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PROCEDE D'ENRICHISSEMENT DE CELLULES SOUCHES
KERATINOCYTAIRES
L'invention a pour objet un procédé d'enrichissement de cellules souches
kératinocytaires.
L'invention a également pour objet des cellules souches kératinocytaires
présentant un
potentiel d'expansion élevé.
Le tissu hématopoïétique et la peau présentent des similitudes au niveau de
leur
organisation. Il s'agit de systèmes biologiques dynamiques et hiérarchisés,
dans lesquels de
grandes quantités de cellules matures sont continuellement produites et
renouvelées, durant
toute la vie de l'individu. Les cellules qui les composent peuvent être .
schématiquement
classées dans 3 compartiments selon leur stade d'évolution. Cependant, il
n'existe pas de
frontières nettement définies entre ces compartiments, chacun d'eux étant en
réalité constitué
1 S d'un continuum de cellules au degré de maturation variable, et donc très
hétérogène.
Un premier compartiment est composé de .cellules matures différenciées dont le
potentiel de prolifération est très limité ou nul (lymphocytes, macrophages,
mégacaryocytes,
érythrocytes ; kératinocytes des couches suprabasales de l'épiderme).
Un deuxième compartiment englobe une population de cellules qui possèdent un
potentiel de prolifération variable mais limité qu'elles perdent
progressivement en s'engageant
vers la différenciation (progéniteurs et précurseurs hématopoïétiques ;
kératinocytes en phase
transitoire d'amplification).
Un troisième compartiment est constitué de cellules rares situées en amont
dans la
hiérarchie de ces systèmes. Il englobe les cellules souches (cellule souche
hématopoïétique ;
cellule souche kératinocytaire) notamment caractérisées par le fait que, bien
que demeurant
majoritairement dans un état de quiescence, ces cellules possèdent un
potentiel d'expansion à
long terme très important, mais aussi notamment caractérisées par leur
capacité
d'autorenouvellement.
Le phénotype des cellules souches kératinocytaires n'étant encore
qu'imparfaitement
caractérisé, ces cellules demeurent à ce jour difficiles à purifier,
difficiles à sélectionner, et
par conséquent on ne dispose à ce jour d'aucun procédé efficace
d'enrichissement de cellules
souches kératinocytaires.
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L'un des buts de l'invention est de proposer un procédé efficace, permettant
d'obtenir
une population de cellules souches kératinocytaires présentant un potentiel
d'expansion à long
terme élevé.
L'un des buts de l'invention est de fournir une population de cellules souches
kératinocytaires présentant un potentiel de prolifération supérieur d'au moins
environ 100 fois
au potentiel de prolifération des cellules souches kératinocytaires obtenues
par les procédés
classiques.
L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'enrichissement
d'une
population de cellules souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de
kératinocytes,
comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches
kératinocytaires par adhésion
de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment
reconnu par
des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des
récepteurs de
la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ
S mn à
environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12
mn, et la
1 S récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de
matrices
extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir
la viabilité des
cellules souches ayant adhéré, notamment par tryspination, notamment à l'aide
de trypsine
0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes.
Par « population de cellules souches kératinocytaires » on désigne une
population de
kératinocytes possédant un potentiel d'expansion à long terme élevé, incluant
des cellules
clonogéniques, et capable de reconstruire un épiderme.
Par « préparation de kératinocytes », on désigne l'ensemble des kératinocytes
obtenus à
partir d'un prélèvement cutané ou d'autres sources possibles de cellules
souches capables de
générer de la peau (par exemple follicule pileux).
L'adhésion se fait par dépôt de la préparation de kératinocytes sur un
substrat
d'adhésion auquel un composant de matrices extracellulaires est adsorbé.
Les cellules non adhérées au substrat d'adhésion sont éliminées par lavage.
Par « composant de matrices extracellulaires », on désigne notamment des
molécules
telles que les collagènes, la laminine, la fibronectine, les protéoglycanes (1
à 7).
L'adhésion des cellules peut être notamment vérifiée en réalisant des lavages
dans des
conditions classiques du substrat d'adhésion. Les cellules adhérentes
sélectionnées ne sont pas
décollées par ce moyen.
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Si la durée de l'adhésion est inférieure à 5 mn, le rendement de récupération
est faible,
par exemple inférieur à 1% par rapport à l'ensemble des cellules contenues
dans la
préparation de kératinocytes.
Si la durée de l'adhésion est supérieure à 30 mn, la séparation est peu
discriminative,
par exemple au moins 30% des cellules contenues dans la préparation de
kératinocytes sont
récupérées.
Le décollement a lieu dans des conditions permettant de maintenir une bonne
viabilité
des cellules, c'est à dire de conserver l'ensemble des cellules vivantes (>97%
de cellules
vivantes après décollement).
La viabilité des cellules peut être notamment déterminée la méthode
d'exclusion au bleu
Trypan (8).
Le procédé de l'invention permet avantageusement d'obtenir une population de
cellules
adhérentes présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ
109.
L'expression « population de cellules adhérentes présentant un potentiel
d'expansion
supérieur à environ 109 » signifie. que la population en question peut être
amplifiée d'un
facteur supérieur à environ 109 et donc générer environ 109 fois plus d~e
cellules qu'il en a été
utilisé pour initier les cultures.
Le potentiel d'expansion est estimé par la mise en oeuvre de cultures à long
terme
(supérieures à 100 jours) permettant d'établir une courbe d'expansion cumulée
(par référence à
la procédure de culture décrite ci-après dans les exemples).
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé d'enrichissement
selon
l'invention, le pourcentage de cellules adhérentes représente environ 5 % à
environ 20 %,
notamment environ 10 %, des cellules contenues dans la préparation de
kératinocytes.
Un autre mode de réalisation avantageux concerne un procédé d'enrichissement
d'une
population de cellules souches kératinocytaires, à partir d'une préparation de
kératinocytes,
comprenant une étape de pré-enrichissement en cellules souches
kératinocytaires par adhésion
de ladite préparation sur un composant de matrices extracellulaires, notamment
reconnu par
des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes, notamment par des
récepteurs de
la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une durée d'environ
5 mn à
environ 30 mn, notamment d'environ 10 mn à environ 20 mn, avantageusement 12
mn, et la
récupération des cellules souches ayant adhéré sur le susdit composant de
matrices
extracellulaires par décollement dans des conditions permettant de maintenir
la viabilité des
cellules souches ayant adhéré, notamment par tryspination, notamment. à l'aide
de trypsine
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0,05 % et EDTA 0,02 %, pour obtenir une population de cellules adhérentes,
environ 70% des
cellules adhérentes exprimant la chaîne a6 des intégrines.
L'expression de la chaîne a6 des intégrines est notamment déterminée par
marquage
immunophénotypique et analyse par cytométrie en flux.
Selon un mode de réalisation de l'invention les cellules adhérentes expriment
fortement
la chaîne a6 des intégrines.
L'expression « expriment fortement la chaîne a6 des intégrines » signifie que
l'intensité
moyenne de fluorescence est supérieure à 55 au jour 1, selon les données d'un
F.A.C.S.
VANTAGE Becton Dickinson.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans le procédé selon
l'invention, la
population de cellules adhérentes comprend des cellules clonogéniques,
notamment à raison
d'au moins environ 1 %, notamment à raison d'au moins 2 % par rapport aux
cellules
adhérentes.
Par « cellules clonogéniques », on désigne des cellules possédant la capacité
de donner
naissance à un clone cellulaire.
On peut vérifier le caractère de clonogénicité des cellules par la mise en
oeuvre d'un test
de culture à court terme (de 6 à 12 jours) (par référence à la procédure de
culture décrite ci-
après dans les exemples).
L'étape de pré-enrichissement du procédé de l'invention permet d'obtenir des
cellules
clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ
5 x lOlo
L'expression « cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal
ou
supérieur à environ 5 x 101° » signifie que les cellules clonogéniques
contenues dans la
population de cellules adhérentes possèdent en moyenne la capacité de générer
une filliation
d'au moins environ 5 x 101° kératinocytes.
Seules les cellules clonogéniques participent effectivement à l'expansion.
Comme
indiqué ci-dessus, étant donné qu'environ 1% à 2% des cellules de la
population adhérente
sont clonogéniques, il en résulte que le potentiel d'expansion de ces cellules
clonogéniques
est environ 50 à 100 fois supérieur à celui estimé à l'échelle de la
population cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé d'enrichissement
selon
l'invention, comprend, après l'étape de pré-enrichissement, une étape
d'enrichissement par
détection du niveau d'expression d'un récepteur mitogénique sur les cellules
adhérentes et
récupération de la fraction de cellules adhérentes qui représente environ 20 %
à environ 50
des cellules souches présentant le plus faible niveau d'expression du
récepteur mitogénique,
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ladite expression étant mesurée par cytométrie de flux, cette fraction étant
désignée par
fraction « récepteur mitogénique fable ».
L'étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression d'un récepteur
mitogénique permet de séparer les cellules adhérentes en 2 fractions
une fraction désignée par fraction « récepteur mitogénique f°rt » qui
exprime le plus
fortement le récepteur mitogénique et l'autre désignée par fraction «
récepteur
mitogéniquefa'b~e » qui contient 20 % à 50 % des cellules adhérentes exprimant
le plus
faiblement le récepteur mitogénique.
Les résultats obtenus ont démontré de manière reproductible que les
kératinocytes les
plus primitifs qui possèdent le potentiel d'expansion le plus important sont
significativement
enrichis dans la fraction récepteur mitogéniquefa'b~e.
Par « récepteur mitogénique », on désigne un récepteur capable d'induire
l'entrée en
mitose et donc de stimuler la prolifération cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, dans le procédé
d'enrichissement selon
l'invention, le récepteur mitogénique est choisi dans le groupe comprenant les
récepteurs de
facteurs de croissance capables d'induire la prolifération de cellules souches
kératinocytaires
et notamment le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF-R), et le
récepteur du
facteur de croissance kératinocytaire (KGF-R).
Par « récepteur de facteurs de croissances capables d'induire la prolifération
des cellules
souches kératinocytaires », on désigne tout récepteur dont le ligand est un
facteur de
çroissance capable de stimuler (entrée en mitose et la prolifération des
cellules souches
kératinocytaires.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé d'enrichissement selon
l'invention,
le pourcentage de cellules souches présentant le plus faible niveau
d'expression du récepteur
mitogénique est d'environ 2 % à environ 5 %, par rapport aux cellules
contenues dans la
préparation de kératinocytes.
Selon un autre mode de réalisation, dans le procédé d'enrichissement selon
l'invention,
le récepteur mitogénique est EGF-R.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon
l'invention
comprend
- une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par
adhésion sur
collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn,
la
récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par
décollement à l'aide
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de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 % et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une
population de
cellules adhérentes,
- une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression du récepteur
EGF-R
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération
de la fraction de
cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules
adhérentes
présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant
désignée par EGF-
Rfaible,
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon
l'invention
comprend
- une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par
adhésion sur
collagène, pendant une durée d'environ 10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn,
la
récupération des cellules ayant adhéré sur le collagène étant effectuée par
décollement à l'aide
de trypsination, à l'aide de trypsine 0,05 % et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une
population de
cellules adhérentes, environ 70% desdites cellules adhérentes exprimant la
chaîne a6 des
intégrines,
- une étape d'enrichissement par détection du~~niveau d'expression du
récepteur EGF-R
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération
de la fraction de
cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules
adhérentes
présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant
désignée par EGF-
Rfaible.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé d'enrichissement selon
l'invention
comprend
- une étape de pré-enrichissement en cellules souches kératinocytaires par
adhésion
d'une préparation de kératinocytes sur un composant de matrices
eXtracellulaires, notamment
reconnu par des molécules impliquées dans l'adhésion des kératinocytes,
notamment par des
récepteurs de la famille des intégrines, notamment du collagène, pendant une
durée d'environ
10 mn à environ 20 mn, notamment 12 mn, la récupération des cellules ayant
adhéré sur le
collagène étant effectuée par décollement à l'aide de trypsination, à l'aide
de trypsine 0,05
et d'EDTA 0,02 % pour obtenir une population de cellules adhérentes, environ
70% desdites
cellules adhérentes exprimant la chaîne a6 des intégrines,
- une étape d'enrichissement par détection du niveau d'expression du récepteur
EGF-R
sur les cellules adhérentes obtenues à l'étape précédente, et la récupération
de la fraction de
cellules souches qui représente environ 20 % à environ 50 % des cellules
adhérentes
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présentant le plus faible niveau d'expression d'EGF-R, cette fraction étant
désignée par EGF-
Rfaible,
Dans lé procédé d'enrichissement selon l'invention, la fraction EGF-Rfa'nte
présente un
potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 101°.
L'expression « fraction EGF-Rfa'b~e présente un potentiel d'expansion égal ou
supérieur
à environ 101° » signifie que la population de cellules adhérentes peut
être amplifiée d'un
facteur supérieur à environ 101° et donc générer environ 101°
fois plus de cellules qu'il en a été
utilisé pour initier les cultures.
Le potentiel d'expansion est estimé par la mise en oeuvre de cultures à long
terme
permettant d'établir une courbe d'expansion cumulée (par référence à la
procédure de culture
décrite ci-après dans les exemples).
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé d'enrichissement
selon
l'invention, la fraction EGF-Rfa'b~e comprend des cellules clonogéniques,
notamment au moins
environ 1 % et notamment au moins environ 2 % par rapport aux cellules
contenues dans la
fraction EGF-R faib~e
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des cellules clonogéniques
présentant un
potentiel d'expansion égal ou supérieur à environ 5 x 1011
L'expression « cellules clonogéniques présentant un potentiel d'expansion égal
ou
supérieur à environ 5 x 101 ~ » signifie que les cellules clonogéniques
contenues dans la
population de cellules adhérentes EGF-Rfa'b1e possèdent en moyenne la capacité
de générer
une filliation d'au moins environ 5 x 1011 kératinocytes.
Environ 1 % à 2% des cellules de la fraction EGF-R faible sont clonogéniques,
et il en
résulte que le potentiel d'expansion de ces cellules est environ 50 à 100 fois
supérieur à celui
estimé à (échelle de la fraction cellulaire.
L'invention concerne également un procédé de culture de cellules souches
kératinocytaires comprenant la mise en culture de la fraction « récepteur
mitogénique faib~e »
obtenue selon le procédé défini ci-dessus, avec une densité d'ensemencement
d'environ
2 500 à environ 7 000 cellules/cm2, pour obtenir au plus environ 120 000
cellules / cm2, suivi
d'un décollement dans des conditions permettant le détachement des cellules
dans des
conditions n'altérant pas leur viabilité, et d'un repiquage, les étapes de
décollement et de
repiquage successives ayant lieu lorsque la densité cellulaire atteint au plus
environ 120 000
cellules / cm2.
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La densité d'ensemencement doit être telle que l'expansion cellulaire obtenue
entre 2
repiquages successifs soit la plus importante possible, c'est à dire que le
nombre de cellules
puisse par exemple être multiplié par environ au moins 15 lorsque les
kératinocytes sont en
phase de croissance exponentielle (expansion cellulaire supérieure à environ
15).
Si la densité d'ensemencement est inférieure à 2 500 cellules / cm2 ou si elle
est
supérieure à 7 000 cellules / cmz, l'expansion cellulaire obtenue entre 2
repiquages successifs
(lorsque les cellules sont en phase de croissance exponentielle) est
inférieure à 15 et donc non
optimale.
On décolle les cellules lorsque le nombre de cellules obtenu est d'environ 120
000
cellules / cmz afin d'éviter que les cultures atteignent un état de
confluence, un tel état
entraînant un engagement des cellules vers la différentiation et conduisant à
un arrêt de la
prolifération.
A la suite du décollement, on effectue un repiquage des cultures qui sont
réensemencées
à une densité comprise entre environ 2 500 et 7 000 cellules / cmz.
Les étapes de décollement et de repiquage successifs sont effectués lorsque la
densité
cellulaire atteint au plus environ 120 000 cellules / ces?.
Le procédé de culture s'arrête lorsque le potentiel d'expansion de la
population cellulaire
testée est épuisé : la culture entre dans un état de sénescence et cesse
spontanément de
proliférer.
Selon un mode de réalisation avantageux, dans le procédé de culture de
cellules souches
kératinocytaires selon l'invention, l'étape de décollement a lieu dans des
conditions
permettant d'une part le détachement d'une partie des cellules les plus
faciles à détacher, par
exemple à l'aide de trypsine 0,05 % + EDTA 0,02 % et d'autre part le
détachement de
cellules les plus difficiles à détacher, par exemple à l'aide de trypsine 0,25
% + EDTA
0,02 %.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, le procédé de culture de
cellules souches
kératinocytaires comprend la mise en culture de la fraction EGF-R faible
définie ci-dessus,
avec une densité d'ensemencement d'environ 2500 à environ 7000 cellules/cm2
pour obtenir
au plus environ 120 000 cellules / cm2, suivi du décollement dans des
conditions permettant le
détachement d'une partie des cellules les plus faciles à détacher, à l'aide de
trypsine 0,05 % +
EDTA 0,02 % et le détachement des cellules les plus difficiles à détacher à
l'aide de trypsine
0,25 % + EDTA 0,02 %, et suivi du repiquage des cellules souches obtenues.
L'invention concerne une composition de cellules souches telles qû'obtenues
par mise
en oeuvre de l'étape de pré-enrichissement telle que définie ci-dessus.
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L'invention concerne également une composition de cellules souches telles
qu'obtenues
par mise en oeuvre du procédé selon l'invention
L'invention concerne également une composition de cellules kératinocytaires
souches
comprenant des cellules souches kératinocytaires, (CSK), possédant un
potentiel d'expansion
S égal ou supérieur à 101°.
L'invention concerne également une composition de CSK telle que définie ci-
dessus,
dans laquelle les CSK sont viables.
L'invention concerne également une composition de cellules souches telle que
définie
ci-dessus, contenant des CSK à la surface desquelles le niveau d'expression
d'un récepteur
mitogénique est faible, le qualificatif « faible » étant défini de manière
relative par rapport au
profil d'expression du récepteur mitogénique observé dans la dite composition
de CSK.
L'invention concerne une composition de cellules souches telle que définie ci-
dessus,
dans laquelle le niveau d'expression du récepteur de fEGF (EGF-R) est faible.
L'invention concerne l'utilisation d'une cômposition de cellules
kératinocytaires
souches telle que définie ci-dessus, pour la reconstruction de peau.
Un mode de réalisation détaillé de l'invention est décrit ci-après.
I/ Pré-sélection d'une population cellulaire de cellules « adhérentes », gui
représente 10% des kératinocytes totaux et englobe l'essentiel des CSKs.
1- Sélection des cellules de la population de cellules « adhérentes » : La
méthode de
sélection repose sur la capacité d'adhésion des kératinocytes. Le substrat
d'adhésion choisi est
un support de plastique sur lequel du collagène de type I est adsorbé. On
dépose les
préparations de kératinocytes issus de prélèvements cutanés sur le substrat
d'adhésion, puis on
procède à une incubation à 37°C pendant un temps court. Les cellules
n'ayant pas adhéré au
support sont prélevées, puis les cellules adhérentes sont décollées par
trypsination douce et
récupérées séparément. Il a été déterminé qu'une durée d'incubation de 12
minutes est adaptée
à la sélection d'une population enrichie en cellules capables d'initier une
expansion cellulaire
in vitro. Les cellules ayant adhéré sont désignées par « adhérentes ».
2 - Caractéristiques phénotypiques des cellules de la population de cellules
« adhérentes » : Des analyses de l'expression de molécules de surface
impliquée dans
l'adhésion cellulaire ont été réalisées par cytométrie en flux sur la
population non fractionnée,
ainsi que sur la population de cellules adhérentes et sur la population de
cellules non-
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adhérentes (Fi ure 9 . On a observé que la population de cellules adhérentes
est
significativement enrichie en cellules exprimant la chaîne a6 des intégrines
(CD49f) (environ
70% des cellules présentent l'intégrine a6 à leur surface), critère associé
aux kératinocytes les
plus primitifs, alors que la population de cellules non adhérentes en est
moins riche (environ
30% des cellules présentent l'intégrine a6 à leur surface). Une expression des
chaînes a2 et
~i 1 des intégrines est détectée de manière moins spécifique à la surface des
cellules issues des
populations totales (non-fractionnées), adhérentes, et non adhérentes.
3 - Caractéristigues fonctionnelles des cellules de la population de cellules
« adhérentes » : Une statistique effectuée sur plusieurs prélèvements
indépendants (n>5
expériences) montre que la population de cellules adhérentes ne représente que
10,4% des
kératinocytes totaux, mais présente un enrichissement important en cellules
clonogéniques
(Figure lA). En effet, la réalisation de tests clonogéniques à court terme (6
jours) sur ces
deux populations de cellules indique que 2,3% des kératinocytes issus de la
population de
cellules non-adhérentes en 12 minutes possèdent la capacité de générer des
clones sur un
support de plastique alors que seulement 0,2% des céllules de la population
des cellules non-
adhérentes sont clonogéniques Fi ure 1B .
Le contenu de chacune des populations de cellules sélectionnées par la méthode
d'adhésion rapide sur collagène de type I en kératinocytes possédant un fort
potentiel
d'expansion, propriété plus représentative de la fonction physiologique des
CSKs, a été
évalué. Les résultats obtenus à partir de plusieurs prélèvements indépendants
(n>S
expériences) montrent que les cellules les plus primitives, qui expriment le
plus fort potentiel
de prolifération à long terme, sont enrichies dans la population de cellules
adhérentes Fi ure
~. En effet, les cellules contenues dans cette population permettent d'obtenir
une expansion
cumulée supérieure à celle de la population totale. En revanche, la population
des cellules non
adhérentes apparaît majoritairement constituée de kératinocytes plus tardifs,
et n'exprime
qu'un potentiel de prolifération plus réduit.
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II/ Tri d'une fraction de cellules dites « adhérentes EGF-Rfa'bie » qui
représente
20% à 45% des cellules de la population de cellules « adhérentes », donc 2% à
4,5% des
kératinocytes totaux, et englobe l'essentiel des CSKs.
1- Fraction de cellules composée de 45% des cellules de la population de
cellules
« adhérentes » exprimant le glus faiblement fEGF-R : La population composée
des cellules
adhérentes en 12 minutes sur collagène de type I a tout d'abord été séparée en
2 fractions de
taille équivalente sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R détectable à
leur surface. La
fraction qualifiée de « EGF-Rfa'bte » contient 45% des kératinocytes adhérents
exprimant le
plus faiblement l'EGF-R et la fraction qualifiée de « EGF-Rf°rt »
contient 45% des
kératinocytes adhérents exprimant le plus fortement ce récepteur (Fi ure 3 .
Ces expériences
ont été réalisées sur plusieurs prélèvements indépendants (n>5). Les résultats
obtenus
démontrent de manière reproductible que les kératinocytes les plus primitifs
qui possèdent le
potentiel d'expansion le plus important sont significativement enrichis dans
la fraction
EGF-Rfa'bie (Fi ure 4 . Ceci corrèle.avec l'observation microscopique des
cellules à différents
temps de culture, qui révèle une production de kératinocytes de petitè taille
indifférenciés à
plus long terme dans les cultures initiées à partir de la fraction EGF-Rfaib~e
Fi ure 5 , critère
associé aux kératinocytes primitifs (9).
2 - Fraction composée de 20% des cellules de la population de cellules «
adhérentes »
exprimant le plus faiblement fEGF-R : La population de cellules adhérentes a
finalement été
séparée en 4 fractions de taille équivalente sur la base du niveau
d'expression de l'EGF-R
détectable à la surface des cellules.
Quatre fractions de représentativité égale et comprenant chacune 20% des
cellules de
cette population ont été définies comme fractions « EGF-R-~+ », « ÉGF-R~ », «
EGF-R~ »,
et « EGF-R~ » (Fi ure 6 : les fractions dites « EGF-R-~+ » et « EGF-R~ » sont
incluses
dans la fraction EGF-Rfa'ble et contiennent chacune 20% des cellules de la
population
adhérente ; les fractions dites ,« EGF-R+~ » et « EGF-R++~ » sont incluses
dans la fraction
EGF-Rf°n et contiennent chacune 20% des cellules de la population
adhérente. On a observé
une proportionnalité inverse entre le niveau d'expression de l'EGF-R à la
surface des cellules
ainsi sélectionnées, et leur potentiel de prolifération à long terme (Fi ure 7
. En effet,
l'expansion cumulée la plus importante est obtenue à partir de la fraction EGF-
R-~+ alors que
la valeur obtenue à partir de la fraction EGF-R~ s'avère la moins élevée. Les
fractions
m
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EGF-R~ et EGF-R~ se comportent de manière intermédiaire (n>3 expériences
indépendantes réalisées).
Ces résultats expérimentaux valident la possibilité d'utiliser un récepteur de
facteur de
croissance mitogénique (récepteur à tyrosine kinase de l'EGF) comme marqueur
phénotypique pour sélectionner une fraction de kératinocytes significativement
enrichie en
CSKs.
III/ Evaluation optimale du potentiel d'expansion à long terme des populations
de
kératinocytes sélectionnées.
1- Trypsination ménagée des cellules lors des repiquages successifs :
L'objectif est de
limiter le stress occasionné aux cellules lors des décollements et repiquages
successifs des
cultures à long terme, problème qui pourrait conduire à une sous estimation de
leur potentiel.
On effectue tout d'abord un traitement protéolytique ménagé (trypsine 0,05%-
EDTA 0,02%)
qui permet le décollement d'une partie des cellules tout en évitant de les
soumettre à un
traitement protéolytique trop drastique qui pourrait altérer leur viabilité.
Les cellules les plus
difficiles à détacher pour lesquelles la protéolyse douce s'est avérée
inefficace sont ensuite
soumises à un traitement protéolytique plus fort (trypsine 0,25%-EDTA 0,02%),
ce qui
permet finalement de récupérer (ensemble de la population. Une étude
comparative de
l'impact de différentes méthodes de décollement sur la viabilité des cellules
a été réalisée.
2 - Densité d'ensemencement des flacons de culture adaptée pour une expansion
optimale des kératinoc es : Afin d'évaluer quelles densités d'ensemencement
sont
compatibles avec une bonne mise en évidence du potentiel d'expansion des
cellules testées,
lors de l'initiation des cultures à long terme ainsi qu'à chaque repiquâge
successif, on a réalisé
des expériences sur une durée de 7 jours. Celles-ci ont permis de déterminer
que des densités
d'ensemencement comprises entre 2500 et 7000 cellules / cm2 sont les plus
adaptées
puisqu'elles permettent d'obtenir une expansion cellulaire d'un facteur 15 à
20, alors que des
densités d'ensemencement inférieures et supérieures donnent de moins bons
résultats.
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Figures lA et 1B : Représentativité et clonogénicité des populations
cellulaires de
cellules « adhérentes » et de cellules « non adhérentes ».
Les figures lA et 1B montrent l'enrichissement en cellules clonogéniques
obtenu après
sélection par la méthode d'adhésion sur collagène de type I.
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été
séparés en une
population cellulaire dite « adhérente » et une population dite « non
adhérente » par une étape
d'adhésion de 12 minutes sur du collagène de type I. La représentativité de
chaque fraction par
rapport à la population cellulaire totale a été évaluée, ainsi que leur
contenu en kératinocytes
clonogéniques.
Sur la figure lA, on a représenté le pourcentage de cellules constituant la
population de
cellules adhérentes par rapport aux cellules totales (colonne hachurée) et le
pourcentage de
cellules constituant la population de cellules non adhérentes par rapport aux
cellules totales
(colonne pleine).
Sur la figure 1B, on a représenté le pourcentage de cellules clonogéniques
respectivement dans la population de cellules adhérentes (colonne hachurée) et
dans la
population de cellules adhérentes (colonne pleine). y
Les résultats obtenus montrent que la population cellulaire dite « adhérente »
est
significativement enrichie en cellules clonogéniques, puisqu'elle ne
représente que 10% des
kératinocytes totaux mais contient un pourcentage de cellules clonogéniques 10
fois plus
élevé que celui de la population dite « non adhérente ».
Figure 2 : Comparaison du potentiel d'expansion des kératinocytes contenus
dans
la population non fractionnée, des populations de cellules « adhérentes » et «
non
adhérentes ». '
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été
séparés en une
population cellulaire dite « adhérente » et une population dite « non
adhérente » par une étape
d'adhésion de 12 minutes sur du collagène de type I. Les cellules contenues
dans les 2
populations, ainsi que celles de la population totale non fractionnée, ont été
soumises à un test
de culture à long terme (nombre total cumulé de cellules produites), afin de
comparer leur
potentiel d'expansion.
On a représenté en abscisses le temps (exprimé en nombre de jours) et en
ordonnées
l'expansion cumulée (nombre de cellules produites au jour X / nombre de
cellules au jour 1).
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La courbe avec des carrés noirs correspond aux résultats obtenus à partir des
cellules de
la population totale, celles avec des triangles à partir des cellules de la
population adhérente
(12 minutes sur collagène I) et celles avec des ronds à partir des cellules de
la population non-
adhérente ( 12 minutes sur collagène I).
Les résultats obtenus montrent que la population cellulaire dite « adhérente »
contient
l'essentiel des cellules primitives à fort potentiel d'expansion, alors que la
population
cellulaire dite « non adhérente » est majoritairement composée de
kératinocytes plus tardifs
qui n'expriment qu'un potentiel d'expansion réduit.
Figures 3A et 3B : Séparation de la population de kératinocytes de cellules
« adhérentes » en 2 fractions sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R.
Des kératinocytes de la fraction dite « adhérente », pré-enrichie en cellules
primitives
par une étape d'adhésion sur collagène de type I, ont été marqués par un
anticorps fluorescent
dirigé contre l'EGF-R (anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de
l'EGF-R). Le
signal a été analysé de manière semi-quantitative par cytométrie en flux:
La figure 3A présente un profil de marquage représentatif de fEGF-R obtenu à
partir de
kératinocytes de la fraction adhérente (surface la plus sombre), ainsi que le
profil contrôle
correspondant (surface la plus claire). L'axe des abscisses représente
l'intensité de fluorescente
mesurée par cytométrie en flux et exprimée en échelle logarithmique. L'axe des
ordonnées
représente la distribution des cellules analysées en fonction de (intensité du
signal fluorescent
mesuré.
La figure 3B permet de visualiser la distribution Gaussienne du niveau
d'expression de
l'EGF-R à la surface des kératinocytes de la fraction adhérente (axes des
abscisses et
ordonnées identiques à ceux de la figure 3A). Les résultats obtenus montrent
une distribution
du signal suffisamment étalée pour permettre le tri de cellules exprimant soit
faiblement
fEGF-R, soit fortement ce récepteur. Le profil présenté illustre une
séparation de la
population adhérente en 2 fractions : l'une, dite « EGF-Rfa'6~e », contient
45% des cellules
adhérentes exprimant le plus faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre,
dite « EGF-Rf°n »,
contient 45% des cellules adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à
leur surface.
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Figure 4 : Comparaison du potentiel d'expansion à long terme des kératinocytes
contenus dans les fractions de phénotype " EGF-Rfa~ble " et " EGF-Rf°rc
".
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-
enrichis en
cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis
séparés en 2
fractions : l'une, dite « EGF-Rfa,bie », contient 45% des cellules adhérentes
exprimant le plus
faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rf°rt »,
contient 45% des cellules
adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à leur surface. Le
potentiel d'expansion à
long terme (nombre total cumulé de cellules produites) de ces 2 fractions a
été comparé.
L'axe des abscisses correspond au temps de culture exprimé en jours et l'axe
des
ordonnées à l'expansion cumulée déjà définie.
La courbe avec des carrés noirs correspond aux résultats obtenus à partir des
cellules de
la fraction EGF-Rfa;bie et celle avec des losanges à partir des cellules de la
fraction EGF-Rf°'~.
Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-Rfa'b~e »
contient
l'essentiel des cellules primitives à fort potentiel d'expansion, alors que
les cellules de la
fraction cellulaire dite « EGF-Rf°'~' » possèdent un potentiel
d'expansion moins important.
Figures SA, SB, SC et SD : Cultures issues des fractions " EGF-Rfa'bie " et
" EGF-Rfort "~
La figure SA correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rfa'b~e (Jour
34 de culture)
La figure SB correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rf°n
(Jour 34 de culture)
La figure SC correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rfa'ble (Jour
70 de culture)
La figure SD correspond à une culture issue de la fraction EGF-Rf°rt
(Jour 70 de culture)
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-
enrichis en
cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis
séparés en deux
fractions : fane, dite « EGF-Rfa'b~e », contient 45% des cellules adhérentes
exprimant le plus
faible niveau d'EGF-R à leur surface ; l'autre, dite « EGF-Rf°rt »,
contient 45% des cellules
adhérentes qui exprime le plus fort niveau d'EGF-R à leur surface. La
production de cellules
de petite taille, critère associé aux CSKs, a été suivie au cours du temps par
observation
microscopique dans les cultures issues de chacune de ces 2 fractions.
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Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-Rfa'b~e »
assure une
production plus prolongée de cellules primitives de petite taille que la
fraction cellulaire dite
« EGF-Rf°rt ».
Figure 6 : Séparation de la population de kératinocytes « adhérente » en 4
fractions sur la base du niveau d'expression de l'EGF-R.
Des kératinocytes de la population dite « adhérente », pré-enrichie en
cellules primitives
par une étape d'adhésion sur collagène de type I, ont été marqués par un
anticorps fluorescent
dirigé contre fEGF-R (anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire de
l'EGF-R). Le
signal a été analysé de manière semi-quantitative par cytométrie en flux.
L'axe des abscisses représente l'intensité de fluorescente mesurée par
cytométrie en flux
et exprimée en échelle logarithmique. L'axe des ordonnées représente la
distribution des
cellules analysées en fonction de (intensité du signal fluorescent mesuré.
Le profil de cytométrie en flux présenté illustre une séparation de la
population
adhérente en 4 fractions : les fractions dites « EGF-R-~+ » et « EGF-R++ »
sont incluses dans la
fraction EGF-Rfa'b~e et contiennent chacune 20% des cellules de la population
adhérente ; les
fractions dites « EGF-R+++ » et « EGF-R++++ » sont incluses dans la fraction
EGF-Rf°rt et
contiennent chacune 20% des cellules de la population de cellules adhérentes.
Figure 7 : Comparaison du potentiel d'expansion à long terme des kératinocytes
contenus dans les fractions de phénotype " EGF-R-~+ ", " EGF-R++ ", " EGF-R+++
", et
" EGF-R+++'~ ".
Les kératinocytes totaux isolés à partir d'un prélèvement cutané ont été pré-
enrichis en
cellules primitives par la méthode d'adhésion sur collagène de type I, puis
séparés en 4
fractions : 2 fractions extrêmes contenant respectivement 20% des cellules
exprimant le plus
faiblement et fortement fEGF-R, « EGF-R-~+ » et « EGF-R++++ », ainsi que 2
fractions
présentant des marquages intermédiaires « EGF-R++ » et « EGF-R+++ ~~. Le
potentiel
d'expansion à long terme de ces 4 fractions a été comparé (nombre total cumulé
de cellules
produites).
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La courbe avec des triangles noirs correspond aux résultats obtenus à partir
des cellules
de la fraction EGF-R-~+, celle avec des losanges à partir des .cellules de la
fraction EGF-R++,
celle avec des ronds à partir des cellules de la fraction EGF-R+++, celle des
carrés à partir des
cellules de la fraction EGF-R++++.
Les résultats obtenus montrent que la fraction cellulaire dite « EGF-R-~+ »
est la plus
enrichie en cellules primitives possédant un fort potentiel d'expansion à long
terme.
FiEUres 8A, 8B, 8C et 8D : Capacité des cellules primitives Adh+~"+EGF-Rfaibie
à générer
in vitro un épiderme pluristrati~é.
Le substrat de culture utilisé est un derme humain dévitalisé et exempt
d'épiderme,
préparé suivant la méthode décrite par Régnier et al., (1981) (10). Les
kératinocytes issus des
différentes sous-populations, Adh+++EGF-Rf°rc (4 ou 7 passages
successifs de cultures) ou
Adh+++EGF-Rfa'bte (4 ou 7 passages successifs de cultures), ont été déposés
sur ce substrat
dermique et cultivés pendant 6 jours dans du milieu DMEM/Ham F12 (invitrogen),
contenant
10% de sérum de veau foetal (Invitrogen) ; 10 ng/ml d'EGF (BD Biosciences,
USA) ;
0,4 ~g/ml d'hydrocortisone (Sigma Chemical Co) ; 10-6 M de isoprotérénol
(Sigma Chemical
Co.) ; 5 pg/ml de transfernne (Sigma Chemical Co.) ; 2x10-9 M de
triiodothyronine (Sigma
Chemical Co.) ; 1,8x10 M d'adénine (Sigma Chemical Co.), et 5 p.g/ml
d'insuline (Sigma
Chemical Co.). Les cultures ont ensuite été placées à l'interface air-liquide
et poursuivies en
absence d'isoprotérénol, de transfernne, de trüothyronine et d'adénine.
L'analyse
histologique des épidermes reconstruits a été effectuée 7 jours plus tard.
(N.B. Adh+++ signifie
qu'il s'agit de kératinocytes issus de la population adhérente suite au pré-
enrichissement).
La figure 8A montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré
à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rfa'b~e au passage 4. L'épiderme obtenu est
correctement
formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 wm, est
graduée tous les
10 pm.
La figure 8B montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré
à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rf°n au passage 4. L'épiderme obtenu
est correctement
formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 ~m,.est
graduée tous les
10 pm.
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La figure 8C montre une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré
à
partir de kératinocytes Adh+++EGF-Rfa'b~e au passage 7. L'épiderme obtenu est
correctement
formé et différencié. L'échelle représentée, de taille maximale 100 pm, est
graduée tous les
10 ~.m.
La figure 8D une coupe microscopique correspondant à un épiderme généré à
partir de
kératinocytes Adh+++EGF-Rforc au passage 7. L'épiderme obtenu est dégénératif.
L'échelle
représentée, de taille maximale 100 gym, est graduée tous les 10 pm.
Les résultats montrent que le potentiel organogénique de la sous-population
Adh~EGF-Rfa'b~e est plus durable que celui des kératinocytes de la sous-
population
Adh+~EGF-Rf°n.
Figures 9A, 9B et 9C : phénotypage par cytométrie en flux de la population non
fractionnée de kératinocytes et des fractions adhérentes et non-adhérentes
obtenue après
le pré-enrichissement.
Les marquages immuno-phénotypiques sont réalisés sur des échantillons de 50
000
cellules en suspension dans du PBSBSA à 0,2%. Afin de limiter la fixation non
spécifique
d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma
globulines "
issues de la même espèce que les anticorps utilisés pour les marquages (Rat y
globulin ou
Mouse y globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech,
Marseille,
France) pendant 10 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées
pendant 30 minutes à
4°C en présence d'un anticorps anti-CD49f FITC (intégrine chaîne a6)
produit chez le rat
(marquage) (anti-human CD49f FITC rat IgG2a ; GoH3 clone, Pharmingen, San
Diego, CA,
USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle
isotypique) (rat
IgG2a-FITC isotypic control, Dako, Glostrup, Denmark) ; d'un anticorps anti-
CD49b-PE
(intégrine chaîne a2) produit chez la souris (marquage) (anti-human CD49b-PE
mouse IgGza ;
12F1-H6 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non
spécifique contrôle
de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgG2~ PE isotypic control; 6155-
178 clone,
Pharmingen, San Diego, CA, USA) ; d'un anticorps anti-CD29-PE (intégrine
chaîne (31)
produit chez le la souris (marquage) (anti-human CD29-FITC mouse IgGI ; 4B4
clone,
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Coulter Corp., Miami, FL, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de
même isotype
(contrôle isotypique) (mouse IgG~-FITC isotypic control; Becton Dickinson, San
Jose, CA,
USA). Les cellules sont ensuite lavées en PBSBSA avant d'être analysées par
cytométrie en
flux. Pour chaque échantillon, les statistiques sont effectuées sur au moins
10 000 événements
comptabilisés.
La Figure 9 représente le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la
population non
fractionnée (avant passage sur collagène, colonne blanche), de la population
adhérente (12
min. sur collagène de type I, colonne noire) et de la population non-adhérente
(12 min. sur
collagène de type I, colonne grise) positives au marquage immunologique des
intégrines a6,
a2 et (31. Ces résultats sont les moyennes et les écarts types obtenus pour 3
expériences
indépendantes.
La Figure 9A montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population
non
fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur
collagène de type I,
colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de
type I, colonne
grise) positives au marquage immunologique de l'int~grine a6.
La Figure 9B montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population
non
fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 min. sur
collagène de type I,
colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de
type I, colonne
grise) positives au marquage immunologique de l'intégrine a2.
La Figure 9C montre le pourcentage (en ordonnée) de cellules de la population
non
fractionnée (colonne blanche), de la population adhérente (12 mina sur
collagène de type I,
colonne noire) et de la population non-adhérente (12 min. sur collagène de
type I, colonne
grise) positives au marquage immunologique de l'intégrine (31.
Les résultats montrent qu'environ 70% des cellules de la population de
cellules
adhérentes expriment l'intégrine a6 alors qu'environ 40% des cellules de la
population non-
fractionnée expriment cette intégrine et que seulement environ 30% des
cellules de la
population non-adhérente l'expriment.
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EXEMPLES
I/ Isolement des kératinocytes à partir d'un prélèvement cutané (prépuce).
Après élimination du tissu sous-cutané à l'aide d'un scalpel, le prélèvement
cutané est
découpé en fragments d'environ Smm x Smm, puis décontaminé par un traitement
antibiotique (Gentamycine (Life Technologies Ltd, Paisley, Scotland), 3 bains
successifs de
minutes dans du milieu de culture DMEM (Life Technologies Ltd, Scotland)).
Pour
permettre la séparation du derme de l'épiderme, le prélèvement est ensuite
soumis à un
traitement protéolytique (dispase (Boehringer, Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim,
10 Germany) 1 nuit à 4°C, puis 30 minutes à 37°C). Les fragments
d'épiderme séparés du tissu
dermique sont placés dans une solution de trypsine 0,05%-EDTA 0,02%
(Biological
Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) (15 minutes à 37°C). La
préparation est agitée
périodiquement pour favoriser la dissociation des cellules. L'effet de la
trypsine est ensuite
neutralisé par l'ajout d'un milieu de culture contenant 10% de sérum de veau
foetal (SVF)
(Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) (DMEM+10%SVF). La suspension
cellulaire
est homogénéisée, puis lavée dans du milieu de culture pour kératinocytes
(Keratinocyte
growth medium, KGM) (KGM Bullet Kit, BioWhittaker, Clonetics Corp., San Diego,
CA,
USA). Les cellules en suspension sont comptées au microscope à l'aide d'une
cellule de
Malassez. La viabilité des échantillons est estimée par la méthode d'exclusion
au bleu Trypan
(Life Technology, Cergy Pontoise Cedex, France).
II/ Enrichissement d'une préparation de kératinocytes en cellules primitives
de la
couche basale de l'épiderme.
La couche basale de l'épiderme contient les kératinocytes les plus primitifs
dits
" souches ". Ces cellules peuvent être séparées des kératinocytes plus matures
sur la base de
leur propriété d'adhésion rapide. Cette étape permet un pré-enrichissement de
la préparation
en cellules primitives.
La suspension cellulaire est placée dans des flacons de culture « recouverts »
avec du
collagène de type I (solution de collagène I (Sigma Chemical Co Ltd, Irvine,
LTK) diluée d'un
facteur 2 dans du PBS, déposée pendant 45 minutes dans les flacôns, puis
séchage après
élimination du surplus), à une densité de 200 000 cellules/cm2. Après 12
minutes, les
kératinocytes n'ayant pas adhéré sont éliminés par lavage en tampon PBS. Les
cellules
adhérentes ainsi sélectionnées sont détachées du support par une trypsination
douce (trypsine
0,05%-EDTA 0,02% (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant
3 à 5
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minutes à 37°C). Après neutralisation de la trypsine (DMEM+10%SVF), les
cellules sont
récupérées, lavées, puis remises en suspension dans du milieu KGM. La fraction
des cellules
adhérentes sélectiônnée par cette méthode représente environ 10% des
kératinocytes totaux de
l' épiderme.
III/ Tests clonogénigues à court terme.
Les kératinocytes sont cultivés dans du milieu KGM à faible densité (1600,
3200 et/ou
4800 cellules/cm2) afin d'obtenir des clones bien individualisés et aisément
observables au
microscope. Le milieu de culture est renouvelé 3 fois par semaine jusqu'à
l'arrêt des
expériences (6 à 12 jours). Les clones sont alors fixés et colorés, puis
comptés et classés
suivant le nombre de cellules qui les composent.
Pour la coloration, les préparations sont tout d'abord fixées pendant 30
minutes à
température ambiante avec de la formaline (aldéhyde formique en solution 35%)
(Merck,
Darmstadt, Germany) diluée à 10% dans du tampon PBS (BioWhittaker Inc.,
Walkersville,
MA, USA), puis lavées 2 fois à l'eau. Les cellules sont ensuite incubées
pendant 2 minutes
avec de l'hématoxyline filtrée (coloration des noyaux) (Sigma diagnostics, St
Louis, MO,
USA). Après rinçage à l'eau, les préparations sont séchées à l'air, puis
incubées pendant 5
minutes dans de l'éosine (Sigma diagnostics, St Louis, MO, USA) à 1% dans du
tampon PBS.
Elles sont à nouveau lavées à l'eau, puis séchées.
IV/ Phénotyua~e par cytométrie en flux de la population non-fractionnée de
kératinocytes, des fractions adhérentes et non-adhérentes obtenues après le
pré-
enrichissement.
Les marquages immuno-phénotypiques sont réalisés sur des échantillons de 50
000
cellules en suspension dans du PBS/BSA à 0,2%. Afin de limiter la fixation non
spécifique
d'anticorps, les cellules sont tout d'abord incubées en présence de " gamma
globulines "
issues de la même espèce que les anticorps utilisés pour les marquages (Rat y
globulin ou
Mouse y globulin, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech,
Marseille,
France) pendant 10 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite incubées
pendant 30 minutes à
4°C en présence d'un anticorps anti-CD49f FITC (intégrine chaîne a6)
produit chez le rat
(marquage) (anti-human CD49f FITC rat IgG2a ; GoH3 clone, Pharmingen, San
Diego, CA,
USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de même isotype (contrôle
isotypique) (rat
IgG2~ FITC isotypic control, Dako, Glostrup, Denmark); d'un anticorps anti-
CD49b-PE
21
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(intégrine chaîne a2) produit chez la souris (marquage) (anti-human CD49b-PE
mouse IgG2a ;
12F1-H6 clone, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ou d'un anticorps non
spécifique contrôle
de même isotype (contrôle isotypique) (mouse IgGZa-PE isotypic control; 6155-
178 clone,
Pharmingen, San Diego, CA, USA) ; d'un anticorps anti-CD29-PE (intégrine
chaîne (31)
produit chez le la souris (marquage) (anti-human CD29-FITC mouse IgG~ ; 4B4
clone,
Coulter Corp., Miami, FL, USA) ou d'un anticorps non spécifique contrôle de
même isotype
(contrôle isotypique) (mouse IgG~-FITC isotypic control; Becton Dickinson, San
Jose, CA,
USA). Les cellules sont ensuite lavées en PBSBSA avant d'être analysées par
cytométrie en
flux. Pour chaque échantillon, les statistiques sont effectuées sur au moins
10 000 événements
comptabilisés.
Les résultats présentés dans la Figure 9 indiquent que la population de
cellules
adhérentes sur le collagène de type I exprime fréquemment l'intégrine a6
(environ 70% des
cellules positives) par rapport à la population non-fractionnée (environ 40%
des cellules
positives) et à la population non-adhérente (environ 30% des cellules
positives). La
population de cellules adhérentes présente donc un enrichissement significatif
en intégrines de
type a6 par rapport à la population non fractionnée. J'ar comparaison, les
intégrines a2 et (31
ne sont pas des marqueurs adaptés pour l'évaluation de l'enrichissement obtenu
car la
majorité des cellules des trois populations (non-fractionnée, adhérente, non-
adhérente)
exprime ces intégrines.
V/ Marguage du récepteur de l'EGF (EGF-R1 pour analyse et tri par cytométrie
en flux.
Les cellules en suspension sont centrifugées et reprises dans du tampon PBS
contenant
0,2% de sérum albumine bovine (BSA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA)
(PBSBSA 0,2%). Afin de limiter la fixation non spécifique d'anticorps, les
cellules sont tout
d'abord incubées en présence de " gamma globulines de rat " (Rat y globulin,
Jackson
ImmunoResearch Laboratories Inc., Immunotech, Marseille, France) pendant 10
minutes à
4°C. Les cellules sont ensuite incubées pendant 30 minutes à 4°C
en présence d'un anticorps
anti-EGF-R (domaine extracellulaire) non conjugué produit chez la souris
(marquage) (anti-
human EGF-R mouse IgGZb; EGFR1 clone, Dako, Glostrup, Denmark) ou d'un
anticorps non
spécifique contrôle de même isotype que l'anticorps anti-EGF-R (contrôle
isotypique) (mouse
IgG2b isotypic control, Immunotech, Marseille, France). Après 2 lavages
successifs en
PBSBSA 0,2%, les cellules sont incubées en présence d'un anticorps secondaire
produit chez
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le rat et couplé à la phyco-érythrine (PE), capable de reconnaître les
anticorps de souris (Rat
anti-Mouse IgGza+b-PE, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) (30 minutes à
4°C). Les
cellules sont à nouveau lavées 2 fois, avant d'être utilisées pour le tri par
cytométrie en flux
(FACS Vantage, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
On a séparé la population de kératinocytes adhérents en fractions présentant
différents
niveaux d'expression de l'EGF-R et trié les cellules qu'elles contiennent afm
de les
caractériser d'un point de vue fonctionnel.
VI/ Evaluation du potentiel d'expansion à long terme des fractions de
kératinocytes triées par cytométrie en flux.
Les cellules de chaque sous-population, triées par cytométrie en flux, sont
soumises à
un test fonctionnel permettant d'évaluer leur capacité d'expansion à long
terme (propriété
associée aux cellules les plus primitives dites "souches")
Après estimation de la viabilité par la méthode d'exclusion au bleu Trypan, 60
000
cellules de chaque sous-population sont ensemencées dans des flacons de
culture non
"recouverts", d'une surface de 25 cmz. Le milieu de culture (KGM) -ést changé
3 fois par
semaine. Les cellules sont décollées de leur support, comptées et
réensemencées à raison de
60 000 cellules viables par flacon de 25 cm2 lorsque les cultures atteignent
70-80% de
confluence, afm d'éviter que les cellules ne s'engagent vers la
différenciation suite à des
phénomènes d'inhibition de contact. Le décollement des cellules est réalisé en
2 étapes
successives. Il s'agit tout d'abord d'une trypsination douce (trypsine 0,05%-
EDTA 0,02%
(Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israël) pendant 3 à 5 minutes à
37°C) qui
permet de détacher environ 80% des cellules. Les cellules les plus difficiles
à détacher pour
lesquelles la protéolyse douce s'est avérée inefficace sont ensuite soumises à
une trypsination
plus forte (trypsine 0,25%-EDTA 0,02% (Biological Industries, Kibbutz Beit
Haemek, Israël)
pendant S minutes à 37°C) qui permet de récupérer l'ensemble de la
population cellulaire.
A chaque passage, l'expansion cumulée obtenue est calculée pour chaque culture
(nombre de cellules produites au jour X / nombre de cellules ensemencées au
jour 1). Les
expériences sont poursuivies jusqu'à épuisement du potentiel de prolifération
des cellules. Les
résultats sont présentés sous la forme d'une courbe d'expansion cumulée qui
permet de
visualiser le potentiel de prolifération total de chacune des sous-populations
cellulaires
testées.
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VII/ Capacité des cellules souches épidermigues sélectionnées à générer in
vitro un
épiderme reconstruit.
Une autre caractéristique des kératinocytes Adh+++EGF-Rfa'b~e qui a été
évaluée est leur
potentiel organogénique, c'est à dire leur capacité à générer in vitro un
épiderme pluristratifié
S (N.B. Adh+++ signifie qu'il s'agit de kératinocytes issus de la population
adhérente suite au
pré-enrichissement). Des kératinocytes des sous-populations Adh+++EGF-
Rf°'~' et
Adh+++EGF-Rfa'b~e ont été cultivés durant 7 passages successifs. A chaque
passage, une partie
des cellules amplifiées a été prélevée pour être ensemencée sur un substrat
dermique. Aux
passages précoces (passage 4), les kératinocytes issus des cultures initiées
avec des cellules
Adh+++EGF-Rf°'~' et avec des cellules Adh+++EGF-Rfai»~e ont montré une
bonne capacité à
produire un épiderme de bonne qualité (Figure 8A, Figure 8B). Dans les deux
cas,
l'histologie est caractéristique d'un épiderme correctement formé et
differencié: I) une couche
basale contenant des cellules polygonales orientées perpendiculairement au
substrat dermique,
II) 3 a 4 couches de cellules spineuses, III) 4 a 6 couches de cellules -
granuleuses, et IV) un
stratum corneum compact composé de cellules cornées anucléées. A un nombre de
passages
plus élevé (passage 7), il a été observé que seulement les kératinocytes issus
de la sous-
population Adh+++EGF-Rfaib~e demeurent capables de générer un épiderme (Figure
8C), les
cultures issues de la sous-population Adh+++EGF-Rf°rt ne produisant
plus qu'un épiderme
dégénératif (Figure 8D). Ces résultats démontrent le potentiel organogénique
de la sous-
population Adh~+EGF-Rfa'b~e plus durable que celui des kératinocytes de la
sous-population
Adh+++EGF-Rf°n.
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