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CA 02531237 2006-O1-03
WO 2005/011866 PCT/FR2004/001707
Titre de l'invention
Procédé et dispositif d'analyse chimique ou biologique par senseur à
chambre monolithique en gerbe mufti-micro-tubulaire et transducteur latéral
de mesure intégrale
Domaine technique de l'invention
L' invention se rapporte au domaine technique des senseurs chimiques et/ou
biologiques. Le but d'un senseur est de mettre en couvre un procédé
d'évaluation de la concentration d'un analyte dans un fluide-échantillon. Les
éléments-analytes sont généralement des entités chimiques solubles ou des
micro-organismes vivants ou morts, ou des parties de micro-organismes
(enzyme, anticorps, antigène, cellule microbienne, gaz, ion, métabolite,
micro-organisme, protéine, oligonucléotide...). L'analyte peut se trouver
dans tout échantillon fluide tel un liquide ou un gaz (air. . . ). Un senseur
a
pour objet de convertir la concentration de l'analyte compris dans le fluide
échantillon en un signal analytique exploitable (généralement électrique).
Parmi les différents types de systèmes analytiques, on entend par senseur un
appareil de mesure de concentration qui réunit
- au sein d'une chambre de réaction, un composé chimique, dit récepteur,
de reconnaissance (moléculaire) de l'analyte et d'émission
20 (éventuellement à l'aide d'un autre composé dit révélateur qui peut être
confondu avec le récepteur) d'un signal élémentaire physico-chimique
de reconnaissance,
- et un système hardware, dit transducteur, de réception de ce signal.
Cela distingue un senseur d'un système analytique qui incorpore soit d'autres
2s étapes supplémentaires de séparation, telles qu'une chromatographie en
phase liquide (HPLC), soit des équiperr~ents hardware supplémentaires, tel
que c'est le cas pour des dispositifs d'analyse à injection de flux (FIA).
A l'intérieur d'un senseur, le récepteur est un composé chimique et/ou
biologique, à la fois
so - adapté pour reconnaître l' analyte,
- et apte à générer, en combinaison avec l' analyte (et éventuellement un
révélateur), un signal élémentaire mesurable de présence d'un élément-
analyte.
Le transducteur est un moyen physique (hardware) qui convertit l'action du
s5 récepteur (ou bio récepteur)
- aboutissant à la génération d'une multitude d'événements de
reconnaissance d'éléments-analytes,
- en un signal global permettant de quantifier la présence de cet élément-
analyte dans l'échantillon.
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On peut classifier les senseurs par l'intermédiaire des paramètres suivants
qui déterminent leurs capacités opérationnelles
- le type de récepteur utilisé,
- la façon dont l'analyte s'interface avec le récepteur,
s - le type de signal élémentaire de présence d'un élément-analyte émis,
- la géométrie de la chambre de réaction,
- la structure et la géométrie du moyen de transduction et sa position par
rapport à la chambre de réaction, c'est-à-dire la géométrie relative du
couple chambre de réaction/transducteur.
1o L'invention concerne spécifiquement le domaine technique des procédés et
dispositifs de senseurs (chimiques et/ou biologiques)
- dont la chambre de réaction est multi-micro-tubulaire monolithique,
- et dont le transducteur est entièrement situé à l'extérieur du volume
d'épreuve de la chambre de réaction.
~s L'invention concerne un procédé améliorant les performances des senseurs
chimiques et/ou biologiques ainsi qu'une nouvelle géométrie de senseur
mettant en oeuvre cette amélioration.
Etat de la technique antérieure
Le principe des senseurs est largement exploité par l'art antérieur. Une
classe
2o particulière de senseurs connue de l'art antérieur est constituée des bio-
senseurs. Dans un bio-senseur, le système de reconnaissance chimique utilise
un mécanisme biochimique. Dans ce cas, le récepteur peut être un anticorps,
un enzyme, une cellule, une portion de membrane cellulaire ou d'organelle,
une fraction de tissu cellulaire, ou un organisme...
25 A titre d'exemple, considérons le principe classique de fonctionnement d'un
bio-senseur pour la mesure de glucose dans un liquide, utilisant comme
récepteur (bio récepteur) un enzyme glucose oxydase de manière à mettre en
oeuvre la réaction de catalyse suivante
Glucose + 02 ~ acide gluconique + H202
so Ce type de senseur à récepteur enzymatique a été décrit pour la première
fois
par Clark et Lyons en 1962.
La transduction, c'est-à-dire la mesure de glucose présent dans le liquide,
peut théoriquement s'effectuer
- par un transducteur à oxygène qui mesurera le ratio entre l'oxygène
35 présent avant et après la réaction enzymatique de reconnaissance,
- par un transducteur de pH qui mesurera la production d'acide
gluconique au cours de la réaction enzymatique de reconnaissance,
- ou par un transducteur au peroxyde qui mesurera la production d'H202
au cours de la réaction enzymatique de reconnaissance.
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On constatera que selon ces trois méthodes le transducteur est situé pour
partie en amont et en aval de la chambre de réaction.
Pour permettre à un senseur d' effectuer une mesure de concentration
d'analyte précise, et rapide on comprend intuitivement qu'il convient
s - d'une part, que l'étape de reconnaissance soit la plus « bijective »,
c'est-
à-dire que la plus grande proportion possible d'éléments-analytes soient
reconnus par un élément-récepteur, (il est rare que plusieurs éléments-
récepteurs identiques identifient le même élément-analyte),
- et d'autre part, que la transduction soit la plus sensible possible et pour
~o ce faire qu'elle porte sur la plus grande quantité possible d'éléments
analytes reconnus.
Si on s'intéresse en outre aux senseurs de type en phase solide, c'est-à-dire
dont au moins un des éléments (analyte ou récepteur ou révélateur) est
immobilisé sur la surface d'épreuve de la chambre de réaction (et tous
15 paramètres étant imposés par ailleurs), la chimie impose que le «
bijectivité »
de la reconnaissance est d'autant plus grande
- que la « surface » d'échange entre éléments-analytes et éléments-
récepteurs au .sein de la chambre de réaction est grande,
- et que la « distance moyenne d'épreuve » entre le fluide échantillon et
20 la surface d'épreuve est petite.
On appellera
- distance moyenne d'épreuve : la moyenne des distances entre les
portions élémentaires de fluide-échantillon à l'intérieur de la chambre
d'épreuve du senseur et la surface d'épreuve,
25 - et section moyenne d'épreuve de la chambre de réaction : deux fois la
distance moyenne d'épreuve.
Notamment dans le cas des senseurs de type en phase solide et pour des
raisons chimiques, il convient donc, dans toute la mesure du possible, de
réaliser des chambres de réaction présentant un volume d'épreuve
so - de grande surface d'épreuve,
- et de petite section moyenne d'épreuve,
- tout en ayant un volume global d'épreuve réduit, pour limiter
l'encombrement et la consommation de fluide-échantillon et de réactifs.
C'est-à-dire qu'il est préférable chimiquement d'optimiser les paramètres de
35 la chambre de réaction en sorte
- que le ratio « surfacique» [entre la surface d'épreuve de la chambre de
réaction et sa section moyenne d'épreuve] soit élevé,
- ~et que le ratio « de sensibilité » [entre la surface d'épreuve de la
chambre de réaction et son volume d' épreuve] soit élevé.
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En outre, pour des raisons de sensibilité de mesure, il est souhaitable
physiquement d'effectuer la mesure de transduction sur le plus grand nombre
d'événements de reconnaissance possible. On conçoit donc que ces
paramètres d'efficacité des senseurs sont a priori contradictoires.
s L'art antérieur a tenté d'atteindre ces objectifs dans plusieurs directions.
Une première direction de l'art antérieur, à chambre de réaction
«bidimensionnelle», vise à mettre en oeuvre l'identification par le récepteur
de l'analyte à l'intérieur d'un volume d'épreuve bidimensionnel fin (quasi
plan). Cette catégorie bidimensionnelle, comprend tout d'abord les
1o dispositifs de test sur membrane capillaire. On appelle test sur membrane
capillaire, un procédé d'analyse mis en oeuvre à l'intérieur d'une membrane
fine constituée d'un milieu poreux tel un papier buvard. Un révélateur
spécifique de l'analyte recherché est immobilisé sur une zone spécifique
d'épreuve de la membrane. Après déposition sur la membrane, le liquide
~5 échantillon incluant l'analyte migre au travers du milieu poreux par
capillarité. Lorsque le liquide échantillon atteint la zone spécifique
d'épreuve,
l' analyte se lie avec le révélateur. Cette réaction entraîne un phénomène
chimiluminescent tel que fluorescence ou coloration de la zone spécifique
d'épreuve. Cela permet de conclure de manière binaire à la présence ou non
2o d'analyte.
Cette stratégie «surfacique» de test sur membrané capillaire répond bien aux
conditions « chimiques » requises décrites plus haut, c'est-à-dire
- grande surface d'épreuve,
- petite section moyenne d'épreuve,
2s - petit volume global.
Mais, on constate que ces tests sur membrane capillaire ne constituent pas
des senseurs au sens précisé plus haut. Ils ne possèdent pas de système
physique transducteur. Il s'agit donc d'un arrière plan technologique des
senseurs à chambre de réaction multi-tubulaires. Le résultat se lit en général
so directement à l'oeil. La conséquence est que ces tests sur membrane
capillaire
sont surtout qualitatifs (binaires). Ils ne permettent pas de quantifier
précisément la concentration d'analyte. En outre la géométrie membranaire
«bidimensionnelle», c'est-à-dire en couche mince présente le défaut d'être
peu sensible à la présence d'analyte (petit volume). Le phénomène visuel qui
s5 apparaît est le résultat des effets physico-chimiques sur une couche
superficielle. En sorte que ces tests membranaires ne sont utilisables que
pour des concentrations importantes d'analyte, (typiquement 106 / ml pour
des micro-organismes).
Pour combler cet obstacle de faible sensibilité, on fait quelquefois appel à
4o une phase initiale d'enrichissement de l'échantillon. Typiquement en
microbiologie, on peut faire une culture de l'échantillon de départ sur boîte
de Pétri af n de multiplier considérablement le nombre de micro-organismes
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présents avant analyse. La conséquence néfaste de cette phase
d'amplification, qui atteint couramment 24 à 72 heures, est une lenteur
caractéristique, regrettée par tous les utilisateurs, coûteuse et pénalisante.
Une deuxième direction de l'art antérieur, à chambre de réaction
s «tridimensionnelle», vise à mettre en oeuvre l'identification par le
récepteur
de l'analyte à l'intérieur d'un volume d'épreuve tridimensionnel.
Une première sous-variante de cette seconde stratégie de senseurs peut être
qualifiée de senseurs à chambre « volumique à faible ratio surfacique».
Un exemple de cette stratégie est l'utilisation comme cellule d'analyse d'une
~o pipette-support conique creuse dans les dispositifs VIDAS de la société
BioMérieux (France). Le fluide échantillon est prélevé à l'intérieur d'une
pipette-support conique recouverte intérieurement d'un récepteur. Puis des
réactifs et solutions de lavage sont successivement aspirés et refoulés dans
le
cône intérieur de la pipette. Les paires (récepteur-analyte) sont détachées de
i s la surface du cône et refoulées dans un puits où elles sont comptées par
spectrophotométrie. Cette méthode permet certes d'automatiser un grand
nombre de tests et de faciliter la manipulation par l'opérateur des
échantillons et des réactifs. Mais bien qu'elle soit très utilisée en
sérologie,
elle ne permet pas en microbiologie de s'affranchir des phases de croissance
2o préliminaires. On comprend qu'un des défauts de ce type de senseurs est que
le ratio « surfacique» [entre la surface d'épreuve de la chambre de réaction
et
sa section moyenne d'épreuve] est faible. La conséquence est que la
probabilité instantanée de capture d'un élément-analyte par un élément-
récepteur est faible. En sorte que la quantité globale de signaux élémentaires
2s de reconnaissance d'éléments-analytes est faible. Le signal résultant capté
par le transducteur est peu sensible. Il nécessite une période d'incubation
pour amplification qui allonge considérablement la durée de réalisation d'un
test. Typiquement un test par un appareil de ce type nécessite un période de
préparation de 18 heures suivie d'un processus de mesure de 15 à 45 minutes.
so Une deuxième sous-variante de cette seconde stratégie peut être qualifiée
de
«mufti-tridimensionnelle». Typiquement on utilise des chambres de réaction
à volume d'épreuve capillaire.
Il est connu de l'art antérieur d'utiliser des structures capillaires dans le
domaine des senseurs. L'homme de l'art connaît bien les structures poreuses
35 notamment obtenues par assemblage de microbilles de polyéthylène ou de
polystyrène ou de fibres de dérivés de cellulose, agglutinées pour constituer
un réseau poreux. Ces structures capillaires sont destinées à immobiliser des
analytes, et à être traversées par des réactifs. Les tests sur membrane
décrits
plus haut utilisent ces techniques. C'est le matériau à la base des tests de
4o grossesse couramment utilisés à domicile ou des tests de détection de
streptocoques en cas d'angine. Comme cela a été vu plus haut, la lecture de
ces tests est purement visuelle à l'apparition d'une coloration. Un
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inconvénient majeur de ce type de tests est sa sensibilité limitée [le «
volume
utile » de coloration étant limité à la partie superficielle de la couche
poreuse]
ce qui en limite l'utilisation à des concentrations d'analytes élevées. En
outre,
on a vu que ces s~stèmes ne constituaient pas des senseurs car ils ne
s possèdent pas de transducteur. Il s'agit donc d'un arrière plan
technologique
lointain de l'invention.
L'art antérieur connaît également la fabrication et l'utilisation de
structures
multi-tubulaires monolithiques pour des applications non liées à l'analyse.
La société (US) Schott en produit et commercialise pour des applications de
laboratoire et d'optoélectronique. La société (US) Burle en produit et
commercialise pour des applications de tubes électroniques et de
photomultiplicateurs. La société (US) Collimated Holes en produit et
commercialise pour des applications liées aux fibres optiques. A ce jour, ces
chambres à structure mufti-micro-tubulaire selon l'art antérieur, ont
i5 typiquement des diamètres de micro-tubes de cinq microns à un millimètre.
La géométrie des micro-tubes est généralement à section circulaire,
hexagonale ou carrée. Le nombre de micro-tubes assemblés est d'environ
200 000. La section globale de la chambre est de l'ordre de 25 mm. Elles
sont classiquement réalisées en verre (borosilicate ou plomb silicate).
2o L'application habituelle, selon l'art antérieur, de ces structures mufti-
micro-
tubulaire concerne . la collimation de flux gazeux et de rayons X, la
calibration de fuite, le contrôle de flux d'air, l'utilisation en tant que
barrière
de pression différentielle, la filtration, l'optoélectronique, la fenêtre
d'entrée
de Lasers. Une application avancée proposée par la société Burle est la
25 réalisation d'un générateur de flux d'électrons amplifié lorsqu'une
différence
de potentiel est appliquée aux deux extrémités de la chambre à structure
mufti-micro-tubulaire. Il ne s'agit donc pas d'applications de senseurs.
Il est également connu par l'art antérieur de réunir un faisceau parallèle de
tubes à paroi membranes écartés les uns des autres pour réaliser un système
so de dialyse. La structure est non monolithique. Les tubes, écartés les uns
des
autres, sont connectés en parallèle à une première extrémité à un connecteur
d'entrée du sang et à une seconde extrémité à un connecteur de sortie du
sang. L'ensemble est placé à l'intérieur d'une enveloppe au travers de
laquelle circule le dialysat. Ce système ne met en oeuvre ni récepteur
35 chimique à l'intérieur des tubes, ni transducteur. Il ne s'agit donc pas
d'une
application de senseurs.
Le document WO 021094440 A2 (« Microchip integrated multichannel
electroosmotic pumping system ») décrit une autre application de gerbe
monolithique de tubes capillaires où cette gerbe constitue une pompe électro-
40 osmotique pour utilisation dans des puces ou des micro-machines. Mais ce
dispositif ne comprend pas de transducteur. Il ne s'agit' d'ailleurs pas d une
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application de senseur. Il s'agit là d'un arrière-plan technologique très
éloigné de l'invention.
Les senseurs de l'art antérieur selon la deuxième sous-variante de cette
seconde stratégie «mufti-tridimensionnelle» visent à mettre en oeuvre
l'identification par le récepteur de l'analyte à l'intérieur d'un volume
d'épreuve tridimensionnel mufti-canalisé. On peut qualifier cette stratégie de
«volumique à haut ratio surfacique ». Mais on verra plus loin que dans ce cas,
l'art antérieur ne se préoccupe pas de la structure du transducteur et de la
géométrie du couple chambre mufti-tubulaire/transducteur.
L'arrière plan technologique de l'invention connaît la fabrication et
l'utilisation de structures « mufti-tridimensionnelle » mufti-tubulaires non
monolithiques pour des applications liées à l'analyse.
Un senseur d'analyse à chambre mufti-tubulaire non monolithique est décrit
dans le brevet US 6,517,778 (« Immunoassays in capillary tubes »). Le
volume d'épreuve est constitué d'un seul tube capillaire ou d'un petit
nombre de tubes capillaires séparés les uns des autres. Le fluide échantillon
est placé dans un ou plusieurs puits d'un plateau récepteur jetable après
usage. Il y est mélangé avec un réactif, aspiré dans un ou plusieurs des tubes
capillaires d'épreuve, séparés au sein d'une boîte support, reliée à un
2o appareil d'analyse. Les éléments-analytes réagissent avec des éléments-
récepteurs portés par la surface du (des) tubes) capillaires) d'épreuve. Les
tubes d'épréuves sont ensuite lavés pour arrêter la réaction et séchés. Chaque
tube capillaire d'épreuve est alors exposé à une lampe pour créer un signal
de fluorescence qui est détecté par un transducteur. Il est à remarquer que
25 - d'une part, chaque tube capillaire est séparé et distant des autres (il
s'agit d'une structure non monolithique),
- et d'autre part, la mesure de transduction est effectuée tube par tube (il
n'est pas décrit de géométrie de transducteur englobant latéralement
l'ensemble des tubes).
3o On comprend qu'un premier défaut de ce type de senseurs est que son ratio
« de sensibilité » [entre la surface intérieure d'épreuve de la chambre de
réaction et son volume d'épreuve] est faible du fait qu'il met oeuvre un petit
nombre de tuyaux écartés les uns des autres. En sorte que sa sensibilité est
faible. Un second défaut de ce dispositif est que sa boîte support de tubes
est
ss encombrante, onéreuse et difficile à transporter et à manipuler (du fait de
sa
taille).
L'art antérieur connaît la fabrication et l'utilisation de structures multi-
tubulaires monolithiques pour des applications liées à l'analyse.
L'utilisation
de ces structures en analyse chimique a été considérablement accélérée par le
ao développement (notamment dans le domaine de la recherche pharmaceutique)
des techniques dites de criblage à haut débit. Celles-ci font appel à des «
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bibliothèques » de réactifs différents simultanément mis en oeuvre sur des
plaques portant typiquement 96 puits de réaction.
Le brevet US 6,027,873 ("Multithrough hole testing plate for high
throughput screening") décrit un dispositif de criblage utilisant une
structure
multi-micro-tubulaire pour relier les réservoirs d'une bibliothèque de
produits au fond des puits d'une plaque mufti-puits. Les extrémités
proximales (du côté de la plaque mufti-puits) sont soudées entre elles pour
constituer une téte de réaction mufti-tubulaire monolithique. Les extrémités
distales (du côté des réservoirs de la bibliothèque) restent individualisées
~ o sous forme de tubes souples. Ceci a pour but de contourner la difficulté
du
remplissage de puits de très petite taille. Il ne s'agit pas là d'une
application
de senseur. On ne décrit dans ce document aucune réaction de type analyte
récepteur à l'intérieur des tubes. De surcroît, on ne décrit pas de
transducteur
de mesure de détection d'analyte. Bien évidemment on ne s'intéresse pas
15 dans ce document à la géométrie du couple transducteur/chambre de réaction.
Le document US 2002 / 0164824 (« Method and apparatus based on bundled
capillaries for high throughput screening ») décrit également essentiellement
un dispositif de criblage à haut débit de composés chimiques du type général
décrit plus haut et non un senseur. Néanmoins on peut considérer ce
2o document comme faisant partie de l'arrière plan technologique de
l'invention,
du . fait que l'utilisation de ces structures capillaires a été proposée
brièvement comme possible support de tests immunologiques
(revendications 55 et suivantes). Dans la description de ce dispositif au
titre
de senseur de type immunologique compétitif, il est équipé des fibres
25 optiques creuses et tapissant concentriquement l'intérieur de chaque micro-
tube. Ces fibres optiques constituent un faisceau de transducteurs. Selon la
technique proposée, la transduction est donc effectuée séparément à
l' intérieur de chacun des tubes de la structure. Le signal est récupéré à
l'extrémité de chacun des tubes. L'inconvénient principal d'un senseur à
3o faisceau transducteur de ce type serait la complexité de la géométrie des
couples transducteurs/micro canaux, et les coûts de fabrication associés. En
outre, le branchement éventuel de la multitude des fibres optiques rendrait
l'assemblage onéreux et fragile. Cela rendrait rédhibitoire la fabrication de
cartouches d'épreuve mobiles jetables selon cette technique.
35 Le document WO 02/10761 A1 (« Microarrays and their manufacture by
slicing ») décrit également la fabrication d'un dispositif de criblage à haut
débit où chaque tube ou cylindre d'une gerbe de tubes ou de cylindres est
recouvert d'un agent biologique différent. On sectionne ces gerbes,
perpendiculairement à leur direction principale, pour constituer des tranches
4o au travers des quelles l'on fait passer un échantillon. Mais on observe la
coloration de chaque tube à l'une de ses extrémités. Il n'y a pas de
transducteur placé latéralement à la gerbe de tubes. Il n'y a pas non plus
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d'intégration en seul signal des signaux de la pluralité de tubes, puisqu'on
observe un signal pour chaque tube.
Le document US 2002/0086325 A1 (« Affinity detecting / analytical chip,
method for production thereof, detection method and detection system using
s saure ») décrit une gerbe de tubes en verre surmoulée par un support en
résine. Les tubes sont recouverts intérieurement de molécules capables de
différentes réactions de couplage spécifiques. On fait passer au travers de la
gerbe un échantillon dont certains composants peuvent être retenus
spécifiquement par les molécules fixées à l'intérieur des tubes. Appliquant
io un flux lumineux à une extrémité des tubes, on observe alors la coloration
à
l'autre extrémité. Celle-ci varie selon qu'il y a eu ou non rétention de
certains composants de l'échantillon à l'intérieur des tubes. Il n'y a pas de
transducteur placé latéralement à la gerbe de tubes et il n'y a pas
intégration
en seul signal des signaux de la pluralité de tubes ; puisqu'on observe un
1 s signal pour chaque tube.
Le brevet US 5,690,894 ("High density array fabrication and readout method
for a fiber optic biosensor") décrit la fabrication et l'utilisation de
biosenseurs comprenant une pluralité de fibres optiques, chaque fibre optique
ayant attachés à son extrémité sensible des éléments spécifiques d'un analyte.
2o Chaque fibre optique agit purement comme un transducteur et assure le seul
transport d'une information optique vers l'autre extrémité. L'information
d'une fibre est soit visualisée par un opérateur, soit traitée par un appareil
numérique. Ce brevet ne décrit pas de mufti canalisation de l'échantillon à
travers une chambre de réaction multitubulaire. Il s'agit donc d'arrière-plan
2s technologique très éloigné de l'invention.
Une troisième direction de l'art antérieur des senseurs s'intéresse plus
particulièrement à l'aspect sensibilité de mesure tel qu'évoqué plus haut.
Le brevet EP 1,262,766 (« Method for analyzing a mixture of biological
and/or chemical components using magnetic particles and device for the
so implementation of said method") enseigne l'utilisation de structures
capillaires poreuses comme support de réaction à l'intérieur du volume
d'épreuve pour augmenter le ratio « de sensibilité » [entre la surface
intérieure d'épreuve de la chambre de réaction et son volume d'épreuve] et
donc la densité d'événements de reconnaissance à l'intérieur du volume
s5 d'épreuve. Le senseur met en oeuvre des anticorps comme éléments-
récepteurs et des billes super paramagnétiques comme éléments-révélateurs.
La transduction est fondée sur l'application d'un champ magnétique au
volume d'épreuve et la mesure de l'induction magnétique qui résulte de la
magnétisation de tous les éléments-révélateurs présents dans le volume
4o d'épreuve. La seule façon décrite de créer une structure capillaire poreuse
est
basée sur un assemblage de microbilles de polyéthylène. Ce document ne
s'intéresse donc pas au domaine spécifique des senseurs à chambre de
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réaction mufti-tubulaire. Ce document ne décrit pas non plus la géométrie
relative du couple chambre de réaction/transducteur. Le défaut principal du
type de structure capillaire poreuse envisagé par microbilles est de créer un
volume d'épreuve à multiples cavités aléatoires dont il a pu être constaté
s qu'il provoque de nombreux faux événements de détection notamment du
fait de billes bloquées dans les cavités. Ce type de configuration de senseur
est imprécis. Un autre défaut de ce type de structure capillaire poreuse est
son ratio « de sensibilité » [entre la surface d' épreuve de la chambre de
réaction et son volume d'épreuve]. Il est plus faible que celui d'une
structure
~ o mufti-tubulaire en sorte que sa sensibilité est inférieure.
Enfin, parmi l'arrière plan technologique de l'invention on peut citer
différents systèmes de traitement chimique utilisant des structures multi-
tubulaires mais non dédiées à la réalisation de senseurs. Ainsi, le brevet US
6,027,627 « Automated parallel capillary electrophoretic system » décrit un
système automatisé d'électrophorèse. Le dispositif utilise une cartouche qui
comprend
- une pluralité de tubes capillaires reliés en leur extrémité, mais non
tangents sur leur longueur,
- et une même pluralité de tubes d'électrophorèse parallèles.
2o A une première extrémité, les tubes capillaires sont reliés à des plateaux
micro-titre, et à l'autre aux tubes d'électrophorèse. Le dispositif comprend
également un système d'alimentation de gel qui sert de milieu de migration.
Ceci permet d'effectuer l'électrophorèse capillaire d'échantillons présents
dans chacun des puits du plateau. La structure micro-tubulaire (aussi bien des
25 tubes capillaires que des tubes d'électrophorèse) n'est pas monolithique.
En
outre ce système ne met en oeuvre aucune réaction de reconnaissance
d'analyte par un récepteur. Enfin le système ne comporte pas de transducteur.
Il ne s'agit pas d'une application de senseur.
Exposé de l'invention
so Sous sa forme la plus générale, l'invention concerne un procédé
d'évaluation
de la concentration d'éléments-analytes d'un analyte présents dans un fluide-
échantillon. On appelle éléments-analytes des entités chimiques solubles ou
des micro-organismes vivants ou morts, ou de parties de micro-organismes.
L'invention concerne une amélioration au procédé habituel de
35 fonctionnement d'un senseur. On appelle senseur un dispositif d'évaluation
de la concentration d'éléments-analytes d'un analyte présents dans un fluide-
échantillon constitué
- d'une chambre de réaction matérialisant intérieurement un volume
d'épreuve à l'intérieur duquel on canalise la fraction du fluide
4o échantillon à analyser,
- et d'un système transducteur de mesure.
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Le volume d' épreuve est circonscrit par une surface enveloppe de réaction.
Topologiquement on définit la surface enveloppe de réaction comme la plus
petite surface continue entourant ledit volume d'épreuve. Classiquement,
cette surface enveloppe est constituée
s - d'une face frontale amont perméable,
- d'une face frontale aval perméable située à l'opposé de la face amont
perméable,
- et d'une face latérale imperméable sensiblement cylindrique, connectée
par ses deux extrémités aux pourtours des deux faces amont et aval.
1o Tout senseur met en oeuvre un composant actif (chimique etlou biologique)
appelé récepteur, que l'on met en contact avec le fluide-échantillon à
l'intérieur du volume d'épreuve. Les éléments-récepteurs possèdent une
affinité avec les éléments-analytes pour les détecter. Le récepteur présente
en
outre la propriété [seul ou en combinaison avec un autre composant actif
1s appelé révélateur également introduit à l'intérieur du volume d'épreuve] de
modifier d'un signal élémentaire, une variable d'état extensive (physique
et/ou chimique) mesurable, à chaque occurrence [ou selon une certaine loi de
probabilité], lors d'un événement de reconnaissance d'un élément-analyte
par un élément-récepteur.
2o Le système transducteur de mesure de la variable d'état extensive est un
composant hardware qui permet de quantifier la présence des éléments-
analytes dans le fluide-échantillon.
Le procédé d'évaluation de concentration selon l'invention est
caractéristique par le fait qu'en combinaison
2s - d'une part, on mufti-canalise en parallèle la fraction du fluide-
échantillon, à travers un senseur doté d'une chambre de réaction
monolithique en gerbe mufti-micro-tubulaire,
- d'autre part, on positionne le système transducteur latéral de mesure
intégrale de la variable d'état extensive, entièrement à l'extérieur de la
so surface d'épreuve de la chambre de réaction, et strictement en regard de
la face latérale ïmperméable,
- et enfin on effectue grâce au système transducteur latéral de mesure
intégrale une mesure intégrale des variations de ladite variable d'état
extensive concomitamment dans tous les canaux de la chambre de
35 réaction.
Plus précisément, on met en oeuvre une chambre de réaction constituée par la
réunion d'une pluralité de canaux micro-tubulaires cylindriques multi
tangents de manière à délimiter une pluralité dense de volumes élémentaires
convexes disjoints, disposés en gerbe, ouverts à leurs deux extrémités, et
4o dont l'union constitue un volume global d'épreuve non convexe.
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- Les canaux sont cylindriques, en ce sens qu'ils délimitent chacun une
surface intérieure élémentaire générée topologiquement par le
déplacement, le long d'une une ligne centrale élémentaire de squelette
virtuelle continue, d'une courbe de forme continue et fermée, placée
s sensiblement perpendiculairement.
- Les canaux sont de longueurs [c'est-à-dire de longueur de lignes
centrales élémentaires] sensiblement égales.
- Les canaux sont micro-tubulaires, c'est-à-dire qu'ils ont une section
intérieure élémentaire perpendiculaire à la ligne centrale élémentaire
qui possède au moins une dimension transversale sélective de plusieurs
ordres de grandeurs plus petite que leur longueur (typiquement de
l'ordre de 1000 fois plus petite).
- Les canaux sont disposés sensiblement parallèlement, c'est-à-dire que
leurs lignes centrales élémentaires sont disposées sensiblement
~ s parallèlement.
- Les canaux sont mufti-tangents. C'est-à-dire que chaque micro-tube est
en contact longitudinal sur sensiblement tout sa longueur avec au
moins un autre micro-tube voisin. En sorte que l'ensemble des canaux
micro-tubulaires constitue une gerbe dense monolithique.
2o Le volume d'épreuve global non convexe' est circonscrit par la surface
enveloppe de réaction dont les faces frontales perméables amont et aval sont
situées au droit des sections d'entrée et de sortie des canaux micro-
tubulaires.
Enfin on met en oeuvre un système transducteur latéral de mesure intégrale
qui effectue une mesure intégrale ~E = E,~-1_._" E;, (dE);;k, (c'est-à-dire
une
25 sommation) des variations de ladite variable d'état extensive,
concomitamment pour tous les volumes élémentaires à la fois, et pour tous
les signaux élémentaires (dE);,k dans chaque tube élémentaire à la fois, ce au
travers de la face latérale imperméable. En sorte qu'on quantifie globalement
la présence des éléments-analytes dans le fluide-échantillon, dans tous les
so canaux micro-tubulaires de la chambre de réaction à la fois.
Liste des figures
- Les figures 1, la et lb montrent les principes de fonctionnement du
procédé d'évaluation de concentration d'analytes selon l'invention à l'aide
d'un senseur à cartouche en gerbe mufti-tubulaire monolithique et
35 transducteur latéral intégral.
- Les figures 2 et 3a à 3d décrivent les relations dimensionnelles et
structures géométriques de gerbes de canaux micro-tubulaires,
recommandées par l' invention, pour réaliser une cartouche d' épreuve.
- Les figures 4a à 4d montrent les différentes étapes de mouvement de
4o fluides et réactifs au travers de la chambre de réaction lors du
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fonctionnement d'un senseur immunologique à récepteur de type anticorps
et révélateur à microbilles super-paramagnétiques selon l'invention.
- Les figures Sa et Sb représentent en perspective et en coupe, un premier
mode préféré de réalisation selon l'invention d'une cartouche cylindrique
s mobile consommable pour senseur.
- La figure 6a représente en perspective, un second mode préféré de
réalisation selon l'invention d'une cartouche conique mobile
consommable pour senseur.
- La figure 6b représente un mode préféré de mise en oeuvre de la cartouche
~ o conique.
- Les figures 7a et 7 b représentent en perspective deux variantes préférées
d'un troisième mode de réalisation selon l'invention d'une cartouche, à
chambre monolithique en gerbe multi-tubulaire lamellaire mono-
périodique mobile consommable.
~ s - La figure 8 décrit schématiquement le procédé de fonctionnement selon
l'invention d'un senseur mufti-localisé (en deux parties).
- Les figures 9a, 9d et 9e décrivent schématiquement un mode de réalisation
selon l'invention d'un senseur mufti-localisé incluant un pistolet de
prélèvement et un dispositif de révélation/mesure.
20 - Les figures 9b et 9c décrivent un mode de réalisation de cartouches à
aiguille selon l'invention.
- La figure 10 décrit plus en détail le schéma fonctionnel du dispositif de
révélation/mesure de la figure 9e.
- La figure 11 décrit une variante de cartouche d'épreuve prolongée d'un
25 cône de prélèvement.
- Les figures 12a, 12b, 13a à 13d et 14 décrivent une autre variante d'un
dispositif robotisé linéaire, selon l'invention.
- Les figures 15, 15a et 15b décrivent une variante robotisée d'un senseur
mufti-localisé à carrousel, selon l'invention.
~o - Les figures 16a et 16b décrivent le principe de fonctionnement d'un
dispositif mufti-localisé séquentiel robotisé d'analyse selon l'invention.
- Les figures 17a et 17b décrivent une variante de cartouche d'épreuve
mufti-chambre.
- La figure 17c décrit une mufti-cartouche d'épreuve mufti-chambre.
35 - Les figures 18a et 18b décrivent une variante simplifiée d'une seringue
de
prélèvement selon l'invention.
- Les figures 19a à 19d décrivent schématiquement 4 modes de mise en
oeuvre d'un senseur mufti-localisé selon l'invention.
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- Les figures 20a à 20c décrivent de façon simplifiée en perspective,
schématiquement et en coupe, un dispositif transducteur magnétique selon
l' invention.
- La figure 21 décrit un senseur mufti-analytes réalisé d'après l'invention.
s - Les figures 22, 22a et 22b décrivent un procédé préféré par l'invention de
fabrication du réseau en gerbe mufti-tubulaire d'une cartouche de senseur.
- Les figures 23a à 23c illustrent la séquence des réactions d'une analyse du
type sandwich.
- Les figures 24a et 24b illustrent la séquence des réactions d'une analyse
~ o par déplacement.
- Les figures 25a et 25b illustrent la séquence des réactions d'une analyse
par remplacement.
Exposé détaillé de l'invention
La figure 1 décrit sur un exemple particulier le procédé selon l'invention de
15 fonctionnement d'un senseur (Sen) pour l'évaluation de la concentration
d'éléments-analytes (a;) d'un analyte (A) présents dans un fluide-échantillon
(F), compris initialement dans un volume échantillon (Vec). Comme cela est
le cas avec tout senseur chimique ou biologique, le fonctionnement du
senseur (Sen) comprend les étapes suivantes
20 - . on canalise une fraction du fluide-échantillon (F) à l'intérieur d'un
volume
d'épreuve (Vep),
- on met en contact le fluide-échantillon (F), à l'intérieur du volume
d'épreuve (Vep), avec un composant actif (chimique et/ou biologique)
appelé récepteur (R),
25 - on mesure, grâce à un système transducteur de mesure (T), la présence des
éléments-analytes (a;) dans le fluide-échantillon (F).
Le volume d'épreuve (Vep) est circonscrit par une surface enveloppe de
réaction (Sev). La surface enveloppe de réaction (Sev) est définie comme la
plus petite surface continue entourant ledit volume d'épreuve (Vep). Le
so senseur (Sen) est principalement constitué par une chambre de réaction
(Cre)
qui matérialise l'intérieur de la surface enveloppe de réaction (Sev). La
surface enveloppe de réaction (Sev) comporte une face frontale amont (sfam)
perméable, une face frontale aval (sfav) perméable (située à l'opposé de la
face amont (sfam) perméable), et une face latérale (slat) imperméable
3s sensiblement cylindrique. La face latérale (slat) est connectée par ses
deux
extrémités aux pourtours (7, 8) des deux faces frontales amont (sfam) et aval
(sfav).
A titre d'exemple, le senseur (Sen) selon l'invention décrit figures 1, la et
lb
est du type immuno-magnétique. Il vise à évaluer par une analyse du type
~o sandwich la présence d'éléments-analytes (a;) constitués par des bactéries
du
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genre Cryptosporidium présents dans un fluide-échantillon (F) d'eau potable.
Les éléments-récepteurs (rlm) d'un premier composant actif récepteur (R1)
(chimique et/ou biologique), constitué en l'occurrence d'anticorps primaires
(apm) [spécifiques du genre Cryptosporidium], sont fixés sur la surface
s d'épreuve (Sep). Ils possèdent une affinité avec les éléments-analytes (a;)
pour les détecter et les immobiliser, lors de leur multi-canalisation au
travers
de la chambre de réaction (Cre). Le composé actif récepteur (R) est présent
dans un Becher (6). Les éléments-récepteurs (r~) ont la propriété de modifier
d'un signal élémentaire (dE), une variable d'état extensive (physique et/ou
~ o chimique) mesurable (E), à chaque occurrence [ou selon une certaine loi de
probabilité], lors d'un événement de reconnaissance d'un élément-analyte (a;)
par un élément-récepteur (r~). Dans ce cas particulier, les éléments-
récepteurs
(r~) sont constitués de paires d'un anticorps secondaire (as~) [spécifique du
genre Cryptosporidium], sur lequel est greffée une microbille super-
15 paramagnétique (sp~). Les microbilles super-paramagnétiques (sp~) sont
dénuées d'activité magnétique en l'absence de champ extérieur, mais
induisent une perturbation d'un champ magnétique extérieur lorsqu'il leur
est appliqué.
Le transducteur de mesure (T) a pour but de mesurer les variations de ladite
2o variable d'état extensive (E), ici le champ magnétique, de manière à
quantifier la présence des éléments-analytes (a;) dans le fluide-échantillon
(F)
sous la forme d'un signal analytique exploitable (Se). En l'occurrence le
transducteur (T) mesure les perturbations générées par les microbilles super
paramagnétiques (sp~) à l'application d'un champ magnétique (H) au regard
2s de la surface latérale imperméable (slat).
Mais, selon le procédé de l'invention, on constate que la fraction du fluide-
échantillon (F), [l'eau chargée de bactéries], est mufti-canalisée en
parallèle à
travers une chambre de réaction (Cre). La chambre de réaction (Cre) est
monolithique mufti-tubulaire, constituée par la réunion en gerbe, d'une
so pluralité de canaux micro-tubulaires cylindriques mufti-tangents (cl, c2,
...,
ck, ..., c~). Les figures 1 a et 2 décrivent plus en détail la configuration
des
canaux micro-tubulaires (ck) à l'intérieur de la chambre de réaction (Cre).
Les canaux (ck) sont cylindriques, c'est-à-dire qu'ils délimitent chacun une
surface intérieure élémentaire (sepk), générée topologiquement par le
35 déplacement, le long d'une ligne centrale élémentaire de squelette (lk)
virtuelle continue, d'une courbe de forme (fk) continue et fermée placée
sensiblement perpendiculairement. Les canaux (ck) peuvent avoir une courbe
de forme (fk) circulaire, elliptique, ovale ou polygonale comme illustré par
les figures 3a à 3d. Les canaux (ck) sont de longueurs (1) sensiblement
égales,
4o c'est-à-dire que les longueurs de leurs lignes centrales élémentaires (lk)
sont
égales. Les canaux (ck) sont micro-tubulaires, c'est-à-dire que leur section
intérieure élémentaire (sk) perpendiculaire à la ligne centrale élémentaire
(l~)
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possède au moins une dimension transversale sélective (dx) de plusieurs
ordres de grandeur plus petite que leur longueur (1) (typiquement de l'ordre
de 1000 fois plus petite). Les canaux (ck) sont disposés sensiblement
parallèlement en gerbe, c'est-à-dire que leurs lignes centrales élémentaires
(1k)
sont disposées sensiblement parallèlement. De plus ils sont multi-tangents.
C'est-à-dire que chaque micro-tube (ck) est en contact longitudinal sur
sensiblement toute sa longueur avec au moins un autre micro-tube (c~~)
voisin. De cette manière, la chambre de réaction (Cre) délimite
intérieurement une pluralité dense de volumes élémentaires convexes
1o disjoints (vec~, vec2, ..., veck, ..., vecn) voisins ouverts à leurs deux
extrémités (eek, esk). Leur union constitue un volume global d'épreuve (Vep)
non convexe. Le volume global d'épreuve (Vep) non convexe est circonscrit
par la surface enveloppe de réaction (Sev), dont les faces frontales
perméables amont (sfam) et aval (sfav) sont situées au droit des sections
d'entrée (sek) et de sortie (ssk) des canaux micro-tubulaires (cl, c2, ...,
ck, ...,
Cn).
En sus de comporter une chambre de réaction (Cre) en gerbe mufti-tubulaire,
le senseur (Sen) est doté d'un système transducteur magnétique latéral de
mesure intégrale (T) de la variable d'état extensive (E). Celui-ci apparaît
plus
2o en détail figures 20a à 20c. Il est constitué d'un émetteur de champ
électromagnétique (11) formé d'un enroulement primaire de spires (71) relié
à une source de courant primaire (72), et d'un récepteur de champ
magnétique (13) constitué d'un enroulement secondaire de spires (73) relié à
un dispositif d'analyse de courant secondaire (12). Les enroulements
primaire (71 ) et secondaire (73 ) de spires (74) entourent la face latérale
imperméable (slat) de la chambre de réaction (Cre) en gerbe mufti-micro-
tubulaire. On constate que la partie active du transducteur magnétique latéral
de mesure intégrale (T), et notamment les enroulements primaire (71 ) et
secondaire (73), est située entièrement à l'extérieur de la surface enveloppe
so (Sev) de la chambre de réaction (Cre) et strictement en regard de la face
latérale imperméable (slat).
Tel que cela apparaît figure l, le senseur (Sen) fonctionne de la manière
suivante. Le fluide-échantillon (F) est situé initialement dans le volume
échantillon (Vec) d'un Becher (1). Il est prélevé par l'intermédiaire d'un
tuyau d'aspiration (2) plongeant dans le Becher (1) et aspiré grâce à une
pompe doseuse (3) située en aval. Il est mufti-canalisé au travers des canaux
micro-tubulaires (ck) de la cartouche d'épreuve (Car), qui sera décrite plus
en
détail figures Sa et Sb. La figure 4a décrit l'aspiration et la mufti-
canalisation
initiale du fluide-échantillon (F) au travers de la chambre de réaction (Cre).
4o Ensuite, comme cela apparaît figures 46 à 4d, on mufti-canalise
successivement par aspirations [et éventuellement refoulements dans certains
cas de mise en oeuvre] les solutions de lavage et réactif suivants au travers
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des canaux micro-tubulaires (ck) de la cartouche d'épreuve (Car). En figure
4b, on aspire en la multi-canalisant une solution de lavage (4) consistant en
un tampon [à pH 7.0], contenue dans un Becher (5). Puis en figure 4c, on
aspire en la mufti-canalisant une suspension du récepteur (R) contenue dans
s le Becher (6). Enfin, en figure 4d on aspire de nouveau en la mufti-
canalisant
la solution de lavage (4). Les réactions biochimiques de ce cas particulier
sont illustrées en figure lb et 23a à 23c. Le récepteur (R1), constitué dans
ce
cas d'anticorps spécifiques de Cryptôsporidium, dits primaires (apm), est
greffé sur la paroi en verre (sepk) des canaux micro-tubulaires (ck)
1o préalablement activée par silanisation, selon les règles de l'art. Au
passage
du fluide-échantillon (F), les bactéries Cryptosporidium (a;), s'il y en a,
sont
spécifiquement retenues par ces anticorps (apm). Au passage du récepteur (R)
en excès, les paires [anticorps secondaires (as~) - microbilles super-
paramagnétiques (sp~)] se fixent spécifiquement sur les bactéries
~s immobilisées (a;). Le passage de la solution de lavage (4) permet
d'éliminer
les paires (as~ = sp~) non liées aux éléments-analytes (a;) ou liées non
sélectivement par des liaisons plus faibles. Chaque bactérie immobilisée (a;)
est alors signalée bijectivement par une microbille super-paramagnétique
(sP~).
2o Le système transducteur magnétique de mesure intégrale latéral (T)
fonctionne préférentiellement selon le principe décrit dans le brevet EP
1,262,766. On applique par le biais de l'enroulement primaire (71), situé de
part et d'autre de la surface latérale imperméable (slat) de la chambre de
réaction (Cre), un champ magnétique variable (H). Chaque particule super-
2s paramagnétique (sp;), inactive en l'absence de champ magnétique extérieur,
induit une perturbation élémentaire (dE);;k du champ. On effectue grâce au
système transducteur magnétique de mesure intégrale latéral (T) une mesure
intégrale 0E = E,~,..." E;; (dE);;k, (c'est-à-dire une sommation) des
variations de
ladite variable d'état extensive (E) [le champ magnétique (H)],
so concomitamment pour tous les volumes élémentaires (veck) à la fois, et pour
tous les signaux élémentaires (dE);~k dans chaque tube élémentaire (ck) à la
fois, ce au travers de la face latérale imperméable (slat). On mesure alors la
somme DE de ces perturbations grâce à l'enroulement secondaire (73) relié
au dispositif d'analyse de courant secondaire (12). De cette manière, on
35 quantifie globalement la présence des éléments-analytes (a;) dans le fluide-
échantillon (F) dans tous les canaux micro-tubulaires (ck) à la fois par
l' intermédiaire des perturbations de champ provoquées par les microbilles
(sP~).
Comme cela apparaît à la figure 2, l' invention recommande des relations
ao dimensionnelles particulières entre les éléments-analytes (a;) et les
canaux
micro-tubulaires (cl, c2, ..., ck, ..., c"). L'exemple décrit concerne le cas
on
l'on souhaite évaluer la concentration d'éléments-analytes (a;) d'un analyte
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(A) biologique [ici des champignons microscopiques ou des bactéries]. Leur
diamètre typique (dt) est typiquement situé entre 0,01 microns et 10 microns.
Il est recommandé par l'invention que la chambre de réaction monolithique
multi-tubulaire (Cre) soit constituée par la réunion d'une gerbe de canaux
s micro-tubulaires (ci, c2, ..., ck, ..., c") dont on choisit ladite dimension
transversale sélective (dx) en corrélation avec le diamètre typique (dt) des
éléments-analytes biologiques (a;). Typiquement on choisit la section
intérieure élémentaire (sk) des canaux micro-tubulaires (ck) de manière que
lesdites dimensions transversales (dx) soient sensiblement égales à environ
~ 0 10 fois le diamètre typique (dt) des éléments-analytes biologiques (a;),
soit
notamment de l'ordre de grandeur de 10 microns si les éléments-analytes
biologiques (a;) sont des bactéries.
Les figures 3a à 3d décrivent les dimensions et relations géométriques
recommandées par l'invention pour la chambre de réaction (Cre) et le
15 transducteur (T). Préférentiellement la chambre de réaction monolithique
multi-micro-tubulaire bi-périodique (Cre) est constituée par la réunion d'une
pluralité de n (n = environ 300 000) canaux micro-tubulaires (cl, c2, ..., ck,
...,
cn). Les canaux micro-tubulaires (ck) ont avantageusement une section
quasi-révolutive, c'est-à-dire une section à courbe de forme (fk) continue
telle
2o que cercle, ellipse, polygone, ovale, ... dont tout couple de deux
dimensions
transversales perpendiculaires (dx, dy) sont du même ordre de grandeur (d)
(d = dx = dy - de l'ordre de 10 microns). Les canaux micro-tubulaires (ck)
sont disposés parallèles, adjacents et jointivement en forme de gerbe (18)
selon une direction . commune axiale (zz') d'orientation de leurs lignes
25 centrales élémentaires (1k). Ils forment un réseau périodique (Rxy)
bidimensionnel perpendiculairement à ladite direction commune axiale (zz')
d'orientation.
Comme cela apparaît figure 20c, le système transducteur latéral de mesure
intégrale (T) de la variable d'état extensive (E) englobe sensiblement
so l'extérieur de la face latérale imperméable (slat), à une distance (Re)
radiale
de l'ordre de 7 mm. Dans le cas général et pour une cartouche (Car)
cylindrique, le système transducteur est à une distance (Re) de l'ordre de
grandeur de Re ~ (2,1 *~ (n /~) * d ) de l'axe constitué par ladite direction
commune (zz') d'orientation de chambre de réaction (Cre) [soit Re = 7mm
35 pour une gerbe (18) de 300 000 canaux micro-tubulaires (c~, c2, ..,c~,..,
c") de
diamètre intérieur (d) de 10 microns]. La combinaison entre une chambre de
réaction (Cre) cylindrique et un système transducteur latéral de mesure
intégrale (T), en englobant sensiblement annulairement l'extérieur de la face
latérale imperméable (slat), permet d'optimiser le ratio d'efficacité de
ao mesure (ref = n / Re) entre le nombre n de canaux micro-tubulaires, et la
distance (Re) entre ledit système transducteur latéral de mesure intégrale (T)
et l'axe (zz') de la chambre de réaction (Cre).
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Les figures Sa et Sb représentent en perspective et en coupe un premier modé
préféré de réalisation selon l'invention d'une cartouche d'épreuve (Car)
cylindrique mobile consommable pour senseur (Sen). Selon l'invention, il est
recommandé de réaliser des cartouches (Car) constituées de n = 300 000
s canaux micro-tubulaires (cl, c2, ..., ck, ..., c") en verre de 10 microns de
diamètre (d) intérieur. Le diamëtre réel des tubes (ck), paroi comprise est
d'environ 1,5 fois le diamètre intérieur (d) soit 15 microns. Dans ce cas, la
chambre monolithique (Cre) à un diamètre (De) d'environ [3 * ~ (n /~) * d]
soit environ lOmm. La chambre de réaction (Cre) est entourée d'un étui (19)
~o également cylindrique surmoulé en matière plastique. L'étui a une paroi
d'épaisseur environ lmm. En sorte que le diamètre (Dc) de la cartouche
d'épreuve (Car) est de 12 mm environ. Sa longueur (L) recommandée est de
18 mm environ. Cet étui ( 19) sert à sa protection, son maintien et facilite
sa
manipulation. La chambre de réaction (Cre) est située à la base de l'étui (19)
15 lui même d'une longueur (L) plus longue que celle (1) de la chambre (Cre).
En sorte qu'un réservoir sas (21) est ménagé à l'intérieur de l'étui (19) en
aval de la chambre de réaction (Cre). L'étui (19) est appliqué à force sur la
face latérale (slat) de la chambre (Cre) et il est équipé d'un élément
d'étanchéité latérale, en l'occurrence une languette annulaire d'étanchéité
20 (20) surmoulée au droit de la face amont (22) de la base de la cartouche
d'épreuve (Car). Ceci assure une étanchéité latérale permettant l'application
d'une différence de pression (0P) entre la face extrême amont (22) et aval
(26) de la chambre de la cartouche d'épreuve (Car) afin de forcer
l'écoulement du fluide-échantillon (F) au travers et de prémunir la cartouche
2s (Car) contre les fuites latérales et les pollutions externes. Un trou (25)
de
prise d'air est ménagé sur la face extrême aval (26) de la cartouche (Car). La
cartouche d'épreuve est mono-usage. On peut soit la jeter après usage, soit
l'archiver à des fins de contrôle.
Les figures 6a et 6b représentent en perspective et en coupe un deuxième
3o mode préféré de réalisation selon l'invention d'une cartouche d'épreuve
(Car)
conique mobile consommable pour senseur (Sen). Celle-ci est semblable à la
cartouche d'épreuve cylindrique (Car) décrite figure Sa et Sb. Sa chambre de
réaction (Cre) a aussi la forme d'un quasi cylindre (Cyre). La différence
réside en ce que l'étui (19), surmoulé sur la chambre de réaction (Cre) a une
35 forme conique. La mise en oeuvre de cette cartouche d'épreuve (Car) de
forme faiblement tronconique, d'angle au sommet (tc) est schématisée figure
6b. On donne à la culasse de mesure (Cme) une forme faiblement
tronconique, d'angle au sommet (tc). On donne à l'évidement intérieur de
mesure cylindrique (Eme) également une forme faiblement tronconique,
~o d'angle au sommet (tc). On positionne la cartouche d'épreuve (Car)
tronconique à l'intérieur de l'évidement intérieur de mesure (Eme)
tronconique de la culasse de mesure (Cme). Cela permet d'assurer un
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contact intime et une réduction de la distance entre le système transducteur
latéral de mesure intégrale (T) et la chambre de réaction (Cre). Cela permet
également une éventuelle mise en pression des canaux micro-tubulaires sans
fuite entre la cartouche (Car) et la culasse de mesure (Cme).
s Les figures 22, 22a et 22b décrivent un mode préféré par l'invention de
fabrication du réseau mufti-tubulaire qui constitue la chambre de réaction
(Cre) d'une cartouche (Car). Préalablement, on rapproche et dispose
sensiblement parallèlement une multitude de tubes en verre (C1, C2, ..., Ck,
...,
Cn) que l'on introduit dans un four de traitement (61) de façon à les
ramollir.
1o Leur vitesse à la sortie du four (62) dite d'étirement (Ve) étant
supérieure à
celle d'alimentation (Va), on les étire et on constitue ainsi un faisceau en
gerbe continue (65) monolithique de canaux micro-tubulaires (cl, c2, ..., ck,
...,
cn). On sectionne alors périodiquement ce faisceau pour constituer une
pluralité de chambres de réaction (Cre) monolithiques en gerbe ( 18) multi
1 s micro-tubulaire.
Puis, on conditionne chimiquement chaque chambre de réaction
monolithique (Cre) suivant les règles de l'art selon le type d'analyse que
l'on
compte effectuer ensuite. Par exemple, pour une analyse de type sandwich,
on dépose et fixe de manière homogène sur la surface intérieure de la
2o pluralité de canaux micro-tubulaires (c,, c2, ..., ck, ..., c"), une
multitude
d'éléments-récepteurs (rlm) du composant récepteur (R1) (par exemple un
anticorps ou un acide nucléique) qui a une affinité pour le composant analyte
(A). L'utilisation des chambres de réaction (Cre) ainsi préparées est décrite
ci avant. L'ensemble de ces étapes sont décrites schématiquement en figures
25 23a à 23c. Pour une senseur à analyse par déplacement, on dépose et on fixe
de manière homogène sur les surfaces intérieures élémentaires (sepk) de la
pluralité de canaux micro-tubulaires (cl, c2, ..., ck, ..., cn) une multitude
d'élément-analogues (bm) d'un composant analogue (B) du composant
analyte (A). Puis on mufti-canalise et fixe une multitude d'éléments-
3o récepteurs (r~) d'un composant récepteur (R) par affinité pour le composant
analogue (B). Le composant récepteur (R) a également une affinité pour
détecter et fixer le composant analyte (A). Le principe de l'utilisation des
chambres de réactions (Cre) ainsi préparées est bien connu de l'homme de
l'art. Lors de la mufti-canalisation du composant analyte (A), les éléments-
3s analytes rentrent en compétition de liaison avec les éléments-analogues
(bm)
et déplacent une partie des éléments-récepteurs (r~) immobilisés sur les
surfaces intérieures (sepk) de la chambre de réaction (Cre). On suit grâce au
transducteur la diminution de la quantité d'éléments-récepteurs (r~) à
l'intérieur du volume d'épreuve (Vep). L'ensemble de ces étapes sont
4o décrites schématiquement en figures 24a et 24b. Pour un senseur à analyse
par remplacement, on dépose et on fixe de manière homogène sur les
surfaces intérieures élémentaires (sepk) de la pluralité de canaux micro-
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tubulaires (cl, c2, ..., cle, ..., c") une multitude d'éléments-récepteurs
(r~) d'un
composant récepteur (R) qui a une affinité pour le composant analyte (A).
Puis on mufti-canalise et fixe un excès d'une multitude d'élément-analogues
(bm) du composant analogue (B) qui a également une affinité pour le
s récepteur (R). Les éléments-révélateurs (um) d'un composant révélateur (U)
sont complexés avec lesdits élement-analogues (bm). Le principe de
l'utilisation des chambres de réactions (Cre) ainsi préparées est bien connu
de l'homme de l'art. Lors de la mufti-canalisation du fluide-échantillon (F),
les éléments-analytes (a;) rentrent en compétition de liaison avec les
~o éléments-analogues (bm), prennent la place d'une partie des éléments
analogues (bm) et leurs éléments-révélateurs (um) conjugués, et sont
immobilisés sur les surfaces intërieures (seple) de la chambre de réaction
(Cre). On suit grâce au transducteur la diminution de la quantité d'éléments
révélateurs (um) à l'intérieur du volume d'épreuve (Vep). L'ensemble de ces
~s étapes sont décrites schématiquement en figures 25a et 25b.
On a représenté figures 7a et 7b un autre mode préféré par l'invention, de
réalisation d'une chambre lamellaire mono-périodique, selon lequel on
mufti-canalise en parallèle la fraction du fluide-échantillon (F) chargé
d'éléments-analytes (a;), à travers une chambre de réaction monolithique
2o mufti-tubulaire lamellaire mono-périodique (Crel). Celle-ci est constituée
par
la.réunion d'une pluralité de n (n - environ 1 000) canaux micro-tubulaires
(cl, c2, ..., cle, ..., c") à section lamellaire (selle). Leur section à
courbe de
forme (fle) est sensiblement rectangulaire, et deux dimensions transversales
perpendiculaires (dx, dy) sont d'au moins un ordre de grandeur différent (dx
2s « dy). Typiquemènt une dimension transversale sélective (dx) est de l'ordre
de 10 microns, et l'autre dimension transversale latérale (dy) est de l'ordre
de lOmm. Les canaux micro-tubulaires (cl, c2, ..., cle, ..., c") à section
lamellaire sont disposés en couches parallèles, adjacents et jointivement
selon une direction commune planaire (yOz) d'orientation de leurs lignes
so centrales élémentaires (lle). L'ensemble constitue un réseau périodique
(Rx)
monodimensionnel perpendiculairement à ladite direction commune planaire
(yOz) d'orientation. La figure 7b représente une variante de fabrication de la
chambre de réaction lamellaire dont en outre la structure est renforcée par
des piliers transversaux (Pif).
35 Les figures 19a à 19d décrivent quatre schémas possibles de mise en oeuvre
du procédé de l'invention sous une forme mufti-localisée, selon laquelle les
lieu de prélèvement (L 1 ), lieu de révélation (L2) et lieu de mesure (L3)
peuvent être distincts ou non. En figure 19a, les trois lieux susdits sont
distincts. Dans le premier lieu de prélèvement (L 1 ), le fluide-échantillon
(F)
4o est prélevé par mufti-canalisation au travers de la cartouche d'épreuve
(Car).
Ladite cartouche d'épreuve (Car) est alors transportée dans le deuxième lieu
de révélation (L2) où l'on met en contact le fluide-échantillon (F) à
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l'intérieur du volume d'épreuve global (Vep) de la chambre de réaction (Cre)
avec un composant actif (chimique et/ou biologique) appelé récepteur (R) [et
éventuellement avec un autre composant actif appelé révélateur (U)]. Puis la
cartouche d'épreuve (Car) est transportée dans un troisième lieu de mesure
s (L3). Dans le lieu de mesure (L3), on positionne le système transducteur
latéral de mesure intégrale (T) de la variable d'état extensive (E). En figure
19b, le premier lieu de prélèvement (L 1 ) et le deuxième lieu de révélation
(L2) sont rassemblés en un lieu commun de prélèvement / révélation (L1/L2).
Dans ce schéma, la cartouche d'épreuve (Car) reste dans le même dispositif
~ o pour les phases de, prélèvement et de révélation. Elle est ensuite
transportée
dans un troisième lieu de mesure (L3) séparé. En figure 19c, ce sont le
deuxième lieu de révélation (L2) et le troisième lieu de mesure (L3) qui sont
rassemblés en un lieu commun de révélation / mesure (L2/L3). En figure 19d,
le premier lieu de prélèvement (L 1 ), le deuxième lieu de révélation (L2) et
le
1s troisième lieu de mesure (L3) sont rassemblés en un lieu commun de
prélèvement / révélation / mesure (L1/L2/L3). Dans ce schéma, une fois
insérée dans le dispositif commun, la cartouche d'épreuve (Car) n'est pas
déplacée jusqu'à la fin du procédé d'analyse.
Il est recommandé par l'invention de revêtir la chambre de réaction multi
2o micro-tubulaire cylindrique (Cre), et plus aisément la cartouche d'épreuve
(Car) d'un identifiant (Id) préalablement au déplacement pour en assurer la
traçabilité. Une variante préférée de cet identifiant est l'étiquette à code à
barres (83) apparaissant figures Sa et 6a.
Les figures 9a à 9e décrivent schématiquement un senseur mufti-localisé (en
2s deux parties) du type de fonctionnement décrit en figure 19c. Dans un
premier lieu de prélèvement (L1), un dispositif mobile de prélèvement (100)
sert au prélèvement du fluide-échantillon (F) dans une cartouche d'épreuve
(Car) mobile. Dans l'exemple décrit, le dispositif mobile de prélèvement
(100) est un pistolet de prélèvement (34) représenté figure 9a. Le pistolet de
so prélèvement (34) comprend une culasse de prélèvement (102) ménageant un
évidement intérieur de prélèvement ( 103 ) de forme de révolution
(cylindrique ou tronconique). Une feuillure (107) disposée en amont de la
culasse de prélèvement (102) constitue à la fois un moyen de maintien (105)
et un moyen d'étanchéité (106) de la cartouche mobile (Car). La culasse de
35 prélèvement comprend après introduction de la cartouche d'épreuve (Car)
deux ouvertures : une ouverture amont ( 111 ) de prélèvement du fluide-
échantillon (F) et une ouverture aval (112). Enfin une pompe (115) de
mouvement du fluide-échantillon (F) est branchée sur l'une ou l'autre des
ouvertures amont de prélèvement ( 111 ) ou aval ( 112). Le pistolet de
4o prélèvement (34) utilise des cartouches-aiguille (38) décrites en figure
9c.
Une aiguille de prélèvement (39), munie d'une coiffe (40) est emboîtée de
manière étanche et amovible sur l'étui protecteur (19) en regard de la face
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amont (22) d'une cartouche (Car). Elle est située du coté de la face frontale
amont (sfam) perméable de la chambre de réaction (Cre). On introduit la
cartouche-aiguille (38) dans la culasse (102) du pistolet de prélèvement (34).
Pour prélever une portion de fluide-échantillon (F) on presse sur la détente
s du pistolet. La cartouche-aiguille (39) est déplacée vers l'extérieur du
canon
du pistolet, en sorte que l'aiguille (39) soit apparente. Le fluide-
échantillon
(F) est aspiré au travers de l'aiguille (39) et est mufti-canalisé en
parallèle au
travers de lâ chambre de réaction (Cre) de la cartouche-aiguille (3 $).
L'aiguille est ensuite désolidarisée de sa cartouche (Car) et recueillie dans
un
io logement pour aiguilles usagées. Dans une variante représentée en figure 1
l,
l'étui protecteur (19) d'une cartouche d'épreuve (Car) peut étre prolongé en
amont de sa face extrême amont (22) en un cône ~de prélèvement (80) muni
d'un évidement de prélèvement (81) en son extrémité (82). Dans une autre
variante on peut utiliser une cartouche d'épreuve (Car) standard.
15 Puis on sort la cartouche (Car) du pistolet de prélèvement (34). Dans un
dispositif indépendant de révélation et de mesure ( 160) décrit figures 9e et
10,
on introduit par un premier logement (196) la cartouche d'épreuve (Car)
mobile, incluant la chambre de réaction (Cre) en gerbe mufti-micro-tubulaire,
à l'intérieur de l'évidement intérieur de mesure cylindrique (Eme) de la
2o culasse de mesure (Cme). Comme cela apparaît plus en détail figure 10, un
épaulement (108) de la culasse (Cme) coopère avec la languette annulaire
(20). Il sert de moyen de maintien (155) de la cartouche mobile (Car) et de
moyen d'étanchéité (156) de la culasse (Cme) après introduction de la
cartouche mobile (Car) vis-à-vis de la paroi (154) de l'évidement intérieur de
25 mesure (Eme). La culasse (Cme) présente une ouverture amont (161)
d'introduction des fluides (55) et une ouverture aval (162). Une pompe (165)
de mouvement des fluides échantillon et/ou réactifs est branchée sur
l' ouverture amont de prélèvement ( 161 ). On introduit ensuite dans un second
logement (194) situé à l'intérieur du dispositif indépendant de révélation et
so de mesure (160) une barrette à puits (50) [telle que représentée figure
12a]
contenant les fluides (55) [réactifs et solutions de lavage] nécessaires à une
analyse selon les règles de l'art. Typiquement cette barrette en plastique
rigide comprend quatre puits indépendants (S 1, 52, 53, 54) fermés par un
opercule (49) constitué d'une feuille de matière plastique. Le premier puits
s5 (51) contient une solution de lavage constituée d'un tampon à pH 7Ø Le
deuxième puits (52) contient les éléments-récepteurs (r~), [ici une suspension
d'anticorps secondaires (as~), spécifiques de l'analyte recherché, par exemple
Cryptosporidium]. Ces anticorps sont greffés de microbilles super-
paramagnétiques (sp~). Le troisième puits (53) contient une solution de
40 lavage constituée d'un tampon à pH 7Ø Le quatrième puits (54) est vide.
Il
sert de poubelle pour les réactifs utilisés. Cette barrette (50) est jetée
après
l'analyse. Les solutions de lavage et les réactifs sont successivement multi-
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canalisés en parallèle au travers de la chambre de réaction (Cre) de la
cartouche d'épreuve (Car) à l'aide d'une pompe (165). Ceci s'effectue selon
un programme de processus enregistré numériquement sur une mémoire
EPROM préalablement programmée en fonction de la nature des éléments-
s analytes recherchés. A la fin de l'exécution de ce programme, les éléments-
analytes (a;), ici Cryptospo~idium, immobilisés sur la surface d'épreuve (Sep)
sont marqués par les éléments-récepteurs (r~).
On effectue alors grâce au système transducteur latéral de mesure intégrale
(T) une mesure intégrale des variations de ladite variable d'état extensive
(E),
1 o au travers à la fois de la surface latérale extérieure (Secm) sensiblement
cylindrique du pourtour de la culasse de mesure (Cme), de la paroi latérale
(Cpl) de la cartouche d'épreuve (Car), et de la face latérale imperméable
(slat)
de la chambre de réaction (Cre).
La traçabilité des cartouches d'épreuve (Car) entre le lieu de prélèvement
15 (L1), ici le pistolet de prélèvement (34), et le lieu de révélation /
mesure
(L2/L3), ici le dispositif indépendant de révélation et de mesure (160), est
assurée par une étiquette d'identification (83) de la cartouche épreuve (Car)
à
code à barres du type décrit figure Sa. Le pistolet de prélèvement (34) est
équipé d'un clavier (33) permettant la saisie des données spécifiques du
2o fluide-échantillon (F) prélevé et d'un système d'émission de type Wifi vers
une base de données centralisée. Le dispositif indépendant de révélation et de
mesure (160) est lui-même relié à cette base de données, en reçoit et y envoie
les données relatives à l'analyse repérée par le code à barres de l'étiquette
d'identification (83) de la cartouche d'épreuve (Car). Le dispositif
2s indépendant de révélation et de mesure (160) peut être équipé d'une
imprimante (193) et d'un clavier (190) ou peut être directement relié à un
ordinateur par un port Entrée / Sortie ( 191 ).
La figure 8 décrit schématiquement le procédé de fonctionnement selon
l'invention d'un senseur mufti-localisé (en deux parties) du type décrit en
so figure 19b. Le premier lieu de prélèvement (Ll) et le deuxième lieu de
révélation (L2) sont confondus en un lieu commun de prélèvement /
révélation (L 1 /L2). Dans cette variante un dispositif mobile de prélèvement
et de révélation ( 121 ) par cartouche mobile d'épreuve (Car) est adapté du
pistolet de prélèvement (34) par ajout d'au moins un réservoir (122) de
s5 réactif chimique et/ou biologique. Le réservoir (122), ici une barrette de
réactifs et solutions de lavage adaptée de la barrette à puits (50) décrite en
figure 12a, est relié à la cartouche d'épreuve (Car) par l'ouverture amont de
prélèvement (111) de la culasse de prélèvement (102) par l'intermédiaire
d'une pompe de mouvement des fluides (115). La cartouche mobile
4o d'épreuve (Car) est alors transférée dans le lieu de mesure (L3) dans un
dispositif indépendant de mesure ( 151 ) schématisé figure 8. La cartouche
(Car) est introduite dans l'évidement intérieur de mesure cylindrique (Eme)
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de la culasse de mesure (Cme) d'épaisseur (epcm). La culasse de mesure
(Cme) a un diamètre (Dm) sensiblement égal mais strictement supérieur au
diamètre cartouche (Dc). Comme décrit précédemment pour le dispositif de
révélation et de mesure ( 160), on effectue grâce au système transducteur
s latéral de mesure intégrale (T) une mesure intégrale des variations de
ladite
variable d'état extensive (E), au travers à la fois de la surface latérale
extérieure (Secm) sensiblement cylindrique du pourtour de la culasse de
mesure (Cme), de la paroi latérale (Cpl) de la cartouche d'épreuve (Car), et
de la face latérale imperméable (slat) de la chambre de réaction (Cre).
~o La mise en oeuvre du procédé de fonctionnement, décrit en figure 19a, d'un
senseur selon l'invention multi-localisé (en trois parties) s'inspire très
largement des deux exemples décrits ci-dessus. Dans un premier lieu de
prélèvement (L 1 ), on utilise un dispositif mobile de prélèvement ( 100),
préférentiellement le pistolet de prélèvement (34). Dans un troisième lieu de
~5 mesure (L3), on utilise le dispositif indépendant de mesure (151) décrit
figure 8. Dans le deuxième lieu de révélation (L2), on utilise un dispositif
indépendant de révélation après prélèvement (131). Après prélèvement, on
introduit la cartouche mobile d'épreuve (Car) de forme de révolution
(cylindrique ou tronconique), dans l'évidement intérieur de révélation d'une
2o culasse de révélation de forme de révolution (cylindrique ou tronconique)
complémentaire de celle de la cartouche d'épreuve. Le maintien de la
cartouche mobile dans la culasse de révélation, l'étanchéité de la culasse de
révélation après introduction de la cartouche mobile (Car) à l'intérieur de
l'évidement intérieur de révélation, le mouvement des fluides échantillon et
25 réactifs sont assurés comme pour le dispositif indépendant de révélation et
de
mesure (160) décrit figure 10.
Une variante du mode de mise en oeuvre préféré du procédé de l' invention,
sous forme d'un senseur multi-localisé adapté pour le traitement automatisé
d'un grand nombre d'échantillons est représenté figure 15, 15a et 15b, 16a et
so 16b. Il comprend également deux parties. Un dispositif de prélèvement, qui
peut être le pistolet de prélèvement (34) décrit auparavant, sert au
prélèvement du fluide-échantillon (F) dans une cartouche d'épreuve (Car).
Un dispositif séquentiel robotisé d'analyse (171) après prélèvement par
cartouche mobile d'épreuve (Car) est à base d'un carrousel (182). Il
3s comprend un support-cartouchière (172) rigide, comprenant dans l'exemple
précis 20 culasses (173x, 173b, 173, 1734, ...), positionnées sur le pourtour
du carrousel (182), séparées d'un angle au sommet égal (oc), ici égal à
18°,
qui constitue le pas constant (p) d'écartement des culasses. Chaque culasse
possède un moyen d'étanchéité (156) actif après introduction de la cartouche
4o mobile (Car) à l' intérieur. Elle comporte deux ouvertures, une ouverture
amont ( 161 ) d' alimentation, et ~ une ouverture aval ( 162). Une pompe ( 165
)
de mouvement des fluides échantillon et/ou réactifs est branchée sur
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l'ouverture amont (161). Un moyen de déplacement périodique du carrousel
(182), ici un moteur électrique, déplace la multitude de culasses (173x, 173b,
173, 1734, ...) d'un écartement (p') égal audit pas constant (p) face à une
même multitude de points d' arrêt ( 181 a, 181 b, 181 ~, . . . ) par rotation
périodique du carrousel (182) d'un angle (a). Vingt cartouches mobiles
d'épreuve (Cars, Carb, Car, Card, ...) incluant chacune une chambre de
réaction (Crea, Creb, Cre~, Cred , ...) en gerbe multi-micro-tubulaire
monolithique, sont insérées à l'intérieur de la multitude de culasses (173x,
173b, 173, 1734, ...). Le carrousel (182) est équipé d'un dispositif
1o d'injection de liquide (201x, 201b, 201, ...) situé en regard du (des)
points)
d'arrêt (181x, 181b, 181, ...). Ce dispositif est équipé de plusieurs
réservoirs
indépendants (195x, 195b, 195, ...) des solutions de lavage et des
suspensions de réactifs utilisables pour plusieurs types d'analytes, par
exemple Salmonella, Legionella, Cryptosporidium. Les protocoles et le
~ s choix des réactifs à mufti-canaliser (qui peuvent être pré-programmés dans
le
microprocesseur de l'appareil) sont effectués en fonction des indications
fournies grâce à l'étiquette d'identification (83) à code à barres de la
cartouche d'épreuve (Car). Le dispositif comprend au moins un récepteur de
mesure physique (Rmpl, Rmp2, Rmp3, ..., Rmpp, ...) [tel notamment un
2o récepteur de champ magnétique (13)], positionné en un point d'arrêt (181x,
181 b, 181 ~, . . . ), périodiquement mobile perpendiculairement au mouvement
du support-cartouchière (172), et venant périodiquement enchâsser la
cartouche d' épreuve située face à lui, au point d' arrêt ( 181 a, 181 b, 181
~, . . . ),
en entourant intimement sa surface extérieure. Dans l'exemple le récepteur
25 de mesure physique (Rmpl, Rmp2, Rmp3, ..., RmpP, ...) est la partie active
d'un transducteur latéral de mesure intégrale (T,, T2, T3, ..., Tp, ...).
Un autre mode de fonctionnement pour l'évaluation mufti-localisée de la
concentration d'éléments-analytes (a;) d'un analyte (A) est décrit en figures
13a à 13d. On fait plonger successivement la cartouche d'épreuve (Car)
so mobile, à l'intérieur d'une succession de puits (51, 52, 53, 54) contenant
différents fluides (55) tels que fluide-échantillon (F) et/ou réactifs et
solutions de lavage. Après chaque introduction dans un puits (51, 52, 53, 54),
on aspire et on mufti-canalise au travers de la chambre de réaction (Cre) en
gerbe mufti-micro-tubulaire de la cartouche (Car), une fraction du fluide (55)
35 du puits (51, 52, 53, 54). En outre, après chaque aspiration du fluide (55)
d'un puits (51, 52, 53, 54), au travers de la chambre de réaction (Cre), on
refoule ce fluide (55) des différents canaux micro-tubulaires (ck) vers le
même puits (51, 52, 53, 54). Un dispositif indépendant de révélation / mesure
robotisé linéaire (200) fondé sur ce mode de fonctionnement est décrit en
4o figure 14~. On introduit les cartouches d'épreuve (Cars, Carb, Car, ...) â
l'intérieur de ce dispositif (200) qui peut en accueillir plusieurs pour
traitement simultané, typiquement 16. On introduit également à l'intérieur du
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dispositif des barrettes mufti-puits (50) du type décrit précédemment, en
quantité identique aux cartouches d'épreuve (Cars, Carb, Car, ...),
typiquement 16. Un moteur assure un mouvement latéral du support des
cartouches d'épreuve (Cars, Carb, Car, ...) pour les déplacer d'un puits à
s l'autre. Il assure également le mouvement vertical des cartouches d'épreuve
(Cars, Carb, Car, ...) pour aspirer et refouler les fluides (55). On peut
analyser plusieurs fluides-échantillon simultanément mais en recherchant le
même analyte (A) dans toutes les cartouches d'épreuve (Cars, Carb, Car, ...).
Les cartouches d'épreuve et les barrettes doivent donc toutes être du même
~ o type, par exemple pour la recherche de Cryptosporidium. Dans le cas
décrit,
à la fin du processus de révélation, les cartouches d'épreuve (Cars, Carb,
Car, ...) sont introduites grâce au moteur dans les culasses de mesure de
transducteurs latéraux de mesure intégrale (T~, T2, T3, ..., Tp, ...) tels que
décrit plus haut.
1s Une autre variante du mode de mise en oeuvre préféré pour l'évaluation
mufti-localisée de la concentration d'éléments-analytes (a;) d'un analyte (A)
porte sur le dispositif mobile de prélèvement de la fraction de fluide-
échantillon (F). Le pistolet de prélèvement (34) est remplacé par une
seringue de prélèvement (210). Cette seringue mono-usage est équipée d'une
2o cartouche d'épreuve (Car) au travers de laquelle le fluide-échantillon est
mufti-canalisé par aspiration lorsqu'on actionne son piston (202). La
seringue peut être équipée pour le prélèvement du fluide-échantillon (F), soit
d'une aiguille (39) en figure 18a, soit d'un cône de prélèvement (80) en
figure 18b. La cartouche d'épreuve est ensuite retirée de la seringue pour
être
2s traitée selon le mode de mise en oeuvre préféré ou ses variantes présentées
ci-
dessus.
Un autre mode de mise en oeuvre préféré sous forme de bio-senseur
monobloc mufti-analyte est présenté figure 21. Dans l'exemple décrit ci-
dessous, il est utilisé pour rechercher simultanément des bactéries
so Cryptosporidium, l'analyte (Al), Escherichia coli, l'analyte (A2), et
Legionella, l'analyte (A3), dans un fluide-échantillon (F) [ici l'eau présente
dans des canalisations de distribution]. Il est constitué par un tuyau
réacteur
mufti-étagé (90). A l'intérieur de ce tuyau réacteur mufti-étagé (90), on
dispose, coaxialement en série et de manière étanche latéralement, trois
s5 chambres de réaction (Cre~, Cre2, Cre3) chacune constituée d'une gerbe (18)
d'une pluralité de canaux micro-tubulaires (cP~, Cp2, ..., Cpk, ..., cp")
cylindriques. On dispose strictement à l'extérieur du tuyau réacteur multi-
étagé (90) trois systèmes transducteurs latéraux de mesure intégrale (T1, T2,
T3) dont les enroulements de spires enchâssent la chambre de réaction (Cre,,
4o Cre2, Cre3) correspondante, en regard de la face latérale imperméable
(slatl,
slat2, slat3) correspondante. Dans l'exemple précis les surfaces d'épreuve des
chambres de réaction ont été préalablement recouvertes, la chambre de
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réaction (Cre~) d'un anticorps spécifique de la bactérie Cryptosporidium, la
chambre de réaction (Cre2) d'un anticorps spécifique de la bactérie
Escherichia coli, et la chambre de réaction (Cre3) d'un anticorps spécifique
de la bactérie Legionella. On mufti-canalise à l' intérieur du tube réacteur
s mufti-étagé une fraction du fluide-échantillon (F). Les éléments-analytes
(ap;),
ici les bactéries Cryptosporidium, Escherichia coli, ou Legionella, se fixent,
s'il y en a, spécifiquement sur la surface d'épreuve : Cryptosporidium de la
chambre de réaction (Crel), Escherichia coli de la chambre de réaction
(Cre2), Legionella de la chambre de réaction (Cre3). On alimente ensuite le
~o tuyau réacteur mufti-étagé (90) grâce à une pompe (223) par l'intermédiaire
d'un robinet trois-voies (221) d'un mélange (R~, R2, R3) d'anticorps greffés
de microbilles super-paramagnétiques (sp~) spécifiques, (R1) de
Cryptosporidium, (R2) d'Escherichia coli, (R3) de Legionella contenus dans
un réservoir mufti-réactifs (222). Les anticorps greffés se fixent
j5 spécifiquement, (Rl) dans la chambre de réaction (Crel), (R2) dans la
chambre de réaction (Crez), et (R3) dans la chambre de réaction (Cre3). Enfin
on lave le tuyau réacteur mufti-étagé (90) en refaisant passer de l'eau (F) au
travers par le robinet trois-voies (221 ). La perturbation mesurée dans chaque
chambre de réaction (Crel, Cre2, Cre~) par chaque système transducteur
20 latéral de mesure intégrale (T1, Tz, T3) est reliée à la concentration de
bactéries Cryptosporidium pour (T1), de bâctéries Escherichia coli pour (T2),
de bactéries Legionella pour (T3), présentes dans le fluide-échantillon (F).
Une variante de la cartouche d'épreuve (Car) peut être utilisée. C'est une
cartouche d'épreuve mufti-chambre (Carm) qui est illustrée figures 17a et
25 17b en perspective et en coupe. Elle comprend au moins deux chambres de
réaction (Crel, Cre2, ...) en gerbe mufti-micro-tubulaire, de section
identique,
positionnée dans l'axe (zz'). Ces chambres de réaction sont recouvertes par
un étui protecteur (19) unique. Les cartouches d'épreuve mufti-chambre
(Carm) sont utilisées pour la détection simultanée d'au moins deux analytes
so différents (A,, A2, . . . ) présents dans le fluide-échantillon (F). Chaque
chambre de réaction (Cre~, Cre2, ...) est spécifique d'un analyte. Le mode
d'utilisation des cartouches d'épreuves mufti-chambre (Carm) s'inspire
largement de celui du tuyau réacteur mufti-étagé (90). Une autre variante est
la mufti-cartouche d'épreuve mufti-chambre (MCarm) formée d'une pluralité
35 de cartouches d'épreuve (Cars, Car2, Cari, ...) conformes à la description
générale, disposées bout à bout en série selon un même axe (zz') et
emboîtées les unes dans les autres deux à deux selon la figure 17c. Les
dispositifs de révélation et/ou de mesure doivent être adaptés pour ce type de
cartouches mufti-chambre en respectant l'esprit de l'invention telle que
4o décrite ci-dessus.
Bien que l'invention soit ici décrite et illustrée en détail pour certains
exemples d'application afin d'en faciliter la compréhension, il est clair pour
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une personne de l'art que certaines modifications peuvent être apportées à
ces exemples sans sortir ni de l'esprit ni du périmètre des revendications de
l' invention.
Buts et avantages de l'invention
s Le but principal de la combinaison de chambres de réaction monolithiques
en gerbe multi-micro-tubulaire avec une transduction latérale intégrale est de
concentrer un grand nombre d'événements de reconnaissance dans un
volume d' épreuve très compact, et ainsi de pouvoir acquérir de l' extérieur
du
volume d'épreuve un signal homogène et suffisamment fort.
~o De façon plus détaillée les avantages sont les suivants
1) Augmenter le ratio « surfacique» [entre la surface d'épreuve de la
chambre de réaction et sa section moyenne d'épreuve] et par là même
accroître la densité volumique d'événements de reconnaissance
d'éléments-analytes par des éléments-récepteurs au sein du volume
15 d'épreuve ;
2) Augmenter le ratio « de sensibilité » [entre la surface d'épreuve de la
chambre de réaction et son volume d'épreuve] et par là même
l'efficacité du transducteur et la sensibilité du senseur ;
3) Diminuer le seuil de sensibilité d'un senseur, donc éviter la phase
2o préalable d'enrichissement de l'échantillon ou l'amplification
enzymatique des événements de reconnaissance, et donc procurer des
senseurs vraiment rapides ;
4) Focaliser les éléments-analytes ou les composants actifs à proximité de
la surface d'épreuve, et donc accélérer leur cinétique de liaison, facteur
2s limitant traditionnel en reconnaissance immunologique ou en
hybridation d'acides nucléiques. En effet les éléments-récepteurs et
éléments-analytes ont une très forte affinité avec une constante
thermodynamique K de l'ordre de 103°. Mais leur liaison, du type « clé-
serrure », nécessite un alignement parfait, à faible distance, des sites
3o spécifiques de reconnaissance. Pour réduire, en moyenne sur toute la
population d'éléments, l'énergie d'activation de la liaison, et la rendre
possible dans les conditions normales de température et de solvant, il
faut augmenter la probabilité de cet alignement à faible distance. La
géométrie micro-tubulaire minimise justement la distance moyenne
35 d'épreuve des portions élémentaires du flux à la surface d'épreuve, et
d'autre part, permet de réduire la vitesse moyenne d'épreuve des
portions élémentaires du flux pour augmenter leur temps de séjour à
proximité de la surface d'épreuve ;
5) Diminuer la dispersion de comportement des portions de fluides
40 (échantillon, réactifs) dans tous les canaux en les soumettant à des
conditions identiques ou « quasi identiques » grâce à la régularité de la
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structure de la chambre de réaction, pour diminuer la dispersion de la
cinétique de reconnaissance, et donc augmenter le rapport « signal /
bruit » du senseur ;
6) Réduire le couplage non spécifique des éléments-analytes ou des
s éléments-récepteurs, et donc réduire le bruit du senseur. Le couplage non
spécifique d'éléments-récepteurs se fait soit avec des bactéries proches
de celles recherchées avec lesquelles les élements-récepteurs peuvent
avoir une affinité limitée mais non nulle, soit avec le support solide
même. Ce couplage non spécifique est plus particulièrement important
~o dans des structures irrégulières, à base de fibres ou de perles
agglomérées. Ces structures ménagent en effet des zones où le
ralentissement du flux et l'encombrement stérique d'une part permettent
plus facilement la fixation non spécifique et d'autre part, rendent moins
efficace les lavages ;
15 7) Diminuer la taille du volume d'épreuve et par là même les dimensions
de la chambre de réaction d'un senseur, à sensibilité égale ;
8) Diminuer la quantité de fluide-échantillon et de réactifs consommés par
un senseur, à sensibilité égale, et par là même faciliter la mise en oeuvre
et réduire les coûts de consommables ;
20 9) Diminuer la perte de charge au travers du volume d'épreuve et donc
limiter la pression nécessaire pour assurer les déplacements de fluides ;
10) Séparer géométriquement les zones de « reconnaissance l révélation » et
de celles transduction d'un senseur, pour rationaliser la mise en oeuvre
industrielle ;
2s 11) Réaliser la chambre de réaction d'un senseur sous la forme d'une
cartouche industrialisable à grande échelle, peu onéreuse et
consommable ;
12) Simplifier la manipulation des fluide-échantillon et réactifs et éviter la
manipulation et la mise en oeuvre par l'utilisateur des composants actifs ;
ao 13) Rationaliser la mise en oeuvre d'un senseur, en limitant le nombre de
manipulations ;
14) Abaisser le coût, la durée et la mobilisation en compétence d'une mesure
par senseur ;
15) Permettre à toute personne même non spécialiste de mettre en oeuvre un
s5 senseur pour obtenir rapidement et sans formation particulière le résultat
d'analyse d'un échantillon ;
16) Permettre effectivement la mise en oeuvre au sein d'un senseur de
révélateurs propres et écologiques (non radioactifs, ...) telles que des
microbilles super-paramagnétiques, tout en assurant une grande
4o sensibilité de mesure.
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Applications industrielles potentielles de l'invention
Les procédés et dispositifs de bio-senseurs de cette invention sont utiles
pour
détecter des analytes pour de nombreuses industries, incluant, mais non
exclusivement, la santé, l'agroalimentaire, la chimie, l'environnement. Les
s types d' échantillons peuvent inclure des fluides variés comme du sang, du
plasma, de l'urine, de la salive, du lait, du vin, de la bière, des produits
chimiques, des effluents liquides, de l'eau de cours d'eau ou prélevée dans
des circuits de distribution, publics ou privés. Dans certains cas de figure
l'échantillon peut être préparé avant analyse. S'il est initialement complexe,
1o solide, très visqueux ou gazeux, on peut d'abord l'extraire, le dissoudre,
le
diluer, afin de lui donner les caractéristiques physiques compatibles avec sa
multi-canalisation dans la chambre de réaction, et les caractéristiques
chimiques compatibles avec la stabilité de la surface d'épreuve et des
complexes de reconnaissance (par exemple un pH compris entre 5 et 9). Une
15 grande variété d'analytes peuvent être détectés en utilisant les procédés
et
dispositifs de l'invention. Il s'agit de tous les analytes susceptibles d'être
reconnus et de constituer une paire avec un récepteur spécifique. L'analyte
peut être un antigène, voir un anticorps, ou un haptène pour les plus petites
molécules comme certaines hormones. Il peut également être un acide
2o nucléique (ADN ou ARN) ou un oligonucléotide, susceptible de s'hybrider
avec le nucléotide complémentaire. Il peut également être une enzyme
spécifique de certains substrats. Quelques exemples : des antibiotiques ; des
additifs alimentaires ; des micro-organismes comme des levures, des algues
unicellulaires, des bactéries, des virus, des prions, des rickettsiae ; des
2s toxines, colorants, des marqueurs pathogènes présents dans les fluides
biologiques, des anticorps, des principes actifs de médicaments, des
cytokines, des protéines de surface de membranes cellulaires, etc.
