmp Tissue Kit > L'tape de lyse se fait
ou sur la nuit
non) (Qiagen) 56C.
> L'lution finale se fait
avec 120 Itl
d'eau distille.
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Tableau 1 (suite)
Ecouvillons rectauxHigh Pure RNA ~ Les couvillons rectaux
Isolation sont
Kit (Boehringer/Roche)resuspendus dans 5 ml
de milieu
M4 (Micro Test Inc., USA).
~ 200 p1 de suspension
sont utiliss
pour l'extraction.
~ Mme remarque que surnageants
de culture.
Fces QIAmp Tissue Kit ~ ~ 100 mg de fces sont
(Qiagen) resuspendus dans 1 ml
de srum
physiologique. Aprs
centrifugation, le surnageant
est
filtr sur 0,22 pm. 200
p1 de
suspension sont utiliss
pour
l'extraction.
r~ L'lution finale de
fait avec 120p1
d'eau distille.
~ 10 p1 dilus au 10' sont
utiliss
our la PCR. '
Ascites High Pure RNA > 200 p1 de solution extrait.
Isolation
Kit (Boehringer/Roche)> Sans tape de DNase.
50 l d'eau distille strile
lution).
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Tableau 2 : Conditions de mise en oeuvre de la réaction
Ractifs VolumesConcentrations finales
Tp PCR TaqManT"'' 5 p1 1X
lOX
MgClz 25 mM 10 ~l 5mM
dNTP (dA, dG, dC 5 ~1 (~~ dG, dC 200pM chaque,
2mM
chaque, dUTP 4 mM) dUTP 400 pM)
Amorce HEX1 (50 pmol/~1)0.3 300 mM
~l
Amorce HEX2 (50 pmol/~1)0.3 300 mM
~l
Sonde HEX ( 10 pmol/~l)0.75 150 mM
~I
AmpErase UNG ( 1 0.5 0.5 unit
U/~l) p1
AmpliTaq Gold (5 0.25 1.25 unit ,
U/~1) p1
Extrait d'chantillon10 ~1
d'urines
H,O 17.9 qsp 50 p1
~l
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Tableau 3 : Délai d'apparition de l'ECP (jours), valeur de la DO en Elisa,
valeur de
Ct (PCR hexon) et du titre en HPLC après inoculation sur cellules A549
d'un surnageant de cellules MRCS récolté après infection avec des
adénovirus sauvages de la collection.
Srotype Groupe Dlai ECP DO Elisa PCR HexonHPLC
(jours) (Ct) (particules/ml)
1 C <_3 1,385 8,5 1,210'
2 C <_3 1,120 8,1 2,3 10'
3 B 1 __<3 0,732 8,5 4,8 10'
4 E <_3 1,222 9,0 3,910'
C <_3 1,211 8,5 6,610'
6 C <_3 1,428 8,1 6,6 10'
7 BI <_3 1,344 9,0 4,410'
11 B2 <_3 1,648 8,5 3,810'
12 A <_3 2,759 21,6 < IOv
13 D <_3 2,343 8,1 4,610'
14 B2 <_3 0,992 8,4 1,110'
18 A 4 >3 19 2,310
20 D <_3 1,229 9,15 8,510'
21 BI <3 1,442 8,2 2,710"'
34 B2 <3 1,960 8,6 4,710'
36 D <_3 2,759 8,3 2,910'
40 F 5 0,537 19,5 < 109
ECP : Effet cytopathique.
Elisa + si DO > 0,171.
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Tableau 5 : Valeurs Ct obtenues avec 1 pfu d'AdSCMVp53 dans la réaction PCR
(101
tests).
N de test N de srie dans Ct 1 Ct2
le test
P 199812702 41 35,8 36,3
P 199814602 41 36,8 36,9
P 199814902 30 41,2 39,5
P 199815602 41 37,3 39,1
P 199817403 35 39,4 38,1
P 199817702 34 37,2 36,8
P 199818802 41 37,1 37,4
P 199819802 41 35,7 37,5
P 199820302 41 37,2 36,5
P 199820502 41 38,6 40,3
P 199821602 41 38,9 38,3
P 199822302 41 39,6 38,3
P 199823102 41 43,6 40
P 199823702 40 41,7 39,3
P 199824002 41 36,4 37,8
P 199824702 41 40,8 38,1
P 199825103 41 37,4 39,1
P 1998261 O 41 36,8 37
1
P 199826501 41 NEG' 39,8
P 199826801 41 36,6 37,1
P 199828201 41 40 40,8
P 199829302 41 36,4 36,9
P 199829601 41 36,2 36,8
P 199830301 41 40,9 NEG
P 199830701 41 39,9 39,4
P 199831001 41 36,8 37,3
P 199831401 41 NEG 40,5
P199832101 39 39,4 40
P 199833501 41 44,4 39,6
P199833801 41 37,9 38,8
P 199834201 41 NEG NEG
P 199834901 41 38,2 38,2
~
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28
Tableau 5 (suite)
P199835101 41 38,1 38
P 199835601 41 38,5 40,7
P 199836301 41 41,1 NEG
P 199900501 41 38,5 38
P 199900801 41 37,8 37,7
P 199901401 41 39 40,3
P 199902201 41 39,9 38,4
P 199902901 41 37,5 37,7
P 199906101 41 38,6 37,2
P 199906301 41 37,9 37,2
P 199906401 41 41 41,3
P 199906901 34 37,9 38,2
P 199907001 40 37,5 37,3
P 199907101 41 37,2 38,6
P 199907701 41 37,8 36,9
P 199907801 41 39,3 41,2
P 199908201 41 36,8 37,4
P 199908301 41 38,7 38,1 .
P 199908401 41 37,9 38
P 199908901 41 NEG NEG
P 199909101 41 37,6 36,8
P 199909801 41 39,2 38
P 199909901 41 37,5 38,1
P 199910401 41 39,2 38,5
P199911101 41 35,5 35,5
P 199911701 41 37,9 36,4
P199911801 33 34,5 35
P 199912501 41 36,3 36,4
P 199913101 41 36,8 37,1
P 199914601 41 35,4 36,2
P199914801 41 35,4 35,2
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29
Tableau 5 (suite)
P199915401 40 38 NDb
P 199915501 39 37 36,2
P 199916001 41 36,2 35,7
P 199916101 41 35,7 36,5
P 199916201 25 36,3 35,4
P 199917301 41 37,1 36
P 199917501 41 37,3 36,5
P 199918001 41 37,3 37,1
P 199918201 41 36,8 36,7
P 199919001 41 35,3 35,2
P 199919703 41 34,7 34,3
P 199920101 41 36,1 35
P 199920201 41 34 34,9
P 199920801 32 39,6 36
P 199921501 41 36,5 35,5
P 199922201 41 34,4 34,4
P 199922401 29 35,5 36,3
P 199924301 4 L 34,9 34,7
P 199924501 22 36,6 35,6
P199925001 41 34,5 35
P 199925201 32 35,5 36,1
P 199925901 41 35,9 36,2
P 199926401 36 36,7 35,7
P 199926601 25 36,7 36,3
P199927801 29 35,6 35.9
P 199927901 10 34,6 34
P 199928101 31 35,2 34,7
P 199928501 41 36, I 35,9
P199929301 32 34,7 34,4
P 199929901 39 35,1 35.1
P 199930101 36 35,3 35,5
P 199932001 41 36,2 36,4
P 199932801 40 35,6 35,3
P 199933001 33 35.5 36,2
P199933501 19 36 35,9
P 199934401 25 36,9 37
a : NEG :Négatif, Ct = 50.
b : ND :Not Done (non fait).
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Tableau 6 : Résultats de la PCR hexon avec deux collections de prélèvements
cliniques
(plasma et urines) ayant eu deux ou trois extractions indépendantes.
PCR
hexon
(Ct)
N de Type
srie d'chantillonExt Ext Ext
l' 2 3
Ctl Ctld Ctl'
Ct2 Ct2d Ct2
1518 Plasma 35,37 35,29 37,28 37,46 NA' NA
3289 38,31 36,76 36,95 37,57 NA NA
3579 35,81 36,24 36,35 36,22 44,60 35,98
4823 36,00 35,74 35,07 35,25 NA NA
5593 37,06 36,88 35,46 34,79 NA NA
5686 36,87 37,92 35,68 36,12 NA NA
5870 36,81 37,50 35.73 36,01 NA NA
2025 Urines 33,72 33,32 33,60 33,03 NA NA
2029 43,02 50,00 40,59 44,82 43,05 41,21
2041 39,00 40,46 38,24 39,30 NA NA
2045 37,85 38,45 38,50 36,36 NA NA
2049 35,75 34,75 35,74 34,66 36,08 36,14
2097 37,50 36,13 37,03 35,63 NA NA
2384 37,40 35,80 34,58 34,55 NA NA
2392 40,95 38,72 38,08 40,29 NA NA
2397 38,27 36,08 36,02 36,36 NA NA
2400 35,56 35,45 36,63 35,45 NA NA
2403 32,62 32,04 29,36 29,41 NA NA
2406 35,36 34.42 34,08 33,37 NA NA
2626 50,00' 40,13 50,00 42,67 NA NA
3277 38,38 38,22 39,52 41,02 NA NA
3736 40,05 41,80 45,08 43,52 NA NA
3763 38,48 40,63 50,00 43,68 NA NA
3765 40,40 41,84 43,41 43,30 NA NA
5399 50,00 41,29 43,29 43,73 NA NA
5400 37,60 37,18 39,96 38,64 NA NA
a: Ext : Extraction. Le chiffre indique le nombre d'extractions faites sur le
même
prélèvement.
b: NA : Non Applicable ; c: Ct = 50 : PCR négative.
d: Chaque extrait est testé dans 2 réactions PCR, Ct 1 pour l'essai 1 PCR et
Ct 2 pour l'essai
2 PCR.
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Tableau 7 : Quantification à l'aide de la PCR hexon avec des prélèvements
cliniques
quantifiables.
Extraction Extraction
n 1 n 2
N de srieType
d'chantillo Quantification Quantification
MOyeIlrie (9uivalent MOyeririe (9uivalent
de C pfu de C pfu
d'AdSCMVp53/ml) d'AdSCMVp53/ml
)
4823 Plasma 35,87 1,1.10' 35,16 1,8.102
2925 Urines 35,52 2,6.10' 33,31 2,8.10'
2049 35,25 8,5.102 35,20 8,4.102
2400 35,50 6,5.10- 36,04 7,4.10Z
2403 32,33 2,3.10 29,38 3,8.10'
2406 34,89 5,1.10' 33,72 2,2.10'
a: La moyenne a été calculée à partir des valeurs de Ct indiquées dans le
tableau 6.
b: Le standard utilisé est connu en nombre de pfu d'AdSCMVp53. Cette
quantification est
rapportée par millilitre de prélèvements cliniques de départ.
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LISTE DE SEQUENCES
<110> AVENTIS PHARMA S.A.
INSTITUT GUSTAVE- ROUSSY
<120> Procédé de détection et de quantification d'adénovirus.
<130> PCR Hexon
<140>
<141>
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 21
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: Amorce
<400> 1
ycccatggay gagcccacmc t 21
<210> 2
<211> 23
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: Amorce
<400> 2
gagaasggbg tgcgcaggta sac 23
<210> 3
<211> 26
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: Sonde
<400> 3
caccagccac accgcggcgt catcga 26
<210> 4
<211> 1001
<212> ADN
<213> ADENOVIRUS
<400> 4
aggtggccat tacctttgac tcttctgtca gctggcctgg caatgaccgc ctgcttaccc 60
ccaacgagtt tgaaattaag cgctcagttg acggggaggg ttacaacgtt gcccagtgta 120
acatgaccaa agactggttc ctggtacaaa tgctagctaa ctacaacatt ggctaccagg 180
gcttctatat cccagagagc tacaaggacc gcatgtactc cttctttaga aacttccagc 240
ccatgagccg tcaggtggtg gatgatacta aatacaagga ctaccaacag gtgggcatcc 300
tacaccaaca caacaactct ggatttgttg gctaccttgc ccccaccatg cgcgaaggac 360
aggcctaccc tgctaacttc ccctatccgc ttataggcaa gaccgcagtt gacagcatta 420
cccagaaaaa gtttctttgc gatcgcaccc tttggcgcat cccattctcc agtaacttta 480
tgtccatggg cgcactcaca gacctgggcc aaaaccttct ctacgccaac tccgcccacg 540
cgctagacat gacttttgag gtggatccca tggacgagcc cacccttctt tatgttttgt 600
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WO 01/59163 PCT/FRO1/00362
ttgaagtctt tgacgtggtc cgtgtgcacc ggccgcaccg cggcgtcatc gaaaccgtgt 660
acctgcgcac gcccttctcg gccggcaacg ccacaacata aagaagcaag caacatcaac 720
aacagctgcc gccatgggct ccagtgagca ggaactgaaa gccattgtca aagatcttgg 780
ttgtgggcca tattttttgg gcacctatga caagcgcttt ccaggctttg tttctccaca 840
caagctcgcc tgcgccatag tcaatacggc cggtcgcgag actgggggcg tacactggat 900
ggcctttgcc tggaacccgc actcaaaaac atgctacctc tttgagccct ttggcttttc 960
tgaccagcga ctcaagcagg tttaccagtt tgagtacgag t 1001
Page 2
