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Utilisation d'associations entre au moins un polymorphisme de
séquence nucléique du gène Sh2 et au moins une caractéristique
de qualité de la graine, dans des procédés de sélection de plantes
s
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la sélection de
variétés de plantes possédant des caractéristiques agronomiques
améliorées, en particulier des caractéristiques phénotypiques de qualité
1o des graines améliorées. Elle est relative à la détection des
caractéristiques phénotypiques de qualité des graines améliorées par
analyse du polymorphisme d'un gène Sh2 pour sélectionner des plantes
à qualité de graine améliorée ainsi qu'à des moyens pour la mise en
oeuvre de cette détection.
ART ANTERIEUR
Composition du grain
Le grain accumule des réserves énergétiques suffisantes pour
permettre la germination de l'embryon. Ces réserves sont sous forme de
2o réserves glucidiques, protéiques ou oléiques. Chez les céréales, les
réserves accumulées sont principalement de formes glucidique et
protéique. Les réserves glucidiques sont en grande partie constituées
par des polyosides tels que l'amidon. L'amidon est composé de deux
fractions polysaccharidiques distinctes, l'amylose et l'amylopectine.
2s L'amylose constitue la fraction minoritaire de l'amidon, c'est une chaîne
de monomères de glucose liés en a 1-4 présentant moins de 1 % de
ramifications. L'âmylopectine représente la fraction majoritaire de
l'amidon. Elle est constituée de monomères de glucose liés en a 1-4 et
est ramifiée à environ 5% avec des monomères de glucose liés à la
3o chaîne principale par des liaisons a 1-6. L'amidon représente près de
85% du poids de l'albumen des grains, la fraction de réserves
énergétiques restante étant essentiellement constituée de protéines.
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Importance agronomique et nutritive des céréales et de l'amidon
L'amidon est le polyoside majoritaire de stockage énergétique
chez les végétaux. II revêt une importance particulière dans les céréales.
Ainsi, l'amidon de riz, de blé ou de maïs constitue le principal apport en
s sucre dans l'alimentation humaine et animale. L'étûde des processus de
remplissage du grain, la sélection et la création de variétés de céréales
avec des teneurs en amidon modifiées constituent un des axes
privilégiés des recherches concernant les céréales.
io Enzyme ADP-Glucose Pyrophosphorylase
L'ADP Glucose Pyrophosphorylase (AGPase) est une enzyme clef
de la voie de biosynthèse des polysaccharides, aussi bien chez les
bactéries que chez les végétaux. Chez les plantes, elle permet de
déphosphoryler le glucose-1-phosphate en ADP-glucose, monomère
is constitutif de l'amidon.
L'AGPase végétale possède une structure complexe sous forme
d'hétérotétramère composé de deux types de sous-unités similaires mais
distincts. Les deux types de sous-unités, d'un poids moléculaire proche
de 50 kDa dans l'albumen, sont codées, l'une par le gène Sh2 pour
2o Shrunken 2, (Bhave et al., 1990) et l'autre par le gène Bt2 pour Brittle-2,
(Bae et al., 1990).
Polymorphisme génétique
Au sein d'une même espèce, le génome présente du
2s polymorphisme. Les principales causes de ces variabilités génétiques
sont des mutations intervenant lors de la réplication de l'ADN qui
précède la multiplication cellulaire. Ce peut être l'insertion ou la délétion
de un ou plusieurs nucléotides (regroupés sous le terme d'indel), ou bien
une substitution de type transition (substitution d'une base purique par
3o une autre base purique ou d'une base pyrimidique par une autre base
pyrimidique) ou transversion (substitution d'une base purique par une
base pyrimidique ou vice versa). Les sites polymorphes sont ainsi
classés en deux catégories selon qu'il s'agit de la substitution d'une base
(SNP pour single nucleotide polymorphism) ou bien d'un indel (Insertion
3s Délétion).
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Si les sites polymorphes sont retrouvés plus fréquemment dans
les régions non codantes du génome, une partie des SNPs ou des indels
est retrouvée dans les régions codantes du génome ou dans des régions
s impliquées dans la régulation de la transcription et/ou de la traduction,
telles que les régions promotrices, les régions 5'-leader, voire même
certains introns. Ce type de polymorphisme peut alors avoir un impact
sur l'expression d'un gène, la structure ou l'activité d'une protéine, et par
suite sur l'expression d'un phénotype donné par la plante.
io
L'analyse de la variabilité des séquences d'ADN permet de
caractériser un individu ou un groupe d'individus par son génome. En
effet, La connaissance de la variabilité génétique des individus permet de
générer des marqueurs pour détecter la ou les formels) allélique(s)
is présente(s) chez d'autres individus. Ce peut être des amorces PCR, des
sondes allèles spécifiques, ou toute autre séquence nucléotidique
permettant de détecter un site pôlymorphe particulier du gène. Lorsqu'un
marqueûr spécifique à un locus est lié à un caractère agronomique
particulier de la plante, la connaissance de la forme allélique du
2o marqueur permet de .prédire le phénotype d'un individu. II est aussi
possible d'utiliser les marqueurs définis grâce au polymorphisme de
séquence pour introgresser ou intégrer, par transgénèse, un allèle
favorable dans une plante.
2s Cas du maïs, enzyme AGPase et gène Sh2
Chez le maïs, plusieurs études ont révélé des QTLs (pour
« Quantitative Trait Loci »), aussi désignés « loci contrôlant un caractère
à variation quantitative », de caractères de remplissage du grain, dans la
région du chromosome 3 qui porte le gène Sh2. II s'agit, en particulier, de
3o QTLs associés à la teneur en amidon et en protéines (Goldman, 1993),
ainsi qu'à la teneur en amylose et au rapport amylose/amylopectine
(Séne et al., 2000). De plus, des modifications de la région amont 3' du
gène, sous l'effet de transposons de type Ac/Ds, peuvent induire une
augmentation de la quantité d'amidon dans le grain (Giroux et al. 1996).
3s II apparaît donc que la variabilité du gène Sh2 puisse rendre compte de
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la variation de caractères de remplissage du grain. Shaw et Hannah
(1992) ont séquencé le gène Sh2 de la variété de maïs Black Mexican
Sweet, qui comprend environ 7200 paires de bases.
s Toutefois, si les études publiées dans l'état de la technique sur le
gène Sh2, suggèrent une certaine relation entre l'activité de ce gène et
les qualités de la graine, elles ne décrivent aucun moyen technique
précis prédictif des caractéristiques phénotypiques de la qualités des
graines, utilisable à grande échelle, et permettant de discriminer, entre
1o eux, les divers types ou niveaux de phénotypes caractérisant la qualité
de la graine, tels que le nombre de grains par épi, la masse du grain mûr,
la teneur en amidon du grain, la teneur en amylose du grain ou la teneur
en protéines du grain ou encore une combinaison des caractéristiques
phénotypiques pécitées
SOMMAIRE DE L'INVENTION
L'invention fournit pour la première. fois un ensemble de moyens
permettant de sélectionner des' variétés de plantes pour leûrs
caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines, par
l'analyse de polymorphismes nouvellement identifiés dans le gène Sh2,
polymorphismes qui sont statistiquement associés à une caractéristique
phénotypique précise de la qualité de la graine, ou à une combinaison de
caractéristiques phénotypiques de la qualité de la graine.
II a en effet été montré selon l'invention qu'un allèle donné de
2s chacun des nouveaux sites polymorphes du gène Sh2 était
statistiquement associé à l'expression d'un ou plusieurs caractères
phénotypiques définissant la qualité de la graine.
L'invention a pour objet l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce
nucléotidique dans un procédé de sélection de plantes possédant des
3o caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines,
caractérisée en ce que ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique
permet la détection d'une base polymorphe ou d'une séquence
nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe du
gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1, ladite base polymorphe ou ladite
3s séquence nucléotidique polymorphe étant contenue dans un acide
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nucléique inclus dans le gène Sh2, choisi parmi les acides nucléiques
comprenant un site nucléotidique polymorphe associé à une
caractéristique ou à une combinaison de caractéristiques phénotypiques
liées à la qualité de la graine, notamment le nombre de graines par épi,
s la masse de la graine mûre, la teneur en protéines de la graine, la teneur
en amidon de la graine, la teneur en amylose de la graine ou le rapport
pondéral protéines/amidon de la graine.
Elle est également relative à un procédé pour déterminer l'identité
de l'allèle d'un site polymorphe au sein d'un acide nucléique dérivé d'un
io gène Sh2 en vue de sélectionner une plante possédant des
caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine,
caractérisé en ce qu'il comprend une étape de caractérisation de
l'identité de la base polymorphe ou de la séquence nucléotidique
polymorphe présente à au moins une position nucléotidique dudit acide
is nucléique correspondant à au moins un des nucléotides inclus dans un
site nucléotidique polymorphe nouvellement identifié du gène Sh2.
Selon ce procédé, ia détermination de l'identité de l'allèle d'un site
polymorphe ou d'une combinaison de sites polymorphes pérmet de
prédire le phénotype de qualité de la graine de la plante analysée, sans
2o nécessiter d'analyse directe des caractères phénotypiques eux-mémes.
L'invention concerne aussi des sondes et des amorces
nucléotidiques permettant de déterminer la forme allélique d'un site
polymorphe du gène Sh2, utiles notamment comme moyens de
détermination de l'identité de la base polymorphe ou de la séquence
2s nucléotidique polymorphe au site polymorphe associé à une
caractéristique ou à une combinaison de caractéristiques phénotypiques
de la qualité de la graine.
Elle a aussi pour objet un acide nucléique dérivé du gène Sh2 et
comprenant au moins un site polymorphe tel que défini dans la présente
3o description, ainsi que des vecteurs recombinants comprenant un tel
acide nucléique.
Elle a également trait à une cellule hôte transformée par un acide
nucléique ou un vecteur recombinant décrit ci-dessus, de préférence une
cellule hôte bactérienne ou végétale.
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Elle concerne encore une plante transformée par un acide
nucléique ou par un vecteur recombinant décrit ci-dessus.
Elle est aussi relative à des anticorps dirigés spécifiquement
contre un polypeptide SH2 codé par un acide nucléique dérivé du gène
s Sh2 comprenant un site polymorphe tel que défini dans la présente
description ainsi qu'à un nécessaire ou kit comprenant l'un de ces
anticorps ou encore une combinaison de plusieurs de ces anticorps.
DESCRIPTION DES FIGURES
io
La Figure 1 représente la séquence nucléotidique du gène Sh2
décrite par Shaw et Hannah (1992), qui est identique à la séquence SEQ
ID N°1 du listage de séquence.
La première colonne de gauche représente la numérotation en
1s nucléotides de la séquence SEQ ID N° 1 du listage de séquences de la
présente description. Le premier nucléotide est numéroté 1.
La seconde colonne de gauche représente la numérotation en
nucléotides prescrite par Shaw et Hannah (1992), qui est basée sur la
position du nucléotide du site d'initiation de la transcription, numéroté +1.
20 Le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ ID N°1 est le
nucléotide en position -1020 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La demanderesse a identifié, dans la séquence du gène Sh2, une
collection de polymorphismes dont elle a montré qu'ils étaient, chacun,
associés à au moins une caractéristique phénotypique définissant la
qualité de la graine d'une plante. L'identification de ces polymorphismes
3o a rendu possible la mise au point de procédés de détection de ces
pôlymorphismes à partir de l'ADN d'un individu végétal, cellule végétale,
plante au stade plantule, plante à un stade précoce de développement
ou plante au stade végétatif, permettant de prédire quelles sont ou seront
les caractéristiques phénotypiques liées à la qualité de la graine ou de la
3s future graine.
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L'association entre la présence d'un allèle défini d'un site
polymorphe du gène Sh2 et au moins un caractère de remplissage du
grain permet de mettre en relation un allèle donné ou une combinaison
d'allèles donnés (haplotype) et un caractère phénotypique ou une
s combinaison de caractères phénotypiques définissant la qualité de la
graine. Les inventeurs ont montré que le polymorphisme du gène Sh2
est statistiquement associé à des caractères de qualité de la graine, tels
que
- le nombre de graines par épi
1o - la masse de la graine mature
- la teneur en protéines de la graine
- la teneur en amidon de la graine
- la teneur en amylose de la graine
- le rapport teneur en protéines/teneur en amidon dans la graine.
1s
L'identification d'allèles particuliers de sites polymorphes associés
aux caractéristiques de qualité de la 'graine, dans la séquence du gène
Sh2, a permis de définir des séquences oligonucléotidiques spécifiques
d'un allèle donné d'un ou de plusieurs sites polymorphes du gène Sh2 et
2o d'utiliser ces séquences en tant que sondes ou amorces pour faciliter la
sélection de plantes assistée par marqueurs, pour générer des
séquences alléliques favorables par mutagénèse dirigée, ou pour cloner
des séquences apportant un caractère agronomique favorable, lié à la
qualité de la graine, à la plante transformée avec ces séquences.
2s II a aussi été montré selon l'invention que certains
polymorphismes du gène Sh2 entraînaient des modifications dans la
séquence d'acides aminés: Les allèles favôrables repérés au niveau de
ces polymorphismes peuvent être utilisés pour modifier la structure ou
l'activité de l'enzyme AGPase.
3o Le gène Sh2 utilisé comme séquence nucléotidique de référence
à partir de laquelle sont définis les divers sites polymorphes
nouvellement identifiés selon l'invention est la séquence nucléotidique
référencée dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès
M81603 et qui est reproduite comme la séquence SEQ ID N°1 du
listage
3s de séquences.
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Le gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1 possède 7320 nucléotides
de longueur. II possède 16 exons, respectivement
- Exon n°1 : du nucléotide en position 1021 jusqu'au nucléotide en
position 1082 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
s séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en
position 62 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992), telle qu'illustrée sur la Figure 1. ;
- Exon n°2 : du nucléotide en position 1521 jusqu'au nucléotide en
position 1745 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
io séquence allant du nucléotide en position 501 jusqu'au nucléotide en
position 725 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°3 : du nucléotide en position 2222 jusqu'au nucléôtide en
position 2344 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
is séquence allant du nucléotide en position 1202 jusqu'au nucléotide en
position 1324 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°4 : du nucléotide en position 2629 jusqu'au nucléotide en
position 2799 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
2o séquence allant du nucléotide en position 1609 jusqu'au nucléotide en
position 1779 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°5 : du nucléotide en position 3036 jusqu'au nucléotide en
position 3125 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
zs séquence allant du nucléotide en position 2016 jusqu'au nucléotide en
position 2105 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°6 : du nucléotide en position 3217 jusqu'au nucléotide eri
position 3303 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
3o séquence allant du nucléotide en position 2197 jusqu'au nucléotide en
position 2283 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°7 : du nucléotide en position 3388 jusqu'au nucléotide en
position 3443 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
3s séquence allant du nucléotide en position 2368 jusqu'au nucléotide en
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position 2423 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°8 : du nucléotide en position 3546 jusqu'au nucléotide en
position 3639 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
s séquence allant du nucléotide en position 2526 jusqu'au nucléotide en
position 2619 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw-et Hannah - -
(1992). ;
- Exon n°9 : du nucléotide en position 3805 jusqu'au nucléotide en
position 3917 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
io séquence allant du nucléotide en position 2785 jusqu'au nucléotide en
position 2897 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°10 : du nucléotide en position 3986 jusqu'au nucléotide en
position 4058 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
is séquence allant du nucléotide en position 2966 jusqu'au nucléotide en
position 3038 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°11 : du nucléotide en position 4217 jusqu'au nucléotide en
position 4297de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
2o séquence allant du nucléotide en position 3197 jusqu'au nucléotide en
position 3277 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°12 : du nucléotide en position 4463 jusqu'au nucléotide en
position 4549 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
2s séquence allant du nucléotide en position 3443 jusqu'au nucléotide en
position 3529 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°13 : du nucléotide en position 4620 jusqu'au nucléotide en
position 4724 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
3o séquence allant du nucléotide en position 3600 jusqu'au nucléotide en
position 3704 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°14 : du nucléotide en position 6546 jusqu'au nucléotide en
position 6652 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
3s séquence allant du nucléotide en position 5526 jusqu'au nucléotide en
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position 5632 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°15 : du nucléotide en position 6735 jusqu'au nucléotide en
position 6795 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
s séquence allant du nucléotide en position 5715 jusqu'au nucléotide en
position 5775 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
- Exon n°16 : du nucléotide en position 6912 jusqu'au nucléotide en
position 7287 de la séquence SEQ ID N°1, ce qui correspond à la
Io séquence allant du nucléotide en position 5892 jusqu'au nucléotide en
position 6267 du gène Sh2 selon la nomenclature de Shaw et Hannah
(1992). ;
Dans la présente description, la numérotation utilisée pour définir
Is la position du nucléotide polymorphe ou de la séquence nucléotidique
polymorphe d'un site polymorphe du gène Sh2 est exclusivement celle
décrite par Shaw et Hannah (1992) et qui est rappelée dans, la première
côlonne de gauche de la séquence du gène Sh2 représentée à la Figure
1.
Sites polymorphes du çtène Sh2 selon l'invention
Le polymorphisme du gène Sh2 a été déterminé à partir de l'ADN
provenant de 33 lignées consanguines de maïs, dont les caractéristiques
phénotypiques liées à la qualité du grain ont été simultanément
2s analysées.
L'analyse de polymorphisme a permis de caractériser 72 sites
polymorphes dans la séquence du gène Sh2.
Parmi ces 72 sites polymorphes, 19 d'entre eux ont présenté une
différence nucléotidique pour une seule des lignées étudiées. Ces 19
3o sites polymorphes ne présentaient pas une distribution statistique
informative pouvant être mise en oeuvre dans une étude d'association
entre la présence d'un allèle donné de ces sites polymorphes et la
constatation d'un caractère phénotypique donné de la qualité de la
graine.
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Parmi les 53 sites polymorphes informatifs, certains d'entre eux
ont été considérés comme redondants en ce que les mêmes allèles de
deux ou plus de ces sites étaient systématiquement retrouvés
conjointement dans l'ADN de plusieurs lignées. Deux sites polymorphes
s redondants apportent la même information statistique concernant
l'association de l'un de leurs allèles avec une caractéristique
phénotypique déterminée de la qualité de la graine. Ils permettent une
discrimination identique entre deux lignées ou deux groupes de lignées.
Selon l'invention, 43 sites polymorphes du gène Sh2 ont été
io retenus comme constituant des polymorphismes ou des groupes de
polymorphismes d'intérêt, dont un allèle déterminé et caractérisé est
statistiquement associé à une caractéristique phénotypique de la qualité
de la graine et parfois à plusieurs caractéristiques phénotypiques de la
qualité de la graine.
is Par « site polymorphe » du gène Sh2, on entend une région de la
séquence du gène Sh2 laquelle, dans le génome de certaines lignées
végétales, plus ,spécifiquement dans certaines lignées de maïs, diffère
par un ou plusieurs -nucléotides consécutifs par rapport 'à la région
correspondante du gène Sh2 défini par la séquence SEQ ID N°1. Un site
2o polymorphe peut consister en une variation d'un seul nucléotide qui peut
prendre deux significations, par exemple une base A ou une base T, un
tel site polymorphe étant alors désigné polymorphisme SNP (pour
« Single Nucleotide Polymorphism »). Un site polymorphe peut aussi
consister en l'addition ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides
2s consécutifs, par rapport à la séquence de référence SEQ ID N°1. Ce
second type de sites polymorphes est désigné « indel » (pour « Insertion-
Délétion »)..
Les sites polymorphes du gène Sh2 caractérisés dans la présente
invention sont définis ci-dessous. Ils sont caractérisés par leur différence
3o nucléotidique par rapport à la séquence du gène Sh2 SEQ ID N°1 de
référence et dont les positions de nucléotides sont définis selon la
nomenclature de Shaw et Hannah (1992) . Tels qu'ils sont définis ci-
dessous, les sites polymorphes du gène Sh2 sont caractérisés par leur
allèle dont la présence, dans le génome d'une plante, est associée à
3s l'expression d'un caractère phénotypique modifié de qualité de la graine.
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(a) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -921 du gne Sh2
est un G ;
(b) un acide nuclique dans lequel les
nuclotides correspondant aux
s nuclotides en positions -830 -824, de e 5'-TGAGAAA-3',
squenc
..du-gne Sh2 sont absents ;
(c) un acide nuclique dans lequel les
nuclotides correspondant aux
nuclotides en positions -580 -573, de 5'-TCACCTAT-3',
squence
du gne Sh2 sont absents ;
io (d) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -438 du gne Sh2
est un G ;
(e) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -362 du gne Sh2
est un A ;
(f~ un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
is nuclotide en position -347 du gne Sh2
est un T ;
(g) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -296 du gne Sh2
est un T ;
(h) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -277 du gne Sh2
est un T ;
20 (i) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -266 du gne Sh2
est un C ;
(j) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -168 du gne Sh2
est un A ;
(k) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
2s nuclotide en position -15 du gne Sh2 est
un A ;
(I) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position +35 du gne Sh2 est
un T ; '
(m) un acide nuclique dans lquel un T se trouve
additionnel aprs le
nuclotide en position +304 du gne Sh2
;
30 (n) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position +515 du gne Sh2
est un C ;
(o) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position +587 du gne Sh2
est un C ;
(p) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
3s nuclotide en position +678 du gne Sh2
est un A ;
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(q) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +960 du gène Sh2 est un A ;
(r) ~ un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +1059 du gèné Sh2 est un G ;
s (s) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +1068 du gène Sh2 est un G ;
(t) un acide nucléique dans lequel le nucléotide A correspondant au
nucléotide en position +1081 du gène Sh2 est absent;
(u) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
io nucléotide en position +1473 du gène Sh2 est un C ;
(v) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après
le nucléotide en position +1505 du gène Sh2 ;
(w) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après
le nucléotide en position +1542 du gène Sh2 ;
is (x) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +1867 du gène Sh2 est un C ;
(y) un acide nucléique dans lequel le nucléotide.T correspondant au,
nucléotide en position +2514 du gène Sh2 est absent;
(z) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après
20 le nucléôtide en position 2771 du gène Sh2;
(ab) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +2939 du gène Sh2 est un G ;
(ac) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +2983 du gène Sh2 est un C ; et
2s (ad) un acide nucléique comprenant l'insertion de la séquence
5'-GTTTTTATTTA-3' après le nucléotide correspondant au nucléotide
en position +3123 du gène Sh2.
Pour le site polymorphe +587, la présence d'une base C constitue
une substitution de base conservative n'entraînant aucun changement
3o dans la séquence d'acides aminés du polypeptide SH2 correspondant,
par rapport au polypeptide SH2 de séquence SEQ ID N°52 codé par la
séquence SEQ ID N°1.
Pour le site polymorphe +678, la présence d'une base A entraîne
le remplacement, dans la séquence du polypeptide SH2 de séquence
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SEQ ID N° 52, de l'acide aminé Alanine, codé par la séquence SEQ
ID
N° 1 à cette position, par l'acide aminé Thréonine.
Pour le site polymorphe +2983, la présence d'une base C entraîne
le remplacement, dans la séquence du polypeptide SH2 de séquence
s SEQ ID N°52, de l'acide aminé Leucine, codé par la séquence SEQ ID
N° 1 à cette position, par l'acide aminé Sérine.
Comme exposé précédemment, la caractérisation selon l'invention
de sites polymorphes informatifs au sein de la séquence du gène Sh2 a
rendu possible la construction de divers moyens de détection d'un allèle
io donné de chacun des sites polymorphes, utiles notamment dans des
procédés de sélection de lignées de plantes, spécifiquement de maïs,
possédant des caractéristiques phénotypiques de qualité de la graine
recherchées.
De tels procédés de sélection de lignées de plantes peuvent être
is réalisés à des stades précoces du développement de la plante, avant la
formation des graines, à un moment du développement de la plante pour
lequel il n'est pas possible de ' déterminer, les caractéristiques
phénotypiques de la graine. Les procédés mettant en oeuvre une analyse
des sites polymorphes du gène Sh2 de l'invention ont donc une valeur
2o prédictive d'un grand intérêt technique et économique.
Utilisations et procédés mettant en aeuvre les caractéristiaues des
sites polymorphes selon l'invention.
L'invention a pour objet l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce
2s nucléotidique dans un procédé de sélection de plantes possédant des
caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité des graines,
caractérisée en ce que ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique
permet la détection d'une base polymorphe ou d'une séquence
nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site polymorphe du
3o gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1, ladite base polymorphe ou ladite
séquence nucléotidique polymorphe étant contenue dans un acide
nucléique inclus dans un gène Sh2, choisi parmi les acides nucléiques
suivants
(a) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
3s nucléotide en position -921 du gène Sh2 est un G ;
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(b) un acide nuclique dans lequel les
nuclotides correspondant aux
nuclotides en positions -830 -824, de
squence 5'-TGAGAAA-3',
du gne Sh2 sont absents ;
(c) un acide nuclique dans lequel les
nuclotides correspondant aux
s nuclotides en positions -580 -573, de 5'-TCACCTAT-3',
squence
du gne Sh2 sont absents ;
(d) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -438 du gne Sh2
est un G ;
(e) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
1o nuclotide en position -362 du gne Sh2
est un A ;
(f) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -347 du gne Sh2
est un T ;
(g) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -296 du gne Sh2
est un T ;
is (h) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -277 du gne Sh2
est un T ;
(i) un acide . nuclique dans lequel le correspondant
nuclotide au
nuclotide en position -266 du gne Sh2
est un C ;
(j) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position -168 du gne Sh2
est un A ;
(k) un acide nuclique dans lequel le nucl.otidecorrespondant
au
nuclotide en position -15 du gne Sh2 est
un A ;
(I) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position +35 du gne Sh2 est
un T ;
2s (m) un acide nuclique dans lequel un T l est prsent
additionne aprs
le nuclotide en position +304 du gne Sh2
;
(n) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position +515 du gne Sh2
est un C ;
(o) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
3o nuclotide en position +587 du gne Sh2
est un C ;
(p) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position +678 du gne Sh2
est un A ;
(q) un acide nuclique dans lequel le nuclotidecorrespondant
au
nuclotide en position +960 du gne Sh2
est un A ;
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(r) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +1059 du gène Sh2 est un G ;
(s) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +1068 du gène Sh2 est un G ;
s (t) un acide nucléique dans lequel le nucléotide A correspondant au
nucléotide en position +1081 du gène Sh2 est absent;
(u) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +1473 du gène Sh2 est un C ;
(v) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après
1o le nucléotide en position +1505 du gène Sh2;
(w) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après
le nucléotide en position +1542 du gène Sh2 ;
(x) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +1867 du gène Sh2 est un C ;
~s (y) un acide nucléique dans lequel le nucléotide T correspondant au
nucléotide en position +2514 du gène Sh2 est absent;
(z) un acide nucléique dans lequel un T additionnel est présent après
le nucléotide en positiôn 2771 du gène Sh2;
(ab) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
2o nucléotide en position +2939 du gène Sh2 est un G ;
(ac) un acide nucléique dans lequel le nucléotide correspondant au
nucléotide en position +2983 du gène Sh2 est un C ; et
(ad) un acide nucléique comprenant l'insertion de la séquence
5'-GTTTTTATTTA-3' après le nucléotide correspondant au nucléotide
2s en position +3123 du gène Sh2.
L'expression «qualité du grain» englobe les caractères influant sur
la qualité et la quantité de la graine tels que par exemple : le nombre de
graines par épi, la masse des graines matures, la teneur en protéines, en
3o amidon, en amylose et le rapport pondéral teneur en protéines/teneur en
amidon dans la graine, ainsi que tous les caractères complexes incluant
un ou plusieurs de ces caractères.
Une des méthodes pouvant être utilisée pour déterminer le
phénotype d'un individu à ce ou ces sites peut consister à
3s i) obtenir un échantillon d'ADN d'un individu,
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ü) identifier l'allèle à une ou plusieurs des positions citées ci-
dessus (en référence aux positions décrites selon la
séquence Genbank n°M81603) dans le gène Sh2,
iii) prédire la qualité du grain de l'individu en référence à
s l'association du polymorphisme du gène Sh2 tel qué décrit
ci-dessus et du caractère de qualité de grain.
L'échantillon d'ADN est obtenu selon les méthodes classiques
d'extractions d'ADN utilisées chez les plantes, en particulier à partir de
jeunes feuilles de maïs (Dellaporta ef al. 1983).
io L'échantillon d'ADN devra contenir au moins la séquence du gène
Sh2, c'est-à-dire une région de cette séquence pouvant être amplifiée
par une quelconque technique connue de l'art antérieur, telle que par
exemple, la PCR.
La qualité du grain de l'individu étudié peut être déterminée en
is référence à la présence d'un allèle à au moins une, plusieurs ou toutes
les positions décrites en combinaison avec d'autres polymorphismes
dans le gène Sh2 qui . sont connus ou qui . seront caractérisés
ultérieurement
II existe un grand nombre de procédures d'analyse connues dans
20 l'état de la technique qui peuvent étre utilisées par l'homme du métier
pour détecter la forme allélique d'un ou plusieurs sites polymorphes du
gène Sh2 de l'invention. En général, la détection des allèles requiert une
technique de discrimination des polymorphismes. En général, les
méthodes courantes impliquent l'amplification de la séquence cible puis
zs l'identification des allèles par des hybridations de courtes sondes, par
restriction par des endonucléases, par discrimination par polymérases ou
ligases; en observant le nucléotide incorporé par la polymérise en
fonction de la séquence-matrice, ou par détection de mésappariement
sur de l'ADN double brin.
3o Parmi ces techniques de détection d'allèles, il peut étre cité les
techniques suivantes : séquençage d'ADN, séquençage par hybridation,
SSCP (Single strand conformation polymorphism analysis), DGGE
(Denaturing gradient gel electrophoresis), TGGE (Temperature gradient
gel electrophoresis), analyse d'hétéroduplex, CMC (Chemical mismatch
3s cleavage), Dot blots, Reverse dot blots, oligonucleotide array (puce à
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ADN), TaqmanT"' (US 5210015 et US 5487972, Hoffmann-La Roche),
ARMST"" (Amplification refractory mutation system), ALEXT""
(Amplification refractory mutation system linear extension, EP 33243581,
Zeneca Itd)), COPS (Gibbs et al. ' 1989), mini-séquençage, APEX
s (Arrayed primer extension), RFLP (Restriction fragment length
polymorphism), sites de restriction sur produit de PCR (CAPS), OLA
(Oligonucleotide ligation assay), pyroséquençage (Nyrèn et al. 1997).
Ces techniques peuvent être utilisées en combinaison avec des
systèmes de générations de signaux comme, par exemple, les
io techniques suivantes : FRET (Fluorescence resonance energy transfer),
fluorescence quenching, fluorescence polarisation (UK 2228998, Zeneca
Itd), chimioluminescence, électrochimioluminescence, radioactivité,
colorimétrie, hybridization protection assay, spectrométrie de masse.
D'autres techniques d'amplification telles que la SSR (Self sustained
1s replication), LCR (Ligase chain reaction), SDA (Strand displacement
amplification) ou leb-DNA (branched DNA). La plupart de ces techniques
de détection des variations alléliques sont récapitulées dans des
ouvrages standard comme « Laboratory Protocols fôr mutation
detection », Ed. by U.Landegren, Oxford University press, 1996 et
20 « PCR », 2"d Edition by Newton et Graham, BIOS Scientific Publishers
Ltd, 1997). D'autres protocoles de séquençage, de clonage et autres
aspects de biologie moléculaire sont répertoriés dans «Genes VII»
(Lewin, 1999).
Ces techniques peuvent utiliser des oligonucléotides synthétisés à
2s partir des séquences suivantes (la forme allélique du SNP ou indel
détecté dans l'invention est indiquée entre parenthèses, et la différence
entre la forme allélique de la variété de référence BMS et l'allèle décrit
est indiquée en gras)
Dans l'utilisation d'une sonde ou d'une amorce nucléotidique, telle
3o qu'elle est définie ci-dessus, ladite sonde ou ladite amorce nucléotidique
peut être caractérisée en ce qu'elle permet de discriminer entre la
présence d'un premier acide nucléique (1 ) et d'un second acide
nucléique (2), lesdits acides nucléiques (1 ) et (2) étant choisis parmi les
suivants
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Sites polymorphes
(a) Site - 921 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°2 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°2 dans lequel le nucléotide en position 41
s est une base A ;
(b) Site - 438 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°3 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°3 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base A ;
io (c) Site - 362 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°4 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°4 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base G ;
(d) Site - 347 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°5 dans
is lequel le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°5 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base C ;
(e) Site - 296 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°6 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique
20 (2) de séquence SEQ ID N°6 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base C ;
(f) Site - 277 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°7 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°7 dans lequel le nucléotide en position 41
2s est une base C ;
(g) Site- 266 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°8 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°8 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base T ;
30 (h) Site - 168 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°9 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°9 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base G ;
(i) Site - 15 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°10 dans
3s lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique
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(2) de séquence SEQ ID N°10 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base G ;
(j) Site + 35 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°11 dans
lequel.le nucléotide en position 41 est une base T et l'acide nucléique
s (2) de séquence SEQ ID N°11 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base C ;
(k) Site + 515 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°12 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°12 dans lequel le nucléotide en position 41
io est une base T ;
(I) Site + 587 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°13 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°13 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base T ;
is (m) Site + 678 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°14 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°14 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base G ;
(n) Site + 960 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°15 dans
20 lequel le nucléotide en position 41 est une base A et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°15 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base G ;
(o) Site + 1059 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°16 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique
2s (2) de séquence SEQ ID N°16 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base C ;
(p) Site + 1068 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°17 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°17 dans lequel le nucléotide en position 41
3o est une base T ;
(q) Site + 1473 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°18 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°18 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base T ;
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21
(r) Site + 1867 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°19 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°19 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base T
s (s) Site + 2939 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°20 dans
lequel le nucléotide en position 41 est une base G et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°20 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base T ;
(t) Site + 2983 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°21 dans
io lequel le nucléotide en position 41 est une base C et l'acide nucléique
(2) de séquence SEQ ID N°21 dans lequel le nucléotide en position 41
est une base T ;
(u) Site - 830 à -824 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°23
et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 22 ;
is (v) Site - 580 à - 573 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID
N°25 et l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 24 ;
(w) Site + 304 : l'acide nucléique (1) de séquence SEQ ID N°27 et
l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 26 ;-
(x) Site + 1081 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°29 et
20 l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 28 ;
(y) Site + 1505 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°31 et
l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 30 ;
(z) Site + 1542 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°33 et
l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 32 ;
2s (aa) Site + 2514 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°35 et
l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 34 ;
(ab) Site + 2771 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ .ID. N°37 et
l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 36 ; et
(ac) Site + 3123 : l'acide nucléique (1 ) de séquence SEQ ID N°39 et
30 l'acide nucléique (2) de séquence SEQ ID N° 38.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ledit acide nucléique
est un acide nucléique s'hybridant spécifiquement avec un acide
nucléique de séquence complémentaire à l'un quelconque des acides
nucléiques (1 ) ou (2) définis en (a) à (ac) ci-dessus.
3s L'utilisation ci-dessus peut être aussi caractérisée en ce que
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a) la sonde nucléotidique s'hybride spécifiquement avec un acide
nucléique d'une première forme allélique de la base polymorphe ou
de la séquence nucléotidique polymorphe définissant un premier
allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 et ne s'hybride pas avec un
s acide nucléique d'une seconde forme allélique de la base
polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe définissant
un second allèle d'un site polymorphe du gène Sh2 ; ou
b) l'amorce nucléotidique hybride spécifiquement avec une séquence
nucléotidique contenue dans un gène Sh2, ladite séquence
io nucléotidique étant localisée en amont d'une forme allélique d'une
base polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe dont
la présence ou l'absence définit un allèle d'un site polymorphe du
gène Sh2.
Le polymorphisme du gène Sh2 une fois identifié par l'une des
1s méthodes décrites ci-dessus peut être utilisé, selon l'invention, pour
réaliser une sélection prédictive de plantes avec une meilleure qualité de
grain, y compris la sélection de plantes au stade plantule et/ou au stade
précoce et/ou au stade végétatif.
La séquence nucléotidique du gène Sh2 de maïs SEQ ID N°1
2o présente une forte identité en nucléotides avec les séquences
nucléotidiques de nombreuses céréales, en particulier de nombreuses
variétés de graminées, identité qui est presque totale dans le cadre
ouvert de lecture (ORF).
En particulier, la séquence du gène Sh2 de maïs possède une très
2s grande identité en nucléotides avec le gène Sh2 de sorgho, l'identité la
plus grande entre les deux séquences étant retrouvée dans le cadre
ouvert de lecture (ORF). Ainsi, le polypeptide SH2 codé par le gène Sh2
de sorgho possède uné différence d'un seul acide aminé avec le
polypeptide SH2 codé par le gène Sh2 de maïs SEQ ID N°1.
3o Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs
pensent que les sites polymorphes retrouvés dans le gène Sh2 de mais
sont également retrouvés dans le gène Sh2 du génome d'autres
céréales, en particulier graminées, et encore plus spécifiquement dans le
gène Sh2 du sorgho. Les sites polymorphes localisés dans le cadre
3s ouvert de lecture du gène Sh2 de maïs SEQ ID N°1 sont ceux qui ont
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statistiquement le plus de probabilité de se retrouver aussi dans les
gènes Sh2 d'autres céréales, en particulier d'autres graminées, comme
le sorgho.
La sélection prédictive s'applique donc en particulier aux céréales
s telles que par exemple le maïs et le sorgho. L'utilisation du
polymorphisme allélique décrit dans l'invention s'applique
particulièrement à la sélection de variétés de maïs. Lorsqu'une
population est ségrégeante sur plusieurs loci affectant plusieurs
caractères de qualité de grain, la sélection assistée par marqueur (SAM)
io est plus efficace qu'une simple évaluation phénotypique puisqu'elle
permet notamment des cycles de sélection beaucoup plus rapides que
les techniques classiques de caractérisation directe du phénotype. Un
autre avantage de la SAM par rapport à l'évaluation phénotypique est
que les analyses sont complètement indépendantes des aléas
is climatiques.
L'utilisation ci-dessus est en outre caractérisée en ce que les
caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine ont
choisies parmi le nombre de graines par épi, la masse des graines, la
teneur en protéines des graines, la teneur en amidon des graines, la
2o teneur en amylose des graines et le rapport pondéral prôtéines/amidon
des graines, ou une combinaison de ces caractéristiques phénotypiques.
L'invention a aussi pour objet un procédé pour déterminer l'identité
de l'allèle d'un site polymorphe au sein d'un acide nucléique dérivé d'un
gène Sh2 en vue de sélectionner une plante possédant des
2s caractéristiques phénotypiques améliorées de qualité de la graine,
caractérisé en ce qu'il comprend une étape de caractérisation de
l'identité de 1â base polymorphe ou de la , séquence nucléotidique
polymorphe présente à au moins une position nucléotidique dudit acide
nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -
30 921, -830 à -824, -580 à -573,-438,- 362, -347, -296, -277, -266, -168, -
15, +35, +304, +515, +587, +678, +960, +1059, +1068, +1081, +1473,
+1505, +1542, +1867, +2514, +2771, +2939, +2983 et +3123 du gène
Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
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Selon un premier aspect, le procédé ci-dessus est caractérisé en
ce que la caractérisation du site polymorphe est réalisée par séquençage
dudit acide nucléique.
Selon un second aspect du procédé ci-dessus, la caractérisation
s de l'identité du site polymorphe est réalisée par hybridation d'une sonde
nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec la séquence d'un allèle
déterminé du gène Sh2. Selon cet aspect, la caractérisation de l'identité
du site polymorphe est réalisée par hybridation d'une sonde
nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec une base polymorphe ou
io une séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle d'un site
polymorphe déterminé du gène Sh2.
Selon un troisième aspect du procédé ci-dessus, la caractérisation
du site polymorphe est réalisée par élongation d'une amorce
nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec une séquence
is nucléotidique localisée en amont d'une forme allélique d'une base
polymorphe ou d'une séquence nucléotidique polymorphe définissant un
allèle d'un site polymorphe déterminé. d'un gène Sh2.
Selon une caractéristique particulière de ce troisième aspect, la
caractérisation de l'identité du site polymorphe est réalisée par
2o hybridation d'une amorce nucléotidique s'hybridant spécifiquement avec
la séquence située en amont, du côté 5' de la base polymorphe ou de la
séquence nucléotidique polymorphe définissant un allèle donné d'un site
polymorphe du gène Sh2 , puis élongation de l'amorce. La
caractérisation de l'allèle polymorphe peut étre réalisée par séquençage
2s du produit de , l'élongation de l'amorce. Dans un mode de réalisation
particulier, le nucléotide situé à l'extrémité 3' de l'amorce hybride avec le
nucléotide situé immédiatement en âmont du côté 5' de la base
polymorphe ou de la séquence nucléotidique polymorphe. Dans ce mode
de réalisation particulier, l'identité de l'allèle du site polymorphe
3o considéré peut étre déterminé directement en réalisant l'étape
d'élongation de l'amorce en présence de didéoxynucléotides fluorescents
bloquant la réaction d'élongation. L'identité du didéoxynucléotide ajouté à
la séquence de l'amorce, et donc l'identité de l'allèle du site polymorphe,
est déterminée directement par analyse de fluorescence. II s'agit de la
3s technique de micro-séquençage, bien connue dans l'état de la technique.
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L'amorce hybride avec le brin d'ADN comprenant la séquence codant le
polypeptide SH2 (le brin+) ou avec le brin d'ADN complémentaire, qui
porte une base complémentaire de la base correspondante portée par le
brin « + » au site polymorphe.
s Selon un quatrième aspect, le procédé est caractérisé en ce que
pour sélectionner une plante possédant un nombre modifié de graines,
on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes
à au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique
correspondant à au moins un des nucléotides en position -168, +1473,
io +1542 et +2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Selon un cinquième aspect, le procédé est caractérisé en ce que
pour sélectionner une plante avec une masse modifiée de graine, on
détermine l'identité de la base ou d'une séquence de bases présentes à
au moins une position nucléotidique dudit acide nucléique correspondant
is à au moins un des nucléotides en position -168, +1473, +1542 et +2983
du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Selon un sixième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que
pour sélectionner une plante ayânt une teneur modifiée en protéines
dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de
2o bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide
nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -
168, +1473, +1542, +2983, -830 à -824, -362, -347, -296, -15, +515,
+587, +1068, +1505 et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Selon un septième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que
2s pour sélectionner une plante possédant une teneur modifiée en amidon
dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence de'
bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide
nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -830
à -824, -362, -347, -296, -15, +515, +587, +1068, +1505 et +2939 du
3o gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Selon un huitième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que
pour sélectionner une plante possédant une teneur modifiée en amylose
dans les graines, on détermine l'identité de la base ou d'une séquence
de bases présentes à au moins une position nucléotidique dudit acide
3s nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en position -
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438, -266, +678, +960, -921, -580 à -573, -277, +35, +304, +1059,
+1081, +1867, +2514, +2771 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ
ID N°1.
Selon un neuvième aspect, ce procédé est caractérisé en ce que
s pour sélectionner une plante possédant un rapport protéines/amidon
modifié dans la graine, on détermine l'identité de la base ou d'une
séquence de bases présentes à au moins une position nucléotidique
dudit acide nucléique correspondant à au moins un des nucléotides en
position -168, +1473, +1542, +2983, -830 à -824, -362, -347, -296, -15,
io +515, +587, +1068, +1505 et +2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID
N°1.
Selon un dixième aspect, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il
est réalisé sur l'ADN prélevé à partir de plantes au stade plantule etlou
au stade précoce et/ou au stade végétatif.
is De préférence, la plante est une céréale, de préférence une
céréale à paille.
Préférentiellement, la plante est choisie parmi le maïs et,le sorgho.
Sondes et amorces nucléotidiques
2o L'invention concerne également les amorces et les sondes
obtenues à partir des séquences nucléotidiques décrites ci-dessus et
spécifiques d'un allèle du gène Sh2. Une des applications de l'invention
consiste à utiliser ces sondes et/ou amorces pour détecter le
polymorphisme du gène Sh2 à au moins l'un des sites polymorphes tels
2s qu'ils ont été définis ci-dessus. Les sondes et les amorces obtenues
selon un des aspects de l'invention peuvent être employées comme
marqueurs spécifiques d'un allèle du gène Sh2. Les amorces
nucléotidiques spécifiques d'allèles, ou permettant de discriminer selon
les allèles connus, sont constituées préférentiellement de 8 à 40
3o nucléotides, plus précisément de 17 à 25 nucléotides. La réalisation de
telles amorces est connue de l'homme du métier. En général, de telles
amorces comprennent une séquence entièrement complémentaire à la
séquence définissant l'allèle de référence ou l'allèle « variant » associé à
un caractère phénotypique de qualité améliorée de la graine, tel que
3s défini précédemment dans la description. Les amorces objets de
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l'invention ainsi réalisées portent un ou plusieurs marquages pour
faciliter leur détection. Par exemple, le marquage peut être fluorimétrique
(digoxygénine, fluoresceine, etc...), radioactif (par exemple 32P),
enzymatique (peroxydase, phosphatase alkaline, etc...), ou réalisé par
s des microbilles d'or, de verre coloré ou de plastique.
Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les
séquences nucléotidiques SEQ ID N°2 à SEQ ID N°39, ainsi que les
acides nucléiques de séquences complémentaires aux séquences SEQ
ID N°2 à SEQ ID N°39, sont utiles pour la fabrication de
sondes ou
io d'amorces permettant, lorsqu'elles sont mises en oeuvre dans des
réactions d'hybridation, d'élongation ou d'amplification, de discriminer
entre eux les deux allèles d'un site polymorphe donné du gène Sh2
caractérisé selon l'invention.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces
is nucléotidiques hybridant avec un acide nucléique choisi parmi les
séquences SEQ ID N°2 à SEQ ID N°39, ou avec un acide nucléique
de
séquence complémentaire à l'une des séquences SEQ ID n°2 à SEQ ID
N°39.
L'invention a aussi pour objet une sonde ou une amorce
2o nucléotidique caractérisée en ce qu'elle permet de discriminer entre eux
les différents allèles d'un site polymorphe à au moins l'une des
positions-921, -830 à
-824, -580 à -573, -438, -362, -347, -296, -277, -266, -168, -15, +35,
+304, +515, +587, +678, +960, +1059, +1068, +1081, +1473, +1505,
2s +1542, +1867, +2514, +2771, +2939, +2983 et +3123 du gène Sh2 de
séquence SEQ ID N°1.
Elle est également relative à l'utilisation d'une sonde ou d'une.
amorce telle qué définie ci-dessus comme marqueur d'au moins un site
polymorphe du gène Sh2.
3o L'invention concerne également les kits de diagnostic comportant
des séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus, spécifiques
de l'allèle favorable du gène Sh2 pour un ou plusieurs des caractères
agronomiques choisis parmi le nombre de grains par épi, la masse du
grain mûr, les teneurs en amidon, en amylose ou en protéines du grain.
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Elle a aussi pour objet une trousse ou kit prédictif des
caractéristiques phénotypiques de qualité d'une graine de plante,
caractérisé en ce qu'il comprend
a) une sonde ou une pluralité de sondes ou d'amorces telles que
s définies ci-dessus ;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une
réaction d'hybridation ou d'amplification.
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est
caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
io Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est
caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un
marqueur détectable.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut
être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du
is métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou
encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la
méthode au phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al.
(1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de Beaucage et al.
(1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet
zo européen n° EP-0.707.592. Chacun des acides nucléiques selon
l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites
ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant une molécule
détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable par des moyens
spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou
2s encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des
isotopes radibactifs (32P 3H, asS), des molécules fluorescentes (5-
bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène) ou encore des
ligands tels que la biotine.
3o Le marquage des sondes est fait de préférence par incorporation
de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension
d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides
nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n° FR-
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78.10975 ou encore dans les articles de Urdea et al. (1988) ou Sanchez
Pescador et al. (1988).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent
avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une
s amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al;
(1991 ) ou encore dans le brevet européen n° EP-0.225.807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être
utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN du
gène Sh2 ou encore dans des hybridations à l'ARN messager de ce
io gène lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée
dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la
détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de
mésappariements.
is Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent
être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont
bien connus de l'homme du métier et englobent les surfiaces des puits de
plaques de micro-titration, les billes de polystyrène, les billes
magnétiques, les bandes de nitrocellulose ou encore les microparticules
2o telles que les particules de latex.
Moyens d'expression des acides nucléiques comprenant un site
polymorphe du gène Sh2.
L'invention concerne également l'utilisation des méthodes décrites
2s ci-dessus pour isoler et /ou cloner les formes alléliques particulières
et/ou
favorables du gène Sh2, notamment en combinaison avec des
techniques de biologie moléculaire coi~r~me par éxemple la PCR, la RT
PCR, le séquençage d'allèles (par exemple pyroséquençage,...).
L'homme de l'art pourra trouver la description des principales techniques
3o de clonage dans des ouvrages généraux tels que « Guide to Molecular
Cloning Techniques » (Berger et Kimmel, ref), « Molecular Cloning A-
laboratory manual » (Sambrook et al., 2001 ), « Current protocols in
molecular biology » (Ausubel et al., 1997).
Un acide nucléique comprenant la séquence complète d'un allèle
3s déterminé du gène Sh2 et comprenant au moins une base polymorphe
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d'un site polymorphe tel que défini dans la présente description, ou un
acide nucléique comprenant l'ensemble des exons de cet allèle
déterminé du gène Sh2, peut être obtenu selon des techniques bien
connues de l'homme du métier, comme par exemple par la techniqûe
s d'amplification PCR à l'aide d'amorces s'hybridant spécifiquement avec
les extrémités nucléotidiques cibles choisies du gène Sh2, comme cela
est décrit notamment dans les exemples.
Notamment, l'homme du métier peut se baser sur la
séquence SEQ ID N°1 pour synthétiser des sondes et des amorces
io nucléotidiques permettant d'isoler et de cloner n'importe quel acide
nucléique allélique du gène Sh2.
Par exemple, l'homme du métier peut obtenir un acide nucléique
dérivé du gène Sh2 et comprenant au moins un allèle associé à une
caractéristique phénotypique de quantité ou de qualité de la graine
ts améliorée d'au moins un site polymorphe selon l'invention en amplifiant
respectivement la partie 5' et la partie 3' du gène Sh2 en se basant sur la
séquence nucléotidique SEQ ID N°1.
L'invention a aussi pour objet un vecteur recombinant dans Lequel
a été inséré un acide nucléique comprenant la séquence complète d'un
2o allèle déterminé du gène Sh2 et comprenant au moins une base
polymorphe d'un site polymorphe tel que défini dans la présente
description, ou un acide nucléique comprenant l'ensemble des exons de
cet allèle déterminé du gène Sh2.
De préférence, un tel acide nucléique est un acide nucléique
2s dérivé du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1 et comprenant au moins
une base polymorphe ou au moins une séquence nucléotidique
polymorphe à au moins l'une des positions -921,-830 à -824,-580 à
573, - 438, - 362; - 347; -296, -277, -266, -168, -15, +35, +304, +515,
+587, +678, +960, +1059, +1068, +1081, +1473, +1505, +1542, +1867,
30 +2514, +2771, +2939, +2983 et +3123 du gène Sh2 de séquence SEQ
ID N°1.
Un premier acide nucléique objet de l'invention est un acide
nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une
céréale, en particulier à un maïs, un nombre modifié de graines, par
3s rapport au maïs de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite
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par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique comprenant la forme
allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de
qualité de la graine, tel que défini dans la présente description à au
moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes - 168, +
s 1473, + 1542 et + 2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Un second acide nucléique objet de l'invention est un acide
nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une
céréale, en particulier à un maïs, une masse modifiée de la graine par
rapport au maïs de référence de la variété Black Mexican Sweet décrite
io par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique comprenant la forme
allélique associée à l'expression du caractère phénotypique modifié de
qualité de la graine, tel que défini dans la présente description, à au
moins un site polymorphe choisi parmi les sites polymorphes -
168,+1473, + 1542 et + 2983 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
1s Un troisième acide nucléique objet de l'invention est un acide
nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une
céréale en particulier à un mais; une teneur modifiée en protéines dans
les graines, par rapport au maïs dé référence de la variété Black Mexican
Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique
2o comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère
phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la
présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les
sites polymorphes - 168, + 1473, + 1542, + 2983, - 830 à - 824, - 362,
347, - 296, - 15, + 515, + 1068, + 1505 et + 2939 du gène Sh2 de
2s séquence SEQ ID N°1.
Un quatrième acide nucléique objet de l'invention est un acide
nucléique susceptible de cônférer à une plante, de préférence une
céréalé en particulier à un maïs, une teneur modifiée en amidon dans les
graines, par rapport au maïs de référence de la variété Black Mexican
3o Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique
comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère
phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la
présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les
sites polymorphes - 830 à - 824, - 362 , - 347, - 296, - 15, + 515, + 587,
3s + 1068, + 1505 et + 2939 du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
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Un cinquième acide nucléique objet de l'invention est un acide
nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une
céréale, en particulier à un maïs, une teneur modifiée en amylose dans
les graines, par rapport au maïs de référence de la variété Black Mexican
s Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique
comprénant la forme allélique associée à l'expression du caractère
phénotypique modifié de qualité de la graine, tel que défini dans la
présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les
sites polymorphes - 438, - 266, + 678 , + 960, - 921, - 580 à - 573, -
io 277, + 35, + 304, + 1059, + 1081, + 1867, + 2514, + 2771 et + 3123 du
gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1.
Un sixième acide nucléique objet de l'invention est un acide
nucléique susceptible de conférer à une plante, de préférence une
céréale en particulier à un maïs un rapport protéines/amidon modifié
is dans la graine, par rapport au maïs de référence de la variété Black
Mexican Sweet décrite par Shaw et Hannah (1992), ledit acide nucléique
comprenant la forme allélique associée à l'expression du caractère
phénotypique modifié de qualité de la graine; tel que défini dans la
présente description, à au moins un site polymorphe choisi parmi les
2o sites polymorphes-168, + 1473, + 1542, + 2983, - 830 à - 824, - 362, -
347, - 296, - 15, + 515, + 587, + 1068, + 1505 et + 2939 du gène Sh2 de
séquence SEQ ID N°1.
La variété de maïs Black Mexican Sweet décrite par Shaw et
Hannah (1992), qui est la variété de référence, peut aussi être désignée
2s variété de maïs « sauvage », aux fins de la présente description.
Les techniques de mesure du nombre de graines, de la masse de
la graine, de la tenéur en protéines de la graine, de la teneur en amidon
dans la graine, de la teneur en amylose dans la graine et le calcul du
rapport teneur en protéines/teneur en amidon font partie des
3o connaissances générales techniques de l'homme du métier.
L'invention concerne aussi un vecteur recombinant, par exemple
un vecteur recombinant de clonage ou un vecteur recombinant
d'expression, dans lequel a été inséré un acide nucléique tel que défini
ci-dessus.
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Selon une des applications de l'invention, les séquences
nucléotidiques constituant des formes alléliques particulières du gène
Sh2 peuvent être clonées, transférées dans des cellules, en particulier
pour produire des plantes transgéniques. Les séquences nucléotidiques
s des loci sélectionnés sont introduites dans les cellules végétales, soit
en culture soit dans des organes de plantes comme par exemple les
feuilles, les tiges, les graines, les racines, etc... L'expression naturelle
ou
synthétique de ces séquences peut être réalisée en liant de manière
opérationnelle ces séquences d'intérêts à un promoteur, en incluant le
1o construit dans un vecteur et en introduisant le vecteur dans une cellule
hôte. Un promoteur endogène lié à la séquence nucléotidique à
introduire peut favorablement être employé. Les vecteurs habituellement
utilisés comprennent des séquences initiatrices et terminatrices à la fois
de transcription et de traduction, et des promoteurs permettant la
is régulation de l'expression de cette séquence nucléotidique particulière.
Les vecteurs peuvent également comprendre des cassettes d'expression
avec au moins une séquence terminatrice indépendante, des séquences
permettant la réplication de la cassette chez les eucaryotes ou les
procaryotes ou les deux (vecteurs navettes) et un marqueur de sélection
2o pour au moins l'un des deux systèmes procaryotiques ou eucaryotiques
(Giliman et Smith, 1979 ; Roberts et al., 1987 ; Schneider et al., 1995 ;
Sambrook et al., 2001 ; Ausubel et al., 1997).
Parmi les terminateurs de transcription pouvant être utilisés, on
peut citer le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur
2s (Franck et al. 1980) ou le terminateur polyA NOS, qui correspond à la
région en 3' non-codante du gène de la nopaline synthase du plasmide
Ti d'Agrôbacferium tumefaciens souche à nopaline.
Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on
peut citer notamment les promoteurs dits constitutifs, les promoteurs dits
3o inductifs ainsi que les promoteurs tissus spécifiques. Un promoteur
constitutif permet une expression forte du transcrit dans l'ensemble des
tissus de la plante régénérée et sera, actif dans la plupart des conditions
environnementales, et dans l'ensemble des étapes de transformation et
de différentiation cellulaires. Par exemple, le promoteur 35S ou le
3s promoteur double pd35S du CaMV décrit dans l'article de Kay et al.,
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(1987), ou le promoteur de l'active du riz suivi de l'intron active de riz
contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Mc Elroy et al. 1991 ; ou
encore le promoteur ubiquitine 1 de mais (Christensen et al., 1996).
Alternativement, il peut être intéressant d'utiliser une séquence
s promotrice de transcription inductible capable d'être contrôlée par les
conditions environnementales ou le stade de développement, comme par
exemple les promoteurs phénylalanine ammoniac lyase (PAL), d'HMG-
CoA réductase (HMG), de chitinases, de glucanases, d'inhibiteurs de
protéinase (PI), de gènes de la famille PR1, de la nopaline synthase
io (nos) ou du gène vspB (US-5.670.349), tous ces promoteurs étant
rappelés avec les références des publications correspondantes par le
Tableau 3 du brevet US-5.670.349. Une autre catégorie de promoteurs
pouvant être utilisée regroupe les promoteurs tissus spécifiques, comme
par exemple les promoteurs tissus spécifiques des graines (Datla, R. et
is al., 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP-0.255.378), de la
glutenine, de l'héliantinine (V110-92/17580), de l'albumine (VllO-
98/45460), de l'oléosine (V1/0-98/454.61 ), de l'ATS1 ou de l'ATS3 (UVO-
99/20775).
Les méthodes les plus répandues pour introduire des acides
2o nucléiques dans des cellules bactériennes peuvent être utilisées dans le
cadre de cette invention. Ce peut être la fusion de cellules réceptrices
avec des protoplastes bactériens contenant l'ADN, l'électroporation, le
bombardement par projectiles, l'infection par des vecteurs viraux, etc.
Les cellules bactériennes sont souvent utilisées pour amplifier le nombre
zs de plasmides contenant le construit comprenant la séquence
nucléotidique, objet de l'invention. Les bactéries sont mises en culture et
les plasmides sont ensuite- isolés selon des méthodes bien connus de
l'homme du métier (se reporter aux manuels de protocoles déjà cités),
incluant les kits de purification de plasmides vendus dans le commerce
3o comme par exemple EasyPrepl de Pharmacia Biotech ou QIAexpress
Expression System de Qiagen. Les plasmides ainsi isolés et purifiés sont
ensuite manipulés pour produire d'autres plasmides qui seront utilisés
pour transfecter les cellules végétales.
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par
3s diverses méthodes telles que, par exemple, le transfert des vecteurs
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susmentionnés dans les protoplastes végétaux après incubation de ces
derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en présence de cations
divalents (Ca 2+), l'électroporation (Fromm et al. 1985), l'utilisation d'un
canon à particules, ou la micro-injection cytoplasmiqûe ou nucléaire
s (Neuhaus et al, 1987).
Une des méthodes de transformation de cellules végétales
pouvant étre utilisée dans le cadre de l'invention est l'infection des
cellules végétales par un hôte cellulaire bactérien comprenant le vecteur
contenant la séquence d'intérêt. L'hôte cellulaire peut être Agrobacterium
io tumefaciens (An et al. 1986), ou A. rhizogenes (Guerche et al. 1987).
De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales
est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire
extrachromosomique inducteur de tumeurs Ti d'A. tumefaciens, en
utilisant un système binaire (UVatson et al., 1994). Pour ce faire, deux
Is vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a
été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un
gène marqueur étant, inséré entre eux pour permettre la sélection dans .
les cellules de plantes: L'autre partenaire du système binaire est un
plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais
2o contient toujours les gènes de virulence vir nécessaires à la
transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans
Agrobacterium.
Selon un mode préféré, la méthode décrite par Ishida et al. (1996)
peut être appliquée pour la transformation des monocotylédones, en
zs particulier le maïs. Selon un autre protocole, la transformation est
réalisée selon la méthode décrite par Finer et al. (1992) utilisant le canon
à particules de tungstène ou d'or.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un acide nucléique
dérivé du gène Sh2 de séquence SEQ ID N°1 tel que défini ci-dessus
3o pour transformer une cellule hôte.
De préférence, la cellule hôte est une cellule hôte bactérienne, par
exemple une cellule de Agrobacterium tumefaciens, ou une cellule
végétale, de préférence une cellule de céréale, et de manière tout à fait
préférée une cellule de maïs, de riz, de blé, de seigle ou d'orge.
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L'invention concerne également les cellules transformées, avec
les séquences nucléotidiques constituant des formes alléliques
particulières du gène Sh2, y compris les micro-organismes (virus et
bactéries) et les cellules végétales, en particulier des cellules dé maïs.
s Elle a trait en particulier à une cellule hôte transformée par un
acide nucléique dérivé du gène Sh2 ou par un vecteur recombinant, tels
que définis ci-dessus.
L'invention concerne également les plantes régénérées à partir
des cellules végétales transformées décrites ci-dessus, ainsi que les
io plantes dont au moins un des parents a été régénéré à partir d'une
cellule végétale transformée comprenant au moins une des séquences
nucléotidiques constituant une forme allélique particulière du gène Sh2.
L'invention concerne également l'utilisation d'un acide nucléique,
ou d'un vecteur recombinant ou d'une cellule hôte transformée, définis
is selon l'invention, pour fabriquer une plante transformée capable de
produire des graines à qualités industrielles ou agroalimentaires
améliorées:
Rentre également dans le cadre de l'invention une p¿ante
transformée comprenant une pluralité de cellules hôtes transformées
2o selon l'invention.
L'invention a également pour objet un procédé pour l'obtention
d'une plante transformée susceptible de produire des graines à qualités
industrielles ou agroalimentaires améliorées, caractérisé en ce qu'il
comporte les étapes suivantes
2s a) transformation d'au moins une cellule végétale par un acide
nucléique ou 'par un vecteur recombinant selon l'invention ;
b) sélection des cellules transformées obtenues à l'étape a) ayant
intëgré dans leur génome au moins une copie d'un acide
nucléique selon l'invention ;
3o c) régénération d'une plante transformée à partir des cellules
transformées obtenues à l'étape b).
L'invention s'étend à une plante transformée ou toute partie d'une
plante transformée telle pue 'définie dans la présente description, telle
que la racine, mais aussi les parties aériennes comme la tige, la feuille,
3s la fleur et surtout la graine. L'invention a encore pour objet une semence
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ou une graine de plante produite par une plante transformée telle que
définie ci-dessus. Typiquement, une telle semence transformée ou un tel
grain transformé comprend une ou plusieurs cellules comprenant dans
leur génome une ou plusieurs copies d'un acide nucléique définie selon
s l'invention, le cas échéant de manière contrôlée et inductible.
Fait également partie de l'invention tout produit de transformation
d'une semence telle que définie dans la présente description.
Anficorps dirigés spécifiquement contre les protéines SH2
to produites par un acide nucléique comprenant un site dont le
polymorphisme est décrit selon l'invention
L'invention concerne également les anticorps monoclonaux ou
polyclonaux reconnaissant spécifiquement des polypeptides
correspondant à des allèles du gène Sh2, ces allèles comprenant au
~s moins l'une des formes décrites aux positions n°-921, -830à-824, -
580à-
573, -438, -362, -347, -296, -277, -266, -168, -15, 35, 304, 515, 587,
678, 960, 1059, 1068, 1081, 1473, 1505, 1542, 1867, 2514, 2771, 2939,
2983, 3123.
Des anticorps préférés selon l'invention sont les anticorps
2o suivants
- les anticorps reconnaissant spécifiquement la région d'acides
aminés d'un polypeptide SH2 codée par les nucléotides localisés à
proximité du site polymorphe +678, ces anticorps étant capables de
discriminer entre la présence d'un résidu Alanine et la présence d'un
2s résidu Thréonine codé par le codon comprenant la base polymorphe de
ce site polymorphe ; et
- les anticorps reconnaissant spécifiquement la région d'acides
aminés d'un polypeptide SH2 codée par les nucléotides lôcalisés à
proximité du site polymorphe +2983, ces anticorps étant capables de
3o discriminer entre la présence d'un résidu Leucine et la présence d'un
résidu Sérine codé par le codon comprenant la base polymorphe de ce
site polymorphe
L'invention concerne également le kit de diagnostic comportant un
mélange de ces anticorps.
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Les anticorps définis ci-dessus sont utiles notamment pour prédire
les caractéristiques phénotypiques de quantité ou de qualité de la graine,
sans nécessiter d'analyse directe, par exemple biochimique, longue et
coûteuse de ces caractéristiques phénotypiques.
s Des anticorps contre les polypeptides SH2 définis ci-dessus
peuvent être préparés selon les techniques classiques bien connues de
l'homme du métier.
Par " anticorps " au sens de la présente invention, on entendra
notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments
io (par exemple les fragments F(ab)'2, F(ab)) ou encore tout polypeptide
comprenant un domaine de l'anticorps initial reconnaissant le polypeptide
ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention.
Des anticorps monoclonaux peuvent étre préparés à partir
d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein (1975)
is La présente invention concerne également des anticorps dirigés
contre un polypeptide tel que décrit ci-dessus ou un fragment ou un
variant de ce dernier, tel que produit dans la technique du trioma ou
encore la technique d'hybridome décrite par Kozbor et al. (1983).
L'invention a également trait à des fragments d'anticorps simple
2o chaîne Fv (ScFv) tels que décrits dans le brevet US N°4,946,778 ou
encore par Martineau et al. (1998).
Les anticorps selon l'invention comprennent également des
fragments d'anticorps obtenus à l'aide de banques de phages telles que
décrites par Ridder et al. (1995) ou encore des anticorps humanisés tels
2s que décrits par Reinmann et al. (1997) et Leger et al. (1997). Les
préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles dans des tests de
détection immunologiques destiriés à l'identification de la présence et/ou
de la quantité d'un polypepfide SH2 tel que défini ci-dessus ou d'un
fragment peptidique de celui-ci, présent dans un échantillon.
30 Un anticorps selon l'invention pourra comprendre en outre un
marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple
fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine,
selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
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Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé pour détecter la
présence d'un polypeptide conforme à l'invention dans un échantillon,
ledit procédé comprenant les étapes de:
a) mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que
s décrit ci-dessus;
b) détecter le complexe antigène/anticorps formé.
L'invention est également relative à un nécessaire ou kit de
diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide conforme à
l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant:
io a) un anticorps tel que défini ci-dessus;
b) le cas échéant, un ou plusieurs réactifs nécessaires à la
détection du complexe antigène/anticorps formé.
De surcroît, l'invention a également pour objet une base de
données comportant au moins l'une quelconque des séquences
is nucléotidiques décrites, obtenues, isolées ou identifiées dans au moins
l'une des applications de l'invention.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être
limitée, par les figures et les exemples suivants:
EXEMPLES
Exemple 1 ' Identification de sites polymorphes dans le gène Sh2.
1.1 Matériel végëtal
Au total, 33 lignées consanguines de maïs ont été analysées pour,
2s d'une part, le séquençage du gène Sh2, et d'autre part les mesures de
phénotypes du grain. Ces lignées sont d'origine européenne, américaine
ou tropicale, et leur apparentement, 'sur la base de données RFLP, est
faible (Dubreuit et al. 1996, et données non publiées). Les
caractéristiques du grain des lignées A à Z et a à e sont présentées dans
le tableau 1.
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Tableau 1 : Caractéristiques des lignées
Lignes Grain
A Corn Dent.
B Dent
C Corn-dent
D Corn
E Dent
F Corn
G Dent
H Corn
I Dent
J Dent
K Corn Dent
L Dent
M Dent
N Dent
O Dent
P Dent
Q Dent
R Dent
S Dent
T Dent
U Dent
V Farineux
W Dent
X Dent
Y Dent
Z Corn
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Tableau 1 : Caractéristiques des lignées (suite)
Lignes Grain
a Corn Dent
b Dent
c Corn
d Corn
e Corn
f Corn
s
1.2 Détection du polymorphisme du gène Sh2
L'ADN a été isolé à partir de jeunes feuilles par une méthode
décrite par Causse et al. (1995). Deux fragments chevauchants ont été
amplifiés par PCR à l'aide de primers dessinés à partir de la séquence
io de référence du gène Sh2 chez la lignée Black Mexican Sweet SEQ ID
N°1 (Shaw and Hannah, 1992). Le premier fragment (Sh2-I) de
longueur
voisine de 2653 bp couvre environ 1000bp en amont de la boite TATA
supposée, les trois premiers introns, les trois premiers exons ainsi
qu'une partie de l'exon 4. Le second fragment (SH2-II) a une longueur
is voisine de 2455 bp, et recouvre les introns 3 à 12, les exons 3 à 12 ainsi
qu'environ 30 bases de l'exon 13. Les amorces utilisées sont les suivants
(position sur la séquence de référence)
pour Sh2-I
- 5'-CTGGGCAGGGAGAGCTAT (position -1OO$) (SEQ ID N° 40)
20 - 3'-GGATATCAATAAGCCTGTAACAT (position 1623) (SEQ ID N°41 )
pour Sh2-II
- 5'-TGCAGCATTCTCAAACACAG (position 1197) (SEQ ID N°42)
- 3'-CGATGTTGCATTCTCTCAGTAA (position 3630) (SEQ ID N° 43)
Pour les deux fragments et toutes les lignées, les amplifications
2s par PCR ont été réalisées dans 100p1 (environ 0.1 à 1.5pg d'ADN, 1.75u
de taq polymérase Roche Expand High Fidelity, 0.5pM de chaque
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amorce, 0.3NM de dNTP, 1.875 mM de Mg2+) dans les conditions
suivantes
- dénaturation à 94°C : 2 min
- 9 cycles
s dénaturation à 94°C : 30 s
hybridation de 60 à 52°C (diminution de 1 °C par
cycle) : 30 s
élongation à 72°C : 2 min
- 25 cycles
1o dénaturation à 94°C : 30 s
hybridation à 51 °C : 30 s
élongation à 72°C : 2 à 10 min (augmentation de 20
s par cycle)
- élongation à 72°C : 7 min
Après purification sur gel grâce au kit QIAEX de Quiagen, les
produits de PCR ont été séquencés par les sociétés Génome Express ou
Genaxis. Tout d'abord, les amorces de PCR ont été utilisées pour la
séquence, puis la partie centrale des fragments a été séquencée grâce
2o aux nouvelles amorces suivantes
- Pour Sh2-I
5'-ATGTCCTGCACCTAGGGAGC (position -424), (SEQ ID N° 44)
5'-CCACCAGTATGCCCTCCTCA (position -58), (SEQ ID N° 45)
3'-GACCCTATTTGAACAAATCTT (position 852), (SEQ ID N° 46)
3'-GCAGCAACTCTAAGGTCTATTT (position 961), (SEQ 1D N° 47)
5'-TTTGGGAGACTTCCAGTCAA (position 1503), (SEQ ID N° 48)
- Pour Sh2-ll
3'-CATCGTCCTCGACATGTTT (position 2365), (SEQ ID N° 49)
3'-GGAAAGCAGATTAGACCATAT (position 2486), (SEQ ID N° 50)
3'-TGGAAACTGGAAACAAAAACAAC (position 3098) (SEQ ID N° 51 )
Une première correction des séquences, les contigs et
l'alignement des séquences ont été réalisés grâce aux logiciels
Sequencing Analysis et Sequence Navigator de ABI. Les séquences ont
3s été alignées soit visuellement, soit en utilisant ta procédure d'alignement
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multiple Clustal du logiciel Sequence Navigator. Les fragments n'ont été
séquencés que sur un seul brin. Néanmoins, des vérifications ont été
réalisées. Tout d'abord la partie chevauchante des fragments de
séquences n'a jamais montré d'incohérence lors de la réalisation des
s contigs. De plus, l'amplification par PCR et le séquençage ont été
répétés sur un total d'environ 10000bp afin de vérifier l'ensemble des
polymorphismes singletons (cas où une seule lignée diffère de toutes les
autres). Des résultats identiques ont toujours été obtenus pour les deux
répétitions.
io Les sites pour lesquels des différences ont été observées parmi
les séquences de Sh2 sont identifiés par leur position par rapport à la
séquence de référence de la lignées Black Mexican Sweet SEQ ID N°1
(Shaw et Hannah, 1992). Sur l'ensemble de la région séquencée, 72
sites polymorphes ont été observés. Parmi ces polymorphismes, 19
is présentent une différence pour une seule lignées, toutes les autres étant
identiques. Ces singletons ne seront pas utilisables dans la recherche
d'associations avec la variabilité phénotypique des .grains. Parmi les 53
sites informatifs restants; certains sont parfaitement redondants entre
eux, c'est à dire qu'ils apportent une information identique quant aux
2o similarités entre lignées et permettent donc une discrimination identique
en deux groupes de lignées. Parmi les 20 sites ou groupes de sites
informatifs et non redondants, ceux trouvés statistiquement associés à
des mesures phénotypiques sont indiqués dans la présentation détaillée
de l'invention. Le tableau 2 présente la forme allélique de chaque lignée,
2s ou groupe de lignées, pour ces polymorphismes.
Tableau 2' : formes alléliques aux 29 polymorphismes décrits, dont 20
SNP et 9 indels, nommés par leur position sur la séquence de référence
SEQ ID N°1 de la lignée Black Mexican Sweet (BMS). Les notes ' à 4
3o indiquent les sites redondants: le site -168 est redondant avec les sites
1473, 1542 et 2983; l'indel -830à-824 est redondant avec les sites -362,
-347, -296, -15, 515, 587, 1068, 1505 et 2939; le site -438 est redondant
avec les sites -266, 678 et 960; le site -921 est redondant avec les sites
-580à-573, -277, 35, 304, 1059, 1081, 1867, 2514, 2771 et 3123. Les
3s haplotypes H1 à H6 correspondent aux lignées suivantes
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Exemple 2: Identification des associations statistiguement
significatives entre un allèle donné des sites polymorphes du gène
Sh2 et une ou plusieurs caractéristigues phénotypigues de la
s qualite de la graine.
2,1 Mesures phénotypiques du grain
Trois essais au champ ont été réalisés. La première année (année 1 ) 30
lignées ont été étudiées, c'est à dire les lignées présentées dans le
io tableau 1 à l'exception des lignées RX01, RX02 et RX03. Pour les essais
mis en place les années 2 et 3, les 33 lignées ont été randomisées et
répétées dans trois blocs. Chaque lignée a été représentée, dans
chaque bloc, par une à quatre plante semées côte à côte. Pour chacune
des trois expérimentations, les plantes ont été autofécondées et les
1s grains récoltés à maturité. Les analyses d'associations avec les
polymorphismes moléculaires de Sh2 ont porté sur des valeurs
moyennes de chaque caractère par expérimentation.
Les teneurs en protéines, amidon et amylose de chaque lignée ont été
dosées manuellement pour l'essai de l'année 1 (voir détail des méthodes
ao dans Sene et al. 2000) et prédites par spectrométrie en réflectance dans
le proche infrarouge (NIRS) au CIRAD-Montpellier par C. Mestres et F.
Davrieux pour les essais des années 2 et 3. L'acquisition des spectres a
été effectuée sur grains entiers par un appareil Nirsystem 6500. Les
données spectrales, pour une gamme de longueurs d'onde de 400 à
2s 2500 nm, ont été collectées et analysées grâce au logiciel NIRS 2
version 4.0 (Infrasoft Internationnal). La gamme de valeurs prédites
n'étant pas parfaitement superposable à la gamme de valeurs ayant
permis le calibrage des équatiôns, une trentaine d'échantillons issue de
nos deux essais a été utilisée pour affiner le calibrage.
2.2 Associations entre polymorphismes du gène Sh2 et
caractères phénotypiques d'intérët.
Les polymorphismes décrits ci-dessus sont statistiquement associés à
des caractères du grains tels que le nombre de grains par épi, la masse
3s du grain mûr, la teneur en protéines, amidon et amylose du grain, et le
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rapport de la teneur en protéines sur la teneur en amidon du grain. Ces
associations ont été mises en évidence par des tests de régressions
multiples grâce au logiciel SAS (1990). Lorsqu'un caractère est
significativement'associé à plusieurs sites, il.est possible de définir la
s part de variabilité du caractère expliquée par l'ensemble des sites
impliqués (RZT, dernière colonne du Tableau 3). Par exemple, on peut
noter que, dans l'expérimentation de la première année, la combinaison
de l'Indel -830 à -824 et du SNP -168 permet d'expliquer 64% de la
variance du rapport protéine/amidon parmi l'ensemble des lignées. La
io redondance des sites (voir tableau 2) rend l'interprétation de causalité
fine entre un site et un caractère difficile. De plus, il est possible que des
polymorphismes non décrits dans l'invention et présents à proximité de la
région séquencée, soit dans la région promotrice soit dans la partie 3'
non séquencée du gène, soient aussi redondants avec les sites décrits et
is donc associés aux mêmes caractères. Chez la pomme de terre, une
zone importante pour la régulation de l'expression du gène se trouve à
plus de 2kb en amont de la .TATA box (Muller-Rober et al.; 1994).
Néanmoins, que la relation de causalité entre polymorphisme
moléculaire et phénotypique soit connue ou non, les associations
2o statistiques décrites dans l'invention permettent l'utilisation des SNP et
indels décrits à des fins de prédiction phénotypique ou d'amélioration de
la valeur génétique des grains de maïs.
Tableau 3 : résultats des tests d'associations par régressions multiples
2s entre chaque caractère du grain et les sites polymorphes dans la
séquence de Sh2 pour 25 à 33 lignées. Les sites indiqués sont en
redondance totale avec d'autres sites le long de la séquence de Sh2
(voir Tableau 2). Les colonnes n1, moy1, n2, et moy2 contiennent les
effectifs et les valeurs moyennes du caractère pour les deux groupes de
30 lignées discriminées par les sites polymorphes correspondants. F: valeur
du test de Fisher, P: degré de signification, R2: part de variation
phénotypique expliquée par un site, R2T: part de variation phénotypique
expliquée par un groupe de sites combinés par régression multiple.
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48
REFERENCES
Ari et al., (1986) Plant Physiol. 81, 86-91
s Ausubel et al., (1997) Current protocols in molecular biology
Bae et al. (1990) Maydica 35: 317-322.
Beaucage et al. (1981 ), Tetrahedron Lett., 22:1859-1862.
Berger et Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques
Bhave et al. (1990) The Plant Cell 2: 581-588.
io Bourdon et al., (2001 ) EMBO reports 2 (5) 394-398.
Brown et al. (1979), Methods Enzymol., 68:109-151.
Causse et al. (1995) Molecular Breeding 1: 259-272.
Christensen et al. (1996), Transgenic. Res., 5:213
Datla, R et al. (1997), Biotechnology Ann. Rev., 3:269-296
Is Dellaporta S.L., Wood J. and Hicks J.B, (1983), Plant Mol. Biol. Reporter
1 (4), 19-21.
Dubreuil et al. (1996) Crop Sci. 36: 790-799.
Finer et al. (1992) Plant Cell Report, 11, 323-328
Franck et al., (1980) Cell, 21, 285-294
2o Fromm et al., (1985) Proc. Noat. Acad. Sci. 82, 5824
Gibbs et a1.(1989), Nuceic acids research, 17, 2347.
Giliman et Smith (1979), Gene 8, 81
Giroux et al., (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5824-5829.
Goldman et al. (1993) Theor. Appl. Genet. 87: 217-224.
2s Guerche et al. (1987), Mol Gen. Genet 206, 382
Ishida et al. (1996) Nature biotechnology 14, 745-750
Kay et al., (1987) Science 236, 4805
Kohler G and Milstein C;, (1975), Nature, volume 256:495
CA 02457787 2004-02-17
WO 03/016564 PCT/FR02/02898
49
Kozbor et al., (1983), Hybridoma, vol.2 (1 ):7-16.
Leger OJ et al., (1997), Hum Antibodies, vol.8 (1 ):3-16
Lewin, (1999), Genes VII
Martineau P et al., (1998), J. Mol. Biol. vo1.280(1 ):117-127.
s Muller-Rober et al. (1994), The plant cell 6, 601-612.
Neuhaus et al., (1987).Theor. Appl. Genet. 75(1 ), 30-36
Nyrèn et al. (1997), Anal. Biochem, 244, 367-373
Reinmann KA et al. (1997), Aids Res. Hum retroviruses, vo1.13 (11 ):933-
943.
io Ridder R. et al., (1995), Biotechnology (NY), vo1.13 (3):255-260.
Roberts et al. (1987), Nature 328, 731
Sambrook et al., (2001 ), Molecular Cloning A-laboratory manual
Sanchez Pescador, (1988), J. Clin. Microbiol., 26 (10):1934-1938.
SAS (1990) SAS user guide: statistics. Version 6. SAS institute, Cary,
is North Carolina.
Schneider et al. (1995), Protein expr. Purif. 6435, 10
Séne et al. (2000) Plant Physiol. Biochem. 38: 459-472.
Shaw et Hannah (1992), Plant Physiol 98, 1214-1216
Urdea et al. (1988), Nucleic Acids Research, 11:4937-4957.
2o Watson et al. (1994) ADN recombinant, Ed. De Boek Université, 273-292
CA 02457787 2004-02-17
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LISTE DE SEQUENCES
<110> Institut National de la Recherche Agronomique (INR
Biogemma
Centre Naional de la Recherche Scientifique (CNRS)
Aventis Cropscience SA
<120> Utilisation d'associations entre au moins un
polymorphisme de séquence nucléique du gène Sh2 et au
moins une caractéristique de qualité de la graine, dans
des procédés de sélection de plantes
<130> SH2
<140>
<141>
<160> 52
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 7320
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 1
tgatgctttt tcctgggcag ggagagctat gagacgtatg tcctcaaagc cactttgcat 60
tgtgtgaaac caatatcgat ctttgttact tcatcatgca tgaacatttg tggaaactac 120
tagcttacaa gcattagtga cagctcagaa aaaagttatc tctgaaaggt ttcatgtgta 180
ccgtgggaaa tgagaaatgt tgccaactca aacaccttca atatgttgtt tgcaggcaaa 240
ctcttctgga.agaâaggtgt ctaaaactat gaacgggtta cagaaaggta taaaccacgg 300
ctgtgcattt tggaagtatc atctatagat gtctgttgag gggaaagccg tacgccaacg 360
ttatttactc agaaacagct tcaacacaca gttgtctgct ttatgatggc atctccaccc 420
aggcacccac catcacctat tcacctatct ctcgtgcctg tttattttct tgccctttct 480
gatcataaaa aatcattaag agtttgcaaa catgcatagg catatcaata tgctcattta 540
ttaatttgct agcagatcat cttcctactc tttactttat ttattgtttg aaaaatatgt 600
cctgcaccta gggagctcgt atacagtacc aatgcatctt cattaaatgt gaatttcaga 660
aaggaagtag gaacctatga gagtattttt caaaattaat tagcggcttc tattatgttt 720
atagcaaagg ccaagggcaa aatcggaaca ctaatgatgg ttggttgcat gagtctgtcg 780
attacttgca agaaatgtga acctttgttt ctgtgcgtgg gcataaaaca aacagcttct 840
agcctctttt acggtacttg cacttgcaag aaatgtgaac tccttttcat ttctgtatgt 900
ggacataatg ccaaagcatc caggcttttt catggttgtt gatgtcttta cacagttcat 960
ctccaccagt atgccctcct catactctat ataaacacat caacagcatc gcaattagcc 1020
acaagatcac ttcgggaggc aagtgtgatt tcgaccttgc agccaccttt ttttgttctg 1080
ttgtaagtat actttccctt accatcttta tctgttagtt taatttgtaa ttgggaagta 1140
ttagtggaaa gaggatgaga tgctatcatc tatgtactct gcaaatgcat ctgacgttat 1200
atgggctgct tcatataatt tgaattgctc cattcttgcc gacaatatat tgcaaggtat 1260
atgcctagtt ccatcaaaag ttctgttttt tcattctaaa agcattttag tggcacgcaa 1320
ttttgtccat gagggaaagg aaatctgttt tggttacttt gcttgaggtg cattcttcat 1380
atgtccagtt ttatggaagt aataaacttc agtttggtca taagatgtca tattaaaggg 1440
caaacatata ttcaatgttc aattcatcgt aaatgttccc tttttgtaaa agattgcata 1500
ctcatttatt tgagttgcag gtgtatctag tagttggagg agatatgcag tttgcacttg 1560
cattggacac gaactcaggt cctcaccaga taagatcttg tgagggtgat gggattgaca 1620
ggttggaaaa attaagtatt gggggcagaa agcaggagaa agctttgaga aataggtgct 1680
ttggtggtag agttgctgca actacacaat gtattcttac ctcagatgct tgtcctgaaa 1740
ctcttgtaag tatccacctc aattattact cttacatgtt ggtttacttt acgtttgtct 1800
tttcaaggga aatttactgt attttttgtg ttttgtggga gttctatact tctgttggac 1860
tggttattgt aaagatttgt tcaaataggg tcatctaata attgtttgaa atctgggaac 1920
tgtggtttca ctgcgttcag gaaaaagtga attattggtt actgcatgaa taacttatgg 1980
aaatagacct tagagttgct gcatgattat cacaaatcat tgctacgata tcttataata 2040
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gttctttcga cctcgcatta catatataac tgcaactcct agttgcgttc aaaaaaaaaa 2100
atgcaactct tagaacgctc accagtgtaa tctttcctga attgttattt aatggcatgt 2160
atgcactact tgtatactta tctaggatta agtaatctaa ctctaggccc catatttgca 2220
gcattctcaa acacagtcct ctaggaaaaa ttatgctgat gcaaaccgtg tatctgctat 2280
cattttgggc ggaggcactg gatctcagct ctttcctctg acaagcacaa gagctacgcc 2340
tgctgtaagg gataacactg aacatccaac gttgattact ctattatagt attatacaga 2400
ctgtactttt cgaatttatc ttagttttct acaatattta gtggattctt ctcattttca 2460
agatacacaa ttgatccata atcgaagtgg tatgtaagac agtgagttaa aagattatat 2520
tttttgggag acttccagtc aaattttctt agaagttttt ttggtccaga tgttcataaa 2580
gtcgccgctt tcatactttt tttaattttt taattggtgc actattaggt acctgttgga 2640
ggatgttaca ggcttattga tatccctatg agtaactgct tcaacagtgg tataaataag 2700
atatttgtga tgagtcagtt caattctact tcgcttaacc gccatattca tcgtacatac 2760
cttgaaggcg ggatcaactt tgctgatgga tctgtacagg tgatttacct catcttgttg 2820
atgtgtaata ctgtaattag gagtagattt gtgtggagag aataataaac agatgccgag 2880
attcttttct aaaagtctag atccaaaggc attgtggttc aaaacactat ggacttctac 2940
catttatgtc attactttgc cttaatgttc cattgaatgg ggcaaattat tgattctaca 3000
âgtgtttaat taaaaactaa ttgttcatcc tgcaggtatt -agcggctaca caaatgcctg 3060
aagagccagc tggatggttc cagggtacag cagactctat cagaaaattt atctgggtac 3120
tcgaggtagt tgatattttc tcgtttatga atgtccattc actcattcct gtagcattgt 3180
ttctttgtaa ttttgagttc tcctgtattt ctttaggatt attacagtca caaatccatt 3240
gacaacattg taatcttgag tggcgatcag ctttatcgga tgaattacat ggaacttgtg 3300
caggtatggt gttctcttgt tcctcatgtt tcacgtaatg tcctgatttt ggattaacca 3360
actacttttg gcatgcatta tttccagaaa catgtcgagg acgatgctga tatcactata 3420
tcatgtgctc ctgttgatga gaggtaatca gttgtttata tcatcctaat atgaatatgt 3480
catcttgtta tccaacacag gatgcatatg gtctaatctg ctttcctttt ttttcccttc 3540
ggaagccgag cttctaaaaa tgggctagtg aagattgatc atactggacg tgtacttcaa 3600
ttctttgaaa aaccaaaggg tgctgatttg aattctatgg ttagaaattc cttgtgtaat 3660
ccaattcttt tgttttcctt tctttcttga gatgaacccc tcttttagtt atttccatgg 3720
ataacctgta cttgacttat tcagaaatga ttttctattt tgctgtagaa tctgacacta 3780
aagctaatag cactgatgtt gcagagagtt gagaccaact tcctgagcta tgctatagat 3840
gatgcacaga aatatccata ccttgcatca atgggcattt-atgtcttcaa gaaagatgca 3900
cttttagacc ttctcaâgtâ. atcactttcc tgtgâcttat ttctatccaa ctcctagttt 3960
accttctaac agtgtcaatt cttaggtcaa aatatactca attacatgac tttggatctg 4020
aaatcctccc aagagctgta ctagatcata gtgtgcaggt aagtctgatc tgtctggagt 4080
atgtgttctg taaactgtaa attcttcatg tcaaaaagtt gtttttgttt ccagtttcca 4140
ctaccaatgc acgatttatg tattttcgct tccatgcatc atacatacta acaatacatt 4200
ttacgtattg tgttaggcat gcatttttac gggctattgg gaggatgttg gaacaatcaa 4260
atcattcttt gatgcaaact tggccctcac tgagcaggta ctctgtcatg tattctgtac 4320
tgcatatata ttacctggaa ttcaatgcat agaatgtgtt agaccatctt agttccatcc 4380
tgttttcttc aattagctta tcatttaata gttgttggct agaatttaaa cacaaattta 4440
cctaatatgt ttctctcttc agccttccaa gtttgatttt tacgatccaa aaacaccttt 4500
cttcactgca ccccgatgct tgcctccgac gcaattggac aagtgcaagg tatatgtctt 4560
actgagcaca attgttacct gagcaagatt ttgtgtactt gacttgttct cctccacaga 4620
tgaaatatgc atttatctca gatggttgct tactgagaga atgcaacatc gagcattctg 4680
tgattggagt ctgctcacgt gtcagctctg gatgtgaact caaggtacat actctgccaa 4740
tgtatctact cttgagtata ccatttcaac accaagcatc accaaatcac acagaacaat 4800
agcaacaaag ccttttagtt ccaagcaatt tagggtagcc tagagttgaa atctaacaaa 4860
acaaaagtca aagctctatc acgtggatag ttgttttcca tgcactctta tttaagctaa 4920
ttttttgggt atactacatc catttaatta ttgttttatt gcttcttccc tttgcctttc 4980
ccccattact atcgcgtctt aagatcatac tacgcactag tgtctttaga ggtctctggt 5040
ggacatgttc aaaccatctc aatcggtgtt ggacaagttt ttcttgaatt tgtgctacac 5100
ctaacctatc acgtatgtca tcgtttcaaa ctcgatcctt cctgtatcat cataaatcca 5160
atgcaacata cgcatttatg caacatttat ctgttgaaca tgtcatcttt ttgtaggtta 5220
acattatgca ccatacaatg tagcatgtct aatcatcatc ctataaaatt tacattttag 5280
cttatgtggt atcctcttgc cacttagaac accatatgct tgatgccatt tcatccaccc 5340
tgctttgatt ctatggctaa catcttcatt aatatcctcg cctctctgta tcattggtcc 5400
taaatatgga aatacattct ttctgggcac tacttgacct tccaaactaa cgtctccttt 5460
gctcctttct tgtgtgtagt agtaccgaag tcacatctca tatattcggt tttagttcta 5520
ctaagtcccg ggttcgatcc ccctcagggg tgaatttcgg gcttggtaaa aaaaatcccc 5580
tcgctgtgtc ccgcccgctc tcggggatcg atatcctgcg cgccaccctc cggctgggca 5640
ttgcagagtg agcagttgat cggctcgtta gtgatgggga gcggggttca agggttttct 5700
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cggccgggac catgtttcgg tctcttaata taatgccggg agggcagtct ttccctcccc 5760
ggtcgagttt tagttctacc gagtctaaaa cctttggact ctagagtccc ctgtcacaac 5820
tcacaactct agttttctat ttacttctac ctagcgttta ttaatgatca ctatatcgtc 5880
tgtaaaaagc atacaccaat gtaatcccct tgtatgtccc ttgtaatatt atccatcaca 5940
agaaaaaaag gtaaggctca aagttgactt ttgatatagt cctattctaa tcgagaagtc 6000
atctgtatct tcgtctcttg ttcgaacact agtcacaaaa ttttttgtac atgttcttaa 6060
tgagtccaac gtaatattcc ttgatatttt gtcataagcc ctcatcaagt caatgaaaat 6120
cacgtgtagg tccttcattt gttccttata ctgctccatc acttgtctca ttaagaaaat 6180
ctctctcata gttaaccttt tggcatgaaa caaaatcaca cagaagttgt ttcctttttt 6240
taagatccca cacaaaagag gtttgatcta aggaatctgg atccctgaca ggtttatcaa 6300
aatcctttgt gtttttctta aaactgaata ttcctccagc ttctagtatt gatgtaatat 6360
tcaatctgtt tagcaagtga acaccttggt tcttgttgtt actgtacccc cccccccccc 6420
ccccccccga ggcccagatt accacgacat gaatacaaga atattgaacc cagatctaga 6480
gtttgtttgt actgttgaaa atcggtgaca attcattttg ttattgcgct ttctgataac 6540
gacaggactc cgtgatgatg ggagcggaca cctatgaaac tgaagaagaa gcttcaaagc 6600
tactgttagc tgggaaggtc ccagttggaa taggâaggaa.cacaaagata.aggtgagtat 6660
ggatgtggaa ccaccggtta gttcccaaaa atatcactca ctgatacctg atggtatcct 6720
ctgattattt tcaggaactg tatcattgac atgaatgcta ggattgggaa gaacgtggtg 6780
atcacaaaca gtaaggtgag cgagcgcacc tacatgggtg cagaatcttg tgtgctcatc 6840
tatcctaatt cggtaattcc tatccagcgc tagtcttgtg accatggggc atgggttcga 6900
ctctgtgaca gggcatccaa gaggctgatc acccggaaga agggtactac ataaggtctg 6960
gaatcgtggt gatcttgaag aatgcaacca tcaacgatgg gtctgtcata tagatcggct 7020
gcgtgtgcgt ctacaaaaca agaacctaca atggtattgc atcgatggat cgtgtaacct 7080
tggtatggta agagccgctt gacagaaagt cgagcgttcg ggcaagatgc gtagtctggc 7140
atgctgttcc ttgaccattt gtgctgctag tatgtactgt tataagctgc cctagaagtt 7200
gcagcaaacc tttttatgaa cctttgtatt tccattacct gctttggatc aactatatct 7260
gtcatcctat atattactaa atttttacgt gtttttctaa ttcggtgctg cttttgggat 7320
<210> 2
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base G
<400> 2
ttgtgtgaaa ccaatatcga tctttgttac ttcatcatgc atgaacattt gtggaaacta 60
ctagcttaca agcattagtg a 81
<210> 3
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base G
<400> 3
aatttgctag cagatcatct tcctactctt tactttattt attgtttgaa aaatatgtcc 60
tgcacctagg gagctcgtat a 81
<210> 4
<211> 80
CA 02457787 2004-02-17
WO 03/016564 PCT/FR02/02898
4/15
<212> ADN
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base A
<400> 4
gtatacagta ccaatgcatc ttcattaaat gtgaatttca gaaaggaagt aggaacctat 60
gagagtattt ttcaaaatta 80
<210> 5
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mâys
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base T
<400> 5
gcatcttcat taaatgtgaa tttcagaaag gaagtaggaa cctatgagag tatttttcaa 60
aattaattag cggcttctat t 81
<210> 6
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base T
<400> 6
atttttcaaa attaattagc ggcttctatt atgtttatag caaaggccaa gggcaaaatc 60
ggaacactaa tgatggttgg t 81
<210> 7
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base T
<400> 7
cggcttctat tatgtttata gcaaaggcca agggcaaaat cggaacacta atgatggttg 60
gttgcatgag tctgtcgatt a 81
<210> 8
<211> 81
<212> ADN
CA 02457787 2004-02-17
WO 03/016564 PCT/FR02/02898
5/15
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base C
<400> 8
atgtttatag caaaggccaa gggcaaaatc ggaacactaa tgatggttgg ttgcatgagt 60
ctgtcgatta cttgcaagaa a 81
<210> 9
<211> 81
<212> ADN
<213 > Zea majrs
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base A
<400> 9
gtgcgtgggc ataaaacaaa cagcttctag cctcttttac ggtacttgca cttgcaagaa 60
atgtgaactc cttttcattt c 81
<210> 10
<211> 81
<212> ADN
<213>. Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base A
<400> 10
ccagtatgcc ctcctcatac tctatataaa cacatcaaca gcatcgcaat tagccacaag 60
atcacttcgg gaggcaagtg t 81
<210> 11
<211> S1
<212> ADN
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base T
<400> 11
ttagccacaa gatcacttcg ggaggcaagt gtgatttcga ccttgcagcc accttttttt 60
gttctgttgt aagtatactt t 81
<210> 12
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
CA 02457787 2004-02-17
WO 03/016564 PCT/FR02/02898
6/15
c220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base C
<400> 12
tgcatactca tttatttgag ttgcaggtgt atctagtagt tggaggagat atgcagtttg 60
cacttgcatt ggacacgaac t 81
<210> 13
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base C
<400> 13
acacgaactc aggtcctcac cagataagat cttgtgaggg tgatgggatt gacaggttgg 60
aaaaattaag tattgggggc a 81
<210> 14
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
c222> (41)
c223> Base A
<400> 14
gaaagctttg agaaataggt gctttggtgg tagagttgct gcaactacac aatgtattct 60
tacctcagat gcttgtcctg a 81
<210> 15
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base A
c400> 15
ggaaaaagtg aattattggt tactgcatga ataacttatg gaaatagacc ttagagttgc 60
tgcatgatta tcacaaatca t 81
<210> 16
<211> 81
<212> ADN
c213> Zea mays
CA 02457787 2004-02-17
WO 03/016564 PCT/FR02/02898
7/15
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base G
<400> 16
tagttctttc gacctcgcat tacatatata actgcaactc ctagttgcgt tcaaaaaaaa 60
aaatgcaact cttagaacgc t 81
<210> 17
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea maya
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base G
<400> 17
cgacctcgca ttacatatat aactgcaact cctagttgcg ttcaaaaaaa aaaatgcaac 60
tcttagaacg ctcaccagtg t 81
<210> 18
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea maya
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base C
<400> 18
cattttcaag atacacaatt gatccataat cgaagtggta tgtaagacag tgagttaaaa 60
gattatattt tttgggagac t 81
<210> 19
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea maya
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base C
<400> 19
atttgtgtgg agagaataat aaacagatgc cgagattctt ttctaaaagt ctagatccaa 60
aggcattgtg gttcaaaaca c 8l
<210> 20
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea maya
<220>
CA 02457787 2004-02-17
WO 03/016564 PCT/FR02/02898
8/15
<221> variation
<222> (41)
<223> Base G
<400> 20
taatcacttt cctgtgactt atttctatcc aactcctagt ttaccttcta acagtgtcaa 60
ttcttaggtc aaaatatact c 81
<210> 21
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
<220>
<221> variation
<222> (41)
<223> Base C
<400> 21
cttctaacag tgtcaattct taggtcaaaa tatactcaat tacatgactt tggatctgaa 60
atcctcccaa gagctgtact a 81
<210> 22
<211> 87
<212> ADN
<213> Zea maya
<400> 22
aaaagttatc tctgaaaggt ttcatgtgta.ccgtgggaaa tgagaaatgt tgccaactca 60
aacaccttca atatgttgtt tgcaggc 87
<210> 23
<211> 80
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 23
aaaagttatc tctgaaaggt ttcatgtgta ccgtgggaaa tgttgccaac tcaaacacct 60
tcaatatgtt gtttgcaggc 80
<210> 24
<211> 88
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 24
tgtctgcttt atgatggcat ctccacccag gcacccacca tcacctattc acctatctct 60
cgtgcctgtt tattttcttg ccctttct 88
<210> 25
<211> 80
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 25
tgtctgcttt atgatggcat ctccacccag gcacccacca tcacctatct ctcgtgcctg 60
CA 02457787 2004-02-17
WO 03/016564 PCT/FR02/02898
9/15
tttattttct tgccctttct SO
<210> 26
<211> 80
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 26
gttttttcat tctaaaagca ttttagtggc acgcaatttt gtccatgagg gaaaggaaat 60
ctgttttggt tactttgctt 80
<210> 27
<211> 81 .
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 27
gttttttcat tctaaaagca ttttagtggc acgcaatttt tgtccatgag ggaaaggaaa 60
tctgttttgg ttactttgct t 81
<210> 28
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 28
catatataac tgcaactcct agttgcgttc aaaaaaaaaa atgcaactct tagaacgctc 60
accagtgtaa tctttcctga a 81
<210> 29
<211> 80
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 29
catatataac tgcaactcct agttgcgttc aaaaaaaaaa tgcaactctt agaacgctca 60
ccagtgtaat ctttcctgaa 80
<210> 30
<211> 80
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 30
agtggtatgt aagacagtga gttaaaagat tatatttttt gggagacttc cagtcaaatt 60
ttcttagaag tttttttggt 80
<210> 31
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 31
agtggtatgt aagacagtga gttaaaagat tatatttttt tgggagactt ccagtcaaat 60
tttcttagaa gtttttttgg t 81
CA 02457787 2004-02-17
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10/15
<210> 32
<211> 80
<212> ADN
<213> Zea mays
<400> 32
tttgggagac ttccagtcaa attttcttag aagttttttt ggtccagatg ttcataaagt 60
cgccgctttc atactttttt 80
<210> 33
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea maya
<400> 33
tttgggagac ttccagtcaa attttcttag aagttttttt tggtccagat gttcataaag 60
tcgccgcttt catacttttt t 8l
<210> 34
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea maya
<400> 34
aacacaggat gcatatggtc taatctgctt tccttttttt tcccttcgga agccgagctt 60
ctaaaaatgg gctagtgaag a 81
<210> 35
<211> 80
<212> ADN
<213> Zea maya
<400> 35
aacacaggat gcatatggtc taatctgctt tccttttttt cccttcggaa gccgagcttc 60
taaaaatggg ctagtgaaga 80
<210> 36
<211> 80
<212> ADN
<213> Zea maya
<400> 36
tttctatttt gctgtagaat ctgacactaa agctaatagc actgatgttg cagagagttg 60
agaccaactt cctgagctat 80
<210> 37
<211> 81
<212> ADN
<213> Zea maya
<400> 37
tttctatttt gctgtagaat ctgacactaa agctaatagc tactgatgtt gcagagagtt 60
gagaccaact tcctgagcta t 81
CA 02457787 2004-02-17
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11/15
<210> 38
<211> BO
<212> ADN
<213> Zea maya
<400> 38
tcttcatgtc aaaaagttgt ttttgtttcc agtttccact accaatgcac gatttatgta 60
ttttcgcttc catgcatcat 80
<210> 39
<211> 91
<212> ADN
<213> Zea maya
<400> 39
tcttcatgtc aaaaagttgt ttttgtttcc agtttccact gtttttattt aaccaatgca 60
cgatttatgt attttcgctt ccatgcatca t 91
<210> 40
<211> 18
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 40
ctgggcaggg agagctat 18
<210> 41
<211> 23
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 41
ggatatcaat aagcctgtaa cat 23
<210> 42
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 42
tgcagcattc tcaaacacag 20
<210> 43
<211> 22
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
CA 02457787 2004-02-17
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12/15
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 43
cgatgttgca ttctctcagt aa 22
<210> 44
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 44
atgtcctgca cctagggagc 20
<210> 45
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 45
ccaccagtat gccctcctca 20
<210> 46
<211> 21
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 46
gaccctattt gaacaaatct t 21
<210> 47
<211> 22
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> '47
gcagcaactc taaggtctat tt 22
<210> 48
<211> 20
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
CA 02457787 2004-02-17
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13/15
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 48
tttgggagac ttccagtcaa 20
<210> 49
<211> 19
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 49
catcgtcctc gacâtgttt 19
<210> 50
<211> 21
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 50
ggaaagcaga ttagaccata t 21
<210> 51
<211> 23
<212> ADN
<213> Séquence artificielle
<220>
<223> Description de la séquence artificielle: amorce
<400> 51
tggaaactgg aaacaaaaac aac 23
<210> 52
<211> 516
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 52
Met Gln Phe Ala Leu Ala Leu Asp Thr Asn Ser Gly Pro His Gln Ile
1 5 10 15
Arg Ser Cye Glu Gly Asp Glj~ Ile Asp Arg Leu Glu L~s Leu Ser Ile
20 25 30
Gly Gly Arg Lys Gln Glu Lys Ala Leu Arg Asn Arg Cys Phe Gly Gly
35 40 45
Arg Val Ala Ala Thr Thr Gln Cys Ile Leu Thr Ser Asp Ala Cys Pro
50 55 60
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14/15
Glu Thr Leu His Ser Gln Thr Gln Ser Ser Arg Lys Asn Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ala Asn Arg Val Ser Ala Ile Ile Leu Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gln
85 90 95
Leu Phe Pro Leu Thr Ser Thr Arg Ala Thr Pro Ala Val Pro Val Gly
100 105 110
Gly Cys Tyr Arg Leu Ile Asp Ile Pro Met Ser Asn Cys Phe Asn Ser
115 120 125
Gly Ile Asn Lys Ile Phe Val Met Ser Gln Phe Asn Ser Thr Ser Leu
130 135 140
Asn Arg His Ile His Arg Thr Tyr Leu Glu Gly Gly Ile Asn Phé Ala
145 150 ' 155 160
Asp Gly Ser Val Gln Val Leu Ala Ala Thr Gln Met Pro Glu Glu Pro
165 170 175
Ala Gly Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp Ser Ile Arg Lys Phe Ile Trp
180 185 190
Val Leu Glu Asp Tyr Tyr Ser His Lys Ser Ile Asp Asn Ile Val Ile
195 200 205
Leu Ser Gly Asp Gln Leu Tyr Arg Met Asn Tyr Met Glu Leu Val Gln
210 215 220
Lys His Va1 Glu Asp Asp Ala Asp Ile Thr Ile Ser Cys Ala Pro VaT
225 230 235 240
Asp Glu Ser Arg Ala Ser Lys Asn Gly Leu Val Lys Ile Asp His Thr
245 250 255
Gly Arg Val Leu Gln Phe Phe Glu Lys Pro Lys Gly Ala Asp Leu Asn
260 265 270
Ser Met Arg Val Glu Thr Asn Phe Leu Ser Tyr Ala Ile Asp Asp Ala
275 280 285
Gln Lys Tyr Pro Tyr Leu Ala Ser Met Gly Ile Tyr Val Phe Lys Lys
290 295 300
Asp Ala Leu Leu Asp Leu Leu Lys Ser Lys Tyr Thr Gln Leu His Asp
305 310 315 320
Phe Gly Ser Glu Ile Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp His Ser Val Gln
325 330 335
Ala Cys Ile Phe Thr Gly Tyr Trp Glu Asp Val Gly Thr Ile Lys Ser
340 345 350
Phe Phe Asp Ala Asn Leu Ala Leu Thr Glu Gln Pro Ser Lys Phe Asp
355 360 365
Phe Tyr Asp Pro Lys Thr Pro Phe Phe Thr Ala Pro Arg Cys Leu Pro
370 375 380
Pro Thr Gln Leu Asp Lys Cys Lys Met Lys Tyr Ala Phe Ile Ser Asp
CA 02457787 2004-02-17
WO 03/016564 PCT/FR02/02898
15/15
385 390 395 400
Gly Cys Leu Leu Arg Glu Cys Asn Ile Glu His Ser Val Ile Gly Val
405 410 415
Cys Ser Arg Val Ser Ser Gly Cys Glu Leu Lys Asp Ser Val Met Met
420 425 430
Gly Ala Asp Thr Tyr Glu Thr Glu Glu Glu Ala Ser Lys Leu Leu Leu
435 440 445
Ala Gly Lys Val Pro Val Gly Ile Gly Arg Asn Thr Lys Ile Arg Asn
450 455 460
Cys Ile Ile.Asp Met Asn Ala Arg Ile Gly Lys Asn Val Val Ile Thr
465 470 475 480
Asn Ser Lys Gly Ile Gln Glu Ala Asp His Pro Glu Glu Gly Tyr Tyr
485 490 495
Ile Arg Ser Gly Ile Val Val Ile Leu Lys Asn Ala Thr Ile Asn Asp
500 505 510
Gly Ser Val Ile
515
