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UTILISATION DE DERIVES DE QUINOhEINE A EFFET ANTI-
INTEGRASE ET SES APPLICATIONS
L'invention a pour objet l'utilisation de dérivés de
quinoléine à effet anti-intégrale et ses applications.
On a déjà rapporté l'effet inhibiteur de dérivés de
quinoléine au niveau de l'intégration de l'ADN viral dans une
cellule hôte.
En particulier, de tels dérivés sont décrits dans la
demande FR 97 04 289 du 8 avril 1997 et la demande FR Ol 13209
du 12 octobre 2001.
L'étude de ces dérivés a montré qu'ils agissaient comme
compétiteurs de l'ADN viral pour la fixation sur l'intégrale.
Les travaux des inventeurs ont à présent permis de mettre
en évidence des effets de ces derniers sur les étapes
précédant l'intégration de l'ADN viral, en particulier sur la
transcription inverse et la translocation nucléaire.
L'invention a donc pour but de fournir une nouvelle
utilisation de ces dérivés de quinoléine pour fabriquer des
médicaments à effet inhibiteur de l'activité de l'intégrase,
couvrant différentes étapes après l'entrée du virus dans la
cellule, et notamment la transcription inverse, la
translocation nucléaïre de l'ADN viral et de l'intégrase, et
le cas échéant l'intégration de l'ADN viral dans le génome de
la cellule hôte.
L'invention vise l'utilisation de dérivés de l'acide 8
hydroxyquinoléine 7-carboxylique, ou de ses sels
pharmaceutiquement acceptables, pour fabriquer des médicaments
inhibiteurs d'intégrale, capables de bloquer la réplication
virale aux étapes précédant l'intégration, et le cas échéant
au niveau de cette étape d'intégration, ces médicaments étant
utilisables pour le traitement de pathologies rétrovirales, en
particulier pour le traitement du Sida.
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Zes dérivés utilisés selon l'invention sont plus
particulièrement des compétiteurs de l'ADN viral poux la
fixation sur l'intégrase.
Selon un mode de réalisation de l'invention, il s'agit de
S styryl quinoléines, avantageusement celles définies dans la
demande FR 97 04 289. On rappelle que, selon la définition 1a
plus générale donnée dans cette demande, ces dérivés répondent
à la formule I
Rb
\ \
-X Z (R~)
O2 L
OH
dans laquelle
- Rb et R~, identiques ou différents les uns des
autres, représentent un ou plusieurs substituants, eux-mémes
identiques ou différents, occupant une position quelconque sur
les cycles, ce ou ces substituants étant choisis parmi, un
groupe -(CHZ)n -Y ou -CH=CH-Y, où Y représente un atome
d'halogène, un radical -OH, -OR, -COH, -COR, -COOH, -COOR,
-COH, -COR, -CONH2, -CON (RX, Ry) -CH=NOH, -CO-CH=NOH, -NH~, -
N (RX, Ry) , -N02, -PO (OR) 2 -SH2, -SR, -S02R, -SOZNHR, CN, ou
Z(R~), où R représente un radical alkyle de 1 à 8 atomes de
carbone, ou un radical aryle ou hétérocyclique, R~ et RY,
identiques ou différents représentent un radical alkyle de 1 à
5 atomes de carbone, Z représente un radical aryle ou
hétérocyclique et n est nul ou un entier de 1 à 5,
Rb pouvant représenter en outre un atome d'hydrogène,
et lorsque Y représente un groupe -COOH ou -COOR dans
R~, Z, s'il représente un groupe aryle, comporte au moins 3
substituants ou le noyau quinoléine est tri-substitué,
- X représente une double liaison éthylénique, un
groupe -(CH2)n -, où n est un entier de 1 à 5, ou un groupe -CH
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(Rd) -CH (Re) -, Rd et Re, identiques ou différents, représentant un
atome d'hydrogène, d'halogène, un groupe hydroxy ou époxy,
ainsi que les sels pharmaceutiquement acceptables de
ces dérivés, leurs formes diastéréoisomères et leurs formes
énantiomères.
L'invention vise tout spécialement l'utilisation de
l'acide 8-hydroxy-2-j2-j(3,4-dihydroxy, 5-méthoxyphényl)
éthényl]] 7-quinoléine carboxylique, désigné ci-après FZ41, de
formule II
Ra
W W
HOa ~ N H-X Z (Rb)
OH O
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les
dérivés utilïsés pour fabriquer lesdits médicaments sont des
dérivés de l'acide 2-carbamoyl-8-hydroxyquinoléïne 7-
carboxylique. En particulier l'invention vise l'utilisation
des dérivés selon la demande de brevet FR O1 13 209. Ces
dérivés, dans leur définition la plus générale, sont
caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule III
Ra'
H02 ~ N N-X=Z'(Rb')
OH O
dans laquelle
- X' représente une chaîne alkyle-(CH2)n- dans laquelle n
est égal à 0, 1 ou 2, 0, ou N,
- Z' représente un cycle aromatique pouvant comporter des
hétéroatomes choisi parmi 0, N ou S, en substitution des
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atomes de carbone constituant ledit cycle aromatique, ce cycle
pouvant ou non être substitué par Rb',
- Rb' représente 1 à 3 substituants identïques ou
différents, choisis parmi les groupements -OH, -OR,-COOH,
COOR, -COH, -COR, -NH2, -NH (R) , -NH (R, R' ) , -SH et -SR et
CN,
- Ra' représente un atome d'hydrogène ou un groupe -
(CHZ)n,-Y', pour lequel n' est égal à 0, 1, 2 ou 3 et Y'
représente -CH3, -COOH, -COOR, -CN, -OH, -OR, SR, ou un
groupement aryle éventuellement substitué par Rb',
- R et R', identiques ou différents, représentent une
chaîne alkyle linéaire ou ramifiée de 1 à 4 atomes de carbone,
et leurs sels pharmaceutiquement acceptables.
L'étude des propriétés des dérivés utilisés selon
l'invention a permis de mettre en évidence leur effet sur les
étapes préalables à l'intégration de l'ADN viral dans le
génome de la cellule hôte avec le cas ëchéant un effet
inhibiteur au niveau de l'étape d'intégration. Ces effets sont
dirigés contre la transcription inverse de l'ARN de rétrovirus
d'origine animale et humaine, et notamment de VIH-1, VIH-2,
VIS, VSR et contre la translocation nucléaire de ces
rétrovirus. L'efficacité de ces dérivés est observée à des
concentrations submicromolaires. Des ICso n'excédant pas 1 ~M,
avantageusement 0,5 ~M et même.0,1 ~M sont ainsi obtenues.
Ces dérivés utilisés selon l'invention présentent de plus
l'avantage d'un grande innocuité et d'une biodisponibilité
satisfaisante de la drogue active.
Ces propriétés sont donc mises à profit conformément à
l'invention en utilisant lesdits dérivés comme principes
actifs de médicaments en association avec des véhicules
pharmaceutiquement acceptables. Ils peuvent être également
avantageusement utilisés en association pour des
multithérapies.
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Les posologies et les modes d'administration seront
adaptés en fonction du traitement par mono- ou multithérapie
utilisé.
Pour des multithérapies, lesdits dérïvés sont
5 avantageusement présentés dans un même conditionnement de
kits.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont
décrits dans les exemples qui suivent. Dans ces exemples, il
est fait référence aux figures 1 et 2, qui représentent,
respectivement .
- la figure l, 1a quantification de l'ADN viral total
synthétisé 6h00 après infection et la quantité d'ADN viral
intégré dans le génome 8h00 après infection, et
- la figure 2, la quantité d'ARN et celle d'ADN génomique
entré 1h30 après infection, et l'ADN total synthétisé 6h00
après infection.
Étude de la quantïfication de l'ADN viral total synthétisé
et de l'ADN intégré dans le gënome d'une cellule hôte après
infection
On opère comme décrit par Butler et al. dans Nat.Med. 2001
Mai ; 7 (5) . 631-4.
Comme le montre la figure 1, on contaste avec la molécule
L731-988 (publiée par Hazuda et al dans Science,
28 janvier 2000, 287 (5453) . 646-50) que l'ADN est
parfaitement synthétisé, mais peu ou pas intégré dans le
génome de la cellule.
En revanche, en administrant le FZ41, on note une forte
diminution de la synthèse d'ADN viral et de l'intégration.
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Détermination de la quantité d'ARN et d'ADN gënomique
après infection et de l'ADN total synthétisé
On utilise comme témoin un inhibiteur non nucléosidique de
la RT, à savoir la névirapine (NNRTI) et comme produits à
S tester le L731-988 ou le FZ41.
Les traitements effectués avec ces produits n'entraînent
pas de diminution de l'ARN génomique entré dans la cellule
1h30 après infection. En comparant les données obtenues en
début et en fin d'étape de RT, on note le fort effet du
produit utilisé selon l'invention et du tëmoin.
Etude de l'effet sur le cycle de réplication viral
La figure 3 montre les quantifications des espèces nucléiques
virales par PCR quantitative dans des cellules infectées par
HIV et traitées ou non par le FZ41, un inhibiteur non
spécifique de l'entrée des virus (dextran sulfate) ou un
inhibiteur de l'intégration (L731-988).
A . quantification par Q-PCR de l'ARN génomique
intracellulaire.
B . quantification par Q-PCR de l'ADNc rétrotranscrit en début
de rétrotranscription
C . quantification par Q-PCR de l'ADNc rétrotranscrit en fin
de rétrotranscription
D . quantification par Q-PCR de l'ADNc intégré dans le génome
hôte
Les résultats obtenus montrent que les dérivés de
styrylquinoléine présentant une activité ïnhibitrice de
l'intégrase et plus particulièrement contenant le
pharmacophore décrit dans les brevets n° FR 2 761 687 A et FR
01 13 209 inhibent la synthèse d'ADN rétroviral dès le début
de transcription inverse, mais n'affectent pas la quantité
d'ARN génomique viral pénétrant dans les cellules.
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Sélection de mutants résistants
La culture du virus en présence de concentration croissantes
de FZ41 a permis l'émergence de virus résistants à la drogue.
Les mutations apparues dans ces virus sont situées dans
l'intégrase aux positions V165 et V249 d'une part et à la
position C280 pour un second virus. Les mutants ont été
générés par mutagënèse dirigée et leur résistance a été
vérifïée.
La figure 4 montre l'index de résistance obtenu pour chacun
des virus, comparê au virus sauvage.
Effet des styrylquinolines sur la translocation nucléaire de
l'intégrase
Les figures 5 et 6 montrent la quantification de l'intensité
de fluorescence mesurée dans un test d'import nucléaire de
l'ïntégrase de VIH-1 dans des cellules HeLa permeabilisées en
présence ou en absence d'extraits cytoplasmiques.
Les tests d'import de la figure 5 ont été réalisés comme
décrit dans Depienne et a1. 2001. Des cellules HeLa ont été
perméabilisées avec de la Digitonïne, puis incubées 30 mïn à
30°C avec de l'ïntégrase couplée au fluorochrome Cyanine 3 en
présence d'énergie, en l'absence d'extraits cytosolïques et en
présence ou en l'absence de concentrations croissantes de
différentes molécules comme indiqué. Les cellules ont ensuite
été fixées, analysées en microscopie à épifluorescence et des
acquisitions ont été réalisées avec une caméra CCD.
Pour chaque condition, l'intensité de la fluorescence par
unité de surface a été quantïfiêe dans 150 à 300 noyaux issus
de 3 expëriences indépendantes.
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La figure 7 montre la quantification de l'intensité de
fluorescence mesurée dans un test d'import nucléaire de la
BSA-NLS dans des cellules HeLa perméabilisées
Les formules de molécules utilisêes sont données dans le
tableau ci-après.
Molécule Formule Inhibiteur d'intégrase
in vitro
/ \
FZ 41 Nao \ ~ N / I \ o" OUI
O OH / O"
"30.0
/ \
KHD161 Nao \ ~ N / \ OH OUI
O" ~ / OH
OH
/ \ _
BioA53 Nao \ ~ N N ~ ~ o" ~ÜI
o OH O
F Z 117 Nao \ ~ N / \ 0 Me NON
o I / o"
0
L731-988 / ~ - °" OUI
~~ O H
F
Les résultats obtenus montrent que les dërivés de
styrylquinoléine présentant une activité inhibitrice de
l'intégrase et plus particulièrement contenant le
pharmacophore décrit dans les brevets n° FR 2 761 687 A et FR
O1 13 209 inhibent la translocation nucléaire de l'intégrase
de VIH.
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Ainsi, les molécules FZ41 et KHD161 diminuent fortement la
quantitë de fluorescence obtenue dans les noyaux de cellules
perméabilisées après traitement.
A contrario, l' adjonction dans l' expérience d' autres
inhibiteur de l'intégrase (L731-988) ou de dérivés de
styrylquinoline inactifs (FZ117) ne modifie pas l'import
nucléaire de 1'intégrase.
L'inhibition de cette translocation de l'intégrase est
spécifique puisque l'import nucléaire de la BSA-NLS (Albumine
de sérum bovin couplée à un signal d'import nucléaire) n'est
pas touché par les drogues (figure 6).
Par ailleurs, les mutations obtenues par sélection avec la
molécule FZ41 et plus particulièrement les mutations
V165I/V249I entraînent un défaut de l'import nucléaire de
l'intégrase dans des expériences d'expression de la protéïne
dans des cellules eucaryotes.
Les données des figures 6 et 7 ont été obtenues comme suit .
Des cellules HeLa ont été perméabilisées avec de la
digitonine, puis incubées 30 min à 30°C avec de l'intégrase
couplée au fluorochrome Cyanine 3 et avec de la sérum albumine
bovine (BSA) couplée au signal de localisation nucléaire
classique de l'antigène T du virus SV40 (NLS) et à la
fluorescéine (BSA-NLS), en présence d'extraits cytosoliques et
d'énergie et en présence ou en l'absence de concentrations
croissantes de différentes molëcules comme indiqué. Les
cellules ont ensuite été fixées, analysées en microscopie à
épifluorescence et des acquisitions ont été réalisées avec une
caméra CCD. Pour chaque condition, l'intensité de la
fluorescence par unité de surface a étë quantifiée dans 150 à
300 noyaux issus de 3 expériences indépendantes. La figure 6
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représente les résultats obtenus avec l'intégrase et la figure
7 ceux obtenus avec la BSA-NLS.
Référence bibliographique
Depienne C, Mousnier A, Leh H, Le Rouzic E, Dormont D,
5 Benichou S, Dargemont C.
Characterization of the nuclear import pathway for HIV-1
integrase. J Biol Chem. 200'1 May 25;276(21):18102-7.
