Note: Descriptions are shown in the official language in which they were submitted.
CA 02601366 2007-09-12
WO 2006/097631 PCT/FR2006/000578
PROCEDE ET DISPOSITIF PERMETTANT D'ISOLER
DES MICROORGANISMES
La présente invention se rapporte à l'isolement des
microorganismes.
Nombre de microorganismes se développent en
synthétisant un biofilm. Outre les bactéries, les
champignons, les algues, les protozoaires s'organisent
également en biofilms.
Les biofilms sont donc omniprésents dans de nombreux
domaines pour lesquels ils présentent des risques sanitaires
et causent parfois des dommages relativement importants.
Lorsqu'un biofilm se dével ppe, il y a d'abord adhésion
des bactéries sur un support puis colonisation de ce
support. Les bactéries en se multipliant forment rapidement
un film constitué par des strates de corps cellulaires
sécrétant une gangue d'exopolysaccharide qui les protège des
agressions du milieu environnant (COSTERTON et al., Science,
vol.284(5418), p :1318-22, 1999). La cinétique de formation
d'un biofilm peut être subdivisée en 5 étapes (figure 1):
- Conditionnement de la surface : Les molécules
organiques ou minérales présentes dans la phase liquide vont
s'adsorber sur la surface, pour y former un film
conditionnant .
- L'adhérence ou adhésion réversible : Les
microorganismes présents se rapprochent des surfaces par
gravimétrie, mouvements browniens ou par chimiotactisme
s'ils possèdent des flagelles. Au cours de cette première
étape de fixation, faisant intervenir uniquement des
phénomènes purement physiques et des interactions physico-
chimiques faibles, les microorganismes peuvent encore être
facilement,décrochés.
CA 02601366 2007-09-12
WO 2006/097631 PCT/FR2006/000578
2
- L'adhésion : Cette étape plus lente fait intervenir
des interactions de plus forte énergie ainsi que le
métabolisme microbien et les appendices cellulaires du
microorganisme (flagelles, pilis,....). L'adhésion est un
phénomène actif et spécifique. Les premiers colonisateurs
vont s'attacher de manière irréversible à la surface grâce
notamment à la synthèse d'exopolysaccharides (EPS). Ce
processus est relativement lent et dépend des facteurs
environnementaux et des microorganismes en présence.
- La maturation du biofilm (développement et
colonisation de la surface) : Après avoir adhéré à une
surface, les bactéries se multiplient et se regroupent pour
former des microcolonies entourées de polymères. Cette
matrice de polymères (ou glycocalyx) va agir comme un
ciment et renforcer l'association des bactéries entre-
elles et avec la surface pour finalement former un biofilm
et atteindre un état d'équilibre. Le biofiim se développe
généralement en une structure tridimensionnelle qui
constitue un lieu de confinement. Ce micro-environnement va
être le siège de nombreuses modifications physiologiques et
moléculaires par rapport au mode de croissance planctonique.
Le biofilm ainsi formé va occuper toute la surface qui lui
est offerte si les conditions le lui permettent.
Généralement la maturation du biofilm est corrélée à la
production d'EPS même si certaines espèces de
microorganismes ne synthétisant pas ou peu de polymères
peuvent également adhérer et former des biofilms sur des
surfaces.
- Décrochement : Les biofiims sont des structures en
perpétuel équilibre dynamique qui évoluent en fonction du
support, des microorganismes et de l'environnement. Cette
évolution peut se traduire par des décrochements de cellules
ou d'agrégats.
Selon la présente invention, la propriété d'adhésion et
de fixation des microorganismes est utilisée pour permettre
l'isolement de ceux-ci.
CA 02601366 2007-09-12
WO 2006/097631 PCT/FR2006/000578
3
Le principe de l'invention consiste à ajouter dans un
prélèvement brut, plus ou moins liquide, d'un milieu dont on
veut étudier la contamination par un microorganisme, des
particules, particulièrement des billes, magnétiques ou
magnétisables, à laisser les billes en contact avec le
milieu pendant un temps suffisant à l'adhésion des
microorganismes à la surface des particules, à isoler
lesdites particules du milieu par tout moyen approprié,
particulièrement à l'aide d'un aimant et à étaler lesdites
particule sur un milieu de culture solide adéquat afin de
réaliser une culture desdits microorganismes piégés avec les
particules.
Ainsi l'invention à pour objet un procédé d'isolement
d'au moins un microorganisme à partir d'un milieu les
contenant, comprenant les étapes suivantes :
a) introduction dans un prélèvement dudit milieu
d'une quantité donnée de particules magnétiques ou
magnétisables
b) incubation des particules et du milieu pendant un
temps suffisant à l'adhésion des microorganismes à la
surface desdites particules ;
c) séparation desdites particules du milieu
d) étalement desdites particules sur un support
compatible avec le développement des microorganismes ;
e) incubation desdites particules sur un support
pendant un temps suffisant au développement de colonies
correspondant au microorganisme isolé.
Selon un mode de réalisation particulier de
l'invention, le procédé peut comprendre une étape préalable
de pré-culture du prélèvement dudit milieu contenant le
microorganisme que l'on veut isoler. Pour cela on porte
ledit prélèvement à une température compatible avec la
viabilité des microorganismes. On sait parfaitement que,
CA 02601366 2007-09-12
WO 2006/097631 PCT/FR2006/000578
4
outre les organismes vivants à des températures classiques
(20 à 50 degrés Celsius), il existe des microorganismes
vivants dans des conditions extrêmes en températures, en
pression partielle de gaz (Oxygène, Azote, gaz carbonique,
5...), en salinité, en pH (acide, basique), en conditions
d'oxydo-réductions et/ou en conditions aérobies ou
anaérobies. Dès Lors, l'Homme du Métier adaptera la
température de culture aux exigences de l'organisme qu'il
cultive. De la manière la plus courante, les températures
de culture peuvent être comprises entre 20 et 50 degrés
Celsius, de préférence entre 30 et 40 degrés Celsius. Cette
étape de préculture qui a pour objectif d'enrichir le milieu
de culture en microorganismes peut s'effectuer pendant un
temps très variable en fonction des microorganismes, qui
peut-être compris entre 20 minutes et 7 à 10 jours, de
préférence entre 1 et 48 heures, éventuellement sous
agitation.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier
de l'invention, le procédé peut comprendre une étape
supplémentaire intercalée entre les étapes c) et d) du
procédé selon l'invention, consistant en l'immersion
facultative des billes obtenues à l'étape c) dans une
solution de rinçage avantageusement aqueuse permettant
d'éliminer le précédent milieu et permettant d'éliminer les
microorganismes non adhérents (présents dans le liquide
d'imbibition des billes). Cette étape permet de sélectionner
les microorganismes les plus adhérents et dont l'adhésion
est la plus irréversible. Cette étape peut aussi être
l'occasion de traitements rapides ou prolongés pour tester
les propriétés d'adhésion des microorganismes (traitements
préventifs ou curatifs dans la solution de rinçage).
L'Homme du Métier sait déterminer sans difficulté la
quantité de billes qu'il introduit dans le milieu.
Selon l'invention, l'incubation de l'étape b) se
poursuit pendant un temps qui peut être compris entre
CA 02601366 2007-09-12
WO 2006/097631 PCT/FR2006/000578
quelques secondes et quelques heures, de préférence entre 15
secondes et 45 minutes en fonction des microorganismes.
Après ce temps d'incubation, les microorganismes ont pu
adhérer sur les particules (billes).
5 Selon l'invention, la séparation des particules et du
milieu à l'étape c) peut être réalisée selon toute méthode
connue de l'Homme du Métier. Par exemple, on pourrait
prélever ces particules par centrifugation et élimination du
milieu de culture, ou encore, et préférentiellement selon
l'invention, en utilisant un système générant un champ
magnétique ou électrique capable d'attirer les particules,
particulièrement un aimant. Selon cette forme de réalisation
particulièrement préférée, les particules sont prélevées à
l'aide d'un aimant, lequel est avantageusement plongé dans
le prélèvement.
Selon un mode de réalisation avantageux, le système
générant un champ magnétique ou électrique capable d'attirer
les particules, particulièrement un aimant, peut être
protégé par tout système, particulièrement un revêtement
amovible ou un capot, réalisé en tout matériau, par exemple
du plastique, qui n'interfère pas avec les ondes magnétiques
ou électriques. Encore plus avantageusement, ledit capot est
jetable après utilisation. On pourrait alors réutiliser cet
aimant.
Selon encore un mode de réalisation particulier de
l'invention, le procédé peut comporter une étape
supplémentaire de lavage du système générant un champ
magnétique ou électrique afin d'éliminer les microorganismes
non adhérents présents dans le liquide de mouillage, ou les
microorganismes faiblement adhérents. Au cours de cette
étape supplémentaire, on plonge ledit système dans une
solution de lavage qui peut, par exemple, être du milieu de
culture stérile. L'Homme du Métier comprend que cette étape
en principe ne dure pas plus de quelques secondes, tout au
CA 02601366 2007-09-12
WO 2006/097631 PCT/FR2006/000578
6
plus quelques minutes, le temps nécessaires à l'élimination
des microorganismes non-adhérents à la surface du système.
Selon l'invention, l'étalement desdites particules sur
un support compatible avec le développement des
microorganismes peut être réalisé par dépôt desdites
particules à la surface d'un dispositif de culture de
microorganisme, par exemple une boîte de Pétri contenant un
milieu de culture adéquat au développement des
microorganismes.
Selon un mode de réalisation particulier, le dépôt
peut-être réalisé en retirant l'aimant du capot plastique
tout en rapprochant le capot plastique de la surface du
dispositif de culture de microorganismes.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, les
billes peuvent être déposées en utilisant un autre aimant
placé sous la surface du dispositif de culture.
Pour étaler et disperser les billes, on peut utiliser
tout système connu de l'Homme du Métier, comme par exemple
un étaleur manuel. Selon un mode de réalisation particulier,
on utilise un aimant rotatif placé sous la surface du
dispositif de culture de microorganismes.
La dispersion des billes peut être obtenue aussi par un
vortex liquide généré par la rotation dispositif de culture
de microorganisme.
Une fois les particules (billes) dispersées, le
dispositif de culture est placé dans un incubateur pendant
un temps suffisant au développement des microorganismes à la
surface du dispositif. Ici, l'Homme du métier adaptera le
temps d'incubation et la température au microorganisme qu'il
désire isoler. Ce temps peut être compris entre quelques
heures et plusieurs jours, de préférence entre 4 heures et
48 heures. La température d'incubation peut être comprise
entre 30 et 40 degrés Celsius.
CA 02601366 2007-09-12
WO 2006/097631 PCT/FR2006/000578
7
D'autres avantages de l'invention apparaîtront dans les
figures annexées dans lesquelles :
= la figure 1 représente une comparaison des méthodes
traditionnelles de prélèvement des microorganismes (A) et la
méthode selon l'invention (B) ;
= la figure 2 représente les étapes de prélèvement et
de rinçage des particules ;
= la figure 3 représente le dépôt des particules à la
surface d'une boîte de Pétri ;
= la figure 4 représente la dispersion des particules
à la surface de la boîte de Pétri à l'aide d'un aimant
rotatif.
