Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
1
Utilisation, en association, d'une activité de purine et d'une activité d'AINS
dans la préparation d'un médicament antithrombotique et/ou anti-inflammatoire
L'invention a pour objet l'utilisation, en association, d'une activité de
purine et
d'une activité d'agent anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) dans la
préparation d'un
médicament destiné à être utilisé comme agent antithrombotique et/ou anti-
inflammatoire.
On sait que la lési6n d'un vaisseau sanguin conduit à l'activation du système
de coagulation et à l'agrégation des plaquettes sanguines (ou thrombocytes).
Il en résulte
la formation d'un caillot constitué de filaments de fibrine dans lesquels sont
emprisonnées
des plaquettes. Ce caillot obture la plaie, ce qui permet l'arrêt de
l'hémorragie et à terme
le retour à une circulation normale du sang.
Il arrive aussi qu'un caillot (ou thrombus) se forme sans nécessité dans un
vaisseau sanguin. Un tel caillot, constitué d'agrégats plaquettaires qui se
déposent souvent
au niveau des plaques d'athérosclérose artérielles, peut alors provoquer un
infarctus
cardiaque, cérébral, ou autre, ou encore l'ischémie aiguë d'une artère du bras
ou de la
jambe. Un faible débit du flux sanguin augmente le risque d'apparition d'un
thrombus,
notamment dans le réseau veineux des membres inférieurs, et un caillot détaché
de ce
thrombus peut être entraîné vers une artère pulmonaire qu'il obstrue,
provoquant ainsi une
embolie pulmonaire.
Dans la prophylaxie des thromboses, on peut utiliser des anticoagulants, mais
aussi des inhibiteurs de l'agrégation plaquettaire. Les inhibiteurs de la
cyclooxygénase
peuvent inhiber notamment la synthèse du thromboxane A2, lequel possède à la
fois des
propriétés agrégantes et vasoconstrictrices. Les inhibiteurs de la
cyclooxygénase sont
donc susceptibles de constituer des médicaments antithrombotiques
intéressants. On
utilise actuellement l'aspirine à faible dose dans cette indication.
On sait aussi que les nucléotides sont impliqués dans de nombreux processus
physiologiques, y compris le tonus vasculaire, les contractions cardiaques et
l'agrégation
plaquettaire.
En particulier, il est connu que l'ADP joue un rôle-clé dans l'induction de
l'agrégation des plaquettes par l'intermédiaire de certains récepteurs P2
plaquettaires, en
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
2
particulier les récepteurs P2X1, P2Y1 et P2T. L'AMP agit notamment par
l'intermédiaire
de récepteurs P1 (en particulier les récepteurs PlA2a).
On a maintenant découvert que l'association d'une activité de purine et d'une
activité d'ami-inflammatoire non stéroïdien (AINS), permet d'obtenir un effet
de synergie
potentialisatrice dans l'inhibition de l'agrégation plaquettaire. Cette
association peut être
réalisée soit par administration d'un produit agissant sur les récepteurs
purinergiques et
d'un AINS, soit par administration d'un produit dans lequel une ou plusieurs
molécules de
purine sont liées par covalence à une ou plusieurs molécules d'AINS,
éventuellement par
l'intermédiaire d'au moins un bras espaceur. De tels produits sont notamment
des produits
de formule I qui seront décrits ci-après.
On peut mentionner ici, comme exemple d'activité de purine, soit une activité
d'agoniste sur les récepteurs impliqués dans l'inhibition de l'agrégation
plaquettaire et
ayant pour ligands naturels l'AMP et/ou l'adénosine (par exemple les
récepteurs de type
P1), soit une activité d'antagoniste sur les récepteurs impliqués dans
l'agrégation
plaquettaire (récepteurs pro-agrégants) et ayant pour ligand naturel l'ADP
(par exemple
les récepteurs de type P2).
On a en outre découvert que l'AMP, utilisé seul, possède une activité anti-
agrégante, et l'AMP peut aussi être utilisé comme ingrédient actif dans la
préparation d'un
médicament anti-agrégant. '
On sait par ailleurs que l'inflammation est la réponse d'un tissu vivant
vascularisé à une lésion locale (traumatisme, infection, irritation par des
produits
chimiques, etc). L'inflammation des tissus se traduit notamment par des
symptômes tels
que rougeur, gonflement, douleur. La lésion engendre initialement une
vasodilatation
accompagnée d'une augmentation de la perméabilité vasculaire, favorisant la
migration
de leucocytes vers le site .lésé. Divers médiateurs chimiques participent. à
la réaction
inflammatoire, parmi lesquels on peut citer en particulier les métabolites de
l'acide
arachidonique (AA). Ces métabolites agissent localement sur les vaisseaux
sanguins et
sur le site lésé, puis ils sont rapidement détruits. L'acide arachidonique est
un constituant
des phospholipides de la membrane des cellules. Sous l'action de divers
stimuli, les
phospholipases membranaires libèrent l'AA qui est alors l'objet de
transformations
métaboliques dont les deux plus importantes sont liées à son utilisation comme
substrat
pour les cyclooxygénases (ou Cox) et les lipooxygénases (ou Lipox). Les
cellules
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
3
produisant l'AA pendant la réponse inflammatoire sont principalement les
leucocytes et
les plaquettes.
La voie de la cyclooxygénase conduit à la production de prostaglandines et de
thromboxanes, qui ont de nombreuses activités biologiques, pouvant dépendre
des
cellules qui les produisent. Parmi ces activités biologiques, on peut citer la
vasodilatation,
l'augmentation de la perméabilité vasculaire, l'augmentation des sensations
douloureuses,
l'induction de la fièvre, etc.
La voie lipooxygénase conduit aux leucotriènes, qui contribuent à
l'inflammation dans diverses pathologies telles que : arthrite rhumatoïde,
asthme,
psoriasis, goutte, etc.
Les substances anti-inflammatoires les plus efficaces actuellement connues
agissent sur le métabolisme de l'acide arachidonique : les anti-inflammatoires
stéroïdiens
inhibent la phospholipase, tandis que les anti-inflammatoires non stéroïdiens
(AINS)
inhibent la cyclooxygénase, et inhibent donc la formation des prostaglandines
et des
. thromboxanes.
On sait qu'il existe deux isoenzymes de la cyclooxygénase, à savoir la Cox-1,
qui est exprimée de façon permanente, notamment dans l'estomac, et la Cox-2,
forme
inductible qui n'est exprimée qu'au cours des réactions inflammatoires. La Cox-
1 produit
dans l'estomac des prostaglandines qui ont pour fonction de protéger la
muqueuse
gastrique contre l'acidité ambiante. La plupart des AINS inhibent à la fois la
Cox-1 et la
Cox-2, et il en résulte des effets secondaires fâcheux comme l'altération de
la muqueuse
gastrique, avec risques d'hémorragies ou de formation d'un ulcère. On connaît
maintenant
des AINS (par exemple le rofecoxib et le celecoxib) qui ne présentent pas .cet
inconvénient, car ce sont des inhibiteurs spécifiques de la Cox-2.
On sait également que certaines purines, par exemple l'adénosine et l'AMP,
sont des agents anti-inflammatoires. Par exemple, l'adénosine (endogène ou
exogène)
protège les cellules contre certains radicaux libres oxydants, et inhibe les
leucocytes
neutrophiles. L'AMP inhibe la migration de leucocytes lors de l'inflammation.
En outre,
l'adénosine intervient dans le mécanisme d'action du méthotrexate et de la
sulfasalazine,
utilisés dans le traitement de l'arthrite rhumatoïde. L'adénosine inhibe
aussi, chez les
humains, la libération de diverses cytokines pro-inflammatoires telles que IL-
6, IL-8,
IL-12, TNF.
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
4
On a maintenant découvert que l'association d'une activité de purine et d'une
activité d'AINS permet d'obtenir un effet de synergie potentialisatrice dans
l'inhibition de
la réaction inflammatoire. Cette association peut être réalisée soit par
administration
d'une purine et d'un AINS, soit par administration d'un produit dans lequel
une ou
plusieurs molécules de purine sont liées par covalence à une ou plusieurs
molécules
d'AINS, éventuellement par l'intermédiaire d'au moins un bras espaceur. De
tels produits
sont notamment des produits de formule I qui seront décrits ci-après.
L'invention a donc pour objet l'utilisation, en association, d'une activité de
purine et d'une activité d'AINS, comme ingrédients actifs dans. la préparation
d'un
médicament destiné à combattre les thromboses et/ou l'inflammation.
Dans la présente demande, on entend par "purine" notamment les nucléosides
et nucléotides à base purique et en particulier l'adénosine ainsi que les
phosphates
correspondants, notamment l'AMP, l'ADP et l'ATP, la guanosine, le GMP, le GDP,
le
GTP, l'inosine ainsi que ses mono-, di- et triphosphates, et leurs dérivés ou
analogues,
notamment leurs sels acceptables en pharmacie (par exemple chlorhydrates de
nucléosides ou de nucléotides à fonction amine, ou sels alcalins des
nucléotides). Plus
généralement, on . entend également par "purine" toute substance capable
d'agir sur les
récepteurs puriniques, également appelés récepteurs purinergiques (notamment
récepteurs
P1 sensibles à l'AMP et à l'adénosine, et récepteurs P2, sensibles à l'ADP et
à l'ATP). De
telles substances sont connues ou peuvent être recherchées selon des méthodes
connues.
Une activité de purine est une activité obtenue par la présence d'une purine
telle qu'elle
vient d'être définie. Parmi les analogues de purines, on peut citer en
particulier,
notamment dans le cas de la préparation d'un médicament anti-agrégant, les
agonistes des
récepteurs de type P1 et les antagonistes des récepteurs de type P2. De tels
produits
agonistes ou antagonistes sont connus ; voir par exemple le site www.sigma-
aldrich.com,
rubrique RBI. En outre, la recherche de tels agonistes ou antagonistes peut
être effectuée
selon les méthodes connues par de simples expériences de routine. Bien
entendu, dans la
préparation d'un médicament anti-agrégant par association d'une purine et d'un
AINS, on
n'utilise pas l'ADP (ni ses agonistes) comme ingrédients actifs.
Dans la présente demande, de façon générale, on appelle "dérivés" tous
produits qui sont obtenus par la modification d'une fonction chimique ou d'un
atome ou
groupe d'atomes d'un produit actif, et qui ont une activité physiologique de
même type
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
que le produit actif. A titre d'exemples, les dérivés de produits actifs ayant
des fonctions
acides peuvent être notamment les sels (par exemple sels de sodium ou sels
d'autres
métaux alcalins, ou encore sels formés avec des amines, par exemple sels de
pipérazine
ou sels de lysine), ou les esters formés par lesdits acides avec des alcools,
ou les amides
5 formés par ces acides avec des amines ; les dérivés de produits actifs ayant
des fonctions
amines sont notamment les amides et les sels d'addition formés par ces amines
avec des
acides ; les dérivés de produits actifs ayant des fonctions alcools sont
notamment les
esters formés par lesdits alcools avec des acides.
Les anti-inflammatoires non stéroïdiens, ou AINS, constituent une classe
connue d'ami-inflammatoires, qui ont plusieurs propriétés en commun, et en
premier lieu
une activité d'inhibition de la cyclooxygénase qui leur donne la capacité
d'inhiber la
synthèse des prostaglandines. Les AINS ont d'autres propriétés en commun, et
notamment le découplage de la phosphorylation oxydative, des modifications des
mouvements intracellulaires des ions calcium, l'activation de la synthèse de
la NO
synthase inductible, l'action sur les facteurs nucléaires kappa, etc. Il est
possible que l'une
ou plusieurs de ces propriétés soit à l'origine de l'effet potentialisateur
des AINS sur les
purines, mais il est également possible que d'autres propriétés, connues ou
inconnues,
soient impliquées.
Parmi les anti-inflammatoires non stéroidiens, on peut citer par exemple (voir
notamment THE MERCK INDEX, 12e édition, Therapeutic Category and Biological
Activity Index)
- les dérivés d'acides aminoarylcarboxyliques tels que : acide enfénamique,
acide étofénamique, acide flufénamique, isonixine, acide méclofénamique, acide
méfénamique, acide niflumique, talniflumate, térofénamate, acide tolfénamique
;
- les dérivés d'acides arylacétiques tels que : aceclofenac, acemétacine,
alclofenac, amfenac, amtolmetine guacile, bromfenac, bufexamac, cinmétacine,
clopirac,
diclofénac, etodolac, felbinac, acide fenclozique, fentiazac, glucamétacine,
ibufenac,
indométacine, isofezolac, isoxepac, lonazolac, acide metiazinique, mofezolac,
oxamétacine, pirazolac, proglumétacine, sulindac, tiaramide, tolmétine,
tropésine,
zomepirac ;
- les dérivés d'acides arylbutyriques tels que : bumadizon, butibufène,
fenbufène, xenbucine ;
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
6
- les dérivés d'acides arylcarboxyliques tels que : clidanac, ketorolac,
tinodirine ;
- les dérivés d'acides arylpropioniques tels que . alininoprofène,
benoxaprofène, bermoprofène, acide bucloxique, carprofène, fénoprofène,
flunoxaprofène, flurbiprofêne, ibuprofène, ibuproxam, indoprofène,
kétoprofène,
loxoprofène, naproxène, oxaprozine, piketoprofène, pirprofène, pranoprofène,
acide
protizinique, acide méthiazinique, suprofène, acide tiaprofénique,
ximoprofène,
zaltoprofène, maproxen ;
- les dérivés d'acide salicylique tels que . acétaminosalol, aspirine,
benorylate, bromosaligénine, acétylsalicylate de calcium, diflunisal,
etersalate, fendosal,
acide gentisique, salicylate de glycol, salicylate d'imidazole,
acétylsalicylate de lysine,
mésalamine, salicylate de morpholine, salicylate de 1-naphtyle, olsalazine,
parsalinide,
. acétylsalicylate de phényle, salicylate de méthyle, salicylate de phényle,
salacétamide,
acide [2-(aminocarbonyl) phénoxy~ acétique, acide salicylsulfurique,
salsalate,
sulfasalazine, aspalatone ; ainsi que les esters nitriques des salicylates ou
de l'aspirine tels
que le 2-acétoxybenzoate de 2-(2-nitroxy) -butyle et le 2-acétoxybenzoate de
2(2-nitroxyméthyl) phényle ;
- d'autres dérivés d'acides carboxyliques tels que . acide
s-acétamidocaproïque, acide 3-amino-4-hydroxybutyrique ;
- des dérivés de pyrazole ou de pyrazolone tels que : difénamizole,
épirizole, apazone, benzpiperylon, feprazone, suxibuzone, bumadizone,
clofézone,
kébuzone, mofébutazone, proxifézone, morazone, oxyphenbutazone,
phénylbutazone,
pipébuzone, propyphénazone, pyrazinophénazone, ramifenazone,
thiazolinobutazone,
tolinétine, antipyrine, noramidopyrine, dipyrone, azapropazone, celecoxib ;
- les dérivés de thiazinecarboxamides tels que : ampiroxicam, droxicam,
isoxicam, lornoxicam, piroxicam, tenoxicam ;
- d'autres anti-inflammatoires tels que : S-adénosyhnéthionine, amixétrine,
bendazac, benzydamine, a-bisabolol, bucolome, difenpiramide, ditazol,
emorfazone,
fepradinol, guaiazulène, nabumetone, nimesulide, oxaceprol, paranyline,
perisoxal,
proquazone, tenidap, zileuton, rofecoxib ;
ainsi que les donneurs de monoxyde d'azote dérivés d'AINS tels que les esters
nitriques et les dérivés nitro ou nitroso qui sont décrits dans les brevets et
demandes de
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
7
brevet EP 0 670 825, US 5 700 947, WO 95/30641, US 5 703 073, US 6 043 232 et
US 6 043 233, dont le contenu est incorporé dans la présente description par
référence.
Dans la liste d'AINS qui précède, la dénomination commune internationale
désigne aussi bien les ingrédients actifs de base que leurs dérivés immédiats
utilisables en
pharmacie (par exemple les acides, et aussi leurs sels).
Les AINS; y compris les AINS à groupe carboxylique, sont des produits
connus, décrits notamment dans THE MERCIS INDEX 12e édition, dont le contenu
(y
compris les données et les références concernant les AINS) est incorporé dans
la présente
description par référence.
Parmi les anti-inflammatoires utilisables, il peut être intéressant de choisir
un
produit qui inhibe sélectivement ou préférentiellement la Cox-2 (par exemple
rofecoxib,
celecoxib, nabumetone).
Les ingrédients actifs d'un médicament obtenu conformément à l'invention
peuvent être présentés de façon séparée, chacun sous une forme pharmaceutique
appropriée, et réunis dans un même emballage.
Mais pour faciliter l'administration simultanée des ingrédients actifs, on
préfère généralement préparer le médicament sous une seule forme
pharmaceutique
contenant les deux ingrédients actifs, ainsi éventuellement qu'un excipient
pharmaceutique approprié.
Bien entendu, un produit ayant à la fois une activité de purine et une
activité
d'AINS doit être considéré comme constituant à lui seul une combinaison ayant
les deux
types d'activités, et peut donc être utilisé conformément à l'invention comme
ingrédient
actif unique. Par exemple, une purine et un AINS peuvent être combinés en
établissant
une liaison chimique entre les deux molécules. On peut notamment amidifier une
fonction amine de la purine, ou estérifier une ou plusieurs fonctions alcool
du produit à
activité de purine, avec un groupement acide présent dans un AINS à fonction
carboxylique tel que par exemple l'acide acétylsalicylique, l'acide
méfénamique, le
diclofénac, le naproxêne, l'ibuprofène, le sulindac, etc. On peut amidifier
notamment une
fonction amine de la base purique de la purine, ou estérifier une ou plusieurs
fonctions
alcool de l'ose de la purine (nucléoside ou nucléotide). On obtient ainsi un
produit
d'amidification qui possède à la fois une activité de purine et une activité
d'AINS. Des
exemples de tels produits sont les produits de formule I qui seront décrits ci-
après.
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
8
Le médicament obtenu conformément à l'invention peut être administré par
voie orale, sublinguale, nasale, pulmonaire, rectale ou parentérale (par
exemple
intravasculaire, intramusculaire, transcutanée, intra-articulaire).
A cet effet, il peut être présenté sous toute forme permettant
l'administration
par voie orale (en particulier sous la forme de gélules, de solutions ou
émulsions
buvables, de poudres, de gels, de granulés, de tablettes ou de comprimés), par
voie nasale
(par exemple des solutions à administrer sous forme de gouttes ou
de~pulvérisations), par
voie pulmonaire (solutions en flacon pressurisé pour aérosols), par voie
rectale
(suppositoires), par voie cutanée (par exemple crèmes, onguents ou dispositifs
transdermiques, encore appelés timbres ou patches), par injection (solutions
injectables,
poudres lyophilisées permettant de reconstituer des solutions injectables) ou
par voie
transmuqueuse comme par exemple par voie sublinguale (solutions en flacon
pressurisé,
ou comprimés à délitement buccal).
Ces formes pharmaceutiques sont préparées de façon usuelle et peuvent
contenir des excipients et véhicules classiques appropriés.
Le médicament de l'invention peut être préparé par exemple sous une forme
pharmaceutique permettant l'administration, à un sujet ayant besoin d'un tel
médicament,
par exemple un sujet humain, de 10 à 1000 mg de purine, par jour, et
permettant en outre
l'administration d'une dose suffisante d'AINS, par exemple une dose de 10 à
3000 mg
d'AINS par jour.
A titre d'exemple, on peut administrer une dose de 50 à 500 mg d'AMP et de
10 à 1000 mg par jour d'aspirine, chez l'humain adulte. On peut remplacer
l'AMP
notamment par des quantités équivalentes d'adénosine. Si on souhaite
substituer une autre
purine à l'AMP et/ou un autre AINS à l'aspirine, on peut facilement adapter
les gammes
de doses mentionnées ci-dessus en remplaçant une dose donnée d'AMP par une
dose
équivalente d'une autre purine et/ou en remplaçant une dose donnée d'aspirine
par une
dose équivalente d'un autre AINS. Une telle dose équivalente peut être
déterminée par
exemple à l'aide de tout test classique anti-inflammatoire. Une dose de purine
équivalente
à une dose d'AMP donnée est par 'exemple une dose capable d'avoir un effet
anti-agrégant
comparable dans les tests décrits dans la partie expérimentale ci-après.
Bien entendu, on peut adapter la posologie en fonction notamment du poids
corporel du sujet traité.
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
9
Le médicament obtenu selon l'invention peut être administré en tant qu'agent
antithrombotique et anti-agrégant notamment dans le traitement des angines de
poitrine,
des insuffisances circulatoires des membres inférieurs, dans le but de
prévenir les
infarctus chez les patients souffrant d'athérosclérose, et aussi dans le but
d'éviter la
récidive des infarctus, notamment cardiaques ou cérébraux.
Le médicament obtenu selon l'invention peut également être administré en
tant qu'agent anti-inflammatoire.dans toutes les pathologies où il convient
d'inhiber ou de
limiter la réaction inflammatoire, notamment dans le traitement de l'arthrose,
de l'arthrite
rhumatoïde, des tendinites, des crises de goutte, des maladies inflammatoires
de l'intestin,
des dysménorrhées, des oedèmes post-traumatiques, de la spondylarthrite
ankylosante, et
dans tous les cas où l'on souhaite lutter contre la douleur et contre la
fièvre.
Par ailleurs, on sait qu'après une angioplastie, la dilatation forcée d'une
artère
par un ballonnet équivaut à un traumatisme pariétal et endothélial
(l'endothélium étant le
revêtement interne de l'artère), lequel déclenche un mécanisme automatique de
réparation
cellulaire. Les cellules musculaires lisses, sous-jacentes à l'endothélium,
sécrètent divers
facteurs de croissance qui ont à ce titre un rôle promoteur essentiel. Le
danger vient de
l'excès de réaction pariétale dû à une réaction de type inflammatoire, en
regard d'une zone
elle-même anormale, avec épaississement de la paroi vasculaire, provoquant la
reconstitution d'une nouvelle sténose (ou resténose), dû à un excès de
cicatrisation. Il en
résulte qu'environ 30 % des angioplasties sont resténosées au bout de 6 mois.
On doit
alors redilater ou recourir à la chirurgie. Différentes méthodes semblent
pouvoir réduire
l'incidence des resténoses : l'usage des stems métalliques (ressorts qui
maintiennent le
vaisseau ouvert et que l'on place après dilatation), la radiothérapie i~ situ,
la libération ou
l'apport sur le site de substances anti-inflammatoires inhibitrices de la
resténose. Cette
dernière méthode est justifiée par le fait que le déclenchement de la réaction
pariétale est
un phénomène qui fait suite sans délai au traumatisme de la dilatation.
L'association d'une purine et d'un AINS (par exemple l'association aspirine-
adénosine ou sulindac-adénosine), administrée immédiatement après une
angioplastie,
peut inhiber ou réduire la resténose.
Comme indiqué ci-dessus, on peut remplacer l'association d'une purine et d'un
AINS par un produit unique dans lequel une purine, ou un analogue de purine,
est lié par
covalence à un AINS, par exemple un produit de formule I tel que décrit ci-
après.
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
L'invention a également pour objet de nouveaux produits comprenant un .
AINS et une purine, liée par covalence audit AINS, éventuellement par
l'intermédiaire
d'au moins un bras espaceur.
Ces produits sont notamment ceux qui répondent à la formule I
5 (A-)m (X)p (-B)" (I)
dans laquelle A est le reste de la molécule d'un AINS, B est le reste d'une
purine et X
représente soit une liaison covalente entre A et B, soit un bras espaceur
reliant au moins
un reste A à au moins un reste B, m est un nombre entier pouvant aller de 1 à
3, n est un
nombre entier pouvant aller de 1 à 3, et p représente zéro ou un nombre entier
au plus
10 égal au plus grand des nombres m et n. On peut en effet, selon les cas,
soit greffer un ou
plusieurs restes A et/ou B sur un seul bras espaceur, soit greffer un ou
plusieurs groupes
A-X- sur un reste B (et alors m = p et n = 1), soit greffer un ou plusieurs
groupes -X-B
sur un reste A (et alors n = p et m = 1). Lorsque p = zéro, soit un ou
plusieurs restes A
sont liés à un reste B (et n = 1), soit un ou plusieurs restes B sont liés à
un reste A
(et m =1).
Les produits de formule I peuvent être utilisés sous forme de sels, en
particulier sous forme de sels de .métaux alcalins tels que des sels de sodium
ou de
potassium ; ces sels sont par exemple ceux des groupements phosphates, s'ils
sont
présents, des groupements phénoliques (cas de l'acide salicylique), etc. On
peut
également utiliser les produits de formule I, le cas échéant, sous forme de
sels d'addition
(par exemple sous forme de chlorhydrate) lorsque ces produits contiennent un
groupement amine.
Les liaisons entre. le bras espaceur et les restes A et B sont des liaisons
covalentes. Les groupes chimiques faisant la liaison entre A et B (lorsque p =
zéro), ou
. entre A et X ou entre X et B (lorsque p est différent de zéro), sont par
exemple des
groupes ester carboxylique, amide carboxylique, ester thiocarboxylique ou
amide
thiocarboxylique.
Dans la formule I, A peut représenter notamment le reste acyle d'un AINS
possédant un groupe carboxylique (PAINS a donc pour formule A-OH) et B peut
représenter le reste d'un nucléoside ou nucléotide à base purique relié à X,
ou relié à A
(en cas d'absence de bras espaceur), par l'intermédiaire de l'azote d'une
amine primaire de
la base purique et/ou par l'intermédiaire de l'oxygène d'un groupe hydroxyle
dudit
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
11
nucléoside ou nucléotide à base purique ; par exemple un ou plusieurs groupes
A ou A-X-
peuvent être reliés à B par l'intermédiaire de l'oxygène de l'alcool primaire
dudit
nucléoside et/ou par l'intermédiaire de l'oxygène d'au moins un alcool
secondaire dudit
nucléotide. Dans ces cas, la purine dont dérive B a évidemment pour formule
BH.
Dans la formule I, ledit nucléoside ou nucléotide est notamment un
ribonucléoside ou ribonucléotide. La purine peut être choisie parmi
l'adénosine, la
guanosine et l'inosine, ainsi que les 5'-monophosphates, -diphosphates et -
triphosphates
correspondants.
Les bras espaceurs peuvent être notamment des restes bivalents de composés
aliphatiques bi-fonctionnels, (c'est-à-dire des composés ayant à chacune de
leurs
extrémités des groupes fonctionnels réactifs permettant chacun de former des
liaisons
covalentes avec A et avec B). Ces composés peuvent être par exemple des
composés qui
possèdent à la fois un groupe amino et un groupe carboxylique (ou
thiocarboxylique)a ou
encore des composés qui possèdent à la fois un groupe amino et un groupe
hydroxyle.
Dans la formule I, le groupe X (en faisant abstraction de ses groupes
fonctionnels d'extrémité) représente notamment un groupe aliphatique divalent
. . éventuellement interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes - O - ou - S -
ou par un ou
plusieurs groupements hétéroatomiques - NH - ou - CO - NH -.
Les agents espaceurs, c'est-à-dire les composés capables de donner, après
réaction avec la purine et PAINS, des produits de formule I dans lesquels A et
B sont
reliés par des bras espaceurs, sont par exemple des acides alpha-, bêta- ou
gamma-amino
alcanecarboxyliques, en particulier des acides alpha - aminés naturels tels
que la glycine,
l'alanine, la valine ou la leucine, ou encore des peptides, notamment des
dipeptides ou des
tripeptides.
Les agents espaceurs peuvent également être des acides hydroxy-
carboxyliques tels que les acides lactique, glycolique, les acides aldoniques
(gluconique,
mannonique, galactonique, ribonique, arabinonique, xylonique et érythronique)
et les
lactones ou dilactones correspondantes (par exemple lactide, glycolide, delta-
glucolonactone, delta-valéronactone), ou encore les acides aldariques.
Les groupes fonctionnels éventuellement présents sur le bras espaceur et non
impliqués dans la liaison avec un élément A ou B peuvent être utilisés pour
greffer
d'autres restes A et/ou B de façon à obtenir des composés de formule I pour
lesquels m
CA 02420066 2003-02-07
' WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
12 ~:
et/ou n sont supérieurs à 1. C'est le cas par exemple des groupes hydroxyles
des
hydroxyacides, du second groupe carboxylique des acides aminés diacides
carboxyliques,
du second groupe amino des aminoacides diaminés, du groupe hydroxyle des
acides
aminés hydroxylés, etc.
Pour préparer les composés de formule I, on utilise les méthodes classiques
de la synthêse organique. Par exemple, pour préparer des amides ou des esters,
on peut
faire réagir un composé carboxylique (AINS ou agent espaceur) sous la forme
d'un
halogénure d'acide carboxylique (ou thiocarboxylique), ou sous la forme d'un
anhydride
mixte, ou sous la forme d'un ester activé, par exemple un ester de p-
nitrophényle. On peut .
également activer l'acide à l'aide d'un agent de couplage tel que le
dicyclohexylcarbodümide.
Comme les composés de formule I comprennent des restes de nucléosides ou
nucléotides, on peut les préparer en utilisant en particulier les méthodes
connues dans la
chimie des acides nucléiques, décrites par exemple dans l'ouvrage de
I~ochetkoc et
Budovskü, Organic Chemistry of Nucleic Acids, Plenum Press,.1971 (2 volumes),
dont le
contenu est incorporé dans la présente description par référence.
Bien entendu, lorsque les composés dont dérivent A, B ou..X de la formule I,
comprennent plusieurs fonctions susceptibles de réagir, il convient d'opérer
soit en
utilisant les réactifs en proportions stoechiométriques (selon le nombre de
produits
précurseurs de A et/ou de B que l'on veut faire réagir), soit en protégeant
temporairement
les fonctions réactives dont on ne souhaite pas qu'elles réagissent. On
utilise pour cela les
méthodes de protection temporaire desdites fonctions réactives. Ces méthodes
de
protection temporaire sont bien connues, notamment celles qui ont été
développées, lors
des recherches concernant la synthèse des peptides. Par exemple, les
groupements -NH2
peuvent être protégés par des groupements carbobenzoxy, phtaloyle, t-
butoxycarbonyle,
trifluoroacétyle, toluènesulfonyle ; les groupements carboxyliques peuvent
être protégés
sous la forme d'esters benzyliques, d'esters de tétrahydropyranyle ou d'esters
de t-butyle ;
les alcools peuvent être protégés sous la forme d'esters (par exemple
acétates), sous la
forme d'éthers de tétrahydropyranyle, d'éthers benzyliques ou d'éthers de
trityle, ou
encore sous la forme d'acétals (y compris sous la forme d'acétonides dans le
cas des
glycols vicinaux). Les réactions de protection et de déprotection éventuelle
de divers
groupes chimiques sont connues et décrites par exemple dans l'ouvrage Advances
in
CA 02420066 2003-02-07
' WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
13
Organic Chemistry, Methods and Results , Vol. 3, Interscience Publishers
(1963), pages
159 et suivantes et pages 191 et suivantes, ainsi que dans l'ouvrage de T.W.
Green,
Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience Publication (1991).
Le
contenu de ces ouvrages est incorporé à la présente description par référence.
Les réactions de phosphatation ou de déphosphatation de l'alcool primaire des
nucléotides ou nucléosides peuvent être mises en oeuvre en utilisant les
enzymes
naturelles (par exemple phosphatases, phosphokinases).
Parmi les produits de formule I, on citera en particulier ceux qui répondent à
la formule Ia
A - B (Ia),
dans laquelle A et B sont définis comme précédemment. A représente
notamment le reste acyle d'un AINS possédant un groupe carboxylique, la
liaison avec B
se faisant par exemple par formation d'un amide ou d'un ester avec une
fonction amine ou
alcool, respectivement, de la purine dont la formule est BH.
Parmi les produits de formule I ou Ia, on citera notamment les amides et
esters formés avec les restes acyle A de l'acide salicylique, de l'acide
acétylsalicylique, du
diclofénac, de l'ibuprofène, du naproxène ou du sulindac, et avec les restes B
dérivés de
l'adénosine ou de l'AMP.
Bien entendu, il est particulièrement intéressant de choisir, parmi les
produits
de formule I, ceux qui présentent un effet de synergie potentialisatrice par
rapport à leurs
constituants purine et AINS. De tels produits peuvent être sélectionnés par de
simples
expériences de routine.
On a remarqué en outre que les produits de formule I ou Ia ont généralement
une tolérance gastrique améliorée, par rapport à PAINS dont ils dérivent.
. Les produits de formule I ou Ia sont administrés sous les mêmes formes
pharmaceutiques que celles décrites ci-dessus, et à des doses équivalentes,
compte tenu
des proportions respectives des molécules dérivées de purine et d'AINS dans le
produit de
formule I ou Ia considéré. Les doses administrées peuvent être déterminées par
des
expériences de routine, en utilisant les tests connus de recherche d'une
activité anti-
inflammatoire ou d'une activité anti-agrégante.
Les indications qui précèdent, données pour les produits de formule I ou Ia,
s'appliquent également, de façon générale, à tout produit comprenant un AINS
et une
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
14
purine, liés par covalence, éventuellement par l'intermédiaire d'au moins un
bras
espaceur.
L'invention faisant l'objet de la présente demande est également définie par
les revendications annexées à la présente description.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
Exemple 1 : Préparation du produit de~ formule A - NH - Y, dans laquelle A
est le reste acyle de l'acide acétylsalicylique et Y est le reste de l'AMP
amputé de son
amine primaire, le groupement NH de la formule représentant le reste de ladite
amine
primaire de l'AMP.
Il s'agit donc du produit d'amidification de l'AMP par l'acide
acétylsalicylique.
Les produits de départ sont l'acide acétylsalicylique (origine : SIGMA) et
l'AMP (ou (5'-O-phosphate) adénosine), sel de sodium (origine : SIGMA).
On dissout 0,5 g d'AMP dans 14 ml d'eau à température ambiante. On ajoute
0,17 g de carbonate de potassium (K2C03), et on ajoute 0,25 g de chlorure de 2-
acétyl
benzoyle, puis 3 ml de dioxane afin de solubiliser ce dernier. On agite le
mélange pendant
12 heures à température ambiante, puis on évapore les solvants.
On élimine les chlorures par dialyse, ou on purifie le produit obtenu par
chromatographie sur gel de silice, en éluant avec un mélange acétate
d'éthyle/eau/isopropanol1:1:1.
Le groupement phosphate est salifié par des ions sodium et potassium.
Les spectres RMN du proton et du phosphore 31P sont en accord avec la
structure indiquée.
En opérant de façon analogue, mais en remplaçant le carbonate de potassium
par du carbonate de sodium, on obtient l'amide correspondant dont les
groupements
phosphates sont salifiés par des ions sodium.
Exemple 2 : Préparation du produit de formule A - NH - Y, dans laquelle A
est un reste salicylyle, Y représente le reste de l'AMP (amputé de son amine
primaire), et
le groupement NH de la formule est le reste de ladite amine primaire de l'AMP.
Il s'agit donc du produit d'amidification de l'AMP par l'acide salicylique.
Le produit de départ est le produit de l'exemple 1, que l'on soumet à une
désacétylation en milieu basique. On dissout ce produit dans l'eau et ajoute 3
équivalents
CA 02420066 2003-02-07
' WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
de carbonate de potassium K2CO3 à température ambiante. Au bout d'un temps
réactionnel de 12 heures à température ambiante, on obtient le produit indiqué
dans le
titre de cet exemple.
On purifie le produit désacétylê par chromatographie sur gel de silice, comme
5 à l'exemple 1.
Les fonctions phosphate et phénate de ce produit sont salifiées par des ions
sodium et potassium.
En remplaçant le carbonate de potassium par le sodium, on obtient le produit
indiqué dans lequel les fonctions phosphate et phénate sont salifiées par des
ions sodium.
10 Exemple 3 : Préparation d'un produit de formule A - NH - Y, dans lequel A
représente un groupement salicylyle, Y représente un reste d'adénosine amputé
de son
amine primaire, et le groupement NH de la formule représente le reste de
ladite amine
primaire de l'adénosine.
Il s'agit donc du produit d'amidification de l'adénosine par l'acide
salicylique.
15 a) 2', 3' 5', O-triacétate d'adénosine
On mélange 5,34 g d'adénosine et 11,4 ml d'anhydride acétique dissous dans
ml de pyridine anhydre. On agite pendant 12 heures à température ambiante,
puis on
évapore les solvants. Le résidu est ensuite repris plusieurs fois à l'éthanol.
On obtient
6,97 g de cristaux blancs.
20 b) N-(2-acétylsalicylyl) 2', 3', 5', 0-triacétate d'adénosine
On dissout 2,457 g du produit obtenu en a) dans 26 ml de dichlorométhane et
0,95 ml de triéthylamine, puis on ajoute 0,402 g de chlorure d'acide
acétylsalicylique, à
une température de 0°C. On laisse le mélange réactionnel se réchauffer
jusqu'à
température ambiante puis on agite pendant 12 heures. Le mélange est alors
extrait par
25 une solution aqueuse saturée en NaCI, puis la phase organique ainsi traitée
est séchée sur
MgS04. Le solvant est évaporé, et le résidu est chromatographié sur gel de
silice en
éluant avec un mélange CH~Ch/MeOH 98:2. On obtient le composé annoncé (1,41 g)
sous la forme d'un solide blanc.
c) N-salicylyl adénosine
On dissout à température ambiante 0,230 g du composé obtenu en b) dans
10 ml d'un mélange mëthanol/eau 7:3, puis on ajoute 0,232 g de KZCO3. Au bout
d'une
heure, le mélange est lavé plusieurs fois au dichlorométhane et la phase
aqueuse est
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
16
concentrée. On obtient 0,156 g d'un solide jaune.
Le spectre RMN est en accord avec la structure indiquée.
Etude des effets des AINS seuls et associés à l'adénosine ou l'AMP sur
l'a~ré~ation
plaquettaire
On prélève du sang recueilli sur tampon citrate, chez des rats n'ayant reçu
aucun traitement ou chez des humains n'ayant reçu aucun traitement dans les
quinze jours
précédant le prélèvement. On prépare par centrifugation selon les méthodes
connues un
plasma riche en plaquettes.
Les mesures sont réalisées grâce à un agrégomètre commercialisé sous la
dénomination "Chrono-log" et elles sont traitées et numérisées par un système
d'acquisition "MP30 Biopac".
a) Effets de l'AMP et de l'adénosine sur l'agrégation des plaquettes de rat
Avec les plaquettes de rat stimulées par l'ADP (20 ~,M), on observe une
agrégation rapide et importante (80 %).
Lorsque l'ADP est ajoutée à la même concentration en présence d'AMP
2,5 mM ou 5,0 mM, on n'observe qu'une agrégation partielle (40 % et 20 %,
respectivement), suivie d'une désagrégation spontanée. Ainsi, l'action de
l'AMP dépend
de la dose.
Lorsqu'on remplace l'AMP (5 mM) par l'adénosine (4 mM), on obtient des
résultats comparables.
Lorsqu'on stimule les plaquettes de rat par l'ADP (20 ~,M), puis ajoute
secondes plus tard l'AMP (10 mM), on observe une désagrégation immédiate.
En conclusion, l'adénosine et l'AMP peuvent inhiber et inverser l'agrégation
des plaquettes induite par l'ADP.
25 b) Effets des GINS seuls et associés à l'AMP sur l 'agrégation des
plaquettes de rat
Si l'on ajoute au plasma du salicylate de sodium (7,5 mM), puis ajoute l'ADP
(20 ~uM), on n'observe pas d'inhibition significative de l'agrégation
plaquettaire.
Lorsqu'on ajoute l'ADP (20 p,M) en présence de salicylate de sodium
(7,5 mM) et d'AMP (2,5 mM), on n'observe pratiquement plus aucune agrégation
30 plaquettaire.
Ainsi, l'association de l'AMP et du salicylate de sodium présente un effet de
synergie potentialisatrice.
CA 02420066 2003-02-07
' WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
17
Des résultats similaires ont été obtenus en remplaçant le salicylate de sodium
par l'aspirine (7,5 mM) ou l'indométacine (0,05 mM).
c) Effets de l'association aspirine + AMP sur l'agrégation des plaquettes de
rat
Les plaquettes sont préparées à partir de sang prélevé chez des rats traités 1
heure auparavant par une injection intraveineuse d'aspirine (2mg/kg) et d'AMP
(1 mg/kg).
On stimule les plaquettes par l'ADP (10 et 20 ~,M).
Avec des doses de 10 et 20 ~uM d'ADP, chez les animaux témoins (n'ayant
reçu aucun traitement préalable), on observe une agrégation plaquettaire
supérieure à
50 %, 3 minutes après l'addition d'ADP.
Chez les animaux traités préalablement par l'aspirine et l'AMP, on observe
une faible agrégation (20 % environ) qui s'inverse au bout de 3 minutes
environ.
d) Effets du produit de l'exemple 1 sur l'agrégation des plaquettes de rats
On stimule par l'ADP (20 ~M) en présence du produit de l'exemple 1
(0,3 mM).
Avec le plasma non traité préalablement, l'agrégation maximale atteint 55 %
avec une pente initiale de la courbe de 0,99. En présence du produit de
l'exemple 1
(ajouté immédiatement avant l'addition d'ADP), l'agrégation maximale est de 39
%, avec
une pente initiale de 0,84. 11 résulte des essais effectués que dans ces
conditions
expérimentales la réduction de l'agrégation est de 30 à 50 %.
Lorsque le produit de l'exemple 1 est ajouté au plasma 25 minutes avant la
stimulation par l'ADP, l'agrégation maximale est inférieure à 30 %.
e) Effet du produit de l'exemple 1 sur l'agrégation des plaquettes de rats ;
comparaison avec l'association AMP + aspirine
Les plaquettes sont stimulées par l'ADP (20 p,M), soit en présence du produit
de l'exemple 1 (0,3 mM), soit en présence d'aspirine (20 mM) + AMP (0,25 mM).
Chez les animaux témoins, la stimulation par l'ADP induit une agrégation
plaquettaire à 50 %.
Dans le cas du plasma traité par le produit de l'exemple 1, l'agrégation
maximale atteint 30 % puis s'inverse.
Dans le cas du plasma ayant reçu de l'aspirine et de l'AMP, (agrégation
atteint 40 % puis s'inverse.
Ces résultats montrent que le produit de l'exemple 1 est plus actif que la
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
18
simple association de l'aspirine et de l'AMP.
fj Effets du produit de l'exemple 1 sur les plaquettes hurnaines
On étudie la réponse des plaquettes humaines stimulées par l'ADP (20 ~,M)
en présence du produit de l'exemple 1 (0,5 mM). Chez les témoins, l'ADP
provoque une
agrégation plaquettaire maximale atteignant 80 %. Dans le cas de l'addition
d'ADP en
présence du produit de l'exemple 1, l'agrégation maximale ne dépasse pas 35 %
et
commence à s'inverser au bout de 3 à 4 minutes.
Dans le cas où les plaquettes sont stimulées par l'acide arachidonique
(20 ~,M), on observe une agrégation de 70 %. Lorsque l'acide arachidonique est
ajouté en
présence du produit de l'exemple 1 (0,005 mM), l'agrégation des plaquettes est
totalement
inhibée.
g) Réponse des plaquettes humaines stimulées par le collagène
On étudie la réponse de plaquettes humaines stimulées par du collagène
(0,19 mg/ml, Biodata). Deux paramètres sont pris en compte : le temps de
latence (délai
entre la mise en contact des plaquettes avec le collagène et le début de
l'agrégation) et
l'amplitude maximum d'agrégation.
La réponse au collagène, en terme de réponse maximum, n'est modifiée ni par
l'aspirine (0,6 mM), ni par le salicylate de sodium (2 mM), ni par l'AMP (0,6
mM), ni par
le produit de l'exemple 1 (0,5 mM), ni par l'association de salicylate de
sodium (2 mM) et
d'AMP (0,6 mM).
En revanche, à la dose indiquée, le produit de l'exemple 1 double le temps de
latence qui suit la mise en contact des plaquettes avec le collagène.
L'association AMP
(0,6 mM) + salicylate de sodium (2 mM) est d'efficacité comparable à celle du
produit de
l'exemple 1 (0,5 mM). Le salicylate de sodium (2 mM) est sans effet sur le
temps de
latence. Dans le cas de l'AMP (0,6 mM), le temps de latence est multiplié par
1,5 environ:
Etude de l'effet anti-inflammatoire
Le test est effectué sur des souris mâles pesant 20 g. Ce protocole dure 5
jours. Au jour J1, on injecte par voie sous-cutanée dans la partie dorsale 3
cm3 d'air. Les
poches d'air obtenues sont regonflées à J2, J3 et J4 avec 1 cm3 d'air. On
administre à J3,
J4 et à J5, 1 heure avant l'induction de l'inflammation, par gavage gastrique,
soit 0,1 ml
d'eau (témoins, n = 14), soit de l'aspirine (100 mg/kg, n = 5), soit le
produit de l'exemple
1 (100 mg/kg, n = 4), soit le produit de l'exemple 3 (100 mg/l~g, n = 5). On
induit
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
19
l'inflammation par injection de 1 ml d'une suspension à 2 % (poids/volume) de
carraghénane en tampon PBS dans la poche d'air. Après 4 heures, les poches
sont lavées
avec 2 ml de PBS et les exsudats sont recueillis. Des paxties aliquotes sont
diluées jusqu'à
1:1 avec une solution à 0,01 % de bleu de méthylène dans un tampon PBS. On
effectue
alors un comptage des cellules (principalement des neutrophiles) dont
l'accumulation est
provoquée par l'inflammation.
Les résultats sont résumés dans le Tableau 1. Ils montrent que les produits
des
exemples 1 et 3 diminuent significativement le nombre de leucocytes accumulés
dans
l'exsudat inflammatoire, par rapport aux témoins et par rapport à l'aspirine
seule.
TABLEAU 1
Produit test Nombre de leucocytes%
(doses en mgJkg/jour)(millions/ml) d'inhibition
Tmoins 9,57 0,48
Aspirine 6,40 0,77 33
(100)
Produit de l'exemple
1
4,54 0,55 53
(100)
Produit de l'exemple3,80 0,80 60
3
(100)
Etude de la toxicité gastrique
Ce test est effectué sur des rats Sprague Dawley (IFFA CREDO, l'Arbresle,
France). Les rats sont mis à jéun (mais ont à leur disposition de l'eau de
boisson ad
libitum) la veille de l'expérimentation. Les rats sont traités par voie sous-
cutanée avec de
l'indométacine (20 mg/kg) ou par gavage avec 100 mg/kg d'aspirine, ou du
produit
composé de l'exemple 1, ou du produit de l'exemple 3. Trois heures plus tard,
les rats sont
sacrifiés par une dose létale de pentobarbital. L'estomac est prélevé, ouvert
le long de la
grande courbure et rincé à l'eau. La muqueuse gastrique est photographiée et
numérisée à
l'aide d'un microordinateur Macintosh G3 équipé d'un logiciel (NIH, USA) et
d'une carte
vidéo (Scion, USA). L'estomac est fixé au formol tamponné afin d'être traité
par les
techniques histologiques classiques pour l'inclusion en paraffine. Les coupes
(5~um) sont
ensuite colorées à l'hématoxyline-éosine-safran.
CA 02420066 2003-02-07
WO 02/11735 PCT/FRO1/02580
Deux observations peuvent être effectuées , macroscopique (après le
prélèvement, sous microscope) et histologique.
Les estomacs des rats traités par l'indométacine présentent des ulcérations
macroscopiques importantes confirmées par l'étude histologique. Les estomacs
des rats
5 traités pax l'aspirine à cette dose, présentent des lésions sous forme de
pétéchies ou des
micro-ulcérations. Cette étude montre que, comparés à l'aspirine et à
l'indométacine, les
produits des exemples 1 et 3 n'induisent pas, dans ce modèle i~c vivo chez le
rat,
d'altération de la paroi gastrique.
