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Procédés de production de lymphocytes y8T
La présente demande concerne des méthodes pour la production de cellules
lymphocytaires, ainsi que les outils, réactifs et kits utilisables pour leur
mise en
oeuvre. Elle concerne plus particulièrement des méthodes de préparation de
lymphocytes yBT, adaptées à une production industrielle de cellules
fonctionnelles de qualité pharmaceutique et en quantités importantes. Elle
concerne également des méthodes d' activation des cellules yBT, des
dispositifs
adaptés à ces méthodes, ainsi que les compositions cellulaires obtenues et
leurs
utilisations. La présente demande est applicable à la production de
lymphocytes
y~T humains ou animaux, et peut être utilisée dans les domaines
pharmaceutiques, thérapeutiques, expérimentaux, cosmétiques, de recherche
industrielle, etc.
Les lymphocytes yST représentent habituellement de 1 à 5 % des lymphocytes du
sang périphérique, chez un individu sain (humains, singes). Ils sont impliqués
dans le développement d'une réponse immune protectrice, et il a été démontré
qu'ils reconnaissent leurs ligands antigéniques pax une interaction directe
avec
l'antigène, sans présentation par les molécules du CMH d'une cellule
présentatrice. Les lymphocytes Ty982 (parfois aussi désignés lymphocytes
Ty282) sont des lymphocytes Y8T porteurs de récepteurs TCR à régions variables
Vy9 et V82. Ils représentent la majorité des lymphocytes Ty8 dans le sang
humain. Lorsqu'ils sont activés, les lymphocytes y8T exercent une puissante
activité cytotoxique non restreinte par le CMH, particulièrement efficace pour
tuer divers types de cellules, notamment des cellules pathogènes. Il peut s'
agir de
cellules infectées par des virus (Poccia et al, J. Leukocyte Biology, 62,
1997, p.
1-5) ou par d'autres parasites intracellulaires, tels que les mycobactéries
(Constant et al, Infection and Immunity, vol. 63, n° 12, Dec. 1995, p.
462-4633)
ou les protozoaires (Behr et al, Infection and Immunity, Vol. 64, n° 8,
1996, p.
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2892-2896). Il peut aussi s'agir de cellules cancéreuses (Poccia et al, J.
Immunol., 159, p. 6009-6015 ; Fournie et Bonneville, Res. Immunol., 66tn
FORUM IN IMMUNOLOGY, 147, p. 338-347). La possibilité de moduler in
vitro, ex vivo ou in vivo l'activité de ces cellules fournirait donc de
nouvelles
approches thérapeutiques efficaces dans le traitement de pathologies variées
telles que les maladies infectieuses (notamment virales ou parasitaires), les
cancers, les allergies, voire les maladies auto-immunes et/ou inflammatoires.
Différentes méthodes ont été envisagées dans l'art antérieur pour la
production
ex vivo ou in vitro de ces cellules. Ainsi, la demande W099/46365 propose un
procédé comprenant une première culture de cellules hémato-lymphoïdes en
présence d'interleukine-12 et d'un ligand du CD2, suivie d'une deuxième
culture
en présence d'un composé mitogène des cellules T et d'interleukine-2. Ce
procédé est complexe, requiert plusieurs étapes de traitement des cellules et
plusieurs voies métaboliques d'activation. En outre, il ne fournit pas des
compositions cellulaires suffisamment enrichies en cellules yBT.
Les demandes WO00/12516 et WO00/12519 décrivent des composés chimiques
capables d'activer les cellules yBT. Ces demandes proposent l'utilisation de
ces
composés pour activer une réponse immunitaire in vivo, et prévoient en outre
d'utiliser ces composés dans des méthodes d'activation ex vivo ou in vitro des
cellules yBT. Toutefois, ces demandes ne décrivent pas de procédé industriel
permettant de générer des populations cellulaires composées essentiellement de
cellules yBT.
Pour envisager l'utilisation de cellules y8T à usage de thérapie cellulaire,
il est
nécessaire de disposer d'un procédé de culture et de conditionnement des
cellules
permettant d' obtenir un grand nombre de cellules de pureté élevée en cellules
yST. Les exemples d'injections de cellules LAK ou clones T montrent que
l'efficacité de ces traitements n'apparait que quand des quantités importantes
de
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cellules sont injectées (bordignon 1999, haematologica. 84:1110-1149 pour
revue). Typiquement et d'après ces exemples, on doit disposer d'une méthode
permettant d'obtenir de panière reproductible et dans des conditions acceptées
par la pharmacopée au moins 100 millions de cellules de pureté supérieure à
80%.
La présente demande décrit à présent un nouveau procédé de production de
cellules yBT. Le procédé est adapté à une production industrielle de quantités
importantes de cellules, permet la production de lymphocytes y8T fonctionnels
et
de qualité pharmaceutique. Le procédé peut être mis en oeuvre directement sur
des cytaphérèses, à partir de quantités importantes et hétérogènes de
cellules, et
permet une stimulation et une expansion très importantes en cellules yBT,
conduisant à des compositions pouvant comprendre plus de 90% de cellules yBT.
En outre, le procédé de l'invention est simplifié puisqu'il ne nécessite
qu'une
étape ou qu'une voie d'activation métabolique. Le procédé permet de produire
des compositions cellulaires adaptées à différentes utilisations, notamment
thérapeutiques.
Un premier objet de l'invention réside plus particulièrement dans un procédé
de
préparation d'une composition de lymphocytes y~T, comprenant au moins une
étape de culture d'une préparation biologique comprenant au moins 50 millions
de cellules mononucléées en présence d'un composé activateur synthétique des
lymphocytes y8T à (initiation de la culture, suivie d'une culture, typiquement
de
10 à 25 jours, en présence d'une cytokine. Les compositions obtenues
présentent
avantageusement les spécifications suivantes
- elles comprennent plus de 80% de cellules yBT, et
- elles comprennent plus de 100 millions de cellules ybT viables et
fonctionnelles.
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Une caractéristique avantageuse du procédé de l'invention réside dans la
possibilité de partir de quantités importantes de cellules non fractionnées,
pour
aboutir à des préparations très enrichies en cellules y8T fonctionnelles.
Avantageusement, les cellules sont maintenues en culture à une densité
cellulaire
inférieure à environ S.10E6 cellules/ml, de préférence à environ 3.10E6, plus
préférentiellement à environ 2.10E6 celluleslml. Les exemples fournis montrent
en effet qu'une telle densité assure une expansion efficace des cellules.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une
composition cellulaire comprenant des lymphocytes y8T fonctionnels,
caractérisé
en ce qu' il comprend
. la culture d'une préparation de cellules sanguines (typiquement de cellules
provenant dune cytaphérèse) en présence d'un composé activateur synthétique
des lymphocytes y8T et d'une cytokine choisie parmi l'interleukine-2 et
l'interleukine-15, ladite culture étant réalisée dans des conditions assurant
le
maintien d'une densité cellulaire essentiellement inférieure à S.10E6
cellules/ml,
de préférence à environ 3.10E6 cellules/ml, et
la récupération des cellules obtenues ou d'une partie d'entre elles, ces
cellules
comprenant des lymphocytes y8T fonctionnels.
Le maintien de la densité cellulaire peut être réalisé de différentes façons,
comme
par exemple par dilutions) successive(s), ajouts) de milieu, transfert de
dispositif, etc.
Un autre objet de l'invention réside dans un procédé d'enrichissement de
cellules
sanguines en lymphocytes yBT, comprenant au moins une étape de culture d'une
préparation biologique comprenant au moins 50 millions de cellules mono-
nucléées sanguines en présence d'un composé activateur synthétique des
lymphocytes y8T à (initiation de la culture, suivie d'une culture, typiquement
de
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10 à 25 jours, en présence d'une cytokine. Les préparations obtenues par un
tel
procédé peuvent comprendre plus de 80% de cellules yBT, voire plus de 90%.
Comme il sera indiqué dans la suite du texte, les cellules utilisées sont
5 préférentiellement humaines, peuvent provenir d'échantillons biologiques
congelés, et sont cultivées préférentiellement pendant une période de temps
supérieure à 10 jours, de préférence entre 10 et 30 jours.
Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique,
caractérisée en ce qu'elle comprend une population de cellules composée à plus
de 80% de lymphocytes y8T fonctionnels et en ce qu' elle comprend plus de 100
millions de cellules yBT. Préférentiellement, la composition comprend en outre
un agent ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique et, plus
préférentiellement, un agent de stabilisation, tel que la sérum-albumine
humaine.
Les cellules sont préférentiellement autologues, c'est-à-dire issues d'une
méme
préparation biologique (ou d'un même donneur). Elles sont plus
préférentiellement obtenues par un procédé tel que décrit ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne une culture de cellules sanguines in
vitro
ou ex vivo, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 80% de lymphocytes
y8T fonctionnels et plus de 100 millions de cellules yBT.
L'invention est également relative à l'utilisation d'une culture de cellules
telle
que définie ci-avant pour la préparation d'une composition pharmaceutique
destinée à la stimulation des défenses immunitaires d'un sujet, plus
particulièrement au traitement de maladies infectieuses, parasiraires ou de
cancers.
L'invention concerne également une méthode de traitement d'une pathologie
susceptible d'être améliorée par augmentation de l'activité des cellules yBT,
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notamment par augmentation des défenses immunitaires d'un sujet, comprenant
l'administration à un sujet d'une quantité efficace d'une composition
pharmaceutique ou d'une composition cellulaire telles que définies ci-avant.
L'administration est réalisée préférentiellement par injection, notamment par
injection systémique (infra-veineuse, infra-péritonéale, infra-musculaire,
intra-
artérielle, sous-cutanée, etc.) ou locale (e.g., infra-tumorale ou dans une
zone
environnant ou irriguant une tumeur). Des inj ections répétées peuvent être
réalisées. Les cellules injectées sont préférentiellement autologues (ou
syngéniques), c'est-à-dire sont préparées à partir d'une préparation
biologique
provenant du patient lui-même (ou d'un jumeau). La méthode est applicable au
traitement de diverses pathologies, telles que les cancers les maladies
infectieuses
ou parasitaires.
Comme indiqué, la présente invention peut être utilisée dans les domaines
pharmaceutiques, thérapeutiques, expérimentaux, cosmétiques, de recherche
industrielle, etc. Elle est particulièrement adaptée à la production de
compositions cellulaires à usage pharmaceutique, notamment pour
l'augmentation d'une réponse immune chez un sujet, par exemple pour le
traitement de pathologies telles que les cancers et maladies infectieuses ou
parasitaires.
Préparation biolo ig'aue
Le procédé de l'invention est avantageux dans la mesure où il permet une
production efficace de cellules y8T à partir d'une préparation biologique
comprenant des quantités importantes de cellules sanguines non triées. Il peut
donc être mis en oeuvre directement à partir d'un échantillon de sang, de
plasma,
ou de sérum, par exemple d'une cytaphérèse. Typiquement, on . utilise une
préparation de cellules mononucléées du sang, notamment du sang périphérique.
Une préparation de cellules du sang périphérique comporte généralement de 30 à
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70% de lymphocytes T ou B, de 5 à 15% de cellules NK et de 1 à 5% de cellules
yBT. Il est bien entendu possible de traiter la préparation biologique
préalablement à la mise en oeuvre du procédé de l'invention, par exemple pour
sélectionner certaines sous populations, ou pour dépléter certaines sous-
populations. Toutefois, un tel pré-traitement n'est pas nécessaire pour
produire
des compositions de cellules y8T fonctionnelles selon l'invention. Ainsi, le
procédé est typiquement mis en oeuvre directement à partir d'un échantillon de
cellules sanguines prélevé chez un sujet, notamment d'un échantillon de
cellules
mono-nucléées totales (c'est-à-dire non fractionnées). Un tel échantillon peut
âtre
obtenu par des méthodes classiques connues de l'homme de l'art et couramment
pratiquées en clinique humaine dans le monde entier, telles que par
cytaphérèse
ou gradient ficoll sur sang total (PBMC). Une source préférée de cellules pour
la
mise en oeuvre de l'invention est composée de cellules mononucléées
périphériques totales telles qu'obtenues par cytaphérèse. Ainsi, dans un mode
particulier de mise en oeuvre, le procédé de l'invention comprend une première
étape de culture d'une cytaphérèse, ou d'une aliquote d'une cytaphérèse, dans
les
conditions décrites ci-avant. Une cytaphérèse permet typiquement d'obtenir
plus
de 10E9 cellules mononucléées. A partir d'une cytaphérèse, il est ainsi
possible
de préparer plusieurs aliquotes, qui peuvent être traitées séparément par le
procédé de l'invention. Ainsi, pour un méme patient, il peut être produit
plusieurs
lots de cellules y8T selon l'invention, de manière séparée et espacée dans le
temps. Cet échantillonnage permet d'effectuer des tests de qualité et de
fonctionnalité sur les cellules, et d'assurer une plus grande sécurité aux
compositions.
A cet égard, la présente demande montre que des cellules y8T fonctionnelles
peuvent être produites à partir de préparations de cellules mono-nucléées
préalablement congelées. Les résultats présentés dans les exemples montrent en
effet qu'une cytaphérèse peut être congelée en vue de sa conservation pendant
de
longues périodes, et que les cellules, une fois décongelées, peuvent âtre
activées
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et multipliées efficacement pour produire des compositions de cellules y8T
fonctionnelles. Cette possibilité de production à partir d'échantillons
préalablement congelés confère un avantage très important à l'invention,
notamment dans le cadre de la préparation de banques de cellules autologues.
Un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention comprend donc la
préparation de cellules ybT à partir d'une préparation biologique (notamment
de
cellules mono-nucléées) préalablement congelée.
Un objet particulier de l'invention concerne également un procédé de
production
de cellules y8T fonctionnelles, comprenant (i) la culture de cellules mono-
nucléées sanguines préalablement congelées en présence d'un composé
activateur synthétique des lymphocytes ybT et d'une cytokine dans des
conditions assurant la prolifération de cellules ybT et (ü) la récupération ou
le
conditionnement des cellules y8T obtenues. Préférentiellement, les cellules
mono-nucléées sanguines proviennent d'une cytaphérèse.
Un autre objet particulier de l'invention concerne un procédé de production de
cellules y~T fonctionnelles, comprenant (i) (l'obtention et) la congélation de
cellules mono-nucléées sanguines à partir d'un sujet, typiquement sous forme
de
doses comprenant environ 10E7 à S.10E9 cellules par ml, (ü) la décongélation
des
cellules ou de doses individuelles et leur culture en présence d'un composé
activateur synthétique des lymphocytes y8T et d'une cytokine dans des
conditions assurant la prolifération de cellules y8T et, (iii) la récupération
ou le
conditionnement des cellules y8T obtenues. Préférentiellement, les cellules
mononucléées sanguines proviennent d'une cytaphérèse.
La congélation des cellules peut être effectuée selon différentes techniques.
Une
méthode préférée utilise un agent stabilisant tel que le DMSO
(diméthylsulfoxyde) et/ou le glycérol. Un tel agent stabilise les membranes
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cellulaires et permet une congélation efficace des cellules, en terme de
viabilité
des cellules à la décongélation. D'autres techniques ou milieux peuvent être
utilisés, mettant en oeuvre des gélatines, des polymères, des protéines, etc.
Un
milieu particulièrement adapté est une solution 90/10 volume sur volumé de
sérum et de DMSO, où le sérum utilisé sert également à la prolifération des
cellules. Le pourcentage de DMSO peut varier entre 5 et 15 % du volume de la
solution. Le sérum peut être remplacé par une solution d'albumine humaine à
4%, par exemple Albumine-LFB 4 % (médicament AMM n°558632-9). Le
pourcentage d'albumine humaine peut cependant être plus élevé, par exemple
jusqu'à 20%. Typiquement, les cellules sont mises en suspension dans un milieu
adapté à la congélation, tel que défini ci-dessus, puis sont placées dans une
atmosphère de congélation, telle que des vapeurs d'azote liquide, par exemple.
La congélation est avantageusement réalisée en tubes ou en poches adaptées, en
conditions stériles, sous forme d'aliquotes d'une même préparation de cellules
sanguines. Les cellules ainsi congelées peuvent être conservées pendant des
périodes de temps très longues, permettant ainsi la production de cellules y8T
à
intervalles de temps importants, sans nécessité de prélèvements répétés chez
un
suj et.
Une caractéristique importante du procédé de l'invention réside dans la
quantité
de matériel biologique traité. Ainsi, le procédé utilise préférentiellement
une
préparation biologique comprenant plus de SO.l0E6 cellules mononucléées,
typiquement entre 50 et 1000 million de cellules, par exemple 50, 100, 200 ou
300 millions de cellules environ. Dans un procédé typique, la préparation
biologique comprend plus de 100 millions de cellules. Il est entendu que des
quantités supérieures peuvent être mises en oeuvre. Dans la mesure où une
préparation biologique typique comprend au départ moins de 10% de cellules
yST, le plus souvent moins de 5% de cellules yBT, une préparation biologique
de
100 millions de cellules contient typiquement de 1 à S millions de cellules
yBT. A
partir d'une telle préparation, le procédé de l'invention permet d'obtenir des
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compositions comprenant 10E8 cellules y8T fonctionnelles ou plus. En outre,
alors que les préparations de départ ne contiennent que 1 à 5% environ de
cellules y~T, les compositions obtenues par le procédé de l'invention
comprennent plus de 80% de cellules yBT, voire plus de 90%. Le procédé de
5 l'invention est donc particulièrement efficace et adapté à la production de
cellules en quantités et qualité pharmaceutiques.
Composé activateur synthétique des l~nphoc es y~T
10 LTn aspect avantageux du procédé de l'invention réside dans l'utilisation
d'un
composé activateur synthétique des lymphocytes yBT. Ainsi, l'invention montre
qu'une activation et une expansion efficaces et orientées des cellules y~T
peuvent
être obtenues par une seule activation métabolique au moyen d'un composé
synthétique.
Le terme composé activateur synthétique indique que l'invention utilise une
molécule produite artificiellement, capable d'activer les lymphocytes y~T. Il
s'agit typiquement d'un ligand (e.g., d'une molécule chimique) capable de lier
le
récepteur T des lymphocytes ybT. Le composé activateur peut être de nature
variée, telle que peptidique, lipidique, chimique, etc. Il peut s'agir d'un
ligand
endogène purifié ou produit par voie chimique, ou d'un fragment ou dérivé d'un
tel ligand, ou d'un anticorps ayant la même spécificité antigénique. Il s'agit
préférentiellement d'un composé chimique de synthèse, capable de lier de
manière sélective le récepteur TCR et d'activer les cellules yBT. La liaison
sélective indique que le composé interagit avec une affinité supérieure sur le
TCR des cellules y8T que sur d'autres récepteurs membranaires, et conduit donc
à une activation sélective ou orientée de la prolifération et de l'activité
des
lymphocytes yBT.
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Différents composés activateurs synthétiques peuvent être utilisés, tels que
les
composés phosphohalohydrines (PHD) décrits dans la demande WO00/12516,
les composés phosphoépoxydes (PED) décrits dans la demande WO00/12519, ou
les composés biphosphonates tels que décrits par Kunzmann et al. (Blood 96
(2000) 384).
Des composés activateurs synthétiques particuliers utilisables de façon
avantageuse dans la mise en oeuvre de l'invention sont les phosphohalohydrines
et les phosphoépoxydes de formule (I) et (II) suivantes, respectivement
OH (I II
X H (CH2)n-O- ~ -O- -O-
2
R1 O-Cat+ O-Cat+
(
H2C O O O
II II
R1 (CH2)n-O- ~ -O- ~ -O-
O-Cat+ O-Cat+ (II)
dans lesquelles X est un atome d'halogène (choisi de préférence parmi un atome
d'iode, de brome ou de chlore), Rl est un groupe méthyle ou éthyle, Cat+
représente un (ou des) cations) organiques) ou minéral(aux) (y compris le
proton) identiques ou différents, et n est un nombre entier compris entre 2 et
20.
Ces composés peuvent être produits par différentes techniques de chimie
connues
de l'homme du métier, et notamment les méthodes décrites dans les demandes
WO00/12516 et WO00/12519. Des composés particuliers sont des composés di-
ou tri-phosphate de formule (I) ou (II) ci-dessus.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre, on utilise un composé PED ou PHD.
Des composés particuliers sont les produits suivants
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3-(bromométhyl)-3-butanol-1-yl-diphosphate (BrHPP)
3-(iodométhyl)-3-butanol-1-yl-diphosphate (IHPP)
3-(chlorométhyl)-3-butanol-1-yl-diphosphate (C1HPP)
3-(bromométhyl)-3-butanol-1-yl-triphosphate (BrHPPP)
3-(iodométhyl)-3-butanol-1-yl-triphosphate (IHPPP)
a,y-di-[3-(bromométhyl)-3-butanol-1-yl]-triphosphate (diBrHTP)
a,y-di-[3-(iodométhyl)-3-butanol-1-yl]-triphosphate (diIHTP)
3,4,-époxy-3-méthyl-1-butyl-diphosphate (Epox-PP)
3,4,-époxy-3-méthyl-1-butyl-triphosphate (Epox-PPP)
a,y-di-3,4,-époxy-3-méthyl-1-butyl-triphosphate (di-Epox-TP)
Dans un autre mode particulier, on utilise des composés aminobiphosphonates,
tels que par exemple l'acide 1-hydroxy-3-(méthylpentylamino)propylidène-
biphosphonique.
Dans une autre variante, l'activateur synthétique est le (E)-4-hydroxy-3-
methyl-
but-2-enyl pyrophosphate, tel que décrit par Hintz et al (FEBS Lett. Dec 7
2001 ;
509(2):317-22)
Bien que moins efficaces, d'autres composés utilisables dans la mise en oeuvre
de
l'invention sont des phosphoantigènes décrits dans la demande W095/20673 ou
l'isopentényl pyrophosphate (IPP) (US5,639,653).
La dose de composé activateur peut être adaptée par l'homme du métier en
fonction de la quantité de cellules et de la nature du composé utilisé.
Généralement, le composé est mis en oeuvre à l'initiation de la culture à une
dose
inférieure ou égale à environ 10 ~,M. Un avantage important du procédé de
l'invention réside dans le fait qu'une seule activation métabolique sélective
est
nécessaire, en début de culture. Ainsi, une fois la culture initiée, il n'est
plus
nécessaire d'ajouter à nouveau dans le milieu le composé activateur
synthétique.
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C okine
Le procédé de l'invention utilise une cytokine (seule ou éventuellement
combinée ou associée à d'autres agents biologiquement actifs), en particulier
une
interleukine. Il s'agit avantageusement d'interleukine-2 ou d'interleukine-15.
La
présente demande montre en effet que ces interleukines, qui utilisent le même
récepteur, permettent une production efficace de cellules y~T, dans les
conditions
décrites ci-avant.
L'interleukine utilisée peut être d'origine humaine ou animale, de préférence
d'origine humaine. Il peut s'agir d'une protéine sauvage ou de tout variant ou
fragment biologiquement actif, c'est-à-dire capable de se fixer à son
récepteur et
d'induire l'activation de cellules y~T dans les conditions du procédé de
l'invention.
Le terme « variant » désigne en particulier tous les variants naturels,
résultant par
exemple de polymorphisme(s), épissage(s), mutations(s), etc. De tels variants
naturels peuvent donc comprendre une ou plusieurs mutations ou substitutions,
une délétion d'un ou plusieurs résidus, etc. par rapport à la séquence
sauvage. Le
terme variant désigne également les polypeptides ayant pour origine une autre
espèce, par exemple de rongeurs, bovins, etc. Avantageusement, on utilise
néanmoins une cytokine d' origine humaine. Le terme « variant » inclut
également tout variant synthétique d'une cytokine, et notamment tout
polypeptide comprenant une ou plusieurs mutations, délétions, substitutions
et/ou
additions d'un ou plusieurs acides aminés par rapport à la séquence sauvage.
Des
variants préférés comportent avantageusement au moins 75% d'identité avec la
séquence primaire de la cytokine sauvage, préférentiellement au moins 80%,
plus
préférentiellement au moins 85%. Encore plus préférentiellement, les variants
préférés comportent au moins 90% d'identité avec la séquence primaire de la
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cytokine sauvage. Le degré d'identité peut être déterminé par différentes
méthodes et au moyen de logiciels connus de l'homme du métier, comme par
exemple selon la méthode CLUSTAL.
Comme indiqué, il est également possible d'utiliser dans le cadre de la
présente
invention tout fragment d'une cytokine conservant l'activité biologique
définie
ci-avant. De tels fragments contiennent de préférence au moins une région ou
un
domaine fonctionnel de la cytokine, comme par exemple un domaine catalytique,
un site de liaison à un récepteur, une structure secondaire (boucle, feuillet,
etc.),
un site consensus, etc. Pour la mise en oeuvre de la présente invention, les
fragments utilisés conservent avantageusement la propriété de l'interleukine-2
ou
de l'interleukine-15 de lier le récepteur membranaire et de stimuler le
développement de lymphocytes yBT.
Les cytokines utilisées peuvent en outre comprendre des résidus hétérologues
ajoutés à la séquence d'acides amines sauvage, tels que des acides aminés,
lipides, sucres, etc. Il peut également s'agir de groupes) chimique(s),
enzymatique(s), radioactif(s), etc. La partie hétérologue peut en particulier
constituer un agent stabilisateur, un agent facilitant la pénétration du
polypeptide
dans les cellules ou améliorant son affinité, etc..
Les cytokines peuvent se présenter sous forme soluble, purifiée, fusionnée ou
complexée avec une autre molécule, telle que par exemple un peptide,
polypeptide ou une protéine biologiquement active. Les cytokines peuvent être
préparées par toute technique biologique, génétique, chimique ou enzymatique
connue de l'homme de l'art, et notamment par expression dans un hôte
cellulaire
approprié d'un acide nucléique correspondant. Les cytokines telles que l'IL-2
et
l'IL-15 peuvent également être obtenues à partir de sources commerciales. De
manière préférée, on utilise une cytokine recombinante humaine, typiquement
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une interleukine-2 recombinante humaine ou une interleukine-15 recombinante
humaine.
Les doses de cytokines utilisées dans le procédé de l'invention peuvent varier
en
5 fonction de la nature des cellules de départ. En outre, la concentration en
cytokine peut être modifiée en cours de culture. Typiquement, les cytokines
sont
utilisées à des doses comprises entre 100 et 500 U/ml, typiquement entre 150
et
500 U/ml environ. Au cours du procédé, la concentration en cytokine peut être
ajustée, par exemple par ajout de milieu de culture. De manière préférée, on
10 utilise des doses de cytokine comprises entre 150 et 400 U/ml. Dans un mode
particulier, il est possible d'initier la culture en présence d'une première
dose de
cytokine, puis de la poursuivre en présence d'une deuxième dose, supérieure à
la
première, afin d'augmenter la prolifération des cellules. Ainsi, un objet
particulier de l'invention réside dans un procédé de préparation d'une
15 composition de lymphocytes y~T à partir d'un échantillon de cellules mono-
nucléées, comprenant au moins
. une première étape de culture des cellules mononucléées en présence d'un
composé activateur synthétique des lymphocytes y8T et d'une cytokine, ladite
cytokine étant présente à une première dose efficace, et
. une deuxième étape de culture desdites cellules en présence d'une deuxième
dose efficace de ladite cytokine, ladite deuxième dose efficace étant
supérieure à
ladite première dose efficace.
La présente demande montre en effet que l'utilisation d'un composé activateur
synthétique favorise l'expression de récepteurs de haute affinité pour la
cytokine
IL2 à la surface des cellules yBT, et que des doses faibles d'IL2 sont
suffisantes
pour permettre la prolifération spécifique des cellules yBT, cette dose faible
ne
favorisant pas la pousse des cellules portant des récepteurs de plus faible
affinité.
Le récepteur de haute affinité disparaît cependant après 7 à 10 jours de
culture et
est remplacé par un récepteur d'affinité moindre. Les cellules doivent alors
être
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cultivées en présence d'une deuxième dose plus élevée de cytokine, afm
d' améliorer les performances du procédé et la prolifération des cellules y8T
fonctionnelles. Dans ce mode de réalisation, la première dose de cytokine est
préférentiellement une dose inférieure ou égale à environ 300 Uhnl, de
préférence de l'ordre de 150 U/ml environ, et la deuxième dose de cytokine est
préférentiellement une dose supérieure à environ 300 U/ml, de préférence à
environ 350 U/ml, typiquement de l'ordre de 400 U/ml.
Dans un autre mode de réalisation, la concentration en cytokine est maintenue
essentiellement constante durant le procédé, par exemple par ajout de milieu
frais
contenant la cytokine à différents intervalles. Préférentiellement, dans ce
mode
de réalisation, la concentration en cytokine est maintenue entre 250 et 500
U/ml,
par exemple entre 300 et 450 U/ml.
Culture
Le procédé de l'invention comprend la culture des cellules en présence d'un
composé activateur (à l'initiation de la culture) et d'une cytokine, pendant
une
période de temps et dans des conditions permettant l'activation et
l'amplification
sélectives des cellules yBT.
Les cellules peuvent être cultivées dans différents milieux et dispositifs
adaptés à
la culture de cellules humaines, notamment de cellules sanguines. Il peut
s'agir
de milieux définis, supplémentés, etc. Des exemples de milieux utilisables
sont
notamment les milieux commerciaux RPMI, Prolifix S3, S6, Ampicell X3 (Bio
Media), X-VIVO-10 et 15 (Biowhittaker), AIM V (Invitrogen), Medium I et II
(Sigma), StemSpan H200 (Stem cell), CellGro SCGM (CellGenix), etc. Ces
milieux peuvent être supplémentés par des antibiotiques, du sérum humain ou
d'origine animale, de préférence agréés pour une utilisation pour la culture
cellulaire à visée thérapeutique, des acides aminés et/ou des vitamines, etc.
Un
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milieu préféré est le milieu RPMI, de préférence supplémenté par du sérum de
veau foetal. Un milieu particulièrement préféré est un sérum de veau irradié,
agréé par les agences réglementaires pour la culture de cellules à visée
thérapeutique. Ce type de sérum est commercialement disponible chez plusieurs
fournisseurs. Les cultures peuvent être réalisées dans différents dispositifs,
tels
que des boites, poches, flasques, bouteilles, tubes, ampoules, réacteurs
biologiques, etc. Les cultures sont avantageusement réalisées dans des
dispositifs
stériles et qui peuvent être obturés. Il n'est pas nécessaire que les cultures
soient
agitées. Des poches perméables aux gaz sont particulièrement adaptées. Selon
le
déroulement du procédé, des changements de dispositif peuvent étre effectués
au
cours de la culture, notamment pour diluer les cellules et favoriser leur
expansion. Un tel changement n'est cependant pas obligatoire, et des
dispositifs
de volume important peuvent être mis en oeuvre dès l'initiation du procédé et
conservés jusqu'à son terme.
Typiquement, si des poches sont utilisées, la préparation biologique ou les
cellules sont contenues dans un volume de milieu tel que la densité cellulaire
initiale soit comprise entre 0.2 et 3.10E6 cellules/ml. Les demandeurs ont en
effet
montré que le maintien d'une densité cellulaire comprise entre 0.2 et 3.10E6
cellules/ml, plus préférentiellement proche de 2.10E6 cellules/ml, favorise
grandement l'expansion des cellules y~T. Des concentrations cellulaires
supérieures pourraient vraisemblablement être obtenues à l'aide de réacteurs
biologiques.
Le maintien de la densité cellulaire peut être réalisé de différentes façons,
comme
par exemple par dilutions) successive(s), ajouts) de milieu, transfert de
dispositif, etc. Bien entendu, la densité cellulaire ne peut être maintenue
constante au cours du procédé, dans la mesure où les cellules se divisent en
permanence. Avantageusement, la densité est donc contrôlée ou ajustée à
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différents intervalles de temps, de manière maintenir le mieux possible une
densité comprise entre 0.5 et 3.10E6 cellules/ml.
Le procédé peut être réalisé sur des périodes de temps variables et/ou suivant
plusieurs cycles. D'une manière générale, la durée du procédé est supérieure à
10
jours environ, typiquement comprise entre environ 10 et 30 jours ou entre
environ 10 et 25 jours. Différentes variantes peuvent être envisagées. Ainsi,
il est
possible, dans une première phase, d'effectuer la culture en présence du
composé
activateur seul et en absence de cytokine. Cette première phase peut durer par
exemple entre lh et 72h, typiquement moins de 4~h. Cette phase est destinée à
stimuler les cellules y8T et à induire une certaine expression de récepteurs
de.
haute affinité pour les cytokines par ces cellules. A l'issue de cette
première
phase, la culture est poursuivie dans un milieu comprenant la cytokine, mais
sans
qu'il soit nécessaire d'ajouter à nouveau le composé activateur. Typiquement,
à
l'issue de cette phase, du milieu frais contenant la cytokine, mais dépourvu
du
composé activateur est ajouté aux cellules. La culture est alors poursuivie
pendant une période de temps supérieure à environ 10 jours, typiquement entre
10 et 25 jours. Comme indiqué, la densité cellulaire est préférentiellement
contrôlée et/ou ajustée pendant la culture, et la dose de cytokine utilisée
peut être
maintenue ou modifiée.
Selon une autre variante, il est possible d'initier la culture en présence du
composé activateur et de la cytokine, et de la poursuivre pendant une période
comprise typiquement entre 10 et 30 jours, en contrôlant la densité et la
concentration en cytokine. Ainsi, en fonction de la densité cellulaire, du
milieu
frais contenant la cytokine (mais typiquement dépourvu du composé activateur)
est ajouté aux cellules. En outre, comme indiqué ci-avant, les cellules
peuvent
être séparées ou transférées en cours de procédure dans des dispositifs de
volume
plus grand, si nécessaire.
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Comme indiqué, le procédé de l'invention permet d'obtenir des compositions de
cellules présentant avantageusement les spécifications suivantes
- elles comprennent plus de 80% de cellules yBT, avantageusement plus de
85%, voire plus de 90%, et
- elles comprennent plus de 100 millions de cellules y8T viables et
fonctionnelles.
Pour obtenir de manière reproductible de telles caractéristiques chez la
plupart
des donneurs, il est nécessaire de mettre en culture au départ un nombre élevé
de
cellules, de l'ordre de 50 millions de PBMC obtenues par exemple de
cytaphérèse.
Le procédé est simple, ne nécessite qu'une activation métabolique, rapide, et
comporte un nombre très limité de manipulations des cellules. Il peut en outre
étre mis en oeuvre à partir de cellules préalablement congelées. Ce procédé
est
donc particulièrement avantageux pour une exploitation pharmaceutique des
cellules yBT.
Utilisations / Conditionnement
Les cellules produites peuvent être utilisées extemporanément ou traitées en
vue
de leur conservation. Généralement, les cellules sont conditionnées dans un
milieu comprenant un agent stabilisant, tel que notamment un polymère ou une
protéine neutre. On peut utiliser avantageusement de l'albumine humaine (HSA),
disponible commercialement en qualité injectable. Les résultats présentés
montrent que les cellules peuvent être conditionnées dans une solution
d'albumine humaine à 4°C, en vue de leur injection. A cet égard, un
objet
particulier de l'invention réside dans une composition comprenant des cellules
y&T et de la sérum albumine humaine, typiquement de 2 à 10%, avantageusement
à 4% environ.
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Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique,
caractérisée en ce qu'elle comprend une population de cellules composée à plus
de 80% de lymphocytes y8T fonctionnels et comprenant plus de 100 millions de
cellules yBT. Préférentiellement, la composition comprend plus de 85% de
5 lymphocytes ybT fonctionnels, voire plus de 90%. Généralement, la
composition
comprend en outre un agent ou véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique
et, plus préférentiellement, un agent de stabilisation, tel que la sérum-
albumine
humaine. Plus préférentiellement, les cellules sont obtenues ou susceptibles
d'être obtenues par un procédé tel que décrit ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une
composition pharmaceutique à base de lymphocytes yBT, le procédé
comprenant
. la culture de cellules selon le procédé décrit dans la présente demande,
. la récupération des cellules obtenues ou d'une partie d'entre elles, ces
cellules
comprenant des lymphocytes y~T fonctionnels, et
le conditionnement des cellules dans un véhicule ou excipient acceptable sur
le
plan pharmaceutique.
Un autre objet de l'invention concerne une culture de cellules sanguines in
vitro
ou ex vivo, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins 80% de lymphocytes
y8T fonctionnels.
L'invention est également relative à l'utilisation d'une culture de cellules
telle
que définie ci-avant pour la préparation d'une composition pharmaceutique
destinée à la stimulation des défenses immunitaires d'un sujet, plus
particulièrement au traitement de maladies infectieuses, parasitaires, de
cancers,
de maladies auto-immunes ou inflammatoires.
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L'invention concerne également une méthode de traitement d'un cancer ou d'une
pathologie infectieuse ou parasitaire, comprenant l'administration à un sujet
d'une quantité efficace d'une composition pharmaceutique ou d'une composition
cellulaire telles que définies ci-avant.
Le terme traitement désigne une réduction ou une suppression des symptômes,
des causes ou de foyers de la maladie, une régression ou un ralentissement de
la
progression d'une maladie, par exemple de la croissance tumorale, une
amélioration de l' état des patients, une réduction de la charge virale ou
parasitaire, une baisse de la douleur ou de la souffrance, une augmentation de
la
durée de vie, etc.
Le terme quantité efficace désigne plus particulièrement une quantité efficace
pour stimuler une réponse immune du patient contre les cellules cancéreuses ou
infectées. Les doses de cellules administrées sont typiquement comprises entre
10E6 et 10E10 cellules par doses, même si des quantités différentes peuvent
être
envisagées. Il est entendu que la quantité de cellules utilisées peut être
ajustée par
le praticien en fonction de la pathologie et du protocole clinique (notamment
du
nombre et du site d' inj ections).
L'administration est réalisée préférentiellement par injection, notamment par
injection systémique (infra-veineuse, infra-péritonéale, infra-musculaire,
intra-
artérielle, sous-cutanée, etc.) ou locale (e.g., infra-tumorale ou dans une
zone
environnant ou irnguant une tumeur). Des injections répétées peuvent être
réalisées. Les cellules injectées sont préférentiellement autologues (ou
syngéniques), c'est-à-dire sont préparées à partir d'une préparation
biologique
provenant du patient lui-même (ou d'un jumeau). Des compositions allogéniques
peuvent être envisagées.
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Dans un mode de réalisation typique, des injections répétées sont réalisées,
avec
une escalade de doses, chaque palier de doses pouvant lui-même comprendre
plusieurs injections (typiquement de une à quatre) à des intervalles de temps
pouvant varier entre une et six semaines par exemple. La dose initiale est
typiquement supérieure à 100 millions de cellules, par exemple comprise entre
100 millions et 5 milliards, et une escalade de doses jusqu'à 10 milliards de
cellules peut être réalisée. Un protocole clinique particulier prévoit une
escalade
de dose (chaque palier de dose comportant trois injections successives à trois
semaines d'intervalle) partant de 1 milliard, puis 4 milliard puis 8 puis 12
milliards de cellules.
En outre, les cellules gamma 9 delta 2 étant dépendantes, pour leur
prolifération
et leur survie, de l'activité de cytokines et de manière préférentielle,
d'interleukine 2, une co-thérapie est avantageusement réalisée. Ainsi, dans un
mode préféré, les cellules obtenues par le procédé de l'invention sont
injectées
avec une co-thérapie de cytokine, notamment d'IL2. Un schéma d'administration
préféré consiste en des injections sous cutanées journalières pendant environ
7
jours d'environ 1 million d'unités de cytokine par mètre carré de surface
corporelle.
Un objet particulier de l'invention réside donc également dans une composition
comprenant des cellules telles que définies ci-avant et une cytokine, de
préférence l'IL-2 ou l'IL-15, plus préférentiellement l'IL-2, en vue de leur
utilisation simultanée, séparée ou espacée dans le temps. Un autre objet de
l'invention réside dans une méthode de traitement comprenant l'administration
à
un sujet d'une composition cellulaire telle que définie ci-avant et d'une
cytokine,
de préférence d'IL-2, les cellules et la cytokine étant administrées de façon
simultanée, séparée ou espacée dans le temps.
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D' autre part, les cellules y8T peuvent être modifiées génétiquement,
préalablement à leur administration, par exemple pour qu' elles expriment un
facteur de stimulation, un facteur de croissance, une cytokine, une toxine,
etc.
La présente invention est utilisable (seule ou en association avec d'autres
thérapies) pour le traitement de différentes pathologies susceptibles d'être
améliorées par une augmentation de l'activité des cellules y8T (et notamment
dans lesquelles des cellules sensibles à l'activité cytolytique des cellules
y8T sont
impliquées). Ainsi, la plupart des lignées tumorales de carcinome rénal sont
tuées
efficacement in vitro par les cellules gamma 9 delta 2 obtenues par le procédé
de
l'invention. Des cancers de différentes histologies peuvent également être
traités, dans lesquels les cellules gamma delta exercent une activité
cytolytiques
myélome, cancer de la vessie, mélanome, astrocytome, neuroblastome. Cette
liste
n'est pas limitative, et d'autres types de cancers susceptibles à la lyse
gamma
delta peuvent également être traités (cancers du poumon, du foie, tête et cou,
colon etc.). S'agissant des maladies infectieuses, les cellules gamma delta
ont été
montrées comme lytiques vis à vis de nombreuses bactéries ou mycobactéries
intracellulaires. Ainsi, l'activité des cellules gamma 9 delta 2 contre les
cellules
infectées par l'agent de la tuberculose ou l'agent de la peste est bien
connue. Ces
cellules répondent également à d'autres pathologies infectieuses comme la
thularémie. Une activité antivirale a également été démontrée contre les
cellules
infectées par le virus HIV, influenza, Sendai, coxsackie, vaccinia, vesicular
stomatitis virus(VSV), and herpes simplex virus-1 (HSV-1) (Scialnmas et al,
1999, TcR gamma delta and viruses, Microbes Infect 1 :203).
D' autres aspects et avantages de la présente demande apparaîtront à la
lecture des
exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non
limitatifs.
EXEMPLES
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EXEMPLE I : Expansion des cellules gamma 9 delta 2 à partir de plus de 50
millions de cellules PBMC non fractionnées de manière à obtenir après 10 à
20 jours de culture une pureté en gamma 9 delta 2 de plus de 80% et plus de
100 millions de cellules gamma 9 delta 2.
IA - Matériels
Echantillons de sang
Des tubes de sang total de 6 ml (sur ACD : Acid Citrate Dextrose) sont
prélevés
sur chacun des 3 donneurs sains et sont stockés à température ambiante.
Le sang sera traité environ 18 heures après le prélèvement.
Poches de c.~taphérèse
Une poche de cytaphérèse (1/2 masse corporelle) est prélevée sur des donneurs
sains et stockée à température ambiante.
Les CMN (cellules mono-nucléées) sont traités environ 18 heures après le
prélèvement.
Milieux de culture
Différents milieux de culture ont été utilisées, synthétiques ou non. Les
cellules
ont ainsi été cultivées en milieu RPMI (SIGMA, réf R0883), éventuellement
supplémenté par ajout de L-glutamine (0.3 g/1 final) extemporanément.
Différents milieux synthétiques ont également été testés, qui sont rassemblés
dans le tableau 1.
Dans certains cas, les milieux ont été supplémentés par du serum, d'origine
humaine ou animale. A cet égard, du sérum de veau foetal irradié a été utilisé
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(lots de « Fetal Clone-I » irradié (25 kGy) provenant de chez Hyclone (réf SH
30080.03 IR)), ainsi que du sérum humain.
Le sérum humain utilisé au cours de ces études provient de pool de serum de
5 donneurs sains préparé par le centre de transfusion de Nantes. Ce serum de
grade
thérapeutique (agréé par l' agence réglementaire Française) est utilisé dans
des
protocoles de thérapie cellulaire visant à l'injection de cellules T alpha
béta
classiques.
10 Composés et réactifs
L'interleukine-2 recombinante humaine utilisée est la Proleukin (Aldesleukine)
à
18 millions UI provenant de chez CHIRON BV (réf FRCOlA) et stockée en
aliquotes à la concentration de 360 000 UI/ml dans du milieu RPMI/SH 10 % à -
20°C. Le Ficoll (« Lymphocyte separation medium ») a été utilisé à une
densité
15 1.077 + 0.001 (SIGMA. réf 913353). L'albumine humaine est l'albumine-LFB 4
%, médicament AMM n°558632-9. Le DMSO et la solution saline proviennent
de Braun medical.
Dispositifs de culture
20 Les dispositifs de culture utilisés sont indiqués dans le Tableau 2.
Anticorps
Les anticorps utilisés sont répertoriés dans le Tableau 3.
IB - Méthodes
Isolement des l~~hoçytes à partir de Sang total + Ficoll
25 Cette procédure est couramment utilisée dans les laboratoire de biologie
cellulaire. Brièvement, le sang total est « Ficollé », puis les PBMC sont
récupérées sur le gradient de Ficoll. Le Ficoll est rincé, et une numération
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cellulaire est réalisée au « Coulter Multisizer II » (sur 3 prélèvements
différents
pour une même condition et pour un même donneur). Les PBMC sont congelées
dans une solution de congélation à 10 % de DMSO (dans de l'albumine humaine
4 % ou dans du SVF).
Isolement des lymphocytes à partir de CMN (c~taphérèse)
Cette procédure comporte une première phase de « dé-plaquettisation » de
l'échantillon, qui est réalisée, sur chaque poche de cytaphérèse, selon la
procédure suivante.
Le contenu de la poche de cytaphérèse est transféré dans des tubes de 50 ml,
dans
lesquels 2 volumes de milieu RPMI sont ajoutés. Les tubes sont centrifugés à
200
g, puis le surnageant est éliminé. Les culots sont poolés (regroupés) et remis
en
suspension dans du milieu RPMI (qsp 50 ml). Les cellules sont comptées, puis
une nouvelle centrifugation est réalisée à 400 g environ (à 20°C). Le
surnageant
est à nouveau éliminé, et le culot mis en suspension dans du sérum de veau
foetal
de manière à avoir une concentration cellulaire finale de 500 millions
cellules/ml
environ. Les cellules sont comptées et la concentration cellulaire est ajustée
à 300
millions cellules/ml environ avec du sérum de veau foetal. Les suspensions
cellulaires sont généralement placées sur la glace ( à 4°C). Les CMN
peuvent
être congelées dans une solution de congélation à 5 à 15 % de DMSO (dans de
l'albumine humaine 4 %, ou du SVF), ou directement mises en culture.
Congélation des cellules
Pour optimiser les paramètres de la congélation, les cellules suspendues dans
de
l'albumine humaine à 4 % ou du SVF sont diluées volume à volume dans la
solution de congélation réfrigérée (20 % de DMSO et 4% d'albumine humaine
ou SVF). Le tube contenant la suspension cellulaire est agité pendant toute la
durée de l'opération et repose avantageusement sur un bac réfrigéré ou sur de
la
glace pilée. Le mélange, homogénéisé, est réparti dans des cryotubes de 1.S ml
(1
ml/tube), qui sont rangés dans une boite de congélation, et placées à -
80°C. Les
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cryotubes sont ensuite transférés et stockés dans une cuve d' azote (au
minimum
4 heures plus tard).
Les CMN et les PBMC sont rapidement décongelées (par immersion au bain-
Marie à 37°C), puis transférées dans des tubes de 15 ml contenant
12 ml de
milieu RPMI. Les cellules sont lavées en milieu RPMI-10 % SVF pour éliminer
le DMSO. La numération cellulaire est effectuée au « Coulter » (sur 3
prélèvements différents pour une même condition et pour un même donneur).
Mise en culture dans des flasdues et des hoches (le jour de l'isolement)
Le nombre de CMN ensemencées dans les différents contenants (ou dispositifs
de culture) a été choisi de manière proportionnelle au rapport « nombre de
lymphocytes/ surface d'un puits » utilisé lors des cultures en plaque 24
puits, soit
1.106 cellules/ 1,9 cm2 environ (voir Tableau 4).
Les cellules mononuclées de chaque donneur sont mises en culture dans les
contenants sous un méme volume et un méme nombre de cellules au départ, soit
100 millions de cellules par contenant, dans 50 ml de milieu de culture RPMI /
10 % SVF / 3 p.M BrHPP, 120 UI/ml IL-2 (soit une concentration cellulaire
initiale de 2 million/ml). Le même milieu contenant 360 UI/ml d'IL2 est ajouté
au cours de la culture comme cela est indiqué pour chaque manipulation.
Mise en culture dans des plaques 24 puits après décon él~ionl
Les PBMC et les CMN sont mise en culture dans des plaques 24 puits à raison de
1 million de cellules par puits dans 1.5 ml de milieu de culture RPMI / 10 %
SVF
/ 3 ~,M BrHPP / 120 UI /ml IL-2 (soit une concentration cellulaire de 0.6
million/ml)
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Maintien de la culture
Les cellules sont maintenues en culture à 37°C en atmosphère
humide et en
présence de 5 % de C02 dans du milieu RPMI / 10 % SVF / 360 UI/ml IL-2. Le
premier changement de milieu intervient par ajout de milieu à jour 4, puis
régulièrement tous les 3 jours. Ainsi, la concentration en IL2 augmente au
cours
de la culture.
Les cellules cultivées dans les plaques 24 puits sont transférées dans des
flasques
de 25 cm2 en position verticale lorsque la densité cellulaire devient
supérieure à
3. 106 cellules/ml.
Pour les cellules cultivées en flasque ou en poche, la densité cellulaire est
maintenue à 2. 106 cellules/ml en ajoutant du milieu de culture : Vmax = 150
ml.
Sachant que le contenant ayant servi à la mise en culture des cellules est
conservé
tout au long de la culture, lorsque le volume maximal est atteint, il faut
procéder
par élimination d'une partie des cellules pour maintenir la densité cellulaire
à 2.
106 cellules/ml (et ajout de milieu frais).
Comptage, phénotype eg~(anal~par cvtométrie en flux
Plusieurs comptages cellulaires et phénotypages sont effectués au cours des 3
semaines de culture, en particulier aux jours J10, J15, J20. Les comptages et
phénotypages sont réalisés comme suit
- Comptage au Coulter de la totalité des cellules vivantes
- Double marquage CD56/CD3
- Triple marquage V~2/CD3/CD69
- Contrôles isotypiques : IgGlk-FITC/R-PE/cyC
- Acquisition des données par cytométrie en flux (FACScan-Becton Dickinson)
Des comptages pourront être faits à d'autres temps, en cas d'expansion
cellulaire
forte afm de compléter avec du milieu frais.
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Analyse fonctionnelle des cellules
Différents tests sont réalisés sur les cellules obtenues, afin de vérifier
leur
caractère fonctionnel. Ces tests portent notamment sur l'activité cytotoxique
des
cellules et sur leur production de TNF.
. Test de cytotoxicité. Pour ce test, les cellules cibles sont marquées avec
un
isotope SICr (10 ~1 de SICr / 1 million de cellules cibles en plaque 24
puits), puis
incubées 1 heure à 37°C. Les cellules sont distribuées (en double) à
raison de
3000 cellules / puits dans du RPMI/10 % SVF (50 ~,1), et la libération
spontanée et maximale de SICr sont déterminées. Les cellules effectrices (y8T
de
l'invention) sont alors ajoutées (50 ~.1 dans du RPMI/SVF 10 %) sur chaque
cible, selon les ratios Effecteur/Cible (E/T) suivants : 30/l, 3/1, 0.3/l, et
incubées
3 à 4 heures à 37°C. L'activité cytotoxique (la lyse des cellules
cibles) est
déterminée par mesure, sur 25 ~,1 de surnageant dans un compteur de plaque (3,
de
la radioactivité libérée.
. Test de relargage de TNF. Les cellules sont lavées deux fois en RPMI puis
mises en culture dans des plaques 96 puits en milieu RPMI, 10% FCS en
présence de 3 ~.M de BrHPP pendant 24 heures. Le TNF est dosé dans le
surnageant par le kit BeckmanCoulter Kit Immunotech, référence IM 11121.
IC - Résultats
Choix d'un milieu
Les milieux supplémentés en sérum humains sont considérés comme les plus
favorables pour cultiver les lymphocytes humains et notamment les cellules
gamma 9 delta 2, notamment du fait que les facteurs de croissance sérique ont
souvent une spécificité d'espèce. Cependant de tels milieux sont très
difficiles à
préparer et à utiliser en clinique, du fait du risque biologique et de la
disponibilité
de quantité importante de sera humains.
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Nous avons donc tenté de cultiver ces cellules en milieu d'obtention plus
facile.
Ces expériences ont été menées à petite échelle, en plaques 24 puits, à partir
de
sang total de trois différents donneurs avec une stimulation initiale avec
l'EpoxPP (voir matériels et méthodes pour les conditions d'activation). Le
taux
5 et le nombre de lymphocytes T gamma delta sont suivis sur une culture de 30
jours environ, par comptage et cytométrie de flux. Les résultats d'un test de
comparaison de prolifération en milieu RPMI supplémenté soit en sérum humain
soit en SVF, ainsi que sur deux milieux synthétiques (XVIVO10 et 15) sur trois
donneurs sains sont rassemblés dans le Tableau 5.
De manière surprenante, le meilleur milieu pour la pousse des gamma 9 delta 2
est le milieu RPMI supplémenté avec du SVF. Le milieu supplémenté en sérum
humain fournit également une amplification très significative des cellules
gamma
9 delta 2, cependant celle-ci est plus limitée et variable de donneur à
donneur. De
plus, au cours du temps, la pureté et le nombre des cellules deviennent moins
bonnes par rapport au milieu complémenté en SVF. Les milieux synthétiques
testés (sans sérum) fournissent une amplification inférieure. Il s'agit
pourtant des
meilleurs milieux synthétiques pour la pousse des gamma 9 delta 2 (résultats
d'un autre expérience non montrée).
En conclusion, les cellules gamma delta ont un potentiel de prolifération à
long
terme très important, dans un milieu favorable. Nous avons choisi le SVF pour
la
suite car il donne des résultats très intéressants et reproductibles d'un lot
à l'autre
(résultats non montrés). Il est également disponible sous forme de lots
irradiés
agréés pour la manipulation de cellules à visée thérapeutique. D'autres
milieux
pourraient vraisemblablement révéler le fort potentiel de pousse des cellules
gamma delta, comme des milieux avec moins de sérum, des combinaisons des
meilleurs milieux synthétiques avec des quantités faibles de sérum, ou des
combinaison de milieux synthétiques.
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PBL versus c.~taphérèse
L'objectif étant de produire à la fin de la culture des quantités importantes
de
cellules gamma 9 delta 2, il est intéressant de pouvoir disposer au départ
d'une
source de cellules en nombre important, éventuellement congelable, pour
pouvoir
disposer de banques de cellules. Une source possible est représentée par les
cellules mononuclées obtenues par cytaphérèse. Toutefois, cette procédure peut
cependant altérer les cellules et empêcher leur prolifération satisfaisante.
Les
cytaphérèses contenant souvent de nombreux globules rouges, les CMN ont été
testées en prolifération, soit juste après déplaquettisation soit après
déplaquettisation et traitement sur Ficoll (voir matériels et méthodes). Nous
avons donc testé si des cellules de cytaphérèse pouvaient proliférer de
manière
satisfaisante. Ce test a été effectué tout d'abord à petite échelle (plaque 24
puits,
voir matériel et méthodes), et les résultats provenant de trois donneurs
différents
sont compilés dans le Tableau 6.
On constate de manière surprenante que les cytaphérèses ont également un
potentiel de prolifération très important, même s'il est inférieur à celui des
PBMC provenant de sang total. Les CMN après ficoll fournissent par ailleurs
une
prolifération moins importante que les CMN non traitées. Malgré la
prolifération
moins importante, et au vu des quantités de cellules nécessaires au départ
pour
obtenir un grand nombre de cellules, nous avons tenté d'effectuer une culture
à
plus grande échelle à partir de CMN fraîches non ficollées.
Nous avons donc effectué un essai de prolifération à partir de CMN fraîches
provenant de donneur sains (D 100, D 119, D 127). Nous avons testé différents
contenants de cultures (voir matériel et méthode). La culture est initiée avec
100
millions de cellules provenant de CMN à raison de 2 millions de cellules par
ml
(volume total initial 50 ml). La stimulation est effectuée avec BrHPP à 3 ~M.
Un
ajout de 50 ml de milieu frais (contenant 350 U/ml d'IL2) est effectué aux
jours 4
et 7. A partir de jour 10, les cellules sont analysées et comptées, et
ramenées à 2
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millions de cellules par ml. Elles sont ensuite diluées tous les trois jours
de façon
à ramener la concentration cellulaire à 2 millions de cellules par ml.
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 7.
Ces résultats montrent que, dans les conditions de l'invention, des valeurs de
100
millions de cellules gamma 9 delta 2 avec plus de 80% de pureté sont atteintes
dès J10 pour certains donneurs dans certains contenants (D 100 et D 119 dans
les
poches NEXELL par exemple). Ces résultats démontrent l'efficacité des
méthodes de l'invention dans la production de cellules y8T fonctionnelles en
qualité pharmaceutique.
EXEMPLE II : Etude de la concentration de maintien des cellules après
jour 10
IIA - Expansion des cellules gamma 9 delta 2
Une nouvelle expérience, basée sur le protocole précédent, a été effectuée
avec
des CMN de trois nouveaux donneurs (D623, D762, D711). Les matériels et
méthodes sont identiques à l'exemple I sauf quand les conditions sont
précisées.
Les conditions de départ de la culture sont identiques. On effectue un ajout
de 50
ml de milieu à jour 4 et à jour 7. A jour 10, les cellules sont analysées et
comptées. La culture est réalisée en triplicate jusqu'à jour 10 (3 cultures
identiques par donneur). On ramène alors la concentration cellulaire à 3
concentrations (0.2, 0.5 et 1 million de cellules par ml, chaque concentration
provenant d'un des trois triplicats), en vue d' étudier l' effet du paramètre
concentration cellulaire. Les cultures sont ensuite analysées tous les trois
jours, et
la concentration est ramenée à la concentration de jour 10 quand les cellules
dépassent la concentration de 2 millions de cellules par ml.
Les résultats sont compilés dans le Tableau 8.
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On constate que les rendements et les puretés des cellules sont très
supérieurs
après jour 10 à ceux obtenus dans l'exemple I. La concentration cellulaire est
donc un facteur important dans la conduite de la culture à partir de cette
date.
Nous découvrons ainsi que le potentiel de prolifération des cellules gamma
delta
est excellent. Partant de 1 à 4 millions de cellules gamma delta au départ on
obtient de 11 à 13 milliards de cellules à jour 21 de pureté supérieure à 90%.
On
peut noter de manière importante que le nombre de cellules obtenues ne semble
pas dépendre du nombre de cellules gamma delta initial.
IIB - Fonctionnalité des cellules obtenues
Les cellules gamma 9 delta 2 naturelles produisent, après stimulation, des
cytokines comme le TNF (« tumor necrosis factor ») et sont cytotoxiques vis-à-
vis de nombreuses cellules cancéreuses. Notamment, les cellules gamma 9 delta
2 sont connues pour lyser spécifiquement la lignée Daudi (myélome), et non la
lignée RAJI.
La fonctionnalité des cellules obtenues par le procédé de culture cellulaire
de
l'invention a été testée suivant deux paramètres : la capacité de cytotoxicité
vis-
à-vis d'une lignée tumorale de carcinome rénal (Lignée 786-0, ATCC, référence
CRL-1932) et d'une lignée de myélome (les cellules RAJI servant de contrôle
négatif).
Les résultats d'un test de cytotoxicité avec les cellules obtenues par le
procédé
(test du maintien de la concentration cellulaire à 0.2, 0.5, 1 millions de
cellules
par ml, voir plus haut) à jour 23, vis-à-vis de ces trois lignées sont
compilés dans
le Tableau 9.
On constate que les cellules obtenues par le procédé sont effectivement
cytotoxiques vis-à-vis des lignées de carcinome rénal et Daudi et, comme
attendu, ne présentent pas de cytotoxicité significative vis-à-vis de la
lignée
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RAJI. Nous montrons par ailleurs que les cellules sont cytotoxiques vis-à-vis
de
la lignée de carcinome rénal 7~6-0.
EXEMPLE III : Etude de la prolifération de cellules de CMN congelées.
Une manière particulièrement pratique de mettre en oeuvre le procédé serait de
pouvoir partir de cellules congelées. En effet une cytaphérèse peut fournir de
2 à
4 milliards de cellules qu'il serait intéressant de pouvoir aliquoter et
congeler
pour pouvoir effectuer plusieurs cultures à partir de la même cytaphérèse.
La congélation des cellules peut cependant altérer fortement leur viabilité et
leur
capacité de pousse après décongélation.
Les trois CMN obtenues pour les expériences de l' exemple II ont été congelées
en 10% DMSO, HSA 4%. Une nouvelle expansion a été effectuée à partir de ce
matériel congelé (méme protocole que pour l'exemple II.
Les résultats de l'expansion sont compilés dans le Tableau 10.
On constate que les cellules congelées peuvent également générer des nombres
importants de cellules de très bonne pureté.
La fonctionnalité des cellules fraiches par rapport aux cellules congelées a
par
ailleurs été évaluée en parallèle sur cellules obtenues à partir de cellules
fraiches
et à partir de cellules congelées. Deux tests ont été effectués : le test de
cytotoxicité et le test de relargage de TNF.
Les résultats du test de cytotoxicité réalisé en parallèle sur les cellules
fraiches et
les cellules congelées à jour 21 sont compilés dans le Tableau 11.
Les résultats du test de relargage de TNF réalisé en parallèle sur les
cellules
fraîches et sur cellules congelées à jour 21 sont compilés dans le Tableau 12.
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On constate que les cellules provenant de cellules congelées ne sont pas
significativement différentes d'un point de vue fonctionnel par rapport aux
cellules provenant de cellules fraîches. Différents milieux de congélation
pourraient améliorer le rendement en cellules.
5
EXEMPLE IV : Formulation des cellules pour une préparation injectable.
En vue de l'injection chez l'homme, le SVF doit être éliminé et les cellules
reprises dans un tampon pharmaceutiquement acceptable. Le milieu HSA à 4% a
10 été testé.
Une nouvelle expansion a été effectuée à partir d'une nouvelle cytaphérèse
congelée. 6 conditions de congélation ont été testées
Deux milieux de congélation : 10% DMSO dans une solution de HSA à 4%,
7.5% DMSO dans du SVF.
15 Ces deux milieux ont été testés avec trois concentrations cellulaires 25,
50, 150
millions de cellules par ml.
Le protocole d'expansion est le même que dans l'exemple II, sauf que les
cellules sont maintenues à 0.5 million de cellules par ml à partir de Jour 7.
Les résultats de l'expansion sont compilés dans le Tableau 13.
20 On constate peu de différence entre ces différentes conditions de
congélation,
avec une légère amélioration pour le milieu de congélation SVF à 7.5% DMSO.
La préparation cellulaire issue de la condition 150 million de cellules par ml
en
SVF, 7.5% DMSO a été formulée en HSA 4%.
25 Le volume des compositions peut être réduit à l'aide du « CytoMate~», puis
les
cellules sont conditionnées en Albumine Humaine 4 %. Pour cela, le culot est
remis en suspension dans 100 à 200 ml d'albumine humaine 4 % , de manière à
obtenir une suspension cellulaire dont la concentration est comprise entre 10
et
100 millions cellules/ml. Une numération et une mesure de la viabilité des
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cellules sont réalisées, puis les cellules sont conservées dans une poche à
5°C +
3, afin de tester la stabilité de la préparation.
Le produit cellulaire formulé a été testé pour sa viabilité (comptage sur
cellule de
malassez au bleu trypan) aux temps 2 h, 4h, 8h, 22h après formulation. Le
produit cellulaire est à plus de 80% de cellules viables jusqu'à au moins 22h
après formulation.
Le produit cellulaire formulé a été testé en fonctionnalité par le test de
relargage
TNF à différents temps pour évaluer la stabilité de la préparation cellulaire
formulée.
Les résultats sont compilés dans le Tableau 14.
On constate que les cellules formulées sont toujours capables de produire du
TNF sous stimulation BrHPP, même 22h après formulation. D'autre part, on ne
constate pas de différence significative de la production de TNF jusqu'à 8 h
après
formulation.
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Tableau 1
Socit CertificationcGMP Milieu Rfrences
FDA
ISO 9001 BPF E-DMF Prolifix PROLIS3
S3
ISO 9002 20123431
Bio Media EN 46002 Prolifix PROLIS6
S6
20123456
Ampicells AMPICLX3
X3 20123698
Bio Whittaker + + X-VIVO US04-380
10
(GIBCO) X-VIVO15 US04-418
(Life ISO 9001 + AIM V 087.0112D
Technologies) Qualit K
Invitro en harma
Sigma - - Medium G-0916
I
Medium G-0791
II
Stem Cell + Stem Span 09700
H 2000
Tableau 2
FournisseurRf. Surface volume volume
cm2 min. max.
Poches de cultureNexell-BaxterR4R2111180 50 ml 150
ml
Lifecell PL732
300
ml
Nutripoches STEDIM FRO501 200 / /
S
EVAM TD
500 ml
Poches de 250 CellGenix 2P-0255262 / /
ml
(Vue Life 255
Culture B a s
Flacons de culturePOLY 056968 185 / /
NUNC 600 ml,
col
drOlt
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Tableau 3
Fournisseur Rfrence Dilution
finale
hu-CD3-FITC / hu-CD56-PEImmunotech IM2075 1/5
hu-V82-FITC Irnmunotech IM1464 1/5
hu-CD3-PE Immunotech IM1282 1/5
hu-CD69-PCS Immunotech IM2656 1/10
Mouse I Gl,k-FITC BD 33814X 1/10
Mouse I Gl,k-R-PE BD 33815X 1/10
Mouse I Gl,k-C Pharmin en 71148L 1/10
Tableau 4
Contenant Surface Densit d'ensemencementNombre effectif
de
thorique (proportionnelleCMN
aux la ues 24 uits ensemences
Puits (plaque 1.9 cm2 1. 10 /
24
uits
Poches de culture180 cm2 90. 10
Lifecell 300
ml
XELL
Nutripoches 200 cm2 100. 10 100. 106
EVAM 500 ml
STEDIM
Poches de 250 262 cm2 140. 10
ml
Vue Life (Cell
Genix
Flacons de culture185 cma 100. 10
NUNC 600 ml ~ ~
Image
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40
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Tableau 7
l Vd2 en TOTAL Vd2
CULTURE LYMPHOS SPECIFIQUE
(millions) (millions)
J10 D100 D119D127 D100 D119 D127 D100 D119D127
FLASK 64,89 79,0527,91160,5 263,52266,22104 208 74
STEDIM 72,81 79,8161,49174 307,47340,2 127 245 209
CELLGENIX79,97 85,2558,89257,87451,52363 206 385 214
NEXELL 80,14 84,5273,06262,26398,75382,11210 337 279
J14 D100 D119D127 D100 D119 D127 D100 D119D127
FLASK 84,94 90,8490,27274,99431,68313,5 234 421 308
STEDIM 83,78 51,6281,3 281,88385,9 340,3 236 199 277
CELLGENIX87,86 84,631,57 405 513,04408 356 434 6
NEXELL 35,64 57,6231,85420 502,35439,9 150 289 140
J20 D100 D119D127 D100 D119 D127 D100 D119D127
FLASK 71 5,8 0,57 430 533,4 456 305 31 3
STEDIM 81,38 31,113,85 351 511,7 420 286 159 16
CELLGENIX75,13 78,437,01 580,8 699,2 591,6 436 548 41
NEXELL 84,14 78,8320,62607,20741,00396,50511 584 82
Tableau 8
Vd2 TOTAL Vd2 SPECIFIQUE
en LYMPHOS
CULTURE
( millions) (millions)
J 0 D D D 711 D D D D 623 D 762
623 762 623 762 711 D 711
initial 2,173,61 1,01 100 100 100 2,17 3,61
1,01
J 10 D D D 711 D D D D 623 D 762
623 762 623 762 711 D 711
(tri pl
i rates)
I 91,2892,0589,45 541 586 615 494 539 550
ll 91,4891,7689,43 552 562 604 505 516 540
III 91,8591,7990,11 579 576 625 532 557 609
J15 D D D 711 D D D D 623 D 762
623 762 623 762 711 D 711
Milliard Milliard
0,2 million/ml97,7595,5595,1 2,8691,5252,1272,80 1,46
2,02
0,5 millionl97,5497,0996,21 3,0472,3412,7592,97 2,27
ml 2,65
1,5 millionl96,8795,9695,57 1,5521,3761,5761,50 1,32
ml 1,51
J21 D D D 711 D D D D 623 D 762
623 762 623 762 711 D 711
0,2 millionl97,894 94,2 7,6995,7615,5537,53 5,42
ml 5,23
0,5 millionl98,2394,6995,88 13,4311,1611,7613,19 10,56
ml 11,28
1,5 millionl97,7996,5296,67 4,9263,8794,92 4,82 3,74
ml 4,76
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Tableau 9
_ ~~ Rsulfiats
de
cytotoxicit
en
a/o
de
lyse
spcifique
suri
lignes
D nneur _~ D D D 711 D 762D D623 D623
711 71 D 76 762 D623
~ at0,2at0,5 at0,2at0,5atl,5
concentration atl,5
de maintien at0,2
at0,5
atl,5
Cible
___.__._.._._.._____........_..__............________.._..___._.___..___....._.
__.._....._........_.___.____..____...__.___..____.._._......._._____._..._____
____._...._..____.__......_.
786-0 ~_....__.....____.._..___..
RATIO 0,3/1 15.9315.84.12 17.3 10.094.285.6184.692
_-.._.._.._._._. . 16.2
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_
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__
RATIO 3/1
RATIO 30/1 65.3854 34 4 - 68 ---654-6.761.0441.7
83 1 25 ~
RAJI D D D 711 D 762'D D623D623D623
~ 711 71 D 76 762
_ at0,2at0,5 at0,2at0,5atl,5
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at0,2
at0,5
atl,5
RATIO 0,3/1 6.82613.310.6 3.92 8.8145.733.86313.71
7.81
RATIO 3/1 55.648.285.73 19.1 11.696.326.94310.59
14.4'
RATIO 30/1 15.3214.111.3 13.2 16.8314.216.8816.88
15.6'
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DAUDI D D D 711 D 762 D623D623D623
711 71 D 76 D 762
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RATIO 0,3/1 43.8749.954.8 59.5 29.146.5253.09
47.3 49.97
RATIO 3/1 59.5154.755.5 67.1 58.9756.161.2758.63
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.. 60.39
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RATIO 30/1
Tableau 14
CA 02475437 2004-08-06
WO 03/070921 PCT/FR03/00585
43
Tableau 10
Vd2 en TOTAL LYMPHOS SPECIFIC
CULTURE Vd2
(milliards) (milliards)
D 623 D D D 623 D 762 D D D 762 D
762 711 711 623 711
J 0 2,173,61 1,01 0,100 0,100 0,1000,00220,0036
0,0010
J 11 92,4 92,130,623 0,609 0,5790,5900,563 0,533
94,82
J17 97,2788,0294,181,196 0,657 1,1251,16330,5783
1,0595
Tableau 11
Cytotoxicité de cellules obtenues à partir de CMN congelées ou fraîches
sur la lignée mRCC
786-0 D 711 D D D D623 D623 contol control
711 762 762 + -
fraiche congel congelfraichecongelG12 A4,5
fraiche
RATIO 5,06495 4,68275,25611,6717,21529,855160,76452141,1945647
0,311
RATIO 21,765 26,25725,2524,01129,18333,20896,1639543,0103031
311
RATIO 49,9806 59,51373,5986,03352,81257,554138,5127677,7407795
3011
Tableau 12
Production de TNF alpha en pg/ml sur 25 000 cellules
D711 D762 D623
fraiche congel fraiche congel fraiche congel
stimul. BrHPP 903,3 1336,16782,08 973,7 1332,7 1442,36
Sans BrHPP <20 <20 <20 <20 <20 <20
CA 02475437 2004-08-06
WO 03/070921 PCT/FR03/00585
44
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