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NOUVELLE PROTEINE ASSOCIEE AUX CENTROSOMES ET SES
APPLICATIONS.
La présente Invention est relative à une nouvelle protéine
associée aux centrosomes, au polynucléotide codant pour ladite protéine ainsi
qu'aux applications de ladite protéine et dudit polynucléotide.
Le processus de division cellulaire consiste en une division
nucléaire (mitose) suivie d'une division cytoplasmique (cytokinèse). La mitose
est dominée par la formation d'un fuseau polaire très organisé (le fuseau
mitotique) constitué de deux familles de microtubules : les microtubules
polaires et les microtubules kinétochoriens. Les microtubules sont des poly-
mères composés de sous-unités d'a- et (3-tubuline. Leur croissance est initiée
dans la région périphérique du centrosome par un complexe contenant majo-
ritairement une protéine apparentée, la y-tubuline. Les microtubules polaires
sont composés de rangées de microtubules et de protéines associées qui
sont mises en place par les deux centres mitotiques, associés à des
centrioles, situés aux pôles opposés du fuseau (asters). Chaque chromosome
répliqué est constitué de deux chromatides sueurs reliées entre elles par le
centromère. Les microtubules kinétochoriens sont liés aux chromosomes
répliqués par des structures spécialisées appelées kinétochores qui se
forment au cours de la prophase sur chacune des deux faces du centromère.
Les chromosomes se condensent pendant la prophase et forment les micro-
tubules kinétochoriens qui commencent à interagir avec les microtubules
polaires du fuseau après rupture de l'enveloppe nucléaire au cours de la
prométaphase. Sous l'effet de la tension due aux forces opposées, dirigées
vers les pôles qui tirent les microtubules kinétochoriens, les chromosomes
s'alignent dans la zone équatoriale du fuseau pendant la métaphase. A l'ana-
phase, sous l'effet de forces continuellement développées au sein du fuseau
mitotique, les chromatides sueurs se détachent et sont attirées vers les pôles
opposés. Dans le même temps, les deux pôles cellulaires s'écartent. Au cours
de la télophase, l'enveloppe nucléaire se reforme à la surface de chaque
groupe de chromosomes.
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La division cellulaire s'achève au moment où le contenu cyto-
plasmique est divisé selon le processus de cytokinèse. Le fuseau mitotique
joue un rôle important dans le processus de cytokinèse, en fixant la mise en
place de la segmentation cellulaire. Le sillon de division apparaît invariable-
s ment dans le plan de la plaque équatoriale, perpendiculairement à l'axe du
fuseau mitotique.
Les processus décrits ci-dessus sont finement régulés par un
équilibre entre des réactions de phosphorylation et de déphosphorylation.
Lorsque la cellule entre en mitose, des changements importants dans la
phosphorylation des protéines interviennent. Le centrosome et le fuseau
mitotique sont particulièrement enrichis en sites phosphorylés. De
nombreuses protéine-kinases, particulièrement des sérine-thréonine-kinases,
ont été décrites comme intervenant dans ces processus de phosphorylation
(voir à cet égard Giet R. et Prigent C., J. Cell Science, 112, 3591-3601,
1999).
Parmi celles-ci on citera celles localisées au niveau des centrosomes, parmi
lesquelles les kinases de type aurora, requises pour la séparation des centro-
somes et l'assemblage du fuseau mitotique, les kinases de type polo, impli-
quées dans la maturation et la formation du fuseau bipolaire et les kinases de
type NIMA qui régulent la séparation des centrosomes.
Les mammifères possèdent au moins trois protéine-kinases
du type aurora. Chez l'homme, ces trois protéine-kinases sont surexprimées
dans des pathologies cancéreuses du fait d'anomalies chromosomiques.
Ainsi, ces protéines semblent jouer un rôle important dans le contrôle de la
ploïdie. Par exemple, une inactivation ou une surexpression de deux de ces
kinases conduit à une polyploïdie. L'inhibition de l'activité de la kinase
aurora
A conduit à la formation de fuseaux monopolaires. L'inhibition de l'activité
de
la kinase aurora B conduit à la formation de cellules multinucléées par défaut
de cytokinèse. Ces anomalies chromosomiques apparaissent liées à des
perturbations dans la formation du fuseau mitotique.
Les partenaires et les substrats de ces protéine-kinases sont
encore peu connus. Par exemple, chez le xénope, aurora A interagit avec une
kinésine impliquée dans la dynamique des microtubules. Chez l'homme, elle
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phosphoryle la protéine HsTACC-3, également surexprimée dans de
nombreuses lignées de cellules cancéreuses. Chez la drosophile, aurora A
phosphoryle la protéine D-TACC et est nécessaire à sa localisation aux
centrosomes afin de réguler les microtubules astraux. D-TACC interagit avec
la protéine associée aux microtubules (MAP : Microtubule Associated Protein)
Msp, qui fait partie de la famille des protéines XMA0215/ch-TOC/Msps, qui
stimulent la croissance des microtubules in vitro et sont concentrées au
niveau des centrosomes in vivo. D-TACC et Msp coopèrent pour stabiliser les
centrosomes. Le terme MAP regroupe une collection de protéines variées
définies sur la base de leur capacité à interagir avec les microtubules. Les
MAP apparaissent comme des partenaireslsubstrats des kinases du centro-
some comme aurora ou polo.
Une division cellulaire correcte nécessite une coordination
entre la ségrégation des chromosomes par le fuseau mitotique et le clivage de
la cellule par l'appareil de cytokinèse. Les microtubules du fuseau mitotique
jouent un rôle essentiel dans les deux processus.
Cependant, malgré l'ensemble des travaux réalisés sur la
division cellulaire, les facteurs intervenant dans une mise en place correcte
du
fuseau mitotique et/ou au contraire perturbant sa mise en place et/ou sa
structure, entraînant ainsi les conséquences ci-dessus décrites ne sont
toujours pas connus.
Une telle connaissance permettrait d'une part de mieux
comprendre les mécanismes de la mitose et d'autre part de pouvoir dévelop-
per des moyens de lutter contre les anomalies de la division cellulaire et les
conséquences qu'elles entraînent.
C'est dans ce domaine que se place la présente Invention.
En effet, de manière surprenante et inattendue, les Inventeurs
ont mis en évidence une nouvelle protéine humaine associée aux centro-
somes. Par immunofluorescence, elle est détectée en colocalisation avec l'a-
tubuline des microtubules du fuseau mitotique, en particulier avec l'aster.
Cette protéine a été nommée ASAP pour Aster Associated Protein (Protéine
Associée à l'Aster) par les Inventeurs.
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La surexpression de la protéine selon l'Invention entraîne des
perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et induit des mitoses
aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multi
polaires). Sa surexpression bloque la division cellulaire et par conséquent la
prolifération cellulaire.
Ainsi, l'Invention a pour objet une protéine isolée, dénommée
ASAP, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée dans le groupe constitué
par
a) une protéine répondant à la séquence représentée dans la
liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 ;
b) une protéine présentant, sur la totalité de sa séquence, au
moins 80% d'identité ou au moins 90% de similarité, de préférence au moins
90 % d'identité ou au moins 95% de similarité, avec la protéine de SEQ ID
NO1.
Une protéine conforme à l'Invention se caractérise par les
propriétés suivantes
- elle présente un poids moléculaire compris entre 60 et
100 kDa, de préférence entre 65 et 80 kDa ;
- elle est associée aux centrosomes ;
- elle est colocalisée par immunofluorescence avec
l'a-tubuline des microtubules du fuseau mitotique ;
- elle présente une faible identité (23%) avec la protéine
MAP1A (Microtubule Associated Protein 1A) ;
- elle présente des domaines coiled-coil essentiellement
regroupés dans sa partie C-terminale entre les acides aminés 297 et 327
d'une part et 477 et 628 d'autre part, indiquant soit que la protéine s'oligo-
mérise, soit qu'elle interagit avec d'autres protéines ;
- elle présente une faible identité (20%), entre les acides
aminés 300 et 600 avec un domaine de type caldesmon (Gusev, N.B.,
Biochemistry, 10 : 1112-1121, 2000), référencé pfam00769 (NCBI, domains,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cddsrv.cgi?uid=pfam00769), et,
entre les acides aminés 480 et 630, avec un domaine de type ERM
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(Ezrin/radixin/moesin ; Louvet-Vallet, S., Biol. Cell, 274 : 305-316, 2000),
réfé-
rencé pfam02029 (NCBI, domains, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/
cdd/cddsrv.cgi?uid=pfam02029). Les protéines caldesmon et ERM sont égale-
ment considérées comme des MAP ;
5 - elle présente également, entre les positions 65 et 303, un
domaine BRCT, (Breast cancer carboxy-terminal domain ; Borlc, P., et coll.,
FASEB J., 11, 68-76 (1997)), indiquant que la protéine est impliquée dans le
contrôle du cycle cellulaire ;
- elle présente une grande richesse en hélices a dans sa
partie C-terminale, en particulier dans la région comprise entre les acides
aminés 420-620, presque exclusivement formée d'hélices a.
Ces éléments permettent de penser que la protéine ASAP est
une nouvelle MAP.
Les protéines selon l'Invention incluent toute protéine (natu-
relie, synthétique, semi-synthétique ou recombinante) de n'importe quel orga-
nisme procaryote ou eucaryote, notamment d'un mammifère, comprenant ou
consistant en une protéine ASAP. Préférentiellement, ladite protéine est une
protéine ASAP fonctionnelle.
On entend par "fonctionnelle", une protéine possédant une
activité biologique normale, c'est à dire capable d'intervenir dans
l'organisation du fuseau mitotique et dans la division cellulaire. Cette
protéine
peut comprendre des mutations silencieuses n'induisant aucun changement
substantiel dans son activité et ne produisant aucune modification phéno-
typique.
Des protéines conformes à l'invention sont notamment repré-
sentées par les protéines ASAP humaine (SEQ ID NO : 1) et mutine (SEQ ID
NO : 46).
Sont incluses dans les protéines selon l'Invention définies en
b), les protéines variantes des séquences SEQ ID NO:. 1 et 4C, en particulier
les protéines dont la séquence en acides aminés présente au moins une
mutation correspondant notamment à une troncation, une délétion, une
substitution et/ou une addition d'au moins un résidu d'acide aminé par rapport
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aux séquences SEQ ID NO: 1 et 46.
De manière préférée, les protéines variantes présentent une
mutation entrainant un dysfonctionnement (activation ou inhibition) de la
protéine, d'autres gènes ou protéines ou encore de la cellule en général.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'Invention,
ladite protéine est une protéine de mammifère, préférentiellement une
protéine d'origine humaine.
Au sens de la présente Invention les définitions suivantes
s'appliquent.
L'identité d'une séquence par rapport à la séquence de SEQ
ID NO :1 comme séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcen-
tage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux
séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de corres-
pondance entre elles.
Le pourcentage d'identité peut être calculé par l'Homme du
métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences
tel que, par exemple celui de la suite BLAST (Altschul et al., NAR, 1997, 25,
3389-3402).
Les programmes BLAST sont mis en oeuvre sur la fenêtre de
comparaison constituée par la totalité de la SEQ ID NO :1, indiquée comme
séquence de référence.
Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au
moins X % d'identité avec une séquence de référence est définie, dans la
présente Invention comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à
100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout
en conservant les propriétés fonctionnelles de ladite protéine de référence.
Au
sens de la présente Invention, le terme altération inclut les délétions, les
substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés
dans la séquence de référence. -
La similarité d'une séquencé par rapport à une séquence de
référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés
qui sont identiques ou qui différent par des substitutions conservatives,
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lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum
de correspondance entre elles. Au sens de la présente Invention, on entend
par substitution conservative, la substitution d'un acide aminé par un autre
qui
présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou
polarité), qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la
protéine.
Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au
moins X % de similarité avec une séquence de référence est définie, dans la
présente Invention comme une protéine dont la séquence peut inclure jusqu'à
100-X altérations non-conservatives pour 100 acides aminés de la séquence
de référence. Au sens de la présente Invention, le terme altérations non-
conservatives inclut les délétions, les substitutions non-conservatives ou les
insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de
référence.
Par "techniques ou méthodes bien connues de l'homme du
métier" on entend ici se référer aux techniques ou méthodes classiquement
utilisées par l'homme du métier et exposées dans de nombreux ouvrages,
comme en particulier celui intitulé Molecular Cloning. A Laboratory Manual
(Sambrook J, Russell DW. (2000) Cold Spring Harbor Laboratory Press).
La protéine selon l'Invention est obtenue soit à partir d'une
cellule, soit par synthèse chimique, soit par recombinaison génétique.
Par synthèse chimique, la protéine peut être obtenue en utili-
saut l'une des nombreuses voies de synthèses peptidiques connues, par
exemple les techniques mettant en oeuvre des phases solides ou des
techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de frag-
ments ou par une synthèse en solution classique. Dans ce cas, la séquence
de la protéine peut être modifiée afin d'améliorer sa solubilité, en
particulier
dans les solvants aqueux. De telles modifications sont connues de l'homme
du métier comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la
substitution d'acides aminés hydrophobes par des acides aminés hydrophiles.
La protéine selon l'Invention est constituée de l'enchaînement
de 13 peptides correspondants aux produits de traduction de 13 des 14 exons
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que comporte le gène correspondant, le premier exon n'étant pas traduit (voir
ci-après).
De manière plus précise, lesdits peptides répondent aux
séquences suivantes (positions données par rapport à la numérotation de la
séquence SEQ ID NO: 1)
- Peptide 1 : il comprend 25 acides aminés correspondants
aux positions 1 à 25 (SEQ ID NO: 2) ;
- Peptide 2 : il comprend 28 acides aminés correspondants
aux positions 26 à 53 (SEQ ID NO: 3) ;
- Peptide 3 : il comprend 107 acides aminés correspondants
aux positions 54 à 160 (SEQ ID NO: 4) ;
- Peptide 4 : il comprend 76 acides aminés correspondants
aux positions 161 à 236 (SEQ ID NO: 5) ;
- Peptide 5 : il comprend 31 acides aminés correspondants
aux positions 237 à 267 (SEQ ID NO: 6) ;
- Peptide 6 : il comprend 83 acides aminés correspondants
aux positions 268 à 350 (SEQ ID NO: 7) ;
- Peptide 7 : il comprend 24 acides aminés correspondants
aux positions 351 à 374 (SEQ ID NO: 8) ;
- Peptide 8 : il comprend 54 acides aminés correspondants
aux positions 375 à 428 (SEQ ID NO: 9) ;
- Peptide 9 : il comprend 32 acides aminés correspondants
aux positions 429 à 460 (SEQ ID NO: 10) ;
- Peptide 10 : il comprend 54 acides aminés correspondants
aux positions 461 à 514 (SEQ ID NO: 11) ;
- Peptide 11 : il comprend 49 acides aminés correspondants
aux positions 515 à 563 (SEQ ID NO: 12) ;
- Peptide 12 : il comprend 43 acides aminés correspondants
-aux positions 564 à 606 (SEQ ID NO: 13) ;
- Peptide 13 : il comprend 41 acides aminés correspondants
aux positions 607à 647 (SEQ ID NO: 14).
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La présente Invention a aussi pour objet un peptide constitué
d'un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs d'une protéine définie
ci-dessus en a) ou b), particulièrement un peptide sélectionné parmi
- les séquences correspondant aux peptides 1 à 13 décrits ci-
dessus, c'est-à-dire sélectionné parmi les séquences SEQ ID NO: 2 à SEQ ID
NO: 14, et
- les séquences SEQ ID NO : 47 à 53 correspondant à des
mutants de la protéine hASAP délétés de la partie N-terminale contenant le
domaine BRCT (Ndel1 : résidus 304 -647 (SEQ ID NO: 48) ; Ndel2 : résidus
411-647 (SEQ ID NO : 49) ; Ndel3 : résidus 478-647 (SEQ ID NO : 50)) ou de
la partie C-terminale contenant le domaine MAP (Cdel1 : résidus 1 à 477
(SEQ ID NO: 51) ; Cdel2 : résidus 1 à 418 (SEQ ID NO: 52) ; Cdel3 : résidus
1 à 303 (SEQ ID NO: 53) ; résidus 1 à 421 (SEQ ID NO: 47)).
Selon un mode de réalisation avantageux de l'Invention, ledit
peptide est utile pour la production d'anticorps reconnaissant spécifiquement
une protéine telle que définie ci-dessus, préférentiellement reconnaissant la
protéine ASAP de séquence SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 46.
L'Invention a ainsi également pour objet des anticorps mono-
clonaux ou polyclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont capables de
reconnaître spécifiquement une protéine selon l'Invention.
De manière préférentielle selon l'Invention, les anticorps
reconnaissent, parmi les MAPs, uniquement et spécifiquement la protéine
ASAP de séquence SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 46.
Les anticorps selon l'Invention sont, par exemple, des anti-
corps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2.
Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anti-
corps marqués afin d'obtenir un signal délectable et/ou quantifiable.
Lesdits anticorps peuvent être obtenus directement à partir de
sérum humain ou à partir de sérum d'animaux immunisés avec les protéines
ou les peptides selon l'Invention. Les anticorps polyclonaux ou monoclonaux
spécifiques peuvent être obtenus selon les techniques bien connues de
l'Homme du Métier.
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L'Invention a également pour objet l'utilisation des anticorps
selon l'Invention pour la détection et/ou la purification d'une protéine selon
l'Invention.
De manière générale, les anticorps selon l'Invention peuvent
5 être avantageusement utilisés pour détecter la présence d'une protéine selon
l'Invention, normale ou mutée.
Particulièrement, les anticorps monoclonaux, peuvent être uti-
lisés pour la détection de ces protéines dans un échantillon biologique. Ils
constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immuno-
10 histochimique de l'expression des protéines selon l'Invention, notamment la
protéine de séquence SEQ ID (VO: 1, sur des coupes de tissus. Généralement
pour de telles analyses, les anticorps utilisés sont marqués afin d'être détec-
tables par exemple par des composés immunofluorescents, par marquage à
l'or ou sous forme d'immunoconjugués enzymatiques.
Ils peuvent permettre notamment de mettre en évidence une
expression anormale de ces protéines dans les tissus ou prélèvements
biologiques et ainsi permettre la détection de cellules présentant des pertur-
bations dans l'organisation du fuseau mitotique et/ou une induction des
mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou
multipolaires) liées à la surexpression de la protéine selon l'Invention.
L'Invention a également pour objet une méthode de détection
dans un échantillon biologique de la protéine selon l'Invention, particulière-
ment de la protéine ASAP, comprenant une première étape de traitement
convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre
accessible le milieu intracellulaire, une seconde étape de mise en contact
dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps selon l'Invention
et
une troisième étape de mise en évidence par tout moyen approprié du
complexe protéine ASAP-anticorps formé.
Cette méthode peut en outre permettre de mesurer le_ taux
d'expression de la protéine selon l'Invention dans des cellules, particulière-
ment dans des cellules cancéreuses. L'étude de l'expression de la protéine
ASAP (sur- ou sous-expression) est un élément d'évaluation de la capacité de
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prolifération ou d'agressivité (capacité à évoluer vers des cancers de mauvais
pronostic) de cellules cancéreuses.
L'Invention a donc également pour objet une méthode d'éva-
luation in vitro de la capacité de prolifération ou d'agressivité des cellules
cancéreuses contenues dans un échantillon biologique, caractérisée en ce
qu'elle comprend une première étape de traitement convenable des cellules
par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intra-
cellulaire, une seconde étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire
ainsi obtenu avec un anticorps selon l'Invention, une troisième étape de mise
en évidence et/ou de mesure par tout moyen approprié du complexe protéine
ASAP-anticorps formé et une quatrième étape d'évaluation du taux de
transcription du gène par comparaison du taux de complexes protéine
ASAP-anticorps formés à celui d'un échantillon biologique témoin préalable-
ment choisi. Ledit témoin peut être constitué par exemple par un échantillon
biologique contenant des cellules présentant un taux de protéines normal ou
altéré, auquel ladite méthode est appliquée dans les mêmes conditions.
L'Invention a également pour objet une trousse permettant de
mettre en aeuvre l'une quelconque des méthodes ci-dessus décrites compre-
nant
a) au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal selon
l'Invention ;
b) les réactifs permettant la détection du complexe protéine
ASAP-anticorps produit lors de la réaction immunologique.
Selon un mode de réalisation particulier de l'Invention, la
trousse peut éventuellement comprendre des réactifs nécessaires pour rendre
accessible le milieu intracellulaire.
Par moyen pour rendre accessible le milieu intracellulaire, on
entend tout moyen connu de l'Homme du Métier comme par exemple la lyse
cellulaire par voie enzymatique, chimique-ou encore la sonication, la perméa- -
tion membranaire, les chocs thermiques.
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La présente Invention a également pour objet un poly-
nucléotide isolé (ADNc ou fragment d'ADN génomique), caractérisé en ce que
sa séquence est sélectionnée dans le groupe constitué par
- les séquences codant pour une protéine ou un peptide
tels que définis ci-dessus, et
- les séquences complémentaires des précédentes, sens
ou anti-sens.
L'Invention englobe, les allèles du gène asap issus de
n'importe quel mammifère, ainsi que les polynucléotides des mutants naturels
ou artificiels du gène asap codant pour une protéine ASAP, particulièrement
pour une protéine ASAP fonctionnelle telle que définie ci-dessus.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'Invention, ledit
polynucléotide codant pour une protéine ASAP répond à une séquence sélec-
tionnée dans le groupe constitué par
- la séquence SEQ ID NO: 15, correspondant à l'ADN
complémentaire de 2575 nucléotides de l'ARNm codant pour la protéine
ASAP humaine (hASAP) ;
- la séquence SEQ ID NO: 45, correspondant à l'ADN
complémentaire de 2767 nucléotides de l'ARNm codant pour la protéine
ASAP murine (mASAP)
- le fragment d'ADN génomique de 29750 nucléotides
répondant à la séquence représentée dans la liste des séquences en annexe
sous le numéro SEQ ID NO: 16, correspondant au gène asap humain
comprenant 14 exons dont' 13 seulement sont traduits, le premier exon n'étant
pas traduit, contenue dans le contig AC097467 (longueur 178204 paires de
bases) entre les bases 115117 et 143828 (version v.7.29a3 NCBI/Ensembl du
12 juillet 2002, http://www.ensembl.org), par ailleurs localisée sur le
chromosome 4q32.1 entre les marqueurs anonymes D4S1053 et D4S571
(région 161,25 Mégabases (Mb) à 161,28 Mb).
La séquence SEQ ID NO: 16 est contenue dans le clone BAC
RP11-27613 (Osoegawa, K., et col., (2001 ) A Bacterial Artificial Chromosome
Library for Sequencing the Complete Human Genome, Genome Research,
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Vol. 11, n°3, 483-496, mars 2001). Les séquences contenues dans le
contig
AC097467 et dans le clone BAC RP11-27613 ont été obtenues dans le cadre
du programme de séquençage du génome humain et n'ont jusqu'à présent fait
l'objet d'aucune reconnaissance ni caractérisation précises permettant de leur
attribuer une quelconque fonction. Deux acides nucléiques correspondants à
des fragments du polynucléotide isolé par les Inventeurs sont répertoriés dans
la base de données GenBank sous les numéros d'accès AK024730 et
AK024812, ainsi que les EST répertoriés sous les numéros d'accès
BU198882, BM693711, AW372449, BM021380, BU928828, AL707573,
AI885274, AI671785, AA805679, BU619959, BM021126, AL598336,
AW976973, BU629726, AI433877, AV751613, BQ372751, AI827535,
AI866257, AA843565, 896130, BU684090, BF958121, BQ351941,
AW194906, BG203580, BF078132, AW486134, AL600279, AA025538,
AL600264, BF170676, BU759494, BB025236, BF214179, AI283076,
BE694273, AI266380, BM670854, AA968415, BU503982, BB700612,
BE988355, BU058357, BB312934, AW061311, BM537962, BE988356,
BB318982, BB311217, BB557152, BB185248, BB557128, BB698742,
BB186736, AV345769, BB274293, BB632007, BB617958, A1391312,
W18534, BB186581, BB311289, BB312835, AW347411, AA972439,
BB263570, AU035125, BB277226, BB274224, BB268445, AW024037,
AA025609, BB274174, 896089, BB272238, BB269037, BB385718,
BE007324, BB325992, AJ275277, AI414381, BB125476, BB430961,
BE232162, BQ121419, BQ121418, BG591509, BF457670, AL897593,
AL897592, BM926692, BM538559, B1759567, AL601021, AL598780,
AU222540, BG567619, AU 166296, BF889835, AU 164011, AV656025,
BF343454, AW262441, AW237952. Ces séquences, obtenues dans le cadre
d'un programme de séquençage en masse de banques d'ADN complémen-
taires humains, sont incomplètes et n'ont jamais été ni reconnues ni caractéri-
sées. En- fait, le polynucléotide isolé par les Inventeurs présente de longs
enchaînements de désoxyadénosines (poly-dA), ce qui explique les difficultés
rencontrées par les Inventeurs pour obtenir l'ADNc complet par utilisation
d'amorces oligo-désoxythymidines (oligo-dT) classiques, celles-ci s'hybridant
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de manière aléatoire avec les enchaînements poly-dA. C'est par l'utilisation
répétée de la technique de l'amplification rapide des extrémités 3' d'ADNc (3'
Rapid Amplification cDNA end ou 3'RACE) que les Inventeurs sont parvenus
à isoler le polynucléotide correspondant à l'ARNm complet.
L'ARNm, correspondant au polynucléotide de séquence SEQ
ID NO: 15, est spécifiquement exprimé dans le testicule sous la forme d'un
polynucléotide d'une longueur d'environ 2,9 kilobases et dans le cerveau sous
la forme d'un polynucléotide d'une longueur d'environ 9 kilobases pouvant
correspondre soit à un prémessager soit à une isoforme de haut poids molé-
culaire.
De manière plus précise, lesdits exons sont répartis comme
suit sur ladite séquence génomique (par rapport à la numérotation de la
séquence SEQ ID NO: 16)
- exon 1 : il comprend 200 paires de bases correspondant
aux
positions 101 300 (SEQ ID NO: 17)
;
- exon 2 : il comprend 139 paires de bases correspondant
aux
positions 1157 1295 (SEQ ID NO: 18)
;
- exon 3 : il comprend 85 paires de bases
correspondant aux posi-
tions 2050 2134 (SEQ ID NO: 19) ;
- exon 4 : il comprend 321 paires de bases correspondant
aux
positions 3615 3935 (SEQ ID NO: 20)
;
- exon 5 : il comprend 227 paires de bases correspondant
aux
positions 8259 8485 (SEQ ID NO: 21)
;
- exon 6 : il comprend 94 paires de bases
correspondant aux posi-
tions 14930 15023 (SEQ ID NO: 22)
;
- exon 7 : il comprend 248 paires de bases correspondant
aux
positions 16715 16962 (SEQ ID NO: 23)
;
- exon 8 : il comprend 71 paires de bases correspondant aux posi-
tions.19552 à 19622 (SEQ ID NO: 24)-;
- exon 9 : il comprend 169 paires de bases correspondant aux
positions 21187 à 21355 (SEQ iD NO: 25) ;
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- exon 10 : il comprend 90 paires de bases correspondant aux
positions 21911 à 22000 (SEQ ID NO: 26) ;
- exon 11 : il comprend 162 paires de bases correspondant aux
positions 23731 à 23892 (SEQ ID NO: 27) ;
5 - exon 12 : il comprend 146 paires de bases correspondant aux
positions 24014 à 24159 (SEQ ID NO: 28) ;
' - exon 13 : il comprend 133 paires de bases correspondant aux
positions 24343 à 24475 (SEQ ID NO: 29) ;
- exon 14 : il comprend 485 paires de bases correspondant aux
10 positions 29166 à 29650 (SEQ ID NO: 30).
L'Invention a aussi pour objet
- un fragment de l'un quelconque des polynucléotides selon
l'Invention, d'au moins 15 à 1500 nucléotides consécutifs à l'exclusion des
séquences répertoriées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et
15 des EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711,
AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785,
AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726,
AI433877, AV751613, BQ372751, AI827535, AI866257, AA843565, 896130,
BU684090, BF958121, BQ351941, AW194906, BG203580, BF078132,
AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494,
BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, AI266380, BM670854,
AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934,
AW061311, BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152,
BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, 88274293,
BB632007, BB617958, AI391312, W18534, BB186581, BB311289,
BB312835, AW347411, AA972439, BB263570, AU035125, BB277226,
BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, 896089,
BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277,
AI414381, BB125476, BB430961, BE232162~ BQ121419, BQ121418,
BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559,
81759567, AL601021, AL598780, AU222540, BG567619, AU166296,
BF889835, AU 164011, AV656025, BF343454, AW262441, AW237952 dans
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la base de données GenBank, particulièrement un fragment sélectionné parmi
les séquences correspondants aux exons c'est-à-dire sélectionné parmi les
séquences SEQ ID NO: 16 à SEQ ID NO: 30 ;
- un acide nucléique présentant un pourcentage d'identité
d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 %, avec l'un des poly-
nucléotides selon l'Invention.
La définition de l'identité d'une séquence donnée précédem-
ment pour les protéines, s'applique par analogie aux molécules d'acide
nucléique.
Sont inclus dans un polynucléotide présentant un pourcentage
d'identité d'au moins 80 %, de préférence au moins 90 %, selon l'Invention,
les polynucléotides variants des séquences SEQ ID NO: 15 et 45, c'est-à-dire
l'ensemble des polynucléotides correspondants à des variants alléliques,
c'est-à-dire à des variations individuelles des séquences SEQ ID NO: 15 et
45. Ces séquences variantes naturelles correspondent à des polymorphismes
présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notam-
ment à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie.
On entend également désigner par polynucléotide variant, tout
ARN ou ADNc résultant d'une mutation et/ou d'une variation d'un site
d'épissage de la séquence génomique dont l'ARNm a comme ADN complé-
mentaire le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO : 45.
De préférence, la présente Invention concerne les poly-
nucléotides ou les fragments variants des séquences SEQ ID NO: 15 et 45,
particulièrement ceux dans lesquelles les mutations conduisent à une modifi-
cation de la séquence en acides aminés des protéines de séquence SEQ ID
NO: 1 et SEQ ID NO : 46.
Les polynucléotides selon l'Invention peuvent être isolés à
partir de cellules, particulièrement des cellules de testicule ou de cerveau
ou à
partir de banques d'ADN cellulaire.,-Ils peuvent également être obtenus par
une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) effectuée sur l'ADN total des
cellules ou encore par RT-PCR effectuée sur les ARN totaux des cellules ou
par synthèse chimique.
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Les polynucléotides selon l'Invention, particulièrement les
fragments de l'un quelconque des polynucléotides selon l'Invention, et les
séquences répertoriées sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812 et
les EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711,
AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785,
AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726,
AI433877, AV751613, BQ372751, AI827535, AI866257, AA843565, 896130,
BU684090, BF958121, BQ351941, AW194906, BG203580, BF078132,
AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494,
88025236, BF214179, AI283076, BE694273, AI266380, BM670854,
AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, 88312934,
AW061311, BM537962, BE988356, 88318982, 88311217, 88557152,
88185248, 88557128, 88698742, 88186736, AV345769, 88274293,
88632007, 88617958, AI391312, W18534, 88186581, 88311289,
88312835, AW347411, AA972439, 88263570, AU035125, 88277226,
88274224, 88268445, AW024037, AA025609, 88274174, 896089,
88272238, 88269037, 88385718, BE007324, 88325992, AJ275277,
AI414381, 88125476, 88430961, BE232162, BQ121419, BQ121418,
BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559,
81759567, AL601021, AL598780, AU222540, BG567619, AU 166296,
BF889835, AU 164011, AV656025, BF343454, AW262441, AW237952 dans
la base de données GenBanlc ou leurs fragments, peuvent notamment être
utilisés comme sondes ou comme amorces pour détecter/amplifier des poly-
nucléotides (ARN ou ADN génomique) correspondants au polynucléotide
selon l'Invention, particulièrement dans d'autres organismes.
Les transcrits du gène asap sont par exemple de préférence
mis en évidence à l'aide de sondes sélectionnées dans le groupe constitué
par les séquences SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO : 45, SEQ ID NO: 17 à SEQ
ID NO: 44 ou à l'aide d'un EST tel que défini ci-dessus ou amplifiés. par RT-
PCR à l'aide d'amorces sélectionnées dans le groupe constitué par les
séquences SEQ ID NO: 31 à 43.
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Le polynucléotide selon l'Invention peut permettre de
diagnostiquer un état pathologique ou une maladie génétique impliquant un
dysfonctionnement du gène asap et de cribler des substances capables de
moduler (activer ou inhiber) la transcription dudit gène.
L'Invention a aussi pour objet les polynucléotides susceptibles
d'être obtenus par amplification à l'aide des amorces selon l'Invention.
Les sondes et amorces selon l'Invention peuvent être
marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non
radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir
un signal délectable et/ou quantifiable.
Le marquage des sondes selon l'Invention est réalisé par des
éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les iso-
topes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 355, le 3H ou
l'~251. Les
entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la
biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les
colorants,
les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémo-
luminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
Les polynucléotides selon l'Invention peuvent ainsi être utili-
sés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre
notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase)
(U.S. N° 4,683,202). D'autres techniques d'amplification de l'acide
nucléique
cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR
II existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplifica-
tion, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplifica-
tion) ou technique d'amplification à déplacement de brin, la technique TAS
(Transcription-based Amplification System), la technique 3SR (Self-Sustained
Sequence Replication), la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based
Amplification), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la
technique LCR (Ligase Chain Reaction)ï la technique de RCR (Repair Chain
Reaction), la technique CPR (Cycling Probe Reaction), la technique d'amplifi-
cation à la Q-bêta-réplicase. On peut encore citer la PCR-SSCP qui permet
de détecter des mutations ponctuelles.
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Ces techniques sont bien entendu parfaitement connues de
l'homme du métier.
Comme sondes ou comme amorces, les différents poly-
nucléotides selon l'Invention peuvent permettent, soit de déterminer le profil
de transcription du gène asap correspondant ou une éventuelle altération de
ce profil dans un échantillon biologique, soit de mettre en évidence le gène
correspondant dans d'autres espèces, des variants alléliques de ce gène ou
une éventuelle altération fonctionnelle de ce gène (changement substantiel
dans l'activité de la protéine codée par ledit gène) résultant d'une mutation
(insertion, délétion ou substitution) d'un ou plusieurs nucléotides au niveau
d'au moins un exon dudit gène. De telles mutations incluent en particulier les
délétions, les insertions ou les substitutions non-conservatives au niveau de
codons correspondant à des résidus d'acides aminés situés dans un domaine
essentiel pour l'activité biologique de la protéine.
Ainsi l'Invention a pour objet une méthode de détermination
du profil de transcription du gène correspondant au polynucléotide selon
l'Invention ou d'une altération dudit profil, dans un échantillon biologique,
comprenant une première étape d'obtention par tout moyen approprié des
ARN totaux à partir de l'échantillon biologique, une deuxième étape de mise
en contact desdits ARN, avec une sonde selon l'Invention, préalablement
marquée, dans des conditions classiques d'hybridation entre les ARN et la
sonde et une troisième étape de révélation par tout moyen approprié des
hybrides formés.
Par conditions classiques d'hybridation, on entend celles
décrites dans Sambrook J, Russell DW. (2000) Cold Spring Harbor Laboratory
Press.
Selon un mode de mise en oeuvre de ladite méthode, la
deuxième étape peut être une étape de transcription inverse et d'amplification
des transcrits, réalisée à l'aide d'une paire - d'amorces telles que décrites
précédemment et la troisième étape, une étape de révélation par tout moyen
approprié des acides nucléiques amplifiés formés.
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Ladite méthode de détermination du profil de transcription du
gène peut en outre comporter une étape d'évaluation du taux de transcription
du gène par comparaison avec un échantillon témoin préalablement choisi.
Ledit témoin peut ëtre constitué par exemple par un échantillon biologique
5 présentant une transcription normale ou altérée du gène correspondant au
polynucléotide selon l'Invention auquel ladite méthode de détermination du
profil de transcription du gène est appliquée dans les mêmes conditions.
L'Invention a aussi pour objet une méthode de mise en
évidence dans d'autres espèces du gène correspondant au polynucléotide
10 selon l'Invention ou des variants alléliques dudit gène ou d'une altération
fonctionnelle de ce gène, dans un échantillon biologique, comprenant une
première étape d'obtention par tout moyen approprié de l'ADN à partir des
cellules d'un échantillon biologique, une deuxième étape de mise en contact
desdits ADN avec une sonde selon l'Invention, préalablement marquée, dans
15 des conditions classiques d'hybridation entre les ADN et la sonde et une
troisième étape de révélation par tout moyen approprié des hybrides formés.
Selon un mode de mise en oeuvre de ladite méthode, la
deuxième étape peut étre une étape d'amplification réalisée à l'aide d'une
paire d'amorces telles que décrites précédemment et la troisième étape, une
20 étape de révélation par tout moyen approprié des acides nucléiques
amplifiés
formés. La méthode peut éventuellement comporter une quatrième étape
d'isolement et de séquençage des acides nucléiques mis en évidence.
L'Invention a également pour objet une trousse de réactifs
pour la mise en oeuvre des méthodes précédemment décrites comprenant
a) au moins une sonde ou une paire d'amorces selon l'Inven-
tion ; .
b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction
classique d'hybridation entre ladite sonde ou lesdites amorces et l'acide
nucléique de l'échantillon biologique ;
c) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction
d'amplification ;
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d) les réactifs nécessaires à la détection et/ou au dosage de
l'hybride formé entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon
biologique ou des acides nucléiques amplifiés formés.
Une telle trousse peut également contenir des contrôles posi-
tifs ou négatifs afin d'assurer la qualité des résultats obtenus. Elle peut
éga-
lement contenir les réactifs nécessaires à la purification des acides
nucléiques
à partir de l'échantillon biologique.
Le polynucléotide de l'Invention ou un de ses fragment, ainsi que les EST
décrits précédemment ou leur fragments peuvent servir à la mise au point de
modèles cellulaires ou animaux n'exprimant pas la protéine ASAP, en invali-
dant le gène ASAP par la méthode de Si RNA (ou RNAi pour RNA inter-
ference ; M. McManus and P. Sharp, Nature Reviews Genetics, 3, 737-747,
2002 ; V. Brondani, F. Kolb, E. Billy, M/S, 6-7, 665-667, 2002) à l'aide
d'oligonucléotides dérivés de leurs séquences.
L'Invention a également pour objet un vecteur de clonage
et/ou d'expression dans lequel est inséré le polynucléotide selon l'Invention.
Un tel vecteur peut contenir les éléments nécessaires à
l'expression et éventuellement à la sécrétion de la protéine dans une cellule
hôte.
Lesdits vecteurs comportent de préférence : un promoteur,
des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des
régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir
être
maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement
comprendre des séquences codant pour des signaux particuliers spécifiant la
sécrétion de la protéine traduite tels que par exemple un promoteur fort de
nature ubiquitaire ou un promoteur sélectif d'un type de cellule et/ou de
tissu
particulier. Ces différentes séquences de contrôle sont choisies en fonction
de
l'hôte cellulaire utilisé.
Le polynucléotide selon l'Invention peut être inséré dans des
vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi ou des vecteurs inté
gratifs de l'hôte choisi.
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Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de
préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique
ou viral. Les vecteurs viraux peuvent notamment être des adénovirus, des
rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques. L'homme du
métier connait les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes.
Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence dans les
chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de
type plasmidique ou viral ; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus ou
les
virus associés aux adénovirus (Adeno-associated virus ou AAV).
Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides
nus tels que l'ADN ou l'ARN nu, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC,
bacterial artificiel chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC,
yeast artificiel chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromo-
somes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expres-
sion dans les cellules mutines et de manière préférée les chromosomes artifi-
ciels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les
cellules humaines.
De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couram-
ment utilisées par l'homme du métier, et les vecteurs recombinants en résul-
tant peuvent être introduits dans l'hôte approprié par des méthodes standards,
telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique,
la
transformation après perméabilisation chimique de la membrane, la fusion
cellulaire.
L'Invention a aussi pour objet les cellules hôtes transformées,
notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, dans lesquelles au moins
un polynucléotide ou un fragment selon l'Invention ou au moins un vecteur
selon l'Invention a été introduit.
Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente
Invention, on peut citer les cellules bactériennes, les cellules de levure,
les
cellules animales, en particulier les cellules de mammifères ou encore les
cellules végétales. On peut citer également les cellules d'insectes dans
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lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en oeuvre des
baculovirus.
L'Invention a également pour objet les organismes trans-
géniques non-humains tels que les animaux ou les végétaux transgéniques,
dont tout ou partie des cellules contient le polynucléotide selon l'Invention
ou
le vecteur selon l'Invention, sous une forme libre ou intégrée.
De préférence selon l'Invention, les organismes transgéniques
non-humains sont ceux porteurs de cellules contenant un polynucléotide selon
l'Invention, non fonctionnel ou porteur d'une mutation.
Selon l'Invention les animaux transgéniques sont de préfé-
rence des mammifères, excepté l'homme, plus préférentiellement les
rongeurs, en particulier les souris ou les rats.
Les animaux transgéniques peuvent être obtenus par toute
méthode classique connue de l'homme du métier, comme par exemple par
recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de
ces cellules souches. à des embryons, sélection des chimères affectées au
niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères.
Les cellules hôtes transformées, les animaux ou les végétaux
transgéniques selon l'Invention peuvent ainsi exprimer ou surexprimer le gène
codant pour la protéine selon l'Invention ou leur gène homologue ou exprimer
ledit gène dans lequel est introduite une mutation.
Les cellules de testicule ou de cerveau, les cellules hôtes
transformées ou les organismes transgéniques selon l'Invention peuvent être
utilisés pour la préparation de la protéine selon l'Invention.
La protéine selon l'Invention, particulièrement la protéine
ASAP native, peut étre purifiée selon les techniques connues de l'homme du
métier. Ainsi, la protéine peut être purifiée à partir de lysats et extraits
cellu-
laires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées indivi-
duellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de
chromatographie, particulièrement de chromatographie d'affinité, les
techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux
spécifiques, etc...
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L'Invention a également pour objet une méthode de prépara-
tion de la protéine ASAP, se caractérisant en ce que l'on cultive des cellules
exprimant la protéine ou des cellules transformées selon la présente Inven-
tion, notamment les cellules de mammifères ou les cellules d'organismes
transgéniques selon l'Invention, dans des conditions permettant l'expression
de ladite protéine, et que l'on purifie ladite protéine.
Comme technique de purification, on peut citer par exemple la
chromatographie d'affinité sur glutathione-sépharose (ou agarose) telle que
décrite dans Sambrook J & Russell DW. (2000, Cold Spring Harbor
Laboratory Press).
L'Invention a également pour objet une protéine, caractérisée
en ce qu'elle est susceptible d'être obtenue par l'une quelconque des
méthodes de préparation ci-dessus décrites.
L'Invention a encore pour objet une méthode de criblage
d'une substance capable d'interagir in vitro, directement ou indirectement,
avec le polynucléotide ou la protéine selon l'Invention caractérisée en ce que
- dans une première étape on met en contact la substance
à tester et le polynucléotide ou la protéine selon l'Invention et
- dans une deuxième étape on détecte par tout moyen
approprié le complexe formé entre ladite substance et le polynucléotide ou la
protéine selon l'Invention.
La présente invention a également pour objet une méthode de
criblage d'une substance capable de moduler (activer ou inhiber) l'activité de
la protéine ASAP, caractérisée en ce que
- dans une première étape on met en contact des cellules d'un
échantillon biologique exprimant la protéine ASAP avec une substance à
tester,
- dans une deuxième étape on mesure par tout moyen appro-
prié l'effet de ladite_substance sur l'activité de ladite protéine ASAP, et
- dans une troisième étape on sélectionne des substances
capables de moduler ladite activité.
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Au sens de la présente invention, on entend par activité de la
protéine ASAP, aussi bien l'expression de la protéine ASAP ou des transcrits
(ARNm) correspondants, que l'activité biologique de ladite protéine ASAP,
comme par exemple son effet sur l'organisation du fuseau mitotique ou
l'induction de mitoses aberrantes et abortives.
La détection du complexe formé entre ladite substance et le
polynucléotide ou la protéine ou la mesure de l'effet de ladite substance sur
l'activité de ladite protéine ASAP peuvent être réalisées par les techniques
classiques d'analyse d'ARNm ou de protéines qui sont connues en
elles-mêmes ; à titre d'exemple non-limitatif, on peut citer les techniques
suivantes : RT-PCR, Northern-blot, Western-blot, RIA, ELISA, immunopréci-
pitation, techniques d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique.
Avantageusement, ladite mesure est réalisée à l'aide des
sondes, des amorces ou des anticorps, tels que définis ci-dessus.
De telles substances peuvent être des macromolécules
biologiques comme par exemple un acide nucléique, un lipide, un sucre, une
protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre,
peptide-lipide ou peptide-sucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a
ajouté des ramifications chimiques ou encore des molécules chimiques.
L'Invention a également pour objet le polynucléotide, la
protéine, les anticorps, les vecteurs ou les cellules transformées selon
flnven-
tion, utilisés comme médicaments.
Comme indiqué précédemment, la surexpression de la
protéine selon l'Invention bloque la division cellulaire et par conséquent la
prolifération cellulaire. Cela en fait un excellent candidat pour une
utilisation
comme agent anti-mitotique, utilisable par exemple dans le traitement des
pathologies cancéreuses.
Ainsi, l'Invention a également pour objet l'utilisation du poly
nucléotide, d'un vecteur ou de la protéine selon l'Invention, dans la prépara
. 30 tion d'un médicament anti-mitotique.
De même comme il est également indiqué précédemment, la
surexpression de la protéine selon l'Invention entraine des perturbations dans
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l'organisation du fuseau mitotique et induit des mitoses aberrantes et abor-
tives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou multipolaires).
Ainsi, l'Invention a aussi pour objet l'utilisation d'un poly-
nucléotide anti-sens ou d'un fragment anti-sens, d'un anticorps, d'un vecteur
contenant un oligonucléotide anti-sens selon l'Invention, capables d'inhiber
l'expression du polynucléotide ou de la protéine selon l'Invention, dans la
préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées aux
perturbations dans l'organisation du fuseau mitotique et/ou à une induction
des mitoses aberrantes et abortives (cellules plurinucléées, fuseaux mono- ou
multipolaires) liées à la surexpression de la protéine selon l'Invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend
encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre,
qui
se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'Invention ainsi qu'aux
dessins annexés, dans lesquels
- La Figure 1 représente la localisation chromosomique et la
structure du gène asap humain.
- La Figure 2 représente les signaux obtenus par Northern
blots sur différents tissus humains après hybridation avec une sonde hASAP.
- La Figure 3 représente les résultats obtenus
(A) par électrophorèse sur gel d'agarose des produits de
RT-PCR obtenus avec des amorces correspondant au polynucléotide de
souris, orthologue du polynucléotide SEQ ID NO: 15, à partir de différents
tissus de souris.
(B) Après transfert du gel après électrophorèse sur une
membrane et hybridation avec une sonde mASAP interne.
- La Figure 4 représente la localisation cellulaire de la protéine
hASAP couplée à la Green Fluorescent Protein (GFP) en 3' ou la Yellow
Fluorescent Protein (YFP) en 5' ou à un tag MYC du côté N-terminal (colonne
fusion).
Les noyaux sont colorés à l'iodure de propidium ou au
Hoechst 33286. (4A : objectif 63x ; 4B, 4C, 4D : objectif IOOX).
- La Figure 5 montre la co-localisation de la protéine ASAP
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humaine avec l'alpha-tubuline. Figure 5 A : localisation cellulaire de l'alpha-
tubuline, Figure 5 B : localisation de la protéine ASAP, Figure 5 C :
superposi-
tion des 2 images montrant la colocalisation des 2 protéines.
Les exemples suivants sont illustratifs de l'Invention et ne la
limitent aucunement.
EXEMPLE 1 : Construction de la séquence codante ASAP complète
On amplifie la séquence complète de l'ADNc de la protéine
ASAP à partir de 2 fragments chevauchants
- un fragment A amplifié par PCR à partir du clone AI885274
avec les amorces
constFIS-1 F (5'-ATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (SEQ
ID NO: 31) et
constFIS-2R (5'-AGGCCTCAAATGATGCTAATGC-3') (SEQ
ID NO: 32) ;
- un fragment B amplifié à partir du clone AI671785 avec les
amorces
constFIS-2F (5'-ATCATTTGAGGCCTGGAAGGC-3') (SEQ ID
NO: 33) et
et constFIS-1 R (5'-AAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3')
(SEQ ID NO: 34).
Puis, pour obtenir un produit PCR unique correspondant à la
séquence complète de l'ADNc de la protéine ASAP, utilisable pour les expé-
riences de fonction, 0,5 pl des produits de chacune des 2 réactions PCR
(fragment A et B) sont hybridés ensemble à 25°C puis amplifiés avec les
amorces constFIS-1 F et constFIS-2F. Ce produit PCR est sous-cloné dans le
vecteur PCR4 suivant les recommandations du fabricant (Invitrogen) et vérifié
par séquençage.
Les difficultés majeures rencontrées se sont situées dans la
détermination in silico de la séquence codante complète ASAP et de sa-
reconstruction in vitro. En particulier, le choix des amorces et des
différentes
PCR de la région 3' ont été délicats en raison de la richesse de la séquence
en polyA.
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EXEMPLE 2 : Analyse bio-informatique
La Figure 1 représente la localisation chromosomique et la
structure du gène asap humain.
L'organisation complète du gène asap et sa localisation
chromosomique ont été obtenues en comparant la séquence de l'ADNc
obtenu à l'exemple 1, à la séquence du génome humain en utilisant les
programmes du Wellcome Trust Sanger Institute
(httl2://www.ensembl.oriz/genome/central/ et plus précisément le programme
de recherche BLAST (htip://genome.cse.ucsc.edu/).
Le gène humain asap est constitué de 29750 nucléotides
comprenant 14 exons dont 13 seulement sont traduits, le premier exon n'étant
pas traduit. La taille des exons s'échelonne de 71 à 321 paires de bases. La
séquence du gène est contenue dans le contig AC097467 (longueur 178204
paires de bases) entre les bases 115117 et 143828 (version v.7.29a3
NCBI/Ensembl du 12 juillet 2002, http ://www.ensembl.org), et est par ailleurs
localisée sur le chromosome 4q32.1 entre les marqueurs anonymes D4S1053
et D4S571 (région 161,25 Mégabases (Mb) à 161,28 Mb). La séquence du
gène est physiquement contenue dans le clone BAC RP11-27613.
Deux acides nucléiques correspondants à des fragments du
polynucléotide isolé par les Inventeurs sont répertoriés dans la base de
données GenBank sous les numéros d'accès AK024730 et AK024812, ainsi
que les EST répertoriés sous les numéros d'accès BU198882, BM693711,
AW372449, BM021380, BU928828, AL707573, AI885274, AI671785,
AA805679, BU619959, BM021126, AL598336, AW976973, BU629726,
AI433877, AV751613, BQ372751, AI827535, A1866257, AA843565, 896130,
BU684090, BF958121, BQ351941, AW194906, BG203580, BF078132,
AW486134, AL600279, AA025538, AL600264, BF170676, BU759494,
BB025236, BF214179, AI283076, BE694273, AI266380, BM670854,
AA968415, BU503982, BB700612, BE988355, BU058357, BB312934,
AW061311, BM537962, BE988356, BB318982, BB311217, BB557152,
BB185248, BB557128, BB698742, BB186736, AV345769, BB274293,
BB632007, BB617958, AI391312, W18534, BB186581, BB311289,
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BB312835, AW347411, AA972439, BB263570, AU035125, BB277226,
BB274224, BB268445, AW024037, AA025609, BB274174, 896089,
BB272238, BB269037, BB385718, BE007324, BB325992, AJ275277,
AI414381, BB125476, BB430961, BE232162, BQ121419, BQ121418,
BG591509, BF457670, AL897593, AL897592, BM926692, BM538559,
B1759567, AL601021, AL598780, AU222540, BG567619, AU166296,
BF889835, AU164011, AV656025, BF343454, AW262441, AW237952. Ces
séquences, obtenues dans le cadre d'un programme de séquençage en
masse de banques d'ADN complémentaires humains, sont incomplètes et
n'ont jamais été ni reconnues ni caractérisées.
La séquence protéique a été comparée aux séquences des
banques de données en utilisant les programmes PSI-BLAST et PHI-BLAST
du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sitemapn. Des motifs protéiques
consensus ont été recherchés en utilisant les programmes DART du NCBI et
SMART d'ExPASy-Tools (http:l/www.expasy.ch/tools/#similariw), dont les
paramètres permettent de détecter des motifs de faible homologie. La
protéine ASAP présente une identité de séquence de 23% sur le tiers
C-terminal avec une protéine associée aux microtubules (MAP 1A pour
Microtubule-Associated-Protein 1A). Par ailleurs la recherche de motifs
conservés (DART on SMART) révèle des domaines de type caldesmon
(Gusev, N.B., Biochemistry, 10 1112-1121, 2000) et ERM
(Ezrinlradixin/moesin) (Louvet-Vallet, S., Biol. Cell, 274 : 305-316, 2000),
qui
sont des protéines également considérées comme des MAPs, avec des
identités d'environ 20%. Elle présente également un domaine BRCT (Breast
cancer carboxy-terminal domain ; Bork, P., et coll., FASEB J., 11, 68-76
(1997)) entre les positions 65 et 303.
La protéine ASAP présente des domaines coiled-coil essen-
tiellement regroupés dans sa partie C-terminale entre les acides aminés 297
et 327 d'une part et 477 et 628 d'autre part, indiquant soit que la protéine
s'oligomérise, soit qu'elle interagit avec d'autres protéines.
L'analyse informatique de la protéine à l'aide des programmes
accessibles dans le site internet (http://npsa-bil.ibcp.fr/cgi-
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bin/npsa_autocoat.pl?page=/NPSA/npsa_secons.html), révèle l'absence de
feuillet ~ et une très grande richesse en hélices a, en particulier pour la
région
comprise entre les acides aminés 420-620, presque exclusivement formées
d'hélices a.
5 Ces éléments permettent de penser que la protéine ASAP est
une nouvelle MAP.
EXEMPLE 3 : Expression tissulaire
a) Analyse par Northern blot
Préparation des sondes radioactives
10 Les ADN à radiomarquer sont isolés sur gel à bas point de
fusion (LMP) selon la technique décrite dans Rouquier, S. et al., (Genomics,
17, 330-340, (1993)). Environ 100 ng d'ADN ainsi isolé, sont marqués par
amorçage aléatoire (fragment de Klenow, Proméga) en présence de [a32P
dCTP] (Amersham) selon la technique décrite dans Feinberg, A.P. &
15 Vogelstein, B., (Anal. Biochem., 132, 6-13, (1983)). Ces sondes sont
purifiées
sur des colonnes de Sephadex G-50 selon la technique décrite dans
Sambrook J & Russell DW. (2000, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Les
hybridations s'effectuent durant la nuit en présence de 2.106 Cpm/ml de sonde
radioactive dénaturée.
20 a.1) Hxbridation
Deux membranes Northern Blot de la société Clontech,
(Human MTN Blot at Human MTN Blot ll, Réf. 7760-1 et 7759-1 ) comportant
des ARNm humains de différents tissus ont été hybridées avec l'ADNc hASAP
complet marqué comme décrit ci-dessus. La membrane est hybridée en
25 présence de formamide à 42°C, en suivant le protocole Clontech. Un
contrôle
d'hybridation de la membrane est réalisé avec une sonde actine. La
membrane est rincée 2 fois à haute stringence en 0,1 X SSC/0,1 % SDS à la
température de 42°C, pendant 15 minutes. Les membranes sont alors analy-
sées par autoradiographie ou au Phôsphorim~ger.
30 Les tissus testés sont : la rate, le thymus, la prostate, le testi-
cule, l'ovaire, l'intestin grêle, le colon, les leucocytes sanguins, le coeur,
le
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cerveau, le placenta, le poumon, le foie, le muscle squelettique, le rein et
le
pancréas.
a.2) Résultats
La Figure 2 illustre ces résultats.
Deux signaux sont détectés
- un signal dans le testicule à environ 2,6 kb, ce qui correspond à
la taille de l'ARNm ;
- un signal dans le cerveau mais à un haut poids moléculaire (9
kb) qui correspond soit à un prémessager, soit à une isoforme de haut poids
moléculaire
b) Analyse par RT-PCR
Cette analyse a été effectuée sur des ARNs totaux de diffé-
rents tissus de souris, à savoir le cerveau, le coeur, le colon, le foie,
l'intestin
grêle, le muscle squelettique, le pancréas, le poumon, le rein, la rate et le
testicule.
b.1) Obtention-de_l'ADNc_orthologue.de souris
Les ARNs totaux de cellules de différents tissus de souris sont
extraits avec le "mammalian total RNA kit" de la société Sigma. Les ARN sont
rétro-transcrits avec le kit Superscript II de la société Invitrogen selon les
conditions prescrites par le fournisseur et en utilisant des amorces oligodT.
Les produits obtenus sont vérifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à I%.
1 pl de chaque échantillon ainsi obtenu est à son tour amplifié par PCR (25 pl
de milieu de réaction, 30 cycles (94°C pendant 15 secondes, 55°C
pendant 30
secondes, 72°C pendant 30 secondes)) avec des amorces spécifiques du
gènes asap de souris (mFIS-1 F, 5'-ACA ACG AAT AAC AGA GTG TCC-3'
(SEQ ID NO: 35) et mFIS-2R, 5'-ACT CCT GAT AAA CAG CTG CC-3' (SEQ
ID NO: 36).
Les produits amplifiés obtenus sont analysés par électro-
phorèse sur gel.d'agarose à 1%, colorés au bromure d'éthydium et leur taille
comparée à un marqueur de taille déposé sur le gel en parallèle.
Après électrophorèse, les produits amplifiés obtenus sont
transférés par capillarité sur membrane de nylon chargée, dans le tampon
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NaCI 1,5M/NaOH 0,5M, selon la technique de Southern (transfert alcalin). La
membrane est ensuite hybridée avec une sonde radiomarquée mASAP, (SEQ
ID NO: 44), générée par amplification de la séquence contenue dans le clone
de souris AW06131 sélectionné après comparaison de la séquence ASAP
humaine dans les banques de données (GenBank)
(http://expression.gnf.org/promoter/tissue/images/41739 s at.png).
L'amplification a été réalisée par PCR (conditions telles que
décrites ci-dessus dans lesquelles le volume de réaction est de 50 pl et le
dCTP froid est à la concentration de 10 pM supplémenté avec 50 pCi d'a-P32
dCTPà 3000Cilmmole), en utilisant les amorces mFIS-1 F (SEQ ID NO: 35) et
mFis-2R (SEQ ID NO: 36). Les hybridations sont réalisées à 65°C (dans
du
tampon 6X SSC/0,5% SDS/5X Denhardt). La membrane est rincée à forte
stringence (O,IX SSC/0.1% SDS), puis analysée par autoradiographie ou au
Phosphorlmager.
b.2 Résultats
......._.._...._..
La Figure 3 illustre ces résultats.
On constate qu'on obtient un signal majoritaire dans le testi-
cule et le cerveau, nettement visible sur gel (Figure 3A).
Après transfert du gel et hybridation avec une sonde interne,
on. constate que l'on détecte un signal très faible dans les autres tissus
(Figure
3B).
Par conséquent l'ARNm codant pour la protéine mASAP est
majoritairement exprimé dans le testicule et le cerveau. L'ADNc complet de
souris, amplifié par RT-PCR à partir de l'ARN de testicule de souris,
correspond à la séquence SEQ ID NO : 45 et la protéine correspondante
(mASAP) à la séquence SEQ ID NO : 46.
EXEMPLE 4 : Localisation cellulaire
a) Sous-clonage de l'ADNc hASAP dans un vecteur d'expression eucaryote
L'ADNc hASAP obtenu à l'exemple 1 est inséré dans trois
vecteurs d'expression
1- dans pEAK10-EGFP en phase avec la Green Fluorescent
Protein (GFP) fusionnée en C-terminal (vecteur 1) (pEAK10, vecteur de Edge
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Biosystems (distribué par Q.BIOgene, Illkirch en France) dans lequel a été
introduit la protéine EGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) suivant la
référence Gaillard, I., et al., Eur. J. Neurosci., 15, 409-418, 2002) ;
2- dans pEYFP-C1 en phase avec la Yellow Fluorescent
Protein (YFP) fusionnée du côté N-terminal (vecteur 2) (distribué par BD
Biosciences Clontech)) ;
3- dans GLOMYC3-1 comportant un tag MYC du côté
N-terminal (vecteur 3) , vecteur dérivé du vecteur pcDNA3.1 (Invitrogen), dans
lequel ont été insérées une région 5' non-traduite (5' UTR) et un tag MYC aux
sites Hindlll-BamHl, et la région 3'UTR de la globine (fragment Spel ~fbal
dans le site ~Cban.
L'ADNc hASAP est amplifié à partir de son vecteur de clonage
initial (pCR4-TOPO) par PCR en utilisant la polymérase haute-fidélité pfu
Turbo, à l'aide d'amorces amplifiant l'ADNc entre la méthionine de départ et
le
dernier acide aminé. Les produits amplifiés obtenus sont sous-clonés dans les
3 vecteurs.
- Clonage dans PEAI<-GFP. Préparation de l'insert d'ADN
par PCR [94°C 2 min ; (94°C 15 sec.; 58°C 30 sec.;
72°C 1 min 30 sec.) 30
cycles ; 72°C 3 min.], à l'aide des amorces
hFIS-Exp1F (5'-GCCACCATGTCTGATGAAGTTTTTAGCAC-3) (SEQ ID NO:
37) et
hFIS-Exp1 R (5'-GAAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (SEQ ID NO: 38).
Le vecteur est coupé par EcoRV et déphosphorylé : 10 ng de
vecteur sont utilisés pour la ligation avec l'insert d'ADN. Le produit PCR est
phosphorylé puis purifié sur high PURE PCR kit (Roche) : 100 ng d'insert sont
utilisés pour la ligation [12h à 16°C dans 10 pl final (ligase
Biolabs), suivant
les conditions standards (Sambrook and Russell)].
- Clonage dans Glomyc : Préparation de l'insert d'ADN par
PCR [94°C 2 min ; (94°C 1.5 sec.; 60°C 30 sec.;
72°C 1 min 30 sec.) -30
cycles ; 72°C 3 min.], à l'aide des amorces
Glomyc-FIS1 F : (5'-TAATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (SEQ ID NO:
39) et
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Glomyc-FIS1R : (5'-TCAAAACACTTTTGCGAACACAGTTC-3') (SEQ ID NO:
40).
Conditions de clonage identiques à celles décrites pour le
clonage dans PEAK-GFP.
- Clonage dans YFP : Préparation de l'insert d'ADN : mêmes
conditions que pour Glomyc, à l'aide des amorces
YFP-FIS1F (5'-AATGTCTGATGAAGTTTTTAGCACC-3') (SEQ ID NO: 41) et
Glomyc-FIS1R (SEQ ID NO: 40) (cf ci-dessus).
Conditions de clonage identiques à celles décrites pour le
clonage dans PEAK-GFP, le vecteur ayant préalablement été coupé par
Sma 1.
Les recombinants sont analysés par PCR en utilisant une
amorce du vecteur et une amorce interne.
PEAK-GFP : annealing à 58°C, extension 45 sec. à 72°C. et
conditions
standards pour le reste. Amorces : constFIS-2F (SEQ ID NO: 33) et GFP-1 R
(5'-TCAGCTTGCCGTAGGTGGC-3') (SEQ ID NO: 42).
YFP : annéaling 55°C pendant 1 min. ; Amorces : YFP-2F (5'-
ATGGTCCTGCTGGAGTTCG-3') (SEQ ID NO: 43) et hFIS-Exp1 R (SEQ ID
NO: 38) .
Glomyc : annealing 44°C, extension 45 sec. à 72°C. Amorces
: constFIS-2F
(SEQ ID NO: 33) et SP6. Les recombinants sont séquencés par séquençage
automatique à façon à partir des produits PCR (Genome Express, Meylan).
b) Sous-clonage de l'ADNc hASAP dans un vecteur d'expression procar
En utilisant une stratégie similaire à celle utilisée au para
graphe a) ci-dessus, l'ADNc hASAP a été cloné dans le vecteur pGEX-4T2
(AMERSHAM), de façon à produire une protéine de fusion avec la GST,
purifiable selon les protocoles standards.
c) Sous-clonage de l'ADNc mASAP dans un vecteur d'expression procar~~ote
ou eucaryote
En utilisant une stratégie similaire à celle utilisée au para-
graphe a) ci-dessus, l'ADNc mASAP a été cloné dans les vecteurs suivants
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- pGEX-4T2, (AMERSHAM), de façon à produire une protéine
de fusion avec la GST, purifiable selon les protocoles standards.
- pEYFP-C1 de façon à produire une protéine de fusion (fusion
N-terminale) avec la Yellow Fluorescent Protein (YFP) détectable par
5 immunofluorescence directe.
d) Transfection, immunofluorescence et microscopie
d.1) matériels_et_méthodes
Les vecteurs obtenus sont transfectés selon la technique au
phosphate de calcium ou de façon plus routinière en utilisant le procédé
10 jetPEl (GDSP10101, Qbiogene) suivant les recommandations du fabricant,
dans les lignées cellulâires suivantes
- PEAK (ref. 37937, Edge Biosystems (distribué par
Q.BIOgene, Illkirch en France), uniquement pour les constructions ASAP
humaines,
15 - HEK-293 (ATCC (American Tissue Culture Collection) réfé-
rence CRL-1573 ; p53 -/- non synchronisable), pour les constructions ASAP
humaines et marines,
- NIH3T3 non-transformées (constructions ASAP marines), et
- U-2 OS (ATCC HTB-96 ; p53 +/-, synchronisable)
20 Pour les vecteurs 1 ) et 2) (constructions ASAP humaines et
marines), les localisations se font directement par détection de la
fluorescence
de la GFP ou de l'YFP à 24h, 48h et 72h après fixation des cellules au para-
formaldéhyde et coloration des noyaux soit au propioiodure de propidium, soit
au Hoechst 33286.
25 Pour le vecteur 3) la détection du tag MYC est réalisée à
l'aide d'un anticorps primaire anti-MYC distribué par TEBU (9 E10, cat.#SC-
40, Santa Cruz Biotechnology, CA) et d'un anticorps secondaire de chèvre
anti-IgG de souris marqué au fluorochrome Alexa-594 (Molecular Probes, ref.
A-11032, distribué en France par Interchim-, Montluçon), après la fixation des
30 cellules et leur perméabilisation au Triton X100 0,1%. Les lames sont analy-
sèes, et les images collectées sur un microscope Zeiss Axiophot.
CA 02511436 2005-06-21
WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
36
d.2)
Résultats__;__Loçalisation_~ellulaire__et_çoloçalisation__de_la_protéine_ASAP
ayeç l'alpha-tubuline
- localisation cellulaire
La Figure 4 illustre la localisation cellulaire de la protéine
hASAP surexprimée dans la lignée HEK-293 (IP = Iodure de propidium).
L'observation au microscope à fluorescence des lâmes
correspondant aux différentes transfections par les vecteurs 1 ), 2) et 3)
montrent les mêmes types de profil : la localisation des protéines hASAP et
mASAP est cytoplasmique et son profil fibreux rappelle celui des filaments de
tubuline.
Par ailleurs, il semble que les cellules transfectées présentent
des défauts de division car les noyaux sont toujours plus gros que dans les
cellules non transfectées (Figure 4A et 4B). De plus, certaines des cellules
transfectées semblent plurinucléées (Figure 4B). Ceci suggère une division
anormale des cellules transfectées.
Enfin, la mitose des cellules transfectées semble anormale,
tant au niveau de l'organisation des chromosomes, que du profil de localisa-
tion des protéines hASAP et mASAP au niveau du fuseau mitotique. Le profil
de localisation des protéines hASAP et mASAP, en étoile, est caractéristique
de la nucléation des microtubules en aster autour du centrosome (Figures 4C
et 4D).
Un profil similaire de localisation de la protéine ASAP est
détecté dans la lignée U-2 OS (p53 +/-) surexprimant hASAP et dans la lignée
NIH 3T3 non-transformée surexprimant mASAP ; une accumulation de
cellules monopolaires en mitose est observée.
En outre, en synchronisant les cellules U-2 OS et en récupé-
rant les extraits cellulaires à différents moments du cycle, il a été vérifié
que la
protéine ASAP était bien présente dans toutes les phases du cycle cellulaire
(interphase, S, G2lM). _
- colocalisation de la protéine ASAP avec l'alpha-tubuline
La Figure 5 illustre la co-localisation de la protéine ASAP
humaine avec l'alpha-tubuline ; de même la protéine ASAP murine co-localise
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37
avec l'alpha-tubuline.
La Figure 5 A illustre la localisation cellulaire de l'alpha-
tubuline détectée par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti-tubuline
(Alexa-594, Molecular Probe).
La Figure 5 B illustre la localisation de la protéine ASAP
marquée à la YFP (yellow fluorescent protein).
La Figure 5 C représente la superposition des 2 images
démontrant la colocalisation des 2 protéines.
EXEMPLE 5 : Production d'anticorps polyclonaux anti-hASAP et mASAP
a) Production d'anticorps
Les constructions suivantes de la protéine ASAP ont été
clonées dans le vecteur d'expression procaryote pGEX 4T-2 (AMERSHAM)
comme décrit à l'exemple 4
- protéine ASAP humaine entière (SEQ ID NO : 1)
- protéine humaine délétée de sa partie C-terminale contenant
le domaine MAP potentiel (résidus 1 à 421, SEQ ID NO : 47)
- protéine mutine entière (SEQ ID NO : 46).
Les protéines ont été exprimées dans E. eoli et purifiées selon
les protocoles standards. Des lapins ont ensuite été immunisés avec !es
protéines ASAP purifiées selon un protocole standard, et les sérums immuns
ont été récoltés.
b) Analyse de la réactivité des sérums polyclonaux vis-à-vis de la protéine
ASAP endogène.
Les sérums polyclonaux monospécifiques dirigés contre la
protéine hASAP entière ou délétée de sa partie C-terminale contenant le
domaine MAP potentiel, ont été testées en Western-blot et en immunofluores
cence, sur des cellules HEK-293 et U-2 OS, selon des protocoles standards.
En Western-blot, le sérum polyclonal monospécifique dirigé
contre la protéine hASAP entière détecte une protéine d'un poids moléculaire
apparent d'environ 110 kDa correspondant à la protéine ASAP endogène,
aussi bien dans les cellules HEK-293 que les cellules U-2 OS. Dans ces
conditions, un anticorps anti-FLAG, détecte une protéine de poids moléculaire
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38
équivalent, dans des cellules contrôle HEK-293 ou U-2 OS, transfectées par
un vecteur d'expression de la protéine hASAP fusionnée avec une étiquette
FLAG.
En immunofluorescence, le sérum polyclonal monospécifique
dirigé contre la protéine hASAP entière marque les microtubules des cellules
HEK-293 en interphase, les asters des cellules en mitose et les microtubules
du corps résiduel en fin de télophase.
Le sérum polyclonal monospécifique dirigé contre la protéine
hASAP délétée de sa partie C-terminale contenant le domaine MAP potentiel
présente le même profil en immunofluorescence et détecte une protéine
d'environ 110 kDa, en Western blot.
Le sérum polyclonal monospécifique dirigé contre la protéine
mASAP est utilisé pour détecter quels sont les types cellulaires exprimant
ASAP et à quels) stades) du cycle cellulaire elle est exprimée, par immuno-
fluorescence sur des coupes testiculaires de souris.
EXEMPLE 6 : Analyse fonctionnelle de la protéine hASAP à l'aide de
mutants délétés de la partie N-terminale contenant le domaine BRCT ou
de la région C-terminale contenant le domaine MAP potentiel.
Des fragments d'ADNc codant pour une protéine hASAP
délétée de la partie N-terminale contenant le domaine BRCT (Ndel1 : résidus
304 -647 (SEQ ID NO : 48) ; Ndel2 : résidus 411-647 (SEQ ID NO : 49) ;
Ndel3: résidus 478-647 (SEQ ID NO: 50)) ou de la partie C-terminale
contenant le domaine MAP (Cdel1 : résidus 1 à 477 (SEQ ID NO : 51) ;
Cdel2 : résidus 1 à 418 (SEQ ID NO : 52) ; Cdel3 : résidus 1 à 303 (SEQ ID
NO : 53)) ont été amplifiés par PCR à l'aide d'amorces appropriées puis
clonés dans les vecteurs d'expression pEAK10-EGFP (fusion C-terminale
avec la GFP) et pEYFP-C1 (fusion N-terminale avec la YFP) selon un
protocole similaire à celui décrit à l'exemple 4.
Les différentes constructions ont été transfectées dans les
lignées HEK-293 et U-2 OS puis la localisation cellulaire des différents
mutants de la protéine hASAP a été analysée comme décrit à l'exemple 4.
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39
On constate que pour les mémes délétions, un profil similaire
est obtenu avec la construction comportant la YFP en N-terminal ou la GFP
en C-terminal. ,
Par comparaison avec la protéine hASAP entière, les 3
constructions délétées de la partie C-terminale ne colocalisent plus en inter-
phase avec la tubuline et ne présentent plus un aspect fibreux ; ces résultats
indiquent que la délétion intéresse un domaine MAP. En outre, aucune cellule
monopolaire bloquée en mitose n'est observée dans les cellules surexprimant
les mutants délétés de la partie C-terminale contenant le domaine MAP.
Par comparaison avec la protéine hASAP entière, les 3
constructions délétées de la partie N-terminale contenant le domaine BRCT,
présentent une localisation nucléaire sous forme de foyers mais il reste dans
le cytoplasme quelques fibres co-localisant avec la tubuline.
L'analyse fonctionnelle de la protéine hASAP est complétée
par des expériences d'inactivation de l'expression du gène par des ARN
interférents (ARNi).
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WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.5T25
SEQUENCE LISTING
<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
GIORGI, Dominique
SAFFIN, Jean-Michel
ROUQUIER, Sylvie
<120> Nouvelle protéine associée aux centrosomes et ses applications
<130> s644PCT88
<160> 53
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 647
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ser Asp Glu Val Phe Ser Thr Thr Leu Ala Tyr Thr Lys Ser Pro
1 5 10 15
Lys Val Thr Lys Arg Thr Thr Phe Gln Asp Glu Leu Ile Arg Ala Ile
20 25 30
Thr Ala Arg Ser Ala Arg Gln Arg Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Asp Phe
35 40 45
Asp Ser Asp Glu Ile Val Ser Leu Gly Asp Phe Ser Asp Thr Ser Ala
50 55 60
Asp Glu Asn Ser Val Asn Lys Lys Met Asn Asp Phe His Ile Ser Asp
65 7p 75 gp _ .
Asp Glu Glu Lys Asn Pro Ser Lys Leu Leu Phe Leu Lys Thr Asn Lys
85 90 95
Ser Asn Gly Asn Ile Thr Lys Asp Glu Pro Val Cys Ala Ile Lys Asn
l00 105 110
1
CA 02511436 2005-06-21
WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.ST25
Glu Glu Glu Met Ala Pro Asp Gly Cys Glu Asp Ile Val Val Lys Ser
115 120 125
Phe Ser Glu Ser Gln Asn Lys Asp Glu Glu Phe Glu Lys Asp Lys Ile
130 135 140
Lys Met Lys Pro Lys Pro Arg Ile Leu Ser Ile Lys Ser Thr Ser Ser
145 150 155 160
Ala Glu Asn Asn Ser Leu Asp Thr Asp Asp His Phe Lys Pro Ser Pro
165 170 175
Trp Pro Arg Ser Met Leu Lys Lys Lys Ser His Met Glu Glu Lys Asp
180 185 190
Gly Leu Glu Asp Lys Glu Thr Ala Leu Ser Glu Glu Leu Glu Leu His
195 200 205
Ser Ala Pro Ser Ser Leu Pro Thr Pro Asn Gly Ile Gln Leu Glu Ala
210 215 220
Glu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asn Leu Asp Pro Glu Asp Ser Cys Leu
225 230 235 240
Thr Ser Leu Ala Ser Ser Ser Leu Lys Gln Ile Leu Gly Asp Ser Phe
245 Z50 255
Ser Pro Gly Ser Glu Gly Asn Ala Ser Gly Lys Asp Pro Asn Glu Glu
260 265 270
I12 Thr Glu Asn His Asn Ser Leu Lys Ser Asp Glu Asn Lys Glu Asn
275 Z80 285
Ser Phe Ser Ala Asp His Val Thr Thr Ala Val Glu Lys 5er Lys Glu
2g0 295 300
Ser Gln Val Thr Ala Asp Asp Leu Glu Glu Glu Lys Ala Lys Ala Glu
305 310 315 320
Leu Ile Met Asp Asp Asp Arg Thr Val Asp Pro Leu Leu Ser Lys Ser
325 330 335
Gln Ser Ile Leu Ile Ser Thr Ser Ala Thr Ala Ser Ser Lys Lys Thr
340 345 350
Ile Glu Asp Arg Asn Ile Lys Asn Lys Lys Ser Thr Asn Asn Arg Ala
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Ala Arg Leu Met Thr Ser Glu Phe Leu Lys Lys Ser
370 375 380
2
CA 02511436 2005-06-21
WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.5T25
Ser Ser Lys Arg Arg Thr Pro Ser Thr Thr Thr Ser Ser His Tyr Leu
385 390 395 400
Gly Thr Leu Lys Val Leu Asp Gln Lys Pro Ser Gln Lys Gln Ser Ile
405 410 415
Glu Pro Asp Arg Ala Asp Asn Ile Arg Ala Ala Val Tyr Gln Glu Trp
420 425 430
Leu Glu Lys Lys Asn Val Tyr Leu His Glu Met His Arg Ile Lys Arg
435 440 445
Ile Glu Ser Glu Asn Leu Arg Ile Gln Asn Glu Gln Lys Lys Ala Ala
450 455 460
Lys Arg Glu Glu Ala Leu Ala Ser Phe Glu Ala Trp Lys Ala Met Lys
465 470 475 480
Glu Lys Glu Ala Lys Lys Ile Ala Ala Lys Lys Arg Leu Glu Glu Lys
485 490 495
Asn Lys Lys Lys Thr Glu Glu Glu Asn Ala Ala Arg Lys Gly Glu Ala
500 505 510
Leu Gln Ala Phe Glu Lys Trp Lys Glu Lys Lys Met Glu Tyr Leu Lys
515 520 525
Glu Lys Asn Arg Lys Glu Arg Glu Tyr Glu Arg Ala Lys Lys Gln Lys
530 535 540
Glu Glu Glu Thr Val Ala Glu Lys Lys Lys Asp Asn Leu Thr Ala Val
545 550 555 560
Glu Lys Trp Asn Glu Lys Lys Glu Ala Phe Phe Lys Gln Lys Lys Lys
565 570 575
Glu Lys Ile Asn Glu Lys Arg Lys Glu Glu Leu Lys Arg Ala Glu Lys
580 585 590
Lys Asp Lys Asp Lys Gln Ala Ile Asn Glu Tyr Glu Lys Trp Leu Glu
595 600 605
Asn Lys Glu Lys Gln Glu Arg Ile Glu Arg Lys Gln Lys Lys Arg His
610 615 - 620
Ser Phe Leu Glu Ser Glu Ala Leu Pro Pro Trp Ser Pro Pro Ser Arg
625 630 635 640
Thr Val Phe Ala Lys Val Phe
645
3
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WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.ST25
<210>2
<211>25
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400> 2
Met Ser Asp Glu Val Phe Ser Thr Thr Leu Ala Tyr Thr Lys Ser Pro
1 5 10 15
Lys Val Thr Lys Arg Thr Thr Phe Gln
20 25
<210>3
<211>28
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400> 3
Asp Glu Leu Ile Arg Ala Ile Thr Ala Arg Ser Ala Arg Gln Arg Ser
l 5 10 15
Ser Glu Tyr Ser Asp Asp Phe Asp Ser Asp Glu Ile
20 25
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Val Ser Leu Gly Asp Phe Ser Asp Thr Ser Ala Asp Glu Asn Ser Val
1 5 10 15
Asn Lys Lys Met Asn Asp Phe His Ile Ser Asp Asp Glu Glu Lys Asn
20 25 _ 3p
Pro Ser Lys Leu Leu Phe Leu Lys Thr Asn Lys Ser Asn Gly Asn Ile
35 40 45
Thr Lys Asp Glu Pro Val Cys Ala Ile Lys Asn Glu Glu Glu Met Ala
50 55 60
4
CA 02511436 2005-06-21
WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.ST25
Pro Asp Gly Cys Glu Asp Ile Val Val Lys Ser Phe Ser Glu Ser Gln
65 70 75 80
Asn Lys Asp Glu Glu Phe Glu Lys Asp Lys Ile Lys Met Lys Pro Lys
85 90 95
Pro Arg Ile Leu Ser Ile Lys Ser Thr Ser Ser
100 105
<210>5
<211>76
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400> 5
Ala Glu Asn Asn Ser Leu Asp Thr Asp Asp His Phe Lys Pro Ser Pro
1 5 10 15
Trp Pro Arg Ser Met Leu Lys Lys Lys Ser His Met Glu Glu Lys Asp
20 25 30
Gly Leu Glu Asp Lys Glu Thr Ala Leu Ser Glu Glu Leu Glu Leu His
35 40 45
Ser Ala Pro Ser Ser Leu Pro Thr Pro Asn Gly Ile Gln Leu Glu Ala
50 55 60
Glu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asn Leu Asp Pro Glu
65 70 75
<210>6
<211>31
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400> 6
Asp Ser Cys Leu Thr Ser Leu Ala 5er Ser Ser Leu Lys Gln Ile Leu
1 5 _ 10 15
Gly Asp Ser Phe Ser Pro Gly Ser Glu Gly Asn Ala Ser Gly Lys
ZO 25 30
<210> 7
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WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
<211> 83
<212> PRT
<213> Homo sapiens
s644PCT88.ST25
<400> 7
Asp Pro Asn Glu Glu Ile Thr Glu Asn His Asn Ser Leu Lys Ser Asp
1 5 10 15
Glu Asn Lys Glu Asn Ser Phe Ser Ala Asp His Val Thr Thr Ala Val
20 25 30
Glu Lys Ser Lys Glu Ser Gln Val Thr Ala Asp Asp Leu Glu Glu Glu
35 40 45
Lys Ala Lys Ala Glu Leu Ile Met Asp Asp Asp Arg Thr Val Asp Pro
50 55 60
Leu Leu Ser Lys Ser Gln Ser Ile Leu Ile Ser Thr,Ser Ala Thr Ala
65 70 75 80
Ser Ser Lys
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Lys Thr Ile Glu Asp Arg Asn Ile Lys Asn Lys Lys Ser Thr Asn Asn
1 5 10 15
Arg Ala ser Ser Ala Ser Ala Arg
<210> 9
<211> 54
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Leu Met Thr Ser Glu Phe Leu Lys Lys Ser Ser Ser Lys Arg Arg Thr
1 5 10 15
6
CA 02511436 2005-06-21
WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.5T25
Pro Ser Thr Thr Thr Ser Ser His Tyr Leu Gly Thr Leu Lys Val Leu
20 25 30
Asp Gln Lys Pro Ser Gln Lys Gln Ser Ile Glu Pro Asp Arg Ala Asp
35 40 45
Asn Ile Arg Ala Ala Val
<210>10
<211>32
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400> 10
Tyr Gln Glu Trp Leu Glu Lys Lys Asn Val Tyr Leu His Glu Met His
1 5 10 15
Arg Ile Lys Arg Ile Glu Ser Glu Asn Leu Arg Ile Gln Asn Glu Gln
ZO 25 30
<210>11
<221>54
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400> 11
Lys Lys Ala Ala Lys Arg Glu Glu Ala Leu Ala Ser Phe Glu Ala Trp
1 5 10 15
Lys Ala Met Lys Glu Lys Glu Ala Lys Lys Ile Ala Ala Lys Lys Arg
20 25 30
Leu Glu Glu Lys Asn Lys Lys Lys Thr Glu Glu Glu Asn Ala Ala Arg
35 40 45
Lys Gly Glu Ala Leu Gln
<210> 12
<211> 49
<212> PRT
7
CA 02511436 2005-06-21
WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
<213> Homo sapiens
s644PCT88.ST25
<400> 12
Ala Phe Glu Lys Trp Lys Glu Lys Lys Met Glu Tyr Leu Lys Glu Lys
1 5 10 15
Asn Arg Lys Glu Arg Glu Tyr Glu Arg Ala Lys Lys Gln Lys Glu Glu
20 25 30
Glu Thr Val Ala Glu Lys Lys Lys Asp Asn Leu Thr Ala Val Glu Lys
35 40 45
Trp
<Z10>13
<211>43
<212>PRT
<2l3>Homo sapiens
<400> 13
Asn Glu Lys Lys Glu Ala Phe Phe Lys Gln Lys Lys Lys Glu Lys Ile
1 5 10 15
Asn Glu Lys Arg Lys Glu Glu Leu Lys Arg Ala Glu Lys Lys Asp Lys
20 25 30
Asp Lys Gln Ala Ile Asri Glu Tyr Glu Lys Trp
35 40
<210>14
<211>41
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<.400> 14
Leu Glu Asn Lys Glu Lys Gln Glu Arg Ile Glu Arg Lys Gln Lys Lys
1 5 10 - 15
Arg His Ser Phe Leu Glu Ser Glu Ala Leu Pro Pro Trp Ser Pro Pro
20 25 30
Ser Arg Thr Val Phe Ala Lys Val Phe
35 40
8
CA 02511436 2005-06-21
WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.ST25
<210>15
<211>2575
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>
15
acttccttcgtctgggtggttgccccagcgacacgttgggccgaagagcggtgttgggta60
cccgagagacccggcggtggggaagtcacttcctcccgaagacgctgtttcctagcaacc120
gccctccgcctctgttattagcccctcctcctcgctcggtccaggaccggctctgcgggc180
gccgccaggcccagaccaagctactatcagaagttgaattctaataattagctattttat240
aaaggtaacgagaaaaaatacactatgtctgatgaagtttttagcaccactttggcatat300
acaaagagtccaaaagttaccaaaagaactactttccaggatgagctaataagagcaatt360
acagctcgctcagccagacaaaggagttctgaatactcagatgactttgacagtgatgag420
attgtttctttaggtgatttttctgacacttcagcagatgaaaattcagttaataaaaaa480
atgaatgactttcatatatcagatgatgaagaaaagaatccttcaaaactattgtttttg540
aaaaccaataaatcaaacggtaacataaccaaagatgagccagtgtgtgccatcaaaaat600
gaagaggaaatggcacctgatgggtgtgaagacattgttgtaaaatctttctctgaatct660
caaaataaggatgaggaatttgaaaaagacaaaataaaaatgaaacctaa-acccagaatt720
ctttcaattaaaagcacatcttcagcagaaaacaacagccttgacacagatgatcacttt780
aaaccatcaccttggccaaggagtatgttaaaaaagaaaagtcacatggaggagaaggat840
ggactagaagataaagaaactgccctcagtgaagaattggagttacattctgcaccttct900
tcccttccaacgccgaatggcatacaattagaagctgagaaaaaagcattctctgaaaac960
cttgatcctgaggattcatgcttaacaagtctagcatcatcatcacttaaacaaattctt1020
s
ggagattctttttcaccaggatctgagggaaacgcatctggaaaagatccaaatgaagaa1080
atcactgaaaaccataattccttgaaatcagatgaaaataaagagaattcattttcagca2140
gaccatgtgactactgcagttgagaaatccaaggaaagtcaagtgactgctgatgacctt1200
gaagaagaaaaggcaaaagcggaactgattatggatgatg.acagaacagttgatccacta1260
ctatctaaatctcagagtatcttaatatctaccagtgcaacagcatcttcaaagaaaaca1320
attgaagatagaaatataaagaataaaaagtcaacaaataatagagcatccagtgcatct1380
gccagattaa-tgacctctgagtttttgaagaaatctagttctaaaaggagaaetccatcg1440
acaactacctcttctcactatttagggactttaaaagtcttggaccaaaaaccttcacag1500
aaacagagcatagaacctgatagagcagataacataagggcagctgtttatcaggagtgg1560
ttagaaaagaaaaatgtatatttacatgaaatgcacagaataaaaagaattgaaagtgaa1620
aacttaaggatccaaaatgaacagaaaaaagctgctaaaagagaagaagcattagcatca1680
9
CA 02511436 2005-06-21
WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.sT25
tttgaggcctggaaggctatgaaagaaaaggaagcaaagaaaatagctgccaaaaagagg1740
cttgaagaaaaaaacaagaagaaaactgaagaagaaaatgctgcaagaaaaggagaagca1800
ctacaagcttttgaaaaatggaaagagaaaaagatggaatatcttaaagagaaaaataga1860
aaggagagagaatatgaaagagcaaagaaacagaaagaggaggaaactgttgccgagaaa1920
aagaaagataatttaactgctgttgagaaatggaatgaaaaaaaggaagcttttttcaag1980
caaaagaaaaaagaaaaaataaatgagaaaagaaaggaagaactgaaaagagctgagaaa2040
aaagataaagataaacaagctattaatgaatatgaaaaatggctggaaaataaggaaaaa2100
caagaaagaattgaacgaaaacagaagaaacgtcattcctttcttgaaagtgaggcactt2160
cctccgtggagccctccaagcagaactgtgttcgcaaaagtgttttgataattctagttc2220
ttacattatttggttatttatcggtttgccaatattagccatagatttaaaccattcaat2280
tatttatagttagaggaatatattttaattaaatgccagacactcctgctgacaatgaaa2340
gaaatactttggaatgtaatcagtgaaagcatttttttgaactgtagataaactgcctca2400
aacaaagacctaataatcagattgtttttaccattaagatacataagattttatcatgtc2460
ctgataattcttatggtggagtgattcatgatctttttcattaagctctgtatgttattt2520
aagtatatttaattccagtaataaaaaggaaatcatctaggtaccataaaaaaaa 2575
<210>16
<211>29750
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>
16
tctgggtgggagttgggcgggtcctgtctcctaggcaacagcacatgcacacaagcgacc 60
aataatgagcccctctccaaagacccaggaaggtgatgtcacttccttcgtctgggtggt 120
tgccccagcgacacgttgggccgaagagcggtgttgggtacccgagagacccggcggtgg 180
ggaagtcacttcctcccgaagacgctgtttcctagcaaccgccctccgcctctgttatta 240
gcccctcctcctcgctcggtccaggaccggctctgcgggcgccgccaggcccagaccaag 300
gtgagcagctcctacccgatgcttggctcttgattctcagggtcgcggagaactggccgc 360
gggcgtccggggccgggaacagaaagcgggacctgggggccatgggggatccggacagag 420
accgcgcttggacgtgcacgggcctggcgttcgctggtgctcagcatacggcgcggtgag 480
gagcggcgagcacccggacgtcacctggcctggtagggaacggaacccggggcgcacaac 540 _
gctatgggcggccctgccaggcctctgctccgagtacgggaaaccgcgattttaatgcgg 600
ctcatcgcgaaagcttcgtcgttttgtctggctctctttaacacttttgtgagaggaaaa 660
attggcttgcaatacatctcgctggctgtttgcgggttagcattacgatctttttctttg 720
aatagcgctgtatgcaaatatatagatacattttttttttggtggtggtgctcataattt 780
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ttacgccgac gatccttttg atggcctttt aaataagacg tgacttattt tgaaggcaat 840
gttatacttt agaagagagg tgaaaaataa ggtgttctat tttaattggc agcattttgt 900
cgtattaact tgtaatcatt tatttgcaga ctttttaagt agttgcaaaa ctattttagg 960
ataacttcca tttgaatttt tttaaacaag cttgttatga gaatttgcta tttctttaca 1020
agaacctttt taagtgaaga tgtagcccaa tgttcatatc agatgctttt ctttgacctt 1080
tgtggggaga gtagaatcaa atgtaataaa ataaattctg aagcatgcga agtctgattt 1140
gttttgtata tttcagctac tatcagaagt tgaattctaa taattagcta ttttataaag 1200
gtaacgagaa aaaatacact atgtctgatg aagtttttag caccactttg gcatatacaa 1260
agagtccaaa agttaccaaa agaactactt tccaggtaaa gtatttttat ttggaatcat 1320
ttcacagtgt aaacactgta ttagatgggt tgaaattggt gattctagaa cagtcctata 1380
taaagcaggg gtaaatctta tattactttt gaggttttgc acatgatcat gtttgggctc 1440
catccagtat tacaaactcc cctatatggt tttaagacta ccaaagtagc ctcaatacta 1500
gtttcctact aagttaaaag ttgaatcgca accttaaatt gccattttta tataaaaact 1560
tttttttctg ttgtaacata atgtttaagt ttttttttct gttgagtcac tgcaattttg 1620
aactcagcct ctaagtttgc aatattgatt gcatccattt ctgaaatatg ccgagacaaa 1680
agctcttaaa aataccaatt tctttcaaaa taccagtttt taataaatta taatctaaat 1740
tgagcccctt cttatttgtt accctccagc tctaattata acctgcaatt aatttgttcc 1800
ataatgtgtg tctcctctag ttaaactgcg agctccatga ggaagggctc ttgtctgtga 1860
tgctctgcat tgagtatgag gcgtaaagtg ggtacatggc ataaagtgag cttgcaggaa 1920
atatttgtta gatgaatgaa acctaagttt gaaagcagtc gttaatcaag cattgtttgt 1980
ttaaagaatt acttgtgaat atgatacctc catgtttgga tggaaattga tttcagtatc 2040
tcatttcagg atgagctaat aagagcaatt acagctcgct cagccagaca aaggagttct 2100
gaatactcag atgactttga cagtgatgag attggtatgt gacagtatgg aaacgtgaac 2160
cacttttctt ctttttgctt ccttagtttt gtatttagcc agccccccaa ccacccatcc 2220
cctcaatcac gtatgttaaa ataataccta agcattcact aattttagat tttcaacttt 2280
ttaattagta gaaagccact cttaattttc aggaagttgt atgattttct ttttttattg 2340
ttgttttgtt ttctgaatgt gtatacgaaa atataaatta attgatggca ggtttgcagt 2400
aaaaggatgg ctgccagtgg taaaccacat tgaagaagac aggttcatct ttaagatcaa 2460
ccctaggagg tgctacagct agttagtaac tagtcccaca gaactaaact tcggtgcaca 2520
ttagaagtgç ttttataaag cttgctataa atcagatttt ttttggctgt gataaggggt 2580..
aaatttaaaa accacagact cttcgtgttt catatatcag tactattata atttggtttc 2640
tcttagctat gtaaacatat taacatttta gtttcaggta taagcataca gaattctaaa 2700
cttggtgttt ttgtttgttt gtttttgttt ttgagatgga gtctcgctca gttgctcaag 2760
ctggagtgca gtggtgcaat ctcggctcac tgcaacctcc acctcccagg ttcaagtgat 2820
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tctcctcctt cagcctcctg agtagctggg actacaggtg cccgccacca tgcccggcta 2880
atttttgtat ttttagtaga gatggggttt caccacatcg gccaggctgg tctcgaactc 2940
ctgaccttgt gatccgcccg cctcagcctc ccaaagtgct gggattatag gtgtgagcca 3000
ccgcacccgg cctggtgttt tattctttaa aatttggtga ataattgtaa ttgatttctg 3060
taaaaccagt aataaccaca gttaaatcac tgctgtatag ttaacttagc atttcttatg 3120
attcttagta aatctaatat tctggtgtgg atggaattgt agttccaaaa tttttatgga 3180
aaaaatataa ttagtaatta ctaattaaat tcttccattt acaaatgttc ttgattttac 3240
atgaagaagt aatttgcaaa taaaagtttt acagtccata atctaattta aatgctacat 3300
gactgattgt tagggacctt tggatggctt tttccagagc aaacagtgtt tggttgtttg 3360
gtaccctaca gacaacacaa taaatacatt ttgaataaat taatgaaatt ggaattttta 3420
tttcataaat gttaatgaga cgtgcctgag ttagctgtgt ttttagagct gcaagtctat 3480
ttataaaata catttgtgcc tattcattgt tagaattttg tttgtagctt ttaaggtaaa 3540
ctttgattaa gttaacgtaa ccttgacaat ttttaaaaat actgttgaaa acatttttct 3600
tttccatttt tcagtttctt taggtgattt ttctgacact tcagcagatg aaaattcagt 3660
taataaaaaa atgaatgact ttcatatatc agatgatgaa gaaaagaatc cttcaaaact 3720
attgtttttg aaaaccaata aatcaaacgg taacataacc aaagatgagc cagtgtgtgc 3780
catcaaaaat gaagaggaaa tggcacctga tgggtgtgaa gacattgttg taaaatcttt 3840
ctctgaatct caaaataagg atgaggaatt tgaaaaagac aaaataaaaa tgaaacctaa 3900
acccagaatt ctttcaatta aaagcacatc ttcaggtaat ttgttaggat tactgtaatt 3960
gcatttcttg gaagtttatt ttaagataat cagtcccaaa atttttatat ggtagctagt 4020
atatatttaa gaaaaaaaga cagacttaac ttccatttta cagacctgtt gtattttgtc 4080
taacttcaat tttacagacc tgttgtattt tgtctaactt caattttaca gacctgttgt 4140
attttgtctt gcatctaggc tgttgcctga tagaaagcca aagcacaaag ccaaagcacc 4200
tttagtcatc catagcatcc atagctgtgg atctccagac acctagacct gtgagcttca 4260
gttttgtttg taggtgtgga actggaatgg aatgctgtct aatccctctc acactccaaa 4320
gattagagtt acagcaatat tgagactaat ccttctaaca gtctttgcca taccaacatt 4380
gtgccagaaa attttcttga catttgtata tttgaaggat gagttatgtt attgctgctg 4440
ttgtttgttg aagcatccag gcactcctta agagaatctc catttgatct ctgtattgcc 4500
tatgaaaatc tactaagatt cagttttcca aaggaaagtt cctggtgtga tctgggatta 4560
cagttagttc tgcccacaat tttactgaat-tttaagcata aaggaacaaa.gatagaatga 4620
aacggagacc aagtcctgtc acataccctg ggccaccatt catgaacttg tatatgcaag 4680
gttaaggatt ttttgttttt cattctttgt attttataaa ggaattatta gttgatgtta 4740
accttcataa aaatctcctt gcatatcatc agtaaataca gtgctggtaa atatttcata 4800
ctttgcatat tagataccag tggtaacgtc agacaaaact ttatttcagg catgtattgg 4860
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ggaactgctc ctttcttcct gaccccacaa tctcattaac tttgaaatga gcaaaggatg 4920
taagcagagc aaagaacact agaataatat ccaggacact gggggaaagg cctctgtata 4980
ttatatatga cttcagcaaa taagttaagc ttcagtatcc tcatgatgag gaagctaaaa 5040
ataaccctct ttctattcct gcaaaattgt gagagtttat tgaagtgcat ctcataaact 5100
ataaaaaact acaaaaatgc aaacagatgc ataatgaaac aattaacttg ttaaaatgta 5160
ccttctaagt atagtgagtg aaatcaatgc tggagagaag aggaacataa ttgaacttcg 5220
ttattaagaa aatgcgagca tatatagcaa ctaaaaattt gtctgagaca ggtggatgta 5280
tataattaga agtttatggt agataatcag gaaagcaata atccacctat ttcatacctt 5340
aaaaaaaaaa aaaacctgtg gtgggttaca atgaataaga aaatactgta ttttaaccac 5400
aaggtggcat caggatccta aatgctctac ttatatatgc aatgttatat tcagtacgtg 5460
taatataaaa ataattacct aaataggtaa ttgtatacat tgattaccaa aaaaagcgct 5520
tttcttaaag tataggcatt tttttttctt tttgggaact tgacagtact tctggaagtg 5580
gaatttttgt agaaaatata ttaaagttgt cattctcagg ttcttcaggt tgaaaagtaa 5640
aaattgaggc tagtgttcct aagataatat ctggcatata taataagtat ttaaatgaat 5700
aaattaatat atgaatgatt tatctttgaa agagggaata tggttcatga gtttatcctc 5760
taaattcttt gacttttttt ttttctgtac aggtttggaa ctcaatgttt ttaatgtggt 5820
gagatattgc tgagtagcaa gtaatgcttt atgaaactat tagagcttga aggttttctc 5880
tgtccttgct tgtcttttgt aaaaagtata ataaccagac tttatagtca ctactgaagt 5940
gacagttgct ctataaagtg aaagtatttt tcacaggata tgtttttatt ttaatactaa 6000
catgactgaa atcatgaact ttggagtcag gatgcttctc ctttaatctg agatctgcag 6060
cctgctagag tttgtgactt tgggcatgag acctctttgt tctcatttta ttcatcttta 6120
aaaacgggat aatagttgcc tgcctctagg agtttgaggc aattaaatga gttcacatat 6180
ttgaagtgct tagaatagta ctggcataaa tttagcactc tataaatgtt ctgattattc 6240
attttattat ttagcgtttg tttataaaca tgctcagcag gtataaagta tcagtcatgc 6300
gggatgcgta agttctagag atctgctgta cattgtgcct atagttaaca gtactgtctt 6360
ttgcactgaa tgtattaaga aggtagatct catgtttgtt cttaccacaa taataaaaaa 6420
aattgactca acaccttctt tçaggcatta tataatattc tgcttaaact gaggctcaaa 6480
agacatgcaa gcatttgtca ggaggagaag caggaagtgg atattctagg cagggggatc 6540
agcttaggta aaggtatggt agcaggaggg attggaggga ttgtggtatg tgtgcatgac 6600
aactgttagc ccagçatttc agaaacacag atgacaaaat ggctgtagat aaggcagtga- 6660
aggacaaaac cataaaatcc gttttatgtt gtttaaaggc agttaagctt ttattctgta 6720
ggattggatc atggggagcc attgaataat tttgtagaaa ggagtgatgt gatctgattt 6780
ggattttgta aatatcatgg aagcagtgat ctaggaaaga gtggataagg acccgacagc 6840
agggatgtag aaagtggaat aaatgagata tttggcaatt agaattgata ggatatattg 6900
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atactctgga tttaggggat aatagaggga ggaatctaga gcccttggat ttggggttga 6960
acatttggct ggagtttagg atgtagctaa aattgtcagc tacttataat aataccaatt 7020
tggtatggtt gtggaatctt ctggcagaat ccataagccc atttttaggt aaatgggagg 7080
aagatgttaa ttagaccaat tttgaagttg agaaaaatgc atttgtagaa caatagaaac 7140
ataaatatgt atagcaggta aaatgcaggc aaaaaatata tacatggaaa gtcttcccat 7200
tgtttcgaat actggatgca aatcagcatt tgattcttga tttaaactta gaagtaatgg 7260
aaagagtgaa attttaataa atgctaaaga agttttatgg actcagaaca âttaactcat 7320
aaaagattcc ttcctctaat gagagttagc actcctatcc cttgagtgcc aacatcatca 7380
tctttgtcct tataatagca cttataatct tagtaatcta gtcttgtaat tttgtttaga 7440
aaaatcaacc tgtaaagtac ctggacaggt ccattgccgc tttgttgatt atgaggttta 7500
gtaacgtgta cagggcttgg tactcaaagg cttgatggat gagcctcctc attttatagt 7560
ggtagaaact ggggcaagat tttgttttgt ttttttattt ttaacatttt ttttttaata 7620
ttataagagt tcacaatgtt gaagagttaa cttcttgtga ctggttactt tcaggatgac 7680
aactgtttct ttactttgtt ttttttttgt tgttgttgtt gtttggtttt tttttttttt 7740
ttagatggat ttttgctctt attacccagg ctggagtgca gtggtgtgat ctcgatctcg 7800
gctcactgca acctcagact cctgggttca agcaatcctc ctgcctcagt ctcctgagta 7860
gctgggatta caggcacgcg ctactaagcc cggctaattt ttttgtattt ttagtagaga 7920
cagggtttca ccgtgttagc caggctggtc tcgaactcct gacctcatga tctgcccacc 7980
tcggcctccc aacgtgctgg gattacaggc gtgagtcacc gctcccaaca tgtcgggatc 8040
acaggcgtga gccaccgcgt ccggcctgat tattaaccat catttatttg tgccttacta 8100
gagctctgta tagagaagag ttgtgggctt catctggact cttcaggaca gagaacaaag 8160
gggcataggc acaggaggga agtatggtag cacccagaga gatagataaa gccatggtca 8220
tttttttata cacacacttt aagcatttta tttttcagca gaaaacaaca gccttgacac 8280
agatgatcac tttaaaccat cacctcggcc aaggagtatg ttgaaaaaga aaagtcacat 8340
ggaggagaag gatggactag aagataaaga aactgccctc agtgaagaat tggagttaca 8400
ttctgcacct tcttcccttc caacgccgaa tggcatacaa ttagaagctg agaaaaaagc 8460
attctctgaa aaccttgatc ctgaggttag cactaccact aaactgttga attgtgttct 8520
tgaatttatg cttttttatc tgattatgaa aaagagaagg agagaatgaa tttgtgtgcg 8580
tgtgtgtgtg ttttacatac tttcttctgc aactgataag gaaataattt ttaaaaatac 8640
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cactaaggaa gaaggaaatg catccaatta aactataaca caccagtgat tgtagagttt 8760
atccagtttt agagaaagta aaatgtcaaa aagtgttgct tttctgaatc tatataatag 8820
tgtttatctt taataatttt ttaaatttat gtatctttga attatgtaat ttatggctaa 8880
gaacaatata gtcagtgtca ttttatttat ttgattttat tcactcaaca aatgtgtgtt 8940
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gaatgttcat ggcactcttc tgtgttcttt gggttatgtt ccaatagcat taaatgtggc 9000
ctttcaggtt tccatcaggg aatttactat gcattgttat taagggagaa cacttcgttt 9060
ttctctttgt atttcactat gagaagcaaa ctgtcccttc tgaacatttc agaagggaaa 9120
agtacaggaa gaacatttct tccccataat ctgcttgggc agattaggga actgcatgcc 9180
acctggccaa gcttctttct ttttctcatc gcttgtctgc agtgttggtg cttaaggatc 9240
tgctctctgg gaggtgaggc agaaggtgct gagaggagct cttttgtgca atgactaaat 9300
gggggaatcc ccctaattca gactggaagt attaggaagc acaataggct accaattcaa 9360
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caccaccatg ctgtttctta atttgttctg aaaacçagaa gaagaaaccc aagcaaatac 9480
tttatattta agaaaattat ctgatccatt gaatattgtg ctagtttctt gtagctgctg 9540
taacaaattg ccacaaactg gttaacttaa aacaacagaa atgtattctc ttagttctgg 9600
aggtcagaag tccaagatca aggtgtttgc agggccattt tcctctgaag gcatcacgga 9660
agaatccttc cttgcctctt ccagcttctt tctagtggtt gccagcagtc catggcattc 9720
cttggcttgt agctggcttg tagctgcatc attcccttct ctgccttcat cccatgtggc 9780
cttcttccct gtgttttctc tgcatgtctg tgtctcttct ttctcttaaa aaaagacacc 9840
aggcattgga tttagggccc accctaattg agtgtgtcct catcttatct atttaaagct 9900
gtaaacacct tatttcctaa gaaagtcgta ttttgaggtt ctggatgaac atgaattttg 9960
gggcattaat gttcgtatgt taaacctagc attcccggga taaactctgg ttagtcatgg 10020
tgtgatattt tattgtggga tgtgatttgt taaaattgtg ttaaggtttg catctatatt 10080
tatgaagtct attggtctgt aatttttttc ttataatgtt accatcaggc ttgggtatca 10140
aatgagttgg ggagtgtctt ttcttcattt tataaaagtt tggtatcatt attttcttaa 10200
atgagaggat tcaccagtac aattatctgg gcctggaatt ttctgtgtgg agacatcttt 10260
ggcattacat ttgatttttt aaataggtat ttcagtactc acattttctg ttttgccagt 10320
ttggtaattg tgtctatcaa gaagtttgtc catttcatct gatatgttga gtttataaac 10380
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tttatttcta acatatataa tttgtgtttt gtgtctttcg tgctaaatct tgataggcat 10500
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ctaataattt tctctattgt ttgtttaatt gattttcagt attatttcag tattattcag 10680
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ctgacatcgt gatccaccca cctcggcctc ccaaggtgtt gggattacag gcgtgagcca 10980
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cggcgcctgg cctcttttac tttcttttgg tttaatttgc ttatctttag atttgaaaat 11040
tttctcattc atttttaaga ttttcgtgat ttctgctaaa cctgttgaaa ggtgtaaact 11100
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aaccttggaa taatatagtt ccatatactc cctcatccat tgtgctattg tcatatatta 12360
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tttgactgca tggtgcctgg gtctagcttt ctttatgttt attctgcttg acgtttgttg 13080
agctttccaa acctataagc tgatactgtc tgtgaaatgg gaagattgtt atttcccacc 13140
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agattgaata acttgtatta cttagtcttc acgtttacag attgtggtcc ggagaatgta 13320
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ttatttcact tattgtggtg ttcaacttca gattttctat tggtattttt tctgtttttt 13500
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CA 02511436 2005-06-21
WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.sT25
cttttcttcc gcctagctag atggtctgtc tctaaaatat taaaatgatt gaagatgatc 27360
taattacagc tttgcttttc tcaattaaaa ttctgaaagg aagtttcctc tttgccttat 27420
tagaaatagc aagcaaacaa acatgcaagc attcttatga catggaatga ggatatgggt 27480
gttaacattg acaaaaaaca aacaaacctc ccacttcact ttgtttgtta catgtgaatg 27540
gaaagcttgt cctgtattgc catattattc ttgtggcatt tatatatata ctgatgaaaa 27600
gatgcataca tacctaatca ttttccataa tgcctttcct cccaagccat caacctgcag 27660
aggcaggttt cactaagggt tttcctgctc cttgaggaat atgagaaaaa taccaagatg 27720
aagaaaccac caaaccttat agtgttagca gagacataaa gggacacctg gtgcccctct 27780
tccatttctt gtctcctgcc ttctgccaag ccttagtcac aatggatatt tttgtttcct 27840
cccacagcac acattttttt tcccactctc agagccctca ccactactgt ttgcaagcaa 27900
agctcttccc cgatatttat cacgagtggc ttctcttatc catcatgtca cacttcaaag 27960
ggactttccc tgagtccatt ttttgttgaa agtaaatact cttttttatt ccttctcata 28020
gttttaaaac atgtttcaga gaaattcaca caatttggaa ttatctgttg tttattttct 28080
ttgtttctgt ccattttgaa agttccctgg gggacaggga ccatatctgt gtgttgggat 28140
tttaaaaaat tatttttatt tgcaaatgac acataaaaag tgcacatatt tatggaatac 28200
agtgtgatgt ttccatctac attgtataca ttgtgtaaca atcagaaatg actcacaaag 28260
gtaggcaaaa tgtttgatgc aaagatatca ttaatattta ttataggaaa gtacacaaat 28320
tactaaaaat taaaggcaaa taccatacat ttaaatgggc caaataattg agcagaaaat 28380
ttacaaaagg ctaaagaaat gtttgaaaat gtgctcaagt tcaataataa agaaacatga 28440
ggcagaattt ttaactattt gtaaaaaatt tgaagtatct catactgtca tgacatattg 28500
aaactttgca cccagtaaac ttacttctga gaatttgttc tcacgaagtc accaccaact 28560
tataacagtt actatatttg agttataatt ataggtcttt ttttctattt tatacaattc 28620
ttttttaatg ttttcacttt taaagtttaa aaaattaagt gatattagta cttgcaaatt 28680
gacaatgttt actaattttt ttcttgtttc cattttttgt ttgtttgttt ttttgagaca 28740
gggtctcact ctgttgccca ggctggagtg cagtggtgca atctcggctc actgcaacct 28800
ccacctccca ggctcaagca atcctcccat ctcagcctcc taagtaggtg ggactatagg 28860
catgcaccgc cacacctggc taatttttgt gttgttttgt agagatgatg tttcaccatg 28920
tttcccaggc tggtctcgaa ctcccaggct caaacaatcc acccacctta gtctcctaaa 28980
gttctgggat tactggcatg agccaccatg cctggcccta cctgttattt ctttatgatc 29040
tgttaaacta ggaagtgata tataaatate ctataatgga ttattttgtt-cttcagcaag- 29100-
caacctgatt tgaaaataat aatcatatat gtacataaat ttatagtgtt ctattttctc 29160
tttaggaaaa taaggaaaaa caagaaagaa ttgaacgaaa acagaagaaa cgtcattcct 29220
ttcttgaaag tgaggcactt cctccgtgga gccctccaag cagaactgtg ttcgcaaaag 29280
tgttttgata attctagttc ttacattatt tggttattta tcggtttgcc aatattagcc 29340
24
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atagatttaa aaccattcaa ttatttatag ttagaggaat atattttaat taaatgccag 29400
acactcctgc tgacaatgaa agaaatactt tggaatgtaa tcagtgaaag catttttttg 29460
aactgtagat aaactgcctc aaacaaagac ctaataatca gattgttttt accattaaga 29520
tacataagat tttatcatgt cctgataatt cttatggtgg agtgattcat gatctttttc 29580
attaagctct gtatgttatt taagtatatt taattccagt aataaaaagg aaatcatcta 29640
ggtaccataa tgatagaaat tattcctttt gtggatgatt gtgaatctag attcaggttt 29700
ttaaatgaag ggtcgctggg aagtgcgcat atattattcc ttctgaaact 29750
<210>17
<211>200
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400> 17
acttccttcg tctgggtggt tgccccagcg acacgttggg ccgaagagcg gtgttgggta 60
cccgagagac ccggcggtgg ggaagtcact tcctcccgaa gacgctgttt cctagcaacc 120
gccctccgcc tctgttatta gcccctcctc ctcgctcggt ccaggaccgg ctctgcgggc 180
gccgccaggc ccagaccaag 200
<210>18
<211>139
<Z12>DNA
<213>Homo sapiens
<400> 18
ctactatcag aagttgaatt ctaataatta gctattttat aaaggtaacg agaaaaaata 60
cactatgtct gatgaagttt ttagcaccac tttggcatat acaaagagtc caaaagttac 120
caaaagaact actttccag 139
<Z10> 19
<211> 85
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
gatgagctaa taagagcaat tacagctcgc tcagccagac aaaggagttc tgaatactca 60
gatgactttg acagtgatga gattg 85
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<210>20
<211>321
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>
20
tttctttaggtgatttttctgacacttcagcagatgaaaattcagttaataaaaaaatga 60
atgactttcatatatcagatgatgaagaaaagaatccttcaaaactattgtttttgaaaa 120
ccaataaatcaaacggtaacataaccaaagatgagccagtgtgtgccatcaaaaatgaag 180
aggaaatggcacctgatgggtgtgaagacattgttgtaaaatctttctctgaatctcaaa 240
ataaggatgaggaatttgaaaaagacaaaataaaaatgaaacctaaacccagaattcttt 300
caattaaaagcacatcttcag 321
<210>21
<211>227
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400> 21
cagaaaacaa cagccttgac acagatgatc actttaaacc. atcacctcgg ccaaggagta 60
tgttgaaaaa gaaaagtcac atggaggaga aggatggact agaagataaa gaaactgccc 120
tcagtgaaga attggagtta cattctgcac cttcttccct tccaacgccg aatggcatac 180
aattagaagc tgagaaaaaa gcattctctg aaaaccttga tcctgag 227
<210> 22
<Z11> 94
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
gattcatgct taacaagtct agcatcatca tcacttaaac aaattcttgg agattctttt 60
tcaccaggat c-tgagggaaa cgcatctgga aaag -. -- 94 - --;
<210> Z3
<211> 248
<212> DNA
26
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<213> Homo sapiens
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<400>
23
atccaaatgaagaaatcactgaaaaccataattccttgaaatcagatgaaaataaagaga60
attcattttcagcagaccatgtgactactgcagttgagaaatccaaggaaagtcaagtga120
ctgctgatgaccttgaagaagaaaaggcaaaagcggaactgattatggatgatgacagaa180
cagttgatccactactatctaaatctcagagtatcttaatatctaccagtgcaacagcat240
cttcaaag 248
<210>24
<211>71
<212>DNA
<Z13>Homo sapiens
<400> 24
aaaacaattg aagatagaaa tataaagaat aaaaagtcaa caaataatag agcatccagt 60
gcatctgcca g 71
<210>25
<211>169
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400> 25
attaatgacc tctgagtttt tgaagaaatc tagttctaaa aggagaactc catcgacaac 60
tacctcttct cactatttag ggactttaaa agtcttggac caaaaacctt cacagaaaca 120
gagcatagaa cctgatagag cagataacat aagggcagct gtttatcag 169
<210>~26
<211>90
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400> 26
gagtggttag aaaagaaaaa tgtgtattta catgaaatgc acagaataaa aagaattgaa 60
agtgaaaact taaggatcca aaatgaacag 90
<210> 27
27
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<211> 160
<212> DNA
<213> Homo sapiens
s644PCT88.5T25
<400> 27
aaaaaagctg ctaaaagaga agaagcatta gcatcatttg aggcctggaa ggctatgaaa 60
gaaaaggaag caaagaaaat agctgccaaa aagaggcttg aagaaaaaaa caagaagaaa 120
actgaagaag aaaatgctgc aagaaaagga gaagcactac 160
<210>28
<211>146
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400> 28
gcttttgaaa aatggaaaga gaaaaagatg gaatatctta aagagaaaaa tagaaaggag 60
agagaatatg aaagagcaaa gaaacagaaa gaggaggaaa ctgttgccga gaaaaagaaa 120
gataatttaa ctgctgttga gaaatg 146
<210>29
<211>133
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400> Z9
gaatgaaaaa aaggaagctt ttttcaagca aaaggaaaaa gaaaaaataa atgagaaaag 60
aaaggaagaa ctgaaaagag ctgagaaaaa agataaagat aaacaagcta ttaatgaata 120
tgaaaaatgg ctg 133
<210> 30
<211> 485
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
gaaaataagg aaaaacaaga aagaattgaa cgaaaacaga agaaacgtca ttcctttctt 60
gaaagtgagg cacttcctcc gtggagccct ccaagcagaa ctgtgttcgc aaaagtgttt 120
tgataattct agttcttaca ttatttggtt atttatcggt ttgccaatat tagccataga 180
28
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tttaaaaccattcaattatttatagttagaggaatatattttaattaaatgccagacact240
cctgctgacaatgaaagaaatactttggaatgtaatcagtgaaagcatttttttgaactg300
tagataaactgcctcaaacaaagacctaataatcagattgtttttaccattaagatacat360
aagattttatcatgtcctgataattcttatggtggagtgattcatgatctttttcattaa420
gctctgtatgttatttaagtatatttaattccagtaataaaaaggaaatcatctaggtac480
cataa 485
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Amorce
<400> 31
atgtctgatg aagtttttag tact 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Amorce
<400> 32
aggcctcaaa tgatgctaat gc 22
<Z10> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Amorce
<400> 33
atcatttgag gcctggaagg c 21
29
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<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
s644PCT~~.5T25
<220>
<223> Amorce
<400> 34
aaacactttt gcgaacacag ttc 23
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Amorce
<400> 35
acaacgaata acagagtgtc c 21
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Amorce
<400> 36
actcctgata aacagctgcc 20
<Z10> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Amorce
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<400> 37
gccaccatgt ctgatgaagt ttttagcac 29
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Amorce
<400> 38
gaaacacttt tgcgaacaca gttc 24
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Amorce
<400> 39
taatgtctga tgaagttttt agcacc 26
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<ZZO>
<223> Amorce
<400> 40
tcaaaacact tttgcgaaca cagttc 26
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
31
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<220>
<223> Amorce
<400> 41
aatgtctgat gaagttttta gcacc 25
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Amorce
<400> 42
tcagcttgcc gtaggtggc 19
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Amorce
<400> 43
atggtcctgc tggagttcg 1g
<210> 44
<211> 391
<212> DNA
<213> Murinae gen. sp.
<400>
44
aaagaagtgaagacagaaacacgaagaataaaaagacaacgaataacagagtgtccagtg 60
cctctggcaggctgatgacctctgagtttttaaagagatccggtcccacaaaaagaagtc 120
catctgcagctacctcctcacactatttagggagtttgaaagtcttggaccagaagcaac 180
cacggaagcagagcctagagccagacaaggctgatcacataagggcagctgtttatcagg 240
agtggttagaaaagaaaaatgtgtatttacatgaaatgcacagaataaaaagaattgaaa 300
gcgaaaacttgaggatccaaaatgaacagaaaaaagctgctaagagagaggaagccctgg 360
catcatttgaggcctggaaggcaatgaaaga 391
32
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<210>45
<211>2767
<212>DNA
<213>Mus musculus
<220>
J
<221> CDS
<222> (204)..(2147)
<223>
<400> 45
gttgggtacc agtcacttcc tcccggggac
60
caagagacca gctgttgcct
ggcggttgga
agcaaccgcc ccgcctccag gttattccaa
120
ttctgcctcc tacctggttt
atcttttgcc
cccagaccgc cacctgtgct agagcatagc
180
gaggcccggg cgctgggttc
ccgggggcga
tcagcagaga c 233
aaaaggacac gat
acc gaa
atg atc
tc ttc
agc
aca
act
ttg
Met e
Ser Phe
Asp Ser
Glu Thr
Il Thr
Leu
1 5 10
gcgtacacc aagagt ccaaaggct accaagaga acttccttt caggat 281
AlaTyrThr LysSer ProLysAla ThrLysArg ThrSerPhe GlnAsp
15 20 25
gagctgatc agagcc attacagcc cggtcagcc aggcagaga agttcc 329
GluLeuIle ArgAla IleThrAla ArgSerAla ArgGlnArg SerSer
30 35 40
gaatactcc gatgac tttgacagt gacgagatt gtttcttta ggtgaa 377
GluTyrSer AspAsp PheAspSer AspGluIle ValSerLeu GlyGlu
45 50 55
ttttcagat acctcg acagatgaa agtctagtt agaaaaaag atgaat 425
PheSerAsp ThrSer ThrAspGlu SerLeuVal ArgLysLys MetAsn
60 65 70
gattttcat atatcc gacgatgag gaaaaaaat tctccaaga ctgtct 473
AspPheHis IleSer AspAspGlu GluLysAsn SerProArg LeuSer
75 80 85 90
tttttgaaa accaag aaagtaaac agggcaata tccaacgat gctctg ~
521
PheLeuLys ThrLys LysValAsn ArgAlaIle SerAsnAsp AlaLeu
95 100 105
gactccagc actccg ggcagcgaa ggctcgtca ccggatgct caagaa 569
AspSerSer ThrPro GlySerGlu GlySerSer ProAspAla GlnGlu
110 115 120 -
gatgtgact ggagat tccctcccc aaatctcaa aatgatgat cgagaa 617
AspValThr GlyAsp SerLeuPro LysSerGln AsnAspAsp ArgGlu
125 130 135
gtcggcaga gagatc atcacagtg aagcctaca cccaggatg cacccc 665
ValGlyArg GluIle IleThrVal LysProThr ProArgMet HisPro
140 145 150
33
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s644PCT88.ST25
gtcaaa agaagcacg tcctcgggg gaaaccagc agcggtctt gatgca 713
ValLys ArgSerThr SerSerGly GluThrSer SerGlyLeu AspAla
155 160 165 170
gatggc cactttaag ccttcaccc cagccaagg agcatgtta aaaaag 761
AspGly HisPheLys ProSerPro GlnProArg SerMetLeu LysLys
175 180 185
agcagc cacactgag gagggagtc agacc gga gttgataaa gaacat 809
SerSer HisThrGlu GluGlyVal ArgProGly ValAspLys GluHis
190 195 200
tccata agcgaagcc tctgctccc acaccttcc cttccaagg cagaat 857
SerIle SerGluAla SerAlaPro ThrProSer LeuProArg GlnAsn
205 210 215
ggcaca gagttgcaa actgaggaa aaaatatac tcggaaaac ctcgat 905
GlyThr GluLeuGln ThrGluGlu LysIleTyr SerGluAsn LeuAsp
220 225 230
cttgag gactcactc ttacaaagt ctgacctca tcttccttc aaagaa 953
LeuGlu AspSerLeu LeuGlnSer LeuThrSer SerSerPhe LysGlu
235 240 245 250
agcccc ggaggttgc acatcacca ggatctcag gaaaaggtg cccata 1001
SerPro GlyGlyCys ThrSerPro GlySerGln GluLysVal ProIle
255 260 265
aaagat catgatgga gaacctact gaaatctgg gattccttg ctatca 1049
LysAsp HisAspGly GluProThr GluIleTrp AspSerLeu LeuSer
270 275 280
aatgaa aatgaagga agttctgtt ttggtgaac tgtgttact cctgaa 1097
AsnGlu AsnGluGly SerSerVal LeuValAsn CysValThr ProGlu
285 290 295
ctcgag cagcccaag gacggtcag gtggcagct gacgacctt gaggaa 1145
LeuGlu GlnProLys AspGlyGln ValAlaAla AspAspLeu GluGlu
300 305 310
gaaaga gagaagggt ggatttaca gaagatgac ctcaccact gacccg 1193
GluArg GluLysGly GlyPheThr GluAspAsp LeuThrThr AspPro
315 320 325 330
ctgctc tccacgtcc ccgagtgtc ataacaccc actgagcca gcagag 1241
LeuLeu SerThrSer ProSerVal IleThrPro ThrGluPro AlaGlu
335 340 345
ccggcc aagaaagca aatgaagac agaaacacg aagaataaa aagaca 1289
ProAla LysLysAla AsnGluAsp ArgAsnThr LysAsnLys LysThr
350 355 360
acgaat aacagagtg tccagtgcc tctggcagc aggctgatg acctct 1337
ThrAsn AsnArgVal SerSerAla SerGlySer ArgLeuMet ThrSer
365 370 375
gagttt ttaaagaga tccggtccc acaaaaaga agtccatct gcagct 1385
GluPhe LeuLysArg SerGlyPro ThrLysArg SerProSer AlaAla
380 . _ 385 390
acctcc tcacactat ttagggagt ttgaaagtc ttggaccag aagcaa 1433
ThrSer SerHisTyr LeuGlySer LeuLysVal LeuAspGln LysGln
395 400 405 410
ccacgg aagcagagc ctagagcca gacaaggct gatcacata agggca 1481
ProArg LysGlnSer LeuGluPro AspLysAla AspHisIle ArgAla
415 420 425
34
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WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.ST25
gctgtttat caggagtgg ttagaa aagaaaaat gtgtatttacat gaa 1529
AlavalTyr GlnGluTrp LeuGlu LysLysAsn ValTyrLeuHis Glu
430 435 440
atgcacaga ataaaaaga attgaa agcgaaaac ttgaggatccaa aat 1577
MetHisArg IleLysArg IleGlu SerGluAsn LeuArgIleGln Asn
445 450 455
gaacagaaa aaagctgct aagaga gaggaagcc ctggcatcattt gag 1625
GluGlnLys LysAlaAla LysArg GluGluAla LeuAlaSerPhe Glu
460 465 470
gcctggaag gcaatgaaa gagaag gaagcaaag agaatagctgca aaa 1673
AlaTrpLys AlaMetLys GluLys GluAlaLys ArgIleAlaAla Lys
475 480 485 , 490
aagaggctg gaggaaaag aacaag aagaaaaca gaagaagaaaat gcc 1721
LysArgLeu GluGluLys AsnLys LysLysThr GluGluGluAsn Ala
495 500 505
atgaggaaa ggcgaggcc ctgcaa gcatttgaa aaatggaaagag aaa 1769
MetArgLys GlyGluAla LeuGln AlaPheGlu LysTrpLysGlu Lys
510 515 520
aagctagaa tacctcaaa gagaag accaggagg gagaaagaatat gaa 1817
LysLeuGlu TyrLeuLys GluLys ThrArgArg GluLysGluTyr Glu
525 530 535
agagcaaag aaacagaaa gaagag gaagcggtt gctgagaaaaag aaa 1865
ArgAlaLys LysGlnLys GluGlu GluAlaVal AlaGluLysLys Lys
540 545 550
gacagttta actgctttt gaaaaa tggagtgag agaaaggaagct ctc 1913
AspSerLeu ThrAlaPhe GluLys TrpSerGlu ArgLysGluAla Leu
555 560 565 570
ctcaagcaa aaggagaag gagaaa ataaatgag agaagaaaggaa gag 1961
LeuLysGln LysGluLys GluLys IleAsnGlu ArgArgLysGlu Glu
575 580 585
ctgaagaga gccgagaag aaagac aaagacaag caagccatcagt gaa 2009
LeuLysArg AlaGluLys LysAsp LysAspLys GlnAlaIleSer Glu
590 595 600
tacgaaaag tggctggaa aagaaa gaaaggcaa gaaagaattgaa cgg 2057
TyrGluLys TrpLeuGlu LysLys GluArgGln GluArgIleGlu Arg
605 610 615
aaacagaag aagcgccac tccttc cttgagagc gagacacaccca cca 2105
LysGlnLys LysArgHis SerPhe LeuGluSer GluThrHisPro Pro
620 625 630
tggagtcct ccgagcaga actgcg ccctcaaaa gtattttga 2147
TrpSerPro ProSerArg ThrAla ProSerLys ValPhe
635 640 645
tgtttctggt tcttgatttt ttttcagtt ctgtactcatggat ttaaaacgag
2207
t caccaa
tcatctcatt atttgtggtt cttccctgcaggag cttctgtgga
22.67
agaagactct
atgtca
gcatgaaaga gatactttgc agtttaatca gtggaaacat tttctgaagt gtcctcatca 2327
gtttgctggg acaatccaga cgcatgaagc tttattatga cctgaacagt ctggtgtggg 2387
gtgattcgtg gtcactgtcg ctgagttcgg agtcttttta aagaatgttt gatcccacta 2447
atgaaagaat gccagctaga taccacaatc gtagagatga ctcggtctgt ggaagtctgt 2507
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gcttctagagtgtagtttgggcattgaaggtccctggagaccatgggcatgttatctctt2567
ctaactccagttcttcaggtcacagaagtatctttgctgtgcaagttatcgactcagtca2627
gttgaggccacagaactctagtcagtcactttagtaaagaactttgccatagggtttaat2687
ctcggtgtggtttgccttcttgaggcttacctgacaatcgtagccacctctataatgggc2747
tcacttctggaatgttcttt 2767
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<211> 647
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 46
Met Ser Asp Glu Ile Phe Ser Thr Thr Leu Ala Tyr Thr Lys Ser Pro
1 5 10 15
Lys Ala Thr Lys Arg Thr Ser Phe Gln Asp Glu Leu Ile Arg Ala Ile
20 25 30
Thr Ala Arg Ser Ala Arg Gln Arg Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Asp Phe
35 40 45
Asp Ser Asp Glu Ile val Ser Leu Gly Glu Phe Ser Asp Thr Ser Thr
50 55 60
Asp Glu Ser Leu Val Arg Lys Lys Met Asn Asp Phe His Ile Ser Asp
65 70 75 80
Asp Glu Glu Lys Asn Ser Pro Arg Leu Ser Phe Leu Lys Thr Lys Lys
85 90 95
Val Asn Arg Ala Ile Ser Asn Asp Ala Leu Asp Ser Ser Thr Pro Gly
100 105 110
Ser Glu Gly Ser Ser Pro Asp Ala Gln Glu Asp Val Thr Gly Asp Ser
115 120 125
Leu Pro Lys Ser Gln Asn Asp Asp Arg Glu Val Gly Arg Glu Ile Ile
130 135 140
Thr Val Lys Pro Thr Pro Arg Met His Pro Val L~s Arg Ser Thr Ser
145 150 155 160
Ser Gly Glu Thr Ser Ser Gly Leu Asp Ala Asp Gly His Phe Lys Pro
165 170 175
36
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Ser Pro Gln Pro Arg Ser Met Leu Lys Lys Ser Ser His Thr Glu Glu
180 185 190
Gly Val Arg Pro Gly Val Asp Lys Glu His Ser Ile Ser Glu Ala Ser
195 200 205
Ala Pro Thr Pro Ser Leu Pro Arg Gln Asn Gly Thr Glu Leu Gln Thr
210 215 220
Glu Glu Lys Ile Tyr Ser Glu Asn Leu Asp Leu Glu Asp Ser Leu Leu
225 230 235 240
Gln Ser Leu Thr Ser Ser Ser Phe Lys Glu Ser Pro Gly Gly Cys Thr
245 250 255
Ser Pro Gly Ser Gln Glu Lys Val Pro Ile Lys Asp His Asp Gly Glu
260 265 270
Pro Thr Glu Ile Trp Asp Ser Leu Leu Ser Asn Glu Asn Glu Gly Ser
275 280 285
Ser Val Leu Val Asn Cys Val Thr Pro Glu Leu Glu Gln Pro Lys Asp
290 295 300
Gly Gln Val Ala Ala Asp Asp Leu Glu Glu Glu Arg Glu Lys Gly Gly
305 310 315 320
Phe Thr Glu Asp Asp Leu Thr Thr Asp Pro Leu Leu Ser Thr Ser Pro
325 330 335
Ser Val Ile Thr Pro Thr Glu Pro Ala Glu Pro Ala Lys Lys Ala Asn
340 345 350
Glu Asp Arg Asn Thr Lys Asn Lys Lys Thr Thr Asn Asn Arg Val Ser
355 360 365
Ser Ala Ser Gly Ser Arg Leu Met Thr Ser Glu Phe Leu Lys Arg Ser
370 375 380
Gly Pro Thr Lys Arg Ser Pro Ser Ala Ala Thr Ser Ser His Tyr Leu
385 390 395 400
Gly Ser Leu Lys Val Leu Asp Gln Lys Gln Pro Arg Lys Gln Ser Leu
405 410 415
Glu Pro Asp Lys Ala-Asp His Ile Arg Ala Ala Val Tyr Gln Glu Trp
420 425 430
Leu Glu Lys Lys Asn Val Tyr Leu His Glu Met His Arg Ile Lys Arg
435 440 445
37
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Ile Glu Ser Glu Asn Leu Arg Ile Gln Asn Glu Gln Lys Lys Ala Ala
450 455 460
Lys Arg Glu Glu Ala Leu Ala Ser Phe Glu Ala Trp Lys Ala Met Lys
465 470 475 480
Glu Lys Glu Ala Lys Arg Ile Ala Ala Lys Lys Arg Leu Glu Glu Lys
485 490 495
Asn Lys Lys Lys Thr Glu Glu Glu Asn Ala Met Arg Lys Gly Glu Ala
500 505 510
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Glu Lys Trp Ser Glu Arg Lys Glu Ala Leu Leu Lys Gln Lys Glu Lys
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Lys Asp Lys Asp Lys Gln Ala Ile Ser Glu Tyr Glu Lys Trp Leu Glu
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Lys Lys Glu Arg Gln Glu Arg Ile Glu Arg Lys Gln Lys Lys Arg His
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Thr Ala Pro ser Lys val Phe
645
<210> 47
<211> 647
<212> PRT
<213> artificial sequence
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Met Ser Asp Glu Ile Phe Ser Thr Thr Leu Ala Tyr Thr Lys Ser Pro
1 5 . 10 15
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Lys Ala Thr Lys Arg Thr Ser Phe Gln Asp Glu Leu Ile Arg Ala Ile
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Thr Ala Arg Ser Ala Arg Gln Arg Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Asp Phe
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Asp Ser Asp Glu Ile Val Ser Leu Gly Glu Phe Ser Asp Thr Ser Thr
50 55 60
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Val Asn Arg Ala Ile Ser Asn Asp Ala Leu Asp Ser Ser Thr Pro Gly
100 105 110
Ser Glu Gly Ser Ser Pro Asp Ala Gln Glu Asp Val Thr Gly Asp Ser
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Leu Pro Lys Ser Gln Asn Asp Asp Arg Glu Val Gly Arg Glu Ile Ile
130 135 140
Thr Val Lys Pro Thr Pro Arg Met His Pro Val Lys Arg Ser Thr Ser
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Ser Gly Glu Thr Ser Ser Gly Leu Asp Ala Asp Gly His Phe Lys Pro
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Ser Pro Gln Pro Arg Ser Met Leu Lys Lys Ser Ser His Thr Glu Glu
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Glu Glu Lys Ile Tyr Ser Glu Asn Leu Asp Leu Glu Asp Ser Leu Leu
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Gln Ser Leu Thr Ser Ser Ser Phe Lys Glu Ser Pro Gly Gly Cys Thr
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Ser Pro Gly Ser Gln Glu Lys Val Pro Ile Lys Asp His Asp Gly Glu
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Pro Thr Glu Ile Trp Asp Ser Leu Leu Ser Asn Glu Asn Glu Gly Ser
275 280 285
39
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Ser Val Leu Val Asn Cys Val Thr Pro Glu Leu Glu Gln Pro Lys Asp
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Gly Gln Val Ala Ala Asp Asp Leu Glu Glu Glu Arg Glu Lys Gly Gly
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Phe Thr Glu Asp Asp Leu Thr Thr Asp Pro Leu Leu Ser Thr Ser Pro
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Ser Ala Ser Gly Ser Arg Leu Met Thr Ser Glu Phe Leu Lys Arg Ser
370 375 380
Gly Pro Thr Lys Arg Ser Pro Ser Ala Ala Thr Ser Ser His Tyr Leu
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Gly Ser Leu Lys Val Leu Asp Gln Lys Gln Pro Arg Lys Gln Ser Leu
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Glu Pro Asp Lys Ala Asp His Ile Arg Ala Ala Val Tyr Gln Glu Trp
420 425 430
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Ile Glu Ser Glu Asn Leu Arg Ile Gln Asn Glu Gln Lys Lys Ala Ala
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Lys Arg Glu Glu Ala Leu Ala Ser Phe Glu Ala Trp Lys Ala Met Lys
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Glu Lys Glu Ala Lys Arg Ile Ala Ala Lys Lys Arg Leu Glu Glu Lys
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Asn Lys Lys Lys Thr Glu Glu Glu Asn Ala Met Arg Lys Gly Glu Ala
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Glu Lys Thr Arg Arg Glu Lys Glu Tyr Glu Arg Ala Lys Lys Gln Lys
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Lys Lys Glu Arg Gln Glu Arg Ile Glu Arg Lys Gln Lys Lys Arg His
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Thr Ala Pro ser Lys val Phe
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Glu Leu Ile Met Asp Asp Asp Arg Thr Val Asp Pro Leu Leu Ser Lys
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Ser Gln Ser Ile Leu Ile Ser Thr Ser Ala Thr Ala Ser Ser Lys Lys
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Leu Gly Thr Leu Lys Val Leu Asp Gln Lys Pro Ser Gln Lys Gln Ser
100 105 110
41
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Ile Glu Pro Asp Arg Ala Asp Asn Ile Arg Ala Ala Val Tyr Gln Glu
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Lys Glu Lys Ile Asn Glu Lys Arg Lys Glu Glu Leu Lys Arg Ala Glu
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Lys Lys Asp Lys Asp Lys Gln Ala Ile Asn Glu Tyr Glû Lys Trp Leu
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Glu Asn Lys Glu Lys Gln Glu Arg Ile Glu Arg Lys Gln Lys Lys Arg
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340
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<223> hASAP mutant 411-647
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Ala Val Tyr Gln Glu Trp Leu Glu Lys Lys Asn Val Tyr Leu His Glu
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Glu Gln Lys Lys Ala Ala Lys Arg Glu Glu Ala Leu Ala Ser Phe Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Arg Leu Glu Glu Lys Asn Lys Lys Lys Thr Glu Glu Glu Asn Ala
85 90 95
Ala Arg Lys Gly Glu Ala Leu Gln Ala Phe Glu Lys Trp Lys Glu Lys
100 105 110
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Arg Ala Lys Lys Gln Lys Glu Glu Glu Thr Val Ala Glu Lys Lys Lys
130 135 140
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Phe Lys Gln Lys Lys Lys Glu Lys Ile Asn Glu Lys Arg Lys Glu Glu
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Leu Lys Arg Ala Glu Lys Lys Asp Lys Asp Lys Gln Ala Ile Asn Glu
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Tyr Glu Lys Trp Leu Glu Asn Lys Glu Lys Gln Glu Arg Ile Glu Arg
195 200 205
Lys Gln Lys Lys Arg His Ser Phe Leu Glu Ser Glu Ala Leu Prô Pro
210 215 220
Trp Ser Pro Pro Ser Arg Thr Val Phe Ala Lys Val Phe
225 230 235
43
CA 02511436 2005-06-21
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Thr Ala Arg Ser Ala Arg Gln Arg Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Asp Phe
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Ser Ala Pro Ser Ser Leu Pro Thr Pro Asn Gly Ile Gln Leu Glu Ala
210 ZI5 220
Glu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asn Leu Asp Pro Glu Asp Ser Cys Leu
225 230 235 240
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Thr Ser Leu Ala Ser Ser Ser Leu Lys Gln Ile Leu Gly Asp Ser Phe
Z45 250 255
Ser Pro Gly Ser Glu Gly Asn Ala Ser Gly Lys Asp Pro Asn Glu Glu
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Ser Gln Val Thr Ala Asp Asp Leu Glu Glu Glu Lys Ala Lys Ala Glu
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Leu Ile Met Asp Asp Asp Arg Thr Val Asp Pro Leu Leu Ser Lys Ser
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Gln Ser Ile Leu Ile Ser Thr Ser Ala Thr Ala Ser Ser Lys Lys Thr
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Ser Ser Ala Ser Ala Arg Leu Met Thr Ser Glu Phe Leu Lys Lys Ser
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Ser Ser Lys Arg Arg Thr Pro Ser Thr Thr Thr Ser Ser His Tyr Leu
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Gly Thr Leu Lys Val Leu Asp Gln Lys Pro Ser Gln Lys Gln Ser Ile
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Glu Pro Asp Arg Ala Asp Asn Ile Arg Ala Ala Val Tyr Gln Glu Trp
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Leu Glu Lys Lys Asn Val Tyr Leu His Glu Met His Arg Ile Lys Arg
435 440 445
Ile Glu Ser Glu Asn Leu Arg Ile Gln Asn Glu Gln Lys Lys Ala Ala
450 455 460
Lys Arg Glu Glu Ala Leu Ala Ser Phe Glu Ala Trp Lys
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<211> 418
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46
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<220>
<223> hASAP mutant 1-418
<400> 52
Met Ser Asp Glu Val Phe Ser Thr Thr Leu Ala Tyr Thr Lys Ser Pro
1 5 10 15
Lys Va1 Thr Lys Arg Thr Thr Phe Gln Asp Glu Leu Ile Arg Ala Ile
20 ~ 25 30
Thr Ala Arg Ser Ala Arg Gln Arg Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Asp Phe
35 40 45
Asp Ser Asp Glu Ile Val Ser Leu Gly Asp Phe Ser Asp Thr Ser Ala
50 55 60
Asp Glu Asn Ser Val Asn Lys Lys Met Asn Asp Phe His Ile Ser Asp
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Ser Asn Gly Asn Ile Thr Lys Asp Glu Pro Val Cys Ala Ile Lys Asn
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Glu Glu Glu Met Ala Pro Asp Gly Cys Glu Asp Ile Val Val Lys Ser
115 120 125
Phe Ser Glu Ser Gln Asn Lys Asp Glu Glu Phe Glu Lys Asp Lys Ile
130 135 140
Lys Met Lys Pro Lys Pro Arg Ile Leu Ser Ile Lys Ser Thr Ser Ser
145 150 155 160
Ala Glu Asn Asn Ser Leu Asp Thr Asp Asp His Phe Lys Pro Ser Pro
165 170 175
Trp Pro Arg Ser Met Leu Lys Lys Lys Ser His Met Glu Glu Lys Asp
180 185 190
Gly Leu Glu Asp Lys Glu Thr Ala Leu Ser Glu Glu Leu Glu Leu His
195 200 205
Ser Ala Pro Ser Ser Leu Pro Thr Pro Asn Gly Ile Gln Leu Glu Ala
210 215 220
Glu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asn Leu Asp Pro Glu Asp Ser Cys Leu
225 230 235 240
- 47
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Thr Ser Leu Ala Ser Ser Ser Leu Lys Gln Ile Leu Gly Asp Ser Phe
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Ser Pro Gly Ser Glu Gly Asn Ala Ser Gly Lys Asp Pro Asn Glu Glu
Z60 265 270
Ile Thr Glu Asn His Asn Ser Leu Lys Ser Asp Glu Asn Lys Glu Asn
275 280 285
Ser Phe Ser Ala Asp His Val Thr Thr Ala Val Glu Lys Ser Lys Glu
290 295 300
Ser Gln Val Thr Ala Asp Asp Leu Glu Glu Glu Lys Ala Lys Ala Glu
305 310 315 320
Leu Ile Met Asp Asp Asp Arg Thr Val Asp Pro Leu Leu Ser Lys Ser
325 330 335
Gln Ser Ile Leu Ile Ser Thr Ser Ala Thr Ala Ser Ser Lys Lys Thr
340 345 350
Ile Glu Asp Arg Asn Ile Lys Asn Lys Lys Ser Thr Asn Asn Arg Ala
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Ala Arg Leu Met Thr Ser Glu Phe Leu Lys Lys Ser
370 375 380
Ser Ser Lys Arg Arg Thr Pro Ser Thr Thr Thr Ser Ser His Tyr Leu
385 390 395 400
Gly Thr Leu Lys Val Leu Asp Gln Lys Pro Ser Gln Lys Gln Ser Ile
405 410 415
Glu Pro
<210> 53
<211> 303
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<220>
<223> hASAP mutant 1-303
<400> 53
Met Ser Asp Glu Val Phe Ser Thr Thr Leu Ala Tyr Thr Lys Ser Pro
1 5 10 15
48
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s644PCT88.ST25
Lys Val Thr Lys Arg Thr Thr Phe Gln Asp Glu Leu Ile Arg Ala Ile
ZO 25 30
Thr Ala Arg Ser Ala Arg Gln Arg Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Asp Phe
35 40 45
Asp Ser Asp Glu Ile Val Ser Leu Gly Asp Phe Ser Asp Thr Ser Ala
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Ser Asn Gly Asn Ile Thr Lys Asp Glu Pro Val Cys Ala Ile Lys Asn
100 105 110
Glu Glu Glu Met Ala Pro Asp Gly Cys Glu Asp Ile Val Val Lys Ser
115 120 125
Phe Ser Glu Ser Gln Asn Lys Asp Glu Glu Phe Glu Lys Asp Lys Ile
130 135 140
Lys Met Lys Pro Lys Pro Arg Ilé Leu Ser Ile Lys Ser Thr Ser Ser
145 150 155 160
Ala Glu Asn Asn Ser Leu Asp Thr Asp Asp His Phe Lys Pro Ser Pro
165 170 175
Trp Pro Arg Ser Met Leu Lys Lys Lys Ser His Met Glu Glu Lys Asp
180 185 190
Gly Leu Glu Asp Lys Glu Thr Ala Leu Ser Glu Glu Leu Glu Leu His
195 200 205
Ser Ala Pro Ser Ser Leu Pro Thr Pro Asn Gly Ile Gln Leu Glu Ala
210 215 220
Glu Lys Lys Ala Phe Ser Glu Asn Leu Asp Pro Glu Asp Ser Cys Leu
225 230 235 240
Thr Ser Leu Ala Ser Ser Ser Leu Lys Gln Ile Leu Gly Asp Ser Phe
245 250 255
Ser Pro Gly Ser GIu Gly ASn Ala Ser Gly Lys Asp Pro Asn Glu Glu
260 265 270
Ile Thr Glu Asn His Asn Ser Leu Lys Ser Asp Glu Asn Lys Glu Asn
275 280 285
49
CA 02511436 2005-06-21
WO 2004/058815 PCT/FR2003/003895
s644PCT88.ST25
Ser Phe Ser Ala Asp His Val Thr Thr Ala Val Glu Lys Ser Lys
290 295 300
