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WO 2005/033262 PCT/FR2004/002476
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Procëdé et dispositif de culture de cellules vivantes par couplae~e d'un
récipient
bioréacteur avec un automate de sélection
La présente invention concerne un procédé et un dispositif de
culture de cellules vivantes par couplage d'un récipient bioréacteur avec un
automate de sélection.
Le traitement des déchets est une préoccupation de plus en plus
constante des citoyens et des gouvernements. Une partie importante des
traitements est effectuée dans des usines mettant en pauvre des cuves
inoculées par une flore bactérienne. Mais la flore bactérienne évolue dans le
temps et cette évolution est souvent défavorable aux réactions que l'on
souhaite voir intervenir dans les cuves.
Le problème de la dérive des cultures bactériennes est un
problème général que l'on trouve par exemple dans l'industrie pharmaceutique.
Dans cette industrie, on évite fa dérive en opérant de manière stérile.
Mais il est inconcevable économiquement de travailler dans de
telles conditions par exemple dans une usine de traitement des déchets.
Les dispositifs de culture tels que mis en pauvre dans l'industrie,
pour la production de métabolites d'intérêt commercial, ou la biodégradation
de
déchets ou d'eaux usées par exemple, sont confrontés au problème de ta
contamination par des espèces provenant du milieu extérieur. La conduite des
cultures sous conditions stériles qui impliquent le confinement total des
équipements est une solution au problème de la contamination par des espèces
extérieures, mais elle est difficile à envisager pour des raisons de coût de
traitement dans les applications teNes que fa biodégradation de déchets, ou
même impossible à mettre en oeuvre dans des utilisations extensives de
populations microbiennes telles que dans le lagunage par exemple.
Par ailleurs, WO 00/34433 décrit une technique qui permet la
sélection et la prolifëration accélérée de cellules vivantes en suspension. En
maintenant un régime de concentration de cellules constant (turbidostat) sur
des périodes illimitées, le dispositif décrit se comporte donc comme un
procédé
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de sélection automatisée qui en même temps élimine les variants statiques de
cellules vivantes, c'est-à-dire les cellules vivantes qui stagnent dans les
conduites et les récipients et privilégie les variants dynamiques restant en
suspension, qui sont de mieux en mieux adaptés aux conditions de culture.
L'industrialisation d'un tel dispositif en vue de traiter des volumes
de plusieurs m3, voire plusieurs dizaines ou centaines de m3 peut s'envisager
par simple homothëtie mais son fonctionnement en serait rendu coûteux pour
plusieurs raisons
- les moyens mis en oeuvre pour le transfert périodique d'une cuve à l'autre
ainsi que le transfert périodique des fluides de stérilisation et de rinçage
et
des additifs de culture consomment de l'énergie,
- une consommation importante de fluides de stérilisation et de rinçage,
- l'utilisation d'une seule cuve à la fois, l'autre restant en attente donc
étant
inutile au procédé. Elle doit cependant posséder tous les équipements
nécessaires au développement de la culture : régulation de température,
système de stérilisation, système d'agitation, etc.
- la difficulté de lire en continu la turbidité dans un récipient bioréacteur
de
grande taille avec des densités de culture importantes.
Pour ces raisons, la biodégradation des eaux usées met en oeuvre
à ce jour des populations bactériennes diverses dont la nature échappe au
contrôle de l'opérateur, et sans qu'il soit possible de n'utiliser que les
espèces
sélectionnées pour leur performance ou leur efficacité par rapport au
substrat,
c'est-à-dire aux composés à dégrader présents dans les eaux usées.
II serait donc souhaitable de disposer d'une technique notamment
de biodégradation des eaux usées permettant de mettre en ceuvre
essentiellement les espèces sélectionnées pour leur performance ou leur
efficacité par rapport aux composés à dégrader présents dans les eaux usées.
Or, après de longues recherches la demanderesse a découvert un
procédé permettant de reproduire et de contrôler les conditions de
prolifération
dans un récipient bioréacteur de grande dimension, ou dans un milieu naturel
tel qu'une lagune ou un plan d'eau par exemple, et fonctionnant de manière
continue, semi-continue ou discontinue, sans avoir recours au confinement et à
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la stérilisation, et en privilégiant les variants dynamiques de cellules
vivantes,
qui sont de mieux en mieux adaptées aux conditions de culture.
Ce procédé est essentiellement fondé sur la coopération entre un
récipient bioréacteur et un dispositif de sélection automatique de cellules
vivantes.
C'est pourquoi la prësente demande a pour objet un procédé de
traitement en continu, semi-continu ou discontinu d'un substrat, dans lequel
ledit substrat installé dans un récipient bioréacteur est soumis à l'action
d'une
culture de cellules vivantes C1 permettant d'effectuer une réaction R1 sur
ledit
substrat et dans lequel on inocule périodiquement et de préférence
régulièrement le milieu à l'aide de cellules vivantes C2 améliorant ladite
réaction, lesdites cellules vivantes C2 étant issues d'une sélection effectuée
par
un dispositif de sélection automatique, de préférence exclusivement en
suspension, d'une population de cellules vivantes dynamiques et ledit
dispositif
de sélection automatique de cellules vivantes étant alimenté soit par un
substrat
différent soit par le même substrat que le récïpient bioréacteur et étant
inoculé à
l'origine par les cellules vivantes C1 présentes dans la cuve du récipient
bioréacteur, et dans lequel avantageusement on prélève des cellules vivantes
dans la cuve du récipient bioréacteur pour les transférer dans le dispositif
de
sélection automatique.
On peut ajouter, si désiré, au dispositif de sélection ou au récipient
bioréacteur, à tout moment, d'autres cellules vivantes, par exemple pour
augmenter la concentration cellulaire ou introduire de nouvelles espèces.
Dans la prësente demande et dans ce qui suit, le terme « cellules
vivantes dynamiques» désigne des cellules vivantes proliférant en suspension
et soumises à une sélection dirigée (à l'inverse des « cellules vivantes
statiques », désignant des cellules vivantes adhérant à la surface des
récipients
et conduites, échappant ainsi à la sélection). On élimine avantageusement
périodiquement les cellules vivantes statiques.
Généralement, on utilisera comme cellules vivantes C2 les
cellules vivantes proliférant en suspension et soumises à une sélection
dirigée.
Dans certaines applications, on utilisera comme cellules vivantes C2 non pas
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les cellules vivantes dynamiques, mais les cellules vivantes statiques.
Le substrat permet le maintien des cultures de cellules vivantes
C 1, C2, etc.
Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre de
l'invention, le dispositif de sélection automatique des cellules vivantes
dynamiques, comporte
- deux récipients ou plus permettant de recevoir et maintenir des cultures de
cellules vivantes en suspension,
- un ensemble de moyens permettant d'alimenter séparément ces récipients en
fluides de stérilisation, de nettoyage ou de neutralisation
- un ensemble de moyens permettant d'alimenter ces récipients en gaz
- un ensemble de moyens permettant d'alimenter ces récipients en substrat
- un ensemble de moyens permettant de transférer le contenu d'un récipient
dans l'autre et vice-versa
- un ensemble de moyens permettant d'évacuer tout ou partie du contenu de
ces récipients vers un autre dispositif tel qu'un récipient bioréacteur
- un ensemble de moyens permettant d'évacuer tout ou partie du contenu de
ces récipients vers une poubelle.
Au début de la mise en oeuvre, des cellules vivantes C1 sont
présentes dans la cuve récipient bioréacteur et dans le dispositif de
sélection
automatique. Au cours du temps, le dispositif de sélection privilégie
(sélectionne) l'apparition et la prolifération de variants de cellules
vivantes
dynamiques C2, toujours mieux adaptées aux conditions de cultures et contre
sélectionne les cellules vivantes C1 moins bien adaptées. Les cellules
vivantes
C2 sont transférées dans le récipient bioréacteur où elles entrent en
compétition avec les cellules vivantes C1 puis les supplantent. A la fin, on
constate que la population de cellules vivantes C1 a été remplacée par les
cellules vivantes C2. De préférence, en parallèle, on prélève des cellules
vivantes dans la cuve du récipient bioréacteur pour les transférer dans le
dispositif de sélection automatique.
Le dispositif de sélection automatique de cellules vivantes
dynamiques comporte notamment
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(a) au moins un premier et au moins un deuxième récipient de culture destinés
à
recevoir une culture
(b) une source de gaz;
(c) une source de milieu;
5 (d) une source pour un agent stérilisant; et
(e) un système de conduites comportant des moyens pour relier au choix l'un
des
deux récipients de culture à la source de milieu tels que des vannes ainsi que
les deux récipients de culture entre eux et pour relier au choix l'autre
récipient
de culture à la source de l'agent stérilisant.
Le gaz utilisé peut étre adapté aux cellules vivantes aérobies ou
anaérobies.
Dans d'autres conditions préférentielles de mise en oeuvre de
l'invention, entre les deux récipients de culture sont prévues deux conduites
de
liaison qui comportent un tronçon de conduite commun.
Dans d'autres conditions préférentielles de mise en oeuvre de
l'invention, sur le tronçon de conduite commun est prévue une conduite
d'évacuation par laquelle on peut prélever les cultures des récipients de
culture.
Les cellules vivantes C2 améliorant la réaction sont de préférence prélevées
par cette conduite.
Dans encore d'autres conditions préférentielles de mise en oeuvre
de l'invention,
- le dispositif bioréacteur et le dispositif de sélection automatisé sont
alimentés
avec le même substrat,
- le bioréacteur fonctionnant en continu, le débit d'alimentation en substrat
appliqué sur la ligne d'arrivée de substrat est identique à celui appliqué à
la
ligne de soutirage de milieu de culture.
Un dispositif de sélection génétique automatisé de cellules
vivantes C2 utilisable est notamment celui décrit dans WO-A-00/34433 et qui
peut fonctionner suivant des conditions de culture telles que le dispositif de
sélection privilégie toujours les cellules vivantes variantes dites
«dynamiques»
qui sont de mieux en mieux adaptées aux conditions de culture maintenues
dans le récipient bioréacteur.
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Parallèlement au fonctionnement du bioréacteur, on transfère de
façon périodique tout ou partie de la culture présente dans le dispositif de
sélection automatisé vers le récipient biorëacteur.
Dans l'invention, on dispose donc en permanence d'une réserve
de cellules vivantes variantes dynamiques de mieux en mieux adaptées aux
conditions de culture pré-établies et imposées au récipient bioréacteur.
Les cellules vivantes variantes dynamiques à fort taux de
croissance sélectionnées par le dispositif de sélection sont inoculëes
périodiquement dans le récipient bioréacteur où elles supplantent les cellules
vivantes statiques à plus faible taux de croissance présentes dans la cuve.
Le rapport entre les taux de croissance des cellules vivantes
présentes dans la cuve et des cellules vivantes à taux de croissance accru
sélectionnées par le dispositif de sélection, fait que les cellules vivantes
issues
du dispositif de sélection supplantent rapidement les cellules vivantes
présentes
dans la cuve du bioréacteur.
En effet le taux de croissance des cellules vivantes issues du
dispositif de sélection sera toujours au moins égal au taux de croissance
maximum des cellules vivantes présentes dans le récipient bioréacteur.
En résumé, si au cours de la culture continue, le taux de
croissance des cellules vivantes issues de l'automate de sélection est égal au
taux de croissance des cellules vivantes présentes dans le récipient
bioréacteur, alors l'ensemble des cellules vivantes évoluera en même temps ;
s'il est supérieur, alors les cellules vivantes issues de l'automate de
sélection
prendront le pas sur celles déjà présentes dans le récipient bioréacteur.
Par ailleurs, en transférant périodiquement des cellules vivantes
du récipient bioréacteur vers le dispositif de sélection automatisë, on a la
certitude de mettre en compétition les deux populations de cellules vivantes
et
de sélectionner parmi les éventuelles variantes issues du récipient
bioréacteur
et celles du dispositif de sélection automatisé les cellules vivantes les
mieux
adaptées aux conditions du bioréacteur.
Les performances du procédé de bioconversion ou de
biodégradation conduit dans le récipient bioréacteur sont donc au pire
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maintenues mais habituellement améliorées en permanence grâce au
remplacement périodique des cellules vivantes actives présentes dans le
récipient bioréacteur par des cellules vivantes actives issues du dispositif
de
sélection automatisé, toujours plus performantes car toujours mieux adaptées
aux conditions de culture.
Par ailleurs l'inoculation étant répétée périodiquement et par
conséquent avec des cellules vivantes de mieux en mieux adaptées aux
conditions de culture, le dispositif de sélection automatisé garantit la
prépondérance des cellules vivantes les plus actives vis-à-vis du substrat
présent dans le récipient bioréacteur.
. Un dispositif de sélection automatisé de faible taille, par exemple
doté de récipients de culture de 25 ml seulement, suffit à faire fonctionner
efficacement un récipient biorëacteur tel que le bassin d'aération d'une
station
de traitement d'eau usée de 100 m3. II est possible, bien sûr, d'utiliser des
récipients de culture de volume plus important, par exemple 1 litre.
Les cellules vivantes C2 utilisées améliorant la réaction de
bioconversion peuvent notamment être produites par mise en oeuvre d'un
procédé comportant les ëtapes suivantes
(a) mise à disposition d'une culture dans au moins un premier récipient de
culture;
(b) alimentation continue de la culture dans le premier récipient de culture
avec
du gaz à partir d'une source de gaz et réapprovisionnement régulier en
liquides à partir d'une source de milieu,
(c) transfert de la culture. du premier récipient de culture par des conduites
de
liaison dans au moins un second récipient de culture au moyen d'un circuit de
conduite approprié,
(d) connexion du premier récipient de culture avec une source pour un agent
stërilisant, pour stériliser le premier récipient de culture,
(e) enlèvement de l'agent stérilisant du premier récipient de culture,
(f) alimentation continue de la culture dans le second récipient de culture
avec
du gaz à partir de la source de gaz et réapprovisionnement régulier en
liquides à partir de la source de milieu,
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(g) retour de (a culture du second récipient de culture par les conduites de
liaison
dans le premier récipient de culture au moyen d'un circuit de conduite
approprié,
(h) connexion du second récipient de culture avec la source pour l'agent
stérilisant, pour stériliser le second récipient de culture ; et
(i) enlèvement de l'agent stérilisant du second récipient de culture.
Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé ci-
dessus décrit, on répète au moins une fois les étapes (b) à (h).
Dans la présente demande et dans ce qui suit, le terme « récipient
bioréacteur » désigne par exemple le bassin d'aération d'une station
d'épuration, le bassin de méthanisation d'une unité de traitement biologique
anaérobie, une lagune, un plan d'eau, une cuve par exemple de 0,5 litre à
100 m3, notamment de 1 litre à 100 m3, particulièrement de 5 litres à 50 m3 et
tout particulièrement de 10 litres à 50 m3 ou un fermenteur par exemple de 0,5
litre à 100 m3, notamment de 1 litre à 100 m3, particulièrement de 5 litres à
50 m3 et tout particulièrement de 10 litres à 50 m3.
Dans la présente demande et dans ce qui suit, le terme
« substrat » désigne un milieu contenant un composé dont on envisage la
conversion métabolique, en particulier une eau d'origine industrielle comme
par
exemple des eaux de lavage de cuves de stockage d'hydrocarbures, des eaux
de lavage d'installations de productions d'intermédiaires pharmaceutiques, des
eaux de rinçage de gâteaux de filtration, des eaux de lavage des fumées issues
de productions chimiques, des effluents issus du dégivrage des aéronefs, une
eau d'origine municipale comme par exemple des eaux usées domestiques, un
polluant accidentel de l'environnement comme par exemple la présence en mer
d'une nappe d'hydrocarbures ou d'autres produits chimiques provenant
respectivement du naufrage d'un pétrolier ou d'un chimiquier, des effluents
chimiques répandus sur le sol suite à un accident impliquant une citerne de
transport (voie routière ou ferrée), des sols pollués aux métaux lourds ou à
la
dioxine.
Le terme « substrat» désigne aussi un composé dont on envisage
la conversion métabolique comme par exemple le glucose servant à la
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production de biomolécules d'intérét industriel comme la lysine, le xanthane,
les
alginates, les polyols comme le glycérol, l'hygromycine, l'éthanol servant à
la
production de vinaigre par fermentation acétique, l'acide oxalique utilisé
pour
des applications de biohydrométallurgie, les pectines et les carraghénanes.
Le terme « substrat» désigne encore un milieu contenant des
cellules vivantes ou mortes dont on envisage la conversion métabolique, par
exemple une boue activée d'une eau résiduaire urbaine ou industrielle, des
dérivés ligno-cellulosique issus de l'industrie papetière, des sous produits
solides ou pâteux issus de l'industrie agroalimentaire, par exemple la
biomasse
végétale, en particulier herbe coupée), les drèches, les levures, les
mélasses,
ou encore des sous produits de l'industrie de la pêche tels que des dérivés
chitineux, par exemple ceux issus de carapaces de crabes ou de crevettes.
Le terme « substrat» désigne également des molécules polluantes
comme les composés organochlorés volatils (comme les solvants chlorés et les
CFCs), les pesticides organochlorés (comme le DDT) ; les hydrocarbures
aromatiques polycycliques halogénés (comme les PCBs, dioxines et furanes) ;
les solvants (comme le benzène, toluène, le xylène}, les composés
phytosanitaires organochlorés ou organophosphorés.
Le terme «cellules vivantes» désigne par exemple une ou
plusieurs flores bactériennes comme Sphingomonas wittichü (qui catalyse la
bioconversion de la dioxine), Pseudomonas putida (qui catalyse la
bioconversion des cyanures et cyanates), Agrobacterium radiobacter (qui
catalyse la bioconversion de pesticides comme le bromoxynil), certaines
souches d'Alcanivorax ou d'Acinetobacter (capables de biodégrader de
nombreux hydrocarbures aliphatiques), Xanthomonas campestris (qui est
impliqué dans la biosynthèse du xanthane) ou Sphingomonas paucimobilis (qui
est impliqué dans la biosynthèse du gellane).
Le terme «cellules vivantes» désigne aussi des cellules animales
comme des cellules de mammifères (comme les cellules HEK-293) pour la
production d'anticorps monoclonaux, de facteurs cellulaires de croissance des
cellules d'insectes pour la production de protéines recombinantes ou de
particules virales entomopathogènes (comme les cellules Sf9).
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Le terme «cellules vivantes» désigne également des cellules
végétales comme des cellules végétales de Datura pour la production
d'alcaloïdes tropaniques (atropine, hyosciamine et scopolamine), des cellules
végétales transgéniques pour la production de molécules d'intérêt industriel
5 (comme la surproduction d'amidon par la pomme de terre).
Le terme ee cellules vivantes » désigne aussi des algues comme
les algues vertes appartenant aux espèces Spirogyra impliquées dans le
traitement biologique d'effluents contenant des colorants comme le Reactive
Yellow 22, des cultures de la micro-algue Scenedesmus quadricauda servant à
10 la bioconversion de la progestérone, les micro-algues Chlorella vulgaris et
Coenochloris pyrenoidosa intervenant dans la biodégradation de p-
chlorophénol, la macro-algue Microspora capable d'éliminer le plomb.
Le terme «cellules vivantes» désigne de même des levures
comme Saccharomyces cerevisiae servant à la production de bioéthanol à
partir du glucose ou à la production de xylitol à partir du glucose, Candida
tropicalis YMEC14 servant à la biodégradation de composés phénolés
(provenant de la production d'huile d'olive), Candida famata servant à la
biodégradation de composés nitrilés.
Le terme «cellules vivantes» désigne tout autant des champignons
comme Penicillium janthinellum capable de produire une xylanase, enzyme
dépolymérisant le xylane, Streptomyces clavuligerus capable de produire la
céphalosporine C à partir du glucose comme unique source de carbone, ou
Phanerochaete chrysosporium capable de biodégrader les dioxine di- et
tétrachlorées.
Le terme « cellules vivantes » désigne également des
protozoaires comme Euglena mutabilis (protozoaire acidophile) impliqué dans
la bioconversion de l'arsenic.
Le terme « cellules vivantes » désigne aussi un mélange de tous
les types de cellules vivantes citées précédemment.
L'inoculation périodique en provenance du dispositif de sélection
automatique de cellules vivantes est par exemple effectuée toutes les 48
heures, de préférence au moins une fois par semaine, particulièrement au
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moins une fois par mois ~et tout particulièrement après chaque amélioration
notable du taux de croissance des cellules vivantes C2.
Les procédés de traitement en continu, serai continu ou discontinu
d'un substrat objet de la présente invention possèdent de très intéressantes
qualïtés. Ils permettent notamment de contrôler biologiquement le
fonctionnement d'un bioréacteur de conception classique en exerçant le
contrôle des cellules vivantes présentes par élimination des cellules vivantes
les moins adaptées au milieu de culture comme un contaminant ayant un taux
de croissance inférieur à celui des cellules vivantes présentes dans le
récipient
bioréacteur par exemple. II est donc possible de s'affranchir des contraintes
de
stérilité.
Un dispositif de sélection de faible taille, par exemple doté de
récipients biorèacteurs d'un litre, suffit à faire fonctionner efficacement un
récipient tel qu'un plan d'eau d'un volume de 4000 m3.
L'invention permet aussi d'améliorer l'efficacité d'un procédé de
culture de conception classique en augmentant l'activité des cellules vivantes
mises en ceuvre dans le procédé sans refonte des dispositifs utilisés. On peut
ainsi augmenter les rendements de production d'une molécule d'intérét et/ou la
vitesse de dégradation de substrats.
Ces qualités sont illustrées ci-après dans la partie expérimentale.
Elles justifient l'utilisation des procédés ci-dessus décrits par
exemple dans la biodégradation de composés récalcitrants. En effet
aujourd'hui, un grand nombre de dëchets issus de l'industrie de la chimie sont
détruits par incinération à des coûts élevés et avec un risque environnemental
important lié au risque d'émission dans l'atmosphère de composés dangereux
pour l'homme et son environnement. Le traitement biologique de ces déchets
(ou bioconversion) est souvent rendu impossible par les temps de traitement
nécessaires ou par l'incapacité des cellules vivantes à métaboliser les
composés présents dans le déchet, ou encore par l'effet inhibiteur de certains
composés vis-à-vis de l'activité bactérienne en général.
Le dispositif de l'invention permet de maintenir dans un récipient
bioréacteur dédié à la bioconversion de déchets, des cellules vivantes
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spécifiquement adaptées et performantes vis-à-vis des composës présents
dans le déchet et donc de rendre possible la bioconversion de déchets
traditionnellement détruits par incinération.
En sélectionnant grâce au dispositif de sélection les cellules
vivantes de mieux en mieux adaptées au milieu de culture, l'invention permet
d'améliorer l'efficacité d'un procédé de culture de conception classique en
augmentant l'activité des cellules vivantes mises en oeuvre dans le procédé
sans refonte des dispositifs de mise en oeuvre.
Ces qualités justifient aussi l'utilisation des procédés ci-dessus
décrits par exemple dans l'amélioration du fonctionnement des stations de
traitement biologique des effluents. En effet, le bon fonctionnement des
stations
d'épuration des effluents urbains ou industriels peut ëtre affecté par la
présence
accidentelle dans les effluents de composés récalcitrants vis-à-vis des
cellules
vivantes présentes. On peut prévoir de remédier à ce problème par adjonction
d'un dispositif tel que décrit ci-dessus. '
Le récipient biorèacteur est dans ce cas matérialisé par le bassin
d'aération existant de la station d'épuration. L'alimentation du dispositif de
sélection automatisé peut être réalisée par un pïquage situé en amont du
système d'aération dans un bassin de décantation primaire par exemple.
L'inoculation réciproque du dispositif de sélection et du récipient
bioréacteur est
réalisée comme illustré ci-après à la figure 1. On peut également utiliser une
ligne de connexion extérieure pour alimenter l'automate avec un substrat
modifié par rapport au milieu prélevé en amont du bassin d'aération. Ce
dispositif peut être utilisé pour enrichir les bassins d'aération en cellules
vivantes adaptées à la biodégradation d'éventuels composés récalcitrants
présents dans les effluents.
Ces qualités justifient aussi l'utilisation des procédés décrits ci-
dessus par exemple dans l'amélioration des performances des biosynthèses.
L'invention peut étre à cet effet être utilisée pour l'amélioration des
performances (rendement, temps de croissance) des procédés industriels de
synthèse par biocatalyse.
Aujourd'hui, l'amélioration des performances des biosynthèses
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reposant sur des fermentations, qu'elles soient en batch ou en continu, se
fait
par l'optimisation de la composition du milieu de culture et des paramètres
physico-chimiques de la culture (Température, oxygénation, pH, etc.).
Ces développements sont longs et coûteux et de toutes façons
limités par le métabolisme des cellules vivantes en présence.
L'invention, en agissant sur le métabolisme des cellules vivantes
présentes permet d'adapter lesdites cellules vivantes aux conditions imposées
par les impératifs technico-économiques et d'en accroitre le taux de
croissance,
et donc par voie de conséquence d'augmenter les performances globales de fa
biosynthèse.
Dans le cas par exempte des levures dites osmotolérantes
intervenant dans la production des polyols (sorbitol, mannitol, xylitol...),
on
observe des temps de culture variant de 4 à 5 jours sur des concentrations en
glucose proches de 30 g/I.
On peut grâce à l'invention mettre les levures en contact avec des
concentrations en glucose de plus en plus importantes de manière à orienter
leur métabolisme naturel vers la production du métabolite extracellulaire ou
intracellulaire désiré, tout en augmentant leur taux de croissance c'est-à-
dire en
diminuant les temps nécessaires à la culture.
Cette amélioration se traduit par une augmentation de la
productivité des équipements utilisés et par une diminution du coüt de revient
de la biosynthèse.
Le procédé selon l'invention peut étre mis en oeuvre sur de
longues périodes et méme indéfiniment.
La présente demande a aussi pour objet un dispositif de culture de
cellules vivantes comprenant
- A : un dispositif de sélection comprenant de préférence
- deux récipients ou plus permettant de recevoir et maintenir des
cultures de cellules vivantes en suspension,
- un ensemble de moyens permettant d'alimenter séparément ces
récipients en fluides de stérilisation de nettoyage ou de neutralisation,
- un ensemble de moyens permettant d'alimenter ces récipients en gaz,
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- un ensemble de moyens permettant d'alimenter ces récipients en
substrat,
- un ensemble de moyens permettant de transférer le contenu d'un
récipient dans l'autre et vice-versa,
- optionnellement un ensemble de moyens permettant d'évacuer tout ou
parue du contenu de ces récipients vers un autre dispositif tel qu'un
récipient bioréacteur,
- un ensemble de moyens permettant d'évacuer tout ou partie du
contenu de ces récipients vers une poubelle.
- B : un récipient bioréacteur,
- C : un système de moyens pour transférer des cellules vivantes entre le
dispositif de sélection et le récipient bioréacteur,
- D : optionnellement une conduite comportant des moyens pour relier le
récipient bioréacteur à un dispositif de séparation solide-liquide tel qu'un
décanteur,
- E : optionnellement une conduite d'évacuation du fluide (eau par exemple)
traité
F : optionnellement un dispositif de régulation de température.
Les moyens pour transférer le contenu d'un récipient dans l'autre
et vice-versa peuvent être des moyens physiques comme des conduites ou des
moyens humains effectuant des prélèvements dans l'un pour les transférer
dans l'autre.
La présente demande a plus particulièrement pour objet un
dispositif de culture de cellules vivantes par couplage avec un automate de
sélection de cellules vivantes comprenant
- A : un dispositif de sélection de cellules vivantes comprenant
(a) au moins un premier et au moins un deuxième récipient de culture
destinés à recevoir une culture
(b) une source de gaz,
(c) une source de milieu,
(d) une source pour un agent stérilisant; et
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(e) un système de conduites comportant des moyens pour relier au choix
l'un des deux récipients de culture à la source de milieu tels que des
vannes ainsi que les deux récipients de culture entre eux et pour relier
au choix l'autre récipient de culture à la source de l'agent stérilisant.
5 - B : un récipient bioréacteur
- C : un système de moyens pour transférer des cellules vivantes entre le
dispositif de sélection et le récipient bioréacteur,
- D : optionnellement une conduite comportant des moyens pour relier le
récipient bioréacteur à un dispositif de séparation solide-liquide tel qu'un
10 décanteur
- E : optionnelfement une conduite d'évacuation du fluide (eau par exemple)
traité.
- F : optionnellement un dispositif de régulation de température.
15 Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre de l'invention,
- une ligne de soutirage est installée entre le récipient bioréacteur et le
dispositif
de sélection automatisé pour permettre de prélever des cellules vivantes
présentes dans le récipient bioréacteur afin de les faire évoluer dans le
dispositif de sélection automatisé,
- une ligne d'inoculation est installée entre le dispositif de sélection
automatisé
et le récipient bioréacteur pour permettre d'ensemencer le récipient
bioréacteur de manière répétée et régulière avec des cellules vivantes ayant
évolué dans le dispositif de sélection automatisé,
- une ligne supplémentaire permet d'enrichir le milieu de culture de
l'automate
avec un ou plusieurs additifs,
- un réservoir de collecte des effluents de rinçage et de stérilisation permet
de
recueillir les fluides de stérilisation et de rinçage du dispositif de
sélection
automatisé,
- un ensemble de pompes permet le transfert des différents fluides.
Les conditions préférentielles de mise en oeuvre des procédés ci-
dessus décrites s'appliquent également aux autres objets de l'invention visés
ci-
dessus, notamment aux dispositifs pour leur mise en oeuvre.
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L'invention sera mieux comprise si l'on se réfère aux dessins
annexés sur lesquels
- la figure 1 représente une vue schématique d'un dispositif de l'invention,
- la figure 2 représente une vue schématique d'un dispositif d'épuration
biologique d'eaux usées,
- la figure 3 représente une vue schématique d'un dispositif de sélection
automatisé décrit dans WO 00/34433.
Sur la figure 1, on peut observer un récipient bioréacteur 1 relié
par un système de conduites retour 5 et aller 6 à un dispositif de sélection
de
cultures automatisé 2. Des pompes 13, 14 sont prévues sur ces conduites.
On peut aussi observer un réservoir tampon 11 de substrat
alimenté extérieurement en substrat et relié par un système de conduites 4
d'une part au dispositif de sélection de cultures automatisé 2 et d'autre part
au
récipient bioréacteur 1. Des pompes 9, 10 sont prévues sur ces conduites.
Un réservoir 8 de collecte des effluents de rinçage et stërilisation
du dispositif de sélection de cellules vivantes automatisé 2 est prévu.
Une conduite d'arrivée d'additifs 12 est prévue pour l'addition dans le
dispositif
de sélection de cellules vivantes automatisé 2.
Le dispositif peut notamment fonctïonner comme suit
Le récipient bioréacteur 1 et le disposïtif de sélection automatisé 2
sont alimentés avec le méme substrat respectivement par les voies 3 et 4.
Le bioréacteur 1 fonctionnant en continu, le débit d'alimentation en
substrat appliquée sur la ligne 3 est identique à celui appliqué à la ligne 7
correspondant au soutirage de milieu de culture. La ligne 7 peut conduire à un
dispositif de séparation solide-liquide, non représenté, tel qu'un décanteur.
Une ligne d'inoculation 5 installée entre le dispositif de sélection
automatisé 2 et le récipient bioréacteur 1 permet d'ensemencer le récipient
bioréacteur 1 de manière répétée et régulière avec des cellules vivantes ayant
évolué dans le dispositif de sélection automatisë 2.
Une ligne de soutirage 6 installée entre le récipient bioréacteur 1
et le dispositif de sélection automatisé 2 permet de prélever des cellules
vivantes présentes dans le récipient bioréacteur 1 afin de les faire évoluer
dans
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le dispositif de sélection automatisé 2.
Une ligne supplémentaire 12 permet d'enrichir le milieu de culture
de l'automate avec un ou plusieurs additifs.
Une poubelle 8 permet de recueillir les fluides de stérilisation et de
rinçage du dispositif de sélection automatisé.
Un ensemble de pompes 9, 10,13 et 14 permet le transfert des
différents fluides.
Sur la figure 2, on peut observer un dispositif d'ëpuration
biologique d'eaux usées.
On peut observer une partie des éléments ci-dessus, à savoir un
récipient bioréacteur 1 qui est un bassin d'aération et un dispositif de
sélection
automatisé 2 alimentés avec le même substrat respectivement par les voies 3
et 4, des lignes d'inoculation et de soutirage 5 et 6 installées entre le
récipient
bioréacteur 1 et le dispositif de sélection automatisé 2, et une conduite 15
comportant des moyens pour relier le récipient bioréacteur 1 à un dispositif
de
séparation solide-liquide, dans le cas présent un décanteur 16.
Sur la figure 3, on peut observer un premier et un deuxième
récipient de culture 20, 21, destinés à recevoir une culture 22, une source de
gaz 23, une source de milieu 24, une source 25 pour un agent stérilisant, et
un
système de conduites comportant des moyens pour relier au choix l'un des
deux récipients de culture 20 ou 21 à la source de milieu 24 tels que des
vannes ainsi que les deux récipients de culture 20, 21 entre eux et pour
relier
au choix l'autre récipient de culture 20 ou 21 à la source 25 de l'agent
stérilisant. Les traits en gras représentent les conduites actives lors d'une
des
phases de mise en oeuvre du procédé.
Ce dispositif permet la mise à disposition d'une culture 22 dans au
moins un premier récipient de culture 20, l'alimentation continue de la
culture 22
dans le premier récipient de culture 20 avec du gaz à partir d'une source de
gaz
23 et réapprovisionnement régulier en liquides à partir d'une source de milieu
24, le transfert de la culture 22 du premier récipient de culture 20 par des
conduites de liaison 28-31 dans au moins un second récipient de culture 21 au
moyen d'un circuit de conduite approprié, la connexion du premier récipient de
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culture 20 avec une source 25 pour un agent stérilisant, pour stériliser le
premier récipient le culture 20, l'enlèvement de l'agent stérilisant du
premier
récipient de culture 20, l'alimentation continue de la culture 22 dans le
second
récipient de culture 21 avec du gaz à partir de la source de gaz 23 et
réapprovisionnement régulier en liquides à partir de la source de milieu 24,
le
retour de la culture 22 du second récipient de culture 21 par les conduites de
liaison 28-31 dans le premier récipient de culture 20 au moyen d'un circuit de
conduite approprié, la connexion du second récipient de culture 21 avec la
source 25 pour l'agent stérilisant, pour stériliser le second récipient de
culture
21 et l'enlèvement de l'agent stérilisant du second récipient de culture 21.
Les exemples qui suivent illustrent la présente demande.
Exemple 1 ~ Bioconversion de dëchets issus de la production de produits
pesticides
On alimente en continu à un débit fixé de 0,75 mL/min un récipient
bioréacteur de 5 litres utiles avec un substrat comprenant des déchets issus
de
la production de produits pesticides. L'analyse de ce déchet met en évidence
les composés chimiques suivants : des alcools (ex :2-butoxyéthanol), des
alcanes (ex : propane-2,2-diméthoxy), des chlorophénols (ex : 2,4-
dichlorophénol), des aromatiques (ex : 1,1'-biphényle, 1-méthylnaphtalène,
2-méthylnaphtalène, 2-éthylnaphtalène), des composés bromés
(ex : benzonitrile-3,3-dibromo-4-hydroxy) et des pesticides (ex : 2,4-D-
butoxyéthylester, MCP et MCPP). La demande chimique en oxygène de ce
déchet est de 2450 mg/L. Le récipient bioréacteur est inoculé avec 10 mL d'un
mélange de cellules vivantes de microorganismes isolées à partir de
prélèvements provenant de différentes niches écologiques ou boues activées
de stations d'épuration ; ces cellules vivantes sont sélectionnées parce
qu'elles
sont capables de dégrader les déchets.
Le régime continu est maintenu en fixant une DCO résiduelle de
1000 mg/L, ce qui représente un rendement de bioconversion stabilisé
à 59,18 %.
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Par ailleurs, on alimente également un dispositif de sélection
automatisé du type décrit sur la figure 1 de WO-A-00!34433 muni de récipients
de culture de 25 mL avec le même substrat et inoculé avec le méme mélange
de cellules vivantes que précëdemment. Au départ, dans les deux récipients on
a donc les mémes cellules vivantes.
Dès que la consigne de turbidité est atteinte pour le système de
sélection (détection au turbidostat), il est procédé automatiquement à
l'inoculation du récipient bioréacteur par 10 mL du milieu présent dans le
dispositif de sélection automatisé.
Après 9 semaines de fonctionnement, on constate que les cellules
vivantes issues du dispositif de sélection automatisé, dont le taux de
croissance
a doublé durant cette période (passant de 0,009 à 0,018 h-~), ont remplacé la
population de cellules vivantes présente à l'origine dans le récipient
bioréacteur.
A ce stade final, seulement deux microorganismes ont pu être identifiés comme
étant Delftia acidovorans et Pseudomonas putida A.
II a de ce fait été possible d'augmenter de 100 % le débit
d'alimentation du fermenteur tout en maintenant le méme rendement de
bioconversion.
