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CA 02448843 2003-11-13
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Effets de différents surnageants de bactéries lactiques de Bio-K Plus sur des
lignées cellulaires endothéliales.
Introduction
La recherche sur le cancer vise à découvrir les moyens par lesquels la
croissance agressive
des tumeurs solides et de leurs métastases peut être abolie de façon
spécifique sans engendrer de
résistance au traitement, ni provoquer de toxicité excessive chez les patients
traités. Ce défi est
de taille puisque Ia transformation des cellules normales en cellules
tumorales est associée à
l'acquisition d'une importante résistance à la plupart des agents cytotoxiques
actuellement utilisés
èn thérapie. Plusieurs études réalisées au cours des dernï.ères années ont
démontré que les
cellules tumorales ne représentent pas le seul déterminant responsable de la
croissance des
tumeurs. Les vaisseaux sanguins présents au sein de ces tumeurs y jouent
également un rôle
crucial. Il a été clairement établi que ces vaisseaux sanguins, formés par le
processus
d'angiogenèse, sont essentiels à Ia croissance agressive des tumeurs et de
leurs métastases. Cette
angiogenèse est due à Ia capacité des cellules tumorales à sécréter un certain
nombre de facteurs
angiogéniques, tels les facteurs de croissance de I'endothélium vasculaire
(VEGF) et
fibroblastique (FGF), liant avec une haute affinité Ia surface des cellules
endothéliales. La
stimulation de ces cellules endothéliales par ces facteurs résulte non
seulement en une hausse de
la sécrétion d'enzymes dëgradant tes composantes de la matrice
extracellulaire, mais également
ën une stimulation de la migration et de la prolifération de ces cellules. Les
cellules ainsi
stimulées envahissent la matrice entourant les tumeurs, formant un réseau de
capillaires qui
assure la croissance des cellules tumorales en leur fournissant les nutriments
et l'oxygène
nécessaires à leur développement. L'inhibition de !'apport sanguin auY tumeurs
constitue donc
une cible de choix pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques
antic~encéreuses
ciblant spécifiquement l'un?iogenèse pour restreindre ou éliminer ta
progression tumorale.
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On estime que les habitudes de vie et L'alimentation sont responsables de plus
d~u tiers des
nouveaux cas de cancers diagnostiqués. Par conséquent, la prévention (nutra-
prévention) suscite
grésenternent un immense intérêt et i1 est estimé qu'au cours des prochaines
années, elle
entrainera des réductions des taux de mortalité reliés au cancer plus grandes
que celles atteintes
par les traitements actuellement disponibles. Il est donc d'actualité et fort
intéressant de
caractériser Le potentiel antiangiogénique des bactéries lactiques des
produits alimentaires Bio-K
Plus.
Objectif de cette étude
Notre intention est de déterminer et de caractériser les propriétés
antiangiogéniques des
produits alimentaires Bio-K Plccs (avec et sans produit Laitier).
Hypothèse proposée
Les bactéries lactiques composant Ies produits alinnentaires Bio-K Plus
sécrètent des
molécules actives qui ont une activité antiangiogênique.
Approches expérimentaies utilisées
1- Effet sur Ia formation des réseaux de capüia,ires sanguins:
?- Effet. sur ia migration des cellules endothélinles à travers Ie vaisseau
sanguin
vers Ia tumeur;
3- Effet sur La prolifération des cellules endothéüales vers la tumeur.
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Conclusion générale suite auY résultats obtenus
Ä la lueur de l'ensemble des résultats obtenus dans cette partie de l'étude,
les bactéries
lactiques contenues dans les produits Bia-K Plus semblent sécréter des
molécules actives qui ont
un potentiel d'activité antiangiogénique. Ainsi, ces moiécules actives ont Ia
capacité d'inhiber Ia
croissance de nouveaux capillaires qui soutient la progression de diverses
maladies tels Ies
rétinopathies, les hémangiomes infantiles, l'arthrite rhumatoïde, Ie
psoriasis, les ulcères
duodénaux, la resténose post-angioplastie et ia croissance tumorale.
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Etude : caractérisation des propriétés antiangiogéniques des bactéries
lactiques composant
le produit alimentaire de Bio-K Pdus sur les cellules endothéliales de veine
ombilicale humaine (HUVECs) et les cellules endothéliales de l'aorte bovine
(B AECs).
1.0 Préparation du matériel d'étude
Dans la présente étude, nous avons caractérisé l'action de divers surnageants
grovenant~
des bactéries lactiques (mili.eu sécrété par les bactéries) et des produits
alimentaires Bio-K Plus.
,.
1.1 Srrrnageatzts de bactéries lactiques
Les bactéries ont été reçues dans 9 ml de milieu complexe MRS et 100 p.l de
cette
suspension a été multipliée dans 100 ml du même milieu. Après 18 heures
d'incubation â 37°C
(agitation à une vitesse de 250 RPM), des aliquots de 1,2 ml ont été prélevés
et répartis dans des
tubes eppendorfs stériles auxquels nous avons rajouté préalablement 0,4 ml de
glycérol à 80%.
Ces tubes ont été congelés à -80°C.
Afin d'obtenir les surnageants de bactëries lactiques, un volume de I00 ~tl de
suspension
bactérienne provenant d'un tube congelé à été prélevé et cette suspension a
été multipliée dans
100 ml de milieu MRS (selon Ia même procédure que décrite précédemment). Après
18 heures
d'incubation, un repiquage a été effectué : 1 mI de suspension bactérienne
dans 100 ml de milieu
KIRS (dilution de I/100). Ce milieu a. été incubé à 37°C -jusqu'à
l'atteinte de sa phase de
croissance « log » correspondant à une densité mesurée à 0,5 à Agi,. Par ia
suite, le surnZgeant a
été obtenu parcentrifugation (I 000 x g, l~ min) et filtré deux fois (un
filtre de 0,~.~ym suivi d'un
filtre de 0,'?3 itm), Une pzrtie de cc surnageant a été aliquoté dans des
tubes eppendorfs stériles
et COII'~I~ à-80°C. L'.mtre partie dLl surnageant a cté concentré IOX à
l'aide do tubes Ultrafree-
:# (> ~ 000 kDa) par ccntrifu;Tation (s 000 r g. 30 min). Ainsi, nous avons
obtenu deux types de
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surnageants : un surnageant concentré i0~~ contenant des molécules dont la
taille est plus grande
que S 000 kDa et un filtrat contenant des molécules dont la taille moléculaire
est plus petite ou
égale à 5 000 kDa. Par la suite, ces surnageants ont été aliquotés et congelés
à -80°C.
1.2 Surnageants de produits alimentaires Bio-K Plus
Dans la présente étude, des surnageants ont été obtenus de deux types de
produits
aliméntaires Bio-K Plus : un composë avec produit laitier (les protéines du
lait sont fermentées)
et l'autre sans produit laitier (les protéines du soya sont fermentées). Ces
surnageants de ces,.
produits ont été obtenus suite à deux centrifugations (une à 6 000 x g , 15
min, 4°C et une autre à
20 000 RP1VI, 30 min, 4°C}. Par la suite, ils ont été filtrés sur deux
filtres (un filtre de 0,45pm
suivi d'ur~ filtre de 0,22 p.m) dans Ie but d'obtenir des surnageants sans
bactéries et stériles afin de
pouvoir traiter les lignées cellulaires endothéliales. Les surnageants ont été
conservés â -80°C
jusqu' à utilisation.
2.4 Résultats
2.1 Caractérisation ira vitro des surnageants de bactéries lactiqices et des
produits
alimentaires Bio-K .Plus sur la formation de strrcctrcres capillaires par les
~1 UVECs
Dans un premier temps, nous avons vérifié si les surnageants de bactéries
lactiques
perturbaient Ia formation de structures capillaires sur I~Iatrigel par tes
HUVECs. Les cellules ont
été ensemencées sur une matrice contenant un mélange hétérogène de facteurs de
croissance
(bFGF, TGF-j3, VEGF, HGF) ainsi que de plusieurs protéines de Ia matrice
extracellulaïre
(collagène, larninine, fibrine} et de protéases {vIi4~IPs, uPA, tPA), recréant
artificiellement Ie
support matriciel retrouvé üt viuo. Une incubation de 6 heures en présence des
différents
surna~tants {dilution ll4) à 37°C a permis d'observer un effet
inhibiteur (variant de I8,2~1o à
27,s~~ inhibition; n=?) des surnzgeants de bactéries lactiques concentrés IOX
(Figures 1r1, 1B).
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De plus, on observe que les réseaux formés sont incomplets et non structurés
comparativement au
contrôle.
Dans un deuxième temps, nous avons vérifié si les surnageants de Bio-K Plus
perturbaient
également la formation des structures par tes HL3VECs (Figures 2A, 2B). Les
résultats semblent
démontré que leurs effets ne sont pas significatifs. De plus, mentionnons que
le pH des
surnageants de Bio-K Plus ne semble pas affecter la formation des réseaux.
2.2 Caractérisation in vitro des surnageants de bactéries lactiques et des
produits
alimentaires Bio-K Plus sur le potentiel migratoire des BAECs et des HUVECs
La migration des cellules endothéliales a êté mesurée à l'aide des chambres de
culture de
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type Boyden. II s'agit de deux chambres contenant des puits de 6,5 mm séparées
par une
membrane de polycarbonate ayant des pores de 8,0 ~Cm et préalablement induite
de gélatine.
Cette membrane constitue la barnère artificielle. Les cellules endothéliales
en croissance ont été
récoltées avec de la trypsine, comptées, centrifugées et resuspendues à une
densité de 1,0 X 10a
celluleslml dans un tampon de migration approprié. Les cellules ont été
ajoutées aux puits de ta
partie supérieure de la membrane et incubées à 37°C. Après 30 min
d'adhésion, les différents
surnageants ont été ajoutés dans tes puits supêrieur et inférieur de la
chambre. Après 2 heures, le
VEGF a été ajouté comme chemoattractant dans les puits inférieurs. Après 3
heures, tes cellules
présentes à Ia surface interne de la membrane, donc celtes qui ont envahi la
barrière, seront
fixées, colorées et comptées à l'aide d'un microscope à haute résolution.
L'activité inhibitrice de
chacun des surnageants a été analysée en fonction de ta présence ou non du
VEGF.
Dans un premier temps, une dilution de i/4 de chacun des surnageants à tester
dans le
milieu de culture cellulaire approprié a été utilisée afïn de déterminer
lequel des surnageants a un
effet potentiel sur la migration. Les résultats chez les cellules BAECs
démontrent que tous les
surnageants ont un effet inhibiteur sur la stimulation de Ia migration induite
par le VEGF
(Figures 3:~, 3B). De plus, on remarque que pour le surnageant de bactéries
lactiques concentré,
son inhibition est complète. En ce qui concerne les HUVECs, tous Ies
surnageants inhibent la
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stïmulation induite par le VEGF, ainsi que le niveau de migration basal
(Figures 4A, 4B}.
L'effet inhibiteur semble plus important pour les surnageants de Bio-K Plus
(Figure 4B).
Par Ia suite, nous avons analysé plus en détail l'effet inhibiteur des
surnageants en
fonction de la dilution. Les résultats obtenus pour les surnageants de Bio-K
Plats (avec produit
laitier) semblent démontrer que l'effet inhibiteur sur la stimulation induite
par Ie VEGF est
fonction de la dilution et que Ia dilution Ia plus faïble (1/7) a un effet
ïnhibiteur également sur le
niveau basal de migration (Figure SA). Des résultats similaires ont été
obtenus pour ies
surnageants de Bio-K Plus (sans produit laitier) (Figure SB). On remarque
cependant que Ia
migration des cellules BAECs semblent plus sensibles aux dilutions 1.120 et
1/10, surtout au
niveau basal.
2.3 Caractérisation in vitro des surnageants des produits ali»zentaires Bio-
I~' Plus sur la .
prolifêration des HITVECs
Le test utilisé pour l'étude de Ia prolifêration cellulaire est Ie WST-l, une
technique qui
mesure l'activité mitochondriale des cellules. Pour ce faire, les HWECs ont
été ensemencées
dans des plaques de 96 puits ~ une densité de 4 000 cellules/puit. Après 24
heures d'incubation,
les diffêrents surnageants ont été ajoutés séparément dans chacun des puits.
Après 30 min
d'incubation, du bFGF a été ajouté. Une solution de WST-1 d'un kit de
Boehringer a été ajoutée
dans chacun des puits après différents temps d'incubation (0 h, 24 h, 48 h et
72 h) et l'activité
métabolique a été quantifiée ~ 4S0 nm. L'activité inhibitrice de chacun des
surnageants a été
analysêe en fonction de la présence ou non du bFGF.
Les différents surnageants de Bio-K Phcs ne semblent pas inhiber ta
prolifération des
HUVECs comparativement au temps 0 (Figures 6A, 6B}. De plus, si on compare
l'effet de
différentes dilutions de surnajeant de Bia-K Plus (avec produit laitier) et
Bio-K Plus (sans produit
laitier), en absence (Figures CA, 6B) et en présence de bFGF (Figures 'iA,
7B}, on constate que
la prolifération des cellules est augmentée en présence du facteur de
croissance, mais que cette
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stimulation semble dimihuer et atteindre les niveaux du temps 0, aux dilutions
1110 et I!7 (Figure
7B} vers 4$ et 72 heures pour les surnageants de Bio-K Plrxs (sans produit
laitier).
3.0 Conclusions
L'ensemble des résultats obtenus semble démontrer que les bactéries tactiques
du Bio-K
Plats relarguent dans ie surnageant des moiêcutes actives qui ont une activitê
antiangiogénique.
Les principales conctusians des résultats obtenus sont les suivantes
I-) La fermentation des protéines du lait ne semble pas étre responsable de
l'action
inhïbitrice du Bio-K Plus puisque lors de la migration, Ie produit contenant
des protéines
,.
de soya fermentées inhibe également la stimulation induite par le VEGF;
2-) Les molécules actives semblent être d'un poids moléculaire plus grand que
5 000 kDa;
3-) Pour observer un effet antiangiogênique sur la formation de structures
capillaires par
les cellules endothéüales, ü faut que ie surnageant de bactéries en culture
soit concentré
fois, ceci pourrait expliquer pourquoi on ne retrouve pas cet effet avec les
surnageants
des produits alimentaires Bio-KPlus.
4.0 Prospectives
Les résultats obtenus supportent clairement Ia présence d'une activité
antiangiogénique
par les bactéries constituant Ie Bio-K Plces. Il nous apparaît donc très
important de poursuivre la
caractérisation de ces propriétés afin de mieux comprendre les mécanismes par
lesquels le produit
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pourrait agir comme agent anticancéreux. Dans cette optique, nous prévoyons
réalïser les
expériences suivantes
1-) Déterminer Ie nombre de bactëries tactiques présentes dans Ia suspension
bactérienne
avant centrifugation et le comparer au nombre de bactéries retrouvêes dans le
produit
alimentaire; ceci nous permettra d'êvaluer, à dilution égale, la concentration
équivalente
de bactéries retrouvée dans Ies surnageants;
2-) Poursuivre les études de prolifération et de migration avec les
surnageants de bactéries
lactiques en fonction de leur dilution;
3-} Avec les surnageants qui démontrent une activitë antiangiogénique, étudier
leurs effets
sur d'autres événements cellulaires rattachés à l'angiogenèse comme: a} l'état
de
,.
phosphorylation de certains récepteurs spécifiques aux cellules endothëliales
suite à Ia
stimulation aux facteurs de croissance; b) Ies nïveaux d'expression des
métalIoproëtases,
famille d'enzymes impliquées dans la dégradation de la matrice
extracellulaire, sécrétées
par les cellules endothéliales et c} l'induction de l'apoptose dans les
cellules endothéliales
suite aux traitements.
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Effets des bactêries lactiques de Bio-K Plus sur des lignées cellulaires
endothéliales et
cancéreuses
Objectif : caractériser les mêcanismes moléculaires du Bio-K Placs dans
diverses lignées
endothéliales et cancéreuses humaines.
1.I Approches expérimentales
B. Caractérisation ira vitro des propriétés antiangiogéniques du Bio-K Plus
sur les
cellules endothéliaies de veine ombilicale humaine (HUVECs).
1- Effet sur la prolifération cellulaire;
2- Effet sur le potentiel migratoire des cellules;
3- Effet sur la formation de structures de capillaires sur Matrigel.
C. Caractérisation ira vitro des propriétés anticancéreuses du Bio-K Plus sur
la
prolifération de 6 lignées de cellules tumorales.
1- MCF-7 (adénocarcinome du sein);
2- Panc-1 (carcinome épithéloïde du pancréas);
3- PC-3 (carcinome de la prostate);
4- Daoy {médulloblastome du cerveau);
5- U-87 (glioblastome-astrocytome du cerveau);
6- 3urkat {lymphocytes de la leucémie).
Ces études permettront de mieux caractériser et d'identifier de nouvelles
cibles
moléculaires dans les cellules endothéliaies et cancéreuses modulées par le
Bio-K Plus.
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1.2 Préparation du matériel d'étude
Dans la présente étude, nous avons caractérisé l'action des surnageants de
bactéries
lactiques irradiées â 3 kGy (S3), 6 kGy (S6) et 9 kGy (S9). Ces surnageants
ont été obtenus suite
à deux centrifugations (une à f> 000g , IS min , 4°C et une autre à 10
OOOg, 20 min, 4°C). Par la
suite, ils ont été filtrés sur deux filtres {un filtre de 0,45~m suivi d'un
filtre de 0,22 ~tm) dans Ie
but d'obtenir des surnageants sans bactéries et stériles afin de pouvoir
traiter les diverses lignées
cellulaires. Les surnageants ont été conservés à -80°C jusqu'à
utilisation.
Pour nos études, nous avons utilisé une concentration de surnageants
équivalente à 10$
bactéries, puisque selon le mémoire de maîtrise de Cindy Baldwin, c'est à
cette concentration que
l'effet inhibiteur est maximal.
1.3 Résultats
1.3.2 Caractérisation in vitro des propriétés antiangiogéniques du Bio-1~ Plus
sur tes
cellules endothéIiales de veine ombilicale humaine {HUVECs).
Nous avons vérifié si les surnageants de bactéries avaient un effet sur les
cellules
endothéliales. La technique du WST-l, qui mesure l'activité mitochandriale des
cellules, nous a
permis d'étudier la prolifération des cellules HUVECs. Les surnageants ne
semblent pas avoir
d'effet inhibiteur sur la prolifération de ces cellules (Figures 4-â; n = ?).
Nous avons par ta suite
évaluë le potentiel migratoire des ceilules en présence de surnageants de
bactéries et les résultats
se sont avérés positifs. Nous avons ~~érifié si tes surnageants inhibent la
stimulation de la
migration des HUVECs sur gélatine induite par te VEGF, le mitogène ie plus
souvent associé au
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phénomène d'angiogenèse. Les surnageants inhibent complètement la migration
par le VEGF
mais également le niveau de migration basale, à environ 50%v (Figure b).
L'effet inhibiteur des
surnageants ne semblent donc pas spécifique au VEGF. Les essais de formation
de tubes sur
Matrigel (une matrice riche en Iaminine, reconstituant la membrane basale et
qui permet la
différenciation des cellules endothéliales en des structures simïlaires aux
capillaires des vaisseaux
sanguins) démontrent que les surnageants de bactéries inhibent de façon
significative Ia formation
des tubes par rapport au témoin chez les I-iUVECs (Figures ZA-~B; n = 2).
L'ensemble de ces
résultats indiquent que tes surnageants de bactéries contiennent des molécules
qui ont un potentiel
antiangiogénique.
i.4 Conclusion
L'ensemble des résultats~obtenus dans ce projet semblent démontrer qu'il y a,
dans les
surnageants provenant de bactéries lactiques contenus dans Ies produits de Bio-
K Plccs, des
molécules relarguées par les bactéries qui semblent avoir une activité
antiangiogénique.
En résumé, les principales conclusions de ce projet sont les suivantes
Un effet inhibiteur des surnageants de bactéries a été observé sur la
migration
des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) et sur la
formation de structures de capillaires par ces cellules;
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