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DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
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METHODES DE CRIBLAGE ET COMPOSITIONS POUR LE TRAITEMENT DE CANCERS
La présente demande concerne des compositions et méthodes pour le traitement
de
pathologies prolifératives, notamment de cancers et plus particulièrement de
cancers
hormono-dépendants. Elle repose sur l'identification de propriétés
particulières d'une
protéine dans le contrôle du cycle cellulaire et dans le contrôle de la
prolifération
cellulaire. Cette protéine, désignée TReP-132, se comporte comme un
suppresseur de
tumeur et constitue donc une cible privilégiée pour le développement de
stratégies
thérapeutiques efficaces. L'invention concerne des compositions, utilisations
et
méthodes d'identification de composés capables de moduler l'activité de cette
protéine
et utilisables pour le traitement de diverses pathologies prolifératives, en
particulier
chez l'homme.
La caractérisation fonctionnelle du promoteur du gène codant pour le
cytochrome
P450scc a permis d'isoler la protéine TReP-132 (Transcriptional Regulating
Protein of
132 kDa). Cette protéine est impliquée dans la régulation de l'expression de
gènes
stéroïdogéniques et notamment dans l'activation de l'expression du gène codant
pour
l'enzyme P450scc (Gizard et al., 2001 et Gizard et al., 2004). Le cytochrome
P450scc
est un enzyme mitochondrial codé par le gène CYP11A1 et exprimé dans des
tissus
stérôidogéniques tels que les ovaires, les testicules, le placenta ou les
surrénales
(Mellon et al., 1993 et Stromstedt et al., 1995). P450scc catalyse la première
étape.
enzymatique de la synthèse stéroïdienne en formant la pregnénolone à partir du
cholestérol (Miller, 1988).
Il a été montré que la sur-expression de TReP-132 dans-- des cellules
adrénales
humaines NCI-H295 entraîne une augmentation significative de la production de
prégnénolone, ce qui est en accord avec la capacité de ce facteur à augmenter
l'expression du gène P450scc et à augmenter potentiellement la production
d'hormones
stéroïdiennes, y compris les minéralocorticoïdes, glucocorticoïdes et
stéroïdes sexuels.
TReP-132 semble donc impliquée dans de multiples effets physiologiques des
hormones stéroïdiennes.
L'ADNc de TReP-132 (3600 nucléotides) a été isolé initialement par criblage
d'une
banque d'ADNc de placenta humain. La séquence de la protéine présente des
motifs
caractéristiques d'un facteur impliqué dans la régulation transcriptionnelle
des gènes
tels que 3 motifs en doigts de zinc de sous type C2H2, des régions riches en
acides
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aminés acides, en proline et en glutamine et 2 motifs LXXLL. L'analyse en
Northern blot
et par protection à la RNase démontre que TReP-132 est exprimé dans différents
tissus, avec un taux d'expression particulièrement élevé dans les tissus
cibles des
stéroïdes tels que l'utérus, la prostate, les testicules et certaines zones du
cerveau
(Gizard et aI ; 2001 ; Gizard et al., 2002b et Duguay et al., 2003) ainsi que
dans les
lignées cellulaires cancéreuses LNCaP, MCF-7 et T47-D (Gizard et al., 2001).
L'analyse en immunocytochimie démontre une localisation de la protéine TReP-
132
dans le noyau. Sur la base de l'analyse de la structure primaire, il apparaît
que TReP-
132 présente plusieurs domaines susceptibles d'interagir avec des protéines
tels que 2
motifs LXXLL.
Il a été montré dans les cellules NCI-H295, que la régulation de l'expression
des gènes
par TReP-132 passe par la formation d'un complexe d'activation
transcriptionnel et par
une interaction directe de TReP-132 avec SF-1 (Steroidogenic Factor-1) et le
cofacteur
CBP/p300 (Gizard et al., 2002b et Gizard et al., 2004). L'interaction TReP-
132/SF-1
requiert le motif LXXLL situé dans la région N-terminale de TReP-132 ainsi que
le
domaine d'activation proximal et le motif AF-2 de la protéine SF-1.
L'interaction de TReP-132 avec l'ADN, sa localisation nucléaire ainsi que son
implication dans la régulation de l'expression des gènes montrent que TReP-132
est un
facteur de régulation de la transcription.
Les inventeurs ont noté que TReP-132 est exprimé dans différents tissus, y
compris
dans des tissus non stéroïdogéniques tels que le cerveau, le thymus ou le
coeur ce qui
semble indiquer, compte tenu de sa capacité à interagir avec l'ADN pour
réguler
l'expression des gènes, que TReP-132 pourrait être impliqué dans différentes
fonctions,
autres que la régulation de la synthèse stérôidienne. La présente demande
démontre
donc maintenant l'implication de TReP-132 dans la prolifération cellulaire et
les
mécanismes associés, tels que la différenciation cellulaire et le
développement
tissulaire. La présente demande démontre notamment une régulation de
l'expression
de TReP-132 pendant le cycle cellulaire, et révèle un rôle de ce facteur dans
la
régulation de la prolifération cellulaire.
Plus particulièrement, les inventeurs ont mis en évidence l'implication de
TReP-132
dans la prolifération cellulaire dépendante des hormones stéroïdes ou de leurs
analogues et plus spécifiquement de la progestérone, notamment au niveau des
cancers affectant les organes sensibles aux hormones stéroïdes et typiquement
féminins, en particulier le cancer du sein et le cancer de l'utérus. Les
hormones
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stéroïdes (cestrogène et progestérone) jouent en effet un rôle clé dans la
prolifération et
la différenciation des glandes mammaires (Musgrove et al., 1994). Des études
in vitro
réalisées sur des lignées cellulaires T47-D ont permis de démontrer que la
réponse
cellulaire à la progestérone ou à ses dérivés R5020 et ORG 2058 (Stahlberg et
al.,
2003) est biphasique : une exposition initiale conduit à une prolifération
tandis qu'une
exposition prolongée entraîne une inhibition de la croissance cellulaire.
Ainsi, les
administrations prolongées de progestatifs de synthèse tels que l'acétate de
Megestrol
ou l'acétate de medroxy-progestérone sont utilisées en clinique dans le
traitement de
certains cancers du sein (Sitruk-Ware et al., 1999 et Ingle, 2002).
La présente demande démontre le rôle de TReP-132 en tant que régulateur de la
prolifération cellulaire. Les inventeurs ont démontré que la transfection de
cellules
HeLa, qui n'expriment pas de PR (Progesterone Receptor) endogène, avec un
plasmide d'expression codant TReP-132 entraîne la présence de moins de
colonies
que la transfection avec un vecteur vide seul. Ce résultat indique que
l'expression de
TReP-132 diminue ou arrête la progression du cycle cellulaire. De plus, les
cellules
exprimant le TReP-132 exogène présentent un temps de dédoublement
significativement plus long que les cellules contrôles et les colonies
obtenues suite à la
transfection de TReP-132 sont plus petites.
Parallèlement, les inventeurs ont mis en évidence que l'expression de TReP-132
est
augmentée dans les cellules T47-D après un traitement à la progestérone et que
l'inhibition sélective de TReP-132 augmente la prolifération cellulaire et
abolit l'action
inhibitrice de la progestérone. Ces résultats démontrent l'effet inhibiteur de
TReP-132
sur la prolifération cellulaire dépendante de la progestérone. L'implication
de TReP-132
dans la prolifération cellulaire a ensuite été démontrée dans les cellules
épithéliales
mammaires humaines cancéreuses MCF-7: le traitement de ces cellules avec de
l'oestradiol conduit à une diminution significative de l'expression de TReP-1
32 et à une
augmentation concomitante de la prolifération cellulaire. Ces résultats
démontrent l'effet
inhibiteur de TReP-132 sur la prolifération cellulaire dépendante ou non de la
progestérone.
De plus, la présente demande démontre une régulation de l'expression de TReP-
132
pendant le cycle cellulaire. Il a été démontré qu'en l'absence d'un traitement
à
l'cestradiol des cellules MCF-7, une proportion plus élevée des cellules était
en phase
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G1, suggérant ainsi que l'expression de TReP-132 arrête la progression du
cycle
cellulaire de la phase GI à la phase S.
L'implication de TReP-132 dans la phase G1 du cycle cellulaire a encore été
démontrée par la mise en évidence que cette protéine est exprimée
exclusivement
durant la phase G1 du cycle cellulaire suite à la synchronisation des cellules
HeLa.
De plus, dans les cellules T47-D, les inventeurs démontrent que la
surexpression de
TReP-132 provoque l'arrêt de la prolifération cellulaire en phase G1 associée
à
l'inhibition des activités CDK (Cyclin Dependant Kinase) et à une baisse de la
phosphorylation de pRb (protéine du Rétinoblastome). Ces résultats démontrent
une
corrélation négative entre l'expression de TReP-132 et la progression du cycle
cellulaire.
Les effets d'une surexpression de TReP-132 sur le niveau d'inhibiteurs de
kinases
dépendantes de cycline (CDKIs) ont également été déterminés. Dans la mesure où
TReP-132 a été caractérisée comme impliquée dans la régulation de l'expression
de
gènes, il est pertinent d'identifier des gènes cibles régulés par TReP-132 qui
sont
impliqués dans le cycle cellulaire. Il a été montré, par des expériences de
protection à
la RNase et des essais gènes rapporteurs, que l'induction de TReP-132 est
associée à
une augmentation de l'expression des CDKIs p21, p16 et p27. Les inventeurs ont
par
ailleurs montré, par des expériences de transfections, d'immunoprécipitations
et de
retards sur gel, que TReP-132 active les promoteurs de gènes codant pour p21,
p16 et
p27 par un mécanisme mettant en jeu un complexe formé de TReP-132, du facteur
de
transcription Sp1 et de PR. Ces résultats montrent donc que TReP-132 agit
comme un
co-facteur de PR (Progesterone Receptor), dans le complexe de régulation formé
avec
Sp1.
De la même manière, les inventeurs ont mis en évidence une interaction entre
TReP-
132 et le récepteur aux oestrogènes (ER).
Les inventeurs suggèrent par ailleurs que l'expression de TReP-132 est
associée à une
faible incidence tumorale et à une faible agressivité tumorale. De manière
intéressante,
il a été montré que le chromosome 6, sur lequel est localisé le gène codant
pour TReP-
132 en position 6p21.1-p12.1 (Gizard et al., 2002a) est le 4ème chromosome
réarrangé
dans les tumeurs humaines et que le locus 6p21 est le siège d'importantes
mutations
associées à des évènements d'immortalisation de certains cancers. Des
mutations
affectant l'expression ou l'activité de TReP-132 pourraient donc être associés
à des
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tumeurs. TReP-132 pourrait donc constituer un marqueur de prédisposition, de
différenciation cellulaire et de développement, et d'agressivité des tumeurs.
La présente demande démontre par ailleurs le rôle de TReP-132 dans la
différenciation
5 cellulaire: Gizard et al., 2004 suggère que la surexpression de TReP-132
dans les
cellules adrénales NCI-H295 induit la différenciation des cellules des zonae
fasciculata
et reticularis et que TReP-132 induit l'expression du gène codant pour la P450
aromatase, nécessaire à la différenciation des glandes mammaires. De plus,
l'inhibition
de la prolifération des cellules T47-D par la progestérone, montrée comme
augmentant
l'expression de TReP-132 par les inventeurs, est liée à l'induction de
programmes de
différenciation (Musgrove et al.,1998). Cette hypothèse est confirmée par
l'augmentation de la régulation de p21, p16 et p27 qui sont des molécules
facilitant la
différenciation hormono-dépendante dans de nombreuses voies de différenciation
cellulaire (Inoue et al., 1999). Dans le tissu mammaire, l'augmentation de la
régulation
de p27 est à la base de l'arrêt de la différenciation au niveau de la phase
alvéolaire
(Said et al., 2001) et des niveaux importants de p21 et p27 sont
respectivement
associés aux états de différenciation intermédiaire et avancé du "ductal
carcinoma in
situ" (DCIS = forme non invasive du cancer du sein) (Mommers et al., 2001). En
considérant les effets similaires de TReP -132 et de la progestérone sur
l'expression de
p21, p27 et p16, il apparaît clairement que TReP-132 est un marqueur de
différenciation cellulaire, en particulier des cellules épithéliales des
glandes mammaires
et que TReP-132 est un facteur de différenciation.
Les activités ainsi démontrées de TReP-132 montrent que le gène codant pour
TReP-
132 est potentiellement un gène suppresseur de tumeur. Comme cela a pu être
démontré pour d'autres gènes suppresseurs de tumeur, tels que p53 qui active
également des gènes inhibiteurs des kinases dépendantes de cyclines comme p21,
TReP-132 régule vraisemblablement aussi le cycle cellulaire via de nombreuses
voies
inhibitrices de la croissance. Ceci inclut la régulation transcriptionnelle
positive de
gènes cibles en favorisant l'apoptose et de gènes inhibiteurs de la
croissance, ainsi que
la régulation négative d'autres groupes de gènes, incluant des facteurs de
survie et des
gènes anti-apoptose.
Pris ensemble, ces résultats démontrent la capacité de la protéine TReP-132 à
réguler
la progression du cycle cellulaire dans différents types cellulaires. TReP-132
constitue
donc un gène suppresseur de tumeur potentiel. L'expression régulée de TReP-1
32 et la
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production de protéines TReP-132 fonctionnelles, sont des étapes clés
nécessaires à la
progression correcte du cycle cellulaire et constituent des cibles
d'intervention
thérapeutique particulièrement avantageuses. Ces résultats montrent également
que
des composés capables d'augmenter l'activité de la protéine TReP-132
représentent
des inhibiteurs potentiels puissants et sélectifs de voies impliquées dans la
progression
du cycle cellulaire, dans une prolifération cellulaire incontrôlée, dans le
développement
tissulaire et/ou la différenciation cellulaire.
Un premier objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé
augmentant ou
mimant l'activité de la protéine TReP-132 pour la préparation d'une
composition
destinée au traitement d'une maladie proliférative.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de cette composition en
combinaison
avec une hormone pour une administration simultanée, séparée ou séquentielle.
L'invention concerne également des méthodes de traitement de pathologies
prolifératives, comprenant l'administration à un sujet d'un composé augmentant
ou
mimant l'activité de la protéine TReP-132, notamment d'un composé qui mime
l'activité
de la protéine TReP-132, stimule l'expression, la maturation ou le ciblage
nucléaire de
la protéine TReP-132 et/ou augmente la concentration de la protéine TReP-132
dans
les cellules. L'administration peut être réalisée par toute voie classique
pour ce type
d'approche thérapeutique, comme notamment par voie systémique, en particulier,
par
injection, notamment intraveineuse, intradermique, intra-tumorale, sous-
cutanée, intra-
péritonéale, intramusculaire, intra-artérielle, etc.
Un objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation de la protéine
TReP-132 ou
d'un analogue pour la préparation d'une composition destinée au traitement
d'une
maladie proliférative.
Un autre objet de la présente demande concerne l'utilisation d'un acide
nucléique
codant la protéine TReP-132 pour la préparation d'une composition destinée au
traitement d'une maladie proliférative.
Un autre objet particulier de l'invention concerne une composition
pharmaceutique
comprenant une protéine TReP-132 ou un acide nucléique codant la protéine TReP-
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132, et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. L'invention
concerne par
ailleurs une composition pharmaceutique comprenant, dans un excipient
acceptable sur
le plan pharmaceutique, un composé choisi parmi la protéine TReP-132, un
analogue
de cette dernière, un composé augmentant ou mimant l'activité TReP-132 et un
composé identifié à l'aide d'une méthode selon l'invention, combiné à une ou à
plusieurs hormones, en vue d'une administration simultanée, séparée ou
séquentielle
pour traiter une maladie proliférative.
Dans un mode de réalisation préférée, la composition pharmaceutique comprend,
dans
un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, la protéine TReP-132.
Dans un autre mode de réalisation préférée, la composition pharmaceutique
comprend,
dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, la progestérone ou un
oestrogène.
L'invention est utilisable pour le traitement de diverses pathologies
prolifératives, et
notamment pour le traitement des cancers. L'invention est particulièrement
adaptée au
traitement des cancers hormono-dépendants, en particulier les cancers
sensibles à un
dérèglement de la synthèse et/ou de l'activité des oestrogènes ou de la
progestérone.
L'invention est notamment utilisable pour le traitement du cancer du sein ou
de l'utérus.
Un autre objet de la présente demande concerne une méthode pour la sélection,
l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs
modulant, de
préférence diminuant, la prolifération cellulaire comprenant la détermination
de la
capacité d'un composé test à mimer, augmenter ou favoriser la liaison de la
protéine
TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une
ou
de plusieurs hormones stéroïdes ou à moduler l'activité d'un gène cible dudit
récepteur,
notamment du gène p27, p21 ou p16.
La présente invention concerne par ailleurs une méthode pour la sélection,
l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs,
comprenant la
détermination de la capacité d'un composé test à moduler la liaison de la
protéine
TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une
ou
de plusieurs hormones stéroïdes.
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Cette méthode pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou
l'optimisation, in
vitro ou ex vivo, de composés actifs modulant la prolifération cellulaire,
comprend :
a) la mise en contact d'un composé test avec :
i) la protéine TReP-132 ou un complexe comprenant la protéine TReP-
132, et,
ii) le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stérôides, et
b) la mesure de la liaison de la protéine TReP-132 ou du complexe comprenant
la
protéine TReP-132 avec ledit récepteur.
Dans le cadre de l'invention, le récepteur d'une ou de plusieurs hormones
stéroïdes est
en particulier le récepteur de la progestérone (PR) ou le récepteur des
oestrogènes
(ER).
Notamment, l'invention concerne un composé test qui augmente ou favorise la
liaison
de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au
récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes (par exemple le récepteur
de la
progestérone), ou encore un composé test qui diminue ou inhibe la liaison de
la
protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au
récepteur
d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes (par exemple le récepteur des
oestrogènes).
Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique
comprenant,
dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, un composé modulant
la
liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones
stérôides.
La présente demande concerne par ailleurs une méthode pour la sélection,
l'identification, la caractérisation ou l'optimisation, in vitro ou ex vivo,
de composés
actifs modulant, de préférence diminuant, la prolifération cellulaire,
comprenant :
a) la mise en contact, en présence de la progestérone ou d' strogènes, d'un
composé test avec:
i) respectivement, le récepteur de la progestérone ou des
oestrogènes,
ii) Sp1, et
iii) un acide nucléique comprenant tout ou partie du promoteur
d'un gène cible de la progestérone ou des oestrogènes, et
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b) la mesure de la liaison de Sp1 ou du complexe comprenant le récepteur de la
progestérone ou des oestrogènes et Sp1 audit promoteur, ou la mesure de
l'expression
dudit promoteur, ladite mesure étant une indication de l'effet du composé test
sur la
prolifération cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la méthode est mise en
oruvre en
présence de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-
132.
De manière préférée, cette méthode peut être mise en oeuvre dans une cellule.
Dans le cadre de l'invention, les gènes cibles de la progestérone ou des
oestrogènes
sont les gènes p21, p16 et/ou p27.
Un autre aspect de la présente demande concerne une méthode de détection d'une
prédisposition, de diagnostic, de suivi et de mesure de l'agressivité d'une
maladie
proliférative comprenant la détection, chez un patient, de la surexpression de
I'oestradiol, de la diminution de l'expression de la progestérone ou d'une
diminution de
l'expression des CDKIs p21, p16 et/ou p27.
Comme indiqué, l'invention repose sur la mise en évidence de la capacité de la
protéine TReP-132 à agir comme un régulateur du cycle cellulaire, et notamment
à
inhiber la prolifération de cellules cancéreuses, en particulier dans le cadre
des cancers
hormono-dépendants.
Dans le cadre de l'invention, les compositions pharmaceutiques comprennent
notamment les composés augmentant la liaison de la protéine TReP-132 au
récepteur
d'une ou de plusieurs hormones stérôides, dans un excipient acceptable sur le
plan
pharmaceutique.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un composé augmentant, favorisant
ou
facilitant la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de
plusieurs
hormones stérôides pour la préparation d'une composition destinée au
traitement d'une
maladie proliférative.
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Un autre objet particulier de l'invention concerne un procédé de préparation
d'une
composition pharmaceutique destinée au traitement d'une maladie proliférative
comprenant une étape utilisant une méthode telle que décrite précédemment.
5 Un objet particulier de l'invention concerne le traitement de diverses
pathologies
prolifératives, telles que le cancer ou la sténose, de manière avantageuse le
cancer.
L'invention est en particulier utilisable dans le traitement de cancers
hormono-
dépendants, et notamment dans le traitement du cancer du sein ou du cancer de
l'utérus.
Dans le cadre de l'invention, le récepteur à une ou plusieurs hormones
stéroïdes est en
particulier un récepteur de la progestérone ou un récepteur des oestrogènes.
Protéine TReP-132
Dans le contexte de l'invention, l'expression protéine TReP-132 désigne un
polypeptide comprenant la séquence SEQ ID NO : 2, les variants, naturels ou
fonctionnels, les dérivés ou homologues de cette dernière. Il s'agit plus
particulièrement
de tout variant naturel de la séquence SEQ ID NO : 2, résultant d'un
polymorphisme,
d'un épissage, d'une mutation, etc. De tels variants naturels peuvent donc
comprendre
une ou plusieurs modifications telles que des substitutions, insertions et/ou
délétions
d'un ou plusieurs résidus, etc. Le terme homologue désigne par ailleurs les
protéines
TReP-132 d'autres espèces, par exemple de rongeurs, bovins, etc. De
préférence, il
s'agit d'un polypeptide reconnu par un anticorps polyclonal produit à partir
de la
protéine TReP-132 de séquence SEQ ID NO : 2.
De manière générale, le terme protéirie TReP-132 désigne un polypeptide de
séquence
SEQ ID NO : 2.
Des variants préférés comportent au moins 80% de la séquence SEQ ID NO : 2,
plus
préférentiellement au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2. Le
degré
d'identité peut être déterminé par exemple en utilisant la méthode CLUSTAL.
Des
variants particuliers possèdent une mutation ou une substitution affectant 5
acides
aminés au plus de la séquence SEQ ID NO: 2. Des variants fonctionnels
particuliers au
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sens de l'invention sont des variants résultant d'épissage(s). Il s'agit par
exemple des
variants décrits dans GenBank sous les numéros de référence AJ277276 et
AJ277275 .
Des variants fonctionnels particuliers selon l'invention sont des fragments de
la protéine
TReP-132 décrite ci-dessus, notamment des polypeptides comprenant une partie
de la
séquence SEQ ID NO : 2. Les polypeptides fragments de l'invention contiennent
de
préférence moins de 200 acides aminés, plus préférentiellement moins de 150
acides
aminés. Une protéine TReP-132 selon l'invention peut par ailleurs comprendre
des
résidus hétérologues, ajoutés à la séquence d'acides aminés indiquée. Ainsi,
un objet
de l'invention réside dans un polypeptide comprenant tout ou partie de la
séquence
SEQ ID NO : 2 ou un variant naturel de celle ci ou une partie hétérologue. La
partie
hétérologue peut correspondre à des acides aminés, à des lipides, à des
sucres, etc. Il
peut également s'agir de groupe(s) chimique(s), enzymatique(s), radioactif(s),
etc.
L'élément hétérologue peut en particulier être un marqueur, un agent de
ciblage, un
agent stabilisateur, un agent facilitant la production, un agent protecteur,
un agent
facilitant la pénétration de la protéine dans les cellules, une toxine, un
composé actif,
un anticorps, etc.
De manière générale, l'expression protéine TReP-132 désigne un polypeptide
de
SEQ ID NO : 2 ou tout polypeptide codé par un acide nucléique s'hybridant avec
la
séquence SEQ ID NO : 1 ou avec une région de celle-ci (typiquement comprenant
au
moins 50 bases), dans des conditions de stringence modérées ou élevées. Des
conditions de stringence adaptées sont par exemple une incubation à 42 C
pendant 12
heures dans une solution comprenant 50% formamide, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's,
0.1% SDS, (1 X SSPE se compose de 0.15M NaCI, 10 mM NaH2PO4, 1.3 mM EDTA,
pH 7.4). Il est bien entendu possible de faire varier la température et la
salinité du
milieu.
Dans le cadre de l'invention, le terme analogue de la protéine TReP-132
désigne tout
analogue fonctionnel de la protéine TreP-132 Ces analogues fonctionnels sont
des
polypeptides, comprenant éventuellement une partie hétérologue telle que
définie ci-
dessus, ayant au moins une propriété biologique de la protéine TReP-132, en
particulier la capacité de lier une protéine, de préférence un récepteur
hormonal et en
particulier un récepteur de la progestérone ou un récepteur des oestrogènes,
ou encore
la capacité de réguler l'expression des gènes p27, p21 et p16. En particulier,
une
protéine TReP-132 ou un variant selon l'invention comprend au moins un motif
LXXLL.
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12
Dans le cadre de l'invention, le terme <e complexe comprenant la protéine TReP-
132
désigne tout type de complexe dans lequel la protéine TReP-132 est impliquée.
Ce
complexe peut comprendre de nombreux partenaires, tels que des récepteurs
nucléaires, des co-facteurs, etc. qui peuvent avoir des natures et des
fonctions variées.
Parmi les cofacteurs, on peut citer par exemple des facteurs de transcription,
en
particulier p300, Sp1 ou VDR (Vitamin D Receptor). Les récepteurs sont
notamment les
récepteurs nucléaires parmi lesquels on peut citer les récepteurs d'une ou de
plusieurs
hormones stéroïdes, les récepteurs orphelins, les récepteurs PPAR, LXR, RXR,
FXR
ou tout autre récepteur nucléaire. De manière préférée, les récepteurs selon
l'invention
sont impliqués dans la prolifération ou la différenciation cellulaire. Encore
plus
préférentiellement, les récepteurs d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes
sont le
récepteur de la progestérone (PR) et le récepteur des oestrogènes (ER).
Une protéine TReP-132 selon l'invention peut être préparée par toute technique
connue
de l'homme de l'art, notamment par synthèse artificielle et plus
particulièrement par
synthèse en phase solide, ou par toute technique biologique, génétique ou
enzymatique, et notamment par expression dans un hôte cellulaire approprié
d'un acide
nucléique codant ladite protéine.
Une protéine TReP-132 préférée au sens de l'invention est une protéine TReP-
132
humaine dont la séquence est par exemple identique à la séquence SEQ ID NO :
2.
Composé
Un objet de l'invention réside dans une méthode pour la sélection,
l'identification, la
caractérisation ou l'optimisation de composés actifs modulant, de préférence
diminuant,
la prolifération cellulaire, comprenant la détermination de la capacité d'un
composé test
à mimer, augmenter ou favoriser la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un
complexe
comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones
stérôides.
Cette méthode peut comprendre la mise en contact d'un composé test avec la
protéine
TReP-132 ou avec un complexe comprenant la protéine TReP-132, et avec un
récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes ; et la mesure de la
liaison de la
protéine TReP-132 ou du complexe comprenant la protéine TReP-132 avec le
récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.
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L'expression composé augmentant, favorisant ou facilitant la liaison de la
protéine
TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones désigne, au sens de
l'invention, tout composé, agent, facteur, condition ou traitement susceptible
d'augmenter ou de stimuler, dans une cellule, la liaison de la protéine TReP-
132 au
récepteur de l'hormone d'intérêt. Il s'agit d'un ligand de récepteur
nucléaire, de
préférence d'hormones stéroïdes (en particulier la progestérone et les
oestrogènes) ou
d'un analogue de stéroïdes.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé modulant
la liaison
de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes,
en
particulier à un récepteur de la progestérone ou à un récepteur des
oestrogènes, pour
la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie
proliférative.
Selon l'invention, la modulation de la liaison peut consister en une
augmentation ou en
une diminution de la liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de
plusieurs hormones stérôides tels ceux mentionnés ci-dessus.
De manière préférée, l'invention concerne l'utilisation d'un composé
augmentant ou
favorisant la liaison de la protéine TReP-132 ou du complexe comprenant cette
protéine au récepteur de la progestérone et/ou diminuant la liaison de la
protéine
TReP-132 ou du complexe comprenant cette protéine au récepteur des
oestrogènes,
pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie
proliférative
et en particulier d'un cancer hormono-dépendant.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé
augmentant ou
mimant l'activité de la protéine TReP-132 pour la préparation d'une
composition
destinée au traitement d'une maladie proliférative. En particulier,
l'invention est
utilisable dans le traitement de cancers hormono-dépendant, notamment dans la
traitement des cancers sensibles à un dérèglement de la synthèse et/ou de
l'activité de
la progestérone ou des cestrogènes tels que le cancer du sein ou de l'utérus.
Dans un mode préférée de mise en oeuvre de l'invention, la composition est
utilisée en
combinaison avec une hormone pour une administration simultanée, séparée ou
séquentielle.
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L'expression composé augmentant ou mimant l'activité de la protéine TReP-132
désigne au sens de l'invention tout composé, agent, facteur, condition ou
traitement
susceptible d'augmenter, de mimer ou de simuler, dans une cellule, l'activité
de la
protéine TReP-132.
Il s'agit préférentiellement de substances, choisies, par exemple, parmi un
acide
nucléique, un polypeptide, un lipide, une petite molécule, etc. De tels
composés
peuvent être identifiés à l'aide d'une méthode selon l'invention.
Le composé utilisé est préférentiellement un composé qui mime l'activité de la
protéine
TReP-132, stimule l'expression ou le transport nucléaire de la protéine TReP-
132 et/ou
augmente la concentration de la protéine TReP-132 dans les cellules.
Les composés particulièrement préférés sont ceux capables d'augmenter de
manière
sélective l'activité de la protéine TReP-132, c'est-à-dire essentiellement
sans affecter
de manière directe et significative l'activité d'une autre voie métabolique.
Plus précisément, au sens de la présente demande, le terme activité de la
protéine
TReP-132 désigne notamment la synthèse de cette protéine (transcription,
traduction,
etc.), sa maturation, son transport vers le noyau, son interaction avec un
récepteur ou
avec un acide nucléique, son activité transcriptionnelle, sa dégradation, etc.
Le
composé augmentant l'activité de la protéine TReP-132 peut donc être un agent
augmentant la synthèse de la protéine TReP-132, un agent augmentant son
transport,
un agoniste de la protéine TReP-132, un agent mimant l'activité de la protéine
TReP-
132, etc.
Dans un mode particulier de mise en oruvre de l'invention, un composé capable
d'augmenter la synthèse de la protéine TReP-132, c'est-à-dire notamment la
transcription ou la traduction de son gène ou de son ARN est utilisé.
Avantageusement,
il est possible d'utiliser un composé qui augmente l'expression de la protéine
TReP-132
dans une cellule. Un objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un
composé
augmentant l'expression de la protéine TReP-132 pour la préparation d'une
composition destinée au traitement des maladies prolifératives.
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Un tel composé est préférentiellement un acide nucléique codant une protéine
TReP-
132, un composé stimulant le promoteur du gène TReP-132 ou un composé
augmentant la stabilité des ARNm TReP-132.
5 A cet égard, un objet particulier de la présente invention réside dans
l'utilisation d'un
acide nucléique codant une protéine TReP-132 pour la préparation d'une
composition
destinée au traitement d'une maladie proliférative. Un autre objet de
l'invention réside
dans une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique codant la
protéine TReP-132 et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
L'acide nucléique, au sens de l'invention, peut être un ADN ou un ARN, par
exemple un
ADN génomique, complémentaire ou synthétique, un ARN messager, etc. Il s'agit
de
préférence d'un ADNc. Un acide nucléique particulier code pour une protéine de
séquence SEQ ID NO : 2 ou pour un variant naturel ou fonctionnel de celle-ci.
Il s'agit
plus particulièrement de tout acide nucléique codant une protéine TReP-132 et
capable
de s'hybrider avec la séquence SEQ ID NO: 1 ou avec une région de celle-ci
(typiquement comprenant au moins 50 bases), dans des conditions de stringence
modérée ou élevée. Des conditions de stringence adaptées sont par exemple une
incubation à 42 C pendant 12 heures dans une solution comprenant 50%
formamide, 5
X SSPE, 5 X Denhardt's, 0.1% SDS, (1 X SSPE se compose de 0.15M NaCI, 10 mM
NaH2PO4, 1.3 mM EDTA, pH 7.4). Il est bien entendu possible de faire varier la
température et la salinité du milieu. Dans le contexte de l'invention, l'acide
nucléique
peut comprendre éventuellement des régions régulatrices, notamment, une région
promotrice, un poly A, etc. Il est notamment possible d'utiliser des
promoteurs
homologues ou hétérologues, forts ou faibles, régulés, constitutifs ou
inductibles,
spécifiques de tissus ou ubiquitaires, etc. Ils peuvent être d'origines
variées, tels que
des promoteurs viraux, cellulaires, bactériens, artificiels, etc. Des exemples
spécifiques
de promoteurs incluent notamment le promoteur HSV-LTR, CMV, TK, SV40, PGK,
albumine, etc.
L'acide nucléique peut être inséré dans un vecteur, notamment un vecteur
d'expression, comme par exemple un plasmide, un cosmide, un phage, un virus,
un
chromosome artificiel, etc. Il s'agit de préférence d'un vecteur plasmidique
ou dérivé
d'un virus, comme par exemple un rétrovirus, un adénovirus, un AAV, un virus
de
l'herpès, etc. Des virus particulièrement utiles sont des rétrovirus, des
adénovirus ou
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des AAV, dont le génome a été modifié pour comporter une région codant une
protéine
TReP-1 32, et pour être défectif pour la réplication. Les techniques de
production de tels
virus défectifs sont connues de l'homme du métier, et comprennent, par
exemple,
l'introduction d'un vecteur viral recombinant dans une cellule
d'encapsidation,
éventuellement en présence d'un plasmide ou d'un virus helper. Les virus
recombinants
utilisés dans le cadre de l'invention sont avantageusement défectifs pour la
réplication,
c'est-à-dire qu'ils sont essentiellement incapables de réplication autonome
dans une
cellule. Ces virus recombinants présentent donc un génome recombinant dans
lequel
un ou plusieurs gènes viraux (ou régions virales) essentiels à la réplication
ont été
inactivés (e.g., mutés ou délétés, en tout ou partie), comme par exemple les
régions El
ou E4 (pour les adénovirus), Rep ou Cap (pour les AAVs), GAG et/ou POL (pour
les
rétrovirus), etc. Des méthodes de production de rétrovirus recombinants ont
été
décrites par exemple dans W090/02806, US 5,324,645 et W094/19478. Des méthodes
de production d'adénovirus recombinants ont été décrites par exemple dans
W095/02697 et W096/22378.
L'acide nucléique ou le vecteur peut être utilisé dans le cadre de l'invention
pour
augmenter l'expression et donc l'activité de la protéine TReP-132 in vitro, ex
vivo ou
directement in vivo. Il s'agit plus généralement d'une utilisation directe in
vivo, dans les
cellules prolifératives, ou ex vivo, à partir du prélèvement d'un échantillon
ou d'une
biopsie du tissu à traiter, qui est ensuite réinjecté au patient, typiquement
après
irradiation.
Un autre objet particulier de la présente invention réside dans l'utilisation
d'un composé
stimulant le promoteur du gène TReP-1 32 ou augmentant la stabilité des ARNm
TReP-
132 pour la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie
proliférative. Un tel composé permet en effet d'augmenter la quantité de
protéine TReP-
132 présente dans une cellule.
Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique,
caractérisée
en ce qu'elle comprend au moins un composé stimulant le promoteur du gène TReP-
132 et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. Un tel composé peut
être
identifié, validé, ou optimisé par exemple à l'aide d'un procédé comprenant la
détermination de la capacité d'un composé test à lier le promoteur du gène
TReP-132
ou une partie de celui-ci, et/ou à activer ce promoteur. Cette activité peut
être
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déterminée par mesure de l'expression d'un gène placé sous le contrôle du
promoteur
du gène TReP-132.
Selon un autre mode préféré de mise en ceuvre, on utilise dans le cadre de
l'invention
un ou plusieurs composés capables d'augmenter, d'induire ou de stimuler la
maturation, la stabilité ou l'activité de la protéine TReP-132 dans une
cellule. Un objet
de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un composé augmentant la
maturation, la
stabilité ou l'activité de la protéine TReP-132 pour la préparation d'une
composition
destinée au traitement d'une maladie proliférative. La protéine TreP-132 et
les
analogues de cette dernière sont des exemples de composés susceptibles d'être
utilisés.
Selon un mode préféré de mise en oruvre de l'invention, il est en effet
possible d'utiliser
directement la protéine TReP-132, typiquement produite par voie recombinante
in vitro,
afin d'augmenter l'activité anti-proliférative. La protéine TReP-132 peut être
fabriquée in
vitro par expression d'un acide nucléique recombinant dans tout système
cellulaire
approprié, et récupération de la protéine fabriquée. On peut citer notamment
une
bactérie (e.g., E. coli), une levure (e.g., Saccharomyces, Kluyveromyces), une
cellule
eucaryote, notamment humaine (fibroblaste, hépatocyte, etc.).
Selon un autre mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, le composé
capable
d'augmenter l'activité transcriptionnelle de la protéine TReP-1 32 est
représenté par tout
composé augmentant la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe
comprenant
la protéine TReP-132 au promoteur d'un gène cible de la protéine TReP-132. On
entend par gène cible de la protéine TReP-132 tout gène dont la transcription
est
régulée par la protéine TReP-132, notamment les gènes p27, p21 et p16. La
présente
demande montre en effet que la protéine TReP-132 est capable de stimuler
l'expression des gènes p27, p21 et p16. La présente invention met donc en
évidence
une nouvelle voie et de nouvelles cibles moléculaires, utilisables dans le
cadre
d'approches thérapeutiques efficaces.
Un objet de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un composé augmentant
la liaison
de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au
promoteur d'un gène cible de la protéine TReP-132 pour la préparation d'une
composition pharmaceutique destinée au traitement d'une maladie proliférative.
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Dans un mode préféré de mise en oruvre de l'invention, on utilise un composé
qui
augmente l'activité du promoteur d'un gène cible de la protéine TReP-132.
Dans le cadre de l'invention, les gènes cibles de la protéine TReP-132 sont
notamment
les gènes codant pour p21, p27 ou p16. Un tel composé peut être sélectionné,
validé
ou optimisé selon différentes approches, et notamment au moyen d'un test de
liaison
ou d'un test transcriptionnel utilisant un gène rapporteur placé sous le
contrôle d'un
promoteur ayant la séquence de tout ou partie du promoteur du gène p27, p21 ou
p16.
Un tel composé peut être un peptide dérivé de la protéine TReP-132, un
anticorps, une
petite molécule, etc.
Bien que toute approche permettant d'augmenter ou de mimer l'activité de la
protéine
TReP-132 soit utilisable dans le cadre de la présente invention, on préfère
tout
particulièrement les stratégies, molécules et conditions permettant
d'augmenter la
synthèse de la protéine TReP-132, notamment l'emploi d'un acide nucléique
codant la
protéine TReP-132. A cet égard, un objet particulier de l'invention réside
dans
l'utilisation d'un acide nucléique codant la protéine TReP-132 pour la
préparation d'une
composition destinée au traitement d'une maladie proliférative.
Un autre objet particulier de l'invention réside dans l'utilisation d'un
composé modulant
la formation ou l'activité du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et
un
récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, e.g., un récepteur de la
progestérone ou un récepteur des oestrogènes, pour la préparation d'une
composition
destinée au traitement d'une maladie proliférative, en particulier d'un cancer
hormono-
dépendant.
Préférentiellement, le composé test module l'interaction de la protéine TReP-
132, de
Sp1 et d'un récepteur d'une ou de plusieurs hormones (en particulier
stérôides, e.g., un
récepteur de la progestérone ou un récepteurs des oestrogènes), module la
liaison du
complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et un tel récepteur aux
promoteurs
de gènes cibles de TReP-132 ou module l'action du complexe comprenant la
protéine
TReP-132, Sp1 et un récepteur tel que décrit ci-dessus sur le promoteur d'un
gène
cible.
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Dans le cadre de l'invention, les gènes cibles sont en particulier les gènes
p21, p27
et/ou p16.
L'invention peut être mise en oruvre dans le traitement d'une maladie
proliférative, telle
que le cancer. Préférentiellement, l'invention est utilisée pour traiter les
cancers
hormono-dépendants, en particulier les cancers sensibles à un dérèglement de
la
synthèse et/ou de l'activité de la progestérone ou de l'cestradiol, encore
plus
préférentiellement, le cancer du sein ou de l'utérus.
Utilisation des composés :
Compte tenu des propriétés fonctionnelles physiologiques de la cible utilisée,
les
composés selon l'invention peuvent être utilisés dans le cadre du traitement
d'une
maladie proliférative et notamment dans le traitement d'un cancer. Les
composés selon
l'invention sont en particulier les composés capables de mimer ou d'augmenter
l'activité
de la protéine TReP-132, les composés capables de moduler la liaison de la
protéine
TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une
ou
de plusieurs hormones stéroïdes, e.g., un récepteur de la progestérone ou un
récepteur
des oestrogènes, ou les composés capables de moduler la formation ou
l'activité du
complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et le récepteur d'une ou de
plusieurs
hormones stéroïdes, e.g., un récepteur de la progestérone ou un récepteur des
oestrogènes. Les composés selon l'invention sont notamment les composés
identifiés à
l'aide d'une méthode telle que décrite précédemment.
Dans le contexte de l'invention, le terme traitement désigne le traitement
préventif,
curatif, palliatif, ainsi que la prise en charge des patients (réduction de la
souffrance,
amélioration de la durée de vie, amélioration de la qualité de vie,
ralentissement de la
progression de la maladie, réduction de la taille d'une tumeur), etc. Le
traitement peut
en outre être réalisé en combinaison avec d'autres agents ou traitements,
notamment
adressant des voies métaboliques distinctes. Il peut aussi être combiné à des
traitements d'hormono-, de chimio- ou de radio-thérapie, par exemple. Un
traitement
combiné particulier comporte l'utilisation séquentielle, simultanée ou séparée
d'un
composé augmentant ou mimant l'activité de la protéine TReP-132 et d'une
hormone.
Un autre traitement combiné particulier comporte l'utilisation séquentielle,
simultanée
ou séparée d'un composé stimulant la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un
complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs
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hormones stéroïdes, e.g., au récepteur de la progestérone ou au récepteur des
oestrogènes et d'une hormone.
Un objet particulier de l'invention concerne ainsi l'utilisation d'une
composition selon
5 l'invention destinée au traitement d'une maladie proliférative en
combinaison avec une
hormone pour une administration simultanée, séparée ou séquentielle.
L'invention est utilisable pour le traitement de maladies prolifératives
affectant les
mammifères, et l'homme en particulier. Les résultats fournis dans les exemples
10 démontrent la capacité de la protéine TReP-132 à inhiber la prolifération
cellulaire,
notamment celle des cellules tumorales, et à bloquer la progression du cycle
cellulaire.
On entend par maladie proliférative au sens de l'invention toute pathologie
caractérisée
par ou associée à une dérégulation du cycle cellulaire et/ou à une
prolifération
15 incontrôlée ou pathologique de cellules. Des exemples typiques de telles
pathologies
sont notamment les cancers, la sténose, la fibrose, le psoriasis, etc.
L'invention est
particulièrement adaptée au traitement du cancer, et notamment des tumeurs
solides,
primaires ou métastasées. On peut citer notamment les cancers du poumon, du
foie, du
colon, les cancers tête-et-cou, du cerveau, de la vessie, de la rate, de la
peau, du sein,
20 de la prostate, de l'utérus, du thymus, etc. Il s'agit en particulier des
cancers hormono-
dépendants et en particulier des cancers typiquement féminins que sont les
cancers du
sein et de l'utérus.
Un objet de l'invention réside dans l'utilisation d'un composé tel que défini
ci avant pour
la préparation d'une composition destinée au traitement d'une maladie
proliférative,
notamment pour le traitement d'un cancer. L'invention fournit également des
méthodes
de traitement des maladies prolifératives basées sur l'utilisation de composés
définis ci
avant.
L'invention concerne notamment l'utilisation d'un composé tel que défini ci
avant pour
réduire la prolifération de cellules tumorales chez un patient, ainsi qu'une
méthode
correspondante.
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L'invention concerne aussi l'utilisation d'un composé tel que défini ci avant
pour réduire
la progression d'une tumeur, ou pour induire une régression de la taille d'une
tumeur
chez un patient, ainsi qu'une méthode correspondante.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un composé tel que défini ci-avant
pour
induire l'apoptose de cellules tumorales chez un patient, ainsi qu'une méthode
correspondante.
Tests de Criblage
L'invention concerne des méthodes pour la sélection, l'identification, la
caractérisation
ou l'optimisation de composés actifs modulant, de préférence diminuant, la
prolifération
cellulaire, basées sur la mesure de la modulation de la liaison ou de
l'activité de la
protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant TReP-132 à un récepteur hormonal
ou à un gène cible, la mesure de la modulation de la liaison ou de l'activité
du complexe
comprenant la protéine TReP-132 et un récepteur hormonal sur le promoteur d'un
gène
cible ou la mesure de la modulation de la liaison du complexe comprenant la
protéine
TReP-132, un récepteur hormonal (par exemple un récepteur de la progestérone
ou
des oestrogènes) et son hormone ainsi que le facteur de transcription Sp1 au
promoteur d'un gène cible.
L'invention concerne en particulier des méthodes pour la sélection,
l'identification, la
caractérisation ou l'optimisation de composés actifs modulant la prolifération
cellulaire,
comprenant la détermination de la capacité d'un composé test à moduler, i.e.,
mimer,
augmenter ou favoriser la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un complexe
comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones
stéroïdes, e.g., au récepteur de la progestérone ou au récepteur des
oestrogènes, ledit
récepteur étant éventuellement complexé au facteur de transcription Sp1.
A cet égard, les tests de criblage selon l'invention reposent, d'une manière
générale,
sur la sélection de composés capables d'augmenter ou de favoriser la liaison
de la
protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au
récepteur
d'une ou de plusieurs hormones stérôides ou encore de diminuer ou d'inhiber la
liaison
de la protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au
récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.
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Un autre objet de l'invention concerne des méthodes pour la sélection,
l'identification, la
caractérisation ou l'optimisation de composés actifs, comprenant la
détermination de la
capacité d'un composé test à moduler l'action de la protéine TReP-132 sur le
promoteur d'un gène cible de la protéine TReP-132.
Les tests de criblage selon l'invention reposent, d'une manière générale, sur
la
sélection de composés capables de moduler l'expression de gènes cibles de la
protéine
TReP-132 (Criblage d'expression) ou sur la sélection de composés capables de
moduler la liaison de la protéine TReP-132 sur l'un ou plusieurs de ses gènes
cibles
(test de liaison), c'est-à-dire de gènes dont l'expression est régulée par
cette protéine.
L'invention concerne aussi un test de criblage de composés modulant la
formation ou
l'activité. du complexe comprenant un récepteur d'une ou de plusieurs hormones
stéroïdes telles que la progestérone ou les oestrogènes et éventuellement la
protéine
TReP-132 et/ou le facteur de transcription Sp1. A cet égard, les tests de
criblage selon
l'invention reposent sur la sélection de composés capables de moduler
l'expression
d'un ou de plusieurs gènes cibles du complexe comprenant un récepteur d'une ou
de
plusieurs hormones stéroïdes, et éventuellement la protéine TReP-132 et/ou le
facteur
de transcription Sp1.
Dans le cadre de l'invention, les gènes cibles de la protéine TReP-132 sont en
particulier les gènes p21, p27 et p16.
Un autre aspect de l'invention concerne des méthodes pour la sélection,
l'identification,
la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs, comprenant la mesure
de
l'expression d'un gène rapporteur placé sous le contrôle de tout ou partie de
la
séquence du promoteur du gène TReP-132, en présence d'un composé test.
Plus particulièrement, l'invention fournit des méthodes de criblage destinées
à
sélectionner, identifier ou caractériser des composés biologiquement actifs ou
des
méthodes utilisables pour la validation, caractérisation, optimisation ou
production des
composés.
Les méthodes selon l'invention peuvent être mises en oeuvre de différentes
façons, en
tests in vitro, cellulaires ou acellulaires, ou in vivo.
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A - Méthodes basées sur un test de liaison
Un objet de l'invention réside dans une méthode pour la sélection,
l'identification, la
caractérisation ou l'optimisation de composés actifs, comprenant la
détermination de la
capacité d'un composé test à moduler la liaison de la protéine TReP-132 ou
d'un
complexe comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs
hormones stérôides.
Préférentiellement, la méthode comprend la détermination de la capacité d'un
composé
test à diminuer ou à inhiber la liaison de la protéine TReP-132 ou d'un
complexe
comprenant la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones
stérôides. Encore plus préférentiellement, la méthode comprend la
détermination de la
capacité d'un composé test à mimer, à augmenter ou à favoriser la liaison de
la
protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au
récepteur
d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.
Un objet de l'invention concerne, dans ce mode de réalisation des méthodes
pour la
sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés
actifs
modulant la prolifération cellulaire, comprenant :
a) la mise en contact d'un composé test avec :
i) la protéine TReP-132 ou un complexe comprenant la protéine TReP-132, et
ii) le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, et
b) la mesure de la liaison de la protéine TReP-132 ou du complexe comprenant
la
protéine TReP-1 32 avec ledit récepteur.
Dans le cadre de l'invention, le récepteur des hormones stérôides est un
récepteur des
oestrogènes (ER) ou un récepteur de la progestérone (PR), préférentiellement,
le
récepteur de la progestérone (PR).
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour la sélection,
l'identification, la
caractérisation ou l'optimisation, in vitro ou ex vivo, de composés actifs
diminuant la
prolifération cellulaire, comprenant :
a) la mise en contact, en présence de la progestérone ou d'orstrogènes, d'un
composé test avec :
i) respectivement le récepteur de la progestérone ou des oestrogènes ,
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ii) Sp1, et
iii) un acide nucléique comprenant tout ou partie du promoteur d'un gène cible
de la
progestérone ou des oestrogènes, et
b) la mesure de la liaison de Sp1 ou du complexe comprenant le récepteur de la
progestérone ou des oestrogènes et Sp1 audit promoteur, ou la mesure de
l'expression dudit promoteur, ladite mesure étant une indication de l'effet du
composé test sur la prolifération cellulaire.
La mise en contact est éventuellement réalisée en présence de la protéine TReP-
132
ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132. Préférentiellement, la mise
en
contact est réalisée dans une cellule.
Comme indiqué ci-dessus, le gène cible des hormones stéroïdes est
avantageusement
choisi parmi les gènes p21, p16 et/ou p27.
Un autre objet de l'invention comprend une méthode pour la sélection,
l'identification, la
caractérisation ou l'optimisation de composés actifs comprenant la
détermination de la
capacité d'un composé test à moduler la liaison de la protéine TReP-132 ou
d'un
complexe comprenant la protéine TReP-132 sur le promoteur des gènes cibles de
la
protéine TReP-132, notamment des gènes p27, p21 et p16.
Dans un autre mode de réalisation, la méthode comprend :
a) la mise en contact du composé test en présence de TReP-132 avec une
construction d'acide nucléique comprenant une séquence de tout ou partie d'un
promoteur du gène p21, p27 ou p16 ou d'une région de celui ci comprenant le
site de
liaison de la protéine TReP-132 ou d'un élément de réponse de la protéine TReP-
132
et,
b) la détermination de la liaison dudit composé test sur l'acide nucléique
cible et/ou sur
le complexe formé par la liaison de TReP-132 à son ou ses éléments de réponse
ou
sites de fixation.
Pour la mise en oeuvre du test de liaison, il est possible d'utiliser un acide
nucléique
comprenant tout ou partie de la séquence du promoteur, et de déterminer in
vitro la
capacité d'un composé test à lier celle-ci. La partie de la séquence comporte
de
préférence au moins 10 nucléotides consécutifs de la séquence du promoteur,
encore
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plus préférentiellement au moins 20 nucléotides consécutifs de la séquence du
promoteur. Par ailleurs, il est possible de tester en parallèle plusieurs
fragments de la
séquence du promoteur.
5 La capacité dudit composé test à moduler la liaison de TReP-132 au récepteur
d'une
ou de plusieurs hormones stéroïdes ou à l'élément de réponse d'un gène cible
de la
protéine TReP-132 peut être mesurée en déterminant la quantité de TReP-132
liée en
présence du composé test par rapport à cette quantité en l'absence du composé
test
ou en effectuant la réaction en présence de la protéine TReP-132 marquée et en
10 mesurant le déplacement de la liaison de la protéine marquée par le composé
test.
Ces tests peuvent être réalisés in vitro, dans tout dispositif approprié
(tube, boite,
flasque, etc.). Ils peuvent éventuellement être réalisés avec l'un des
partenaires
immobilisé, par exemple l'acide nucléique (colonne, bille, support, verre,
filtre,
15 membrane, etc.).
La liaison du composé test dans le cadre des méthodes selon l'invention peut
être mise
en évidence grâce à une migration sur gel, une électrophorèse ainsi que par
d'autres
méthodes basées sur la luminescence ou utilisant la technique FRET
(Fluorescence
20 Resonance Energy Transfer) ou la technique SPA (Scientillation Proximity
Assay), ou
par toute autre technique connue de l'homme du métier.
B - Méthodes basées sur un criblacge d'expression
25 Un autre objet de l'invention est basé sur l'activité transcriptionnelle de
la protéine
TReP-1 32 (test d'activité transcriptionnelle).
Selon un premier mode préféré de réalisation de l'invention, la méthode pour
la
sélection, l'identification ou l'optimisation de composés actifs comprend :
a) La mise en contact d'un composé test avec un acide nucléique rapporteur
comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur comprenant
tout
ou partie de la séquence du promoteur du gène codant pour la protéine TReP-132
et,
b) La mesure de l'expression du gène rapporteur.
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Un autre objet de l'invention comprend la détermination de la capacité d'un
composé
test à moduler l'expression d'un ou de plusieurs gènes cibles de la protéine
TReP-132,
notamment des gènes p21, p16 et/ou p27.
Dans ce mode de réalisation, la méthode comprend :
a) la mise en contact d'un composé test, en présence de la protéine TReP-132,
avec un acide nucléique rapporteur comprenant un gène rapporteur placé sous le
contrôle d'un promoteur comprenant tout ou une partie de la séquence du
promoteur du
gène p21, p16 ou p27 ou du site de liaison de la protéine TReP-132 ou d'un
élément de
réponse de la protéine TReP-132 et,
b) la détermination de l'effet du composé test sur l'expression du gène
rapporteur.
Selon un mode d'exécution particulier des méthodes selon l'invention, les
effets
éventuels obtenus sont comparés avec les effets éventuels déterminés grâce à
une
méthode réalisée dans les mêmes conditions mais avec une construction d'acide
nucléique comprenant au moins un variant inactif (par exemple une copie mutée)
de la
séquence du promoteur du gène p27, p21 ou p16 ou d'une région de celui-ci
comprenant le site de liaison de la protéine TReP-132 ou un élément de réponse
de
TReP-1 32.
Des études ont démontré la capacité de TReP-132 d'interagir directement avec
l'ADN
pour réguler l'activité de promoteurs. Par ailleurs, il a également été montré
que TReP-
132 interagit avec d'autres protéines liant l'ADN pour réguler la
transcription. Ainsi,
TReP-132 peut fonctionner comme co-régulateur de récepteurs nucléaires tels
que SF-
1 pour réguler l'expression de gènes. De ce fait, TReP-132 peut aussi réguler
l'activité
de promoteurs sans interagir avec l'ADN.
Compte tenu de la capacité de TReP-132 à fonctionner comme co-régulateur de
récepteurs nucléaires, la protéine entière ou des fragments de celle-ci
peuvent être
utilisés dans un test de recrutement de protéines nécessitant la présence d'un
ligand
ainsi que pour le criblage de ligands de récepteurs nucléaires partenaires. La
protéine
d'un récepteur nucléaire X peut être incubée avec la protéine TReP-132 entière
ou
avec des fragments de celle-ci, afin de permettre le recrutement du
polypeptide TReP-
132 par le récepteur nucléaire, en présence du ligand. Selon le type de
marquage du
récepteur nucléaire et du polypeptide TReP-132, il est possible de mesurer
l'interaction
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protéine-protéine ou le recrutement de protéine par différentes techniques,
incluant la
fluorescence, le comptage de scintillation radioactive ou la calorimétrie. Les
composés
isolés peuvent conduire à une augmentation ou à une diminution du recrutement
de
TReP-132 dans le mécanisme d'expression du gène. En utilisant ces approches,
il est
possible de cribler des composés se liant à des récepteurs nucléaires qui
affectent
l'expression de gènes cibles régulés par TReP-1 32.
Un objet particulier de l'invention concerne une méthode pour la sélection,
l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs
comprenant la
détermination de la capacité d'un composé test à moduler l'activité du
complexe
constitué d'au moins la protéine TReP-132 et d'un récepteur à une ou plusieurs
hormones stéroïdes.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour la sélection,
l'identification, la
caractérisation ou l'optimisation de composés actifs comprenant la
détermination de la
capacité d'un composé test à moduler l'expression de gènes cibles du complexe
comprenant la protéine TReP-132 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones
stéroïdes.
Dans le cadre de ce mode de réalisation particulier de l'invention, la méthode
comprend :
a) la mise en contact du composé test avec la protéine TReP-132 et un acide
nucléique rapporteur comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un
promoteur comprenant la séquence du promoteur d'un gène cible du complexe
comprenant la protéine TReP-132 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones
stéroïdes, ou une région dudit promoteur comprenant le site de liaison du
complexe ou
un élément de réponse du complexe et,
b) la mesure de l'expression dudit gène rapporteur.
Dans le cadre de l'invention, le récepteur d'une ou de plusieurs hormones
stéroïdes est
un récepteur des oestrogènes (ER) ou un récepteur de la progestérone (PR).
Les gènes cibles de la protéine TReP-1 32 sont notamment les gènes codant pour
p27,
p21 ou p16.
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Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour la sélection,
l'identification, la
caractérisation ou l'optimisation, in vitro ou ex vivo, de composés actifs
diminuant la
prolifération cellulaire, comprenant :
a) la mise en contact, en présence de la progestérone ou d'cestrogènes, d'un
composé
test avec :
i) respectivement le récepteur de la progestérone ou aux oestrogènes ,
ii) Sp1, et
iii) un acide nucléique comprenant tout ou partie du promoteur d'un gène cible
de
la progestérone ou des oestrogènes, et
b) la mesure de la liaison de Sp1 ou du complexe comprenant le récepteur de la
progestérone ou des oestrogènes et Sp1 audit promoteur, ou la mesure de
l'expression
dudit promoteur, ladite mesure étant une indication de l'effet du composé test
sur la
prolifération cellulaire.
Les procédés de l'invention peuvent être mis en oeuvre avec différents types
de
cellules, de promoteurs, de gènes rapporteurs, et dans différentes conditions,
comme il
est décrit ci-après.
Cellule hôte :
Certaines méthodes de criblage, utilisées dans le cadre de la présente
invention,
comprennent une étape de mise en contact du composé test avec une cellule
hôte,
dans des conditions particulières permettant de déterminer l'expression dans
ladite
cellule d'un gène rapporteur ou de la protéine TReP-132, de mettre
éventuellement en
évidence d'autres étapes de la synthèse de la protéine TReP-132, et d'obtenir
ainsi une
information concernant l'effet du composé test. Classiquement, l'effet du
composé test
est comparé au niveau d'expression du gène rapporteur ou à l'activité du
produit
d'expression déterminés en l'absence dudit composé.
Les cellules utilisées peuvent être choisies parmi toutes les cellules
cultivables en
laboratoire. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, il s'agit de
cellules de
mammifères (hépatocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, musculaires,
glandes
mammaires, etc.). De manière encore plus préférée, ces cellules sont d'origine
humaine. Il peut s'agir de cultures primaires ou de lignées établies. Dans un
autre
mode de mise en oeuvre, il est possible également d'utiliser des cellules
procaryotes
(bactéries), des cellules de levure (Saccharomyces, Kluyveromyces, etc.), des
cellules
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végétales, etc.
Système rapporteur :
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, cette dernière met en
oruvre un
système rapporteur comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un
promoteur particulier. Cette construction, ou toute cassette ou vecteur la
contenant,
peut être introduite dans des cellules hôtes, utilisables pour des tests
cellulaires.
Pour la mise en oeuvre du test transcriptionnel, un système rapporteur
comprenant tout
ou partie du promoteur du gène cible lié de manière opérationnelle à un gène
rapporteur est avantageusement utilisé.
Ledit gène rapporteur peut être notamment tout gène dont le produit de
transcription ou
d'expression peut être détecté ou dosé dans des extraits biologiques. Il peut
s'agir, par
exemple, du gène codant pour la luciférase et plus particulièrement pour la
luciférase
de luciole ou pour celle de Renilla, pour la phosphatase alcaline sécrétée, la
galactosidase, la lactamase, la Chloramphénicol acétyle transférase (CAT),
l'hormone
de croissance humaine (hGH), la P-glucuronidase (Gluc) et la Green fluorescent
protein
(GFP) etc. Il est entendu que le terme gène désigne au sens large tout
acide
nucléique, notamment un ADNc, un ADNg, un ADN synthétique, un ARN, etc.
Le gène rapporteur, quel qu'il soit, est placé sous le contrôle d'un promoteur
comprenant tout ou partie de la séquence du promoteur d'un gène cible de la
protéine
TReP-132 ou du complexe comprenant la protéine TReP-132 et un récepteur d'une
ou
de plusieurs hormones stérôides, du promoteur du gène codant pour la protéine
TReP-
132, du promoteur du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et un
récepteur
d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes ou d'un variant fonctionnel de celle-
ci, tel
que défini ci-avant. Préférentiellement, il s'agit d'un promoteur dont le
différentiel
d'activité en présence et en l'absence de TReP-132 ou d'un équivalent
fonctionnel de
ce dernier peut être détecté.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, le gène rapporteur est
placé
sous le contrôle d'un promoteur qui comprend la séquence complète du promoteur
d'un
gène cible de la protéine TReP-132, d'un gène cible du complexe comprenant la
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protéine TReP-132 et un récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes, du
promoteur du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et un récepteur
d'une
ou de plusieurs hormones stéroïdes ou du promoteur du gène codant la protéine
TReP-
132. A cet égard, un objet de l'invention concerne également un acide
nucléique
5 comprenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur
comprenant tout
ou partie de la séquence du promoteur du gène p27, p21 ou p16, notamment du
promoteur humain. La partie éventuellement sélectionnée de la séquence du
promoteur
comprend avantageusement au moins 10 nucléotides consécutifs de cette
séquence,
de préférence au moins 20, plus préférentiellement au moins 30, encore plus
10 préférentiellement au moins 50. Le promoteur peut comprendre en outre des
régions
hétérologues, provenant d'autres gènes ou promoteurs, comme par exemple des
signaux silencers ou enhancers, des séquences conférant un caractère régulable
ou
spécifique de tissu, etc. Ces séquences particulières peuvent être présentes à
raison
d'une ou de plusieurs copies dans le promoteur (préférentiellement 1 à 10 et
encore
15 plus préférentiellement 1 à 6), en amont, en aval ou en interne, dans la
même
orientation ou dans l'orientation opposée. Le promoteur peut être un promoteur
hybride
associant des régions d'autres promoteurs, par exemple du promoteur du gène de
la
thymidine kinase (TK) du virus de l'herpès, du promoteur immédiat du CMV, du
promoteur PGK, du promoteur SV40, etc.
20 En outre, les différents domaines fonctionnels mentionnés ci-dessus peuvent
être liées
directement les uns aux autres, ou séparés par des nucléotides n'affectant pas
significativement le caractère fonctionnel de la cassette d'expression ou
conférant des
caractéristiques ou performances améliorées au système (amplificateur,
silencer,
intron, site d'épissage, etc.).
La construction peut être introduite dans tout vecteur approprié, tel qu'un
plasmide, un
cosmide, un phage, un virus, etc. La construction ou le vecteur peut être
introduit dans
une cellule hôte par tôute méthode classique, incluant notamment
l'électroporation, la
précipitation au phosphate de calcium, les liposomes, les agents
transfectants, etc. Les
cellules ou leur descendance peuvent être cultivées dans tout milieu approprié
(DMEM,
RPMI, etc.).
Mise en contact :
Les composés tests peuvent être mis au contact des cellules à différents
moments,
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selon leur(s) effet(s), leur concentration, la nature des cellules et
l'appréciation
technique.
Le contact peut être effectué sur tout support approprié et notamment sur une
plaque,
une boîte, dans un tube ou une flasque. Généralement, la mise en contact est
réalisée
sur une plaque multi-puits ce qui permet de conduire, en parallèle, des essais
nombreux et variés. Parmi les supports typiques on trouve des plaques de
microtitration
et plus particulièrement des plaques 96 ou 384 puits (ou plus), faciles à
manipuler.
Selon le support et la nature du composé test, des quantités variables de
cellules
peuvent être utilisées lors de la mise en oruvre des méthodes décrites. De
manière
classique, entre 103 et 106 cellules sont mises en contact avec un composé
test
particulier, dans un milieu de culture approprié, et de manière préférentielle
entre 104 et
105 cellules. A titre d'exemple : dans une plaque de 96 puits, 105 cellules
peuvent être
incubées dans chaque puit avec une quantité voulue d'un composé test ; dans
une
plaque à 384 puits, moins de 105 cellules et typiquement entre 1x104 et 4x104
cellules
sont généralement incubées dans chaque puit avec le composé test.
La quantité (ou la concentration) de composé test peut être ajustée par
l'utilisateur en
fonction des caractéristiques dudit composé (sa toxicité, sa capacité de
pénétration
cellulaire, etc.), du nombre de cellules, de la longueur de la période
d'incubation, etc.
Généralement, les cellules sont exposées à des quantités de composés test qui
varient
entre 1 nM et 1 mM. Il est bien sûr possible de tester d'autres concentrations
sans dévier
de la présente invention. Chaque composé peut de plus être testé en parallèle
à
différentes concentrations.
Différents adjuvants et/ou vecteurs et/ou produits facilitant la pénétration
des composés
dans les cellules tels que des liposomes, des lipides cationiques ou des
polymères
peuvent en outre être utilisés, si nécessaire.
Le contact est typiquement maintenu entre quelques minutes et plusieurs
heures,
généralement entre 1 et 48 heures. En particulier, lorsque le test comprend
l'expression
d'un gène rapporteur, les cellules et les divers réactifs doivent, de
préférence, rester en
contact suffisamment longtemps pour permettre la synthèse de novo du produit
d'expression du gène rapporteur.
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Mesure de l'effet :
La mesure ou la mise en évidence d'un effet du composé test peut être réalisée
de
différentes façons, selon le test utilisé.
Des méthodes de détection de la liaison in vitro ont été mentionnées ci-avant.
Les tests d'activité transcriptionnelle comprennent une étape de détermination
et de
détection de l'expression du gène rapporteur.
Il peut s'agir d'une détermination de l'activité transcriptionnelle. A cette
fin, l'ARN total
est extrait des cellules en culture dans des conditions expérimentales d'une
part et
dans une situation témoin d'autre part. Cet ARN est dosé (ou utilisé comme
sonde)
pour analyser les changements dans l'expression du ou des gène(s)
rapporteur(s).
Il peut également s'agir d'une révélation ou d'un dosage du produit
d'expression du
gène rapporteur. Cette révélation (ou ce dosage) peut être obtenue à l'aide de
techniques variées dont la nature dépend du type de gène rapporteur utilisé.
La mesure
peut, par exemple, correspondre à une densité optique ou à une émission
fluorescente
dans le cas d'une utilisation comme gène rapporteur du gène codant pour la
galactosidase ou la luciférase.
L'expression du gène rapporteur peut encore être mesurée à travers le niveau
d'hydrolyse d'un substrat du produit d'expression du gène rapporteur, comme
par
exemple un substrat de la P-lactamase. On peut citer notamment tout produit
contenant
un noyau (3-lactame et dont l'hydrolyse peut être contrôlée. Les substrats
préférés sont
ceux spécifiques de la P-lactamase (i.e., ils ne sont généralement pas
hydrolysés dans
les cellules de mammifères en l'absence de (3-lactamase), ceux qui ne sont pas
toxiques à l'égard des cellules de mammifères et/ou dont le produit
d'hydrolyse peut
être contrôlé facilement, par exemple par des méthodes basées sur la
fluorescence, la
radioactivité, une activité enzymatique ou toute autre méthode de détection.
Des substrats encore plus préférés sont les substrats radiométriques.
L'hydrolyse de
ces substrats peut être directement corrélée à l'activité du produit
d'expression du gène
rapporteur par le nombre de cellules.
Le produit d'expression peut également être dosé par des techniques
immunologiques
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ou immunoenzymatiques, impliquant par exemple un anticorps spécifique. Ce
système
est particulièrement adapté pour doser par exemple la protéine TReP-132
synthétisée
par une cellule traitée ou non traitée par un composé test.
D'une manière générale, la présence du produit du gène rapporteur (ou du
produit
d'hydrolyse du substrat) peut être déterminée par des méthodes classiques
connues de
l'homme du métier [fluorescence, radioactivité, D.O., luminescence, FRET (voir
WO
0037077), SPA, biopuces, méthodes immunologiques, etc.]. Généralement, on
détermine l'activité d'un composé test dans une cellule et cet effet est
comparé au
niveau d'activité en l'absence de composé test ou à une valeur moyenne
déterminée en
l'absence de tout composé test.
La mesure de l'hydrolyse implique essentiellement une mesure (ou la
détermination de
la quantité relative) du produit d'hydrolyse contenu dans chaque échantillon
réactionnel
grâce à différentes techniques connues de l'homme du métier, incluant la
détection
d'une fluorescence, d'une radioactivité, d'une couleur, d'une activité
enzymatique, d'un
complexe immun antigène-anticorps.
Un test secondaire permettant de valider la sélection des composés peut être
réalisé,
par exemple par la détermination de la prolifération cellulaire en culture ou
chez
l'animal, ou par comparaison avec des cellules ou animaux non traités.
La présente invention est particulièrement adaptée à la sélection,
l'identification ou la
caractérisation d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et
efficace peut
être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en
particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage
efficace et
simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous
forme séparée.
Les méthodes décrites précédemment pour la sélection, l'identification et la
caractérisation de composés test selon l'invention peuvent être utilisés pour
la
sélection, l'identification et la caractérisation de composés capables
d'inhiber la
prolifération cellulaire et/ou de réguler le cycle cellulaire.
D'autres objets de l'invention concernent une méthode de détection d'une
prédisposition, une méthode de diagnostic, une méthode de suivi et de mesure
de
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l'agressivité d'une maladie proliférative comprenant la mesure de la liaison
de la
protéine TReP-132 à une ou à plusieurs hormones stéroïdes dans un échantillon
prélevé sur un mammifère, en particulier chez l'homme. Comme indiqué
précédemment, le récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes est
préférentiellement un récepteur de la progestérone (PR) ou un récepteur des
oestrogènes (ER).
Les méthodes mentionnées ci-dessus peuvent comprendre ou impliquer uniquement
le
dosage de la protéine TReP-1 32.
Un objet particulier de l'invention concerne par ailleurs une méthode de
détection d'une
prédisposition, de diagnostic, de suivi et de mesure de l'agressivité d'une
maladie
proliférative comprenant la détection, chez un patient, de la surexpression de
l'cestradiol, de la diminution de la progestérone ou d'une diminution de
l'expression des
CDKIs p21, p16 et/ou p27.
Composés test.
Les composés susceptibles d'être identifiés à l'aide d'un procédé selon
l'invention
peuvent être des composés de nature, structure et origine variées, notamment
des
composés biologiques, des facteurs nucléaires, des cofacteurs, des composés
chimiques, synthétiques, etc.
La présente invention peut donc être appliquée à tout type de composé test.
Ainsi, le
composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou
en,
mélange avec d'autres produits. Le composé peut être défini en termes de
structure
et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé peut,
par
exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de
structure
indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition
indéfinie
comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi
être
testés, en mélange ou de manière séparée. De telles compositions indéfinies
peuvent
être, par exemple, des échantillons de tissus, des fluides biologiques, des
surnageants
cellulaires, des préparations végétales, etc. Les composés test peuvent être
choisis
parmi un produit inorganique ou organique et notamment un polypeptide, une
protéine
ou un peptide, un acide nucléique, un lipide, un polysaccharide et un composé
chimique ou biologique. Il peut s'agir par exemple d'un facteur nucléaire,
d'un cofacteur
ou de tout mélange ou dérivé de ces derniers. Le composé peut être d'origine
naturelle
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ou synthétique et inclure une banque combinatoire, un clone ou une banque de
clones
d'acides nucléiques exprimant un ou plusieurs polypeptide(s) liant l'ADN, etc.
Composition pharmaceutique
5
Un objet particulier de l'invention concerne une composition pharmaceutique
comprenant un composé augmentant ou mimant l'activité de la protéine TReP-132
et
un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique.
Préférentiellement, cette composition pharmaceutique est utilisée en
combinaison avec
10 une hormone pour une administration simultanée, séparée ou séquentielle.
Encore plus préférentiellement, la composition pharmaceutique selon
l'invention
comprend la protéine TReP-132 ou un analogue de cette dernière dans un
excipient
acceptable sur le plan pharmaceutique.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un
composé modulant, en particulier mimant, augmentant ou favorisant, la liaison
de la
protéine TReP-132 ou d'un complexe comprenant la protéine TReP-132 au
récepteur
d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes et un excipient acceptable sur le
plan
pharmaceutique.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique comprend un composé
stimulant la
liaison de la protéine TReP-132 au récepteur d'une ou de plusieurs hormones
stéroïdes
et un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique. Encore plus
préférentiellement,
la composition pharmaceutique comprend un composé augmentant la liaison de la
protéine TReP-132 au récepteur de la progestérone (PR) ou à celui des
oestrogènes
(ER).
Un autre objet de l'invention réside dans une composition pharmaceutique
caractérisée
en ce qu'elle comprend, dans un véhicule acceptable sur le plan
pharmaceutique, un
composé stimulant l'activité du complexe comprenant la protéine TReP-132 et un
récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.
Un autre objet particulier de l'invention concerne une composition
pharmaceutique,
caractérisé en ce qu'elle comprend, dans un excipient acceptable sur le plan
pharmaceutique, un composé modulant, en particulier mimant, augmentant ou
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favorisant, l'action de la protéine TReP-132 sur l'un des promoteurs de ses
gènes
cibles, notamment celui d'un gène codant pour p21, p27 ou p16.
La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique
comprenant,
dans un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique, un acide nucléique
codant la
protéine TReP-132. De manière préférée, l'acide nucléique est incorporé à un
vecteur
d'expression, de préférence à un vecteur plasmidique ou viral.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique
comprenant,
dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, un composé modulant
la
formation ou l'activité du complexe comprenant la protéine TReP-132, Sp1 et un
récepteur d'une ou de plusieurs hormones stéroïdes.
Un objet particulier de l'invention concerne une composition pharmaceutique
comprenant : dans un excipient acceptable sur le plan pharmaceutique, un
composé
choisi parmi la protéine TReP-132, un analogue de cette dernière, un composé
augmentant ou mimant l'activité TReP-1 32 et un composé identifié à l'aide de
l'une des
méthodes selon l'invention, combiné à une ou à plusieurs hormones, en vue
d'une
administration simultanée, séparée ou séquentielle pour traiter une maladie
proliférative.
De manière préférée, la composition pharmaceutique selon l'invention comprend
un
composé identifié à l'aide d'une méthode telle que décrite précédemment. De
manière
encore plus préférée, le composé choisi est TReP-1 32.
De manière préférée, l'hormone combinée au composé choisi est la progestérone.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention, destinées au traitement de
maladies prolifératives, peuvent notamment être préparées selon un procédé
comprenant une étape impliquant une méthode telle que décrite précédemment.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent avantageusement
un
ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique.
On peut
citer par exemple des solutions salines, physiologiques, isotoniques,
tamponnées, etc.,
compatibles avec un usage pharmaceutique et connues de l'homme du métier. Les
compositions peuvent contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis
parmi les
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dispersants, solubilisants, stabilisants, surfactants, conservateurs, etc.
D'autre part, les
compositions selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents ou principes
actifs.
Les composés ou compositions selon l'invention peuvent être administrés de
différentes manières et sous différentes formes. Les composés de l'invention
sont
typiquement administrés par voie systémique, de préférence locale. On peut
citer
avantageusement l'injection intra-tumorale ainsi que l'injection dans une zone
proche
de la tumeur ou irriguant une tumeur.
Des doses variées peuvent être mises en oruvre, selon le composé, le nombre
d'administrations, l'association avec d'autres principes actifs, le stade
d'évolution de la
pathologie, etc.
La présente invention représente une nouvelle stratégie efficace et
avantageuse de
traitement des maladies prolifératives. Elle est en effet basée sur la
caractérisation
d'une voie métabolique naturelle sur laquelle des interventions sélectives
peuvent être
réalisées.
D'autres aspects et avantages de la présente demande apparaîtront à la lecture
des
exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non
limitatifs.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1: Effet de la protéine TReP-132 sur la formation de colonies
résistantes au
G418.
Figure 2: Expression de la protéine TReP-132 dans des cellules MCF-7
cancéreuses
du sein, dépendantes des oestrogènes.
Figure 3: Induction de TReP-132 par la progestérone et abolition de
l'inhibition de la
prolifération des cellules T47-D par la progestérone suite à la suppression de
l'ARNm
de TReP-132 par la technique d'interférences-ARN ("siRNA") (Les cellules T47-D
sont
traitées pendant les périodes de temps indiquées avec de la progestérone
(30nM)). Les
expériences ont été réalisées en triplicata, et les valeurs représentent les
moyennes
ET d'une expérience représentative.
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Figure 3A: Analyse des taux d'ARNm TReP-1 32 par RT-PCR quantitative.
Figure 3B : Les cellules, transfectées avec les siRNA contrôle ou les siRNA
TReP-132
(400ng) à 0 et 3 jours, sont récupérées à 2, 4 ou 6 jours pour être comptées.
(ns : non
significatifs - *, p<0.05 ; **, p<0.01 ; ***, p<0.001).
Figure 4: Système d'expression bidirectionnel Tet-Off.
Figure 5: Induction de l'expression de la protéine TReP-132 en absence de
doxycycline.
Figure 6: Inhibition de la prolifération cellulaire par la protéine TReP-132.
Figure 7: Effet de l'induction de la protéine TReP-132 sur la transition Gl/S
du cycle
cellulaire.
Figure 8A, 8B: Expression de l'ARNm de TReP-132 après synchronisation des
cellules
en fin de phase G1.
Figure 9: Effet de TReP-1 32 sur les activités CDK de la phase G, et sur les
niveaux de
phosphorylation de pRb.
Figure 9A : L'activité kinase associée à chaque CDK ou cycline
immunoprécipitée a été
quantifiée en utilisant les substrats pRb pour la mesure des activités
associées à la
cycline D1 et à CDK6, ou l'histone H1 pour la mesure de l'activité de la
cycline A et de
la CDK2. Les niveaux de phosphorylation de l'histone H1 ou de pRb dans les
cellules
HTO (HeLa Tet Off) induites sont exprimés par rapport aux niveaux dans les
cellules
HTO non induites (correspondant au niveau 1.0).
Figure 9B : Les extraits protéiques (20 microgrammes) des cellules HTO
exprimant la
GFP ou la GFP et TReP-132 sous le contrôle de la doxycycline, incubées ou non
avec
la Dox pendant les périodes de temps indiquées, sont analysés par Western-blot
en
utilisant des anticorps anti-pRb dirigés contre la totalité des pRb
(hyperphopshorylée,
phosphorylée et hypophosphorylée) ou seulement contre la pRb phosphorylée au
niveau de la Ser 780, un résidu cible de la cycline D1/CDK4.
Figure 10: Effet de l'induction de l'expression de la protéine TReP-132 sur la
transcription de gènes régulateurs clés du cycle cellulaire (CDK et CDKI).
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Figure 11 : La protéine TReP-132 active les promoteurs de p16, p21 et p27.
Figure 12: Action synergique de la protéine TReP-132 avec Sp1 et p300 sur
l'activation du promoteur p21.
Figure 13: Induction des activités des promoteurs des gènes p21 et p27 par
TReP-132
mettant en jeu une interaction avec Sp1 dans les cellules Hela.
Figures 13A et 13B : les constructions rapporteurs Luciférase sous le contrôle
des
promoteurs p21 et p27 délétés ou mutés sont cotransfectées dans des cellules
HeLa
avec les plasmides d'expression Sp1 (0.1 microgrammes) et/ou TReP-132 (0.3
microgrammes). Les lysats cellulaires sont ensuite testés pour leur activité
luciférase.
Les résultats représentent les niveaux d'activité luciférase, les activités
des
constructions rapporteurs -2320p21 Luc et -3568p27 Luc étant arbitrairement
fixées à
1Ø Les flèches indiquent les sites d'initiation de la transcription.
Figure 13C : Les cellules HTO-GFP ou HTO-GFP/TReP-132 incubées ou non avec la
Dox pendant 48 heurés ont été récupérées pour extraction de la chromatine
soluble.
Les immunoprécipitations (IPs) ont été réalisées avec l'anticorps anti-Flag.
Les PCR
contrôles sont effectuées sans ADN (H20) ou avec des l'ADN génomique non
précipitée (input). Les extraits d'ADN sont amplifiés en utilisant les primers
suivants :
zone -117/-65 du promoteur du gène p21, région distale du promoteur du gène
p21
(1kb en amont du promoteur), zone -549/-511 du promoteur du gène p27, région
distale
du promoteur du gène p27 (1 kb en amont du promoteur) ou une zone du gène
codant
pour la béta-actine.
Figure 13D: les protéines GST-TReP-132 sont incubées avec du 35[S]-Spl et
immobilisées sur une colonne Glutathion-sepharose. L'analyse des interactions
spécifiques se fait par comparaison avec les résultats issus de l'incubation
de la GST
seule avec du 35[S]-Sp1.
Sp1 input : 1/10ème du taux de Sp1 radioactive utilisée dans les incubations.
Figure 14: Augmentation de l'activation progestérone-dépendante des promoteurs
des
gènes p21 et p27 par TReP-132, via une augmentation des liaisons des sites de
liaison
Sp1 dans les cellules T47-D.
Figures 14A et 14B : les cellules T47-D sont cotransfectées avec des
constructions
rapporteurs contenant le promoteur p21 (Figure 14A) ou p27 (figure 14B). 12
heures
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après les transfections, les cellules sont incubées avec de la progestérone
(30nM) ou
de l'éthanol pendant 34 heures. Les lysats cellulaires sont ensuite testés
pour leur
activité luciférase. Les activités luciférase des constructions -93p21 Luc et -
549p27
Luc représentent le niveau 1. Les flèches indiquent les sites de départ de
transcription.
5 Figure 14C: la chromatine est issue des cellules T47-D traitées ou non à la
progestérone (30nM). Les IPs sont réalisées avec les anticorps anti-TReP-132
(colonnes 2-3). Les contrôles incluent les PCR réalisées sans ADN (colonne 1,
H20),
les PCR réalisées avec AD N génomique non précipitée (colonnes 2 et 3, input),
les
immunoprécipitations réalisées sans anticorps (colonnes 4 et 5, no Ab) ou avec
un
10 anticorps non pertinent (colonnes 6 et 7, anti-HA). L'ADN extrait est
amplifié en utilisant
les mêmes primers que ceux décrits pour la figure 13C.
Figure 14D à gauche : la GST-TReP-132 immobilisée sur glutathion-Sepharose est
incubée avec le PR marqué à la 35[S]-Methionine, en absence ou avec des
concentrations croissantes de progestérone (0-10 microM). Les interactions
spécifiques
15 sont analysées par comparaison avec des expériences réalisées en incubant
la GST
avec des 35[S]-PR, en présence de 100 microM de progestérone (GST).
Figure 14D à droite : la GST-TReP-132 wt, la GST-TReP-132 ml (mutée au niveau
du
site LRQLL) et la GST-TReP-132 m2 (mutée au niveau du site LEMLL) sont
analysées
au niveau de l'interaction avec 35[S]-PR tel que décrit précédemment, en
présence de
20 10 microM de progestérone.
Input PR: 1/10ème du taux de PR radioactifs utilisé dans les expériences.
Figure 15 : Analyse de l'interaction entre TReP-132 et le récepteur des
oestrogènes
(ER).
25 La GST-TReP-132 wt est analysée au niveau de l'interaction avec 35[S]-ER,
de la
manière décrite précédemment.
EXEMPLES
MATÉRIELS ET MÉTHODES
1. Plasmides.
Le vecteur TReP-132-HA, correspondant à la région entière de l'ADNc de TReP-
132
possédant en 3' l'épitope HA, est créé par amplification par PCR de TReP-132
avec les
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oligonucléotides introduisant un site fCpnl en 5' et un épitope HA et un site
Xbal en 3'.
Les produits de PCR sont digérés avec Kpnl et Xbal et sous-clonés dans le
vecteur
d'expression pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Le plasmide GST-TReP-132 est
réalisé par la fusion en phase de la région codante de TReP-1 32 en aval de la
séquence GST du vecteur pGEX-2TK (Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfé,
Québec, Canada). Les mutants GST-TReP-132m1 et GST-TReP-132m2 ont été créés
en utilisant le kit QuickChange site-directed mutagenesis (Stratagene), par
mutations
des leucines en alanines dans les NR-box (Nuclear Receptor box) 1 et 2 (Gizard
et al.,
2002b). Le plasmide pBI-EGFP qui contient un promoteur bidirectionnel
répondant à la
tétracycline permettant de coexprimer un gène d'intérêt avec la protéine
fluorescente
verte (EGFP pour "Enhanced Green Fluorescent Protein"). Il provient de
Clontech
Laboratories, Palo Alto, CA, ainsi que le plasmide pBi-EGFP-Luc contrôle,
exprimant à
la fois la protéine GFP et la luciférase. Le plasmide pBl-EGFP-TReP-132 a été
réalisé
par clonage direct de l'ADNc complet de TReP-132 obtenu par PCR dans le site
Nhel
de pBI-EGFP. Toutes les constructions ont été validées par séquençage aux
didéoxynucléotides. Le plasmide d'expression pcDNA3-Spl (Blais et al., 2002)
et le
plasmide rapporteur du gène humain de p21 WAF' contenant le fragment -1560/+34
(p21-Luc -1560/+34) sous-cloné dans le vecteur pGL3, ont été généreusement
fourni
par le Dr. Monté (IBL, France). De la même manière, les constructions -2320p21
Luc et
-154p21 Luc ont été fournies généreusement par les Drs Kraft et Biggs (Div. Of
Oncology, University of Colorado, Health Sciences center, Denver), la
construction -
93p21 Luc et ses mutants par Dr. Wang (Dept. Of Pharmacology, Duke University
Medical Center, NC), et le plasmide rapporteur du gène humain p27K'p' sous-
cloné dans
vecteur basique pGL2 (Promega) par le Dr. Toshiyuki Sakai (Kyoto Prefectural
University of Medecine, Japon). La région en 5' du gène humain codant pour p16
CDKN2
contenant la séquence nucléotidique de -1 à-369 par rapport à l'ATG, sous-
clonée
entre les sites Kpnl et Bglll de pGL2, a été généreusement fourni par le Dr
Gordon
Peters. La série de vecteurs rapporteurs de p16CDKN2 a été construite par
cette équipe
par sous-clonage de différents fragments de PCR générés avec des
oligonucléotides
spécifiques en 5' du gène.
2. Cultures cellulaires.
Les lignées cellulaires dérivées de cancer du sein cervicales HeLa et
mammaires T47-
D et MCF-7 et la lignée HeLa proviennent de l'ATCC (American Type Culture
Collection, Manassas, VA) et sont cultivées en monocouche. Les cellules HeLa
sont
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cultivées dans du milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) (Life
Technologies, Gaithersburg, MD), les cellules MCF-7 dans du milieu DMEM-F12
(composé d'un mélange égal de DMEM et de milieu Ham's F-12), et les cellules
T47-D
dans du milieu RPMI 1640. Tous les milieux sont additionnés de 10% de sérum
bovin
foetal (Hyclone, Logan, UT), de glutamine (2 mM), de pénicilline (50 U/ml) et
de
streptomycine (50 mg/ml) (Life Technologies, Ontario, CA). Pour les MCF-7, le
milieu
est supplémenté de 10-9 M d'orstradiol (E2) (Sigma-Aldrich CA Ltd.).
Pour les essais de transfections, les cellules HeLa et T47-D sont incubées 24
heures
dans des plaques 24 puits à une densité initiale respective de 1.5x104 et
1.5x105
cellules par puit. Les cellules HeLa sont ensuite transfectées avec le
transfectant
ExGen 500 (MBI fermentas, Flamborough, Ontario, Canada) à un ratio de 4
microlitres
d'ExGen 500 pour 0.5 microgrammes d'ADN et les cellules T47-D avec le
transfectant
FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Laval, Canada) à un ratio de 3:1
(FuGENE :ADN).
Les constructions rapporteurs pGL2 et pGL3 (100ng) sont cotransfectées avec
les
montants indiqués de vecteurs d'expression et lOng du plasmide contrôle
pRL.Null. La
quantité de plasmides a ensuite été normalisée avec le vecteur vide pcDNA3.
Après 12
heures de transfection, le milieu est changé et les cellules sont incubées
pour une
durée additionnelle de 10 et 34 heures respectivement. Durant cette période,
les
cellules T47-D sont cultivées en présence et en absence de progestérone
(30nM). Les
cellules sont ensuite récupérées et l'activité Luciférase du lysat cellulaire
(20
microlitres) est testée (Dual LuciféraseTM reporter Assay System, Promega,
Madison,
USA) dans un luminomètre Berthold LUMAT LB9501. Les transfections sont
réalisées
en triplicata et chaque expérience est répétée au moins 3 fois.
3. Essai de formation de colonies.
Les cellules HeLa sont ensemencées dans une plaque de 12 puits à une densité
initiale de 100 000 cellules par puit. Après une incubation de 24 heures, les
cellules
sont transfectées avec chacun des plasmides suivants: pcDNA3, pcDNA3-Luc,
pcDNA3-SF-1, ou pcDNA3-TReP-132, chacun possédant le gène de résistance à la
néomycine. Les transfections sont effectuées en triplicata avec le
transfectant ExGen
500 (MBI Fermentas, Flamborough, Ontario, Canada) à un ratio de 5 ial d'ExGen
500
pour 1 pg de plasmide. Après une transfection de 12 heures, le milieu est
changé et les
cellules sont incubées pour une durée additionnelle de 8 heures. Les cellules
sont
ensuite trypsinées et transférées dans un pétri de 100 mm. Après 48 heures, le
milieu
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est supplémenté avec 400 pg/ml de l'agent de sélection G418 (Sigma-Aldrich CA
Ltd.).
La forrriation de colonies distinctes est détectable après deux semaines de
sélection
avec le G418. Les cellules sont alors rincées avec du PBS et fixées avec un
mélange
de 10% d'acide acétique / 10% méthanol pendant 15 min, puis colorées au
crystal
violet (Sigma-Aldrich CA Ltd.).
4. Analyses de protections à la RNase dans les cellules MCF-7.
La préparation de la sonde TReP-132 radioactive est effectuée comme suit : le
plasmide pcDNA3-TReP-1 32-HA est tout d'abord linéarisé par digestion avec
l'enzyme
de restriction Narl (New England Biolabs, Beverly, MA) avant d'amorcer la
transcription
in vitro à partir du promoteur T7 en présence du ribonucléotide marqué [a-
32P]UTP
suivant les conditions spécifiées dans le kit MAXiscript (Ambion, Austin,
Texas) . La
sonde générée est un ARNc de 226 pb, contenant 174 bases nucléotidiques
retrouvées
à l'extrémité 3' de TReP-132 et 52 bases provenant du polylinker et
incluant la
séquence du tag HA. La ribosonde 18S utilisée pour la normalisation est
générée à
partir du vecteur humain pTRI-18S (Ambion, Austin, Texas) et protège un
fragment de
80 pb. Les essais de protection à la ribonucléase sont réalisés en utilisant
le Kit de
Protection à la Ribonucléase Il (Ambion, Austin, Texas) selon le protocole
décrit par le
manufacturier. 30 pg d'ARN provenant des cellules MCF-7 sont hybridés aux deux
sondes pendant 16 heures à 45 C, et les hybrides sont ensuite digérés à 37 C
pendant
45 min dans la solution RNase A/RNase T1 diluée au 1/75 dans le tampon de
digestion. Les échantillons sont résolus sur un gel de polyacrilamide-6%
d'urée.
5. Reverse transcription et PCR quantitative.
Les ARN totaux des cellules T47-D traitées ou non avec la progestérone sont
transcrits
de manière reverse et les niveaux d'ARNm de TReP-132 sont ensuite mesurés par
RT-
PCR quantitative tel que décrit dans (Gizard et al., 2004) en utilisant les
primers
spécifiques de TReP-132 (5'-gtcaacaatatggcccaggtg-3' et 5'-
gccagaggctgctggtcgtc-3').
6. Abolition de l'expression de TReP-132 par la technique de Small
Interfering RNA (siRNA).
Les oligonucléotides sens 5'-aacatgtttgagttgccaggcctgtctc-3' et antisens 5'-
aacctggccaactcaaacatgcctgtctc-3' sont synthétisés (Eurogentec) et utilisés
pour
générer un siRNA double brins spécifiques de TReP-132 (21 bp correspondant aux
acides aminés 861-881 en amont du codon d'initiation du gène humain TReP-132).
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L'oligonucléotide non silencing siRNA de Qiagen, non spécifique de gène de
mammifère est utilisé comme contrôle négatif. La transfection est réalisée en
utilisant le
réactif GeneSilencer (Gene Therapy Systems, San Diego, USA) de la manière
décrite
par le fabricant. L'efficacité de transfection est vérifiée par analyse des
cellules par
FACS (Fluorescence-Activated Celi Sorting) (voir ci-dessous). La PCR
quantitative
indique une diminution de 75 +/- 12% des niveaux d'ARNm TReP-132. Les analyses
statistiques sont réalisées en utilisant le test non paramétrique Kruskal-
Wallis.
7. Synchronisation des cellules HeLa en phase G, .
Les cellules HeLa sont synchronisées en phase G, au niveau de la transition Gl-
>S par
un double blocage à la thymidine comme décrit dans (Cao et al., 1991 et Tobey
et al.,
1967) avec quelques modifications. L'addition d'un excès de thymidine a pour
effet
d'inhiber la réaction enzymatique catalysant la formation de déoxycytidine
triphosphate
à partir de cytidine-5'-phosphate et d'empêcher la réplication de l'ADN,
caractéristique
de la phase S. Les cellules HeLa sont tout d'abord ensemencées à 1 million de
cellules
par boite de pétri (100 mm de diamètre) et cultivées pendant 24 heures. La
thymidine
est ajoutée à une concentration finale de 5mM et les cellules sont incubées
pendant 14
heures. Cette période est calculée pour être un peu plus longue que la somme
des
durées des phases G2, M et G, pour les cellules HeLa. Les cellules sont
ensuite
synchronisées pour entrer en phase S en enlevant la thymidine du milieu pour
une
période de 9.5 heures, temps qui excède celui de la phase S. L'arrêt du cycle
avant
l'entrée en phase S se fait de nouveau par l'addition de thymidine dans le
milieu pour
une durée de 5 heures. Après cette période, la thymidine est enlevée et
correspond au
temps 0 de nos expériences.
8. Expression inductible de TReP-132 par le système Tet-off.
Les cellules HeLa Tet-off exprimant le transactivateur tTA sous contrôle de la
tétracycline ou doxycycline (Dox) (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) ont
été
transfectées de façon stable avec le plasmide pBl-EGFP-TReP-132 ou le plasmide
contrôle pBi-EGFP. Afin de sélectionner les cellules transfectées de façon
stable, le
plasmide pcDNA6 (Invitrogen, Ontario, CA) possédant le gène de résistance à la
blasticine a été cotransfecté au 1/50. Pour ces transfections, les cellules
sont d'abord
ensemencées dans des plaques de 6 puits à une densité initiale de 1x105
cellules par
puit. Après une incubation de 24 heures, les cellules sont transfectées avec
ExGen 500
(MBI Fermentas, Flamborough, Ontario, CA) à_un ratio de 5 tai d'ExGen 500 pour
une
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quantité totale de 1 pg de plasmide comme décrit ci-dessus dans la section
essai de
formation de colonies. 48 heures après la transfection, les cellules sont
sélectionnées
pendant 2 semaines avec 2 pg/ml de blasticidine (Sigma-Aldrich CA Ltd.).
Lorsque les
colonies sont suffisamment isolées, elles sont repiquées et transférées dans
une
5 plaque de 12 puits pour permettre leur croissance. Il est à noter que les
cellules sont
toujours maintenues en présence de doxycycline de façon à réprimer la
transcription
des gènes sous le contrôle du transactivateur tTA.
9. Tri des cellules au FACS (Fluorescence-activated cell sorting).
10 Afin de déterminer l'efficacité du système d'expression inductible contrôlé
par la
doxycycline dans les clones stables transfectés avec le vecteur pBI-EGFP-TReP
(système décrit ci-dessus), la fluorescence de chaque cellule à l'intérieur
d'une
population donnée est individuellement mesurée par cytométrie en flux sur un
appareil
EPICS XL (Beckman Coulter, Mississauga, CA). Les paramètres mesurés sont le FS
15 (Forward scatter), SS (side scatter) et la fluorescence émise à la longueur
d'onde de
520 nm après excitation avec un laser Argon à 488 nm. Les cellules exprimant
la GFP
sont alors triées avec un appareil EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter,
Mississauga,
CA).
20 10. Mesure de la prolifération cellulaire.
Le taux de prolifération cellulaire est déterminé par le contenu en ADN des
cellules en
utilisant le fluorochorome DABA (dimethylaminobenzaldehyde). Après avoir
enlever le
milieu, les cellules sont déshydratées en ajoutant 150 lai de méthanol dans
chaque puit.
Après évaporation complète, les cellules sont incubées pendant 1 heure à 60 C
avec
25 150 pl d'une solution de DABA préparée comme suit : 2 g de DABA sont
dissout dans
10 ml d'acide chlorhydrique (HCI) 1N, et 1g/10 ml de Norit A Carbon est
ajouté. Après
agitation, le mélange est centrifugé pendant 30 minutes à température
ambiante, puis
passé sur un filtre de 0.45 microns. Après incubation, les plaques sont
transférées dans
la glace pour 10 min, et 1.25 ml d'HCI 1 N est ajouté dans chaque tube. La
fluorescence
30 est mesurée à l'aide d'un fluorimètre Perkin-Elmer LS-2B Filter
Fluorimeter, à la
longueur d'onde d'excitation 400 nm et d'émission 508 nm. La quantité d'ADN
est
calculée d'après une courbe standard effectuée avec des quantités déterminées
d'ADN
de sperme de saumon.
35 11. Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux.
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Afin d'évaluer le pourcentage de cellules en Go/G,, S, ou G2/M, des profils de
cytométrie en flux sont réalisés sur l'ADN de ces cellules incubées avec de
l'iodure de
propidium. Pour ce faire, les cellules sont trypsinées, centrifugées, re-
suspendues dans
300 pI de PBS et refroidies dans la glace. Ensuite, en maintenant les cellules
sous
agitation douce à l'aide d'un vortex, on ajoute goutte à goutte un volume de
700 pl
d'éthanol 95% et les cellules sont fixées dans la glace pour une durée de 30
min. Après
centrifugation et lavage au PBS, les cellules sont incubées dans 500 pl de PBS
contenant 40 U/ml de RNase ( DNAse free , Roche Diagnostics, Laval, Québec,
CA)
et 50 lag/ml d'iodure de propidium (Sigma-Aldrich CA Ltd.) pendant 30 min à
température ambiante à l'abri de la lumière. Les mesures d'ADN sont effectuées
sur un
appareil Epics XL (Beckman Coulter, Mississauga, CA) en utilisant une longueur
d'onde
d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 620 nm. Les
pourcentages des cellules en phase GI, S, et G2/M sont quantifiés à l'aide du
programme Multicycle AV (Phoenix Flow system, San Diego, CA) (28).
12. Transfections des cellules HeLa et T47D.
Les études d'activation des promoteurs des inhibiteurs de cycline p21, p27 et
p16 par
TReP-132 ont été réalisées par transfection des cellules HeLa et T47-D. Les
cellules
HeLa sont ensemencées à une densité initiale de 15,000 cellules par puit dans
une
plaque de 24 puits et transfectées le lendemain avec ExGen 500 (MBI Fermentas,
Flamborough, Ontario, Canada) au ratio de 0.5 pg d'ADN pour 4 pl d'ExGen 500.
Les
cellules T47D sont ensemencées à une densité de 100,000 cellules par puit et
transfectées le lendemain avec le réactif FuGENE 6 (Roche Molecular
Biochemicals,
Laval, Canada), au ratio de 3 pl de FuGENE pour 1 pg d'ADN. Après une
incubation de
12 heures à 37 C, le milieu est remplacé et les cellules sont incubées pour
une période
additionnelle de 8 heures. Les cellules sont ensuite lysées pendant 15 minutes
à la
température ambiante dans une solution contenant 0.8% Triton X-100, 25 mM
Glycylglycine pH 7.8, 15 mM MgSO4, et 4 mM EGTA. L'activité luciférase est
dosée à
l'aide d'un luminomètre Bérthold Lumat LB9501 (Berthold Detection Systems
GmbH,
Pforzheim, Allemagne) en utilisant le kit "Dual-LuciferaseTM reporter Assay
System"
(Promega Corporation, Madison, WI) permettant de doser simultanément les
activités
de la luciférase de type firefly et de la Iuciférase de type Rénilla
(codée par le
plasmide pRL-null pour normalisation). Pour toutes les transfections, 0.1 pg
de
plasmide rapporteur contenant le promoteur étudié (p21WAF'iciP', p27Kip1, ou
p16CDKN2) et
0.01 pg de pRL-null sont utilisés. Les quantités utilisées de vecteurs
d'expression pour
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TReP-132, p300, et Sp1 varient en fonction des expériences et sont précisées
dans la
section "résultat". Pour chaque expérience, une transfection contrôle avec le
plasmide
d'expression pCDNA3-EGFP a été effectuée et une analyse de cytométrie en flux
a
permis de valider qu'il y ait au moins 60% des cellules transfectées.
13. Analyses de protections à la RNase dans les cellules HeLa.
La préparation de la sonde TReP-132 radioactive est effectuée comme décrit
précédemment : le plasmide pcDNA3-TReP-132-HA est tout d'abord linéarisé par
digestion avec l'enzyme de restriction Narl (New England Biolabs, Beverly, MA)
avant
d'amorcer la transcription in vitro à partir du promoteur T7 en présence du
ribonucléotide marqué [a-32P]UTP suivant les conditions spécifiées dans le kit
MAXlscript (Ambion, Austin, Texas) . La sonde générée est un ARNc de 226 pb,
contenant 174 bases nucléotidiques retrouvées à l'extrémité 3' de TReP-132 et
52
bases provenant du polylinker et incluant la séquence du tag HA. La
ribosonde
18S utilisée pour la normalisation est générée à partir du vecteur humain pTRI-
18S
(Ambion, Austin, Texas) et protège un fragment de 80 pb. Les essais de
protection à la
ribonucléase sont réalisés en utilisant le Kit de Protection à la Ribonucléase
Il (Ambion,
Austin, Texas) selon le protocole décrit par le manufacturier. 30 pg d'ARN
provenant
des cellules HeLa sont hybridés aux deux sondes pendant 16 heures à 45 C, et
les
hybrides sont ensuite digérés à 37 C pendant 45 min dans la solution RNase
A/RNase
T1 diluée au 1/75 dans le tampon de digestion. Les échantillons sont résolus
sur un gel
de polyacrilamide-6% d'urée.
L'ensemble des sondes radioactives spécifiques aux gènes p130, Rb, p107, p53,
p57,
p27, p21, p19, p18, p14/p15, L32, et GAPDH sont marquées avec le
ribonucléotide [a-
32P]UTP (PerkinElmer Life Sciences, Woodbridge, Ontario, CA) dans les
conditions
spécifiées dans le kit "hCC-2 Muti-Probe Template Set" (Pharmingen,
Mississauga,
Ontario, CA). Les essais de protection à la ribonucléase sont réalisés en
utilisant le Kit
de Protection à la Ribonucléase III (Ambion, Austin, Texas). 10 pg d'ARN
provenant
des cellules HeLa sont hybridés avec le mixte de sondes radioactives à 56 C
puis sont
digérés à 30 C pendant 45 min dans la solution RNAseA/RNase T1 diluée au
1/1000
dans le tampon de digestion. Les échantillons sont résolus sur un gel de
polyacrilamide-6% d'urée.
14. Préparation des extraits protéiques, Analyse en Western blot et
Coimmunoprécipitation.
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Les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS (Phosphate Buffer Saline)
refroidi, puis
collectées soit dans du tampon RIPA refroidi (1x PBS, 1% Nonidet P-40, 0.5%
Sodium
deoxycholate, 0.1% SDS, Inhibiteurs de phosphatases et de protéases) pour les
analyses de co-immunoprécipitation, soit dans du tampon de lyse (5OmM Tris, pH
8.0,
0.1 % IGEPAL (Sigma)) pour les essais de kinases. Les lysats sont incubés
pendant 30
min sur la glace et les débris cellulaires sont enlevés par centrifugation.
Les extraits
sont ensuite aliquotés et conservés à-80 C. Pour les analyses en Western Blot,
le
tampon RIPA ou le tampon de lyse est utilisé. Pour l'immunoprécipitation, les
lysats de
cellules entières (1 mg) mis dans le tampon RIPA sont préincubés avec 0.1
microgramme d'IgG de souris ou de lapin et 20 microlitres de billes de
Sépharose-
protéine A (Amersham Biosciences , Uppsala, Sweden) pendant 30 min à 4 C.
Après
centrifugation, les lysats (1 mg) sont immunoprécipités pendant 1 heure à 4 C
avec un
anticorps anti-CDK2 (sc-163) (Santa Cruz), anti-CDK6 (RB-017), anti-cyclin A
(RB-010)
ou anti-cyclin D1 (MS-395) (Microm France, Francheville), puis incubés à 4 C
pendant
1 nuit avec la protéine A-Sepharose. Les protéines immunoprécipitées sont
ensuite
lavées 4 fois avec du tampon de lyse, puis resuspendues dans du tampon
d'electrophorèse.
Les échantillons de protéines (20-100 microgrammes) sont ensuite portés à 95 C
pendant 5 min, puis séparés par SDS-PAGE et transférés sur une membrane de
nitrocellulose. Les membranes ont été saturé par du lait déshydraté dilué dans
du
tampon TBS (10 mM Tris, Ph 8.0, 150 mM NaCI) additionné de 0.2% de Tween 20
(Sigma) et incubé ensuite (2-4 heures à température ambiante ou toute la nuit
à 4 C)
avec les anticorps anti-p21 (OP64) (Merck Eurolab, Fontenay-sous-bois, France)
; anti-
p27 (K25020, Transduction Laboratories, Lexington, KY) ; anti-pRb (554136,
reconnaissant tous les états de phosphorylation de pRb) ; anti-ppRb-Ser780 (sc-
12901)
spécifique de pRb phosphorylé au niveau de la Ser 780 ; anti-PR (MS-298-P) et
anti-
béta-actine (sc-7210) comme contrôle. Après lavage, les membranes sont
incubées
avec un anticorps secondaire de souris ou de lapin couplé au HRP (Jackson
Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) pendant 45 min. Les blots sont
ensuite
révélés avec un agent ECL et la quantification se fait avec les logiciels
SCANWISE et
Perfect-IMAGE V-5.3 (CLARA VISION, France).
15. Les essais Kinases.
Les activités des kinases des histones H1 ou de la protéine Rb des
immunoprécipitats
sont mesurées de la manière suivante : les immunoprécipitats sont tout d'abord
lavés
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une fois avec 1 ml de tampon de dosage (50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 10 mM MgC12, 1
mM
dithiotheitol (DTT)), puis sont re-suspendus dans 20 microlitres de tampon de
dosage
contenant lmg/ml de caséine (Sigma) et 1 microgramme d'histone H1 ou de
protéine
Rb (769) (sc-4112) comme substrat. Après 5 min de préincubation à 30 C, la
réaction
est initiée par l'addition de 1 microMolaire d'ATP et 5 microCurie de [gamma
32P] ATP,
puis continuée à 30 C pendant 1 heure.
microlitres de tampon d'électrophorèse (3X) sont ajoutés ensuite pour stopper
la
réaction et les échantillons sont déposés sur un gel SDS-PAGE 10%. Le gel est
séché
puis autoradiographié et les quantités d'histones ou de pRB phosphorylés sont
10 mesurées par densitométrie.
16. Tests de liaison /n Vitro.
Afin d'évaluer l'interaction de TReP-132, Sp1, ER et PR, des protéines de
fusion GST-
TReP-132 wt et mutées sont exprimées puis immobilisées sur Glutathion-
Sepharose de
15 la manière décrite dans (Frangioni and Neel, 1993 - Monte et al., 1998).
Les protéines
35S-[Sp1], 35S-[ER] et 35S-[PR-B] sont synthétisées in vitro en utilisant des
lysat de
réticulocytes de lapin et le système d'ARN polymerase T7 selon la procédure du
fabricant (Promega Corporation, Madison, WI). Les protéines liées, puis
détachées de
la Sépharose après avoir été portées à ébullition dans du tampon SDS sont
ensuite
séparées par SDS-PAGE 10%. Les gels sont ensuite colorés par le bleu de
Coomassie, puis séchés et autoradiographiés.
17. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP).
Les cellules HTO incubées en présence de Dox ou les cellules T47-D sont
cultivées
jusque 70% de confluence dans des boites de Pétri (150 mm de diamètre). Pour
les
cellules HTO, la Doxycyline est retirée sur la moitié des boites 48 heures
avant la lyse.
Les cellules T47-D sont incubées avec 30 nM de progestérone ou avec de
l'éthanol
contenant 0.2% de BSA-RPMI pendant 2h30 avant la lyse. Les lysats cellulaires
sont
ensuite soumis à une sonication sur glace, 15 fois pendant 15 sec à 45 sec
d'intervalle.
Un volume de lysat correspondant à 4x106 cellules est immunoprécipité en
utilisant 4
microgrammes d'anticorps (indiqués précédemment) ainsi qu'un anticorps anti-HA
comme contrôle négatif. Le même volume est gardé pour une purification
ultérieure
d'ADN génomique. 1/20 ème de l'ADN extrait est ensuite amplifié par PCR
pendant 35
cycles (30 sec à 92 C, 30 sec à 55 C et 30 sec à 72 C) en utilisant les
primers : pour
p21, 5'-ggcactcttgttcccccaggc-3' et accatccccttcctcacctg-3' (élément de
réponse à Sp1
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sur p21) ou 5'-gcacactgacgcagcacacag-3' et 5'-cagtttgagaagcagccacct-3'
(élément
distal de p21); pour p27: 5'-aggccagccagagcaggtttgt-3' et 5'-
ggaggagatccattggttgcgg-3'
(élément de réponse à Sp1 sur p27) ou 5'-gacttgcatctagtcctgactccgg-3' et 5'-
gcctacctcatctcatacgctccag-3' (élément distal de p27); et pour la béta-actine:
5'-
5 aaactctccctcctcctcttcct-3' et 5'-cgagccataaaaggcaactttcg-3'. Un volume
équivalent
d'ADN génomique non précipité est amplifié comme contrôle négatif. 1/15ème
(ADN
génomique non précipité) ou 1/5ème (ADN précipité) des produits de la PCR sont
ensuite séparés sur un gel d'agarose 2% contenant du bromure d'éthidium.
10 18. FRET
Afin d'évaluer l'effet d'un ligand sur le recrutement de TReP-132 par ER et
PR, un
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) est réalisé entre TReP-1 32 et
PR ou
ER.
Des protéines de fusion GST-LBD ER et GST-LBD PR ( GST pour Gluthatione-S-
15 Transferase et LBD pour Ligand Binding Domain) sont exprimées et
purifiées à
l'aide de colonnes GST-Trap (Amersham pharmacia).
Les 2 peptides correspondant aux NR-box (Domaine de liaison aux récepteurs
nucléaires) de TReP-132 (NH2-AVMDGAPDSALRQLLQKPMEPPAPA-COOH et NH2-
FEAKGDVMVALEMLLLRKPVRLKCH-COOH) sont synthétisés et marqués avec la
20 biotine. Les GST-LBD ER, GST-LBD PR et les peptides de NR box sont
respectivement
détectés avec l'AlloPhycoCyanin (APC) couplée avec un anticorps anti-GST et
avec la
R-phycoerythrine (RPE) couplée à la streptavidine.
Une concentration croissante de composés est incubée dans le tampon de liaison
(0,1M PBS 2mM CHAPS, 2mM EDTA, lmM DTT, 0,1% BSA, pH 7,2) avec 35 nM de
25 GST-LBD ER ou de GST-LBD PR, 26.3 nM d'anticorps anti-GST marqués à I'APC,
1,25
nM de RPE strepavidine, 5-30 nM de peptide NR box biotinylé à 4 C pendant 4
heures
dans des plaques de 384 puits. La RPE est excitée à 495 nm et son émission est
mesurée à 635 nm (émission du RPE) et celle de I'APC à 670 nm. Les intensités
de
fluorescence sont mesurées avec un Genesis Freedom 200 Tecan. Les ratio de
30 fluoresence (intensité à 670 nm / intensité à 635 nm) par rapport au ligand
sont
calculés.
RÉSULTATS
35 1- Effet de TReP 132 sur la prolifération cellulaire.
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L'effet de TReP-132 sur la prolifération cellulaire a été démontré tout
d'abord dans les
cellules HeLa par un essai de formation de colonies. Dans cette expérience, il
a été
démontré que les cellules HeLa transfectées avec un vecteur d'expression
pcDNA3-
TReP forment beaucoup moins de colonies résistantes au G418 comparativement
aux
cellules transfectées avec le vecteur pcDNA3 seul (figure 1). Le nombre de
colonies
obtenues suite à la transfection du plasmide pcDNA3-TReP est 75 à 80%
inférieur à
celui obtenu suite à la transfection du plasmide contrôle. De plus, quand ces
cellules
ont été analysées pour l'expression du TReP-132 exogène, seules 2 colonies sur
20
étaient positives. Quand ces deux colonies ont été dispersées et
réensemencées, le
taux de prolifération des cellules était diminué de façon significative. La
durée de
dédoublement des cellules exprimant TReP-132 était de 30 heures au lieu de 18
pour
les cellules contrôles transfectées avec le vecteur pcDNA3 seul. Ainsi, ces
résultats
montrent que l'augmentation de l'expression de TReP-132 est corrélée avec la
diminution de la prolifération cellulaire et est vraisemblablement en
conséquence
responsable du nombre réduit de colonies cellulaires viables.
Pour mettre davantage en évidence que l'expression de TReP-132 est en étroite
relation avec la prolifération cellulaire, les cellules humaines de cancer du
sein MCF-7
ont été traitées pendant 6 jours avec 10"$M d'oestradiol (E2), un composé
connu pour
son effet prolifératif sur les cellules oestrogéno-dépendantes comme les
cellules de
cancer du sein par l'induction de la transition GI/S. Suite au traitement des
cellules
MCF-7 avec de l'cestradiol, une analyse basée sur la protection de la RNase a
permis
de mettre en évidence une diminution nette de l'expression de TReP-132 (figure
2) et
une augmentation concomitante de la prolifération cellulaire.
L'effet de TReP-132 sur la prolifération cellulaire dépendante de la
progestérone a été
démontré par mesure des taux d'ARNm TReP-132 dans les cellules T47-D traitées
ou
non à la progestérone. Il a déjà été montré que TReP-132 est un facteur
stéroïdogénique exprimé dans les cellules mammaires cancéreuses T47-D
(Musgrove
et al., 1997) exprimant d'importants niveaux de PR (Progesterone Receptor)
(Mockus et
al., 1982). Les résultats présentés sur la figure 3A montrent que les taux
d'ARNm
TReP-132 augmentent en fonction du temps d'exposition à la progestérone pour
atteindre un maximum d'expression (3X) à 48 heures d'exposition. Ces résultats
montrent ainsi que l'expression de TReP-132 est augmentée par le traitement
des
cellules T47-D à la progestérone.
L'influence de TReP-132 sur la prolifération cellulaire et sur la réponse à la
progestérone est ensuite montrée par la technique du Small Interfering RNA
(siRNA).
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Les résultats de la figure 3B montrent que la progestérone inhibe la
prolifération
cellulaire après 4 à 6 jours de traitement des cellules contrôles
transfectées, tandis que
le silencing de TReP-132 entraîne l'inhibition de la prolifération cellulaire,
même dans
les cellules non traitées. Ces résultats montrent ainsi que TReP-132 est un
facteur
d'inhibition de la croissance cellulaire et que TReP-132 agit comme médiateur
sur l'effet
anti-prolifératif de la progestérone.
De manière à étudier le mécanisme d'action de TReP-132 dans le contrôle de la
croissance cellulaire, des clones stables exprimant de façon inductible TReP-
132 par le
système Tet-off ont été produits dans les cellules HeLa (Figure 4). Ainsi, les
lignées
cellulaires co-exprimant la GFP et TReP-132-Flag (HTO-GFP/TReP) ou exprimant
seulement la GFP (HTO-GFP) sont établies. Dans ce système, les cellules sont
cultivées en présence de doxycycline de façon à réprimer l'expression de TReP-
132.
La protéine TReP-132-Flag n'est pas détectable dans les cellules cultivées en
présence
de Dox. Par contre, après enlèvement de la dox du milieu, la protéine TReP-132-
flag
ést détectable dès 12h et augmente jusqu'à 48h (Figure 5). Ainsi cette lignée
représente un modèle relevant pour étudier les effets de l'expression de TReP-
1 32 sur
la prolifération cellulaire. Alors que les cellules HTO-GFP/TReP-132 cultivées
en
présence de Dox reprennent une croissance cellulaire normale avec un temps de
doublement d'environ 16h 4 jours après l'ensemencement des cellules,
l'enlèvement de
la Dox réduit considérablement le taux de prolifération cellulaire à un temps
de
doublement d'environ 60h (Figure 6). Puisqu'il n'était pas observé de
différence dans
les taux de prolifération entre les cellules HTO-GFP ou les cellules
parentales HTO
incubées ou non avec la Dox, il peut être conclu que la sur-expression de TReP-
132
résulte en un effet inhibiteur puissant de la prolifération des cellules HeLa.
2- Effet de la sur-expression de TReP-132 sur le cycle cellulaire : arrêt en
phase
G1.
Si TReP-132 est effectivement impliqué dans la régulation de la progression du
cycle
cellulaire, on peut s'attendre à ce que son expression soit aussi régulée
durant les
différentes phases du cycle cellulaire. Pour résoudre cette question, l'étude
par
cytométrie de flux du contenu en ADN des cellules colorées à l'iodure de
propidium
indique que l'induction de l'expression de TReP-132 bloque les cellules en
phase G1
(Figure 7). En effet, à partir de 48 heures après l'enlèvement de la
doxycycline, qui
correspond à l'induction optimale de TReP-132, on observe une augmentation de
cellules en phase G1 et parallèlement, une diminution de cellules en phase S.
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53
De plus, des cellules Hela ont été synchronisées en fin de phase GI par double
blocage à la thymidine. Vingt heures après la fin de la deuxième incubation
des cellules
à la thymidine, qui correspond au temps 0 de nos expériences, les cellules ont
été
récoltées toutes les quatre heures, pour analyses du cycle cellulaire par
cytométrie de
flux et de l'expression de TReP-1 32 par RNase protection. L'expression de
TReP-1 32
est induite aux temps T20 et T28, lorsque les cellules sont majoritairement en
phase
G1 (88 et 57% des cellules, respectivement) (Figure 8). Au contraire, elle
n'est pas
détectable lorsque les cellules sont à 82% en phase S, au temps T24. Ainsi
cette
expérience démontre que l'expression de TReP-132 est dépendante du cycle
cellulaire
en phase G1, ce qui est cohérent avec la capacité de cette protéine à arrêter
la
progression du cycle cellulàire au niveau de cette phase.
Ces résultats démontrent une corrélation inverse entre l'expression de TReP-1
32 et la
progression du cycle cellulaire.
3- L'expression de TReP-132 conduit à l'inhibition des activités CDK (Cyclin
Dependant Kinases) et à la baisse de la phosphorylation de pRb (protéine du
Rétinoblastome).
La progression du cycle cellulaire est assurée par des protéines kinases
dépendantes
des cyclines (CDKs) qui phosphorylent une variété de protéines clés impliquées
dans le
contrôle du cycle cellulaire (Schafer, 1998). Les CDKs étant constitutivement
exprimées
au cours du cycle cellulaire, la régulation de leur activité, qui intervient
uniquement à
des étapes spécifiques du cycle cellulaire, est assurée par des mécanismes
post-
transcriptionnels. Ainsi, elles ne sont activées que par leur interaction avec
des cyclines
spécifiques, les cyclines A, B, C, Dl, ou E, appelées ainsi du fait de leur
expression
cyclique au cours du cycle cellulaire. D'autre part, elles sont inhibées par
interaction
avec les inhibiteurs des CDKs (CDKIs), ce qui empêche par compétition leur
liaison
avec les cyclines et leur activation conséquente. L'expression des CDKIs est
également
régulée pendant la progression du cycle cellulaire, ainsi que par les facteurs
de
croissance (Owa et al., 2001), en particulier ceux de la famille de l'insuline
(Stewart et
al., 1990). Par ailleurs, il a été montré que les taux respectifs des CDKIs
(et des
cyclines) sont altérés par l'exposition des cellules aux radiations,
confirmant ainsi leur
implication dans les processus associés au développement des tumeurs (Bernhard
et
al., 1995). Le fait que TReP-132 ait initialement été caractérisé comme
facteur de
transcription (Gizard et al., 2001) suggérait qu'il contrôlait la progression
du cycle
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cellulaire en régulant l'expression des protéines induites transitoirement au
cours du
cycle.
La progression tout au long du cycle cellulaire est contrôlée par une famille
de cdks
dont l'activité est régulée par phosphorylation, activée par la liaison des
cyclines et
inhibée par des inhibiteurs de cdk, qui incluent la famille des inhibiteurs
de cdk4
( INK4 ) (p16i"K4A, p15 i"K4g, p18 et p19) et la famille des protéines
inhibitrices des
kinases ( KIP ) (p21 WAFiaP-', p27Kip1 et p57Kip2) (Sherr, 1994; Morgan,
1995; Sherr
and Roberts, 1999). Une cible clef de l'action de cdk durant la phase G1 est
le produit
du gène de sensibilité au rétinoblastome (pRb) qui induit l'arrêt en phase G1
en
séquestrant des facteurs de transcription de la famille E2F-DP. La
phosphorylation de
pRb et d'autres membres de cette famille tels que p107 et p130, grâce à des
complexes actifs cycline-cdk, conduit à la libération de E2F et DP et à la
régulation
transcriptionnelle qui en découle de gènes cibles requis pour l'entrée en
phase S.
La phosphorylation de pRb et des histones H1 par les CDK de la phase G1
représente
un événement important pour la passage des cellules en phase S (Peter and
Herskowitz, 1994; Zarkoska and Mittnacht, 1997). Afin de déterminer
l'influence de
TReP-132 sur les activités des complexes cyclines/CDKs, les activités kinases
associées aux complexes immunoprécipités cycline D1/CDK6 et cycline A/CDK2 ont
été mesurées in vitro en utilisant respectivement les substrats pRb et les
histones H1
(Kitagawa et al., 1996; Koff et al., 1991). Les résultats, présentés sur la
figure 9A,
montrent que l'induction de l'expression de TReP-132 dans les cellules HTO-
GFP/TReP-132 pendant 48 heures réduit les activités kinases étudiées in vitro
associées aux complexes cyclines/CDKs immunoprécipités de phase G1 (cycline
D1/CDK6 et cycline A/CDK2).
Les analyses réalisées directement à partir d'extraits protéiques totaux de
cellules HTO
présentés sur la figure 9B montrent que tandis que pRb est majoritairement
présent
dans un état inactif hyperphosphorylé (ppRb) dans les cellules HTO exprimant
la GFP
et TReP-132 sous le contrôle de la Doxycycline non induites, l'expression de
TReP-132
entraîne une augmentation significative de l'état hypophosphorylé de pRb (pRb)
avec
une réduction marquée du niveau de pRb phosphorylé (ppRb). Les niveaux de pRb
phosphorylée baisse dans les 24 heures du retrait de la Dox avec un niveau
presque
indétectable après 72 heures tandis qu'aucun changement n'est constaté sur la
phosphorylation de pRb dans les cellules HTO exprimant la GFP seule. Ainsi,
ces
résultats montrent que l'hypophosphorylation de pRb atteint son maximum à 36
heures,
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moment clé précédent l'accumulation maximale de cellules en phase G1 (observée
à
48 heures), ce qui démontre le rôle de TReP-132 dans l'arrêt en phase G1.
4- TReP-132 entraîne une augmentation de l'expression des CDKI (Cyclin
5 Dependant Kinase Inhibitor).
Il a ensuite été déterminé par protection de la RNase si l'induction de TReP-
132 dans
les cellules HeLa affectait la transcription des gènes codant pour les CDKIs
suivantes:
p57, p27, p21, p19, p18, p16 et p27/p15, ainsi que celle des facteurs
contrôlant la
progression de la phase G1: Rb, p130, p107 et p53. L'étude a montré que suite
à
10 l'induction de l'expression de TReP-132 par l'élimination de la doxycycline
du milieu, les
gènes p27KIP', p21cIP1/WAF1~ p16I"K4 ont été induits (Figure 10). Le fait que
ces trois
inhibiteurs de cyclines soient impliqués dans la modulation de la progression
de la
phase G1 corrèle avec le fait que l'expression de TReP-132 est induite et que
TReP-
132 bloque le cycle cellulaire en phase G1.
15 La capacité de TReP-132 à activer les promoteurs de ces gènes a ensuite été
déterminée. Des doses croissantes du vecteur d'expression pcDNA3-TReP-132 ont
été
co-transfectées avec chacun des plasmides rapporteurs contenant les régions
promotrices des gènes codant pour p21, p16 et p27. Le promoteur p27 est activé
d'une
manière dose-dépendante avec TReP-1 32, jusqu'à atteindre environ une
induction de 7
20 fois, en co-transfectant 0,3 pg de vecteur d'expression TReP-132 (Figure
11). A des
niveaux moindres, les promoteurs p21 et p16 peuvent aussi être activés par
TReP-132
avec un niveau maximal d'induction de 2 à 3 fois, comparativement au contrôle
en
absence de TReP-132. Ces expériences démontrent clairement le rôle direct de
TReP-
132 sur la transcription de molécules clés régulatrices du cycle cellulaire.
5. Caractérisation de l'activation avec TReP-132 agissant comme médiateur sur
les promoteurs p27 et p21.
p21 et p27 sont les CDKIs dont la régulation a été la plus étudiée notamment
au niveau
de leur fonction déterminante dans la transition de la phase GI à la phase S
du cycle
cellulaire. En effet, ils inhibent les complexes CDK2 et CDK4 associés aux
cyclines,
dont l'activité est corrélée avec le début de la duplication des chromosomes.
La transcription de p21 peut être induite par la progestérone. (Owen et al.,
1998) ont
démontré que cette induction implique une interaction entre le récepteur à la
progestérone (PR), CBP/p300 et le facteur de transcription Sp1, au niveau des
sites de
liaison de l'ADN à Sp1 à proximité de la TATA box. Puisque TReP-132 interagit
avec
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CBP/p300 pour augmenter la transcription du gène codant pour P450scc (Gizard
et al.,
2001), il a été évalué si l'induction du promoteur p21 par TReP-132 impliquait
similairement une interaction avec CBP/300. Afin de tester cette hypothèse,
les
vecteurs d'expression codant pour TReP-132, Sp1, ou p300 ont été co-
transfectés
indépendamment ou simultanément. Comme décrit précédemment par (Owen et al.,
1998) Sp1 et p300 peuvent induire le promoteur p21 et ont un effet additif
lorsque qu'ils
sont co-transfectés simultanément (Figure 12). Dans cette invention, les
inventeurs ont
démontré que TReP-132 a un effet additif sur l'activation conférée par Sp1 ou
p300, et
qu'une activation maximale du promoteur p21 est obtenue lorsque les trois
facteurs de
transcription sont co-exprimés. La spécificité du rôle de p300 dans cette
activation est
démontrée par la co-expression de E1A qui est connu pour son effet inhibiteur
sur p300
(Frangioni and Neel, 1993; Monte et al., 1998). Ainsi, en présence de la
protéine E1A,
l'effet activateur est fortement réprimé.
Des études antérieures ont permis l'identification de 6 sites de liaison
proximaux à Sp1
dans la région -117/-51 du promoteur du gène p21 (Hong et al., 2002 ;
Kardassis et al.,
1999 ; Lu et al., 2000 ; Nakano et al., 1997 ; Pardali et al., 2000; Prowse et
al., 1997 ;
Santini et al., 2001 ; Somasundaram et al., 1997 ; Steger et al., 2002; Zhang
et al.,
2000) et de 2 sites de liaison au niveau des positions -544 et -536 du
promoteur du
gène p27 (Lee et al., 2003 ; Ryhanen et al., 2003 ; Williamson et al., 2002)
jouant un
rôle clé dans la régulation de ces gènes.
Afin d'étudier le mécanisme d'activation des promoteurs des gènes p21 et p27
par
TReP-132, des constructions rapporteurs contenant des éléments de réponse à
Sp1
wt, mutants ou délétés ont été co-transfectées avec des vecteurs d'expression
Sp1
et/ou TReP-132 dans des cellules HeLa. Les résultats, présentés sur les
figures 13A et
13B montrent que, de manière surprenante, les activités des construits -2320
p21 Luc
et -3568 p27 Luc sont augmentées en présence de Sp1 ou de TReP-132 seul,
l'activité
la plus importante étant obtenue lors de la transfection des 2 facteurs. Les
résultats de
la figure 13B montrent que la construction promotrice la plus courte (-154 p21
Luc)
comprenant l'élément de réponse à Sp1 est activée par Sp1 et TReP-132 tandis
que la
réponse à Sp1 et/ou à TReP-132 est abolie lorsque l'élément de réponse à Sp1
est
délété. Les résultats de la figure 13B montrent que la construction -549 p27
Luc est
toujours activée par Sp1 et/ou TReP-132 tandis que des délétions
supplémentaires de
la région comprenant les sites Sp1 entraînent un arrêt de l'activation par Sp1
ou TReP-
132, seul ou ensemble. L'activation par Sp1 et TReP-132 est abolie par la
mutation du
nucléotide -544 dans la construction -3568 p27 Luc. Ces résultats indiquent
donc que
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TReP-132 et Sp1 interagissent au niveau des sites proximaux de liaison à Sp1
sur les
promoteurs des gènes p21 et p27.
Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ont ensuite été
mise en
oruvre pour évaluer l'interaction de TReP-132 et de Sp1 avec les sites
proximaux de
liaison à Sp1 des prom'oteurs des gènes p21 et p27 dans la cellule. Pour ce
faire, les
expériences sont réalisées dans des cellules HTO en utilisant un anticorps
anti-Flag
pour immunoprécipiter la protéine de fusion Flag-TReP-132. Les résultats sont
présentés sur la figure 13C. Les régions d'ADN génomiques entourant les
éléments de
réponse à Sp1 des promoteurs des gènes p21 et p27 ont été immunoprécipitées
par
l'anticorps anti-Flag dans les cellules HTO exprimant la GFP et TReP 132 sous
le
contrôle de la doxycycline dans lesquelles l'expression de TReP-132 est
induite, mais
non dans les cellules HTO exprimant la GFP. Des amplifications par PCR
utilisant des
amorces couvrant une région d'environ 1 kb en amont des éléments de réponse à
Sp1
des promoteurs des gènes p21 et p27 ou des oligonucléotides spécifiques de la
béta-
actine n'ont pas montré de signaux significatifs démontrant ainsi la
spécificité des
immunoprécipitations et des réactions d'amplification par PCR. Ces résultats
démontrent ainsi que TReP-132 fait parti d'un complexe liant les sites de
liaison
proximaux de Sp1 des promoteurs des gènes p21 et p27.
Des expériences de retard sur gel utilisant une protéine TReP-132 produite in
vitro et
des oligonucléotides double brins entourant les sites Sp1 sur les promoteurs
des gènes
p21 et p27 ont ensuite été réalisées afin de déterminer si TReP-132 se lie
directement
aux sites des liaison Sp1. La formation de complexes ADN/protéine n'a pas été
détectée, ce qui indique que TReP-132 active le promoteur via l'interaction
avec
d'autres protéines de liaison à l'ADN telles que Sp1. Afin de tester cette
hypothèse, des
expériences de pull-down ont été réalisées en utilisant les protéines de
fusion GST ou
GST-TReP-132 et des protéines Sp1 marquées. Les résultats, présentés sur la
figure
13D, montrent qu'une interaction protéine/protéine est observée entre Sp1 et
la
protéine de fusion GST-TReP-132 tandis qu'aucune interaction n'est observée
entre
Sp1 et la protéine GST.
6- Interaction de TReP-132 avec les récepteurs de la progestérone et des
oestrogènes.
La médiation par TReP-132 des effets inhibiteurs de la croissance cellulaire
de la
progestérone ainsi que les effets similaires de TReP-132 et de la progestérone
sur la
prolifération des cellules du cancer du sein suggèrent que ces 2 facteurs
interagissent
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pour réguler la transcription des gènes p21 et p27. L'activation du gène p21
par le
récepteur à la progestérone lié (PR) au travers de l'interaction avec Sp1 au
niveau du
3ème et 4ème sites Sp1 (respectivement Sp1-3 et Sp1-4) a été démontrée par
(Owen et
al., 1998).
Afin de tester l'interaction de TReP-132, PR et Sp1 au niveau des sites de
liaison à Sp1
des 2 promoteurs, les constructions rapporteurs comprenant les 2 promoteurs
ont été
co-transfectées dans les cellules T47-D avec des plasmides d'expression TReP-
132 et
les cellules ont été traitées ou non à la progestérone. Les résultats,
présentés sur les
figures 14A et 14B, montrent que TReP-132 stimule les 2 promoteurs, de la même
manière que le traitement à la progestérone tandis qu'une activation plus
importante est
constatée lors de la transfection des cellules avec TReP-132 combinée au
traitement à
la progestérone. Les résultats de la figure 14A montrent qu'une mutation au
niveau du
site Sp1-3 du construit -93 p21 Luc abolit complètement l'activation du
promoteur par
TReP-132 et la progestérone, seul ou en combinaison, tandis que la mutation au
niveau du Sp1-4 entraîne une réduction de l'activation progestérone-
dépendante. De la
même manière, la figure 14B présente les résultats obtenus lors de la délétion
des sites
de liaison Sp1 du promoteur du gène p27 montrant une réduction des effets
d'induction
de TReP-132 et de la progestérone. Ces résultats indiquent que TReP-132
pourrait
coopérer avec PR et Sp1 pour agir en tant que médiateur des effets de la
progestérone
sur l'expression des gènes p21 et p27.
Des essais ChIP ont ensuite été réalisés afin de tester cette hypothèse dans
la cellule,
en utilisant l'ADN des cellules T47-D traitées ou non avec la progestérone et
un
anticorps anti-TReP-132. Les résultats (figure 14C) montrent que l'élément de
réponse
à Sp1 proximal des promoteurs p21 et p27 est immunoprécipité dans un complexe
obtenu en utilisant un anticorps anti-TReP-132. La liaison par TReP-132 est
beaucoup
plus prononcée avec l'ADN des cellules traitées à la progestérone. Le contrôle
négatif
est constitué par des extraits d'ADN amplifiés avec des amorces couvrant une
région
d'environ 1 kb en amont des sites de liaison Sp1 ou des amorces spécifiques du
gène
de la béta-actine pour lesquels aucun produit n'a été identifié.
Des expériences de pull-down ont permis ensuite de montrer que TReP-132 et PR
interagissent (figure 14D, colonne 3) et que cette interaction est augmentée
de manière
dose-dépendante par la progestérone (figure 14D, colonnes 3 à 7). TReP-132
présente
2 NR-box (Nuclear Receptor box) et des motifs LXXLL au niveau des acides
aminés
181 (LRQLL) et 863 (LEMLL) (Gizard et al., 2001). De plus, il a été montré que
la
présence du motif LXXLL amino-terminal est indispensable pour l'interaction
avec SF-1
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(Gizard et al., 2002b). Des expériences de pull-down ont ensuite été réalisées
avec des
protéines GST-TReP-132 mutées au niveau de chaque motif LXXLL. La figure 14D
(à
droite) montre qu'une mutation de chaque motif entraîne une diminution nette
de la
liaison de TReP-132 à PR ce qui prouve l'importance des motifs LXXLL dans
l'interaction in vitro de TReP-132 avec PR. Pris ensemble, ces résultats
montrent que
TReP-132 est un co-activateur de PR dans le complexe de régulation formé avec
SP1
au niveau du site de liaison proximal à SP1 des promoteurs des gènes p21 et
p27.
De la même manière, des expériences de pull-down ont été réalisées afin de
tester
l'interaction de TReP-132 et de ER. Les résultats, présentés sur la figure 15,
montrent
que TReP-132 et ER interagissent (Iigne 3).
En combinant ces résultats avec les résultats montrant une diminution nette de
l'expression de TReP-132 associée à une augmentation de la prolifération
cellulaire
dans les cellules MCF-7 traitées à l'cestradiol, on peut conclure que l'action
de ER sur
la prolifération cellulaire passe par un mécanisme mettant en jeu une
interaction avec
TReP-132.
Des expériences supplémentaires de FRET (Fluorescence Resonance Energy
Transfer) ont par ailleurs permis de mettre en évidence l'effet d'un ligand
sur le
recrutement de TReP-132 par ER et PR : la mesure du transfert d'énergie entre
d'un
côté l'AlloPhycoCyanin (APC) couplée à un anticorps anti-GST aux protéines de
fusion
GST-PR ou GST-ER et de l'autre la R-phycoerythrine (RPE) couplée à la
streptavidine
au complexe Biotine/NR-box de TReP 132 permet la mise en évidence de la
liaison
ligand dépendante entre TReP 132 et les récepteurs ER et PR.
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