Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 1 PCT/FR2003/002299
Particules revêtues en surface de hyaluronane ou d'un de ses dérivés et leur
utilisation à
titre de vecteurs biologiques pour des matières actives
La présente invention concerne principalement des particules revêtues au
moins partiellement en surface de hyaluronane ou dérivé et l'utilisation de
ces particules à
titre de vecteurs biologiques pour des matières actives.
La vectorisation est une opération visant à moduler et si possible à
totalement
maîtriser la distribution d'une substance, en l'associant à un système
approprié appelé
vecteur.
Dans le domaine de la vectorisation, trois fonctions principales sont à
assurer :
- transporter la ou les matières actives dans les liquides biologiques de
l'organisme,
- acheminer les matières actives vers les organes à traiter, et
- assurer la libération de ces matières actives.
A ces trois fonctions, s'ajoute une exigence de biodisponibilité du vecteur.
Il
doit être biodégradable et ses sous-unités doivent être tolérées par
l'organisme.
En fait, le devenir in vivo du vecteur est conditionné par sa taille, ses
caractéristiques physico-chimiques et, en particulier, ses propriétés de
surface qui, d'une
part jouent un rôle déterminant avec les composants du milieu biologique et,
d'autre part
peuvent induire un comportement ciblé vers un site spécifique à traiter.
Les vecteurs biologiques, plus particulièrement concernés dans le cadre de la
présente invention, appartiennent au domaine des particules, notamment nano-
et micro-
particules.
Des nano-particules et micro-particules de poly(acide lactique) (PLA) et/ou de
polyester biodégradable dont les produits de dégradation sont des métabolites
naturels d'un
organisme humain, sont proposées depuis longtemps pour vectoriser des
molécules
bioactives pour différents types d'administration. Cependant, le caractère
hydrophobe de la
surface de ces particules ainsi que la présence de groupes carboxylates
(extrémités des
chaînes de PLA) entraînent une adsorption de protéines plasmatiques, les
opsonines,
responsables en particulier de la capture des particules par les cellules du
Système des
Phagocytes Mononucléés (SPM). Il en résulte une disparition rapide des
particules du
volume circulant en même temps qu'une accumulation dans les organes du SPM
(foie,
rate, reins).
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 2 PCT/FR2003/002299
La présente invention a notamment pour objectif de proposer de nouvelles
particules possédant une durée de vie prolongée et particulièrement
avantageuses pour
véhiculer des matières actives biologiques ou synthétiques, intéressantes dans
le domaine
de la rhumatologie.
Dans ce domaine clinique, le praticien est souvent confronté à des pathologies
inflammatoires et/ou dégénératives qui engendrent, à plus ou moins long terme,
des
dégradations parfois irréversibles du cartilage. Outre des traitements non
spécifiques à base
d'antalgiques et d'anti-inflammatoires non stéroïdiens, on peut avoir recours,
entre autres,
à des injections locales de corticoïdes. Les doses élevées de corticoïdes
utilisées dans ce
cas de figure peuvent, toutefois, induire des effets indésirables non
négligeables. Par
ailleurs, il est généralement nécessaire de multiplier ces injections en
raison d'une action
bénéfique trop réduite.
L'administration de ce type de matières actives par l'intermédiaire de
particules serait donc une alternative particulièrement avantageuse aux
thérapies
conventionnelles.
En l'occurrence, la présente invention vise notamment à proposer un vecteur de
type particules qui, d'une part est biodégradable et approprié au relargage
contrôlé d'une
matière active et, d'autre part est capable de cibler efficacement la
libération de cette
matière active au niveau des cellules tissulaires et plus particulièrement des
cellules
possédant des récepteurs spécifiques aux hyaluronanes, encore dénommés CD44.
Ces récepteurs sont notamment présents au niveau des cellules de la sphère
articulaire comme par exemple les chondrocytes et les synoviocytes. Les
chondrocytes sont
des cellules impliquées dans la synthèse de la matrice cartilagineuse. Elles
gèrent
également le maintien de l'homéostasie du cartilage. Les synoviocytes qui sont
des cellules
localisées dans la membrane synoviale, sont pour leur part impliquées dans la
synthèse du
hyaluronane dans le liquide synoviale.
De manière inattendue, les inventeurs ont mis en évidence qu'il était possible
de cibler efficacement le relargage d'une matière active encapsulée dans des
particules vers
des cellules possédant notamment ce type de récepteur, en les fonctionnalisant
en surface
avec du hyaluronane.
Un premier aspect de l'invention concerne donc des particules dont le coeur
est
à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, caractérisées en ce
qu'elles
CA 02493470 2011-04-15
3
sont revêtues, au moins partiellement en surface, d'au moins un hyaluronane ou
de l'un de
ses dérivés.
Plus particulièrement, l'invention concerne des particules hydrosolubles,
chaque particule comprenant :
un coeur à base d'au moins un polymère organosoluble biodégradable, le
coeur étant revêtu, au moins partiellement en surface d'au moins un
hyaluronane, le
hyaluronane étant un hyaluronane amphiphile, hydrosoluble et dont les
fonctions
carboxyliques sont en partie transformées pour figurer des groupes
hydrophobes,
ces groupes hydrophobes étant ancrés dans le coeur en polymère des particules,
et
au moins une matière active encapsulée dans le coeur de polymère.
L'invention concerne également un vecteur pour la vectorisation d'au
moins une matière active. Le vecteur comprend au moins des particules
hydrosolubles, chaque particule hydrosoluble comprenant un coeur à base d'au
moins un polymère organosoluble biodégradable, le coeur étant revêtu, au moins
partiellement en surface d'au moins un hyaluronane, le hyaluronane étant un
hyaluronane amphiphile, hydrosoluble et dont les fonctions carboxyliques sont
en
partie transformées pour figurer des groupes hydrophobes, ces groupes
hydrophobes étant ancrés dans le coeur en polymère des particules.
L'invention concerne aussi l'utilisation de ce vecteur pour encapsuler et
vectoriser au moins une matière active.
L'invention a de plus pour objet l'utilisation des particules ou du vecteur
pour le traitement de l'arthrose.
L'invention concerne aussi l'utilisation du hyaluronane tel que défini ci-
dessus à titre d'agent de ciblage en surface de particules et de capsules.
L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique ou de
diagnostic comprenant au moins des particules telles que définies ci-dessus,
associé(es) à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable et
compatible.
CA 02493470 2011-04-15
3a
L'invention concerne de plus une composition pharmaceutique ou de
diagnostic comprenant au moins un vecteur tel que défini dans l'invention, et
au
moins une matière active.
De préférence, la composition comprend en outre au moins un véhicule
pharmaceutiquement acceptable et compatible.
L'acide hyaluronique est un polysaccharide naturel constitué par une
succession de motifs disaccharidique.s N-acétylglucosamine/acide glucuronique
et dont les
solutions aqueuses ont une viscosité élevée. Il est présent notamment dans le
cordon
ombilical, dans l'humeur vitrée et dans le liquide synovial. Il est également
produit par
certaines bactéries, notamment par des streptocoques hémolytiques des groupes
A et C. La
masse molaire de l'acide hyaluronique peut varier de 10 000 à 10 000 000 g
environ, selon
l'origine. L'acide hyaluronique est commercialisé notamment sous la forme de
son sel de
sodium (encore dénommé hyaluronate). On utilise le terme générique
hyaluronane pour
désigner indistinctement l'acide hyaluronique et les hyaluronates, notamment
sous la
forme de sels inorganiques ou organiques et en particulier les sels alcalins
et/ou alcalino-
terreux.
Plus particulièrement, ce hyaluronane est mis en oeuvre sous la forme d'un
hyaluronane amphiphile, hydrosoluble dont les fonctions carboxyliques sont en
partie
transformées de manière à figurer des groupements hydrophobes. La fixation de
ces
groupements hydrophobes peut notamment être établie par réaction de ceux-ci
avec les
fonctions carboxyliques du hyaluronate selon une réaction d'estérification ou
d'amidification. Cette transformation est effectuée à un taux suffisant pour
conférer un
comportement amphiphile audit hyaluronane.
La transformation des fonctions carboxyliques du hyaluronate peut ainsi être
obtenue par une estérification et/ou amidification partielle de ces fonctions.
De tels dérivés
sont notamment décrits dans FR 2 794 763.
Les groupes hydrophobes peuvent notamment dériver de l'estérification des
fonctions carboxyliques par au moins un groupe choisi parmi :
CA 02493470 2011-04-15
3b
des chaînes alkyles, linéaires ou ramifiées, saturées ou insaturées, pouvant
être interrompues par un ou plusieurs hétéroatomes comme les atomes de S, O et
N, et le
cas échéant, substituées par au moins un noyau aromatique, et
- des oligomères comme ceux dérivant des a-hydroxyacides.
Les chaînes alkyles peuvent posséder un nombre d'atomes de carbone
supérieur à 5 et notamment supérieur à 10. Toutefois, dans le cas particulier
où une telle
chaîne est substituée par un noyau aromatique, son nombre d'atomes de carbone
peut être
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 4 PCT/FR2003/002299
réduit.
Le taux de transformation est généralement ajusté de manière à préserver une
hydrosolubilité suffisante au dérivé hyaluronane amphiphile ainsi obtenu.
Il est également contrôlé en tenant compte de l'hydrophobie des groupes fixés
sur le hyaluronane.
D'une manière générale, concernant les chaînes alkyles, plus la chaîne est
longue, plus le taux de fixation au niveau du squelette hyaluronane pourra
être faible.
Inversement, avec des chaînes alkyles courtes, le taux de fixation pourra être
plus élevé. Il
est clair que cet ajustement entre le taux de fixation et la longueur des
chaînes alkyles
relève des compétences de l'homme de l'art.
A titre indicatif, pour une chaîne alkyle contenant de 15 à 20 atomes de
carbone et en particulier 18 atomes de carbone, le taux d'estérification peut
être d'au plus
%, voire inférieur à 10 % et, notamment inférieur à 7 % et en particulier
compris entre
0,05 et 5 %. Pour une chaîne alkyle contenant de 10 à 14 atomes de carbone et
notamment
15 de 12 atomes de carbone, ce taux d'estérification peut être supérieur ou
égal à 25 % et pour
une chaîne alkyle de 6 atomes de carbone, il peut être de l'ordre de 50 %.
Ce taux de transformation est généralement ajusté de manière à permettre la
fixation du dérivé hyaluronane en surface des particules grâce à l'interaction
de ses
groupements hydrophobes avec la matrice polymérique hydrophobe constituant les
particules. En d'autres termes, les chaînes alkyles sont ancrées dans la
matrice hydrophobe
pendant la formation des particules. Dans le cas de la présente invention, la
fonctionnalisation en surface des particules par hyaluronane ne fait pas
intervenir de lien
covalent ni ionique entre ces deux entités. La fixation du dérivé hyaluronane
relève
essentiellement d'interactions de type hydrophobe et Van der Waals.
Le taux de transformation est également ajusté de manière à ne pas affecter
l'affinité naturelle du hyaluronane pour les récepteurs CD44.
La présence de hyaluronane en surface de particules est particulièrement
avantageuse pour les diriger sélectivement vers les récepteurs CD44 présents
notamment
sur les cellules de la sphère articulaire. Grâce à cette enveloppe
hyaluronane, les particules,
selon l'invention, utilisées à titre de vecteur biologique pour une matière
active biologique
ou synthétique permettent avantageusement de cibler efficacement la libération
de cette
matière active au niveau des cellules à récepteurs CD44, par exemple des
chondrocytes
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 5 PCT/FR2003/002299
et/ou des synoviocytes. Il en résulte une action contrôlée et prolongée de
cette matière
active au niveau de la lésion visée. Ce dernier aspect est particulièrement
intéressant pour
le bien-être du patient, dans la mesure où il donne accès à une meilleure
disponibilité du
médicament et donc, permet de réduire les quantités administrées et leur
fréquence
d'administration.
La biodégradabilité des particules revendiquées est, par ailleurs, également
assurée grâce à la nature des polymères qui les constituent.
Au sens de l'invention, on entend désigner sous l'appellation biodégradable
tout polymère qui se dissout ou se dégrade en une période acceptable pour
l'application à
laquelle il est destiné, habituellement en thérapie in vivo. Généralement,
cette période doit
être inférieure à 5 ans et plus préférentiellement à une année lorsque l'on
expose une
solution physiologique correspondante à un pH de 6 à 8 et à une température
comprise
entre 25 C et 37 C.
Les polymères biodégradables selon l'invention sont ou dérivent de polymères
biodégradables synthétiques ou naturels.
Concernant les polymères biodégradables organosolubles utilisables pour
constituer le coeur des particules, ils peuvent notamment être choisis parmi
les polyesters
comme les poly(acide lactique) (PLA), poly(acide glycolique) (PGA), poly(c-
caprolactone)
(PCL), les polyanhydrides, poly(alkylcyanoacrylates), polyorthoesters,
poly(alkylène
tartrate), polyphosphazènes, polyaminoacides, polyamidoamines, polycarbonates,
polyméthylidènemalonate, polysiloxane, le polyhydroxybutyrate ou le poly(acide
malique),
ainsi que leurs copolymères et dérivés.
Selon une variante particulière de l'invention, les particules revendiquées
possèdent une matrice polymérique incorporant au moins un polymère différent
du
hyaluronane. Plus préférentiellement, cette matrice est constituée d'un ou
plusieurs
polymères autres que le hyaluronane.
Sont notamment préférés comme polymères organosolubles biodégradables
selon l'invention, les polyesters comme les polyacide lactique), poly(acide
glycolique),
poly(s-caprolactone), et leurs copolymères, comme par exemple le poly(acide
lactique-co-
acide glycolique) (PLGA).
Selon une variante particulière de l'invention, les particules sont composées
majoritairement c'est-à-dire à plus de 50 % en poids, en particulier plus de
75 % en poids,
CA 02493470 2011-04-15
6
voire en totalité, de poly(acide lactique).
Les particules selon l'invention, comprennent de préférence au moins une
matière active biologique ou synthétique de type médicament sous une forme
encapsulée
dans le coeur de polymère.
Comme matières actives biologiques, on peut plus particulièrement citer les
peptides, les protéines, les carbohydrates, les acides nucléiques, les
lipides, les
polysaccharides ou leurs mélanges. Il peut également s'agir de molécules
organiques ou
inorganiques synthétiques, qui, administrées in vivo à un animal ou à un
patient, sont
susceptibles d'induire un effet biologique et/ou manifester une activité
thérapeutique. Il
peut ainsi s'agir d'antigènes, d'enzymes, d'hormones, de récepteurs, de
vitamines et/ou de
minéraux.
A titre représentatif et non limitatif des médicaments susceptibles d'être
incorporés dans ces particules, on peut citer les composés anti-
inflammatoires, les
anesthésiants, les agents chimiothérapeutiques, les immunotoxines, les agents
immunosuppresseurs, les stéroïdes, les antibiotiques, les antiviraux, les
antifongiques, les
antiparasitaires, les substances vaccinantes, les immunomodulateurs et les
analgésiques.
Dans la mesure où les particules selon l'invention sont avantageusement
ciblées vers les cellules de structure tissulaires comme par exemple les
chondrocytes et
synoviocytes, on peut privilégier l'utilisation à titre de matières actives
des composés
suivants : les anti-inflammatoires, des composants matriciels comme par
exemple les
glycosaminoglycanes, et des facteurs biologiques impliqués dans le processus
de
régénération et/ou protection du cartilage ou dans l'arthrose, et leur
mélange. Les
particules ont notamment pour avantage de protéger efficacement ce type de
matière
active particulièrement sensibles au phénomène de biodégradation.
Il peut également s'agir de composés biologiques plus particulièrement actifs
vis-à-vis de l'arthrose comme par exemple la glucosâmine des
glycosaminoglycannes,
l'acide hyaluronique, le sulfate de chondroïtine et leurs mélanges.
CA 02493470 2011-04-15
6a
Les particules conformes à l'invention peuvent comprendre jusqu'à 95 % en
poids d'une matière active.
La matière active peut ainsi être présente en une quantité variant de 0,001 à
950 mg/g de particule et préférentiellement de 0,1 à 500 mg/g. Il est à noter
que dans le cas
de l'encapsulation de certains composés macromoléculaires (ADN,
oligonucléotides,
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 7 PCT/FR2003/002299
protéines, peptides, etc) des charges encore plus faibles peuvent être
suffisantes.
Les particules selon l'invention peuvent posséder une taille variant de 50 nm
à
600 m et notamment de 80 nm à 250 m.
Les particules selon l'invention possédant une taille comprise entre 1 et
1000 nm sont dénommées nanoparticules. Les particules dont la taille varie de
1 à
plusieurs milliers de microns font référence à des microparticules.
Les particules sont généralement sous forme sphérique, mais peuvent
également se présenter sous d'autres formes.
Les nanoparticules ou microparticules revendiquées peuvent être préparées
selon des méthodes déjà décrites dans la littérature, et plus particulièrement
peuvent être
obtenues par la technique d'émulsion/évaporation du solvant et notamment celle
décrite
par R. Gurny et al. Development of biodégradable and injectable latices for
controlled
release ofpotent drugs Drug Dev. Ind. Pharm., vol. 7, p. 1-25 1981.
De manière inattendue, les inventeurs ont ainsi mis en évidence que les
hyaluronanes amphiphiles précités pouvaient avantageusement être utilisés à la
place des
tensioactifs conventionnels pour la préparation de particules selon la
technique
émulsion/évaporation de solvant.
En fait, deux variantes de cette technique sont considérées selon la nature
hydrophobe ou hydrophile de la matière active à encapsuler.
Lorsque que l'on cherche à encapsuler une matière active hydrophobe, on
prépare une simple émulsion. Pour ce faire, le polymère biodégradable choisi
est dissous
dans la phase organique, notamment un solvant peu soluble dans l'eau comme par
exemple
du chlorure de méthylène ou de l'acétate d'éthyle, avec la matière active à
encapsuler. Le
hyaluronane amphiphile, est pour sa part dissous dans la phase aqueuse qui
sert de milieu
dispersant à la phase organique. A l'issue du mélange de ces deux phases, le
dérivé
hyaluronane se localise à l'interface eau/phase organique grâce à ses
propriétés
amphiphiles et stabilise ainsi l'émulsion. Lors de l'évaporation du solvant
organique, les
dérivés amphiphiles de hyaluronane demeurent avantageusement fixés à la
surface des
particules ainsi formées, les groupes hydrophobes étant ancrés plus ou moins
profondément dans le coeur de polymère organosolubles formant les particules
et la partie
hydrophile, correspondant principalement au squelette hyaluronane, étant
exposée à la
surface. A la fin de l'évaporation du solvant, on récupère des particules
conformes à
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 8 PCT/FR2003/002299
l'invention qui subissent ensuite un lavage à l'eau, une centrifugation ou une
lyophilisation.
Dans le cas où la matière active à encapsuler est hydrophile à l'image des
protéines et polysaccharides par exemple, on prépare une première émulsion de
type huile
dans eau, composée d'une phase organique contenant le polymère organosoluble
biodégradable et d'une première phase aqueuse contenant la matière active.
Cette émulsion
dite inversée est ensuite mise en présence d'une seconde phase aqueuse
contenant le dérivé
hyaluronane amphiphile de manière à obtenir une double émulsion eau/huile/eau
vis-à-vis
de laquelle le hyaluronane anphiphile joue le rôle de stabilisant. Après
évaporation du
solvant, on récupère des particules conformes à la présente invention qui sont
traitées
comme précédemment.
Les conditions utilisées lors de la préparation des émulsions déterminent
généralement la taille des particules et leur ajustement relève des
compétences de l'homme
de l'art.
L'utilisation d'un dérivé hyaluronane à titre d'agent stabilisant dans ce type
de
procédé de préparation de particules est donc particulièrement avantageuse à
au moins
deux titres :
- elle permet de s'affranchir de la présence des agents tensioactifs
systématiquement utilisés dans les procédés conventionnels. En l'occurrence,
ces derniers
ne sont pas toujours biocompatibles et parfois difficiles à éliminer en fin de
synthèse ;
- elle conduit à l'issue de la synthèse des particules, à un vecteur
manifestant
une affinité sélective pour des cellules de structure tissulaires et plus
particulièrement pour
des cellules de la sphère articulaire et en particulier pour les chondrocytes
et les
synoviocytes.
La concentration de hyaluronane dans le milieu de synthèse des particules,
détermine le taux de recouvrement des particules, c'est-à-dire la quantité de
hyaluronane
déposée à leur surface. Le dérivé hyaluronane est généralement réparti de
manière
homogène en surface des particules avec une densité surfacique pouvant varier
de manière
significative.
On peut également incorporer dans les particules, des composés à finalité de
diagnostic. Il peut ainsi s'agir de substances détectables par rayons X,
fluorescence,
ultrasons, résonance magnétique nucléaire ou radioactivité. Les particules
peuvent ainsi
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 9 PCT/FR2003/002299
inclure des particules magnétiques, des matériaux radio-opaques, comme
notamment le
baryum ou des composés fluorescents. Alternativement, des émetteurs gamma (par
exemple Indium ou Technetium) peuvent y être incorporés.
Comme décrit précédemment, la matière active est de préférence incorporée
dans ces particules lors de leur processus de formation. Toutefois, lorsque
cela s' avère
possible, elle peut également être chargée au niveau des particules une fois
que celles-ci
sont obtenues.
Les particules selon l'invention peuvent être administrées de différentes
façons,
par exemple par voie orale ou parentérale et notamment par voies intra-
articulaire,
oculaire, pulmonaire, nasale, vaginale, cutanée et/ou buccale.
Les hyaluronanes présents en surface des particules selon l'invention, portant
une multitude de fonctions OH réactives, il est en outre possible une fois les
particules
formées, de fixer à ses fonctions toutes sortes de molécules par des liaisons
covalentes. A
titre illustratif et non limitatif de ce type de molécules, on peut notamment
citer les
molécules de type marqueurs et les composés susceptibles de potentialiser la
fonction de
ciblage assurée par le hyaluronane, comme par exemple des peptides RGD
(arginine
glycine - acide aspartique) qui favorisent l'adhésion entre les cellules et
leurs matrices
extracellulaires.
Un second aspect de l'invention concerne un vecteur biologique notamment
pour une ou plusieurs matière(s) active(s) biologique(s) ou synthétique(s)
comprenant au
moins des particules selon l'invention.
L'invention concerne également l'utilisation de ce vecteur, ou des particules
revendiquées pour encapsuler au moins une matière active, biologique ou
synthétique.
Un autre aspect de l'invention se rapporte à des compositions pharmaceutiques
ou de diagnostic comprenant au moins un vecteur et notamment des particules
selon
l'invention, le cas échéant associé(es) à au moins un véhicule
pharmaceutiquement
acceptable et compatible.
Comme évoqué précédemment, les particules revendiquées sont
particulièrement avantageuses sur le plan pharmaceutique ou du diagnostic.
Elles assurent une protection satisfaisante de la matière active encapsulée.
Elles
limitent la diffusion de cette matière active dans l'organisme grâce à l'effet
stérique des
particules en soi et à l'affinité naturelle du hyaluronane pour les récepteurs
CD44. Elles
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 10 PCT/FR2003/002299
autorisent une libération progressive de cette substance active à proximité de
la lésion et/ou
des cellules visées permettant ainsi une action prolongée. Enfin, elles se
dégradent
lentement en produits bien tolérés par l'organisme.
Un autre aspect de la présente invention concerne l'utilisation de particules
telles que définies ci-dessus voir d'un vecteur biologique en incorporant pour
la
préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de
l'arthrose.
Les particules peuvent également être incorporées dans des capsules, ou
incorporées dans des implants, gels ou tablettes. Elles peuvent également être
formulées
directement dans un fluide de type huile par exemple et être injectées
directement au
niveau du site biologique à traiter.
Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de hyaluronane ou dérivé
amphiphile tel que défini précédemment à titre d'agent de ciblage en surface
de particules,
en particulier constituées d'au moins un polymère biodégradable ou de
capsules,
notamment creuses. Ces particules ou capsules peuvent notamment être des nano-
ou
micro-sphères ou des nano- ou micro-particules.
Les exemples et figures présentés ci-après sont soumis à titre illustratif et
non
limitatif du domaine de l'invention.
FIGURES :
Figure L: Représentation de la prolifération cellulaire de chondrocytes de
rats
cultivés en système monocouche après 48 h de traitement en présence de
nanoparticules à
base de PLA (témoin) et de PLA revêtue de hyaluronane amphiphile.
Figure 2 : Représentation de la prolifération cellulaire et activité de
synthèse en
protéoglycanes, de chondrocytes cultivés sur billes d'alginate (culture
tridimensionnelle)
après 48 heures de traitement en présence de nanoparticules à base de PLA
(témoin) et de
PLA revêtue de hyaluronane amphiphile.
MATERIEL ET METHODE
Synthèse des HA modifiés
A titre d'exemple, est décrite ci-dessous la synthèse d'un hyaluronane
substitué
par des chaînes aliphatiques à 18 carbones.
Le hyaluronate de sodium (HA, M, = 600 000 g/mol) provient de la Société
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 11 PCT/FR2003/002299
Bioibérica (Barcelone, Espagne).
1 g de hyaluronate de sodium est dissous dans 100 ml d'eau distillée. La
solution est mise en contact pendant 15 minutes avec 5 g de résine Dowex 50*8
échangeuse de cations conditionnée en H+ à 2,5 meq/g (stoechiométrie 1:6).
Après
filtration, la solution contenant la forme acide du polysaccharide est
neutralisée à pH 7 à
l'hydroxyde de tétrabutylammonium, puis lyophilisée. On obtient ainsi le
hyaluronate de
tétrabutylammonium HA-TBA.
1 g de HA-TBA est dissous dans 100 ml de diméthylsulfoxyde. 36 l de
C18H37Br sont ajoutés. Après 24 h de réaction à 30 C sous agitation, le
mélange est mis en
dialyse : 1 jour contre eau distillée, 6 jours contre eau distillée + acide
NaN3 (1/2500) puis
1 jour contre eau distillée. Enfin, la solution dialysée est lyophilisée.
On obtient ainsi un dérivé du hyaluronate de sodium dont environ 4 % des
fonctions carboxyliques sont estérifiées par des chaînes à 18 carbones.
EXEMPLE 1 :
Synthèse et caractérisation de particules conformes à l'invention.
A titre d'exemple, est donné ci-dessous le protocole de synthèse 'de
particules
recouvertes du hyaluronate amphiphile HA-C18-1,3 % c'est-à-dire d'un polymère
contenant 1,3 chaînes alkyle à 18 carbones pour 100 motifs glucose.
Le poly(D,L-acide lactique) (PLA, M,,, = 106 000g/mol) et le dichorométhane
(CH2Cl2) sont des produits Sigma-Aldrich (France).
10 mg de HA-C18-1,3 % sont dissous pendant 24 h sous agitation dans 10 ml
d'eau distillée. On ajoute 1 ml de CH2Cl2 contenant 25 mg de PLA. Une émulsion
huile
dans eau stable est réalisée par l'utilisation d'un vortex pendant 30 s puis
des ultra-sons à
une puissance de 10 W en mode pulsé (50 % de cycle actif) pendant 60 s. Le
solvant
organique est ensuite évaporé sous agitation, à température et pression
ambiantes pendant
2 h. La suspension aqueuse de particules ainsi obtenue est lavée à l'eau par 3
centrifugations successives de 10 mn à 12 000 tr/mn.
Les particules obtenues dans ces conditions ont un diamètre moyen de 450 Mn
(diamètre moyen en intensité, déterminé par spectroscopie à corrélation de
photons sur un
appareil Malvern 4600).
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 12 PCT/FR2003/002299
EXEMPLE 2:
Evaluation biologique in vitro des particules conformes à l'invention.
Des chondrocytes (cellules du cartilage) de rats obtenus après digestion de
fragments de cartilage par la pronase et par la collagénase, sont mis en
culture dans du
DMEM (Gibco BRL, RU) en présence de particules obtenues selon l'exemple 1.
Deux systèmes de culture sont utilisés :
1) un système en monocouche classique applicable à tous les types
cellulaires et qui permet d'appréhender les paramètres généraux de
biocompatibilité tels
que la viabilité et la prolifération.
Les chondrocytes sont répartis dans des plaques de culture à 24 puits à raison
d'environ 100 000 chondrocytes par puits. Une suspension de nanoparticules
recouvertes
de HA amphiphile et synthétisées selon l'exemple 1, est préparée dans le
milieu de culture
DMEM de façon à avoir en moyenne environ 107 particules par ml. 1 ml de cette
suspension est mis en contact avec les chondrocytes dans les puits de culture
ce qui donne
un ratio moyen d'environ 100 particules par chondrocytes. Le contact est
maintenu
pendant 48 h.
La figure 1 montre qu'après ce contact de 48 h avec des particules recouvertes
de HA amphiphiles substitués à différents taux par des chaînes à 18 ou 12
atomes de
carbone, la viabilité et la prolifération des chondrocytes sont similaires à
celles obtenues
avec le témoin.
En revanche, on peut observer que dans ces conditions expérimentales, la
présence des particules de PLA nues modifie significativement ces paramètres.
2) un système tridimensionnel : dans le cas des chondrocytes, on complète
l'analyse précédente par l'étude d'une culture dans des billes d'alginate de
calcium qui
sont enrichies ou non en particules conformes à l'invention, afin
d'appréhender l'activité
de synthèse des protéoglycanes du chondrocyte dans cet environnement nano ou
microparticulaire.
Les culots cellulaires sont suspendus dans une solution d'alginate de sodium à
2 % dans du NaCI stérile 0,9 % et contenant les particules recouvertes de HA,
de façon à
avoir approximativement 500 000 chondrocytes par ml et en moyenne environ 200
CA 02493470 2005-01-24
WO 2004/014347 13 PCT/FR2003/002299
nanoparticules par chondrocyte. La suspension résultante est alors déposée au
goutte à
goutte dans une solution de CaC12 100 MM à l'aide d'une seringue de 2 ml
équipée d'une
aiguille 0,8x25, ce qui permet de former des billes d'environ 2 mm de diamètre
au contact
du CaC12. Après repos de 20 mn dans la solution de CaC12, les billes sont
lavées 2 fois de
suite par du NaC10,9 %.
La figure 2 montre que le contact avec des nanosphères recouvertes de HA
amphiphiles substitués à différents taux par des chaînes à 18 ou 12 atomes de
carbone, ne
perturbe pas significativement la prolifération et l'activité métabolique des
chondrocytes
dans cet environnement.
