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GENE DE RESISTANCE A APHIS GOSSYPII
La présente invention est relative à de nouveaux moyens de lutte contre
les insectes ravageurs, et notamment contre les pucerons.
Les insectes ravageurs constituent une des préoccupations majeures en
agriculture. Outre les dégâts produits par les insectes eux-mémes, l'attaque
par ces insectes
favorise très souvent la transmission et l'infection des plantes par des
maladies
bactériennes, virales ou fongiques.
Parmi les ravageurs, les pucerons (également dénommés aphides) sont
les plus courants. Il en existe plus de 4000 espèces dont les plus répandues
sont lllyzus
persicae et Aphis gossypü.
Chaque espèce possède un cycle de vie particulier et un ensemble d'hôtes
privilégiés. Les aphides sont des organismes extrêmement dynamiques, qui
s'adaptent
rapidement aux conditions environnementales. Cette rapide adaptation est
essentiellement
due aux diverses stratégies reproductives développées par les aphides. Selon
les conditions
~ climatiques, les aphides se reproduisent par voie sexuée ou asexuée et sont
ovipares ou
vivipares. Ils peuvent ou non être ailés, facilitant ainsi leur passage d'une
plante à une
autre. Grâce à cette grande faculté d'adaptation et de reproduction,
l'infestation totale
d'une culture en plein champ et a fortiori en serre est extrêmement rapide. Un
seul
individu donne naissance à un nombre de larves compris entre 40 et 100.
Le puceron du cotonnier ou du melon Aphis gossypü est présent dans l~
plupart des régions du monde à l'exception des plus septentrionales. Il est
capable
d'effectuer un cycle complet de développement et de se reproduire en moins
d'une
semaine. Grâce à ses facultés d' adaptation et de reproduction, un grand
nombre de
générations peut être produit en une saison quelles qu'en soient les
conditions climatiques.
Le puceron du melon a un large spectre d'hôtes (environ 700 plantes cultivées
ou sauvages
dont une cinquantaine en France). Parmi celles-ci, les plus sensibles sont les
cucurbitacées
dont par exemple le melon, la courgette, le concombre, les malvacées comme le
cotonnier
ou l'hibiscus et dans une moindre mesure les solanacées et les rutacées comme
les
agrumes.
Le puceron du melon colonise principalement la face inférieure des
feuilles, les bourgeons et jeunes pousses. En puisant dans le phloème ses
éléments nutritifs,
le puceron détourne les ressources de la plante et l'affaiblit. Les tissus
colonisés deviennent
chlorotiques, les feuilles s'enroulent sur elles même et le rendement de la
photosynthèse
diminue. Le puceron sécrète un miellat très riche en sucres servant de
substrat à des
champignons saprophytes comme la fumagine qui dépose un voile noir sur la
feuille
réduisant encore les capacités de photosynthèse de la plante et provoquant une
forte
dépréciation commerciale des légumes et des fruits atteints. De surcroît, le
puceron est un
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vecteur de nombreux virus qu'il introduit directement dans le phloème de la
plante
lorsqu'il en pique les vaisseaux.
La lutte chimique est actuellement encore la plus répandue. Elle présente
toutefois de nombreux inconvénients. Les produits utilisés ont fréquemment un
spectre
d'action large, et détruisent en même temps que les pucerons les insectes
bénéfiques. Les
risques de pollution de l'environnement sont également importants : les
aphicides font en
effet partie des produits les plus toxiques pour l'homme, la faune utile et
l'environnement
(Recueil des effets non intentionnels des produits phytosanitaires, Acta 1998,
256p,
BERGER et VAN HOLST, 2001, environ. Sci. Pollut. Res. Int., 8, 109-112). Par
ailleurs,
le puceron Aphis gossypü a développé dans certaines régions des résistances
aux composés
chimiques employés comme les organophosphates, les carbamates, les
pyrethroïdes et
organochlorés (LARRY et al. the Journal of Cotton Science, 5, 22-29, 2001 ;
DELORME
Pesticide Science, 49, 90-96, 1997).
La lutte biologique consiste à utiliser les prédateurs et parasites naturels
d'Aphis gossypü comme par exemple les coccinelles, certains héminoptères ou
les
champignons pathogènes. Elle n'est toutefois utilisable que pour les cultures
sous serre.
Une autre approche repose sur la recherche de variétés naturellement
résistantes aux pucerons, et sur leur utilisation pour l'amélioration
variétale et la création
d'hybrides.
Des variétés résistantes aux pucerons ont ainsi été trouvées notamment
chez le blé, le pommier, le pois fourrager, la laitue, la tomate, etc. ..
Chez le melon (Cucumis melo), l'existence d'un locus dominant
conférant une résistance au puceron Aphis gossypü, a été découverte chez des
lignées de
melons originaires d'Extrême-Orient ou d'Inde. Ce locus, qui a été dénommé Ag
(pour
Aphis gossypü Resistance) ou hat (pour Virus Aphid Transmission Resistance)
confère un
double phénotype de résistance : une résistance à l'infestation de la plante
par Aphis
gossypü, et une résistance à la transmission par ce puceron des virus dont il
est le vecteur
(KISHABA et al., J. Econ. Entomol., 64, 935-937, 1971 ; BOHN et al., J. Amer.
Soc. Hort.
Science, 98, 37-40, 1973 ; LECOQ et al., Phytopathology, 69, 1223-1225, 1979 ;
PITRAT
et LECOQ, Phytopathology, 70, 958-961, 1980).
Le locus hat favorable à la résistance a été introduit par croisement dans
différentes variétés de melon commercialisées ; cependant, la création de
variétés de melon
résistantes aux pucerons par les techniques usuelles d'amélioration variétale
demeure
longue et coûteuse.
Il appaxaît donc souhaitable d'identifier précisément et de cloner le gène
vat, afin de permettre notamment
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- de transférer l'allèle Yat favorable à la résistance, par transgenèse, à des
variétés de melon sensibles à Aphis gossypü, et également à d'autres espèces
sensibles à ce
puceron et pour lesquelles aucune résistance naturelle n'a été détectée,
telles que par
exemple la courgette, le concombre ou le cotonnier ; l'allèle du gène hat
favorable à la
résistance peut aussi être transféré dans des espèces de plantes sensibles à
la transmission
virale par les pucerons, comme par exemple les solanacées, notamment la tomate
;
- de rechercher des orthologues du gène hat chez d'autres espèces que le
melon ;
- de définir de nouveaux marqueurs, utilisables notamment dans le cadre
des techniques classiques de sélection variétale, pour faciliter
l'identification de variétés
résistantes, et/ou le suivi de l'introgression du caractère de résistance dans
des variétés
d'intérêt agronomique.
Le gène T~at a été localisé sur le chromosome V du melon en position
sub-télomérique (PERIN et al., Theor Appl Genet, 104, 1017-1034, 2002).
Plusieurs
séquences homologues à des gènes de résistance ont été cartographiées dans
cette région
(KLINGER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci., 126, 56-63, 2001 ; BROTMAN et al.,
Theor.
Apl. Genet., 104, 1055-1063, 2002), ce qui permet de supposer que le gène fat
appartient
à la superfamille des NBS-LRR, dont font partie un grand nombre de gènes de
résistance
actuellement clonés.
Cette superfamille regroupe des gènes contenant un site de liaison à un
nucléotide (NBS pour nucleotide binding site) et des séquences répétées riches
en leucine
(LRR pour leucine-rich repeats). Il a été observé que des séquences homologues
à des
NBS-LRR étaient liées au locus hat (KLINGLER et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci.,
126, 56-
63, 2001). Parmi ces homologues de gènes de résistance, NBS-2, NBS46-7, NBSSa
et
NBSSb ont été localisés respectivement à 4,75, 7,5, 10 et 11 cM de Yat ;
cependant,
aucune d'entre elles ne coségrège avec le locus Yat (BROTMAN et al., Theor.
Appl.
Genet., 104, 1055-1063, 2002).
Les Inventeurs ont construit une banque BAC (bacterial artificial
chromosome) à partir d'ADN génomique de melon homozygote pour l'allèle Pat
favorable
à la résistance à Aphis gossypü et à la résistance à la transmission virale
par ce vecteur. Ils
ont parallèlement défini des marqueurs encadrant plus précisément le locus hat
que les
marqueurs connus dans l'art antérieur. Le criblage de la banque BAC à l'aide
de ces
marqueurs a permis d'identifier des clones portant la totalité du locus Yat.
Le sous-clonage de l'un de ces clones a permis d'obtenir un fragment
d'ADN génomique de 11000 pb environ contenant le gène hat. La séquence de ce
fragment est représentée sur la Figure 1 (les 4 exons sont surlignés en gris
et les 3 introns
sont soulignés), ainsi que dans la liste de séquences en annexe sous le numéro
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SEQ ~ NO: 1. La séquence de l'ADNc correspondant a également été obtenue et la
séquence polypeptidique correspondante a été déterminée. Ces séquences d'ADNc
et
polypeptidique sont respectivement représentées dans la liste de séquences en
annexe sous
les numéros SEQ ID NO: 2 et SEQ ID NO: 3.
Un paralogue du gène Tlat, ci-après dénommé Yat-litre a également été
isolé à partir de la banque BAC. La séquence de ce gène hat-litre est
représentée dans la
liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4. La séquence d'ADNc
et la
séquence polypeptidique déduite sont respectivement représentées en annexe
sous les
numéros SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6.
La Figure 2 montre l'alignement de séquence entre l'ADNc de Irat et
l'ADNc de vat-litre. L'ADNc de hat comprend 4422 pb alors que l'ADNc de hat
litre ne
comprend que 4233 pb du fait d'une délétion de 195 pb localisée entre les
positions 3014
et 3210 de la séquence de T~at et d'une addition de 6 pb localisée entre les
positions 3649 et
3656 de la séquence de Yat-litre. Les séquences de Tlat et Trat litre
présentent 92,4%
d'identité entre elles.
La Fïgure 3 montre l' alignement des séquences des protéines VAT et
VAT-litre déduites qui se composent respectivement de 1473 acides aminés et
1410 acides
aminés. Les séquences de VAT et VAT-litre présentent environ 90% d'identité
entre elles.
Le gène Yat et Yat-litre sont liés génétiquement et physiquement (séparés
de 17 kb). Des plantes recombinantes entre vat et Yat-litre ont été
identifiées par analyse
génétique. Les plantes portant uniquement le gène Yat-litre sont sensibles à
la colonisation
et à la transmission des virus par A. gossypü. Au contraire, les plantes
portant uniquement
le gène Yat sont résistantes à la colonisation et à la transmission des virus
par A. gossypü.
Donc, le gène Yat est nécessaire et suffisant pour conférer le double
phénotype décrit
précédemment.
La présente invention a pour objet un polynucléotide isolé choisi parmi
a) un polynucléotide codant pour un polypeptide intervenant dans la résistance
au
puceron Aphis gossypii et/ou à la transmission virale par ledit puceron,
lequel
polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de manière
tout
à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3 ;
b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ;
c) un polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement, en conditions
stringentes,
avec le polynucléotide a) ; ou le polynucléotide b).
Sauf précision contraire, les pourcentages d'identité de séquence indiqués
ici pour les séquences nucléotidiques ou peptidiques se réfèrent à la valeur
obtenue, sur
une fenêtre de comparaison constituée par la totalité de la séquence de
référence, avec la
suite logicielle BLAST (ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402,
1997) en
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utilisant les paramètres par défaut, sur une fenêtre de comparaison constituée
par la totalité
de la séquence de référence.
On définit comme polynucléotide « codant pour » un polypeptide donné,
tout polynucléotide contenant l'information génétique permettant la synthèse
dudit
polypeptide.
Ainsi, des polynucléotides conformes à (invention codant pour un
polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis g~ssypü et/ou à la
transmission virale par ledit puceron, comprennent notamment le polynucléotide
de
séquence SEQ ID NO: 1 et le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2.
La présente invention inclut également tout fragment d'au moins 10 pb,
de préférence au moins 20 pb, et de manière tout à fait préférée au moins 50
pb d'un
polynucléotide a) ou b) ci-dessus, ou capable de s'hybrider sélectivement, en
conditions
stringentes, avec un polynucléotide a) ou b) ci-dessus. Des fragments préférés
sont ceux
d'un quelconque des polynucléotides de séquence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5 ou ceux capables de s'hybrider sélectivement en
conditions stringentes avec l'un de ces polynucléotides ou son complémentaire.
D'autres
fragments préférés sont ceux de l'un quelconque des polynucléotides SEQ ID NO
: 1 ou
SEQ ID NO : 2, qui ne sont pas présents dans les polynucléotides SEQ ID NO : 4
ou
SEQ ID NO : 5, ou des fragments qui sont capables de s'hybrider sélectivement
avec l'un
des polynucléotides SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, sans s'hybrider avec les
polynucléotides SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5.
Des conditions stringentes d'hybridation, pour un polynucléotide donné,
peuvent être identifiées par l'homme du métïer en fonction de la taille et de
la composition
en bases du polynucléotide concerné, ainsi que de la composition du mélange
d'hybridation (notamment pH et force ionique). Généralement, des conditions
stringentes,
pour un polynucléotide de taille et de séquence données, sont obtenues en
opérant à une
température inférieure d'environ 5°C à 10°C à la température de
fusion (Tm) de l'hybride
formé, dans le même mélange réactionnel, par ce polynucléotide et son
complémentaire.
On définit ici comme polynucléotide capable de s'hybrider sélectivement
avec un polynucléotide a) ou b) conforme à (invention tout polynucléotide qui
lorsqu'il est
hybridé en conditions stringentes avec une banque d'acide nucléique de melon
(notamment
une banque d'ADN génomique ou d'ADNc) produit un signal d'hybridation
détectable
(c'est-à-dire au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 5 fois
supérieur au bruit de
fond) avec ledit polynucléotide, mais ne produit aucun signal détectable avec
d'autres
séquences de ladite banque, et notamment avec des séquences codant pour
d'autres
protéines de la famille NBS-LRR.
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La présente invention a également pour objet des sondes
polynucléotidiques ou des amorces d'amplification obtenues à partir de
polynucléotides a)
ou b) conformes à l'invention ou des fragments de ceux-ci.
La présente invention englobe également tout polynucléotide codant pour
un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à
la
transmission virale par ledit puceron, et pouvant être obtenu à partir d'une
banque d'ADN
génomique ou d'ADNc de plante par criblage de ladite banque à l'aide de sondes
ou
d'amorces conformes à (invention.
Ceci inclut notamment d'autres allèles du gène Irat de melon, et
notamment d'autres allèles capables de conférer une résistance au puceron
Aphis gossypü
et/ou à la transmission virale par ledit puceron, ainsi que des orthologues du
gène Yat chez
des plantes autres que le melon, notamment chez d'autres cucurbitacées telles
que la
courgette et le concombre, et de manière plus générale chez des plantes
susceptibles d'être
infectées par Aphis gossypü (par exemple des malvacées comme le cotonnier)
et/ou
sensibles à la transmission virale par ledit puceron (par exemple des
solanacées comme la
tomate).
La présente invention englobe également des marqueurs génétiques
permettant la détection de la présence ou de l'absence chez une plante, et
notamment chez
le melon, d'un allèle du gène Yat favorable à la résistance à la colonisation
par le puceron
Aphis gossypü et/ou à la résistance à la transmission virale par ledit
puceron.
Des marqueurs génétiques conformes à l'invention, comprennent
notamment les marqueurs suivants : L273, L246, V681, V 1684, V432, GRP805, M8,
marqueur E, marqueur D.
Les marqueurs E et D sont plus particulièrement utilisables pour
différencier les gènes Irat et Tlat-like chez PI161375.
Ces marqueurs sont utilisables notamment chez les cucurbitacées, en
particulier le melon. Ils peuvent également être utilisés chez d'autres
plantes, par exemple
des malvacées telles que le cotonnier ou l'hibiscus ou des solanacées telles
que la tomate.
Les marqueurs conformes à (invention sont respectivement définis par
les amorces suivantes
L273
F2-B2 : GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7)
F2-Br : TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8)
L246
F2-B2 Eco : ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9)
F2 Eco : GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10)
V681
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V681 : GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11)
V681R : GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12)
V1684
V588 : CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13)
VSS1R : GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14)
V432
V432 : AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15)
V432R : TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16)
GRP805
GRP805 : ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17)
GRP805R : AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18)
M8:
M8 : CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19)
M8R : TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20)
Marqueur E
LRRl : CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21)
LRR842R : CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22)
Marqueur D
LRR915 : AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23)
LRR1R : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
D'autres marqueurs génétiques de résistance au puceron A. gossypü et/ou
à la transmission virale par ledit puceron peuvent également être définis à
partir des
séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2, en comparant ces séquences avec
leurs
homologues obtenus à partir de plantes sensibles à A. gossypü et/ou à la
transmission virale
par ce puceron, afin de détecter les polyrnorphismes existant entre ces
séquences, et de
déterminer la forme associée à la résistance et la forme associée à la
sensibilité.
Ces polymorphismes peuvent être situés dans les régions codantes du
gène Yat, et se traduire par des modifications de la séquence peptidique de la
protéine
VAT. Il peut également s'agir de polyrnorphismes situés dans la région 5' non
codante ou
dans les introns du gène Irat, ou de polymorphismes situés dans les régions
codantes mais
ne se~traduisant pas par une modification de séquence de la protéine VAT.
Lorsqu'un polymorphisme a été ainsi identifié, il est possible de l'utiliser
comme marqueur génétique de résistance ou de sensibilité, et de définir des
outils (sondes
d'acide nucléique, amorces d'amplification, enzymes de restriction) permettant
de
distinguer ses différentes formes.
La présente invention englobe également l'utilisation d'au moins un
polynucléotide ou d'au moins un marqueur génétique conforme à l'invention pour
la
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détection de la présence, chez une plante, d'un allële du gène hat favorable à
la résistance
au puceron Aphis gossypü et/ou à la résistance à la transmission virale par
ledit puceron.
La présente invention a en particulier pour objet un procédé d'évaluation
de la résistance ou de la sensibilité d'une plante au puceron Aphis gossypü,
et/ou à la
transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la
détermination de
la forme allélique du gène vat présente chez ladite plante.
La présente invention a également pour objet des amorces
oligonucléotidiques utilisables pour la mise en oeuvre des méthodes de
détection définies
ci-dessus.
En particulier la présente invention a pour objet
- tout couple d'amorces permettant l'amplification d'une région du gène
TTat comprenant au moins un polymorphisme associé à la résistance ou la
sensibilité à
Aphis gossypü etlou à la transmission virale par ledit puceron ;
- tout couple d'amorces permettant l'amplification de l'un des marqueurs
L273, L246, V681, V1684, V432, GRP805, M8, marqueur E, ou marqueur D,
mentionnés
ci-dessus.
Lâ présente invention a également pour objet des kits pour la mise en
oeuvre d'un procédé conforme à l'invention. Ces kits comprennent au moins un
couple
d'amorces conforme à l'invention, éventuellement associé à des réactifs
permettant la mise
en oeuvre d'une réaction d'amplification, à des moyens de détection du produit
d'amplification, à une ou plusieurs enzymes de restriction, etlou à des
témoins positifs
et/ou des témoins négatifs d'amplification.
La présente invention a aussi pour objet
- une cassette d'expression comprenant un polynucléotide conforme à
l'invention, et notamment un polynucléotide codant pour un polypeptide
intervenant dans
la résistance au 'puceron Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par
ledit puceron,
placé sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
- un vecteur recombinant résultant de l'insertion, dans un vecteur-hôte
approprié, d'un polynucléotide ou d'une cassette d'expression conforme à
l'invention.
La présente invention englobe également un procédé de production d'un
polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il comprend la transformation
d'une cellule
hôte, procaryote ou eucaryote, par un polynucléotide conforme à l'invention
côdant pour
un polypeptide intervenant dans la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à
la
transmission virale par ledit puceron, et la récupération dudit polypeptide
produit par ladite
cellule.
La présente invention a aussi pour objet un polypeptide intervenant dans
la résistance au puceron Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par
ledit puceron,
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lequel polypeptide possède au moins 80%, de préférence au moins 90% et de
rrianière tout
à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 3,
ainsi que des
fragments d'au moins 5, de préférence au moins 10, et de manière tout à fait
préférée au
moins 15 acides aminés consécutifs dudit polypeptide.
La présente invention englobe aussi des cellules-hôtes génétiquement
transformées par un polynucléotide ou une cassette d'expression conforme à
(invention.
Les cellules hôtes peuvent être des cellules eucaryotes ou procaryotes. A
titre d'exemples on citera des bactéries, notamment E. coli ou Agrobacterium,
des levures,
par exemple Saccharomyces, des cellules animales ou, préférentiellement, des
cellules
végétales.
La présente invention englobe également des plantes transgéniques
génétiquement transformées par un polynucléotide conforme à l'invention.
Les techniques classiques de construction de vecteurs recombinants, de
transformation de cellules ou d'organismes hôte, et de production de protéines
recombinantes, sont utilisables pour la mise en oeuvre de la présente
invention.
Le choix du vecteur-hôte, et des séquences de régulation de l'expression
seront effectuées en fonction de la cellule hôte ou de l'organisme hôte choisi
et de
l'application envisagée.
La transformation génétique de plantes par un polynucléotide conforme à
l'invention permet l'obtention de plantes transgéniques résistantes au puceron
Aphis
gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un polynucléotide
conforme à l'invention, pour augmenter la résistance d'une plante au puceron
Aphis
gossypü.
La présente invention a ainsi plus particulièrement pour objet un procédé
de production d'une plante transgénique résistante au puceron Aphis gossypü
et/ou à la
transmission virale par ledit puceron, caractérisé en ce qu'il comprend la
transformation
génétique de ladite plante par un polynucléotide conforme à l'invention.
Ladite plante est avantageusement choisie parmi les espèces sensibles à
Aphis gossypü, notamment parmi les cucurbitacées telles que le melon, le
concombre ou la
courgette, ou les malvacées telles que le cotonnier ou l'hibiscus, ou parmi
les espèces
sensibles aux virus transmis par A. gossypü, notamment parmi les solanacées
telles que la
tomate ou le piment.
En outre, la sur-expression du gène T~at à un niveau élevé peut conduire à
une résistance constitutive de la plante contre des agents pathogènes plus
variés chez le
melon ou dans d'autres espèces végétales (cucurbitacées, solanacées ou
malvacées). Par
exemple, cette sur-expression peut permettre à la plante de reconnaitre des
pucerons
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phylogénétiquement éloignés de Aphis gossypü ou de conférer une résistance
constitutive
faible qui retardera le cycle infectieux des agents pathogènes en général.
Pour cela, on peut
produire des plantes transgéniques qui expriment le gène Yat sous contrôle
d'un promoteur
fort (35S) et donc qui l'exprimeront à un niveau supérieur à celui qu'il a
lorsqu'il est sous
contrôle de son propre promoteur. Cependant, il faudra nécessairement
contrôler
l'expression du gène à son plus juste niveau afin d'éviter des effets néfastes
sur la biologie
de la plante (mort cellulaire par exemple).
La transformation génétique des plantes peut être effectuée par les
méthodes classiques connues en elles-mêmes de l'homme du métier.
A titre d'exemples non limitatifs, pour la transformation des
cucurbitacées et notamment du melon, on pourra utiliser les techniques
décrites par GUIS
et al. (Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 15, 289-31 l, 1998 ;
Scientia
horticulturae, 84, 91-99, 2000). Pour la transformation du cotonnier on pourra
utiliser les
techniques décrites par PANNETIER et al. (Euphytica, 96, 163-166, 1997). Pour
la
transformation de la tomate, il est possible d'utiliser les protocoles décrits
par HAMZA et
CHUPEAU (J. Exp. Bot., 44, 1837-1845, 1993).
Alternativement, des plantes possédant une résistance accrue au puceron
Aphis gossypü et/ou à la transmission virale par ledit puceron, peuvent être
obtenues par
mutagenèse dirigée, afin d'introduire dans l'allèle du géne ï~at présent chez
lesdites plantes
les modifications nécessaires pour conférer cette résistance.
Des méthodes de mutagenèse dirigée utilisables dans le cadre de la
présente invention sont connues en elles-mêmes de l'homme du métier ; elles
sont par
exemples décrites dans l'ouvrage de D. TAGU (eds 1NRA 1999).
L'invention concerne également les plantes transformées obtenues par un
procédé de transgenèse ou de mutagenèse dirigée conforme à l'invention, ainsi
que les
descendants de ces plantes. L'invention englobe également les produits obtenus
à partir de
ces plantes, tels qu'organes ou tissus végétaux, cellules, semences etc.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de
description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs
illustrant la définition
de marqueurs associés au gène Irat, le clonage de ce gène et l'utilisation
dudit gène pour
obtenir des plantes résistantes au puceron A. gossypü et/ou à la transmission
virale.
EXEMPLE 1: IDENTIFICATION DU GENE T~AT PAR UNE APPROCHE
GENETIQUE
- Création de la bangue BAC
Une banque BAC d'ADN génomique de melon (variété PI 161375
résistante à Aphis gossypü et à la transmission virale par ce puceron)
représentant environ
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29 équivalents génome a été construite. La première partie de la banque BAC
comporte
66048 clones (ADN digéré par BamHI, Hindlll), la seconde 56448 clones (ADN
digéré par
EcoR~.
- Criblage de la bangue BAC et choix du clone BAC porteur du locus T~at
Afin d'identifier le clone porteur du gène Yat, la banque a été criblée à
l'aide de marqueurs flanquant le locus Yat. Plusieurs clones BAC couvrant le
locus vat ont
été identifiés et ordonnés. A partir de ces clones BAC de nouveaux marqueurs
ont été
générés. Le clone BAC 3.18.9 porteur d'une insertion de 170 kb comprenant le
locus Yat a
été choisi pour l'identification du gène hat et séquencé. Ce clone comprend
les marqueurs
L273 et L246 encadrant le locus Yat. Dix plantes recombinantes sur 6000
plantes issues
d'une population backcross [(Védrantais(sensible) x PI 161375 (résistant)) x
Védrantais]
ont été identifiées entre le marqueur L273 et le gène T~at, alors qu'une seule
a été identifiée
entre le marqueur L246 et le gène Yat.
Le marqueur L273 est défini par les amorces:
F2-B2 :GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO : 7)
et
F2-Br :TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO : 8)
Le produit d'amplification obtenu à partir d'ADN génomique de la
variété Védrantais (Vilmorin) (sensible à Aphis gossypü) ou de la variété PI
161375
(accession d'origine coréenne multipliée par l'1NR.A) (résistante à A.
gossypü) a une
longueur de 210 pb. Le produit d'amplification possède un site de restriction
BsiWI dans la
variété PI 161375 conduisant à l'obtention de deux fragments de 181 pb et 29
pb. En
revanche, la digestion par l'enzyme BsrGI restreint l'amplifiat de Védrantais
en trois
fragments : 153 pb, 28 pb et 29 pb et celui de PI 161375 en deux fragments de
182 pb et 28
pb.
Le marqueur L246 est défini par les amorces:
F2-B2 Eco:ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID NO : 9)
et
F2 Eco:GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID NO : 10)
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la
variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 173 pb. Le
produit
d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour
l'enzyme EcoRh
conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 144 pb et 29 pb.
A partir du clone BAC 3-18-9 possédant les deux marqueurs L273 et
L246, des oligonucléotides (Tableau 1) ont été désignés'dans la région
comprise entre ces
deux marqueurs afin d'en réduire l'intervalle et de délimiter précisément le
gène hat.
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Le marqueur V432 est défini par les amorces:
V432:AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO: 15)
et
V432R:TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16)
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la
variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 432pb. Le
produit
d'amplification de la variété PI 161375 possède un site de restriction pour
l'enzyme HaeII
conduisant à l'obtention de deux fragments respectivement de 223 pb et 209 pb.
Ce site de restriction est absent chez la variété Védrantais.
Le marqueur V681 est défini par les amorces
V681: GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ 117 NO : 11)
et
V681R: GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12)
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la
variété Védrantais ou de la variété PI 161375 a une longueur de 681 pb. Le
produit
d'amplification de la variété PI 161375 possède deux sites de restriction pour
l'enzyme
Rsal conduisant à l'obtention de trois fragments respectivement de 435 pb, 221
pb et 25
pb. Ces sites de restriction sont absents chez la variété Védrantais.
Le marqueur V 1684 est défini par les amorces
V588 :CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13)
et
VSS1R :GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14)
Le fragment amplifié dans la variété Védrantais mesure environ 1300 pb
tandis que dans la variété PI161375, l'amplifiat mesure 1684 pb. Il s'agit
dans ce cas, d'un
polymorphisme de taille.
Ces marqueurs, ainsi que les marqueurs D, E, et M8 (cf. exemple 4 ci-
dessous) et les oligonucléotides les définissant sont indiqués dans le Tableau
1 ci-après
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TahlPai i 1
MarqueursOligonuclotides5' Squence oligonuclotide 3'
L273 F2-B2 GGAGAGAGAATCCGGGACTAAGTGACT (SEQ ID NO
: 7)
F2-Br TAACCACCTTTTCCGATCAAATTTCGTAC (SEQ ID NO
: 8)
L246 F2-B2 Eco ATTGATGAATCTACACTCCTCGATCTCTTC (SEQ ID
NO : 9)
F2 Eco GAGTTCAATCCATTTCAATGATTTAAGATA (SEQ ID
NO : 10)
V681 V681 GGAATCTTGTTGAGGCCGAGAGGG (SEQ ID NO : 11
)
V681R GTTGTATATGGCTTCCCTGTAGCC (SEQ ID NO : 12)
V1684 V588 CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG (SEQ ID NO : 13)
V551R GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGCC (SEQ ID NO : 14)
V432 V432 AACTTCTCCAACTCCCTCCACTGC (SEQ ID NO : 15)
V432R TTAGAGTGGCAAAGGGAAGATGGG (SEQ ID NO : 16)
GRP805 GRP805 ATCCCCTGTTTCCTTCAACAACCC (SEQ ID NO : 17)
GRP805R AACCCCCAAGAAGAAGAACAACCC (SEQ ID NO : 18)
M8 M8 CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO :
19)
M8R TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO
: 20)
MarqueurLRR1 CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21
E )
LRR842R CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22)
MarqueurLRR915 AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23)
D
LRR1R GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
Des combinaisons de ces oligonucléotides (Tableau 2) ont été utilisées
pour amplifier l'ADN de plantes backcross issues du croisement [F1(Védrantais
x PI
161375) x Védrantais] et qui présentent des événements de recombinaison à
proximité du
locus Tlat.
Les résultats sont illustrés par le Tableau 2 ci-après, et la Figure 4.
TahlPai ~ ~
MarqueurL273 GRP805 V432 V1684 Vat V681L246 M8
Oli o F2-B2GRP805 V432 V588 :Q V681F2-B2EcoM8
1 ~
Oli o F2-BrGRP805RV432R V551 ,~ V681F2Eco M8R
2 R ~, R
~
~
DigestionBsrGl_ Haell Pas de ~ v,. RsalEcoRV Aat
Sapl II
n, di estion
L :0
,
Vdrantais+28pb805 432pb 1 00 ~ 681 173 228
p b . b c pb pb pb
'~ +29 p .
m b
182pb805 223pb ~ 435pb144pb 195
pb ~ pb
E PI 161375+28 + 508 +209 1684pb a ~ +221+29 +33
Q b pb b ~ pb b b
p p p p
297 +25
b b
P20 82 - + + + R + + +
P6 93 - - + + R + + +
P147 - - + + R - + +
+
848 - _ _ _ S _ _ +
P4 23 + - - - S - - -
P1174 + - - - S - - -
- P35 35 + - - - S - - -
P35 53 + _ _ - S _ _ _
310 + + _ _ S _- - _
P26 64 + + + _ S _ _ _
P10 35 + + + + S _ _ _
P49 40 + + ~ + ~ + ~- - _ _
~ ~ ~ +
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Ces résultats montrent que
La plante P26 64 présente un événement de recombinaison entre le
marqueur V432 et le gène T~at.
La plante P49 40 présente un événement de recombinaison entre le
marqueur L246 et le gène hat.
La plante P10 35 présente un événement de recombinaison entre le
marqueur V1684 et le gène Tlat. Comme le marqueur V1684 comprend l'ATG du gène
Yat, cette plante présente une recombinaison intragénique détruisant la
fonction du gène.
Le marqueur V681 co-ségrège avec le gène Tlat.
Ces données permettent donc d'identifier génétiquement le gène hat.
EXEMPLE 2 : SOUS-CLONAGE ET VERIFICATION DE LA SEQUENCE DU
GENE YAT
Un sous clonage du gène T~at a été réalisé dans le vecteur pGEM~3Zf+
(Promega). Pour ee faire, une digestion du clone BAC 3-18-9 avec l'enzyme de
restriction
Mscl a été réalisée. Chaque fragment ainsi généré a été ligué dans le vecteur
pGEM~3Zf+
(Promega) puis criblé avec les marqueurs flanquant le gène T~at ou internes à
ce gène.
Un clone de 18185 pb contenant le gène hat a été identifié (Clone C7.1).
Le séquençage des extrémités du clone C7.1, des restrictions enzymatiques
ainsi que le
séquençage du gène Yat avec les oligonucléotides du Tableau 1 ont permis de
vérifier qu'il
s'agissait bien du gène T~at. La séquence d'une portion de 11097 pb de ce
clone est
représentée sur la Figure 1, ainsi que dans la liste de séquences en annexe
(SEQ ID NO: 1).
EXEMPLE 3 : OBTENTION DE L'ADNc DU GENE YAT
L'ADNc a été obtenu en utilisant le kit MarathonTM cDNA clone kit,
(Clontech). Cet ADNc est représenté sur la liste de séquences en annexe sous
le numéro
SEQ ID NO: 2.
Le gène Tlat comporte 4 exons et 3 introns
Le premier exon comporte 2367pb et s'étend de la base 1 du codon
d'initiation ATG (correspondant à la position 2344 selon SEQ ID NO : 1) à la
base 2367
(correspondant à la position 4710 selon SEQ ID NO : 1).
Le premier intron s'étend de la base 2368 à la base 2921 (4711 à 5264
selon SEQ ID NO : 1).
Le deuxième exon s'étend de la base 2922 à la base 4055 (5265 à 6398
selon SEQ ID NO : 1).
Le deuxième intron s'étend de la base 4056 à la base 4876 (6399 à 7219
selon SEQ ID NO : 1).
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Le troisième exon s'étend de la base 4877 à la base 5734 (7220 à 8077
selon SEQ ID NO : 1).
Le troisième intron s'étend de la base 5735 à la base 5833 (8078 à 8176
selon SEQ ID NO : 1).
Le quatrième exon s'étend de la base 5834 à la base 5896 (8177 à 8239
selon SEQ ID NO : 1).
EXEMPLE 4 : DISTINCTION ENTRE LE GENE VAT ET LE GENE VAT-LIKE
Lors du criblage précédent, un clone portant un homologue du gène hat
(Yat-litre) a été identifié (93,8% d'identité au niveau nucléique et 89,9% au
niveau
protéique). La séquence de Trat-litre est représentée dans la liste de
séquences en annexe
sous le numéro SEQ ID NO: 4.
Les gènes Yat et Yat-litre sont liés génétiquement et physiquement
puisqu'ils sont séparés de 17 kb.
Deux marqueurs (marqueur D et marqueur E) permettent de distinguer le
gène T~at du gëne Yat-litre chez PI 161375.
Le marqueur E est défini par les amorces
LRRl :CCTTAGAAGAAGATGAAGTCTCCC (SEQ ID NO : 21)
et
LRR842R:CTCCACTCAGAATTGGTAGGTGCC (SEQ ID NO : 22)
Ce marqueur permet d'amplifier chez PI 161375 un fragment de 1722 pb
correspondant au gène T~at, et un fragment de 1527 pb correspondant au gène
T~at-litre.
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la
variété Védrantais a sur gel d'agarose une longueur d'environ 1,3 kb.
Le marqueur D est défini par les amorces
LRR915:AACAACTTAGAACCATCTCCCAGC (SEQ ID NO : 23)
et
LRR1R:GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC (SEQ ID NO : 24)
Ce marqueur permet d'amplifier chez PI161375 un fragment de 1549 pb
correspondant au gène Yat et un fragment de 1372 pb correspondant au gène hat
litre.
Chez Védrantais, le marqueur permet d'amplifier 4 fragments d'ADN d'environ
750 pb,
900 pb, 1100 pb, 1300 pb.
Les marqueurs L246 et M8 permettent de caractériser des recombinants
entre le gène vat et le gène hat-litre et de distinguer génétiquement ces deux
gènes.
CA 02512644 2005-07-06
16
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Le marqueur M8 est défini par les amorces
MS :CCGACGCATCTCCCGACGCGTTGTTG (SEQ ID NO : 19)
et
M8R :TCGTGAAGGGTTTTGGAGAGTGAGAAA (SEQ ID NO : 20)
Le produit d'amplification obtenu à partir de l'ADN génomique de la
variété Védrantais et PI 161375 a une longueur de 228 pb. Le produit
d'amplification de la
variété PI 161375 possède un site de restriction pour l'enzyme AatII
conduisant à
l'obtention de deux fragments respectivement de 195 pb et 33 pb.
En effet, des plantes recombinantes entre les gènes Vat et Vat-litre ont été
identifiées au sein de la population backcross [F1(Védrantais x PI 161375) x
Védrantais].
Les plantes portant uniquement le gène Vat-litre sont sensibles à Aphis
gossypü, par
exemple, la plante 848 (tableau 2). A l'inverse, les plantes ne possédant pas
le gène Vat
like sont résistantes aux pucerons A. gossypü, par exemple la plante P4940
(Tableau 2).
EXEMPLE 5 . CONSTRUCTION D'UN VECTEUR D'EXPRESSION
CONTENANT LE G~NE YAT
L'ADN génomique du gène vat sans son promoteur est introduit dans le
vecteur binaire pain 61 (BENDAHMANE et al., The Plant Journal 32, 195-204,
2002 ;
séquence également disponible sur le site http://www.sainsbury-
laboratory.ac.uk/david-
baulcombe/Services/pBin6l.doc) contenant notamment le gène chimérique
NOS/NPTII, le
marqueur de sélection de résistance à la kanamycine et le promoteur p35S. Le
gène Yat en
orientation sens est introduit après le promoteur p35S. Le vecteur pBin61 est
introduit dans
différentes souches d'Agrobacterium turnefaciens (LBA4404, C58C1-pch32 )
Alternativement, l'ADN génomique complet, comprenant 2,5 kb environ
en amont et en aval du gène Yat afin de s'assurer de la présence du promoteur
et des
séquences régulatrices, est introduit en bouts francs dans le vecteur SLJ7292
(JONES et
al., Transgenic Research, 1, 285- 30 297, 1992) et pain 19 (BEVAN et al.,
Nucleic Acids
Res 12 : 8711-8721, 1984). Les vecteurs binaires SLJ7292 et pain 19 contenant
le gène
Yat sont introduits dans différentes souches d'Agrobacte~ium tumefaciens
(LBA4404,
C58C1-pch32, C58C1-pMP90)(SCHWEITZER et al., Plasmid, 4(2), 196-204, 1980 ;
GOODNER et al., Science, 294(5550), 2323-2328, 2001), ou C58pGV2260 (DEBLAERE.
et al., Nucleic Acids Res. 13, 4777-4788, 1985).
Le tableau 3 indique les constructions utilisées en fonction des plantes.
CA 02512644 2005-07-06
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TahlPan R
Nom romoteursouche Plasmide antibioti ues Plante
B1-1 Vat C58C1- ch32Bin 19 kanam cine 50m Melon,
lL tomate
B1-3 Vat C58C1-pMP90pBin19 kanamycine (50mg/L)Melon,
gentamycine tomate,
20m lL cotonnier
pGV2260 Vat C58C1- pain 19 kanamycine (50mg/L)Cotonnier
Vat-Vat pGV2260 carbencilline
(50
mg/L)
rifam cine 50m
/L
Vat 11.1Vat LBA4404 SLJ7292 ttracycline Cotonnier
(5mg/L)
streptomycine
(300mg/L)
rifam cine 50m
lL
A6-3 35S C58C1-pch32pain 61 kanamycine (50mg/L)Melon,
ttracycline tomate,
(5mg/L)
cotonnier
35C 35S-GUS LBA4404 B1121 kanam cine 50m Melon
/L
EXEMPLE 6 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LE MELON
- Obtention de plantes de melon génétiguement transformées
Le protocole suivi est adapté à partir de celui de GUIS et al. (Scientia
Horticulturae, 84, 91-99, 2000).
De jeunes expiants de feuilles de melon sensible de la variété Védrantais
(VILMOR1N) sont incubés sous agitation dans une suspension d'Agrobacterium
tumefaciens (106 à 108 celluleslmL), pendant 30 minutes. Les transformations
sont réalisées
avec les constructions décrites dans l'exemple 5.
Les expiants potentiellement transformés sont ensuite transférés sur du
papier Whatman n°1 pendant 10 minutes, puis incubés 2 jours à
27°C à l'obscurité sur un
milieu de coculture contenant 1 ~.M de 6-benzylaminopurine (BAP), 1 ~,M de 6-
(g,g-
diméthylallylamino)-purine (2iP), 0,2mM d'acétosyringone et 0,7g.L-1 d'agar.
La régénération des expiants foliaires est obtenue en utilisant les
conditions décrites par KATHAL et al. (Plant Cell Reports, 7, 449-451, 1988)
avec
quelques modifications. Les expiants foliaires sont transférés sur un milieu
de régénération
composé du milieu MURASHIGE et SKOOG (MS) (Physiol. Plant, 15, 473-497, 1962)
supplémenté avec 1 ~.M de 6-benzylaminopurine (BAP), 1 ~,M de 6-(g,g
diméthylallylamino)-purine (2iP), contenant 100 mg.L-1 de kanamycine et 225
mg.L -1 de
timentin et solidifié dans l'agar 0,7g.L -1.
Après 3 semaines de culture, les bourgeons formés sur les expiants
foliaires sont excisés et ïncubés sur un milieu de développement constitué par
le milieu MS
supplémenté avec 1 ~.M de BAP et 0,3~.M d'acide gibbérélique (GA3) contenant
100
mg.L-1 de kanamycine et 225 mg.L '1 de timentin et solidifié dans 0,7g.L-1
d'agar.
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Les bourgeons sont ensuite placés dans le milieu d'enracinement
constitué par le milieu MS sans régulateur de croissance et contenant les
mêmes quantités
d'antibiotiques et d'agar.
Dès que les racines apparaissent, les plantules sont acclimatées selon
GUIS et al. (Scientia Horticulturae, 69, 199-206, 1997) et transférées en
serre suivant les
pratiques culturales décrites par AYUB et al. (Nature Biotechnology, 14, 862-
866, 1996).
Les plantes régénérées et enracinées sont analysées par cytométrie de
flux. Seules les plantes diploïdes sont conservées et étudiées au niveau
moléculaire par
PCR pour vérifier la présence du transgène.
Pour révéler la présence du gène Pat, la paire d'amorces V1684 (SEQ ID
N° 13 et 14) située au niveau du promoteur Yat et la paire d'amorces D
(SEQ ID N° 23 et
24) située au milieu du gène hat comme décrites dans l'exemple 1, sont
utilisées.
Les conditions de PCR sont les suivantes
Mélange réactionnel : eau qsp 1 O~.L ; tampon l OX 1 ~.L ; dNTP's (4mM)
0,6~L ; amorce 1 (10 pM) 0,4~L et amorce 2 (10 pM) 0,4~L ; Taq Takara (SU/~.L)
0,08~L ; ADN 1,2~,L.
- Conditions de PCR utilisées:
étape 1 : 2 mn à 94°C
étape 2 dénaturation : 30 sec à 94°C
étape 3 appariement : 45 sec à 60°C
étape 4 élongation : 2 mn à 72°C
étape 5 : 30 cycles de l'étape 2 à l'étape 4
étape 6 : 10 mn à 72°C
b- Pour révéler la présence du gène nptll de résistance à la kanamycine,
les amorces
Kana II : 5'-CCGGCTACCTGCCCATTC-3' (SEQ ID NO : 25)
et Kana III : 5'-GCGATAGAAGGCGATGCG-3' (SEQ ID NO : 26)
sont utilisées dans les conditions suivantes
- Mélange réactionnel : eau qsp 1 O~,L ; tampon l OX 1 ~.L ; MgCl2
(25mM) 0,6~,L ; dNTP's (4mM) 0,2~L ; amorce 1 (10 pM) 0,4~.L et amorce 2 (10
pM)
0,4~.L ; Taq Promega (SU/~L) 0,04~L ; ADN 1,2~L.
- Conditions de PCR utilisées:
étape 1 : 2 min à 94°C
étape 2 dénaturation : 30 sec à 94°C
étape 3 appariement : 1 min à 53°C
étape 4 élongation : 1 min à 72°C
étape 5 : 30 cycles de l'étape 2 à l'étape 4
CA 02512644 2005-07-06
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étape 6 : 10 min à 72°C
c- Pour vérifier qu'aucune amplification n'est due à la présence de bactéries
résiduelles
dans les tissus étudiés, les plantes sont également testées par PCR avec les
amorces PicA+
(ATGCGCATGAGGCTCGTCTTCGAG ; SEQ ID NO : 27) et PicA-
(GACGCAACGCATCCTCGATCAGCT; SEQ ID NO: 28) spécifiques de l'ADN
chromosomique des souches C58 d'A. tumefaciens ; le mélange réactionnel et les
conditions de PCR étant identiques à ceux utilisés vis-vis du gène nptll.
Plusieurs séries de transformations sont réalisées sur melon à partir des
différentes constructions présentées dans l'exemple 5. Les résultats de ces
transformations
sont synthétisés dans le tableau 4.
Tahlaai ~ 4
Nombre
de
Nombre expiantsplantes Nombre
de
plantes
diplides
positives
en
GnotypeConstructionen culture racines PCR
di lides
Vat Vat
nptllmarqueurmarqueurPicA+/PicA-
V1684 D
VdrantaisB1-1 100 2 2* 2* 2* 0
VdrantaisB1-3 106 0 0 0 0 0
VdrantaisA6-3 112 0 0 0 0 0
Vdrantais 0 0 0 0
tmoin
sensible
P1161375 0 + + 0
tmoin
rsistant
Vat
"' Deux plantes dipldides de melon Védrantais (M~ et M4) obtenues sur le meure
expiant a parer ae
la construction B1-1 sont identifiées comme porteuses de l'insert contenant
les gènes nptll et Vaf.
Deux transformants porteurs du gène T~at du génotype Védrantais orit été
obtenus par ce premier protocole.
Les plantes racinées diploïdes sont bouturées i~ vitro sur milieu dépourvu
d'antibiotiques, puis sevrées et acclimatées en chambre climatisée (8h de nuit
à 18°C-16h
de jour à 24°C) pendant 4 semaines avant la réalisation des tests
biologiques.
Alternativement, la méthode de transformation génétique d'expiants
cotylédonnaires décrite dans le brevet EP0412912 (LIMAGRAIN) a également été
suivie.
Environ 10 000 expiants du génotype de melon ClTzl ont été inoculés avec la
bactérie
C58C1pmp90 porteuse de la construction pVat-gène Vat. Les plantes régénérées
et
enracinées sur le milieu pourvu de 100 mg. L-1 de kanamycine ont été analysées
par PCR
pour vérifier la présence des transgènes : raptll et hat. Les amorces et
conditions PCR
utilisées sont celles décrites ci-dessus. 27 évènements de transformation ont
été identifiés
comme porteurs du gène nptll.
Au total, 2 transformants porteurs du gène Vat du génotype Védrantais
ont été obtenus par le premier protocole et 27 transformants ont été obtenus
par le second
protocole.
CA 02512644 2005-07-06
WO 2004/072109 2~ PCT/FR2004/000050
- Mesure de la résistance à la colonisation uar A ~ossynü
Le clone Nml collecté sur des melons (G. LABONNE, INRA ,
Montpellier) et décrit comme le clone 13 (LUPOLI et al., Entomologia
Experimentalis et
Applicata, 65, 291-300, 1992) est utilisé. Les pucerons A. gossypü sont élevés
sur melon
Védrantais en chambre de culture (16 heures de jour à 24°C et 8 heures
de nuit à 18°C).
Les plantes ih vitro issues des expériences de transformation génétique
ainsi que des mises en germination in vitro des plantes témoin ont été
acclimatées i~ vivo
pendant 10 jours.
Le test de résistance à la colonisation par A. gossypü est adapté de
PITRAT et LECOQ (Phytopathology, 70, 958-961, 1980). Les adultes aptères sont
prélevés avec un pinceau fin et mis à jeûner pendant 1 heure dans une boîte de
Pétri. Dix
pucerons sont déposés sur deux feuilles étalées de chaque plante à tester. 48
heures aprés
dépôt, le nombre de pucerons fixés sur les feuilles est comptabilisé. A 48
heures, sur les
plantes sensibles les 10 pucerons déposés sont fixés alors que sur les plantes
résistantes
seuls quelques pucerons (en général moins de 5) restent sur les feuilles. Puis
7 jours après
infestation, le nombre de pucerons adultes et de larves, ainsi que leur stade
de
développement est observé. Au bout de cette période sur les plantes sensibles,
une nouvelle
génération de pucerons est produite (plus de 100 pucerons présents en moyenne)
et de
nombreuses larves sont présentes (également plus de 100). Sur les plantes
résistantes,
quelques adultes (en général moins de 5) restent sur les feuilles et seules
quelques larves
peu développées sont présentes (moins de 30). Dans chaque test, le témoin
sensible utilisé
est le cultivar Védrantais et le témoin résistant est le cultivar Margot
homozygote pour le
locus hat.
Les résultats obtenus sont présentés dans les tableaux 5 et 6
CA 02512644 2005-07-06
WO 2004/072109 ~1 PCT/FR2004/000050
TahlPai ~ .r,
Observations Observations
48h 7 jours
Plantes Nombre Nombre Nombre Nombre Nombre
plantes plantes tantes
testes p plantes plantes
rsistantessensiblesrsistantessensibles
Tmoin sensible10 0 10 0 10
Vdrantais
Tmoin rsistant10 10 0 10 0
Mar ot
M1 8 7 1 7 1
M4 I 12 - I 12 ~ 12 0
~ ah~eau H
Plante Nombre Nombre mo ndividus
mo en en d'i 7 'ours
d'individus
48h
s adultes larves adultes larves
Tmoin sensible9 84 116 128
7
Vdrantais ~
Tmoin rsistant
2,5 3,2 1,1 18
Mar ot
M1 3,6 17* 8,7* 34*
M4 3,2 10 4,5 30
esnme sur les plantes résistantes
Alternativement, on peut déposer 3 pucerons au lieu de 10 sur les feuilles
de chaque plante à tester. Les pucerons peuvent être maintenus en cage ou non.
Sept jours
aprës le dépôt des pucerons, le nombre de pucerons adultes et de larves
présents sur les
plantes sont comptés.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 7:
TahlPai i 7
N
Nombre Nombre Nombre Nombre de Nombre
de de de de
plantulesplantuleslantules plantules
l P plantules Remarques
c acclimatesinoculesrsistantesintermdiairessensibles
one
CITz15 5 0 0 5 Tmoin
sensible
CITz35 5 5 0 0 Tmoin
rsistant
V2.3 9 9 0 0 9 Sensible
Prsence
de
V2.4 6 4 2 2 0 boutons
floraux
V2.1212 11 0 0 11 Sensble
V2.156 6 6 0 0 Rsistant
V3.1 12 12 12 0 0 Rsistant
V3.6 4 4 4 0 0 Rsistant
V 7 7 7 0 0 Rsistant
4.18
V4.457 7 0 0 7 Sensible
V7.197 7 7 0 0 Rsistant
V7.257 7 0 0 7 Sensible
V8.268 7 0 0 7 Sensible
Ces résultats monirent que les clones M1, M4, V2.15, V3.1, V3.6, V4.18
et V7.19 sont résistants aux pucerons.
CA 02512644 2005-07-06
WO 2004/072109 22 PCT/FR2004/000050
- Mesure de la résistance à la transmission des virus uar A. gossypü.
Les tests de transmission virale sont réalisés essentiellement comme
décrit par PITRAT et LECOQ (Phytopathology, 70, 958-961, 1980). La souche I17F
du
CMV (Cucumber Mosaic Virus) peut être utilisée pour les tests de transmission
par A.
gossypü chez les plantes transformées et les lignées témoins Védrantais et
Margot. Le virus
est multiplié sur melons Védrantais par inoculation mécanique. Après 1 heure
de jeûne, les
pucerons adultes sont déposés pour 5 minutes d'acquisition sur les feuilles
virosées placées
en boîte de Pétri. Les pucerons sont ensuite transférés sur les plantes à
tester. Environ 15
minutes après dépôt des pucerons virulifères, les pucerons sont retirés au
pinceau puis les
plantes sont traitées avec un insecticide et mises en chambre de culture (12
heures de jour à
24°C et 12 heures de nuit à 18°C). Quinze jours après
inoculation, les plantes sensibles à la
transmission du CMV par A. gossypü développent des symptômes de mosaïque
sévères.
Les plantes résistantes ne présentent aucun symptôme et le virus n'est pas
détecté par
ELISA dans ces plantes. Le test ELISA suit le protocole décrit pas CLARI~ et
ADAMS (J.
Gen. Virol, 34, 475-483, 1977) avec un anticorps dirigé contre la protéine de
capside du
CMV (ADGEN, fourni par la société LCA, Bordeaux, France).
EXEMPLE 7 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LA TOMATE
Transformation de la tomate
Le protocole de transformation est adapté de HAMZA et CHUPEAU (J.
Exp. Bot., 44, 1837-1845, 1993) par P. Rousselle (1NRA, Montfavet, France) à
partir de
cotylédons de plusieurs génotypes Férum (lignée INRA), et Montfavet 63.5
(hybride F 1 ).
Les souches utilisées pour la transformation sont celles décrites dans
l'exemple 5. Les plantes régénérées et enracinées sont analysées par
cytométrie de flux et
seules les plantes diploïdes sont conservées.
Les analyses moléculaires ayant pour objet de vérifier la présence de
l'insert contenant le gène nptll et le gène Yat ainsi que son expression dans
le génome des
plantes régénérées sont effectuées par PCR et RT-PCR. Les conditions PCR
utilisées sont
identiques à celles décrites dans l'exemple 6. Quatre paires d'amorces ont été
utilisées
V 1684 (SEQ ID N° 13 et SEQ ID N° 14) située au niveau du
promoteur Tlat, les paires
d'amorces des marqueurs D (SEQ ID N°23 et SEQ ID N°24) et E (SEQ
ID N°21 et SEQ
ID N°22) situées au milieu du gène Trat et les amorces V632 qui
amplifient un fragment
situé en 3' du gène. Les séquences des amorces V632 sont les suivantes
Vat 6328 : CTGGTGATGACATTCATATCTTCC (SEQ 1D NO : 29)
Vat 632F : CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC (SEQ ID NO : 30)
CA 02512644 2005-07-06
WO 2004/072109 23 PCT/FR2004/000050
Plusieurs séries de transformations sont réalisées sur tomate à partir des
différentes constructions (tableau 8) et sur deux génotypes différents Ferum
et Montfavet
(INRA). .
Tahlc~i i f2
NombreNombre
expiantsplantes
GnotypeConstruction Nombre
de
plantes
positives
en
PCR
en racines
culturedi
Idides
Vat Vat Vat Vat
picA+
nptllmarqueurmarqueurmarqueurmarqueurIPicA-
V1684 E D V632
Ferum B1-1 120 0 0 0 0 0 0 0
Ferum B1-2 105 3 3 3 2* 2* 2* 0
Ferum B1-3 90 0 0 0 0 0 0 0
Ferum A6-3 120 0 0 0 0 0 0 0
MontfavetB1-1 90 1 1 1 1 1 1 0
MontfavetB 1-2 80 6 6 3 4 4 4 0
MontfavetB1-3 80 3 3 3 2 2 2 0
MontfavetA6-3 91 11 10 ** 9 10 10 0
Ferum 0 0 0 0 0 0
tmoin
sensible
non
transform
Montfavet 0 0 0 0 0 0
tmoin
sensible
*
Deux
plantes
(T2
et
T7)
ont
intgr
l'insert
en
entier.
Dans
la
troisime
plante
seul
le
gne
nptll
et
une
fraction
du
gne
Vat
(incluant
le
marqueur
V1684)
ont
t
intgrs.
**
La
construction
A6-3
contient
le
gne
Vat
sous
contrle
du
promoteur
35S
;
la
paire
d'amorces
V1684
(situ
sur
une
rgion
du
promoteur
Vat)
ne
permet
pas
de
cribler
les
transformants.
Les
analyses
molculaires
par
RT-PCR
sur
la
plante
T7
et
un
tmoin
Ferum
avec
la
paire
d'amorces
du
marqueur
D
(selon
les
conditions
dcrites
dans
l'exemple
6)
ont
permis
de
rvler
l'expression
du
gne
fat
dans
la
plante
transforme
(T7)
L'ensemble des amorces utilisées sur les plantes transformées du
génotype Montfavet permet de déterminer 14 plantes provenant d'expiants
différents ayant
intégré la totalité du transgène.
Au total, 2 plantes du génotype Ferum et 14 plantes du génotype
Montfavet 63.5 ont intégré le gène hat.
Seules les plantes transformées sont bouturées, sevrées et acclimatées en
chambre climatisée (8h de nuit à 18°C-16h de jour à 24°C)
pendant 4 semaines avant la
réalisation des tests biologiques. Seules les deux plantes Ferum ont été
analysées à ce jour.
- Mesure de la transmission virale
La méme souche d'A. gossypü (Nml) et le même protocole de
transmission par A. gossypü que pour les tests de résistance à la transmission
du virus sur
melon sont utilisés. Le virus choisi est le CMV (virus de la mosaïque du
concombre)
souche I17F qui infecte le melon et la tomate. Cette souche est efficacement
transmise à la
tomate, lorsqu'elle est inoculée mécaniquement ou transmise par Myzus persicae
(JACQUEMOND et al., Molecular Breeding, 8(1), 85-94, 2001). Le virus est
multiplié sur
r
CA 02512644 2005-07-06
24
WO 2004/072109 PCT/FR2004/000050
plantules de melon Védrantais. L'acquisition du CMV par A. gossypü est faite
sur ces
plantules de melon infectées. La transmission est faite sur des plantules de
tomate issues
d'in vitro au stade 5 feuilles ou sur plantules issues de semis au stade 2
feuilles (environ 5
semaines après semis) en déposant 10 pucerons virulifères sur chaque plante.
Le taux de
transmission sur chaque génotype (tomates témoins et transformées) est évalué
sur au
minimum 2 répétitions de 20 plantes. La variété témoin sensible est la variété
Férum.
Le test ELISA suit le protocole décrit par CLARK et ADAMS (J. Gen.
Virol., 34, 475-483, 1977) avec un anticorps dirigé contre la protéine de
capside du CMV
(ADGEN, fourni par la société LCA, Bordeaux, France).
Les premiers résultats obtenus sur un faible effectif de plantes sont
décrits dans le tableau 9.
TahlPan 9
Nombre Evaluation 21 'ours a rs infection
lantes
Plantes p Nombre plantes Nombre plantes non
testes infectes infectes*
Ferum tmoin sensible6 6 0
Ferum T1 9 9 0
Ferum T2 3 2 1
Ferum T7 6 3 3
au~m k;C ue ~ymyrnes ei ae mrus aeiecie par c~mH
Les plantes dn code T1, porteur d'un gène hat tronqué, et celles du
témoin sensible sont infectées à 100%. Dans quelques plantes transformées des
codes T2 et
T7, le virus n'a pas été transmis, ce qui suggère que le gène Irat aurait un
effet sur la
résistance à la transmission virale par A. gossypü chez les tomates
transgéniques ayant
intégré T~at.
EXEMPLE 8 : VALIDATION FONCTIONNELLE CHEZ LE COTONNIER
- Transformation du cotonnier
La transformation génétique du cotonnier (Gossypium hirsutum L.) est
basée sur la régénération de transformants via un processus d'embryogenèse
somatique
publié par SHOEMAKER et al. (Plant Cell Reports, 3, 178-181, 1986) et par
TROLINDER et GOODIN (Plant Cell Reports, 6, 231-234, 1987). Ce procédé de
transformation utilise la bactérie Agrobactenium tumefaciens comme vecteur de
transformation selon UMBECK et al. (Biotechnology, 5, 263-266, 1987) et
FIROOZABADY et al. (Plant Molecular Biology, 10, 105-116, 1987) avec quelques
modifications et adaptations par rapport aux publications mentionnées. Les
souches
d'Agrobactéries utilisées pour la transformation sont les mêmes que celles
décrites dans
l'exemple 5 et notamment les souches LBA4404, C58C1pGV2260 et C58C1pMP90. La
première souche contient soit le plasmide pSLJ7292 composé entre autre du gène
de
résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur Nos et le gène Yat sous
contrôle de
CA 02512644 2005-07-06
WO 2004/072109 25 PCT/FR2004/000050
son propre promoteur, soit le plasmide pain 61 qui comprend le gène hat sous
contrôle du
promoteur 355. Les deux autres souches sont porteuses du plasmide pBinl9
composé entre
autre du gène de résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur Nos et
le gène hat
sous contrôle de son propre promoteur.
- Résénération du cotonnier
Des expiants d'hypocotyles (variété Coker 310) prélevées sur des jeunes
plantes cultivées en conditions aseptiques sont utilisés. Ils sont mis en
présence de
l'Agrobactérie pendant 20 minutes puis mis en culture 48 heures sur un milieu
de culture
(milieu de base) composé des éléments minéraux de MURASHIGE et SKOOG (MS), 30
g
L-I de glucose, les vitamines de MOREL et WETMORE (Am. J. Bot. 38, 141-143,
1951),
0,1 à 0,05 mg L-1 d' acide 2,4 dichlorophenoxyacétique et 0,1 à 0,01 mg L-1 de
kinétine. Ce
milieu ne contient ni agent de sélection ni antibiotique ayant pour but de
stopper la
croissance de la bactérie. Après cette période de co-culture, les expiants
sont repiqués sur
le même milieu additionné de kanamycine à la concentration 25 mg L-1 et de
céfotaxime à
la concentration 500 mg L-1. Les expiants sont ensuite repiqués tous les 15
jours sur ce
même milieu. Les cals issus de la prolifération des cellules transformées
apparaissent après
3 à 5 semaines de culture. Lorsque leur taille atteint environ 0,5 cm de
diamètre, ils sont
isolés et repiqués sur le même milieu dans lequel la concentration en
céfotaxime a été
réduite de moitié et la concentration en substances de croissance (acide 2,4
dichlorophenoxyacétique et kinétine) a été également réduite. Les repiquages
interviennent
ensuite toutes les 2 semaines jusqu'à l'apparition des tissus embryonnaires.
Selon le
comportement des cals, des séquences de milieux variant pour la concentration
en
substances de croissance peuvent être appliquées. Les tissus embryonnaires
sont isolés sur
le milieu de base sans ajout de substances de croissance. Sur ce milieu une
certaine
proportion des pro-embryons se développe en plantules. Ces dernières sont
transférées en
tube sur un support de vermiculite « arrosé » par le milieu de base liquide
dépourvu de
substances de croissance et où le saccharose remplace le glucose. Lorsqu'elles
atteignent
une taille d'environ 4-6 cm, elles sont directement transférées en serre de
type S2.
L'analyse moléculaire ayant pour objet de vérifier la présence du gène
vat et son expression dans le génome des plantes régénérées est effectuée par
PCR. Une
paire d'amorces est utilisée pour amplifier le gène rapt II. Deux paires
d'amorces ont été
utilisées pour le gène Pat : la première paire appelée 632 amplifie un
fragment de hat situé
en 3' du gène, la seconde appelée LRR amplifie un fragment situé dans le
milieu du gène.
Les séquences de la paire d'amorces utilisées pour amplifier le gène nptll
sont les suivantes
Kana III GCGATAGAAGGCGATGCG (SEQ ID NO : 26)
CA 02512644 2005-07-06
WO 2004/072109 26 PCT/FR2004/000050
kana R CCGGCTACCTGCCATTCG (SEQ ID NO : 31)
Les séquences de la paire d'amorces 632 sont les suivantes
Vat632F : CCCAGCAACATACTGATTCCAAGC (SEQ ID NO : 30)
Vat632R : CTGGTGATGACATTCATATCTTCC (SEQ ID NO : 29)
Les séquences de la paire d'amorces LRR sont les suivantes
LRR F : GTTGTTGAGAGCAATAGTGTAC (SEQ ID NO : 32)
LRR R : CCTTAGAGAAGAATGAAGTCTC (SEQ ID NO : 33)
Les conditions de PCR sont les suivantes, quelles que soient les amorces
utilisées
Pour 25 ~,L de milieu réactionnel
Eau 9,5 ~.L
tampon lOX : 2,S~,L
dNTP (2,SmM) : 2~.L
Oligo 1 (10 ~,M) : 2,5 ~.L
Oligo 2 (10 ~,M) 2,5 ~,L
Taq (Su/wL) : 0,25 ~L
ADN : 5 ~.L
programme
3 minutes à 94°C
puis 35 cycles de : 30 secondes à 94°C - 45 secondes à 59°C - 45
secondes à 72°C.
Au total après 8 mois, 12 plantes transformées ont été transférées en
serre ; elles sont issues de 5 souches embryogènes différentes. Parmi celles-
ci 2 sont issues
de 2 souches différentes pour lesquelles l'amplification du gène hat a été
obtenue dans les
conditions de PCR présentées ci-dessus. Les autres sont issues de souches pour
lesquelles
(amplification du gène nptll a été obtenu mais pas celle du gène Yat. Il n'est
pas
impossible qu'elles représentent des faux négatifs dans la mesure où en
faisant varier la
quantité de matrice il a été possible d'obtenir une amplification à la bonne
taille avec un
extrait qui s'était avéré précédemment négatif.
Mesure de la résistance à l'infection par Aphis ~ossynü
Un clone d'A. gossypü prélevé sur cotonnier (origine Ile de la Réunion)
est utilisé et maintenu sur cotonnier. En effet, il a été montré que les
populations d'A.
gossypü sont fortement structurées génétiquement en fonction de la plante hôte
(VANLERBERGHE-MASUTTI et CHAVIGNY, Molecular Ecology, 7, 905-914, 1998).
Le test est réalisé selon le même protocole que sur melon mais avec des
conditions de
culture des plantes adaptées au cotonnier. Les cotonniers sont maintenus en
serre de type
CA 02512644 2005-07-06
WO 2004/072109 2~ PCT/FR2004/000050
S2 à une température de 28°C à 30°C, un éclairage d'appoint, en
intensité et en durée, est
apporté pour une photopériode de 12-12.
En plus de l'évaluation de la résistance réalisée comme pour le test
melon, une évaluation plus précise de l'histoire de vie des pucerons sur les
plantes
transformées (durée des différents stades larvaires, durée de survie des
adultes, taux
d'accroissement intrinsèque,...) (XIA et al. Entomologia Experimentalis et
Applicata, 90,
25-35, 1999) peut être également réalisée afin de détecter des effets
éventuellement plus
faibles du gène hat sur A. gossypü en situation hétérologue.
CA 02512644 2005-07-06
WO 2004/072109 1 PCT/FR2004/000050
SEQUENCE LISTING
<110> GENOPLANTE-VALOR
DOGIMONT, Catherine
BENDAHMANE, Abdelhafid
PITRAT, Michel
BURGET-BIGEARD, Emilie
HAGEN, Lynda
LE MENN, Aline
PAUQUET, Jérôme
ROUSSELLE, Patrick
CABOCHE, Michel
CHOVELON, Véronique
<120> GENS DE RESISTANCE A APHIS GOSSYPII
<130> MJPbv1516/11
<150> FR 03 00287
<151> 2003-01-13
<160> 33
<l70> Patentln version 3.1
<210> 1
<2l1> 10922
<212> DNA
<213> Cucumis melo
<220>
<221> exon
<222> (2344)..(4710)
<223>
<220>
<221> Intron
CA 02512644 2005-07-06
WO 2004/072109 2 PCT/FR2004/000050
<222> (4711)..(5264)
<223>
<220>
<221> exon
<222> (5265)..(6398)
<223>
<220>
<221> Intron
<222> (6399)..(7219)
<223>
<220>
<221> exon
<222> (7220)..(8077)
<223>
<220>
<221> Intron
<222> (8078)..(8176)
<223>
<220>
<221> exon
<222> (8177)..(8239)
<223>
<400>
1
ccggagtgtacataataaggagacaccatcacaagtcttgaagctttggcgctcttgaaa60
ttcagcttttaaattaattagtcatgtttttcaaatatataacataggagaatatgagtt120
ttgcgtcaaatcccatcttggcagagtgtattttgatgaaattccttattggaaggaact180
gccatatttttagaatttggaatctgtaaagttattctcatgtggttttttgggcagtgg240
agggagttggagaagttgattggtgtgcagatctatgtataggacagatcattgaagagg300
aaaaaagaattggaatattagggatttggttaattaagcaatatgggaagttggatttca360
gaattgcaattcatgattgggtttcgatttaggaagaatggacttgcaaattcaatttaa420
cataaaatttcttttttttttcctaaattaatttttatttgatcttcggactcatccaat480
gcaatttacaggtcactacaaacaatatccatgtcagcacacataacgtgtctagtagac540
CA 02512644 2005-07-06
WO 2004/072109 3 PCT/FR2004/000050
attacgttaacttaatgtaggaaacaaaaagaaaaacgaaaaaggcaagaaatgaaaaag600
gaaacgttgtgtatgatgattaaaatgtacgttgatagctaaattcaactttgttcttca660
ttagcaacaacaagggacaacaaaatgaaaatttcagcacagttatggaatgttgaagaa720
gaaggtgacgagagagatgccacatcataaaaaattaatattataatcatttttgtcaca780
tcagttttctgattacttatatttaacctacacatcattttgccgttactcaactaacga840
tcgatatgacctttaaagctcgatgattaaaatgtttattttgaactttcagggactata900
taaatgtatatatatcaacttcaaatcttagcggtcaaaagtgcattttgttttagttta960
aaacaccgagatgtgacgattaataatgcctacacactcacgtactcacacatgcagtga1020
gttttttatgttttttttacacacattagacgcaaattgaattcctaattccattcccta1080
agacaagtttctaatgacttatacaattcacataggcatgcatgcagaacaagcgaaaaa1140
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caccgagatggcccgagatgaaagaattatgtctttattttattcgatattaagcataca1440
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ttatgaaaatacgatcatgtgtcataaacttttcttattttgttatatagaccgtaaata1620
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tctttttacgttttcttttttaaaattaaataacaaatacttttccactgcttttctttt1980
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ata atg act gca att gcc 2388
gac atc aaa gaa tac
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Met Asp Ile Leu Ile Ser Val Thr Ala Lys Ile Ala Glu Tyr Thr
1 5 10 15
gtt gag cct gtt gga cgc caa ctt ggt tat gta ttt ttc att cgt tcc 2436
Val Glu Pro Val Gly Arg Gln Leu Gly Tyr Val Phe Phe Ile Arg Ser
20 25 30
aac ttt caa aaa ctt aag act caa gta gaa aag ctg aag att aca aga 2484
CA 02512644 2005-07-06
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Asn Phe Gln Lys Leu Lys Thr Gln Val Glu Lys Leu Lys Ile Thr Arg
35 40 45
gag tct gtg caa cac aag atc cat agt gca aga aga aat gct gaa gac 2532
Glu Ser Val Gln His Lys Ile His Ser Ala Arg Arg Asn Ala Glu Asp
50 55 60
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Ile LysPro AlaValGlu GluTrp LeuLysLys ValAspAsp PheVal
65 70 75
cga gaatct gacgagata ttagcc aatgaaggt ggacatggt ggactc 2628
Arg GluSer AspGluIle LeuAla AsnGluGly GlyHisGly GlyLeu
80 85 90 95
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Cys SerThr TyrLeuVal GlnArg HisLysLeu SerArgLys AlaSer
100 105 110
aaa atggta gatgaggtt cttgag atgaaaaat gagggggaa agtttt 2724
Lys MetVal AspGluVal LeuGlu MetLysAsn GluGlyGlu SerPhe
115 120 125
gat atggta tcctataaa agtgtt atcccatca gttgattgt tcactt 2772
Asp MetVal SerTyrLys SerVal IleProSer ValAspCys SerLeu
130 135 140
cca aaagtg cctgacttt cttgac tttgagtca agaaagtcg attatg 2820
Pro LysVal ProAspPhe LeuAsp PheGluSer ArgLysSer IleMet
145 150 l55
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Glu GlnIle MetAspAla LeuSer AspGlyAsn ValHisArg IleGly
160 165 l70 175
gta tatggg atggggggt gttggc aaaacaatg ctagtgaag gatatt 2916
Val TyrGly MetGlyGly ValGly LysThrMet LeuValLys AspIle
180 185 l90
tta agaaaa attgtggag agtaag aagcctttt gatgaggtg gtaaca 2964
Leu ArgLys IleValGlu SerLys LysProPhe AspGluVal ValThr
195 200 205
tcc acgatc agccaaaca ccagat tttagaagt atccaagga caacta 3012
Ser ThrIle SerGlnThr ProAsp PheArgSer IleGlnGly GlnLeu
210 215 220
gct gacaag ctaggtttg aaattc gaacaagaa acaatagaa ggaagg 3060
Ala AspLys LeuGlyLeu LysPhe GluGlnGlu ThrIleGlu GlyArg
225 230 235
CA 02512644 2005-07-06
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gctact attcta cgaaagagg ttaaag atggagaga agtatccta gtt 3108
AlaThr IleLeu ArgLysArg LeuLys MetGluArg SerIleLeu Val
240 245 250 255
gtgttg gatgat gtttgggag tatatt gatttggaa actatagga att 3156
ValLeu AspAsp ValTrpGlu TyrIle AspLeuGlu ThrIleGly Ile
260 265 270
ccaagt gttgaa gatcatacg gggtgc aagatcttg tttaccact agg 3204
ProSer ValGlu AspHisThr GlyCys LysIleLeu PheThrThr Arg
275 280 285
attaaa catttg atctcaaat caaatg tgcgccaat aaaattttt gag 3252
IleLys HisLeu IleSerAsn GlnMet CysAlaAsn LysIlePhe Glu
290 295 300
ataaaa gtttta ggaaaagat gagtca tggaattta tttaaggca atg 3300
IleLys ValLeu GlyLysAsp GluSer TrpAsnLeu PheLysAla Met
305 310 315
gcaggt gacatt gttgatgca agtgat ttgaagcct atagccatt cga 3348
AlaGly AspTle ValAspAla SerAsp LeuLysPro IleAlaIle Arg
320 325 330 335
attgtg agagaa tgtgcaggt ttgcct attgctatt actactgtt gct 3396
IleVal ArgGlu CysAlaGly LeuPro IleAlaIle ThrThrVal Ala
340 345 350
aaggca ttacga aataaacct tccgac atttggaat gatgcctta gat 3444
LysAla LeuArg AsnLysPro SerAsp IleTrpAsn AspAlaLeu Asp
355 360 365
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GlnLeu LysThr ValAspVal GlyMet AlaAsnIle GlyGluMet Glu
370 375 380
aagaaa gtgtat ttgtcacta aaactg agttacgat tgcttggga tat 3540
LysLys ValTyr LeuSerLeu LysLeu SerTyrAsp CysLeuGly Tyr
385 390 395
gaagag gtgaag ttattattc ttgtta tgcagcatg tttccagaa gac 3588
GluGlu ValLys LeuLeuPhe LeuLeu CysSerMet PheProGlu Asp
400 405 410 415
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PheSer IleAsp ValGluGly LeuHis ValTyrAla MetGlyMet Gly
420 425 430
ttc tta cat ggt gtt gat act gtg gta aaa gga cga cgt agg ata aaa 3684
CA 02512644 2005-07-06
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PheLeuHis GlyValAsp ThrValVal LysGlyArg ArgArg IleLys
435 440 445
aaattggtt gatgatctt atatcttct tctttgctt caacaa tattct 3732
LysLeuVal AspAspLeu IleSerSer SerLeuLeu GlnGln TyrSer
450 455 460
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GluTyrGly CysAsnTyr ValLysMet HisAspMet ValArg AspVal
465 470 475
gccctatta attgcatct aagaatgaa cacgtacgt acattg agctat 3828
AlaLeuLeu IleAlaSer LysAsnGlu HisValArg ThrLeu SerTyr
480 485 490 495
gtgaaaaga tcgaatgaa gaatgggaa gaagagaaa ctattg ggtaat 3876
ValLysArg SerAsnGlu GluTrpGlu GluGluLys LeuLeu GlyAsn
500 505 510
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HisThrAla ValPheIle AspGlyLeu HisTyrPro LeuPro LysLeu
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GlnArgPro SerAspVal TyrSerLeu AlaAsnIle ArgVal LeuArg
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ttggaaaga tgtcaatta ttagggagc atagattgg attggt gaatta 4164
LeuGluArg CysGlnLeu LeuGlySer IleAspTrp IleGly GluLeu
595 600 605
aaaaagctt gaaattctt gattttagt gaatctaac atcaca caaatt 4212
LysLysLeu GluIleLeu AspPhe5er GluSerAsn IleThr GlnIle
610 615 620
cctacaacc atgagccaa ttgacacag ctaaaagtg ttgaat ttatct 4260
ProThrThr MetSerGln LeuThrGln LeuLysVal LeuAsn LeuSer
625 630 635
CA 02512644 2005-07-06
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tct tgt gaa caa ctt gag gta att cca cca aat att ctt tca aag ttg 4308
Ser Cys Glu Gln Leu Glu Val Ile Pro Pro Asn Ile Leu Ser Lys Leu
640 645 650 655
aca aaa ttg gaa gaa tta gat ctg gaa act ttt gat gga tgg gaa gga 4356
Thr Lys Leu Glu Glu Leu Asp Leu Glu Thr Phe Asp Gly Trp Glu Gly
660 665 670
gaa gaa tgg tat gaa gga agg aaa aat gct agc ctt tct gaa ctc aag 4404
Glu Glu Trp Tyr Glu Gly Arg Lys Asn Ala Ser Leu Ser Glu Leu Lys
675 680 685
tgc ttg cga cac ctt tat gct tta aac tta acc att caa gat gaa gaa 4452
Cys Leu Arg His Leu Tyr Ala Leu Asn Leu Thr Tle Gln Asp Glu Glu
690 695 700
att atg cca gaa aac ttg ttc tta gtt ggg aag ttg aag ctt caa aaa 4500
Ile Met Pro Glu Asn Leu Phe Leu Val Gly Lys Leu Lys Leu Gln Lys
705 710 715
ttc aac tgt att ggt tgc agc aaa aag tat act ttt gca 4548
att gaa tta
Phe Asn Cys Ile Gly Cys Ser Lys Lys Tyr Thr Phe Ala
Ile Glu Leu
720 725 730 735
tac aag aga atc aaa aac att gga aag atg gaa tca gga 4596
aac ttc atc
Tyr Lys Arg Ile Lys Asn Ile Gly Lys Met Glu Ser Gly
Asn Phe Ile
740 745 750
agg tgc gat gat tgg ata aat ttg aag agg tcg gac aat 4644
ttg aaa tta
Arg Cys Asp Asp Trp Ile Asn Leu Lys Arg Ser Asp Asn
Leu Lys Leu
755 760 765
gtg ctt gaa gga tca gtt tca aag ctc cac tca gaa ttg 4692
ttg tgt gtt
Val Leu Glu Gly Ser Val Ser Lys Leu His Ser Glu Leu
Leu Cys Val
770 775 780
gta ggt aat aac ttc gtaagtttgc agtatctcta 4740
gcc cctttatgat
Val Gly Asn Asn Phe
Ala
785
aattcaaaatttcaacattt tatcaacgttagcaataccatcaacattga agaatcattt4800
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atatttcctatctaaggaag caaatttgaagtaatcattttacacaattt gttatggtaa5160
3
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ttttaaaaca ctatataaat tatatgttgt tagttagcat cagttgtgat gatatggtta 5220
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ValSer Pro
Leu
790
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TrpSerAsn AsnValPro IleLeu AsnSerPheSer LysLeu GluGlu
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aatatgatg gacattctc acatgc cttaaagtctta gagatc aaaaat 5468
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GluLysIle ArgIleTrp SerCys AsnAsnLeuGln LysIle LeuPhe
955 960 965
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ccttcaaat atgatg ggcattctt aca 5852
tgc
ctt
aaa
gtc
tta
gag
atc
ProSerAsn MetMet GlyIleLeu Thr
Cys
Leu
Lys
Val
Leu
Glu
Ile
970 975 980 985
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ttt
gaa
gtg
caa
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cca
att
ArgAspCys GluLeu LeuGluGly Ile u
Phe Pro
Glu Ile
Val
Gln
Gl
990 995 1000
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SerValVal GluSer AsnAsnLeu Pro Ile LeuAsnSer Phe Ser
1005 1010 1015
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LysLeuGlu GluIle ArgIleGly Ser Cys AsnAsnLeu Gln Lys
1020 1025 1030
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ValLeuPhe ProPro AsnMetMet Gly Ile LeuThrCys Leu Lys
1035 1040 1045
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ValLeuGlu IleArg HisCysAsn Leu Leu GluGlyIle Phe Glu
1050 1055 1060
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1065 1070 1075
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GlnAsnLeu SerSer LeuMetLeu Cys Asn LeuProAsn Leu Glu
1080 1085 1090
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IleLysSerLeu ThrIleAsp LysCys Pro ArgLeuArg Arg Glu
1110 1115 1120
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Tyr5erValLys IleLeuLys GlnLeu Glu AspValSer Ile Asp
1125 1130 1135
atcaaacaattg atgaaggtt attgag aag gaaaagtca gca cat 6350
IleLysGlnLeu MetLysVal IleGlu Lys GluLysSer Ala His
1140 1145 1150
cat aat atg ttg gaa tca aag caa tgg gag act tca tct tct tct 6395
CA 02512644 2005-07-06
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His Asn Met Leu Glu Ser Lys Gln Trp Glu Thr Ser Ser Ser Ser
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Lys
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Asp Gly
gttcta cggctg ggagat ggttct aagttg ttt ccaaatctt aaa 7270
ValLeu ArgLeu GlyAsp GlySer LysLeu Phe ProAsnLeu Lys
1170 1175 1180
agtttg aagcta tatggt tttgtt gattat aac tcaacccat tta 7315
SerLeu LysLeu TyrGly PheVal AspTyr Asn SerThrHis Leu
1185 1190 1195
ccaatg gaaatg ttgcaa atctta ttccaa ctt gtagtcttt gaa 7360
ProMet GluMet LeuGln IleLeu PheGln Leu ValValPhe Glu
1200 1205 1210
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1230 1235 1240
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1380 1385 1390
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taa ggaattatat ggatattgtt gtacactact taatatatca tttcatccac 8289
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gtcaaattga aaagtctcga tagatttgtt aaattaactt ttgatacaag tcataaaatg 8409
ttaattagta taataataat atatctgatc ccatcaaatt aattagaagt aacgacaaat 8469
ttaacttctg taatatcaat tcaatttgat gtctcaatca actgcataaa atttgatgtc 8529
acaaatttaa cttctgtaat gtgaatcttt tttttttttc cctttgcaca taaaaccaac 8589
aagttaaaat agatataaca aagaatttaa ttcacatata ataaattcat ccaatataat 8649
gttctttcac ctttttctct ctttcacaaa actgtaataa taatatctac cacaaaaggt 8709
aaaccattaa tatgattctt caagaaggtt gtttatttgg tcaaattttc atgaaagtat 8769
taatacagtg tatgttttgc aaaggaagct gccaaatacc tacctcaatc ctagcagatg 8829
cgttctttgc aagttggctg tcaaagactt gaaccatatt ttcacaacct gtgccaattc 8889
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gactttgagt caagaaagtc gattatggaa caaatcatgg atgcactatc tgatggtaat 600
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Met Asp Ile Leu Ile Ser Val Thr Ala Lys Ile Ala Glu Tyr Thr Val
1 5 10 15
Glu Pro Val Gly Arg Gln Leu Gly Tyr Val Phe Phe Ile Arg Ser Asn
20 25 30
Phe Gln Lys Leu Lys Thr Gln Val Glu Lys Leu Lys Ile Thr Arg Glu
35 40 45
Ser Val Gln His Lys Ile His Ser Ala Arg Arg Asn Ala Glu Asp Ile
50 55 60
Lys Pro Ala Val Glu Glu Trp Leu Lys Lys Val Asp Asp Phe Val Arg
65 70 75 80
Glu Ser Asp Glu Ile Leu Ala Asn Glu Gly Gly His Gly Gly Leu Cys
85 90 95
Ser Thr Tyr Leu Val Gln Arg His Lys Leu Ser Arg Lys Ala Ser Lys
100 105 110
Met Val Asp Glu Val Leu Glu Met Lys Asn Glu Gly Glu Ser Phe Asp
115 120 125
Met Val Ser Tyr Lys Ser Val Ile Pro Ser Val Asp Cys Ser Leu Pro
130 135 140
Lys Val Pro Asp Phe Leu Asp Phe Glu Ser Arg Lys Ser Ile Met Glu
145 150 l55 l60
Gln Ile Met Asp Ala Leu Ser Asp Gly Asn Val His Arg Ile Gly Val
165 170 175
Tyr Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Met Leu Val Lys Asp Ile Leu
180 185 190
Arg Lys Ile Val Glu Ser Lys Lys Pro Phe Asp Glu Val Val Thr Ser
195 200 205
Thr Ile Ser Gln Thr Pro Asp Phe Arg Ser Ile Gln Gly Gln Leu Ala
210 215 220
Asp Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Gln Glu Thr Ile Glu Gly Arg Ala
225 230 235 240
Thr Ile Leu Arg Lys Arg Leu Lys Met Glu Arg Ser Ile Leu Val Val
245 250 255
Leu Asp Asp Val Trp Glu Tyr Ile Asp Leu Glu Thr Ile Gly Ile Pro
260 265 270
CA 02512644 2005-07-06
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Ser Val Glu Asp His Thr Gly Cys Lys Ile Leu Phe Thr Thr Arg Ile
275 280 285
Lys His Leu Ile Ser Asn Gln Met Cys Ala Asn Lys Ile Phe Glu Ile
290 295 300
Lys Val Leu Gly Lys Asp Glu Ser Trp Asn Leu Phe Lys Ala Met Ala
305 310 315 320
Gly Asp Ile Val Asp Ala Ser Asp Leu Lys Pro Ile Ala Ile Arg Ile
325 330 335
Val Arg Glu Cys Ala Gly Leu Pro Ile Ala Ile Thr Thr Val Ala Lys
340 345 350
Ala Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asp Ile Trp Asn Asp Ala Leu Asp Gln
355 360 365
Leu Lys Thr Val Asp Val Gly Met Ala Asn Ile Gly Glu Met Glu Lys
370 375 380
Lys Val Tyr Leu Ser Leu Lys Leu 5er Tyr Asp Cys Leu Gly Tyr Glu
385 390 395 400
Glu Val Lys Leu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Met Phe Pro Glu Asp Phe
405 410 415
Ser Ile Asp Val Glu Gly Leu His Val Tyr Ala Met Gly Met Gly Phe
420 425 430
Leu His Gly Val Asp Thr Val Val Lys Gly Arg Arg Arg Ile Lys Lys
435 440 445
Leu Val Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Gln Gln Tyr Ser Glu
450 455 460
Tyr Gly Cys Asn Tyr Val Lys Met His Asp Met Val Arg Asp Val Ala
465 470 475 480
Leu Leu Ile Ala Ser Lys Asn Glu His Val Arg Thr Leu Ser Tyr Val
485 490 495
Lys Arg Ser Asn Glu Glu Trp Glu Glu Glu Lys Leu Leu Gly Asn His
500 505 510
Thr Ala Val Phe Ile Asp Gly Leu His Tyr Pro Leu Pro Lys Leu Thr
515 520 525
Leu Pro Lys Val Gln Leu Leu Arg Leu Val Ala Lys Tyr Cys Trp Glu
530 535 540
His Asn Lys Arg Val Ser Val Val Glu Thr Phe Phe Glu Glu Met Lys
545 550 555 560
Glu Leu Lys Gly Leu Val Val Glu Asn Va1 Asn Ile Ser Leu Met Gln
565 570 575
CA 02512644 2005-07-06
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Arg Pro Ser Asp Val Tyr Ser Leu Ala Asn Ile Arg Val Leu Arg Leu
580 585 590
Glu Arg Cys Gln Leu Leu Gly Ser Ile Asp Trp Ile Gly Glu Leu Lys
595 600 605
Lys Leu Glu Ile Leu Asp Phe Ser Glu Ser Asn Ile Thr Gln Ile Pro
610 615 620
Thr Thr Met Ser Gln Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Asn Leu Ser Ser
625 630 635 640
Cys Glu Gln Leu Glu Val Ile Pro Pro Asn Ile Leu Ser Lys Leu Thr
645 650 655
Lys Leu Glu Glu Leu Asp Leu Glu Thr Phe Asp Gly Trp Glu Gly Glu
660 665 670
Glu Trp Tyr Glu Gly Arg Lys Asn Ala Ser Leu Ser Glu Leu Lys Cys
675 680 685
Leu Arg His Leu Tyr Ala Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asp Glu Glu Ile
690 695 700
Met Pro Glu Asn Leu Phe Leu Val Gly Lys Leu Lys Leu Gln Lys Phe
705 710 715 720
Asn Ile Cys Ile Gly Cys Glu Ser Lys Leu Lys Tyr Thr Phe Ala Tyr
725 730 735
Lys Asn Arg Tle Lys Asn Phe Ile Gly Ile Lys Met Glu Ser Gly Arg
740 745 750
Cys Leu Asp Asp Trp Ile Lys Asn Leu Leu Lys Arg Ser Asp Asn Val
755 760 765
Leu Leu Glu Gly Ser Val Cys Ser Lys Val Leu His Ser Glu Leu Val
770 775 780
Gly Ala Asn Asn Phe Val Ser Leu Pro Asn Leu Glu Lys Leu Glu Ile
785 790 795 800
Val Asn Ala Lys Ser Leu Lys Met Ile Trp Ser Asn Asn Val Pro Ile
805 810 815
Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Lys Ile Tyr Ser Cys Asn
820 825 830
Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Pro Asn Met Met Asp Ile Leu Thr
835 840 845
Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Lys Asn Cys Asp Leu Leu Glu Gly Ile
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Phe Glu Ala Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu 5er Asn Asn Leu Pro
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CA 02512644 2005-07-06
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Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Arg Ile Trp Ser Cys
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Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile Leu
900 905 910
Pro Cys Leu Lys Val Leu Asp Ile Arg Gly Cys Glu Leu Leu Glu Gly
915 920 925
Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Ser Val
930 935 940
Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Lys Ile Arg Ile Trp Ser
945 950 955 960
Cys Asn Asn Leu~Gln Lys Ile Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile
965 970 975
Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Arg Asp Cys Glu Leu Leu Glu
980 985 990
Gly Ile Phe Glu Val G1n Glu Pro Ile 5er Val Val Glu Ser Asn Asn
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Leu Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Arg Ile
1010 1015 1020
Gly Ser Cys Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Pro Asn Met
1025 1030 1035
Met Gly Ile Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Arg His Cys
1040 1045 1050
Asn Leu Leu Glu Gly Tle Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Ile
1055 1060 1065
Val Glu Ala Ser Pro Ile Leu Leu Gln Asn Leu Ser Ser Leu Met
1070 1075 1080
Leu Cys Asn Leu Pro Asn Leu Glu Tyr Val Trp Ser Lys Asn Pro
1085 1090 1095
Tyr Glu Leu Leu Ser Leu Glu Asn Ile Lys Ser Leu Thr Ile Asp
1100 1105 1110
Lys Cys Pro Arg Leu Arg Arg Glu Tyr Ser Val Lys Ile Leu Lys
1115 1120 1125
Gln Leu Glu Asp Val Ser Ile Asp Ile Lys Gln Leu Met Lys Val
1130 1135 1140
Ile Glu Lys Glu Lys Ser Ala His His Asn Met Leu Glu Ser Lys
1145 1150 1155
Gln Trp Glu Thr Ser Ser Ser Ser Lys Asp Gly Val Leu Arg Leu
1160 1165 1170
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Gly Asp Gly Ser Lys Leu Phe Pro Asn Leu Lys Ser Leu Lys Leu
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Tyr Gly Phe Val Asp Tyr Asn Ser Thr His Leu Pro Met Glu Met
1190 1195 1200
Leu Gln Ile Leu Phe Gln Leu Val Val Phe Glu Leu Glu Gly Ala
1205 1210 1215
Phe Leu Glu Glu Ile Phe Pro 5er Asn Ile Leu 21e Pro Ser Tyr
1220 1225 1230
Met Val Leu Arg Arg Leu Ala Leu Ser Lys Leu Pro Lys Leu Lys
1235 1240 1245
His Leu Trp Ser Glu Glu Cys Ser Gln Asn Asn Ile Thr Ser Val
1250 1255 1260
Leu Gln His Leu Ile Ser Leu Arg Ile Ser Glu Cys Gly Arg Leu
1265 1270 1275
Ser Ser Leu Leu Ser Ser Ile Val Cys Phe Thr Asn Leu Lys His
1280 1285 1290
Leu Arg Val Tyr Lys Cys Asp Gly Leu Thr His Leu Leu Asn Pro
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Ser Val Ala Thr Thr Leu Val Gln Leu Glu Ser Leu Thr Ile Glu
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Glu Cys Lys Arg Met Ser Ser Val Ile Glu Gly Gly Ser Thr Glu
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Glu Asp Gly Asn Asp G1u Met Val Val Phe Asn Asn Leu Gln His
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Leu Tyr Ile Phe Asn Cys Ser Asn Leu Thr Ser Phe Tyr Cys Gly
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Asn Cys Ser Glu Met Lys Val Phe Ser Leu Gly Ile Val Ser Thr
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gaagacttgaaccatattttcacaacctgtgccaattcgcaaatagcctctgggtcaaac4500
tgcacgacaaaattggtggaaactttgatacaaacagtatcaaagccctctgttggtctc4560
ttggctcgctgaaacaatcaaacagaaagaacatcattctctcgatgtaggtgtggatct4620
tcttttgtccatttgggtggaaagaaacaataggattttcatagacatagaaagaagctt4680
agtcacatttgggaagatatcgaaactttgattggaccatggtcgagtagaaacaaaatg4740
ttcaaagactacaatccaacatcaatctttaaactttagagctttgttagattaatgttt4800
gttgtatatggcttccctgtggccaaagaaatatacattgtaacaatggtttgatgaaat4860
gataatgaagtggtatggtgttaaaatcacctttatcactctgtgtttcaatttcaaaa 4919
<210> 6
<211> 1410
<212> PRT
<213> Cucumis melo
<400> 6
Met Asp Ile Leu Ile Ser Val Thr Ala Lys Ile Ala Glu Tyr Thr Val
1 5 10 15
Glu Pro Val Gly Arg Gln Leu Gly Tyr Val Phe Phe Ile Arg Ser Asn
20 25 30
Phe Gln Lys Leu Lys Thr Gln Val Glu Lys Leu Lys Ile Thr Arg Glu
35 40 45
Ser Val Gln His Lys Ile His Ser Ala Arg Arg Asn Ala Glu Asp Ile
50 55 60
Lys Pro Ala Val Glu Glu Trp Leu Lys Lys Val Asp Asp Phe Val Arg
65 70 75 80
Glu Ser Asp Glu Ile Leu Ala Asn Glu Gly Gly His Gly Gly Leu Cys
85 90 95
Ser Thr Tyr Leu Val Gln Arg His Lys Leu Ser Arg Lys Ala Ser Lys
100 105 110
Met Val Asp Glu Val Leu Glu Met Lys Asn Glu Gly Glu Ser Phe Asp
115 120 l25
Met Val Ser Tyr Lys Ser Val Ile Pro Ser Val Asp Cys Ser Leu Pro
130 135 140
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Lys Val Pro Asp Phe Ile Asp Phe Glu Ser Arg Lys Ser Ile Met Glu
145 150 155 160
G1n Ile Met Asp Ala Leu Ser Asp Gly Asn Val His Arg Ile Gly Val
165 170 l75
Tyr Gly Met Gly Gly Val Gly Lys Thr Met Leu Val Lys Asp Ile Leu
180 185 190
Arg Lys Ile Val Glu Ser Lys Lys Pro Phe Asp Glu Val Val Thr Ser
195 200 205
Thr Ile Ser Gln Thr Pro Asp Phe Arg Ser Ile Gln Gly Gln Leu Ala
210 215 220
Asp Lys Leu Gly Leu Lys Phe Glu Gln Glu Thr Ile Glu Gly Arg Ala
225 230 235 240
Thr Ile Leu Arg Lys Arg Leu Lys Met Glu Arg Ser Ile Leu Val Val
245 250 255
Leu Asp Asp Val Trp Glu Tyr Ile Asp Leu Glu Thr Ile Gly Ile Pro
260 265 270
Ser Val Glu Asp His Thr Gly Cys Lys Ile Leu Phe Thr Thr Arg Ile
275 280 285
Lys His Leu Ile Ser Asn Gln Met Cys Ala Asn Lys Tle Phe Glu Ile
290 295 ~ 300
Lys Val Leu Gly Lys Asp Glu Ser Trp Asn Leu Phe Lys Ala Met Ala
305 310 315 320
Gly Asp Ile Val Asp Ala Ser Asp Leu Lys Pro Ile Ala Ile Arg Ile
325 330 335
Val Arg Glu Cys Ala Gly Leu Pro Ile Ala Ile Thr Thr Val Ala Lys
340 345 350
Ala Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asp Ile Trp Asn Asp Ala Leu Asp Gln
355 360 365
Leu Lys Ser Val Asp Val Gly Met Ala Asn Ile Gly Glu Met Glu Lys
370 375 380
Lys Val Tyr Leu Ser Leu Lys Leu Ser Tyr Asp Cys Leu Gly Tyr Glu
385 390 395 400
Glu Val Lys Leu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Met Phe Pro Glu Asp Phe
405 410 415
Ser Ile Asp Val Glu Gly Leu His Val Tyr Ala Met Gly Met Gly Phe
420 425 430
Leu His Gly Val Asp Thr Val Val Lys Gly Arg Arg Arg Ile Lys Lys
435 440 445
CA 02512644 2005-07-06
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Leu Val Asp Asp Leu Ile Ser Ser Ser Leu Leu Gln Gln Tyr Ser Glu
450 455 460
Tyr Gly Cys Asn Tyr Val Lys Met His Asp Met Val Arg Asp Val Ala
465 470 475 480
Leu Leu Ile Ala Ser Lys Asn Glu His Val Arg Thr Leu Ser Tyr Val
485 490 495
Lys Arg Ser Asn Glu Glu Trp Glu Glu Glu Lys Leu Leu Gly Asn His
500 505 510
Thr Ala Val Phe Ile Asp Gly Leu His Tyr Pro Leu Pro Lys Leu Thr
515 520 525
Leu Pro Lys Val Gln Leu Leu Arg Leu Va1 Ala Gln Asp Cys Trp Glu
530 535 540
His Asn Lys Arg Val Ser Val Val Glu Thr Phe Phe Glu Glu Met Lys
545 550 555 560
Glu Leu Lys Gly Leu Val Leu Ala Asn Val Asn Ile Ser Leu Met Gln
565 570 575
Arg Thr Ser Asp Leu Tyr Ser Leu Ala Asn Ile Arg Val Leu Arg Leu
580 585 590
Gln Ser Cys Asn Leu Leu Gly Ser Ile Asp Trp Ile Gly Glu Leu Lys
595 600 605
Lys Leu Glu Ile Leu Asp Phe Ile Gly Ser Asn Ile Thr Gln Ile Pro
610 615 620
Thr Thr Met Ser Gln Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Asn Leu Ser Ser
625 630 635 640
Cys His Gln Leu Lys Val Ile Pro Pro Asn Ile Leu Ser Lys Leu Thr
645 650 655
Lys Leu Glu Glu Leu Ser Leu Glu Thr Phe Asp Arg Trp Glu Gly Glu
660 665 670
Glu Trp Tyr Glu Gly Arg Lys Asn Ala Ser Leu Ser Glu Leu Lys Cys
675 680 685
Leu Arg His Leu Tyr Ala Leu Asn Leu Thr Ile Gln Asp Glu Glu Ile
690 695 700
Met Pro Lys Asp Leu Phe Leu Ala Glu Glu Leu Lys Leu Gln Lys Phe
705 710 715 720
Asn Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Lys Leu Lys Tyr Thr Phe Gly Pro,
725 730 735
Thr Asn Arg Ile Lys Asn Phe Ile Ala Ile Lys Met Glu Ser Gly Arg
740 745 750
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Cys Leu Asp Asn Trp Ile Lys Asn Leu Leu Lys Arg Ser Asp Asn Val
755 760 765
Phe Leu Glu Gly Ser Ile Cys Ser Lys Val Leu His Ser Glu Leu Val
770 775 780
Gly Ala Asn Asp Phe Val Ser Leu Pro Asn Leu Glu Lys Leu Glu Ile
785 790 795 800
Val Asn Ala Lys Ser Leu Lys Met Ile Trp Ser Asn Asn Val Pro Ile
805 810 815
Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Lys Ile Tyr Ser Cys Asn
820 825 830
Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Pro Asn Met Met Asp Ile Leu Thr
835 840 845
Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Lys Asn Cys Asp Leu Leu Glu Gly Ile
850 855 860
Phe Glu Ala Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Asn Leu Pro
865 870 875 880
Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Glu Ile Arg Ile Trp Ser Cys
885 890 895
Asn Asn Leu Gln Lys Val Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile Leu
900 905 910
Pro Cys Leu Lys Val Leu Asp Ile Arg Gly Cys Glu Leu Leu Glu Gly
915 920 925
Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ser Asn Ser Val
930 935 940
Pro Ile Leu Asn Ser Phe Ser Lys Leu Glu Lys Ile Arg Ile Trp Ser
945 950 955 960
Cys Asn Asn Leu Gln Lys Ile Leu Phe Pro Ser Asn Met Met Gly Ile
965 970 975
Leu Thr Cys Leu Lys Val Leu Glu Ile Arg Asp Cys Glu Leu Leu Glu
980 985 990
Gly Ile Phe Glu Val Gln Glu Pro Ile Ser Val Val Glu Ala Ser Pro
995 1000 1005
Ile Val Leu Gln Asn Leu Ile Arg Leu Glu Leu Tyr Asn Leu Pro
1010 1015 1020
Asn Leu Glu Tyr Val Trp Ser Lys Asn Pro Cys Glu Leu Leu Ser
1025 1030 1035
Leu Glu Asn Ile Lys Ser Leu Thr Ile Glu Glu Cys Pro Arg Leu
1040 1045 1050
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Arg Arg Glu Tyr Ser Val Lys Ile Phe Lys Pro Leu Gln Tyr Val
1055 1060 1065
Ser Ile Asp Ile Lys Gln Leu Met Lys Val Ile Glu Lys Glu Lys
1070 1075 1080
Ser Ala Asp His Asn Met Leu Glu Ser Lys Gln Trp Glu Thr Ser
1085 1090 1095
Ser Ser Ser Lys Asp G1y Val Leu Arg Leu Gly Asp Gly Ser Lys
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Leu Phe Pro Asn Leu Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gly Phe Val Asp
1115 1120 1125
Tyr Asn Ser Thr His Leu Pro Met Glu Met Leu Gln Ile Leu Phe
1130 1135 1140
Gln Leu Lys His Phe Glu Leu Glu Gly Ala Phe Ile Glu Glu Ile
1145 1150 1155
Phe Pro Ser Asn Ile Leu Ile Ser Ser Ser Met Asp Leu Gln Ser
1160 1165 1170
Leu Ala Leu Tyr Lys Leu Pro Lys Leu Lys His Leu Trp Ser Glu
1175 1180 1185
Glu Cys Ser Arg Asn Asn Ile Thr Ser Val Leu Gln His Leu Ile
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Phe Leu Arg Ile Ser Asp Cys Gly Arg Leu Ser Ser Leu Thr Leu
1205 1210 1215
Val Ser Ser Leu Val Cys Phe Thr Asn Leu Lys Ser Leu Ala Val
1220 1225 1230
Tyr Lys Cys Asp Arg Leu Thr His Leu Leu Asn Pro Ser Met Ala
1235 1240 1245
Thr Thr Leu Val Gln Leu Gln Asp Leu Thr Ile Lys Glu Cys Lys
1250 1255 1260
Arg Met Arg Ser Val Ile Glu Glu Gly Ser Thr Glu Glu Asp Gly
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Asn Asp Glu Met Val Val Phe Asn Asn Leu Arg His Leu Tyr Ile
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Phe Asn Cys Ser Asn Leu Thr Ser Phe Tyr Cys Gly Arg Cys Ile
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Val Lys Phe Pro Cys Leu Glu Arg Val Phe Ile Gln Asn Cys Pro
1310 1315 1320
Glu Met Lys Val Phe Ser Leu Gly Ile Val Ser Thr Pro Arg Leu
1325 1330 1335
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LysTyr Glu LysPheThr Leu MetAsn AspTyrAsp Asp LysTrp
1340 1345 1350
CysHis Leu LysTyrPro Lys TyrMet LeuValGlu Asp MetAsn
1355 1360 1365
ValIle Thr ArgGluTyr Trp GluAsp AsnValAsp Thr GlyIle
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ProAsn Leu PheAlaGlu Gln SerLeu GluGluAsn Arg SerGlu
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ggagagagaa tccgggacta agtgact
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
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taaccacctt ttccgatcaa atttcgtac 29
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> amorce PCR F2 Eco du marqueur L246
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
<220>
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gttgtatatg gcttccctgt agcc
24
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<21l> 24
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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ctccactcag aattggtagg tgcc 24
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<213> Artificial sequence
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<211> 24
<212> DNA
<2l3> Artificial sequence
<220>
<223> amorce PCR LRR1 du marqueur D
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gttgttgaga gcaatagtgt accc 24
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> amorce PCR Kana III
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18
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atgcgcatga ggctcgtctt cgag 24
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<211> 24
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<223> amorce PCR PicaA-
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gacgcaacgc atcctcgatc agct 24
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WO 2004/072109 PCT/FR2004/000050
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<223> amorce PCR Vat 632F
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cccagcaaca tactgattcc aagc . 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> amorce PCR LRR R
<400> 33
ccttagagaa gaatgaagtc tc 22
