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NOUVELLES PUCES A ADN
La présente invention se rapporte à un système de puces à ADN pour détecter
une
mutation dans un acide nucléique cible de manière à ce que seul l'ADN
comportant la
mutation demeure sur la puce à l'issu du procédé. L'invention concerne un
procédé
dans lequel un aS-phosphothioatedésoxynucléotide complémentaire de la mutation
est
ajouté au moyen d'une ADN polymérase à l'extrémité 3' de la sonde hybridée à
l'acide nucléique cible et dans lequel une exonucléase est ajoutée de sorte
que seules
les sondes élongées ne sont pas dégradées. La détection de la présence ou de
l'absence
de la mutation est effectuée par mesure directe ou indirecte de la présence ou
de
l'absence d'ADN en un site donné sur la puce. Avantageusement, la puce
comprend
des transistors du type ISFET ou des transducteurs piézo-électriques.
Les mutations dans les cellules germinales ou dans les lignées somatiques
peuvent
avoir des conséquences redoutables sur l'organisme en provoquant par exemple
des
maladies génétiques héréditaires ou l'apparition de cancer. L'effet d'une
mutation
dépend étroitement de sa localisation dans l'ADN. Dans le cas d'une mutation
dans
une région codante, on peut observer la perte de la fonction de la protéine
codée. Si la
mutation se trouve dans une région régulatrice, l'expression de l'ADN peut
être abolit
ou augmenter. Une mutation dans un gène impliqué dans le cancer au niveau de
la
lignée germinale ne signifie pas obligatoirement que l'individu concerné
contractera
effectivement une tumeur, mais seulement que le risque de celle-ci est accru.
En outre,
lorsque l'on cherche à diagnostiquer le potentiel invasif d'une tumeur déjà
établie, on
ne sait pas d'avance quelles mutations il faut attendre car celles-ci peuvent
se trouver
sur plusieurs gènes ou à plusieurs endroits d'un même gène. Dès lors, il
apparaît
nécessaire de pouvoir détecter simultanément de nombreuses mutations.
Le besoin en une technique de détection de mutations, de typage ou encore
d'étude du
polymorphisme se fait de plus en plus ressentir dans l'industrie soit pour
permettre la
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découverte de nouvelles cibles biologiques d'intérêts, soit pour connaître
précisément
le profil génétique d'une tumeur ou d'un patient et envisager des thérapies
adaptées.
Ce besoin a conduit au développement de diverses techniques telles que la LCR,
la
SSCP et la RFLP mais elles ne permettent pas une recherche systématique de
nombreuses mutations au sein d'un échantillon.
L'objectif à la base de la présente invention a été de mettre au point une
technique
permettant la détermination simultanée de plusieurs nucléotides à identifier
et par
conséquent le diagnostic de mutations et de polymorphismes de gènes, ou
fidentification de micro-organismes pathogènes ou génétiquement modifiés. Plus
spécifiquement, le problème réside en une compilation de différentes
techniques
biochimiques, électroniques ou optiques au sein d'un même dispositif qui
serait
particulièrement facile d'utilisation, qui pourrait générer des signaux avec
un faible
ratio bruit/ signal sans pour autant nécessiter un traitement fastidieux et
une
interprétation compliquée. Il est également important de fournir un dispositif
le plus
intégré possible et de faible coût.
Les puces à ADN pourraient répondre aux problèmes précités, mais telles
qu'elles sont
proposées dans l'état de la technique, elles comportent des limites inhérentes
qui
freinent leur exploitation à grande échelle.
Une puce consiste en une multitude de sondes nucléiques fixées avec précision
à des
endroits définis sur un support solide se présentant sous la forme de surfaces
planes ou
poreuses composées de différents matériaux permettant une telle fixation.
Jusqu'à présent, le choix du support était conditionné par sa capacité à
permettre la
fixation des sondes. Des matériaux comme le verre, le silicium ou des
polymères sont
couramment utilisés dans l'état de la technique. Les sondes sont greffées sur
ces
surfaces lors d'une première étape appelée « fonctionalisation » dans laquelle
on ajoute
une couche intermédiaire de molécules réactives pour capter ou fixer les
sondes.
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Le verre est un matériau de choix puisqu'il est inerte, non polaire et
mécaniquement
stable. Il a été utilisé dans un procédé de synthèse in situ
d'oligonucléotides par un
adressage photochimique mis au point par la société Affymetrix. Cette
technique
consiste à utiliser une surface de verre activée par addition de silane
portant des
groupes NH2 ou OH; Sheldon E.L. (1993) Clin. Chem. 39 (4), 718-719.
Une autre méthode consiste à recouvrir la surface de verre par de la poly-L-
lysine, de
déposer les sondes puis d'effectuer la greffe par exposition aux UV. On peut
également citer les polymères tels que les polypyrroles développés par CIS Bio-
international.
Une fois les sondes attachées au support solide, on permet à l'ADN provenant
d'échantillons de s'hybrider dans des conditions prédéfinies. La composition
en base
du duplex est un élément essentiel influençant sa stabilité qui dépend
étroitement de la
température de fusion (Tm). Lorsque l'on cherche à détecter des mutations
ponctuelles,
les mésappariements entraînent une chute du Tm, ce qui a pour conséquence une
élimination des acides nucléiques qui ne se sont pas totalement hybridées lors
de
l'étape de lavage. Ainsi, il quasiment impossible de rechercher à détecter
simultanément plusieurs mutations dans plusieurs gènes d'intérêts car les Tm
varient
d'un duplex à l'autre. De plus, la longueur des sondes représentent une
difficulté
technique non négligeable lorsque l'on souhaite détecter simultanément de
nombreuses
mutations à l'aide de différentes sondes de longueur différente.
En ce qui concerne l'étape de détection des hybridations, l'utilisation de
molécules
fluorescentes, telles que la fluorescéine, constitue la méthode de marquage la
plus
courante. Cette méthode permet une révélation directe ou indirecte de
l'hybridation et
l'utilisation de différents fluorochromes au sein d'une même expérience.
Cependant,
elle reste coûteuse, car elle nécessite l'emploi de dispositifs assez lourds
pour la lecture
des longueurs émises et pour l'interprétation du signal.
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La détection de l'hybridation peut également être réalisée en utilisant des
marqueurs
radioactifs. Toutefois, cette technique ne permet pas d'obtenir une définition
satisfaisante lorsque l'on recherche une miniaturiser les puces.
S Une approche alternative consiste à utiliser les propriétés des matériaux
semi-
conducteurs. Par exemple, on peut choisir un support solide à base de silicium
(Si)
recouvert d'un diélectrique (Si02) sur lequel on fixe les sondes. Dans
certaines
conditions de polarisation adéquates, un courant, sensible aux modifications
de charge
du semi-conducteur, circule normalement de la source vers le drain.
L'hybridation
entre les sondes et l'ADN de l'échantillon entraîne une modification de la
densité de
charge du semi-conducteur à l'interface Si/Si02. Cette variation peut être
mesurée et
permet de détecter l'hybridation spécifique entre sondes et acides nucléiques
cibles ;
Souteyrand et al. (1995) Lettre des Sciences Chimiques 54, 9-11. Cette
technique est
utilisée par le laboratoire IFOS de l'Ecole Centrale de Lyon.
Une autre possibilité est l'utilisation de la puce développée par Bechman
Instruments
(Permittivity Chips) qui bénéficie de la dispersion diélectrique due aux
charges
négatives des groupements phosphates présents dans le squelette nucléotidique.
Ce
phénomène, dépendant de la longueur de la molécule d'ADN, peut être quantifié
par la
fréquence de relaxation de la molécule. Cette grandeur varie en effet d'un
facteur 100
lorsque la quantité d'ADN varie d'un facteur 10 ; Beattie K. et al (1993) Clin
Chem 39
(4), 719-721. Dans cette technologie, on utilise un analyseur d'impédance pour
mesurer l'énergie absorbée par les sondes lorsque celles-ci se trouvent
appariées.
Les puces destinées à l'analyse de mutations doivent être capables d'analyser
à l'aide
de sondes chaque base d'une séquence déjà connue ou de détecter des mutations
identifiées au préalable comme étant impliquées dans des maladies telles que
le cancer.
Dans l'état de la technique, ces sondes sont décrites comme comprenant une
partie
homologue à la séquence de type sauvage et une modification (substitution,
délétion,
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addition) localisée en milieu de séquence afin de standardiser les conditions
d'hybridation. Dans le cas d'une analyse de substitution de base, les sondes
sont
organisées en tétrades, ensembles de quatre éléments dans lesquels une des
sondes
possède en position centrale la base homologue au nucléotide se trouvant dans
la
S séquence sauvage ; les trois autres sondes contenant les trois autres bases
possibles.
Cette analyse in extenso est décrite dans Chee M. et al. (1996) Science 274,
610-613.
Selon cette technique, une puce à ADN a été mise au point pour détecter des
mutations
hétérozygotes dans le gène BRCA1 par mesure de la fluorescence. Ce système
comporte environ 105 oligonucléotides permettant la détection de substitutions
et
d'insertions de bases uniques, ainsi que des délétions longues de 1 à 5
nucléotides. Le
système d'analyse des hybridations repose sur un marquage par deux couleurs
(vert par
la fluorescéine et rouge par une association phycoérythrine et streptavidine)
; Hacia JG
et al. (1996) Nature Genet 14, 441-447.
Comme évoquée précédemment, la constitution des puces doit être améliorée car
l'analyse des hybridations est rendue difficile par l'adressage photochimique
qui
produit des impuretés et par les variations de stabilité des hetéroduplex. De
plus, les
dispositifs actuellement disponibles dans le commerce sont relativement
onéreux.
Enfin, ce système est limité par le fait qu'une étape d'amplification des
échantillons est
nécessaire si l'on veut obtenir un signal détectable. Une revue sur les puces
à ADN est
présentée dans Gramsey Graham « DNA Chips State of the Art » Nature
Biotechnology vol. 16, Janvier 1998, dans Hinfray G. « Les puces à ADN »
Biofutur,
avril 1997 n° 166, cahier n°91 et dans Marshall A. and Hodgson
J. ; Nature
Biotechnology vol. 16, Janvier 1998.
Dans le cadre de la présente invention, on a mis au point un système de puces
à ADN
qui repose sur l'hybridation spécifique de la sonde (servant dans le cas
présent
d'amorce oligonucléotidique) avec l'ADN cible, l'extension la sonde avec
addition
sélective d'au moins un dérivé d'oligonucléotide à l'extrémité 3' de l'amorce
complémentaire de l'ADN cible ; l'amorce ainsi allongée étant résistante à la
digestion
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par une exonucléase, en particulier par l'exonucléase III. On peut par exemple
ajouter
un aS-phosphothioatedésoxynucléotide grâce à une ADN polymérase ce qui empêche
l'exonucléase III de digérer le duplex.
Ainsi, l'ADN reste présent en un site donné sur la puce seulement lorsque les
conditions suivantes sont réunies
a) hybridation entre la sonde et l'ADN cible de l'échantillon, et
b) présence d'une base complémentaire dans l'ADN cible permettant
l'incorporation
du aS-phosphothioatedésoxynucléotide dans la sonde ; ce qui empêche sa
dégradation par la nucléâse.
Dans le cas où la sonde ne s'hybride pas avec l'ADN cible, il y a élimination
de la
sonde en un site donné (micropuits ou autre). De même, si l'ADN cible ne
contient pas
la base complémentaire du aS-phosphothioatedésoxynucléotide donné, ce dernier
n'est
pas incorporé et la sonde est ensuite digérée par la nucléase.
On obtient ainsi des résultats simples à interpréter puisqu'ils sont seulement
de deux
type
- ADN présent ( 1 )
- ou ADN absent (0).
Cette technique associée avec un support solide électronique permet de mesurer
la
différence de charge, de conductance, de résistance, d'impédance ou tout autre
effet de
variation électrique, de variation d'effet de champ ou encore toute variation
de masse
entraînant une variation électrique (transducteur piézoélectrique) sur le
support solide.
Par exemple, un tel support peut être un système semiconducteur, notamment un
système ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor). Ce système capte donc
des
signaux simples 0 (pas d'ADN) ou 1 (ADN) du type binaire qui peuvent être
directement transmis à un système de traitement de donné, notamment à un
ordinateur.
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Il est également possible de détecter la présence d'ADN en un site donné de la
puce
par lecture optique (modification des propriétés optiques du support telles
que la
réfraction, variation de la densité ou mesure de la fluorescence) par exemple
en
couplant le dispositif à une caméra CCD. Dans un tel système, les résultats
sont faciles
à interpréter car ils se résument à des résultats ADN présent ( 1 ) ou ADN
absent (0) et
tous les signaux entre 1 et 0 obtenus jusqu'à présent dans l'état de la
technique sont
éliminés.
Les avantages conséquents de ce système résident dans le fait qu'un signal
simple est
détecté sans avoir obligatoirement recours à des marqueurs, que la sensibilité
de
détection se trouve accrue, qu'il existe moins de risque d'obtenir des faux
négatifs ou
positifs et que l'interprétation des signaux ne nécessite pas d'algorithme
excessivement
compliqué. D'autres avantages apparaîtront ci-après dans la description
détaillée de
l' invention.
Ainsi, la présente invention se rapporte à un procédé de détection d'une
mutation en
position n dans un acide nucléique cible, caractérisé en ce qu'il comprend les
étapes
suivantes
a) hybridation d'une sonde liée en 5' à un support solide du type puce à ADN
avec un
acide nucléique cible, l'extrémité 3' de ladite sonde s'hybridant au maximum
jusqu'au
nucléotide n-1 de l'acide nucléique cible ,
b) élongation de la sonde hybridée à l'étape a) par incorporation dans la
direction 5'-3'
de nucléotides complémentaires dudit acide nucléique cible au moyen d'un
mélange
réactionnel comprenant au moins un dérivé de nucléotide résistant à la
dégradation par
une exonucléase et une ADN polymérise,
c) digestion par ladite exonucléase de sorte que seules les sondes élongées à
l'étape b)
ne sont pas dégradées, lavage,
d) détection de la présence ou de l'absence de la mutation par mesure directe
ou
indirecte de la présence ou de l'absence d'ADN.
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Les étapes clés de ce procédé sont illustrées dans l'exemple présenté à la
figure 1 ci-
après.
On entend par « ADN polymérase », tout enzyme naturel ou modifié ayant une
activité
polymérasique. On peut citer par exemple les ADN pol exo-, notamment la T7 ou
le
fragment de klenow.
On entend par « exonucléase » tout enzyme naturel ou modifié ayant une
activité
exonucléasique. On peut citer par exemple l'exonucléase III. On peut également
envisager l'utilisation des ADN polymérase possédant une activité de
pyrophophorolyse (en présence d'une forte concentration en pyrophosphate, cet
enzyme ajoute un pyrophosphate sur la dernière liaison phosphodiester et
relâche donc
le nucléotide en 3'. Ce produit est disponible chez Promega sous la marque
READITTM, et des variants utilisant un système de révélation à la luciférase
est
disponible sous la marque READase~.
Lors de l'étape d), la présence ou l'absence de la mutation peut être mise en
évidence,
selon une premier mode de réalisation, par la mesure de la modification d'une
propriété du support solide liée à la présence ou à l'absence d'ADN.
Une autre solution, consiste à détecter la présence ou l'absence de la
mutation par
lecture optique de la présence ou à l'absence d'ADN. On entend par lecture
optique,
toute mesure d'absorption, de transmission ou d'émission de lumière qui peut
éventuellement se trouver à une longueur d'onde spécifique (260 nm par
exemple) soit
directement de l'ADN, soit de toute molécule marqueur liée à la sonde. Cette
définition comprend également toute mesure de la fluorescence émise par des
marqueurs (fluorescéine et/ou phycoérythrine).
On entend par « dérivé de nucléotides », tout analogue de nucléotides qui
résiste à la
dégradation par une nucléase. On peut citer par exemple les aS-
phosphothioatedésoxynucléotides tels que aS-dATP, aS-dTTP, aS-dCTP, aS-dGTP,
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aS-dUTP et aS-dITP. Ces dérivés de nucléotides peuvent être marqués notamment
avec un marqueur fluorescent.
Une « sonde » se définie comme étant un fragment nucléotidique comprenant par
exemple de 10 à 100 nucléotides, notamment de 15 à 35 nucléotides, possédant
une
spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un
complexe
d'hybridation avec un acide nucléique cible. Les sondes selon l'invention,
qu'elles
soient spécifiques ou non-spécifiques, peuvent être immobilisées, directement
ou
indirectement, sur un support solide et peuvent porter un agent marqueur
permettant ou
améliorant leur détection.
Bien entendu, la sonde sert d'amorce dans le cadre de l'invention puisque
l'objectif est
d'incorporer un nucléotide modifié en position n correspondant à la position
de la
mutation que l'on recherche. L'extrémité 3' de la sonde se termine donc au
maximum
et de préférence à n-1.
La sonde est immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, par
exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un support
solide.
Ces techniques sont notamment décrites dans la demande de brevet WO 92/10092.
La sonde peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi par exemple parmi les
isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles
d'agir sur un
substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou
une
phosphatase alcaline) ou encore des enzymes produisant ou utilisant des
protons
(oxydase ou hydrolase) ; des composés chimiques chromophores, des composés
chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base
nucléotitiques, et
des ligands tels que la biotine. Le marquage des sondes selon l'invention est
réalisé par
des éléments sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la
streptavidine,
la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que
les agents
radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents,
phosphorescents. Une autre possibilité est de marquer la sonde avec un peptide
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comprenant un épitope reconnu par un anticorps donné. La présence de cet
anticorps
peut être révélé au moyen d'un second anticorps marqué.
Selon la première alternative évoquée ci-dessus, l'étape d) comporte la mesure
d'une
5 variation d'une caractéristique physico-chimique, électrique, optique ou
mécanique du
support solide notamment choisit parmi la charge, le dopage, la conductivité,
la
résistance, l'impédance ou tout autre effet de variation électrique, de
l'effet de champ
ou encore toute variation de masse entraînant une variation de champ, de la
fréquence
de résonance ou de l'admittance électroacoustique.
10 En ce sens, le support solide consiste en une puce à ADN qui peut comporter
un
matériau sélectionné parmi les semiconducteurs, les diélectriques et les
transducteurs
piézo-électriques ou une structure or-prisme. On peut donc retrouver donc une
structure de base du type Si/SiOz , des structures du type Métal-Oxyde-
Semiconducteur (MOS), de préférence Electrolyte-Oxyde-Semiconducteur (EOS). De
telles structures sont décrites Jaffrezic-Renault N. ISFET-ENFET,
Microcapteurs et
Microtechniques 225-235. En résumé, il s'agit de transistors à effet de champ
(FET),
notamment des transistors du type ISFET ou de préférence ENFET (Enzymatic
Field
Effect Transistor). Dans le cas d'un support ENFET, il peut être avantageux de
lier à la
sonde des enzymes de types hydrolases ou oxydases qui consomment ou produisent
des protons. On rajoute un substrat de ces enzymes et on mesure la variation
de pH.
Parmi les molécules permettant d'améliorer et/ou de simplifier la détection,
un groupe
contenant un atome métallique peut être greffé sur les sondes, notamment un
groupe
ferrocène.
Par mesure d'une modification des propriétés optiques du support, on entend
toute
mesure de la variation d'une propriété optique du support solide liée à la
présence ou à
l'absence d'ADN sur ledit support. On peut citer par exemple la technologie de
la
société Biacore qui est notamment décrite dans WO 97/38132. Ce mode de
réalisation
de l'invention comprend donc la mesure d'indice de réfraction du support. On
peut
mesurer par cette technique la réflection interne et externe, par exemple de
l'ellipsométrie, des ondes évanescentes comprenant la mesure de la SPR
(surface
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plasmon resonance), de l'angle de réfraction de Brewster, de l'angle critique
de
réflection, de la FTR (frustrated total reflection), ou la STIR (scattered
total internai
reflection). Ces analyses peuvent être réalisées au moyen du Biacore 3000TM.
Conformément à la deuxième possibilité évoquée précédemment, l'étape d)
consiste à
mesurer la quantité de lumière transmise, absorbée ou émise. Dans ce cas, le
support
est fait d'un matériau transparent, notamment du verre. Les techniques
d'accrochage
des sondes sur le verre sont bien connues de l'homme du métier. On peut par
exemple
mesurer la fluorescence des sondes préalablement marquées et effectuer la
lecture
optique avec une caméra CCD.
Dans un mode préféré de réalisation, un aS-phosphothioatedésoxynucléotide tel
que
aS-dATP, aS-dTTP, aS-dCTP, aS-dGTP, aS-dUTP ou aS-dITP est incorporé à
l'extrémité 3'de la sonde.
1 S Cela peut s'effectuer par exemple par LCR, ou de préférence par PCR
asymétrique, la
sonde servant alors d'amorce étant dans chaque cas couplée chimiquement à son
extrémité 5' à la phase solide en un site prédéterminé. Les aS-
phosphothioatedésoxynucléotides peuvent être aisément incorporés dans des
polynucléotides par toutes les polymérases et transcriptases inverses testées,
ce qui
permet d'utiliser des ADN polymérases d'un prix de revient plus avantageux que
dans
d'autres détections de mutations.
La fixation préalable des sondes en un site déterminé sur la puce peut être
réalisée par
les techniques d'adressage microfluidique développée par la société Orchid ou
photochimique de la société Affimétrix ou encore d'electroadressage par Cis-
Bio
international, lesdites techniques étant à la portée de l'homme du métier.
Selon l'invention, l'ADN cible est hybridé avec une sonde de manière à ce que
son
extrémité 3' se termine immédiatement avant le nucléotide à identifier. Un aS-
phosphothioatedésoxynucléotide est rajouté à l'extrémité 3' de la sonde au
moyen
d'une ADN polymérase et est par conséquent complémentaire du nucléotide à
identifier.
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L'étape b) peut être réalisée parallèlement sur 4 sites (en tétrades) pour
chaque sonde,
avec addition d'un mélange réactionnel comprenant un aS-
phosphothioatedésoxynucléotide différent par site. Il est ainsi possible de
détecter une
S mutation en une position donnée de l'ADN cible quelque soit la nature de la
substitution de base. Concernant la digestion de l'ADN à l'étape c), on peut
avantageusement utiliser l'exonucléase III.
Le procédé selon l'invention est particulièrement destiné à la détection de
mutations
dans des gènes impliquées dans des maladies. On peut notamment citer les
maladies
génétiques héréditaires, en particulier l'hémochromatose, l'anémie à hématies
falciformes, les ~3 et a thalassemies, la fibrose kystique, l'hémophilie, et
des mutations
dans les gènes impliqués dans le cancer, par exemple dans les gènes Ras, p53,
BRCA1.
Une liste exhaustive des mutations dans ces gènes est donné sur le site
internet
suivant : ftp://ncbi.nlm.nih.gov/repository/OMIM/morbidmap
En outre, le procédé selon l'invention est utile lors de l'étude du
polymorphisme des
gènes ou de toute région génétique et pour la détection et/ou l'identification
d'organismes génétiquement modifiés (OGM).
Un autre aspect de l'invention porte sur un dispositif permettant de mettre en
oeuvre le
procédé tel que décrit ci-dessus. Un tel procédé peut comprendre un système de
détection de la présence ou de l'absence d'ADN en un site donné d'une puce,
notamment un transducteur piezo-électrique, un transducteur à effet de champ,
un
lecteur de densité optique ou de fluorescence. Il peut être couplé à système
de
traitement de données, notamment à un ordinateur.
Un autre aspect de l' invention concerne un kit comprenant une puce à ADN sur
laquelle sont fixées des sondes et au moins un des éléments choisis parmi
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un lot de 4 mélanges réactionnels comportant chacun un aS-
phosphothioatedésoxynucléotide différent sélectionné parmi aS-dATP, aS-dTTP,
aS-dCTP et aS-dGTP,
- une ADN polymérase,
S - une exonucléase, en particulier l'exonucléase III,
- un lot de solutions pour solubiliser l'ADN polymérase et/ou l'exonucléase
dans le
cas où ces enzymes se présentent sous la forme de poudre lyophilisée.
Avantageusement, les puces de ce kit comportent un support solide du type
ISFET,
ENFET.
Ce kit est destiné à la détection de mutations de gènes impliquées dans des
maladies,
notamment dans des maladies génétiques héréditaires et dans le cancer. II peut
également servir pour le typage génétique et l'étude du polymorphisme des
gènes
(pour la détection de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisme)) et pour la
détection
1 S et/ou l'identification d'organismes génétiquement modifiés (OGM).
Légendes des figures
Figure 1 : représentation schématique d'un mode particulier de mise en oeuvre
procédé selon l'invention.
a) hybridation d'une sonde liée en 5' à un support solide du type puce à ADN
avec un
acide nucléique cible, l'extrémité 3' de ladite sonde s'hybridant jusqu'au
nucléotide n-
1 de l'acide nucléique cible,
b) incorporation dans la direction 5'-3' d'un aS-dATP
c) digestion par l'exonucléase III de sorte que seules les sondes élongées à
l'étape b)
ne sont pas dégradées et lavage,
d) détection de la présence ou de l'absence de la mutation par mesure directe
ou
indirecte de la présence ou de l'absence d'ADN.
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Figure 2 : structure classique d'un support du type Métal-Oxyde-Semiconducteur
(MOS).
Schémas tirés de Jaffrezic-Renault.
Figure 3 : structures du type IFSET.
A- IFSET tirée de Jaffrezic-Renault
B- DNAFET
Figure 4 : principe des puces selon l'invention avec une série de tétrades
pour la
détection de mutations dans le gène de l'hémochromatose.
Exemple 1 : mode de réalisation particulier de l'invention
L'ADN cible comportant un fragment d'ADN qui contient une mutation T-~G en
position n à identifier, est ajouté à la surface de la puce. Ledit fragment
d'ADN
s'hybride à la sonde oligonucléotidique complémentaire marquée au FITC
(isothiocyanate de fluorescéine) immobilisée en un site défini sur le support
de la puce.
Lors de la réaction subséquente avec la polymérase, un
phosphothioatedésoxynucléotide (aSdATP) incorporé se trouve en position
complémentaire par rapport au nucléotide T en position n. Si le
phosphothioatedésoxynucléotide qui se trouve dans le mélange réactionnel n'est
pas
complémentaire du nucléotide à identifier (différent de aSdATP), la sonde
n'est pas
prolongée en 3'. L'exonucléase III dégrade ensuite toutes les sondes qui n'ont
pas été
prolongées par un phosphothioatedésoxynucléotide. On réalise ensuite la
détection par
la liaison d'un conjugué anti-FITC conjugué à la peroxydase. Une fois
effectuée la
réaction enzyme-substrat, un fort signal de mesure indique donc si le
nucléotide à
identifier (T) est complémentaire du phosphothioatedésoxynucléotide (aSdATP)
qui a
été ajouté au mélange réactionnel pour la réaction avec la polymérase.
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Exemple 2 : Utilisation d'un support de type ISFET ou ENFET (Jaffrezic-Renault
N., Microcapteurs et Microtechniques 225-235).
5
La figure 3A (tirée de Jaffrezic-Renault) représente schématiquement la
structure
ISFET. Celle-ci dérive de la structure MOSFET (voir figure 2 ; Jaffrezic-
Renault) en
ce sens que la grille métallique est remplacée par les électrolytes et
l'électrode de
référence.
10 L'expression de la tension de seuil est : VT = Wsc - Wref + cpo - (QS +
QF)/Ci - 2cpb
VT est fonction des caractéristique chimique de la solution (cpo est la
différence de
potentiel entre la membrane sensible et la solution). Dans le circuit présenté
à la figure
3A, le courant de drain est maintenu constant et on mesure la variation de
tension VG
qui est proportionnel à cpo.
15 La membrane sensible au pH consiste en des couches minces de A1203, Ta205,
Si3N4.
D'autres membranes sensibles aux ions K+, Na+, Ag+, F-, Br , I-, Ca2+ et N03-
sont
également disponibles.
Dans le cadre de l'invention, on peut fixer sur le support les sondes marquées
avec un
enzyme qui produit des protons, système ENFET (Figure 3B). On obtient ainsi,
une
mesure de la présence ou de l'absence de l'ADN sur le support suite à la
digestion par
l'exonucléase III via une mesure de la variation du pH de la solution se
traduisant
directement par une variation de la tension VT. Ce système peut éventuellement
être
couplé à un ou plusieurs amplificateur(s). La variation de tension dénote donc
de la
présence d'ADN. Le système peut être conçu de manière à ce qu'une variation
seuil de
tension provoque ou non la passage du courant par une série d'amplificateurs
et de
transistors et donne in fine un signal de type binaire
(1) variation de la tension supérieure ou égale au seuil du transistor (ADN
présent et
mutation détectée),
(0) variation inférieure au seuil du transistor (ADN absent et donc pas de
mutation).
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16
Ces résultats peuvent ensuite être importés dans un système de traitement de
données
afin de compiler les résultats obtenus pour chaque site donné sur la puce.
Exemple 3: Utilisation d'un support solide du type transducteurs piézo-
électrique.
Certains matériaux tels que Si02, Ti03Ba, LiNb03 et les polymères pièzo-
électrique
(PVF2) ont la propriété de se déformer lorsqu'une contrainte physique est
appliquée ;
Perrot H. et Hoummady M., Transducteurs piézo-électrique. Il apparaît alors un
potentiel électrique mesurable du à la pression exercée par la masse des
molécules
d'ADN. Cette mesure peut être la fréquence de résonance ou l'admittance autour
de la
fréquence de résonance. Dans le cas de la présente invention, l'ADN se trouve
en
milieu liquide. Dès lors, on peut également mesurer l'admittance
électroacoustique ou
la conductivité qui dépend notamment de la densité et de la viscosité de la
solution
1 S contenant les électrolytes. On peu ainsi détecter une différence de 100 pg
en :milieu
liquide.
Exemple 4: Utilisation du procédé selon l'invention pour la détection de
mutations ponctuelles impliquées dans l'hémochromatose.
Les mutations ponctuelles désignées HHP-1, HHP-19 et HHP-29 dans US 5,753,438
peuvent être détecter au moyen du procédé selon l'invention en utilisant une
sonde
dont l'extémité 3' se termine à n-1 de la position de la mutation
HHP-1
séquence normale
5' TCTTTTCAGAGCCACTCACG64CTTCCAGAGAAAGAGCCT 3' (SEQ ID N° 1 )
séquence mutée AG64
5' TCTTTTCAGAGCCACTCACA6aCTTCCAGAGAAAGAGCCT 3' (SEQ ID N°
2).
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17
On utilise donc une sonde de séquence 5' AGAAAAGTCTCGGTGAGTG63 3' (SEQ
ID N°3) accroché en 4 sites prédéfini de la puce (site A, T, G, C). Sur
le site où on
applique le mélange réactionnel comprenant aS-dTTP (site T), on obtient un
signal
dans le cas où il y a effectivement mutation dans l'ADN provenant de
l'échantillon.
Sur les autres sites A, G, et C , aucun signal n'est obtenu puisque l'ADN est
digéré par
l'exonucléase III.
Pour HHP-19 (A~G), on peut utiliser la sonde suivante
5'TATATAGATATTAGATATAAAGAA3' (SEQ ID N°4)
Pour HHP-29 (A-~G) ), on peut utiliser la sonde suivante
S'AACCCCTAAAATATCTAAAAT3' (SEQ ID N°5)
On peut également détecter la mutation H63D, qui est due au remplacement d'une
cystéine par une guanine sur le brin sens, avec les sondes SED ID N°6
et N°7
G
SEQ ID N°6 T
5' C~AGCTGTTCGTGTTCTATGA11CATGAGAGTCGCCGTGTGGAGCCCCG 3'
3'GTCGACAAGCACAAGATACTAG CTCTCAGCGGCACACCTCGGGGCS'
~L SEQ ID N°7
C
On peut également détecter la mutation C282Y, qui est due au remplacement
d'une
guanine par une adénine sur le brin sens, avec les sondes SED ID N°8 et
N°9
A
SEQ ID N°8 T
5' GGAAGAGCAGAGATATACG'I~GCCAGGTGGAGCACCCAGGCCTGGAT 3'
3'CCCTTCTCGTCTCTATATGCAC GGTCCACCTCGTGGGTCCG CCTA-S'
~L SEQ ID N°9
C
Les quatre oligonucléotides SED ID N°6 à 9 peuvent être utilisés pour
l'identification
du nucléotide qui se trouve immédiatement après l'extrémité 3'de ces
oligonucléotides.
On peut prévoir à cet effet un système en tétrade (voir figure 4).
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Exemple 5 : détection de mutations dans des gènes impliqués dans le cancer.
a) Mutations dans le gène MLHl EST liées à l'apparition du cancer colorectal.
S Il existe à ce jour 60 mutations ponctuelles identifiées dans MLH1 comme
étant
impliquées dans le cancer colorectal ; Bronner (1994) Nature 368, 258,
Papadopoulos
(1994) Science 263, 1625.
On peut citer par exemple les mutations suivantes
Accession Codon Nucleotide acide aminé
CM950799 62 CAA-TAA Gln-Term
CM960964 107 ATA-AGA Ile-Arg
La liste complète est donnée online à www.uwcm.ac.uk/uwcm/m~/ns/1/249617.html.
Au w du nombre importants de mutations pour un même gène, le procédé de
détection
selon l'invention avec une puce comportant des sondes spécifiques pour chacune
des
mutations précitées apparaît donc indispensable pour garantir à un patient un
diagnostic exact.
b) Détection de mutations dans le gène K-ras.
W0 91/13075 présente des sondes permettant de détecter des mutations
ponctuelles
dans le codon 12 de K-ras. Dans le cadre de l'invention, on peut greffé sur la
puce les
sondes suivantes et dès lors garantir une détection complète de toutes les
mutations
possibles
- 5' AAGGCACTCTTGCCTACGCCA 3' (SEQ ID N° 10)
- 5' AGGCACTCTTGCCTACGCCAC 3' (SEQ ID N° 11 )
- 5' AACTTGTGGTAGTTGGAGCT 3' (SEQ ID N° 12)
- S' ACTTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3' (SEQ ID N°13)
- 5' ACTGGTGGTGGTTGGAGCAG 3' (SEQ ID N° 14)
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19
Exemple 6
1) Obiectif
Ce travail a pour objectif la détermination du polymorphisme génétique d'un
ADN
grâce à l'utilisation d'une nouvelle technique de biopuce.
Cette technique consiste en l'amplification génique d'intérêt, l'hybridation
des produits
d'amplification obtenus sur un support solide (substrat) préalablement préparé
par
fixation d'une sonde de façon covalente, extension de la sonde avec un
nucléotide
modifié, révélation de la dégradation ou de la protection de la sonde.
Ce protocole ci-dessous décrit est appliqué à la détermination du génotype
C282Y et
H63D du gène de l'hémochromatose.
2) Protocole
a) Préparation de l'ADN
PCR avec amorces pour amplifier région génomique d'intérêt correspondant au
génotype C282Y et H63D.
Séquence des amorces utilisées
C282Y For : gggCTggATAACCTTggCT (SEQ ID N°15)
C282Y Rev : gTCACATACCCCAgATCACA (SEQ ID N° 16)
H63D For : CCTTggTCTTTCCTTgTT"TgA (SEQ ID N° 17)
H63D Rev : TCTggCTTgAAATTCTACTgg (SEQ ID N°18)
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Ces amorces sont modifiées à leur extrémité 5' avec l'ajout d'un marqueur
fluorescent
Cy3 (Amersham)
La taille des fragments d'amplification attendue dans chaque cas est d'environ
100 pb
S Les amplifications obtenues sont vérifiées sur gel d'agarose 1,5%
Les sondes utilisées pour C282Y et H63D sont celles décrites dans l'exemple 4:
deux sondes pour chaque génotype à déterminer.
10 b) Préparation des supports solides
Les sondes sont fixées suite à une modification chimique de la surface
permettant la
réactivité de l' extrémités S' des oligonucléotides sondes.
Pour chaque génotype à déterminer, 2 sondes sont dessinées permettant
l'hybridation
1 S des brins sens et anti-sens de l'amplification, et positionnées juste en
amont de la base
à révéler.
voir description Exemple 4.
c) Hybridation sur les puces
1 Dilution des amplifications volume:volume avec du TE 1X
2 Dénaturation des PCR 100°c pendant 5 min puis déposés dans la glace 1
min
3 Hybridation des PCR:
- Produits d'amplification dilués dans un tampon d'hybridation (SSC SX,
Denhardt
1 X)
- Dépôt sur le substrat de silicium de la PCR
- Les substrats sont placés en chambre humide dans une boîte de Pétri à
37°c
pendant 45 min sous 300 rpm
- Lavages avec SSC SX .
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4 Détection du nolymornhisme:
a)- Elongation avec le dGTP uniquement
Mix réalisé pour chaque puce
Bst pol 8U/~1 (Biolabs): 0,8 p1 (soit 0,016 U/pl)
S Tampon Bst pol 10 X (Biolabs): 40 p1
alphaThiodGTP (Amersham) 1 mM : 4 p1
Eau stérile: 355, 2 p1
- Dépôt des 400 p1 de Mix sur chaque puce
- Incubation à 50°C 20 min sous 300 rnm
- Lavages avec SSC SX
b)- Digestion
Mix réalisé pour les 3 puces
1 S Eau stérile : 1350 ~ l
Tampon Exo III 10 X (Biolabs): 150 p1
Exo III 100U/pl (Biolabs): 0,3 p1
- Dépôt des 400 ~l de Mix sur chaque puce
- Incubation à 37°c 10 min sous 300 rpm
- Lavages dans du PB S 0,1 % Tween 20
d)- Révélation
La mesure de l'émission de fluorescence due à Cy3 est effectuée (lecture sur
un
scanner par exemple) sur chaque plotlpuce.
3) Résultats
Un signal positif a été obtenu pour C282Y et H63D (résultats non présentés).
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Pour les diffërents ADN testés, on observe une disparition de la fluorescence
due à
Cy3 dans 1 plots sur 2 pour les différents génotypes.
En conclusion, une dégradation de certaines sondes par l'Exo III est observée
et cette
dégradation n'est observée que pour les brins n'ayant pas incorporé le
thiodGTP.
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1
LISTE DE SÉQUENCES
<110> Nucleica
<120> Procédé de détection de mutations par puces à ADN.
<130> D18635
<150> FR 00 026 14
<151> 2000-03-O1
<160> 18
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 38
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Séquence HHP-1 du gène HH normal.
<400> 1
tcttttcaga gccactcacg cttccagaga aagagcct 38
<210> 2
<211> 38
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Séquence HHP-1 mutée en AG64.
<400> 2
tcttttcaga gccactcaca cttccagaga aagagcct 38
<210> 3
<211> 19
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde de détection selon l'invention de HHP-1
AG64.
<400> 3
agaaaagtct cggtgagtg 19
<210> 4
<211> 24
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde de détection selon l'invention de HHP-19
(A-->G).
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2
<400> 4
tatatagata ttagatataa agaa 24
<210> 5
<211> 21
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde de détection selon l'invention de HHP-29
(A-->G).
<400> 5
aacccctaaa atatctaaaa t 21
<210> 6
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde de détection selon l'invention de H63D.
<400> 6
agctgttcgt gttctatgat 20
<210> 7
<211> 19
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde de détection selon l'invention de H63D.
<400> 7
actctcagcg gcacacctc 19
<210> 8
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde de détection selon l'invention de C282Y.
<400> 8
ggaagagcag agatatacgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde de détection selon l'invention de C282Y.
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3
<400> 9
ggtccacctc gtgggtccgg 20
<210> 10
<211> 21
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde selon l'invention de détection de mutations
dans le gène K-ras.
<400> 10
aaggcactct tgcctacgcc a 21
<210> 11
<211> 21
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde selon l'invention de détection de mutations
dans le gène K-ras.
<400> 11
aggcactctt gcctacgcca c 21
<210> 12
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde selon l'invention de détection de mutations
dans le gène K-ras.
<400> 12
aacttgtggt agttggagct 20
<210> 13
<211> 21
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Sonde selon l'invention de détection de mutations
dans le gène K-ras.
<900> 13
actttgtggt agttggagct g 21
<210> 14
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
CA 02401867 2002-08-30
WO 01/64945 PCT/FRO1/00604
4
<220>
<223> Sonde selon l'invention de détection de mutations
dans le gène K-ras.
<400> 14
actggtggtg gttggagcag 20
<210> 15
<211> 19
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> C282Y For
<400> 15
gggctggata accttggct 19
<210> 16
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> C282Y Rev
<400> 16
gtcacatacc ccagatcaca 20
<210> 17
<211> 21
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> H63D For
<400> 17
ccttggtctt tccttgtttg a 21
<210> 18
<211> 21
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> H63D Rev
<400> 18
tctggcttga aattctactg g 21
