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WO 03/035886 PCT/FR02/03617
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PREPARATION D'HEPARINE A PARTIR DE CULTURES DE MASTOCYTES.
La présente invention est relative à la
préparation d'héparine à partir de cultures de cellules.
L'héparine appartient à la famille des
glycosaminoglycanes (GAG), qui regroupe les polysaccharides
linéaires contenant _ une répétition d'une séquence
disaccharidique se composant d'un sucre aminé (D-
glucosamine ou galactosamine) et d'un acide uronique (D-
glucuronique ou iduronique).
Dans le cas de l' héparine, qui appartient, avec
l'héparane sulfate, à la sous-famille des
glucosaminoglycanes le sucre aminé est la D-glucosamine.
L'acide uronique est soit l'acide glucuronique (,Glc), soit
l'acide iduronique (Ido). La glucosamine peut être N-
acétylëe, N-sulfatée ou O-sulfatée.
Conventionnellement, on désigne sous le terme
"héparine" des. polysaccharides hautement sulfatés dans
lesquels plus de 80~ des résidus glucosamine sont N-
sulfatés et le nombre de 0-sulfate est plus important que
celui des N-sulfates. Le rapport sulfate/disaccharide est
généralement supérieur à 2 pour l'héparine. Cependant, la
structure ~de l' hêparine est en fait très hétérogène, et il
existe des chaînes pouvant contenir des rapports très
différents.
35~ Comme tous les GAGs, l'héparine est synthétisée
sous forme d'un protéoglycane. Cette synthèse a lieu
prêfèrentiellement dans une sous-population de mastocytes,
les mastocytes séreux ou conjonctifs (CTMC). Ces mastocytes
sont abondants dans la peau, et les sous-muqueuses
respiratoires. Leur durée de vie est très longue (au moins
6 mois). Outre l'héparine, ils contiennent de l'héparane
sulfate, et des quantités appréciables d'histamine (environ
10 pg/cellule, selon l'espèce animale).
La première étape de la synthèse de l'héparine
est la formation du noyau protéique serglycine, constitué
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de résidus sérine et glycine, régulièrement alternés.
L' élongation de la draine d' héparine se fait à partir d' un
tétrasaccharide, par ajouts successifs d'osamine et
d'acides uroniques.
Le protéoglycane ainsi formé subit de nombreuses
transformations séquentielles . N-désacétylation,
N -sulfatation, épimérisation de l'acide D-glucuronique, et
O-sulfatation.
Toutefois, cette maturation complète n'a lieu
que sur une partie du protéoglycane, ce qui génère une
grande variabilité structurale de l'héparine, responsable
de son hétérogénéité.
_ Les chaînes de polysaccharides sont ensuite
clivées de la serglycine par une endoglucuronidase. Ces
chaînes ont alors un poids moléculaire entre 5000 et
30000 Da. Elles forment des complexes avec les protéases
basiques et sont ainsi stockées dans les granules des
mastocytes. L'héparïne est excrétée uniquement lors de la
dégranulation des mastocytes.
L'héparïne joue un rôle biologique important,
notamment dans l'hémostase, et est très largement utilisée
en thérapeutique, en particulier en tant qu'agent
anticoagulant et antithrombotique.
Actuellement, la majeure partie de l'héparine
~5 u~ilisëe est isolée à partir de la muqueuse intestinale du
porc, d'où elle est extraite par protéolyse, suivie de
purification sur résine échangeuse d'anions (pour revue sur
les différents procédés de préparation de l'héparine, cf.
DUCLOS; « L'Héparine . fabrication, structure, propriétés,
analyse »; Ed. Masson, Paris, 1984).
A l'hétérogénéité inhérente à l'héparine,
s'ajoute 1a diversité des lots d'animaux à partir desquels
elle est obtenue. Il en résulte une variabilitë très
importante, se traduisant notamment au niveau de l'activité
biologique. En outre, il est difficile de disposer de
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manière régulière d'un approvisionnement suffisant en
matière première.
L'utilisation de cellules issues de mammifères
pour la production de GAG ou de ou de protéoglycanes a déjà
Été proposëe.
Ainsi la demande WO 99/26983 décrit
l'obtention de composés de type héparinique, qui peuvent
ttre des protéoglycanes (HEP-PG) ou des glycosaminoglycanes
(HFP-GAG) à partir de cellules de mastocytes de rat. Les
composés ne sont pas de l'héparine. Les cellules ainsi
solèes ne sont pas des lignëes établies. En outre le
demandeur recommande la co-cultivation des cellules isolées
ûvec des fibroblastes.
L'article de Wang et Kovanen (Circulation
~e.search,_ 84, 1, 74-83, 1999)décrit lui aussi l'isolement
~de mastocytes séreux de rat et la production de
oro~èoglycanes à partir de ces cellules. Comme dans la
de~-~ande WO 99/26983, les cellules utilisées pour la
__~~duction de protéoglycanes ne sont pas des lignées
2C _rwbl_ies mais simplement des cellules isolées, puis
s~__nulées pour produire des protéoglycanes.
La demande WO 90/14418, citée dans le rapport de
__~herche, décrit des .lignées cellulaires obtenues à partir
mastocytomes de souris et leur utilisation pour la
2~ __~,duction d'héparine. Ces cellules ont donc une origine
_.~:unrale ce qui est susceptible de soulever des problèmes
sanitaires. Un article de Montgomery et al (Proc Natl Acad
Sc_ USA, 89, 23, 11327-11331, 1992) décrit lui aussi
;'-solement de mastocytomes de souris.
30 La présente invention propose de pallier les
inconvénients mentionnés ci-dessus et de s'affranchir des
problèmes d'approvisionnement en termes de quantité et de
qualité, en utilisant une source commodément disponible de
matiëre première homogène, et aux caractéristiques stables,
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facilitant l'obtention de préparations d'héparine de
qualité constante.
Les Inventeurs ont constaté qu'il était possible
de produire en quantité importante à partir de cultures de
lignées de mastocytes, de l'héparine possédant des
propriétés comparables à celles de l'héparine extraite du
mucus intestinal porcin. L'utilisation de cultures
cellulaires comme matière première permet en outre de
co:Ztr~~ler les conditions de synthèse de l' héparine, et
d'obtenir ainsi un produit possédant des caractéristiques
re~~r ociuctibles .
La présente invention a pour objet un procédé de
production d'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend la
culture de mastocytes d'origine porcine et la récupération
de 1'héparine à partir des cultures obtenues.
De manière préférée, lesdites cultures de
mas~c~cytes sont des lignées de mastocytes d'origine
:~o~-cine .
Le terme « culture » désigne ici, de manière
générale, une cellule ou un ensemble de cellules cultivées
?:~ w?iro. Une culture développée directement à partir d'un
~r-ëlévement cellulaire ou tissulaire effectué sur un animal
rs~ dénommée « culture primaire ». Le terme « lignée » est
employé à partir du moment où au moins un passage, et
?5 _;~:_~~ral eurent plusieurs passages consécutifs en sous-culture
_~n~ été effectués avec succès, et désigne toute culture qui
~n est issue. (SCHAEFFER, In Vitro Cellular and
Developmental Biology, 26, 91-101, 1990).
Avantageusement, lesdits mastocytes sont issus
de cultures et notamment de lignées de mastocytes porcins
obtenues comme décrit dans la Demande FR 0113608, ainsi que
dans la Demande PCT intitulée « Cultures de mastocytes de
porc et leurs utilisations » au nom de~l'INRA, et de l'ENVA
~_a~posée le même jour que la présente Demande. Parmi celles
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ci, des lignées préférées pour la mise en ouvre du procédé
conforme à l'invention sont .
- la lignée de mastocytes issus de foie fatal de
porc déposée par l'INRA (147 rue de l'Université, 75007
5 Paris, France) auprès de la CNCM (Collection Nationale de
Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 26, rue du
D~~~cteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, France) le 17 octobre
''001, sous le numéro I-2735 ;
- la lignëe de mastocytes issus de foie fatal de
porc, et transfectés par l'antigène T du virus SV40 déposée
par l'INRA auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous 1e
numéro I-2736 ;
- la lignée de mastocytes issus de moelle
osseuse de fétus de porc et transfectés par l'antigène T du
virus SV40, déposée par l'INRA auprès de la CNCM 1e
17 octobre 2001, sous le numéro I-2734.
Préférentiellement ces mastocytes~ sont des
mastocytes séreux.
Ces mastocytes seront de préférence cultivés
dans un milieu de culture défini (MEMa/DMEM, RPMI, IMDM,
...) supplémenté en facteurs de croissance, utilisés en
combinaison ou de façon individuelle, tels que le SCF (Stem
Cell Factor) à une concentration comprise entre 1 ng/ml et
1 yg/ml, et éventuellement l'IL3 (Interleukine 3) à une
~'S concentration comprise entre 0,1 ng/ml et 100 ng/ml, ou la
PGE~' (prostaglandine E2), à une concentration comprise
entre 1 nM et 1 ~~M.
Les milieux peuvent également être supplémentés
avec du sérum bovin, à une concentration comprise entre
0, 5 ri et 20 ô (ZT/V)
L'addition de sérum bovin dans les milieux de
culture peut être remplacée par l'utilisation d'un milieu
de culture sans sérum tel que AIMV (INVITROGEN) de façon à
réduire la concentration protéique du milieu et les risques
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associés à l'utilisation de composés d'origine animale
(I,AMBE et al., J. Immunol. Methods, 240, 101-10, 200).
L'indépendance des cellules vis-à-vis de l'ajout
de sérum et/ou de l'utilisation de facteurs de croissance,
peut être obtenue par mutation controlée du phénotype
cellulaire par l'action d'agents transformants et/ou
immortalisants (TSUJIMURA, Pathology International, 46,
933-8, 1996 ; PIAO et BERNSTEIN, Blood, 87(8), 3117-23,
1996) .
Les mastocytes peuvent être cultivés en
utilisant les techniques développées pour la culture en
masse de cellules eucaryotes, comme décrit par exemple par
GRIFFITHS et al. (Animal Cell Biology, , Eds. Spier et
Griffiths, Academic Press, Londres, vol.3, 179-220, 1986).
On peut utiliser des bioréacteurs de capacité supérieure à
plusieurs m3 comme décrit par PHILIPS et al. (Large Scale
Mammalian Cell Culture, Eds. Feder et Tolbert, Academic
Press, Orlando, U.S.A., 1985), ou par MIZRAHI (Process
Biochem, Août, 9-12, 1983).
~'0 La culture peut également être rëalisée en
suspension ou sur micro-support selon 1a technique décrite
par VAN MEZEL (Nature, 216, 64-65, 1967).
On peut êgalement utiliser des systèmes de
culture en lots (batch), qui sont fréquemment utilisés pour
5 les culte-'-es de cellules eucaryotes, du fait de leur plus
grande simplicitP de mise en ouvre à l'échelle industrielle
(VGGEL e~ TODARO, Fermentation and Biochemical Engineering
Handbook, 2"'r edition, Noyes Publication, Westwood, New
Jersey, U.S.A., 1997). Les densités cellulaires obtenues
30 avec ces systèmes sont généralement comprises entre 106 et
5 :_ 10r cellules/ml.
La productivité des cultures en batch peut être
avantageusement augmentée en prélevant une partie des
cellules du bioréacteur (70~ à 90~) pour les opérations
35 d'extraction des GAGS et d'isolement de l'héparine et en
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conservant les cellules restantes au sein du même
bioréacteur pour initier une nouvelle culture. Dans ce mode
de culture dit en batch répété on peut de plus distinguer
les paramètres optimum de la phase de croissance
cellulaire, de ceux permettant une plus grande accumulation
de GAGs et d'hëparine au sein des cellules.
Des systèmes de culture en continu de type
perfusés, avec ou sans rétention cellulaire peuvent
également étre utilisés (VELEZ et al., J. Immunol. Methods,
10''(2), 275-278, 1987 ; CHAUBARD et al., Gen. Eng. News,
20, 18-48, 2000). Dans le cadre de la présente invention on
peut notamment utiliser des systèmes de culture perfusés
permettant la rétention des cellules à l'intérieur du
réacteur, et aboutissant à une croissance et une production
supérieures à celles pouvant être obtenues en batch. La
rêtention peut être effectuée par l'intermédiaire de
systèmes de rétention de type filtre tournant (spin-
filter), fibres creuses, ou matrice solide (V~1ANG et al.,
Cytotechnology, 9, 41-49, 1992 ; VELEZ et al., J. Immunol.
Methods, 102(2), 275-278, 1987). Les densités cellulaires
obtenues sont généralement comprises entre 10~ et 5 x 10~
cellules/ml. La culture en bio-réacteurs permet, par
l'utilisation de capteurs de mesure en ligne, un meilleur
contrôle des paramètres physico-chimiques de la croissance
cellulaire ainsi que de l'accumulation de GAGS et
d' héparine au sein des cellules: pH, pQ2, Red/Ox, substrats
de croissance tels que vitamines, acides aminés, substrats
carbcrnës (par exemple glucose, fructose, galactose),
mëtabolites tels que lactate ou ammoniaque, etc.
A partir de 3 à 30 jours de culture,
gênéralement à partir de 3 à 10 jours, de culture dans ces
conditions les cellules peuvent être récoltées et séparées
du milieu de culture, généralement par centrifugation ou
filtration.
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Différents systèmes de centrifugation peuvent
être utilisés, on citera par exemple ceux décrits par VOGEL
et TODARO (Fermentation and Biochemical Engineering
Handbook, 2"'1 Édition, Noyes Publication, Westwood, New
jersey; U.S.A.).
Alternativement, ou en combinaison avec la
centrifugation, on peut effectuer la séparation par
microfiltration tangentielle, à l'aide de membranes dont la
porosité est inférieure au diamètre moyen des cellules (5 à
~0 ~tm) tout en permettant le passage des autres composés en
solution/suspension. La vitesse du flux tangentiel et la
pression appliquée sur la membrane sera choisie de façon à
gên êrer peu de force de cisaillement (nombre de Reynolds
in_~ërieur à 5000 sec~z) afin de réduire le colmatage des
membranes et préserver l'intégrité des cellules pendant
1'~~pération de séparation.
Différentes membranes peuvent être utilisées,
par el.emple, des membranes spirales (AMICON, MILLIPORE),
des membranes planes ou des fibres creuses (AMICON,
MILT.IPORE, SARTORIUS, PALL, GF) .
On peut aussi choisir des membranes dont 1a
;~~~-r~sité, la charge ou le greffage permettent d' effectuer
un e séparation et une première purification vis-à-vis
d'~i-entuels contaminants pouvant. être présents dans le
?ru '_ieu de culture, tels que protéines cellulaires, ADN,
%-~~~us, ou autres macromolécules.
On peut utiliser des méthodes de production et
de récolte des cellules permettant de conserver les GAGs et
l'hêparine dans le contenu intra-cellulaire ; toutefois on
;peut aussi récolter les GAGS et l'héparine dans le milieu
de culture après lyse ou dêgranulation des cellules.
La dégranulation peut être provoquée par la
fi_~ation de ligands spécifiques sur les récepteurs présents
à la surface des mastocytes, par exemple la fixation
d'agents de type allergène (tels que fragment Fc des IgE ou
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' analogues de ce fragment) sur les rëcepteurs IgE des
mastocytes. Dans le cas où l'héparine a été libérée du
contenu intracellulaire, par dégranulation ou lyse de tout
ou partie des mast~ocytes, et est présente dans le milieu de
culture au moment de l'étape de séparation, l'utilisation
de membranes de porosité plus réduite peut aussi être
envisagêe. Dans ce cas, la séparation des cellules est
combinée à une étape d'ultrafiltration sur une ou plusieurs
membranes dont l'agencement et la porosité permet de
concentrer l'hëparine et de la séparer des autres espèces
presentes dans le milieu, en fonction de la taille et du
poids moléculaire, et éventuellement de la charge
électrique, ou des propriétés biologiques.
Dans le cadre de ce mode de mise en ceuvre, le
seuil de coupure -des membranes est de préférence compris
entre 1000 et 5 KDa. On peut utiliser des systèmes de
membranes similaires à ceux employés pour la micro
filtration, par exemple, membranes spirales, membranes
plans, ou fibres creuses. On peut avantageusement utiliser
des membranes permettant d'effectuer une séparation et une
purification de l'héparine, du fait de leurs propriétés de
charge, ou du greffage de ligands présentant une affinité
pour l'héparine (par exemple anticorps, ATIII, lectine,
peptides, nucléotides, etc ).
D'autres agents peuvent aussi induire une
ciégranulation des mastocytes. Ces agents peuvent être
classés en plusieurs catégories telles que les agents
cytotoxiques, les enzymes, les polysaccharides, les
lectines, les anaphylatoxines, les composés basiques
(composé 48/80, substance P, etc), le calcium (ionophore
A23187, ionomycine, etc). [D. Lagunoff and T . W. Martin.
1983. Agents that release his amine from mast tells. Ann.
Rev. Pharmacol. Toxicol., 23:331-51]. L'utilisation d'agent
de dégranulation peut être effectuée de façon répétée sur
les illF'meS cellules maintenues en culture. Dans ce mode de
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production la productivité est augmentée de façon
significative par la simplification du procédé de récolte à
partir du surnageant et par le maintien en culture des
cellules.
5 Dans le cas particulier de l'ionophore A23187,
la dégranulation des mastocytes peut être induite par
exemple par traitement de 2.10 cellules/ml de mastocytes
avec l' ionophore A23187 à des concentrations comprises
entre 1 à 100 ~g/ml et des temps d'action variant de 1
10 minute à 4 heures.
La lyse des mastocytes peut être induite, par
exemple, par choc osmotique en utilisant des solutions
hypotoniques ou hypertoniques, par choc thermiqûe
(con gêlation/décongélation), par choc mécanique (par
exemple sonication ou variation de pression), par action
d' agents chimiques (NaOH, THESITTM, NP40TM, TWEEN 20TM, BRIJ-
58T~~', TRITON XTM-100, . . . ) , ou par lyse enzymatique (papaïne,
trypSln e,...), ou par combinaison de deux ou plusieurs de
ces mëthodes.
Pour extraire et purifier l'héparine à partir du
lysat cellulaire, séparer les chaînes polysaccharidiques du
no~~au ser-glycine, et séparer les chaînes d'héparine des
autres GAGS présents dans le milieu d'extraction, on pourra
utiliser des méthodes similaires à celles utilisées dans le
cadre de l'ex_traction et la purification d'héparine à
oar-tir de tissus animaux, qui sont connues en elles-mêmes,
~t décrites dans des ouvrages généraux, tels que le manuel
de DUCLOS, citê ci-dessus).
A titre d'exemples non-limitatifs, pour séparer
l'héparine des acides nucléiques et des protéines
cellulaires, et 1a solubiliser, c'est à dire rompre les
liaisons avec le noyau serglycine .
- on peut soumettre le lysat cellulaire à une ou
plusieurs digestions enzymatiques (pronase, trypsine,
papaïne, etc. . . ) ;
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les liaisons héparine-protéine peuvent être
hydrolysées en milieu alcalin, en présence de sulfates ou
de chlorures ;
- on peut également effectuer un traitement en
milieu acide (par exemple par de l'acide trichloracétique à
froid) pour détruire les acides nucléiques et les protéines
prcwenant des cellules, complété par l'utilisation d'une
Solution ionique qui permet de dissocier les interactions
GAGS-protéines ;
- on peut également effectuer une extraction par
la guanidine, après hydrolyse enzymatique ; pour purifier
l'héparine solubilisée, on peut par exemple la précipiter
par l'acétate de potassium, par un ammonium quaternaire,
pûr l'acétone, etc.
Ces étapes de purification peuvent
avantageusement être complétées ou remplacées par une ou
plusieurs étapes de chromatographie, notamment de
chromatographie d'échange d'anions ou chromatographie
d' affinitë.
La présente invention a également pour objet les
préparations d'héparine susceptïbles d'être obtenues à
partir de cultures de mastocytes en mettant en ouvre un
~.~rocédé selon l'invention.
Les préparations d'héparine conformes à
?5 '_'invention, qui possèdent des propriétés biologiques
comparables à celles des préparations d'héparine obtenues
dans l'art antérieur à partir de tissus animaux, peuvent
âtre utilisëes dans toutes les applications usuelles de
l'héparine.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se
réfère à des exemples de préparation d'héparine à partir de
cultures de mastocytes et de caractérisation de l'héparine
obtenue.
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EXEMPLE 1 . EXTRACTION D'HÉPARINE Ä PARTIR DE CULTURES DE
MASTOCYTES
Culture des mastocytes
Une lignée de mastocytes de foie fatal de porc,
et une lignée de mastocytes de foie fatal de porc
transfectées par l'antigène T du virus SV40 des (lignées
CNCM I-?735 et CNCM I-2736, respectivement), ont été
utilisées ;
Les cellules sont ensemencées à raison de 105 à
5 .. 10r' cellules/ml, dans du milieu MEMa complet en présence
d'IL3 porcine (2 ng/ml) et de SCF porcin (80 ng/ml).
Les cultures sont réalisées en boîte de culture
ou en suspension en flacon de 1 litre de type e< spinner ».
La croissance cellulaire est suivie journellement pendant 4
à 12 jours. La production d'héparine est suivie en
parallèle, par l'analyse des glycosaminoglycanes produits
en culture. Les résultats sont présentés dans les Figures 1
c ,
Les Figures l, 2 et 3 illustrent la croissance
LO des mastocytes de foie en culture statique en boîte
(Figure 1 ; ensemencement initial . ~ :1 x 105 cellules ;
~ . ? x 105 cellules) et en suspension en flacon (Figu_re
?), et la croissance des mastocytes de foie transfectés en
suspension en flacon (Figure 3).
Dans ces expérimentations, les cultures en
suspension en flacon présentent une densité cellulaire
rnar~imale allant d'environ 8 x 105 (pour les cellules non
transfectées) à environ 1,5 x 10~ cellules/ml (pour les
cellules transfectées). Le temps de doublement, calculé
pendant la phase exponentielle de croissance, est compris
entre 24 et 48 heures.
Purification des glycosaminoglycanes
Les cellules subissent une hydrolyse en milieu
alcalin en présence de sel afin de rompre les
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protéoglycanes et éviter les interactions GAGs/protéines de
types ioniques.
Ce traitement comprend les étapes suivantes .
1. Traitement par la soude en milieu salin:
cette étape vise à détruire les cellules et à couper les
liaisons entre l'héparine et sa protéine mère.
L' étape comprend l' ajout de 100 ~.rl de NaOH 1 M
at de 800 ~.rl de NaCl 0, 5 M à un culot de 106 cellules . Le
mélange ainsi obtenu est chauffé au bain-marie à 80°C
pendant 30 minutes puis soniqué pendant 5 minutes avant
d'être neutralisê avec du HCl 1 N.
2. Extraction . l'échantillon hydrolysé est
déposé sur une colonne de résine échangeuse d'anions (SAX,
~'arian), qui retient l'héparine. La colonne est lavée trois
fois en tampon Tris/HCl pH 7,4, NaCl 0,5 M afin d'éliminer
les protéines et les autres GAGS, notamment le dermatane.
Puis l'héparine est éluée par 1 ml de tampon Tris/HCl
pH 7,4, NaCl 3 M.
3. Dessalage/Lyophilisation . l'élïmination du
chlorure de sodium (nécessaire pour pouvoir appliquer
certaines des méthodes d'analyse qui sont décrites ci
zprès) s'effectue par chromatographie d'exclusion stérique
sur gel SEPHADEX G10, suivié par conductimétrie. Les
_ractions d'héparine collectées sont ensuite lyophilisées
;pour c~>>ncentrer l' échantil lon.
Analyse par électrophorése en gel de polyacrylamide
Cette technique permet de séparer les GAGS selon
heur taille et leur charge, et constitue un test permettant
de vérifie r rapidement 1a présence ou l'absence d'héparine.
La préparation purifiée obtenue comme décrit
,::i-dessus est déposée sur gel de polyacrylamide
Tris/tricine (gradient de 10 à 20~) permettant de séparer
des molécules de 30 à 1 kDa, à raison de 20 ~~1 de
préparation par dëpôt. On dépose sur le même gel 25 ng de
wlerrnatane, 25 ng d' héparine porcine standard SPIM ( 4ème
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étalon international d'héparine porcine, mucus intestinal),
et de l'héparine extraite de mucus porcin et purifiée par
traitement par la soude et purification sur résine
ëchan geuse d'anions dans les mêmes conditions que celles
décrites ci-dessus.
Une double coloration avec une solution de bleu
alcian puis du nitrate d'argent comme décrit dans AL,-HAKIM
et LINHARDT (Applied and Theoretical Electrophoresis 1,
305-12, 1991) permet de révéler les glycosaminoglycanes (le
nitrate d'argent seul ne révèle que les protéines).
Les gels sont ensuite analysés par un scanner
(BIO-RAD) pour quantifier les différents GAGS. La limite de
quantification de l'héparine est de 10 ng par bande.
Les résultats d'une expérimentation sont résumés
dans le Tableau 1 ci-dessous, . dans lequel la quantité
d' héparine produite par les cellules est exprimée en )..~.g/106
cellulés.
Tableau 1
Jours de rcolte 3 4 5 6 7 10 11 14
I Cellules foie, bote 2,6 3,5 4,4 6,5 3,7 4,2 - 8,1
Cellules foie transfectes,2,6 6,9 9,0 11,710,8 8,5 5,4 7,1
bote
Cellules foie, flacon 1,2 - - - - - -
Cellules foie transfectes,- 2,1 - - - - - -
flacon
Ces résultats sont également illustrés par 1a
Figure 4 (courbe - population cellulaire ; barres
production d'héparine).
La Figure 4 illustre la production d'héparine au
cours de la croissance des mastocytes de foie en culture
statique en boîte.
Les concentrations en héparine généralement
observées sont comprises entre 2 et 14 ~.~g pour 106 cellules,
en culture statique et en suspension.
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EXEMPLE 2 . CARACTÉRISATION DE LA PRÉPARATION D'HÉPARINE
OBTENUE Ä PARTIR DE CULTURES DE MASTOCYTES
Profil disaccharidique par CLHP
La composition en disaccharides permet de
5 différencier l'héparine des autres glycosaminoglycanes.
Le profil disaccharidique des
c~lycosaminoglycanes produits par les mastocytes en culture
a été déterminé selon la méthode décrite par LINHARDT et
al. (Biomethods, 9, 183-97, 1997).
10 La prëparation de GAGs obtenue comme décrit à
l'Eemple 1 ci-dessus a été dépolymérisée par un mélange
d'hêparinases de Flavobacterium heparinium (héparinases I,
II, et III, GRAMPIAN ENZYMES). Les conditions utilisées
sont décrites dans la publication de LINHARDT et al., citëe
15 ci-dessus.
A titre de témoin, l'héparine standard SPIM a
été dépolymérisée dans les mêmes conditions.
Dans ces conditions, la dépolymérisation est
complète, et produit des disaccharides.
~0 Les disaccharides principaux, au nombre de huit,
qui sont soit N-sulfatés, soit N-acétylés sont représentés
sur la Figure 5.
Détection par UV
Ces disaccharides sont sêparés et identifiés par
CLHP, sur colonne échangeuse d'anions comme décrit par
LINHARDT et al., (cité ci-dessus).
Les résultats sont illustrés par la
Figure c~,représentant le profil disaccharidique de la
préparation d'héparine produite par une culture en flacon
de mastocytes dérivés du foie fcetal (~), par rapport au
profil disaccharidique de l'héparine standard (~).
Ces résultats montrent que tous les
disaccharides présents dans l'héparine porcine de référence
SPIM sont également présents dans l'héparine de mastocyte,
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bien que dans des proportions différentes. Le rapport
IS/IIS est de 3,7.
Détection par fluorescence
Une méthode similaire avec une détection
fluorimétrique permet de quantifier uniquement les
disaccharides IS et IIS, caractéristiques de l'héparine, et
d'en faire le rapport.
La dépolymérisation enzymatique et la séparation
c_,LHP sr_,nt conduites de la même manière que celle décrite
ci-dessus.
La séparation est suivie d'une dérivatisation
post-colonne, pour former un complexe fluorescent avec la
guanidine .
Le disaccharide trisulfaté IS qui possède le
facteur de réponse le plus fort par cette technique, est
détecté et quantifié par rapport à une solution d'héparine
standard de concentration connue.
La limite de détection de la méthode est de
l'ordre de 5 ng/ml d'héparine dans les échantillons de
~0 culture cellulaire.
Le Tableau 2 ci-dessous illustre le rapport
IS/TIS de cultures cellulaires au cours du temps.
Tableau 2
Jours de rcolte 3 4 5 6 7 10 11 14
Cellules foie, bote 1,9 1,6 1,6 1,4 1,4 1,3 - 1,4
Cellules foie transfectes,4,1 5 4,6 6,6 3,7 4,9 5,6 5,7
bote
Cellules foie, flacon 2,3 - - - - - -
Cellules foie transfectes,- 2,9 - - - - - -
flacon
EXEMPLE 3 . CARACTERISATION BIOLOGIQUE DE L'HEPARINE PAR
DETERMINATION DES ACTIVITES ANTI-XA ET ANTI-IIA
Activités biologiques
L'inactivation des facteurs Xa et IIa est
caractëristique de l'héparine, et permet de la différencier
de l'héparane sulfate et du dermatane.
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La méthode utilisée est celle décrite dans la
monographie des héparines de basse masse moléculaire de la
Pharmacopée Européenne 3eme édition (1997).
La réaction se déroule en trois étapes .
1. ATIII + Héparine --~, [ATTII - Héparine]
1'. [ATIII - Héparine] + Facteur(excès) -~,[ATIII - Héparine
- Facteur] + Facteur(résiduel)
3. Facteur(résiduel) + substrat chromophore ~,pNA
La quantité de paranitroaniline (pNA) libérée
est mesurée à 405 nm. Elle est inversement proportionnelle
à la quantité d'héparine.
L'activitë anti-Xa ou anti-IIa est évaluée par
rapport à une droite d'étalonnage établie avec le standard
SPIM.
La sensibilitë de la méthode est de 0,006 UI/ml.
Les résultats obtenus sont représentés sur le
Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3
Jours de rcolte 3 4 5 6 7 10 11 14
Cellules foie, boite
j Anti-Xa 2,1 1,8 5,7 4,0 2,4 2,2 - 0,0
Anti-Ila - - - - - - - -
Ratio anti-Xa/anti-Ila- - - - - - - -
Cellules foie transfectes,
boite
Anti-Xa 44 11,511,7 12,311,4 13,011,6 12,9
Anti-Ila - - - - - - - -
Ratio anti-Xa/anti-Ila- - - - - - - -
Cellules foie, flacon
Anti-Xa 0,7 - - - - - - -
Anti-I la 1,4 - - - - - - -
Ratio anti-Xa/anti-Ila0,6 - - - - - - -
i Cellules foie transfectes,
flacon
- 3,1
i _ _ - _ _ _
Anti-Xa
Anti-Ila - 14 - - - - - -
Ratio anti-Xalanti-Ila- 0,2 - - - - - -
L'activité anti-Xa ou anti-IIa de l'héparine
obtenue à partir de mastocytes en culture a été comparée à
l'activité anti-Xa ou anti-IIa, respectivement, de
l'héparine obtenue à partir de mucus porcin ou de
l'héparine standard. Les résultats sont illustrés dans le
Tableau 4 ci-dessous.
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Tableau 4
Anti-Xa Anti-Ila Xa/Ila
UI/m UI/m UI/m
Hparine de mastoc tes 18 3,1 14 3 0,2 1
Hparine de mucus 80 81 1
I Hparine standard 180 180 1
~
Caractérisation de la liaison à l'ATIII
La liaison entre l' héparine et l' ATIII est mise
en ëvidence par un retard de migration par des techniques
d'electrophorèse comme décrit dans LEE et LANDER (Pros.
Ivatl. Acad. Sci., 88, 2768-72, 1991).
L'électrophorèse est réalisée sur gel d'agarose
à ~,,8c. dans une solution à pH 3 (acide acétique/hydroxyde
cie l i thium) .
A 100 ~.rl d'échantillon à tester, on ajoute
100 fil de solution de concentration dëcroissantes de 584 à
183 yg/m1 d'ATIII (origine humaine ; BIOGENIC).
Des dépôts de 100 ~.~1 d' échantillon sont faits .
L.a migration est de 30 minutes à 100 volts.
Les gels sont fixés par une solution de bromure
~~i' h.~__adécyltriméthyl ammonium (CETAVLON-SIGMA) à 0, 1$.
La révélation est effectuée par 1'A~ure A (0,08
.~a:~s l' eau) .
Les gels sont scannés et interprétés avec le
~0 1 ,~~=tic? el QUANTITY ONE (BIO-RAD) .
Les résultats sont exprimés en ~ d'héparine liée
~' ATII i .
Les résultats obtenus dans le cas d' une culture
~n flacon de cellules de foie transfectées sont illustrés
~a-- la Fi Bure 7 .
On observe une liaison de l'ATIII de 31~ (valeur
Zhéorique 33~) en présence d'héparine standard (SPIM), et
~~ie 27=:,:, en prësence de l'héparine obtenue à partir de
mastocytes en culture (composé).
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EXEMPLE 4 . CULTURE DE MASTOCYTES EN BIO-RÉACTEUR EN MODE
BATCH RÉPÉTÉ
Une lignée de mastocytes issus du foie fatal
~~orcin non transfectée a ëté utilisée. Les cellules sont
ensemencées à raison de 2.0 à 4.0 x105 cellules par ml dans
du milieu DMEM/F12 complet additionné d'IL3
porcine(2ng/ml)de SCF porcin (80ng/ml).
Le bioréacteur utilisé a une capacité de 2
litres de milieux de culture, 1a tension d'oxygène de la
culture est maintenue entre 20~ et 40~ de la saturation, le
pH entre 7.0 et 7.4, la température est maintenue à 37°C
+/- 0.5°C par circulation d'eau thermostatée dans la double
enveloppe du bioréacteur. L'agïtation de la culture est
réalisée par une hélice de type marine avec une vitesse
comprise entre 80 à 150 tours/minutes.
Après 4 jours de culture la densité cellulaire
est de 1.3 x 106 cellules/ml, correspondant à un temps de
doublement compris entre 24 et 48h. Le jour de la récolte,
80°-,-; de la culture est prélevée pour l'extractïon
d'héparine, 1e reste de la culture est maintenue dans le
bio-réacteur et diluée avec du milieu frais à une
concentration comprise entre 2.0 à 3.0x105 cellules/ml tel
que décrit pour une opération de production en batch
répété. Trois jours après dilution en mode batch répété, la
densité cellulaire obtenue est de ~.U x 105 cellules/ml,
correspondant à un temps de doublement compris entre 24 et
98 heures et comparable à la première mise en
culture(Figure 8).
La purification de l'héparine s'effectue comme
décrit dans l'exemple 1.
L'héparine purifiée est alors analysée par HPLC,
comme décrit dans l'ex_emple 2, en utilisant l'héparine
standard SPIM à titre de témoin.
Le tableau 5 et la figure 9 représentent le
profil disaccharidique et la proportion du noyau protéique
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serglycine (Gly-Ser) de la préparation d'héparine produite
par la culture de mastocytes en suspension dérivés du foie
fo~tal porcin (~), par rapport au profil obtenu pour
l'l~ëparine standard SPIM
5 Le tableau 6 représente le profil de N-acétylation, de N-
sulfatation et de 0-sulfatation des disaccharides de
l'héparine produite par la culture de mastocytes en
suspension dérivés du foie fatal porcin par rapport à celui
des disaccharides de l'héparine SPIM standard.
10 Tableau 5
Standard % Culture
GI -Ser 3,5 3,2
IVa 4 5,4
IVs 3,1 7,6
Ila 3,1 4,4
Illa 1,5 0,7
I Is 8,4 11,9
I Ils 7,2 17,1
la 1,3 0,2
Is 62 48,8
Tableau 6
Disaccharides Standard % Culture
Actyls 11,8 10,7
2-O-sulfats 23 8
I 6-O-sulfats 42 42
I N-Sulfats 83 85
2-O-sulfats 84 77
6-Osulfats 89
71
Sulfates/carboxylates 2,4 21
~
Des résultats similaires sont obtenus lorsque
utilise une lignée de mastocytes transfectés par
l'rn~igène T du virus SV40.
15 E~EM PLE 5 . PRODUCTION D'HÉPARINE DANS LE SURNAGEANT DE
CULTURE PAR MISE EN OUVRE D'UN AGENT DE DÉGRANULATION.
Les expérimentations ont été effectuées sur une
lignée de mastocytes de foie fatal non-transfectés.
Au 762eme jour (compté à partir de la première
20 mise en culture), la concentration de mastocytes a été
ajustée à 2x.10 cellules/ml, et la culture est incubée
pendant une heure en milieu MEM comprenant 4ug/ml de
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l'ionophore A23187, ce qui induit la dégranulation des
mastocytes.
Les GAGs totaux, et les GAGs sécrétés produits
l~~ar les cellules sont quantifiés en PAGE. La Figure 10
montre que 70 à 75 ô des GAGS sont retrouvés dans le
surnageant après traitement par l'ionophore A23187, contre
environ 10~ dans les cellules non traitées (0 ug/ml de
A23187).
Les mastocytes pour lesquels la récolte de GAGs
a été réalisée au 762eme jour de culture ont été remis en
culture. On n'observe aucune perte de viabilité et de
vitesse de croissance.
21 jours plus tard, ces mastocytes sont soumis à
une nouvelle dégranulation, et les GAGS sont dosés comme
décrit ci-dessus. Une culture de mastocytes du même âge,
n'ayant pas subi de dégranulation au 762eme jour est
utilisée à titre de contrôle.
Les résultats sont illustrés par la Figure 10
qui montre que le pourcentages de GAGS sécrétés est
~0 comparable à celui obtenu lors de la première dégranulatïon
et aussi comparable à celui obtenu avec les cellules
COn trôle du même âge.
Des rësultats sïmilaires sont obtenus lorsque
l'on utilise une lignée de mastocytes transfectés par
î'antigëne T du virus SV40.
