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WO 01/80836 PCT/FRO1/01289
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UTILISATION DE VECTEURS PARTICULAIRES DANS L'IMMUNOMODULATION
La présente invention a pour objet un procédê
pour améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une
substance, autre qu'un antigène, capable de moduler la
réponse immunologique consistant à mélanger ladite substance
avec des particules hydrophiles portant ou non des ligands
ioniques et éventuellement recouvertes d'une couche de
composés amphiphiles. L'invention concerne le traitement
et/ou la prévention des maladies comprenant un caractère
immunogénique comme les cancers ou les infections.
L'invention s'intéresse tout particulièrement
une composition thérapeutique notamment vaccinale et à leur
procédé de préparation.
L'invention vise tout spécialement
l'utilisation de vecteurs particulaires incorporant de
l'interleukine 2 pour la préparation de médicaments destinés
au traitement des cancers.
Le cancer est une maladie caractérisée par une
prolifération incontrôlée de certaines cellules, qui
échappent à la surveîllance du système immunitaire. En
effet, le rôle du système immunitaire est non seulement de
rejeter les corps étrangers (virus, bactéries, parasites...)
pathogènes qui peuvent pénétrer dans le corps humain, mais
aussi d'éliminer les cellules présentant des
caractéristiques anormales. Il est parfois possible que les
3 0 cellules cancéreuses échappent à la vigilance du système
immunitaire, par exemple en diminuant l'expression de
certains antigènes spécifiques de la tumeur, ou de molécules
impliquées dans la reconnaissance par le système immunitaire
(protéines du complexe majeur d'histocompatibilité). Dans
d'autres cas, bien que les tumeurs soient fortement
immunogéniques, le système immunitaire ne peut les
combattre, les lymphocytes étant dans un état anergique à
proximité des amas cancéreux.
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Une nouvelle stratégie développée dans les
dernières années consiste à stimuler le système immunitaire
par l'injection de protéines d'intérêt thérapeutique, ayant
un rôle dans la régulation du système immunitaire. Parmi ces
protéines, on peut citer bien sûr les cytokines, mais aussi
d'autres agents comme les chémokines. En particulier, on
peut mettre l'accent sur les interleukines, les interférons,
les TNF (facteurs nécrosants de tumeurs), les TGF (facteurs
transformants de croissance), les facteurs de croissance
hématopoïétique tels que les M-CSF et GM-CSF, mais aussi des
facteurs d'attraction de cellules immunitaires, tels que le
MIF ou RANTES.
Une cytokine particulièrement intéressante dans
la stimulation du système immunitaire est l'interleukine 2
(IL-2). Elle est synthétisée majoritairement par les
lymphocytes T helper de type 1 (Thl) en réponse à une
stimulation par l'antigène présenté par des cellules
appropriées. Elle est impliquée dans le développement de
réponses immunitaires spécifiques et non spécifiques, en ce
qu'elle interagit avec de nombreuses cellules (lymphocytes
B, T, cellules tueurs naturels NK) pour les activer et
induire leur différentiation et/ou leur prolifération.
Ainsi, il a été montré que l'IL-2 possède des propriétés
antitumorales, en ce qu'elle peut induire une régression de
différentes tumeurs solides, de mélanomes, de leucémies ou
de lymphomes, etc...
Toutefois, l'utilisation de l'IL-2 en
chimiothérapie se heurte à de nombreux problèmes. Pour
obtenir l'effet recherché, il est souvent nécessaire
d'administrer des doses importantes de protéine, ce qui peut
provoquer des effets secondaires gênants (fièvre, erythème,
oedème). Par ailleurs, la purification de cette protéine est
difficile, elle est en général produite par génie génétique,
et est donc coûteuse. Par ailleurs, les cytokines sont
souvent instables en solution, même à 4°C, ce qui pose un
problème de conservation. De plus, les procédés de
préparation des solutions comprenant de l'IL-2 contiennent
une étape d'ajout de protéine stabilisatrice, souvent
l'albumine, ce qui devient difficilement acceptable pour les
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agences de régulation, en raison des risques posés par
l'utilisation de l'albumine.
La présente invention se propose de résoudre ces
différents problèmes, en mettant en ouvre une nouvelle façon
de formuler les compositions contenant de l'IL-2, qui permet
d'obtenir des solutions ayant une activité, en particulier
anti-tumorale, plus importante que les formulations
usuelles. Cette nouvelle formulation permet également
d'augmenter la stabilité de l'IL-2. De plus, l'invention
peut-être utilisée pour la fabrication d'un médicament qui
peut être administré par voie intranasale ou orale, un
système de délivrance de principe actif présentant une
amélioration très importante par rapport aux systèmes
précédemment décrits. Enfin, une formulation selon
l'invention permet de s'affranchir de la présence d'albumine
dans les compositions comprenant de l'IL-2, destinées à une
administration sous forme injectable.
La Demanderesse a développé son expertise dans
la préparation de vecteurs particulaires synthétiques,
désignés aussi ci-après "BVSMT'~'" .
Un premier type de BVSM, et son procédé de
préparation, ont été décrits dans le brevet européen No. 344
040. I1 s'agit de particules comprenant de l'intérieur vers
l'extérieur .
- un noyau central hydrophile non liquide
constitué d'une , matrice de polysaccharides ou
d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés,
pouvant être modifiés par des groupements ioniques divers;
- une couche d'acides gras greffés par des
liaisons covalentes au noyau;
- une ou plusieurs couches lipidiques
constituées notamment de phospholipides.
Les développements de cette première génération
de BVSM ont conduit la Demanderesse à concevoir et préparer
de nouveaux BVSM, aux propriétés améliorées notamment en
fonction des principes actifs transportés.
Les demandes de brevet publiées sous les numéros
WO 94/20078, WO 96/06638 et EP 782 851 décrivent ces BVSM,
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leur fabrication, leur association à divers principes actifs
et leur utilisation pour la préparation de compositions
pharmaceutiques.
Ainsi, le noyau hydrophile peut être obtenu par
différentes méthodes déjà décrites précédemment (ainsi les
brevets EP344040, W092/21329, W094/20078), et les procédés
de réticulation sont connus de l'homme du métier, le
polysaccharide peut être chargé positivement ou
négativement, par la greffe de groupements ioniques,
cationiques ou anioniques, aux sucres composant le polymère.
Ces groupements peuvent être choisis parmi des fonctions
ammoniums quaternaires ou carboxyméthyles. Les procédés ont
été décrits dans W092/21329 et les brevets cités
précédemment. La charge du cour polysaccharidique des
vecteurs des compositions selon l'invention est en général
de préférence une charge positive. Toutefois les vecteurs
dont les cours contiennent des charges négatives peuvent
parfois être préférés, en particulier dans une composition
pour une utilisation sous forme injectable.
Les brevets précédemment cités décrivent
également les protocoles que l'homme du métier peut utiliser
pour l'incorporation de la couche externe lipidique. Celle-
ci est de préférence composée de " DPPC-like ", c'est à dire
de DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) ou de tout autre
composé possédant les mêmes propriétés que ce produit, dans
lequel est ajouté du cholestérol. Toutefois, d'autres
composés lipidiques..peuvent être utilisés en particulier des
phospholipides ou des céramides, auxquels on peut
additionner d'autres constituants, par exemple des
3 0 constituants des membranes biologiques. De façon préférée,
le rapport massique DPPC/Cholestérol est de 70/30.
Le savoir-faire dont dispose aujourd'hui la
Demanderesse sur la préparation des BVSM lui permet de
disposer d'une gamme étendue de type de BVSM. Ces BVSM sont
formés d'un polymère hydrophile réticulé, préférentiellement
des polysaccharides, sous forme de gel nanoparticulaire, ces
BVSM sont dits de type PSC (ou NPS en français).
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Comme indiqué ci-dessus, ce polymère peut
éventuellement porter des ligands ioniques positifs, BVSM
dit cationique, ou négatifs, BVSM dit anionique. Ce polymère
chargé ou non est optionnellement recouvert d'une couche de
5 composés amphiphiles, préférentiellement des phospholipides,
BVSM dit de type Light décrit dans la demande de brevet PCT
W094/20078.
La taille des BVSM est comprise entre 20 et 200
nm, préférentiellement entre 50 et 100 nm et plus
préférentiellement entre 60 et 80 nm.
Les BVSM sont stérilisables par filtration et
leur association aux principes actifs se fait sur les BVSM
complètement fabriqués (Major et al., Biochem. & Biophys.
Acta (1997),1327,32-40). Ceci permet de travailler les
molécules biologiques, particulièrement fragiles, dans des
conditions optimales.
Les BVSM protègent les molécules biologiques de
la dégradation (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N°6
pp. 511-520 Combination of hCMV recombinant IE1 protein with
80 nm cationic biovectors . protection from proteolysis and
potentiation of presentation to CD4).
Il a aussi été montré qu'ils augmentent
l'activité biologique de peptides et de protéines comme des
enzymes, des antigènes, etc....
Les BVSM sont connus pour être utilisés comme
transporteurs de substances actives, par exemple peptides,
antigènes ou oligonucléotides. Dans cette utilisation, il y
a formation d'un réel complexe entre le BVSM et la substance
active, comme des interactions ioniques entre le noyau
cationique du BVSM et l'oligonucléotide anionique. I1 y a
donc formation d'un conjugué ionique stable dans un milieu
biologique. Dans ce type de préparation, le rapport
oligonucléotide / BVSM est de 5 à 10 ~ et le rendement
d'association mesuré est supérieur à 90
La demande de brevet PCT publiée sous le numéro
WO 96/06638 rapporte l'augmentation de l'immunogénicité d'un
antigène, obtenue par un simple mélange antigène/BVSM.
L'antigène est là aussi associé au vecteur particulaire par
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des liaisons ioniques et/ou hydrophobes. Pour obtenir ce
résultat, on incube par exemple 1 mg de protéine GST-e4 pour
mg de BVSM, ce qui permet d'obtenir des taux
d'association moyens de 90 ~ quel que soit le type de BVSM
S utilisé (Prieur R. et al. Vaccins (1996) Vol 14, N°6 pp 511-
520) .
La Demanderesse a maintenant découvert que les
BVSM permettent d'améliorer les propriétés
10 immunomodulatrices d'une substance autre qu'un antigène
capable de moduler la réponse immunologique. Ces substances
sont plus particulièrement .
- des adjuvants capables d'amplifier, de réguler
ou de modifier la réponse immune,
- des cytokines et chemokines dont la
propriété intrinsèque est de modifier l'activité des
cellules du système immunitaire,
- des immunosuppresseurs du fait de leur
utilisation dans le traitement des allergies, et/ou du rejet
de greffe,
- des substances capables de modifier la balance
Thl/Th2.
On peut rappeler que la réponse immunitaire est
relayée par les cellules lymphocytaires notamment les
cellules B et les lymphocytes T. Ces derniers peuvent être
classés en deux sous-types sur la base de leur expression
d'antigènes de surface CD4 et CD8. Les cellules CD4+ sont
généralement impliquées dans les fonctions " helper ". En
particulier, ils sécrètent des cytokines qui induisent la
prolifération et la maturation des autres cellules
lymphocytaires. Ainsi, deux profils des lymphocytes T helper
peuvent être définis .
- d'une part, un profil Thl, qui caractérise une
réponse à médiation cellulaire, avec l'induction de
cytokines notamment d'IL2, d'IL7 et d'interféron gamma, la
stimulation des CTL et l'induction d'anticorps de type
IgG2a, et
- d'autre part, un profil Th2, qui caractérise
une réponse à médiation humorale, avec l'induction de
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cytokines notamment d'IL4, d'IL5 et d'IL10, et la présence
d'anticorps de type IgGl et IgE.
Les antigènes protéiques, dont la présentation
par les cellules présentatrices d'antigènes (APC) est
majoritairement faite par le CMH de classe II, induisent une
réponse orientée vers les Th2. A l'inverse, l'ADN qui permet
après transfection de présenter les antigènes directement
sur les CMH de classe I, oriente la réponse immunitaire vers
les Thl.
Certains adjuvants sont connus pour orienter la
réponse majoritairement vers Thl ou Th2. Par exemple, les
sels d'aluminium qui induisent une réponse sérique de type
IgGl sont considérés comme Th2. A l'inverse des adjuvants
comme les dérivés du lipid A (MPL) ou les dérivés du QuilA,
qui induisent une réponse IgG2a et CTL, sont considérés
comme Thl. I1 serait donc utile de disposer de moyens
permettant d'agir sur la balance Thl/Th2, ce que précisément
se propose de réaliser la présente invention.
Les travaux de recherche réalisés par la
Demanderesse dans le cadre de la présente invention montrent
que le BVSM n'agit pas comme un adjuvant, car seul il
n'induit pas d'activation du système immunitaire, mais comme
un " carrier " permettant une meilleure pénétration et/ou
une meilleure présentation de l'antigène aux cellules
présentatrices. Ainsi, les résultats obtenus ont montré
l' apport de BVSM sur le pouvoir adjuvant de la CTB, des MPL
et des ODN. De façon surprenante, le pouvoir adjuvant est
visualisé de manière différente .
- sur la réponse IgG sérique, pour laquelle, une
forte synergie, dans le cas de la CTB, ou une addition des
réponses, dans le cas des ODN CpG, a été obtenue,
- sur la réponse IgA, où une synergie est
clairement démontrée pour les MPL,
- sur la balance Thl/Th2, où même dans le cas
d'une réponse quantitativement équivalente (IL2), on observe
une différence qualitative de la réponse notamment dans la
balance Igl/IgG2a qui reflète un différentiel dans la
réponse cellulaire.
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L'invention a donc tout d'abord pour objet
l'utilisation d'un vecteur du type comportant un noyau
hydrophile non liquide pour la préparation d'un médicament
destiné au traitement des cancers et/ou des maladies
virales, ledit vecteur étant associé dans le médicament avec
au moins une substance, autre qu'un antigène, capable de
moduler la réponse immunitaire.
Le vecteur est avantageusement du type
comportant un noyau hydrophile non liquide et une couche
externe constituée au moins en partie de composés
amphiphiles, associée au noyau par des interactions
hydrophobes et/ou des liaisons ioniques. La couche externe
est formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et de
cholestérol.
Le noyau hydrophile non liquide est constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides
naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont
greffés des ligands ioniques.
Les ligands ioniques sont de préférence à charge
positive, comme des ammoniums quaternaires.
Les vecteurs particulaires possédant un noyau
hydrophile non liquide et une couche externe constituée de
composés amphiphiles ont déjà été décrits, en particulier
dans la demande de brevet W094/20078.
Le noyau hydrophile peut être obtenu par
différentes méthodes déjà décrites précédemment (ainsi les
brevets EP344040, W092/21329, W094/20078), et les procédés
de réticulation sont connus de l'homme du métier, le
polysaccharide peut être chargé positivement ou
négativement, par la greffe de groupements ioniques,
cationiques ou anioniques, aux sucres composant le polymère.
Ces groupements peuvent être choisis parmi des fonctions
ammoniums quaternaires ou carboxyméthyles. Les procédés ont
été décrits dans W092/21329 et les brevets cités
précédemment. La charge du cour polysaccharidique des
vecteurs des compositions selon l'invention est en général
de préférence une charge positive. Toutefois les vecteurs
dont les coeurs contiennent des charges négatives peuvent
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parfois être préférés, en particulier dans une composition
pour une utilisation sous forme injectable.
Les brevets précédemment cités décrivent
également les protocoles que l'homme du métier peut utiliser
pour l'incorporation de la couche externe lipidique. Celle
ci est de préférence composée de " DPPC-like ", c'est à dire
de DPPC (dipalmitoyl phosphatidyl choline) ou de tout autre
composé possédant les mêmes propriétés que ce produit, dans
lequel est ajouté du cholestérol. Toutefois, d'autres
composés lipidiques peuvent être utilisés en particulier des
phospholipides ou des céramides, auxquels on peut
additionner d'autres constituants, par exemple des
constituants des membranes biologiques. De façon préférée,
le rapport massique DPPC/Cholestérol est de 70/30.
Dans l'utilisation de l'invention, le rapport
pondéral substance / particules est compris entre environ 1~
et 20~, de préférence entre environ 5% et 10~.
Avantageusement, le rapport pondéral (substance) / (noyau +
couche externe) est de 1 contre 10.
Une première classe de substances, autres qu'un
antigène, capables de moduler la réponse immunitaire
comprend des protéines d'intérêt thérapeutique qui jouent un
rôle dans le fonctionnement du système immunitaire. Il
s'agit plus particulièrement d'une cytokine ou d'une
chémokine, de préférence choisie dans le groupe comprenant
les interleukines, .les interférons, les TNF, les TGF, le G-
CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un mélange de ceux-ci.
Une seconde classe de substances, autres qu'un
antigène, capables de moduler la réponse immunitaire,
recouvrant partiellement la précédente, comprend les
adjuvants. On entend par adjuvant, une molécule permettant
d'amplifier, de réguler ou d'orienter la réponse immune
spécifique d'un antigène. Ainsi, afin d'évaluer les
propriétés des BVSM sur le pouvoir immunomodulateur de
substances autres que des antigènes, diverses molécules
appartenant aux principales catégories d'adjuvants ont été
testées dans le cadre de la présente invention, comme des
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produits bactériens (endotoxines, composants de la paroi),
des cytokines, des oligonucléotides (CpG). On peut citer
plus particulièrement parmi celles-ci .
- des enterotoxines bactériennes, comme CT, CTB,
S LT,
- des dérivés liposaccharidiques, comme MPL et
dérivés de lipide A,
- des dérivés de la saponine type QS21,
- des sels d'ammonium et leurs dérivés, comme
10 l' alum,
- des protéines type DT, TT,
ou un mélange de ceux-ci
La substance, autre qu'un antigène, capable de
moduler la réponse immunitaire est choisie de préférence
parmi .
- les adjuvants, capables d'amplifier, de
réguler ou de modifier la réponse immune,
- les cytokines et chemokines dont la
propriété intrinsèque est de modifier l'activité des
cellules du système immunitaire,
- les immunosuppresseurs du fait de leur
utilisation dans le traitement des allergies et/ou du rejet
de greffe,
- les substances capables de modifier la balance
Thl/Th2.
Parmi celles-ci, l'invention envisage plus
particulièrement comme substance, dont on souhaite améliorer
les propriétés immunomodulatrices, les cytokines qui
stimulent l'activité des cellules immunitaires, et parmi
celles-ci, l'IL2, l'IL11 et le GM-CSF. En effet, les
cytokines stimulent ou inhibent l'activité des cellules
immunitaires.
Une forme de mise en oeuvre toute préfére de
l'invention concerne l'utilisation d'un vecteur comportant .
a) un noyau hydrophile non liquide, constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'olïgosaccharides
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naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont
greffés des ligands ioniques,
b) une couche externe constituée au moins en
partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des
interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et
c) incorporant de l'interleukine 2
pour la préparation d'un médicament destiné au
traitement des cancers.
Une telle composition pharmaceutique, contenant
un vecteur comportant .
a) un noyau hydrophile non liquide, constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides
naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont
greffés des ligands ioniques,
b) une couche externe constituée au moins en
partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des
interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et
c) incorporant de l'interleukine 2
fait également partie de l'invention.
Dans cette utilisation, l'invention s'intéresse
au traitement des cancers du type non immunogénique ou
faiblement immunogénique, et/ou au traitement des infections
notamment virales comme le sida ou l'hépatite chronique où
les immunomodulateurs ont été proposés en complément de
traitements thérapeutiques pour activer la réponse
immunitaire. Une composition pour la mise en ouvre de cette
utilisation comprend des particules hydrophiles portant ou
non des ligands ioniques et éventuellement recouvertes d'une
couche de composés amphiphiles dans lesquelles sont
incorporées des protéines d'intérêt thérapeutique ou des
adjuvants comme définis ci-dessus. Une telle composition ne
comprend pas d'antigène.
Les cancers pouvant être traités par une
composition selon l'invention peuvent être de toutes sortes.
En particulier, on cite les cancers de la sphère ORL, de
l'oesophage, de l'estomac, du colon, du rectum, de la
prostate, du foie, du pancréas, du sein, du col ou du corps
utérin, de l'ovaire, du rein, de la vessie, de l'os, ou de
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la thyroïde. On ajoute aussi les cancers broncho-
pulmonaires, les mélanomes malins, les tumeurs cérébrales,
les lymphomes (Hodgskiniens ou non), les leucémies
(myéloïdes ou lymphoïdes), les cancers de localisation
primitive inconnue. Ces cancers peuvent être primaires ou
métastatiques. Ils peuvent être de type sarcome, adénome,
carcinome, adénocarcinome, lymphome, myélome, gliome,
blastome, glioblastome. Les cancers pouvant être traités par
une composition selon l'invention peuvent être
immunogéniques ou non. La Demanderesse a montré que les
compositions selon l'invention sont particulièrement
efficaces dans le traitement et le contrôle de cancers peu
ou pas immunogéniques.
Les compositions et médicaments selon
l'invention peuvent être administrés de diverses façons, en
particulier par voie parentérale. On peut ainsi administrer
les compositions selon l'invention par voie intraveineuse,
sous-cutanée, intramusculaire, ou intradermale.
L'administration peut également être effectuée (et c'est un
gros avantage de l'invention) par voie orale ou intranasale.
Les compositions permettant une prise orale peuvent être des
comprimés, des gélules, des poudres, des granules ou des
suspensions ou solutions orales. Elles comprennent également
les formes d'administration sublinguale et buccale.
On peut éventuellement rajouter certains
excipients aux compositions pharmaceutiques selon
l'invention. On peut ainsi utiliser toute sorte d'agents
liant, tensioactif, d'enrobage, de dispersion, ou de
mouillage.
3 0 La Demanderesse a montré que ces vecteurs sont
capables de fixer l'IL-2 de façon très efficace, que la
protéine conserve son activité biologique, et que, de façon
inattendue, cette activité est augmentée par rapport à la
protéine non formulée.
La Demanderesse a également montré qu'une
formulation selon l'invention permet de stabiliser la
protéine en solution, de la même manière qu'en présence
d'albumine. Ainsi, l'utilisation d'un vecteur comportant .
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(a) un noyau hydrophile non liquide constitué
d'une matrice polysaccharidique ou d'oligosaccharides
naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont
greffés des ligands ioniques de charge positive ou négative,
$ (b) une couche externe constituée au moins en
partie de composés amphiphiles associée au noyau par des
interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques et
(c) incorporant l'IL-2
pour la préparation d'un médicament destiné à
l'administration sous forme injectable de ladite protéine
IL-2 en l'absence d'albumine fait également partie de
l'invention.
De plus, la Demanderesse a montré que
l'association vecteur-protéine reste stable (mesurée par un
maintien de l'activité après plusieurs mois de stockage), ce
qui présente une amélioration par rapport à la technique
précédente, dans laquelle les préparations thérapeutiques
d'IL-2 ne peuvent être conservées, ce qui en augmente
d'autant plus le coût.
Enfin, la Demanderesse a montré que, de façon
surprenante, l'IL-2 formulée selon l'invention, et
administrée par la voie intranasale posséde une activité
similaire ou supérieure à l'IL-2 administrée par des voies
plus classiques, telles la voie sous-cutanée.
L'utilisation d'un vecteur selon l'invention
permet donc de s'affranchir de tous les différents problèmes
précédemment posés lors de l'utilisation de l'IL-2.
Un vecteur selon l'invention est donc utilisable
pour la traitement des cancers où l'on recherche une
potentiation de la réponse immunitaire.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour
améliorer les propriétés immunomodulatrices d'une substance,
autre qu'un antigène, capable de moduler la réponse
immunitaire, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange de
ladite substance avec des vecteurs du type comportant un
noyau hydrophile non liquide. Avantageusement, les vecteurs
sont du type comportant un noyau hydrophile non liquide et
une couche externe constituée au moins en partie de composés
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amphiphiles, associée au noyau par des interactions
hydrophobes et/ou des liaisons ioniques. Comme indiqué
précédemment, le noyau hydrophile non liquide est constitué
d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides
naturellement ou chimiquement réticulés, sur lequel sont
greffés des ligands ioniques, notamment de charge positive,
comme des ammoniums quaternaires. La couche externe est par
exemple formée de dipalmitoyl phosphatidyl choline (DDPC) et
de cholestérol, notamment selon le rapport massique
DPPC/cholestérol est de 70/30. De préférence, le rapport
pondéral substance/vecteurs dans le mélange est compris
entre environ l~ et 20~, de préférence entre environ 5~ et
10~.
Comme précédemment, la substance, autre qu'un
antigène, capable de moduler la réponse immunitaire est
choisie parmi .
- une protéine d'intérêt thérapeutique qui joue
un rôle dans le fonctionnement du système immunitaire, comme
une cytokine ou une chémokine, de préférence choisie dans le
groupe comprenant les interleukines, les interférons, les
TNF, les TGF, le G-CSF, le GM-CSF, le MIF, le RANTES, ou un
mélange de ceux-ci,
- un adjuvant, notamment choisi dans le groupe
comprenant les enterotoxines bactériennes, les dérivés de
liposaccharides, les oligonucléotides, des saponines, les
sels d'ammonium et leurs dérivés, les protéines de type DT
ou TT ou un mélange., de ceux-ci.
- une substances capable de modifier la balance
Thl/Th2.
- un immunosupresseur.
L'invention se rapporte aussi à une composition
pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend .
- un vecteur du type comportant un noyau
hydrophile non liquide constitué d'une matrice de
polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou
chimiquement réticulés, sur lequel sont greffés des ligands
ioniques, et une couche externe constituée au moins en
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partie de composés amphiphiles, associée au noyau par des
interactions hydrophobes et/ou des liaisons ioniques, et
- au moins une protéine d'intérêt thérapeutique
et/ou un adjuvant ou un mélange de ceux-ci.
5 Le vecteur, la protéine d'intérêt thérapeutique
et l'adjuvant étant définis comme précédemment.
L'invention concerne encore tout
particulièrement l'utilisation de vecteurs, comme définis
10 précédemment, pour la préparation d'une composition
vaccinale thérapeutique ou prophylactique, lesdites
particules étant mélangées dans la composition avec au moins
un antigène et au moins une substance capable de moduler la
réponse immunologique audit antigène. Dans le cas d'une
15 utilisation thérapeutique, l'invention s'intéresse tout
particulièrement au traitement et/ou à la prévention des
maladies virales, notamment le sida et l'hépatite chronique,
mais aussi des cancers ayant un caractère immunogénique.
L'invention concerne donc tout spécialement une
composition vaccinale caractérisée en ce qu'elle comprend
des vecteurs comme définis précédemment et un antigène ou un
mélange d'antigènes, et au moins une substance capable de
moduler la réponse immunologique audit antigène.
La substance capable de moduler la réponse
immunologique à l'antigène présent dans la composition de
l'invention est de préférence un adjuvant. Parmi ceux-ci,
l'invention envisage des produits bactériens (endotoxines,
composants de la paroi), des cytokines, des oligonucléotides
(CpG). On peut citer plus particulièrement parmi celles-ci .
- des enterotoxines bactériennes, comme CT, CTB,
LT,
- des dérivés liposaccharidiques, comme MPL et
dérivés de lipide A,
- des dérivés de la saponine type QS21,
- des sels d'ammonium et leurs dérivés, comme
l'alum,
- des protéines type DT, TT,
ou un mélange de ceux-ci.
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Comme indiqué précédemment, le rapport pondéral
substance/particules est compris entre environ 1~ et 20%, de
préférence entre environ 5~ et 10~.
L'invention est tout particulièrement adaptée à
la préparation de composition, plus particulièrement, pour
l'administration mucosale, notamment nasale, mais tout autre
mode d'administration, par exemple parentérale, peut être
envisagée.
D'autres caractéristiques et avantages de
l'invention apparaîtront des exemples qui suivent
concernant:
- Exemple 1 . la préparation et l'activité
biologique de BVSM-IL2.
- Exemple 2 . (ii) l'effet chez la souris du
BVSM sur l'immunogénicité d'un split Influenza trivalent à
celui de différents adjuvants, et (iii) l'effet chez la
souris de la co-administration de la formulation et de
différents adjuvants sur l'immunogénicité d'un split
Influenza trivalent.
Les exemples qui suivent sont destinés à
illustrer l'invention, sans toutefois être limitatifs. En
particulier les valeurs données ne le sont qu'à titre
d'exemple et peuvent être optimisées lors d'une mise en
ouvre de la présente invention.
I1 sera fait référence dans l'exemple 1 aux
figures suivantes .
Figure 1 . Analyse ELISA des interactions BVSM
IL2, permettant en particulier de calculer le rapport
massique optimal entre la protéine d'intérêt et le vecteur.
Les valeurs sont données en Unités Arbitraires (UA).
Figure 2 . Analyse des BVSM-IL2 sur un appareil
Biacore . Comparaison de la réfraction entre une composition
d'IL-2 libre et la composition BVSM-IL2. Les valeurs sont
données en Unités de Réfraction (RU).
Figure 3 . Prolifération de cellules
mononucléaires périphériques stimulées préalablement
stimulées par PHA, et par des BVSM-IL2 de diverses
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compositions. La prolifération est mesurée par incorporation
de thymidine marquée au 3H et est proportionnelle au nombre
de coups par minutes (cpm) relevés.
Figure 4 . Effet de différentes formulations
d'IL-2 sur l'implantation et la croissance d'une tumeur dans
un modèle TS/A, après co-administration. Les symboles
représentent . PBS, tampon de saline ; IL-2, interleukine 2
non formulée ; KY, vecteur à cour cationique et couche DPPC
/ Cholestérol ; KY / IL-2, vecteur KY formulé avec IL-2.
Figure 5 . Effet de différentes formulations
d'IL-2 sur l'implantation et la croissance d'une tumeur dans
un modèle TS/A, après administration dans le flanc
contralatéral de souris BALB/c. Les symboles sont les mêmes
que précédemment, les valeurs numériques indiquées
correspondent aux valeurs UI de l'IL-2.
Figure 6 . A. Propriétés de rejet d'une tumeur
TS/A implantée par administration sous cutanée de KY / IL-2
dans le flanc contralatéral de souris BALB/c à un ou cinq
site(s), six jours après implantation. Les symboles sont les
mêmes que précédemment, les valeurs numériques indiquées
correspondent aux valeurs UI de l'IL-2. B. protection de
souris guéries après ré-injection de cellules tumorales
TS/A. Dans les deux figures, le nombre de souris présentant
des tumeurs est indiqué entre parenthèses.
Figure 7 . A. Propriétés de rejet d'une tumeur
TS/A implantée par administration intranasale de KY / IL-2
dans le flanc contralatéral de souris BALB/c une ou deux
fois par jour, pendant cinq jours, six jours après
implantation. Les symboles sont les mêmes que précédemment,
les valeurs numériques indiquées correspondent aux valeurs
UI de l'IL-2. B. protection de souris guéries après ré-
injection de cellules tumorales TS/A. Dans les deux figures,
le nombre de souris présentant des tumeurs est indiqué entre
parenthèses.
Figure 8 . activité CTL antitumorale chez les
souris ayant rejeté les cellules TS/A après administration
de KY / IL-2. A. Souris ayant reçu une administration sous
cutanée. B. Souris ayant reçu une administration
intranasale.
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Il sera fait référence dans l'exemple 2 au
figures suivantes
Figure 9 . analyse au Biacore (résonance
plasmonique de surface) de l'association de la CTB avec les
BVSMTM en fonction de la concentration en CTB.
Figure 10 . analyse au Biacore de l'association
du MPL avec les BVSMTM en fonction de la concentration en
MPL.
Figure 11 . inhibition de l'association du split
B Harbin sur les BVSM en présence d'une quantité croissante
de CTB.
Figure 12 . inhibition de l'association de split
B Harbin sur les BVSM en présence d'une quantité croissante
de MPL.
Figure 13 . sensorgrammes obtenus en comparant
les deux modes de préparation de la CTB et des antigènes
grippe sur les BVSM immobilisés sur la sensorship HPA. Dans
un premier temps la CTB puis l'antigène sont déposés
successivement sur les BVSM (courbe A) et inversement
(courbe B) .
Figure 14 . sensorgrammes obtenus en comparant
les deux modes de préparation du MPL et des antigènes de la
grippe sur les BVSM immobilisés sur la sensorship HPA. Dans
un premier temps, le MPL puis l'antigène sont déposés
successivement sur les BVSM (courbe A) et inversement
(courbe B).
Figure 15 . titration spécifique du split
B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des secrétions nasales
(IgA) de souris administrées par les formulations
trivalentes et les témoins antigènes associês ou non à la
CTB.
Figure 16 . titration spécifique du split
B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des secrétions nasales
(IgA) de souris administrées par les formulations
trivalentes et les témoins antigènes associés ou non au MPL.
Figure 17 . représente la titration spécifique
du split B/Harbin des pools de sérums (IgG) et des
secrétions nasales (IgA) de souris administrées par les
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formulations trivalentes et les témoins antigènes associés
ou non aux oligonucléotides.
Exemple 1 Préparation et activité biologique
de BVSM-IL2.
1) Caractérisation des particules chargées en
IL-2.
A. Préparation des vecteurs chargés en IL-2.
Les vecteurs utilisés (BVSM) dans cet exemple
ont été décrits précédemment. I1 s'agit de vecteurs
cationiques possédant une couche lipidique en DPPC-
Cholestérol.
L'interleukine 2 (IL-2) utilisée provient de
chez Chiron. Elle se présente sous forme d'IL-2 recombinante
lyophilisée, telle que 18.106 UI - 1,1 mg de protéine
lyophilisée.
Une composition selon l'invention est obtenue
par la liaison BVSM-IL2 par simple mélange des deux
composés, dans un rapport en poids de 10/1, et dans une
solution de saline tamponnée (PBS).
B. Détermination du rapport optimal BVSM-IL2.
Le rapport massique optimal de BVSM par rapport
à la protéine est déterminé par analyse par ELISA, selon une
méthode bien connue de l'homme du métiér.
Brièvement, on couvre les puits avec un
anticorps anti-IL2, et on sature avec de la BSA (albumine de
sérum bovine). On ajoute la préparation d'IL-2 à tester,
puis on ajoute un second anticorps anti-IL2, biotinylê.
L'ajout de streptavidine liée à une peroxydase suivi de
l'addition d'un substrat de ladite peroxydase permet de
déterminer la quantité d'IL-2 présente dans la solution, par
colorimétrie. Les valeurs obtenues sont exprimées en Unités
Arbitraires, une valeur étant d'autant plus élevée qu'il y a
d'IL-2 présente dans la solution testée.
Les préparations testées sont des préparations
dans lesquelles une même quantité d'IL-2 a été introduite,
en présence de vecteurs dans des proportions diverses, ou en
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leur absence, avec ou sans BSA en tant que stabilisateur des
protéines.
Les résultats sont exprimés dans la figure 1. On
observe que l'on obtient environ le même taux d'IL-2
5 disponible dans les préparations contenant de la BSA, ou un
taux de vecteurs particulaires tel que le rapport massique
BVSM/IL-2 soit de 10/1. Lorsque l'IL-2 est seule dans le PBS
ou que le rapport massique est inférieur, il y a moins d'IL-
2 disponible en solution.
10 Ces résultats montrent donc que les vecteurs
sont aussi efficaces que l'albumine pour stabiliser l'IL-2
et empêcher une baisse de la concentration efficace.
C. Détermination du taux d'association de l'IL-2
15 aux BVSM.
On détermine le taux d'association de l'IL-2 aux
vecteurs par la technique de résonance de surface du plasmon
dans un appareil Biacore X, en suivant les instructions du
fabricant. Cette méthode permet la détection des différences
20 dans l'index de réfraction d'une couche de surface d'une
solution en contact avec la puce de détection, par
illumination avec une lumière polarisée monochromatique.
Le protocole opératoire est le suivant .
- on adsorbe les BVSM (0,05 g/1) sur la surface
de la puce de détection ;
- on injecte l'IL-2 libre (1-6 mg/ml) afin de
déterminer la courbe standard (exprimée comme unités de
résonance, RU) qui est fonction de la concentration de
protéine injectée ;
- après régénération, on injecte une préparation
telle que préparée dans l'exemple 1.A, dans laquelle sont
présents les BVSM-IL2, ainsi que de l'IL-2 libre. Seule
cette dernière peut s'associer aux BVSM fixés à la surface
de la puce de détection.
Ce protocole permet de déterminer la
concentration d'IL-2 libre dans la formulation de l'exemple
1.A et d'en déduire le taux d'association BVSM-IL2.
Les données de la figure 2 permettent de
calculer que ledit taux d'association est de 85 ~.
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2) Analyse de l'activité biologique de l'IL-2
ow.e.r,n.i ô0 3 ~-7i ~~~roni-o ~rcn~ciirc
Cet exemple montre l'importance de la
composition des noyaux et couches du vecteur sur l'activité
biologique de l'IL-2.
On utilise quatre types différents de vecteurs .
- deux vecteurs possédant un coeur anionique avec
une couche lipidique contenant
a. un mélange Phospholipon / Cholestérol (P
PLpon/Chol), ou
b. un mélange DPPC / Cholestérol (P DPPC/Chol,
ou PY)
deux vecteurs possédant un coeur cationique et
une membrane contenant
c. un mélange Phospholipon / Cholestérol (QAE
PLpon/Chol), ou
d. un mélange DPPC / Cholestérol (QAE
DPPC/Chol, ou KY)
L'IL-2 est ajoutée aux BVSM dans un rapport
massique de 1/10.
On évalue l'activité biologique de l'IL-2
associée aux différents BVSM en mesurant la prolifération de
cellules mononucléaires sanguines, calculée par
incorporation de thymidine marquée à 1'3H. Ces cellules ont
préalablement été stimulées par des composés (PHA) qui
induisent l'expression du récepteur CD25, qui possède une
forte affinité pour l'IL-2.
On observe (figure 3) que tous les BVSM
permettent d'obtenir une activité équivalente à celle de
l'IL-2 contrôle non formulée in vitro, les BVSM QAE
DPPC/Chol permettant même d'améliorer cette activité
biologique.
3) Etude de la stabilité des préparations d'IL-
2.
Les préparations d'IL-2 en solution ne sont en
général pas stables en solution à 4 °C, l'IL-2 perdant son
activité biologique.
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La préparation BVSM-IL2 (QAE/DPPC/Chol) reste
stable après deux mois de stockage à 4 °C, 9 5~ de
l'activité biologique de l'IL-2 fraîche étant maintenue,
comme mesurée par incorporation de thymidine marquée à 3H
dans les cellules murines CTLL-2.
4) Tests in vivo. Tumeur TS/A.
On a testé l'activité des BVSM-IL2 (KY / IL2,
rapport massique 10/1) dans le modèle de tumeur TS/A
(adénocarcinome mammaire non différencié, non
immunogénique), dans un modèle de rejet d'implantation
tumorale, ou un modèle de traitement de tumeurs
préalablement implantées.
A. Rejet de l'implantation tumorale.
A. 1. Coadministration dans le même flanc
On co-administre 5.104 cellules tumorales à des
souris femelles BALB/c par voie sous cutanée (s.c.), ainsi
que les BVSM-IL2 (KY/IL-2) correspondant à la concentration
en IL-2 indiquée sur la figure 4. En tant que contrôle, on
administre également les vecteurs seuls ou l'IL-2 non
formulée, ou du simple PBS. On mesure l'implantation et
l'évolution de la taille des tumeurs.
La figure 4 montre clairement qu'il y a
implantation des cellules tumorales et croissance de la
tumeur après administration des vecteurs seuls ou de l'IL-2
seule, alors que l'IL-2 formulée avec les vecteurs KY permet
de retarder la croissance tumorale.
A.2. Administration contralatérale
On administre 5.104 cellules tumorales TS/A à
des souris BALB/c, par voie s.c., ainsi que les KY / IL-2
correspondant aux concentrations en IL-2 indiquée sur la
figure 5, dans le flanc contralatéral. On administre de
l'IL-2 non formulée ou du PBS en tant que contrôles.
La figure 5 montre que l'administration
contralatérale de l'IL-2 complexée aux vecteurs permet la
diminution de la croissance tumorale, un résultat non
observé avec l'IL-2 non formulée, même utilisée à une dose
100 fois supérieure.
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B. Effet thérapeutiaue et protecteur sur une
tumeur implantée ; administration par voie sous-cutanée.
B.1. Effet thérapeutique
Six jours après administration s.c. de 5.104
cellules TS/A à 10 souris/groupe, on administre les KY / IL
2, par voie s.c., dans le flanc contralatéral. On effectue
l'administration à un site (5.103 Unités d'IL-2) ou à cinq
sites distincts, la dose injectée étant alors 1.103 Unités
par site.
Dans un tel modèle, la tumeur est implantée et
est palpable (surface d'environ 40 mm). On évalue
l'augmentation de la taille de la tumeur. La figure 6.A.t
montre que l'IL-2 complexée aux vecteurs permet de ralentir
la croissance tumorale, d'une façon plus importante que
l'IL-2 seule. Par ailleurs, il semble que l'injections de
petites doses à de multiples sites soit plus efficace que
l'injection d'une dose plus forte à un site unique.
Trois animaux sur les 10 souris ayant reçu les
KY / IL-2 à un site unique ne présentent pas de tumeur
détectable après 30 jours, alors que 6 souris sur les 10
ayant reçu les KY / IL-2 à cinq sites d'administration sont
également sans tumeur détectable. Ces neufs animaux ne
redéveloppent pas de tumeurs plus tard.
B.2. Effet protecteur
On réinjecte 25.104 cellules TS/A aux neuf
souris décrites précédemment, qui ne présentent plus de
tumeurs 46 jours après l'administration de l'IL-2. Des
souris naïves sont utilisées comme contrôles.
La figure 6.B montre que l'administration
préalable de KY / IL-2 permet de protéger partiellement les
animaux contre un nouveau challenge. En effet, quatre souris
sur neuf ne développent pas de tumeurs, et le développement
tumoral est ralenti chez les autres animaux, par rapport aux
animaux naïfs.
C. Effet thérapeutique et protecteur sur une
tumeur implantée ; administration par voie intranasale.
C.1. Effet thérapeutique
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En commençant six jours après l'administration
s.c. de 5.104 cellules TS/A à 10 souris/groupe, on
administre les KY / IL-2, par voie intranasale, pendant une
période de 5 jours. On effectue l'administration une ou deux
fois par jour. Les contrôles utilisés sont l'IL-2 seule
(administrée deux fois par jour), les vecteurs seuls ou du
PBS.
Dans un tel modèle, la tumeur est implantée et
est palpable (surface d'environ 40 mm-). On évalue
l'augmentation de la taille de la tumeur. La figure 7.A.
montre que l'IL-2 complexée aux vecteurs permet de ralentir
la croissance tumorale, d'une façon plus importante que
l'IL-2 seule. I1 ne semble pas que le nombre
d'administrations mène à des différences sur les résultats
observés.
Quatre animaux sur les 10 souris ayant reçu les
KY / IL-2 par voie intranasale, une fois par jour ne
présentent pas de tumeur détectable après 35 jours, et 6
souris sur les 10 ayant reçu les KY / IL-2 deux fois par
jour sont également sans tumeur détectable. Ces dix animaux
ne redéveloppent pas de tumeurs plus tard.
C.2. Effet protecteur
On réinjecte 25.104 cellules TS/A aux dix souris
décrites précédemment, qui ne présentent plus de tumeurs 48
jours après l'administration de l'IL-2. Des souris naïves
sont utilisées comme contrôles.
La figure 7.B montre que l'administration
préalable de KY / IL-2 permet de protéger partiellement les
animaux contre un nouveau challenge. En effet, quatre souris
sur dix ne développent pas de tumeurs, et le développement
tumoral est ralenti chez les autres animaux, par rapport aux
animaux naïfs.
5) Induction de CTL.
On isole les splénocytes des quatre souris
traitées par voie sous cutanée (après 75 jours) ou
intranasale (après 79 jours), qui ont rejeté la tumeur
implantée et n'ont pas redéveloppé de tumeurs après un
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nouveau challenge avec une dose plus importante (sections
4.B et 4.C).
Les splénocytes sont stimulés in vitro avec les
cellules TS/A pendant 6 jours et 1 'activité CTL contre les
5 cellules TS/A est étudiée.
On observe que les souris ayant reçu les KY /
IL-2 par voie sous-cutanée expriment une activité CTL
spécifique des TS/A (figure 8.A), puisque les cellules
syngéniques WEHI 164 ou les cellules YAC ne sont pas lysées.
10 On observe également une activité CTL spécifique
chez les souris ayant reçu les KY / IL-2 par voie
intranasale.
Exemple 2 . Effet chez la souris du BVSM sur
15 l'immunogénicité d'un split Influenza trivalent à celui de
différents adjuvants, et effet chez la souris de la co-
administration de la formulation et de différents adjuvants
sur l'immunoqénicité d'un split Influenza trivalent.
20 I - Matériel et méthodes.
1) Materiel.
Les animaux utilisés sont des souris femelles
BALB/cJ/Rj (âgées de 10 semaines au début de l'étude)
25 provenant du centre d'élevage Janvier (Route des Chênes-Sec
- B.P.5 - Le Genest-Saint-Isle), sont acclimatées pendant 7
jours, à raison de 6 souris par cage avant le début de
l'étude.
3 0 2) Produits.
a ) BVSMTM .
Le BVSM1'~' utilisé est de type KY . QAE - 2 mEg -
DPPC/Cholesterol. Il correspond à un noyau polysaccharidique
greffé par le glycidyl trimethylammonium et entouré d'une
couche de DPPC / Cholesterol. Ce type de vecteur est décrit
dans EP 687 173 .
b) Adjuvants.
Les 4 adjuvants suivants ont été utilisés .
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- Sous-unité B de la choléra toxine (CTB) (réf .
C9903, Sigma, St Quentin Fallavier, France).
- Monophosphoryl, Lipide A (MPL) (réf. R-350,
Ribi Immunochem Research, Inc, Hamilton, MO).
- IL-2 recombinante, Proleukin, activité 16,3.
106 U/mg (Chiron France, Suresnes, France).
- Oligonucléotides ODN . 5TCCATGACGTTCCTGAC'
(Eurogentec, Bruxelles, Belgique).
c) Split Influenza trivalent.
Une solution à 250 }zg d' HA/ml ( 83 , 3 ~.zg/souche)
de split Influenza trivalent est préparée avec 3 split neuf
monovalents de chez Biochem Pharma (Canada).
- le split neuf monovalent produit à partir de la
souche B/Harbin 7/94.
- le split neuf monovalent produit à partir de la
souche A/Johannesburg 82/96.
- le split neuf monovalent produit à partir de la
souche A/Nanchang 933/95.
Ces split sont constitués d'un mélange de
protéines virales, notamment d'hémagglutinine (HA) et de
neuraminidase.
d) Formulation.
- Formulation antigène + BVSMTM
Une formulation à 250 ~g d'HA/ml (83,3
~zg/souche) de split Influenza trivalent est préparée avec
les 3 split neuf monovalents ci-dessus afin d'obtenir un
rapport d'HA/BVSM égal à 1/89 . 250 ~zg d'HA trivalente /
22,25 mg de BVSM / ml.
Cette formulation est obtenue par mélange, à
volume égal, de 3 formulations à 250 ~g d'HA / 22,25 mg de
BVSMTT' /ml, de chacun des split monovalents.
- Formulation antigène + BVSMTM + adjuvant.
A partir de la formulation antigène + BVSMTM,
quatre autres formulations avec adjuvant ont été préparées.
Ces formulations sont obtenues par dilution de la
formulation trivalente à 250 ~zg d'HA / ml en présence et par
ajout d'adjuvant. La dilution permet d'ajuster la dose d'HA
monovalente / souris / immunisation à 1,2 ug, soit 60 ug
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d'HA monovalente / ml et d'ajouter l'adjuvant dans le volume
utilisé pour diluer.
e) Témoin.
Trois types de témoins ont été préparés .
- des témoins split trivalent, dénommés ci-après
AS et AN, préparés par mélange, à volume égal, de 3
solutions à 250 ug d'HA/ml de chacun des split monovalents,
- des témoins split trivalent + adjuvant,
- un contrôle naïf (PBS 0,22X).
Selon la voie d'administration sous-cutanée (AS)
ou intranasale (AN) la solution de split trivalent est
respectivement préparée en Phosphate Buffered Saline ou en
eau stérile.
3) Méthodes.
Les différentes formules (adjuvant ~ BVSM ~ Ag)
sont administrées à j0 et 21 selon le schéma suivant .
Contrôle PBS i. n.
C . Contrôle naïf i. n.
AS . Ag s. c.
AN . Ag i. n.
FA . Ag + BVSM i. n.
Ax . Ag + Adj X i. n.
FX . Ag + BVSM + Adj X i. n.
L'immunogénicité est évaluée après le rappel, à
j35
au niveau sérique, détection par ELISA des IgG
spécifiques de chaque split monovalent
- au niveau muqueux, détection par ELISA dans
les sécrétions nasales et/ou vaginales des IgA spécifiques
de chaque split monovalent.
a) Immunisation des souris.
- Administrations.
L'administration des formules (BVSM ~ Adj ~ Ag)
est réalisée sans anesthésie soit par voie .
. sous-cutanée . 100 u1 à la seringue de 1 ml au
niveau dorsal pour les contrôles,
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nasale . 20u1 (10 ul/narine) à la micropipette
de 10 u1 pour les échantillons testés et les contrôles,
Pour chaque groupe l'immunisation comprend deux
administrations, à JO et J21 effectuées selon le même mode.
- Prélèvement sanguin.
Un prélèvement sanguin d'environ 0,3 ml est
réalisé à la veine rétroorbitale à JO (contrôle) et J35.
Après formation d'un caillot et centrifugation
le sérum est congelé à -20°C jusqu'à utilisation.
. Prélèvement des sécrétions nasales.
Le lavage des cavités nasales est réalisé à
l'aide de 500 ~1 de tampon phosphate salin - BSA 1~
introduit dans la trachée en direction des turbines nasales.
L'opération est ainsi répétée 3 fois avec le même PBS- BSA
1~. Le prélèvement nasal est conservé dans un tube Eppendorf
à -20°C. Les sécrétions nasales sont récupérées à J35.
b) Analyse des prélèvements.
L'analyse des sérums et des sécrétions nasale
est réalisée par un test ELISA. Brièvement, les microplaques
(Nunc, Immunoplate maxisorb, polylabo) sont coatées par le
vaccin de la grippe (100 ng de HA/puits dans un tampon
carbonate, pH 9,6, 2h00 à 37°C). Après rinçage ( trois fois
en tampon PBS-tween pH 7,6) puis saturation par 250 ~l/puits
d'une solution de PBS-BSA 3% (1h00 à 37°C), les gammes de
sérums ou de sécrétions nasales sont incubées 1 heure à
37°C. et rincées de nouveau avec une solution de PBS-tween,
pH 7,6. Après rinçage (trois fois) les anticorps sont
détectés par des anti IgG murines (réf. A4416 Sigma) ou ,
anti IgA murines (réf. A4789 Sigma), couplés à la
péroxydase. Après une dernière étape de rinçage (cinq fois),
le substrat OPD est ajouté (réf. P8287, Sigma 1 pastille
dans 5 ml de tampon de révélation + 50u1 d'H202, 100
~..L1/puits). Après 30 minutes d'incubation à 37°C, l'acide
chlorydrique 1N (réf. 30024-290, Prolabo) est ajouté
(50~.z1/puits) et l'absorbance est mesurée à 490 nm. Les
titres sont définis comme l'inverse de la dilution
permettant d'obtenir une DO de 0,1.
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II - Influence du mode de preparation des
formulations BVSMTM/ Adjuvant /influenza.
Afin d'évaluer le meilleur mode de préparation
des formulations BVSM / Adjuvant / Influenza, l'association
de split Influenza sur les BVSM est étudiée en présence
d'adjuvant (CTB ou MPL) en utilisant la résonnance
plasmonique de surface (RPS) Biacore X (Pharmacia Biosensor
Inc.). Dans cette étude, 201 d'une suspension de BVSM
(50pg/ml en PBS 0,3 X) sont introduits sur des sensorchips
hydrophobes (HPA, Biacore, BR-1000-30) à 5~.z1 /min.
La figure 9 montre le sensorgramme obtenu par
association de la CTB et des BVSM immobilisés sur la
sensorchip HPA en fonction de la concentration en CTB ( 1)
2,5ug/ml ; 2) 25ug/ml ; 3) 250ug/ml en PBS 45mM ) (ce qui
correspond à 0,3 X).
La figure 10 montre le sensorgramme obtenu par
association du MPL et des BVSM immobilisés sur la sensorchip
HPA en fonction de la concentration en MPL (1) 1,56ug/ml ;
2) 3,125ug/ml ; 3) 6,25ug/ml ; 4) 12,5ug/ml ; 5) 25ug/ml ;
6) 50~zg/ml en PBS 45mM) .
Dans les deux cas, CTB et MPL, les sensorgrammes
obtenus confirment la capacité d'association des BVSM et des
adjuvants.
Le mode de préparation des formulations
BVSM/Adjuvant/split Influenza est alors étudié. Deux
méthodes sont utilisées .
Dans la première, une solution d'adjuvant est
introduite avant l'ajout du split Influenza.
Dans la seconde, le split Influenza est
introduit avant l'ajout de l'adjuvant.
La figure 11 résume les résultats obtenus dans
le cas d'un split B Harbin. Des quantités variables de CTB
sont introduites sur les BVSM immobilisés ( 1) Pas de CTB,
2) 2,5Mg/ml, 3) 25ug/ml, 4) 250ug/ml en PBS 45mM ). Le split
monovalent B Harbin à 25~zg/ml est ensuite déposé sur le BVSM
adjuvanté. On note clairement une inhibition de
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l'association du split sur le BVSM lorsque la CTB est
ajoutée avant le split.
De la même façon, la figure 12 résume les
résultats obtenus dans le cas du MPL et d'un split B Harbin.
5 Des quantités variables de MPL sont introduites sur les BVSM
immobilisés ( 1) 1,56~g/ml ; 2) 3,12ug/ml ;
3 ) 6 , 2 5~.zg/ml ; 4 ) 12 , 5~zg/ml ; 5 ) 2 5~zg/ml ; 6 ) 5 0}zg/ml en
PBS 45 mM ). Le split à 25ug/ml est ensuite déposé sur les
BVSM adjuvantés. Comme pour la CTB et proportionnellement à
10 la quantité de MPL, il existe une inhibition de
l'association du split sur les BVSM lorsque l'adjuvant est
ajoutê avant le split.
La figure 13 représente les sensorgrammes
obtenus en comparant les deux modes de préparation dans le
15 cas de la CTB. En A, la CTB est ajoutée sur les BVSM
immobilisés, puis le split monovalent est introduit.
En B, le split monovalent est ajouté sur les
BVSM immobilisés, on introduit ensuite la CTB.
On constate que lorsque l'antigène est ajouté
20 avant la CTB, il existe une diminution de cette association
du split sur les BVSM. A l'inverse, lorsque la CTB est
ajoutée après le split, le BVSM permet l'association d'une
quantité supplémentaire de matériel correspondant à la CTB.
Ainsi pour préserver le rôle du BVSM comme " Antigen
25 Carrier ", il est important de maintenir un mode de
préparation dans lequel la CTB est ajoutée sur les
formulations BVSM/split.
De la même façon, la figure 14 représente les
sensorgrammes obtenus en comparant les deux modes de
30 préparation dans le cas du MPL.
En A, le MPL est abouté avant le split. En B,
c'est l'inverse.
Lorsque l'antigène est ajouté avant le MPL, il
n'existe pas de modification significative de l'association
split/BVSM, mais le BVSM permet d'associer une quantité
supplémentaire de matériel correspondant au MPL.
Il semble donc possible de définir un mode de
préparation des formulations adjuvantées dans lequel .
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- l'adjuvant est ajouté sur les formulations
BVSM/antigène
- le rôle du BVSM comme " Antigen Carrier " est
préservé.
III - Effet de la CTB sur la réponse
immunologique des formulations BVSM/Influenza.
1) Protocole.La formulation antigène + BVSM~" est
préparée comme mentionné dans la partie " Matériel et
méthodes ".
Un contrôle est réalisé dans les mêmes
conditions mais en absence de BVSMT"" aboutissant à un Split
trivalent à 250~.zg d' HA ( 831.zg/souche) /ml .
Une solution de CTB est ajoutée sur chacune de
ces préparations afin d'obtenir les formulations et
contrôles correspondants adjuvantés.
36 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10
semaines au début de l'étude) sont divisées en 6 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le
traitement est réalisé comme décrit précédemment. Le tableau
1 ci-dessous résume le traitement de chaque groupe.
Tableau 1
Code Groupe Route Formule
(nombre administre
de Quantit
souris) / dose
C Contrle i.n. 20 ~1 PBS 80mOsm/kg '
naf
FA Ag + BVSM . i . 3 , 6 ~g + 3 2 0 , 4 ~.,Ig
n . HA BVSM
AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~g HA
AN Ag i.n. i.n. 3,6 ~g HA
F~TB Ag + BVSM + CTB i.n. 3,6 ~g HA + 320,4 ~g BVSM
+ 1 ~.Ig
CTB
A~TB Ag + CTB i . 3 , 6 ~g + 1 ~.lg CTB
n . HA
Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements
sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales et leurs
analyses comme indiqué dans la partie " Matériel et
méthodes ".
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2) Résultats.
La figure 15 résume les résultats obtenus en
titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums
(IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris. Elle permet
de comparer les résultats des formulations trivalentes
contenant la CTB (F-CTB)à différents témoins. Ces témoins
sont soit des témoins antigènes seuls, soit des témoins
antigènes associés à la CTB, soit la formulation de
référence (ratio HA / BVSM . 1/89). Ces résultats ont été
confirmés par l'analyse de la réponse individuelle contre
les split B/Harbin et A/Nanchang.
De façon attendue, la formulation de référence
(FA) induit un taux d'anticorps de type G équivalent au
témoin antigène seul administré par voie sous cutanée (AS)
et un taux plus élevé d'IgG que le témoin seul administré
par voie nasale (AN) (22,4X).
Les témoins antigènes associés à la CTB ( ACTB)
administrés par voie nasale induisent des IgG nettement plus
élevés que l'antigène libre administré par la même voie
(augmentation de 22,4X). Parallèlement ces formulations (Ag
+CTB) (ACTB) induisent une forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant CTB (FCTB)
induit une réponse IgG spécifique nettement supérieure à la
formulation de référence (FA) et à son témoin de référence
(ACTB). Pour cet adjuvant, il existe une effet de synergie
important entre la CTB et les BVSMT"" ainsi, les taux d'IgG
sérique obtenus sont multipliés par un facteur de 3,7 par
rapport à la formulation de référence FA. A l'inverse, et en
présence d'une activité adjuvante mucosale importante de la
CTB, avec certainement un effet de saturation de la réponse
biologique, il est difficile à ce stade de définir le
potentiel de synergie de la réponse IgA pour ce type
adjuvant et les BVSM~".
IV - Effet du MPL sur la réponse immunoloqic~ue
des formulations BVSM~/Influenza.
1 ) Protocole .
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Une formulation trivalente et le contrôle
correspondant sont préparés à 250 pg d'HA/ml (83,3
ug/souche)/ de split Influenza.
Une solution de MPL est ajoutée sur chacune de
ces préparations afin d'obtenir les formulations et
contrôles correspondants adjuvantés.
36 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10
semaines au début de l'étude) sont divisés en 6 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le
traitement est réalisé comme décrit dans la partie
" Matériel et méthodes ". Le tableau 2 ci-dessous résume le
traitement de chaque groupe.
Tableau 2
,Code Groupe Route Formule administre
(nombre de souris) Quantit/dose
C Contrle naf (6) i.n. 20 ~.ll PBS 80mOsm/kg
FA Ag + BVSM i . 3 , 6 ~g HA + 32 0 , 4
n . )..lg BVSM
AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~.tg HA
AN Ag i.n. i.n. 3,6 ~,HA
FMPL Ag + BVSM + MPL i . 3 ' 6 ~,.l.g HA + 3 2 0
n . , 4 ~..l,g BVSM
+ 5 ~Lg MPL
AMPL Ag + MPL i.n. 3 flg HA + 5 ~.ig MPL
Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements
sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales comme
décrit dans la partie méthodes.
L'analyse des sérums et des sécrétions nasale
est réalisée par test ELISA.
2) Résultats.
La figure 16 résume les résultats obtenus en
titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums
(IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrés
avec les formulations adjuvantées par le MPL. Ces résulats
ont été confirmés par l'analyse de la réponse individuelle
contre les split B/Harbin et A/Nanchang.
Les split influenza virus associés au BVSMTM ou
au MPL administrés par voie nasale induisent une réponse IgG
sérique nettement plus élevés que l'antigène libre
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administré par la même voie (augmentation respective de
22,4X et 7,3X). Parallèlement ces formulations induisent une
forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant MPL induit
une réponse IgG spécifique similaire à la formulation de
référence. A l'inverse, pour cet adjuvant il existe un effet
de synergie important entre le MPL et les BVSMTM. Ainsi les
taux d'IgA obtenus sont multipliés par un facteur de 2.7 par
rapport à la formulation de réf. (Ag/BVSM) (FA). Ainsi, à
l'inverse de la réponse IgG, un fort potentiel de synergie
entre la MPL et les BVSMTM peut être démontré pour la réponse
mucosale.
V - Effet des Oliqonucleotides sur la reponse
immunologigue des formulations BVSM/Influenza.
1 ) Protocole .
Une formulation trivalente et le contrôle
correspondant sont préparés à 250 ug d'HA/ml (83,3
ug/souche)/ de split Influenza
Une solution d'oligonucléotide (ODN) est ajoutée
sur chacune de ces préparations afin d'obtenir les
formulations et contrôles correspondants adjuvantés.
42 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10
semaines au début de l'étude) sont divisés en 7 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le
traitement est réalisé comme décrit dans la partie
" Matériel et méthodes ". Le tableau 3 résume le traitement
de chaque groupe.
Tableau 3
Code Groupe Route Formule administre
(nombre de souris) Quantit/dose
C Contrle naf i.n. 20 X11 PBS 80mOsm/kg
FA Ag + BVSM i . 3 , 6 dag HA + 32 0 , 4
n . ~.tg BVSM
AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~g HA
AN Ag i.n. i.n. 3,6 ~..~g HA
FODN Ag + BVSM + ODN i.n. 3'6 ~g HA + 320,4 ~g BVSM
'
+ 1 ~..lg ODN1
AoDrr Ag + ODN i .
n . 3 , 6 ~..lg HA + 1 ~.Lg
ODN1
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Pour chaque groupe, on réalise les prélèvements
sanguins et les prélèvements de sécrétions nasales comme
indiqué dans la partie méthode.
5 L'analyse des sérums et des sécrétions nasales
est réalisée par test ELISA comme décrit précédemment.
2) Résultats.
La figure 17 résume les résultats obtenus en
10 titration spécifique du split B/Harbin des pools de sérums
(IgG) et des sécrétions nasales (IgA) de souris administrées
avec les formulations adjuvantées par les oligonucléotides.
Ces résulats ont été confirmés par l'analyse de la réponse
individuelle contre les split B/Harbin et A/Nanchang.
15 Les split influenza virus associé au BVSMTM ou
aux ODN administrés par voie nasale induisent une réponse
IgG sérique nettement plus élevée que l'antigène libre
administré par la même voie (augmentation respective de
22,4X et 7,3X). Parallèlement ces formulations induisent une
20 forte immunité mucosale.
La formulation associée à l'adjuvant ODN induit
une réponse IgG supérieure à la formulation de référence et
à son témoin de référence (Ag + ODN) . Pour cet adjuvant, il
semble exister une additivité des réponses, les titres IgG
25 obtenus pour la formulation étant égaux à la somme des
réponses obtenues pour l'antigène + ODN1(ApDNl) et pour la
formulation de référence (Ag + BVSMTM) (FA).
VI - Modification de la balance IqG2a/IqGl par
30 ad~uvantation des formulations BVSM/Influenza.
1 ) Protocole .
Une formulation trivalente et le contrôle
correspondant sont préparés à 250 ~Zg d'HA/ml (83,3
35 ug/souche)/ de split Influenza. A partir de la formulation
trivalente, trois formulations adjuvantées sont obtenues:
BVSMTM /Ag/CTB: Par ajout sur la formulation
trivalente d'une solution de CTB.
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BVSMTM /Ag/IL2: Par ajout sur la formulation
trivalente d'une solution d'IL-2 recombinante
BVSMTM /Ag/MPL: Par ajout sur la formulation
trivalente d'une solution de MPL
54 souris femelles BALB/cJ/Rj (âgées de 10
semaines au début de l'étude) sont divisés en 9 groupes à
raison de 6 souris par groupe. Pour chaque groupe le
traitement et les prélèvements sont réalisés comme décrit
dans la partie " Matériel et méthodes ".
Le tableau 4 ci-dessous récapitule ces
traitements.
Tableau 4
Code Groupe Route Formule administre
(nombre Quantit/dose
de
souris)
C Contrle i.n. 20 ~l PBS mOsm/kg '
naf 80
FA Ag + BVSM i . 3 , 6 ~..lg 3 2 0 BVSM
n HA + , 4
. ~..Lg
AS Ag s.c. s.c. 3,6 ~..lg
HA
3 ' 6 ~..tg 3 2 0 BVSM
HA + , 4
~.I,g
FcTB Ag + BVSM + CTB i .
n
.
+ 1 ~..lg
CTB
AcTS Ag + CTB i . 3 , 6 E.l,g 1 ~.Ig
n HA + CTB
.
3 ' 6 j~g 3 2 0 BVSM
HA + , 4
~.lg
FMPL Ag + BVSM + MPL i .
n
.
+ 5 ~tg MPL
AMPL Ag + MPL ( 6 ) i . 3 ~.Lg HA ~.~g
n + 5 MPL
.
3'6 ~..lg 320,4 BVSM
HA + ~..lg
FIL Ag + BVSM + IL-2 i.n. + 0, 613 ~.lgL-2
I
3' 6 ~.lg 0, 613 IL-2
HA + ~.Lg I
AIL Ag + IL-2 i.n. I
L'analyse des sérums est réalisée par test ELISA
tel que décrit précédemment, en utilisant soit un anti IgG2a
murine, soit un anti IgGl murine.
2) Résultats.
Le tableau 5 ci-dessous résume les résultats
obtenus en terme de sous-type de gamma globuline (IgG2a et
IgGl) des différentes formulations BVSMTM/influenza
adjuvantées et des contrôles correspondants après
administration nasale. Par rapport à l'antigène libre
administré par voie sous-cutanée, la formulation
BVSMTT'/influenza administrée par voie nasale induit une
modeste augmentation de production IgG2a spécifique.
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Par comparaison l'adjonction de la CTB à la
formülation Ag/BVSMTM induit une nette augmentation de la
production Ig2a (multiplication par 5.4 de l'index Ig2a/Igl
versus Ag S.c). Il est important de noter que cette
modification de la balance Thl/Th2 n'est pas prévisible à
partir des résultats obtenus par l'association de la CTB aux
antigènes. En effet, dans ce groupe contrôle, il existe un
abaissement de l'index Ig2a/IgGl.
Tahl eam 5
Route IgG2A IgGl Index Ratio versus
IgG2a/IgGl Ag s.c.
Contrle naf i.n. 0 0 0 0,0
Ag s.c. s.c. 157 233556,7 1,0
Ag i.n. i.n. 0 9793 0,0 0,0
Ag+BVSM i.n. 572 656998,7 1,3
Ag+CTB i.n. 87 447711,9 0,3
Ag+BVSM+CTB i.n. 2506 6887736,4 5,4
Ag+MPL i.n. 143 3003 47,6 7,1
Ag+BVSM+MPL i.n. 101 105619,6 1,4
Ag+IL-2 i.n. 0 3234 0,0 0,0
Ag+BVSM+IL-2 i.n. 26 249521,0 0,2
A l'inverse, le MPL qui lorsqu'il est associé au
split influenza favorise la production IgG2a (index 47.6
versus 6.7 pour les Ag s.c) n'entraîne qu'une modification
mineure de la balance Thl/Th2 après association avec les
formulation Ag/BVSMTM.
Finalement, l'association ILZ aux formulations
Ag/BVSMTM permettent de modifier la balance Thl/Th2 comme
nous pouvons le visualiser sur l'abaissement de l'index
IgG2a/Igl.
Ainsi, même en absence de modification
quantitative de la réponse immunologique l'association
d'adjuvant aux formulations Antigène/BVSMTM permet d'induire
une modification qualitative de la réponse immunologique.
Cette association devrait permettre par un choix correct de
l'adjuvant utilisé d'adapter la balance Thl/Th2 à la
stratégie vaccinale proposée.
