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DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
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THIS IS VOLUME 1 OF 2
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Utilisation d'un symbiotique pour le traitement de la dermatite atopique
Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui produisent un bénéfice
pour la
santé de leur hôte. Cet effet bénéfique s'explique notamment par
l'amélioration de
l'équilibre de la flore intestinale (1). Les plus connus sont les
lactobacilles et les
bifidobactéries qui permettent, en se multipliant dans l'intestin, de réduire
par simple
compétition la population bactérienne potentiellement pathogène.
1o Les prébiotiques sont quant à eux des substances qui ne peuvent être
digérées par
l'organisme et/ou qui ont des effets bénéfiques sur la personne qui les
consomme en
stimulant la croissance ou l'activité de certaines bactéries non pathogènes et
naturellement présentes dans le côlon:;
La durée de vie limitée et le faible taux de survie des probiotiques demeurent
toutefois
des obstacles majeurs à leur utilisation en thérapie. Il y a donc un besoin
pour des
prébiotiques appropriés, ainsi que des combinaisons optimisées de prébiotiques
et de
probiotiques (symbiotiques) permettant d'obtenir une amélioration
significative de
l'efficacité des probiotiques. Une telle combinaison présenterait bien entendu
des
avantages certains pour le traitement d'affections atopiques, et tout
particulièrement de
la dermatite atopique (DA).
A ce jour, il n'existe aucune donnée sur l'utilisation de prébiotiques ou de
symbiotiques
dans le traitement de la dermatite atopique.
La dermatite atopique est une dermatose dont la prévaience chez les enfants
des pays
occidentaux est située entre 10 et 25% (2, 3). Son évolution est chronique
avec
amélioration fréquente à l'adolescence. Les formes modérées et sévères, de par
la
chronicité des lésions prurigineuses, inesthétiques et nécessitant des soins
locaux
quotidiens, ont un retentissement psychologique important. Le traitement de
fond
repose sur l'application régulière d'émollients, associée à des règles hygiéno-
diététiques. Les poussées nécessitent l'application de corticoïdes ou
d'immunosuppresseurs sous forme topique. Cependant les rechutes sont
courantes, la
chronicité peut détériorer la quafité de vie tant du pâtient que de sa
famille, et l'usage
prolongé de traitement induit des effets secondaires.
La pathogénie de la dermatite atopique repose sur une dysrégulation de
l'immunité à
médiation cellulaire avec déséquilibre dans le rapport Thl/Th2, au profit
d'une réponse
de type Th2. L'augmentation constante de la prévaience de la dermatite
atopique dans
les pays occidentalisés serait corrélée à l'amélioration des conditions
d'hygiène. Les
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enfants seraient ainsi moins exposés aux agents infectieux pendant leurs
premiers
mois ou années de vie et développeraient ainsi une réponse Th2 préférentielle
(4-7). Il
n'existe à i'heuré actuelle aucun traitement commercialisé permettant de
corriger cette
dysrégulation immunitaire.
Les probiotiques sont des micro-organismes vivants, commensaux du tube
digestif, qui
peuvent avoir des propriétés antiallergiques en favorisant une réponse de type
Th1 (8,
9). Tous les probiotiques n'ont cependant pas les mêmes propriétés
immunologiques.
Dans un récent article réalisé avec des cellules dendritiques de souris, la
bactérie
Lactobacillus rhamnosus a montré de manière significative qu'elle induisait la
production de cytokines favorisant la réponse Th1 [à savoir les interleukines
IL-12, IL-
6, le facteur a de nécrose des tumeurs TNF tumour necrosis factor a ] sans
augmenter la production d'IL-10 (connue pour son rôle actif dans la réponse
Th2) (10).
Cette souche présente donc un grand intérêt dans le traitement de la dermatite
atopique.
II a été montré par ailleurs que L. rhamnosus GG était efficace dans la
prévention de la
dermatite atopique (11 et 12) et, à un degré moindre, dans le traitement des
jeunes
enfants (13-15). Ces études ont été réalisées avec de très jeunes enfants et
l'efficacité
du traitement pourrait être dû à une colonisation initiale de la microflore
intestinale.
Cependant, les effets immuno-modulateurs des probiotiques sont aussi observés
chez
les enfants et les adultes, et pourraient donc être efficaces sur ces groupes
d'âge (16).
A ce jour, une unique étude a évalué l'utilisation de probiotiques pendant 6
semaines
seulement, chez des enfants âgés de 6 mois ou plus (17). Si cette étude permet
de
mettre en évidence que des probiotiques peuvent permettre de réduire
l'inflammation
intestinale consécutive à la dermatite atopique, l'efficacité à long terme de
l'usage de
probiotiques pour traiter la dermatite atopique n'est cependant pas traitée.
II existe donc un important besoin pour une association symbiotique d'un
prébiotique et
d'un probiotique, permettant d'une part d'assurer un bon taux de survie du
probiotique
et d'autre part de traiter la dermatite atopique.
La présente invention montre l'efficacité du symbiotique (probiotique L.
rhamnosus et
prébiotiques), dans la prévention et le traitement de la dermatite atopique,
en
.. ,
particulier chez des enfants de plus de deux ans.
La présente invention concerne tout particulièrement l'utilisation de la
souche
Lactobacillus rhamnosus Lcr35 (probiotique) associée à du lactose (notamment
en
association avec un milieu à base de lactose), dans le traitement de la
dermatite
atopique. Par traitement de la dermatite atopique, on comprend traitement
curatif et/ou
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préventif. L'invention met également en lumière l'importance du lactose dans
le
traitement de la dermatite atopique.
La souche Lactobacillus rhamnosus Lcr35 est une souche dérivée de l'espèce
Lactobacillus rhamnosus (aussi nommée Lactobacillus casei subsp. rhamnosus),
cette
dernière étant déposée à l'ATCC sous le numéro ATCC 7469. La souche
particulière
Lactobacillus rhamnosus Lcr35 peut être obtenue selon le protocole défini dans
l'exemple 1.
La présente invention concerne l'utilisation d'un produit comprenant une
bactérie
Lactobacillus rhamnosus en association avec du lactose dans le traitement de
la
dermatite atopique. De préférence, la bactérie Lactobacillus rhamnosus est
dans un
milieu à base de lactose. L'utilisation est de préférence pour la fabrication
d'un
médicament, d'un complément alimentaire, etc..., pour traiter un patient
atteint de
dermatite atopique ou pour la prévention d'une telle affection. Le traitement
ou la
prévention, au sens de la présente invention, comprend la réduction du risque
allergique et l'amélioration de l'état de santé du patient.
Le produit selon l'invention est donc une combinaison d'un probiotique
(bactérie
Lactobacillus rhamnosus) et d'un prébiotique (lactose, et plus spécifiquement
milieu à
base de lactose). Un tel produit peut donc être dénommé symbiotique. Le
lactose est
en effet connu pour son activité prébiotique ; il arrive dans l'intestin sous
forme non
transformée, il constitue alors un aliment pour certaines populations
bactériennes de la
flore intestinale, ce qui justifie son appellation de prébiotique.
Du fait de l'implication du lactose dans les allergies au lait, l'utilisation
de ce dernier
comme prébiotique par les présents inventeurs est particulièrement originale.
De préférence, la bactérie considérée, entrant dans la composition du produit,
est
capable de fermenter le lactose.
En effet, les inventeurs ont constaté que le taux de survie du probiotique
était très
largement augmenté lorsque ledit probïotique était associé avec un élément
nécessaire
à sa croissance. Ainsi, dans un produit selon l'invention, sont présents le
probiotique
capable de fermenter le lactose ainsi que, notamment, du lactose, nécessaire à
la
survie du probiotique.
Selon un aspect particulièrement préféré de la présente invention, ladite
bactérie est la
,. ,
bactérie Lactobacillus rhamnosus Lcr35. En effet, la souche L. rhamnosus Lcr35
a la
capacité de fermenter le lactose alors que la souche L. rhamnosus GG par
exemple ne
peut le faire.
Un symbiotique tel que défini dans la présente invention peut bien entendu
contenir au
moins deux, voire plusieurs, probiotiques différents. Il peut s'agir d'une
bactérie
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Lactobacillus rhamnosus avec une bactérie d'un autre genre, ou bien il peut
s'agir d'au
moins une ou plusieurs bactéries du genre Lactobacillus, d'espèces
différentes.
Le produit symbiotique tel que décrit comprend de préférence la bactérie
vivante. Par
vivante, il faut comprendre que l'intégrité de la cellule est conservée et que
les
processus cellulaires se produisent ou peuvent se produire si la bactérie est
cultivée
dans un milieu et des conditions adéquates. Toute bactérie vivante peut être
de
nouveau ensemencée sur un milieu de culture adéquat et se multiplier, dans des
conditions adéquates.
La présente invention comprend donc notamment l'utilisation de Lactobacillus
rhamnosus Lcr35 sous forme lyophilisée ou sous forme congelée.
Un produit selon l'invention est considéré comme un symbiotique. En effet, la
bactérie
est un probiotique alors que le milieu à base notamment de lactose est un
prébiotique.
Par médicament ou préparation alimentaire ou complément alimentaire, etc.., il
faut
entendre toute forme acceptable sur le plan pharmacologique, notamment sous
forme
de préparation pour nourrisson, de produit destinés aux enfants en bas âge,
d'aliment
diététique et de régime, d'aliment diététique de complémentation orale, de
produit
d'hygiène, de denrée alimentaire ou diététique à fins médicales particulières
(ou spéciales), ou dispositif médical, ou toute autre forme adaptée bien
connue de
l'homme du métier. Le produit est de préférence sous une forme galénique
adaptée à
l'administration orale, par exemple sous forme de suspension buvable ou de
gélule. Il
peut également se présenter sous forme de poudre ou granule à ajouter aux
aliments
ou à une boisson, ou bien à sucer.
Par dermatite atopique, il faut entendre toutes les affections diagnostiquées
comme
étant des dermatites atopiques ou eczéma atopique, ainsi que les affections
atopiques
dont les symptômes sont essentiellement identiques et qui reçoivent par
ailleurs des
traitements identiques.
Le patient traité recevant le produit tel que décrit est de préférence un être
humain, de
préférence un enfant. Par enfant, on entend toute personne âgée de moins de 18
ans,
de préférence moins de 15 ans ou moins de 12 ans. Le patient est de préférence
un
enfant de plus de 1 an, tout particulièrement un enfant âgé d'au moins deux
ans.
Alternativement, le patient considéré peut être un mammifère autre que
l'homme, par
exemple un singe, un chien, un chat ou un lapin.
Une classe préférée de patients pour une utilisation selon la présente
invention est les
enfants ayant entre 2 et 12 ans.
Une autre population de patients susceptibles de recevoir un produit selon la
présente
invention est constituée de sujets qui présentent des allergies au lactose,
notamment
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des allergies au lait de vache. De préférence les allergies considérées sont
des
allergies bénignes ou modérées au lactose.
Par traitement de la dermatite atopique, on entend notamment toute action
visant à
supprimer ou à réduire les symptômes de la dermatite atopique, ainsi que toute
action
5 préventive tendant à empêcher, retarder ou ralentir leur apparition.
La durée du traitement est à définir en fonction de l'évolution de la
dermatite atopique,
elle ést de préférence supérieure à 2 semaines. Elle peut être de 3 mois ou
plus,
notamment au moins 6 mois ou une année. Il peut s'avérer approprié de
poursuivre le
traitement sur plusieurs années, par exemple sur 2, 5 ou 8 années, en
particulier dans
le cas d'une application préventive.
De préférence, dans le traitement ou la prévention de la dermatite atopique,
le produit
selon l'invention est administré au moins une fois par semaine, de préférence
au moins
une fois par jour. Dans le cadre de la présente invention, une posologie
préférée est de
trois fois par jour.
Le produit selon l'invention peut se présenter sous toute forme appropriée.
Des formes
appropriées sont bien connues de l'homme du métier. Elles doivent notamment
permettre d'assurer la survie du probiotique. En effet, si le probiotique
n'est pas vivant
au moment de l'ingestion, les effets bénéfiques du symbiotique sont absents.
Il est très
important de tenir compte de trois facteurs essentiels qui sont l'atmosphère,
l'humidité
et la température. Les différents moyens de conservation des probiotiques sont
bien
connus de l'homme du métier.
De préférence, le produit est sous forme lyophilisée. En effet, cette forme
assure non
seulement une excellente conservation, mais elle permet également de préserver
toute
bactérie vivante faisant partie du produit selon l'invention. Il est important
de
déterminer le dénombrement du probiotique lors de l'obtention d'un produit
lyophilisé
selon l'invention.
La bactérie contenue dans le produit peut être le seul élément lyophilisé,
mais de
préférence, la bactérie est lyophilisée avec le produit contenant le milieu à
base
notamment de lactose. Le produit peut bien sûr comprendre des constituants
additionnels, en sus de la bactérie et du milieu à base entre autres de
lactose. De tels
constituants sont ou bien ajoutés avant lyophilisatiqn des autres composants,
ou bien
après (cas par exemple des excipients permettant la mise en forme galénique du
produit).
Le milieu à base de lactose est un milieu contenant au moins 5% en masse de
lactose,
de préférence au moins 20%.
Ledit milieu est de préférence stérile, avant ensemencement avec le
probiotique.
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De préférence, un tel milieu est un milieu de culture (de fermentation)
contenant donc
d'autres substances. Le milieu est de préférence un milieu essentiellement
constitué
de lait, par exemple de lait écrémé.
Le milieu à base de lactose contient avantageusement également de l'amidon de
pomme de terre. Il peut contenir également de la dextrine maltose. Tout autre
composé
ou excipient pharmacologiquement acceptable peut également entrer dans la
composition d'un milieu à base de lactose comme défini.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le milieu à
base de
lactose correspond à un milieu de culture compatible avec la fermentation du
lactose
par la bactérie probiotique comprise dans le produit selon l'invention. Ainsi,
selon un
mode de réalisation préféré de l'invention, la bactérie est cultivée sur un
milieu de
culture, qui est éventuellement complémenté par la suite pour former un
produit selon
l'invention, c'est-à-dire un symbiotique (combinaison d'un probiotique et d'un
prébiotique). Une telle situation est étayée par un exemple dans la partie
expérimentale de la présente demande (voir exemple 1).
Il est particulièrement avantageux que le milieu à base de lactose soit issu
du milieu de
culture du probiotique. Ainsi, en vue de l'obtention du produit, il est
inutile de changer
le probiotique de milieu. Ceci évite un trop grand nombre d'étapes de
centrifugation ;
en effet, lors des centrifugations, les parois cellulaires des micro-
organismes peuvent
être endommagées, ce qui nuit à leur survie. Ainsi, en évitant de changer le
probiotique
de milieu et en réduisant ainsi le nombre de centrifugations, on assure un
meilleur taux
de survie au probiotique. De préférence, le probiotique utilisé n'est pas
ensemencé ou
cultivé sur du MRS.
Du fait que le prébiotique correspond à un milieu de culture adapté pour le
probiotique
(bactérie), lorsque le produit selon l'invention est ingéré (et notamment
quand il se
présente sous forme lyophilisée et qu'il est remis en suspension avant
l'ingestion), la
bactérie se trouve immédiatement dans un milieu compatible avec sa survie. Un
taux
de survie augmenté des probiotiques serait ainsi obtenu.
De préférence, la bactérie a été cultivée pendant au moins 4 heures, au moins
12h, de
préférence entre 24 et 48 heures, voire plus, par exemple environ 72 heures,
sur un
milieu de culture à base notamment de lactose'
qui est ensuite éventuellement
complémenté pour former le produit selon l'invention.
L'invention repose en effet sur les effets obtenus par le symbiotique, c'est-à-
dire par le
combinaison d'un probiotique (la bactérie de l'espèce Lactobacillus rhamnosus)
et d'un
prébiotique (le lactose, de préférence sous forme de milieu à base de
lactose). Les
effets obtenus sont encore plus avantageux quand la bactérie a été cultivée
sur le
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milieu à base en autres de lactose. En effet, dans ces conditions, le milieu
contient
égalëmerit des métabolites résultant de cette culture. Or certains de ces
métabolites
ont des propriétés antimicrobiennes particulièrement avantageuses (31).
L'association
de ces composés (probiotique, prébiotiques et métabolites) contribue à l'effet
bénéfique sur la dermatite atopique.
Dans un produit selon la présente invention, le nombre de bactéries ou germes
par
gramme de produit est de préférence compris entre 1x108 et 1x101 .
Avant une éventuelle lyophilisation du produit symbiotique selon l'invention,
celui-ci est
généralement sous forme liquide. Dans une telle situation, pour une
utilisation dans le
traitement de la dermatite atopique, le produit comprend de préférence une
concentration dans le milieu égale ou supérieure à 1x10$ UFC (unités formant
colonie
ou germes) par mL.
Pour une application dans la préventiôn ou le traitement de la dermatite
atopique, on
administre au patient environ entre 1x10a et 1x1010 UFC de Lactobacillus
rhamnosus
par prise. Plusieurs prises peuvent être administrées par jour, par exemple
sous forme
de 3 prises quotidiennes. Les doses peuvent être ajustées, notamment en
fonction de
la corpulence du patient à traiter et de son éventuelle réaction au
traitemènt.
Comme mentionné dans les paragraphes précédents, une bactérie particulièrement
préférée de l'espèce Lactobacillus rhamnosus (équivalent à Lactobacillus casei
subsp.
rhamnosus) capable de fermenter le lactose est la souche Lcr35 qui peut être
obtenue
selon le protocole défini dans l'exemple 1. D'autres protocoles sont bien
connus de
l'homme du métier.
Dans le choix d'un probiotique pour obtenir un produit selon l'invention, il
est essentiel
de rechercher une bactérie qui n'ait aucun effet pathogène et qui soit de
préférence
connue comme ayant de bonnes propriétés en ce qui concerne son taux de survie.
Un
autre paramètre à prendre en compte est sa résistance aux procédés
technologiques.
Il peut également être avantageux que le probiotique en question possède des
résistances à la plupart des antibiotiques classiques. A l'inverse, il est des
situations où
le probiotique est de préférence sensible à la majorité des antibiotiques
connus.
De plus, une souche pour utilisation selon la présente invention doit
également
présenter la capacité à coloniser la flore intestinafe ~
La souche spécifique Lactobacillus rhamnosus Lcr35 est particulièrement
préférée
dans le cadre de la présente invention car elle présente les différents
avantages
mentionnés ci-dessus. Elle est de plus résistante à la streptomycine, à la
tétracycline, à
l'érythromycine, à l'acide nalidixique, à l'acide pipémidique, à l'acide
fusidique, à la
colistine, à la polymyxine, au sulfaméthoxazole et à la triméthoprime.
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Les caractères fermentaires de cette souche sont particulièrement avantageux.
Alternativement, l'invention concerne également l'utilisation du lactose seul
ou en
combinaison avec un probiotique, dans le traitement ou la prévention de la
dermatite
atopique.
Légende des figures :
Figure 1: génotypage de la souche Lactobacillus rhamnosus Lcr35.
Figure 1A : séquence intergénique ADNr 16S-23S; Figure 1B : ADN ribosomal 16S.
Figure 2: représentation des régions séquencées de Lactobacillus rhamnosus
Lcr35.
Figures 3A et 3B : comparaison des profils métaboliques 50 API CH des souches
Lactobacillus rhamnosus Lcr35 et Lactobacillus GG.
Exemple 1: Obtention de la souche, Lactobacillus rhamnosus Lcr35 lyophilisée
et
conditionnement.
Réactivation :
Les germes obtenus dans le commerce (Bacilor des laboratoire Lyocentre) ou
issus
de la souchothèque des laboratoires Lyocentre, sont remis en activité en
ensemençant
avec 100 à 200 mg du produit lyophilisé 10mL de milieu au lait écrémé enrichi
(glucose
15g/L, extrait de levure 5g/L). Ce tube est placé dans une étuve à 37 C
pendant 72
heures.
1 mL de la culture de ce premier tube est introduit dans un second tube
contenant
10mL de milieu au lait enrichi stérile, ce tube est placé à l'étuve à 37 C,
pendant 72
heures. Cette opération est recommencée plusieurs fois de manière à obtenir
une
population la plus importante possible, supérieure à 1x109 germes par mL.
Préparation du pied de cuve :
1 mL de cette souche réactivée est introduit dans un ballon contenant 180mL de
lait
écrémé enrichi stérilisé puis cultivé à 37 C pendant 72 heures, ce pied de
cuve sert à
ensemencer les ballons.
Milieu de culture
Afin de pouvoir disposer d'une culture lyophilisée de Lactobacillus casei var.
rhamnosus (aussi dénommée Lactobacillus rhamnosus) de titre adapté, celle-ci
est
élaborée simultanément selon 2 procédés de culture différents :
- sur milieu simplifié
- sur milieu enrichi
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a) constituants des milieux:
1. MiNieu simplifié :
lait écrémé en poudre 100g
Eau, qsp 1,000 L
2. Milieu enrichi:
lait écrémé en poudre 16,650g
Glucose 4,450g
Sulfate de manganèse 0,028g
Citrate de sodium 0,560g
Phosphate monopotassique 1,780g
Phosphate dipotassique 3,560g
Autolysat de levure de bière 1,670g
Eau, qsp 1,000 L
b) Préparation et stérilisation des milieux
1. Milieu simplifié :
formule :
lait écrémé en poudre 100g
Eau, qsp 1,000 L
Méthode :
Dans un contenant, mettre 2001itres d'eau et ajouter par petites fractions
sous
agitation lente les 28kg de lait écrémé en poudre. Après complète dispersion,
ajuster à
280 L avec de l'eau. Ce lait est réparti en contenants correctement bouchés et
stérilisés à l'autoclave pendant 30 minutes à 115 C.
3o 2. Milieu enrichi :
Formule pour un contenant de 20001itres
lait écrémé en poudre 30,00kg
Glucose 8,00kg
Sulfate de manganèse 0,05kg
Citrate de sodium 1,00kg
Phosphate monopotassique 3,20kg
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Phosphate dipotassique 6,40kg
Autolysat de levure de bière 3,00kg
Eau, qsp 1800,00 L
5 Méthode :
Dans un contenant, mettre 1000L d'eau, puis sous agitation rapide, ajouter le
lait ;
après complète dispersion ajouter le glucose, le sulfate de manganèse, le
citrate de
sodium, les phosphates mono et dipotassique, et enfin l'autolysat de levure de
bière.
Après dispersion complète, ajuster à 1800 litres par de l'eau.
10 Ensuite, toujours sous agitation, stériliser ce milieu à 115 C pendant 30
minutes puis
refroidir pour le ramener à 37 C.
Ensemencement et culture
a) milieu simplifié :
Introduire par contenant de 1 à 2 ml de préculture provenant du pied de cuve,
sous une
hotte à flux d'air laminaire vertical.
Ensuite ces contenants sont placés pendant 72 heures dans des étuves de - '
bactériologie maintenues à 37 C, plus ou moins 2 C.
b) milieu enrichi :
Introduire par contenant de 1800 litres, 2,4 litres de préculture provenant du
pied de
cuve. Maintenir grâce à un dispositif thermostaté approprié la température à
37 C
pendant 48 heures sous agitation lente.
Préparation de la culture pour Iyophilisation :
a) milieu simplifié :
constituants :
- culture de Lactobacillus casei var. rhamnosus 136,8 L
- amidon de pomme de terre 35,0 kg
- lactose 15,0 kg
- suspension d'hydroxyde de,çalcium q.s. po,ur neutralisation pH=7,0
Méthode de préparation :
Sous hotte à flux d'air laminaire, verser la culture obtenue dans une cuve de
200 litres,
agiter fortement pour briser le caillé et ajouter sous agitation rapide
l'amidon de pomme
de terre et le lactose. Quand leur dispersion est totale, mesurer le pH qui
doit être
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voisin de 3. Ensuite, avec de l'hydroxyde de calcium, neutraliser ce mélange
jusqu'à
pH=7;0 0,1.
b) milieu enrichi
constituants :
- culture de Lactobacillus casei var. rhamnosus 1800,0 L
- amidon de pomme de terre 6,6 kg
- lactose 3,3 kg
- dextrine maltose 6,0 kg
- suspension d'hydroxyde de calcium q.s. pour neutralisation pH=7,0
Méthode de préparation :
La culture de Lactobacillus casei var. rhamnosus est centrifugée en continu
dans une
centrifugeuse pour éliminer totalement le surnageant. Le culot est récupéré
sous hotte
à flux d'air laminaire, il est mélangé sous agitation rapide avec les
excipients de
lyophilisation. Ensuite, à l'aide d'hydroxyde de calcium, neutraliser ce
mélange jusqu'à
pH=7,0 0,1.
Lyophilisation
Les préparations de culture de Lactobacillus casei var. rhamnosus pour
lyophilisation
sont réparties aseptiquement dans des plateaux en acier inoxydable.
C,ongeler rapidement à-40 C, ensuite effectuer la sublimation à-22 C. Quand le
produit a dépassé le seuil de 0 C, réaliser un étuvage à+37 C.
Selon les préparations mises en ceuvre, les quantités obtenues de produit sec
lyophilisé sont environ les suivantes :
Culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus
Milieu simplifié 57 kg
Milieu enrichi 17 kg
Broyage, mélange, conditionnement
a) broyage
Dans une pièce à atmosphère déshumidifiée (H.R. inférieure à 50% et filtrée
(filtration
99,999)), la culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus est
récupérée,
broyée et tamisée sur calibreur de type oscillant équipé d'une grille de 60
MESH, un
échantillon est prélevé pour dénombrement des lactobacilles.
Le produit est conservé dans des containers hermétiquement clos.
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Après titrage des Lactobacillus casei var. rhamnosus vivants, les produits
sont
homogénéisés afin d'obtenir une matière .première de titre désiré.
b) mélange
Afin d'obtenir des lots de culture lyophilisée de Lactobacillus casei var.
rhamnosus de
200 à 225 kg dont le titre est compris entre 1x109 et 1x1010 germes par
gramme, un
mélange est effectué dans un mélangeur doux selon la méthode suivante :
-Q.S. de culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus sur milieu
simplifié.
-Q.S. de culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus sur milieu
enrichi, de telle sorte que le poids du mélange final soit compris entre 200
et 225 kg
d'une poudre dont le titre est compris entre 1x109 et 1x10'0 germes par
gramme.
c) conditionnement
Après mélange, des échantillons sont prélevés pour contrôles. Le reste du
mélange est
conditionné en fonction de la demande en containers adaptés hermétiquement
clos.
Puis cette poudre est mise en forme galénique.
Exemple 2: Etude de l'effet sur la dermatite atopique d'un produit à base de
LCR35
Les objectifs de cette étude sont d'une part, l'étude de l'efficacité du
Lactobacillus
casei variété rhamnosus en association avec un prébiotique dans le traitement
de la
dermatite atopique modérée à sévère de l'enfant, d'autre part, l'évaluation
des effets
indésirables et la tolérance clinique de ce traitement.
Type d'étude :
Etude prospective contrôlée en double aveugle versus placebo.
Etude de phase 2.
Connaissances actuelles
1) La dermatite atopique
La dermatite atopique est une dermatose fréquente (prévaience estimée entre 10
et
25% dans les pays occidentaux) (2, 3). Son évolution est chronique avec
amélioration
fréquente à l'adolescence. Les formes modérées et sévères, de par la
chronicité des
lésions prurigineuses, inesthétiques et nécessitant des soins locaux
quotidiens, ont un
retentissement psychologique important, peuvent altérer la relation parents /
enfant et
retentissent sur la qualité de vie de l'enfant et sa famille.
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Le traitement de fond repose sur l'application régulière d'émollients,
associée à des
règles hygiéno-diététiques. Les poussées nécessitent l'application de
corticoïdes ou
d'immunosuppresseurs sous forme topique.
La pathogénie de la derrriatite atopique repose sur une dysrégulation de
l'immunité à
médiation cellulaire avec déséquilibre du rapport Thl/Th2 au profit d'une
réponse de
type Th2. Il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement commercialisé
permettant de
corriger cette dysrégulation immunitaire.
2) Les probiotigues
Les probiotiques sont des microbes commensaux du tube digestif ayant
potentiellement des propriétés anti-allergiques en favorisant une réponse de
type Th1
(8-9). IIs sont utilisés depuis près de 40 ans dans le traitement
symptomatique
d'appoint de la diarrhée de l'enfant et de l'adulte. Cependant tous les
probiotiques n'ont
apparemment pas les mêmes propriétés. Dans une étude sur les cellules
dendritiques
de souris le Lactobacillus casei apparaît comme le probiotique induisant à
faible
concentration la production majoritaire d'interleukines favorisant la réponse
Th1 (IL12,
IL6, TNFa) sans augmenter la production d'ILIO (principale interleukine de la
réponse
Th2) (10).
Les probiotiques ont déjà démontré leur efficacité en prévention primaire de
la maladie
atopique (11) et sur une courte série dans le traitement de la dermatite
atopique du
nourrisson (13). Ces études interviennent à un âge très précoce et
l'efficacité de ce
traitement est possiblement due à la colonisation initiale de la microflore
intestinale.
Cependant les effets immunomodulateurs des probiotiques s'observent aussi chez
le
grand enfant et l'adulte: iis pourraient donc également être efficaces dans
ces tranches
d'âge (16). Enfin ces traitements s'avèrent particulièrement sûrs puisque
seuls
quelques rares cas d'endocardites et de septicémies ont été décrits chez des
sujets
gravement immunodéprimés.
L'utilisation notamment de la souche LCR35 comme source de L. casei offre de
multiples avantages.
- Cette souche est commercialisée depuis 1967 (sous le nom d'Antibiophilus
puis de
Bacilor visa 01/12/1959, AMM 29/03/1974) dans le traitement symptomatique
d'appoint de la diarrhée.
~ -
- Sa tolérance est excellente. Aucun effet indésirable n'a été relevé en
France ou à
l'étranger.
- Il contient du Lactobacillus casei variété rhamnosus (aussi appelé
Lactobacillus
rhamnosus) qui semble être aujourd'hui un probiotique prometteur dans le
traitement et
la prévention des manifestations atopiques.
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Matériels et méthodes
1) Critères d'inclusion
L'étude a été réalisée sur une période de 17 mois. Les patients, des enfants
âgés de 2
à 12 ans présentant une dermatite atopique modérée à sévère, ont été inclus
dans
cette étude après obtention du consentement écrit des parents et également des
enfants en âge de comprendre. Le diagnostic de la dermatite atopique a été
réalisé
selon les critères standardisés (18). Seuls les patients présentant un SCORAD
supérieur à 15 ont été inclus dans l'étude.
2) Critères de non inclusion
Les patients présentant une immunodépression connue (congénitale ou acquise)
ainsi
que ceux qui prenaient ou avaient pris un traitement pouvant induire une
immunodépression générale (corticôides par voie générale ou médicament
immunosuppresseur) dans les trois môis précédents, n'ont pas été inclus dans
l'étude.
3) Conditions de réalisation du double aveugle
Les enfants ont été répartis par tirage au sort en 2 groupes.
Le premier a reçu le symbiotique (contenant du Lactobacillus casei variété
rhamnosus
sous la forme du Bacilor ) ; le second a reçu uniquement le prébiotique (sans
Lactobacillus casei variété rhamnosus).
La randomisation a été réalisée avant le début de l'étude, selon la sévérité
de la
dermatite atopique (SCORAD < OU ? 40) et selon la saison (hiver, printemps,
été,
automne).
Les sachets contenant les probiotiques (+prébiotiques + métabolites) ne
peuvent être
différenciés ni par le patient, ni par le médecin, des sachets ne contenant
que le
prébiotique.
4) Modalités d'administration
Le symbiotique comprenant le Lactobacillus casei variété rhamnosus est
administré
par voie orale sous forme de sachets de Bacilor (produit par les laboratoires
Lyocentre, à Aurillac, France) à 1,5g. Chaque dose de 1,5g est conservée dans
des
sachets d'aluminium, étanches à l'air. Les doses de symbiotique contiennent
environ
1,2x109 unités formant colonie (ou germes) de L. rhamnosus Lcr35 + une
préparation
d'un prébiotique spécifique et des métabolites sécrétés par la bactérie.
La préparation prébiotique est dérivée du milieu de fermentation de L.
rhamnosus
Lcr35, et contient du lait écrémé en poudre (en moyenne 0,344g- 33% de
protéine
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bovine, 52% de lactose), de l'amidon de pomme de terre (en moyenne 0,759g) et
du
lactose (en moyenne 0,397g).
Les doses de préparation de symbiotiques et de prébiotiques ont été données
sous
forme de poudre pour suspension buvable, trois fois par jour, durant 3 mois.
Il a été
5 demandé aux patients de dissoudre la préparation dans de l'eau ou tout autre
liquide
froid de leur convenance. Aucun des patients n'a modifié son régime
alimentaire durant
la période de l'étude.
Durant la période de l'étude, les traitements habituels des patients pour la
dermatite
atopique sont restés inchangés ; tous les patients appliquaient des émollients
et
10 presque tous utilisaient des dermocorticoïdes ou des immunosuppresseurs
locaux. Les
traitements topiques étaient notés ainsi que toutes les autres prises
médicamenteuses
qu'elles soient régulières ou occasionnelles. La consommation de
dermocorticdides et
d'immunosuppresseurs locaux a été évaluée quantitativement par estimation en
poids
des tubes utilisés, à chaque visite.
5) Critères d'évaluation de l'efficacité du traitement
Ni le patient, ni ses parents, ni le dermatologue investigateur ne
connaissaient le
traitement administré au patient.
Des évaluations cliniques ont été réalisées avant le début du traitement, à un
mois
(Ml), à deux (M2) et trois mois (M3). Chaque patient a été examiné par le même
dermatologue à chaque visite.
L'évolution de la symptomatologie et de l'efficacité du traitement sont
quantifiées par
un score global de gravité: le SCORAD (pour SCORing Atopic Dermatitis)
développé le
'European Task Force for Atopic Dermatitis' (19). Ce score strictement
clinique
constitue la référence dans l'évaluation des traitements de la dermatite
atopique.
Le score dénommé SCORAD combine l'évaluation clinique de l'intensité et de
l'étendue des symptômes avec un score subjectif lié au prurit et à l'insomnie
indiqué
par le patient, ses parents ou bien les deux, sur une échelle visuelle. Le
SCROAD
objectif se situe entre 0 et 83. Quand on ajoute le prurit et l'insomnie, le
score peut
alors être compris entre 0 et 103.
Lors de la visite initiale, les patients sont clas$és,dans un groupe modéré
(SCORAD
entre 16 et 39) ou sévère (SCORAD supérieur à 40). A chaque visite, le SCORAD
objectif et le SCORAD total sont calculés. L'IGA (Investigator's Global
Assessment ou
Evaluation Globale de l'Investigateur, une échelle à 6 niveaux incluant les
catégories
suivantes : 0, rien ; 1, presque rien ; 2, léger; 3, modéré ; 4, sévère ; 5,
très sévère) a
aussi été évalué à chaque visite. Le nombre de poussées et l'utilisation de
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dermocorticdides ou d'immunosuppresseurs locaux durant le mois précédent ont
également été notés ainsi que les possibles effets secondaires. Lors de la
dernière
visite, l'opinion des patients et/ou celle des parents sur l'efficacité du
traitement
(aggravation, inchangé, amélioration) ainsi que sur la tolérance ont été
notés.
Enfin, les parents ont été joints 6-12 mois après la fin de l'étude pour
déterminer s'ils
ont observé une rechute de la maladie après l'arrêt du traitement.
6) Surveillance des effets secondaires
La surveillance est exclusivement clinique. Elle est mensuelle.
7) Analyse statistigue
Le nombre de patients nécessaires, pour mettre en évidence une différence de
scorad
de 15 points entre les deux groupes, avec un écart-type de 16, un risque de
première
espèce (alpha) de 5%, une puissance de 80% et un pourcentage maximal de
patients
exclus au cours de l'essai clinique de 20%, a été donc de 22 personnes par
groupes.
Les différences potentielles liées au sexe, à d'autres maladies atopiques et à
l'utilisation des traitements topiques entre les deux groupes ont été analysés
à l'aide du
test du X2 (ou par le test exact de Fisher, selon le cas). Le taux de base
(qui est le taux
au départ de l'étude avant toute intervention) pour l'âge, les nombres de
poussées par
mois, l'utilisation de traitements topiques, le SCORAD (total) et le SCORAD
objectif ont
été comparés pour les deux groupes à l'aide du test t (ou du test de Kruskal-
Wallis
pour les données non-paramétriques).
A la fin de la période d'étude, les changements dans le SCORAD et dans le
SCORAD
objectif, par référence au taux de base, dans chaque groupe de traitement, ont
été
analysés à l'aide du test t de Student apparié; le SCORAD objectif et le
SCORAD entre
les deux groupes à M3 ont été comparés à l'aide du test t pour des
échantillons
indépendants. Cette analyse a également été effectuée dans le sous-groupe des
patients présentant d'autres manifestations atopiques. Seuls ceux ayant achevé
l'étude
(résultat primaire et SCORAD disponible à M3) ont été inclus dans ces
analyses.
Cependant, les analyses ont été répétées sur la totalité de la population de
l'étude,
après avoir remplacé les SCORAD manquants à M3 par la moyenne des SCORAD
.. ,
dans chaque groupe de traitement, sur la base des données disponibles à M3.
Les résultats des patients de chaque groupe ayant obtenu une baisse du SCORAD
supérieure ou égale à 50%, ou supérieure ou égale à 90% par rapport au taux de
base
à M3, ont également été analysés à l'aide du test exact de Fisher. Les scores
IGA ont
été analysés de manière similaire en utilisant les tests de Wilcoxon et Mann-
Whitney.
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Enfin, le nombre total de poussées et les quantités de traitements topiques
utilisés
duraht la période de l'étude ont également été comparés entre les deux groupes
et ce
pour le mois précédant l'étude et pour le dernier mois de l'étude (test de
Kruskal-Wallis
et test de Friedman pour les échantillons appariés).
Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel SPPS pour
Windows.
Résultats :
Etude de la population :
Parmi les 48 patients inclus dans l'étude, neuf (groupe symbiotique, n=7;
groupe
prébiotique, n=2; P=0,13) ont été exclus de l'étude. Les raisons de ces
exclusions sont
la non présentation des patients aux consultations prévues, (groupe
symbiotique, n=5;
groupe prébiotique, n=2) ou le retrait du consentement éclairé (groupe
symbiotique,
n=2). Trente-neuf patients (moyenne d'.âge 5,82 ans, moyenne de SCORAD =39,7)
ont
mené cette étude jusqu'à son terme. Les caractéristiques de la population de
l'étude
sont indiquées dans le tableau 1. Aucune différence statistique n'a été mise
en
évidence entre les deux groupes sur la base de l'âge, de la présence d'autres
manifestations atopiques, du nombre de poussées mensuelles, de -l'utilisation
de
dermocorticoïdes ou d'immunosuppresseurs locaux et sur le SCORAD objectif et
le
SCORAD. Le taux de base pour le SCORAD objectif est de 29,1 (groupe
symbiotique
= 28,7 contre groupe prébiotique = 29,4), et la moyenne de référence du SCORAD
est
de 39,2 (groupe symbiotique = 39,1 contre groupe prébiotique = 39,3).
Effets cliniques
L'évolution du SCORAD objectif et du SCORAD dans les deux groupes est indiquée
respectivement dans les tableaux 2 et 3. Dans le groupe symbiotique, le SCORAD
moyen était de 39,1 avant le traitement (n=24) contre 20,7 après trois mois de
traitement (n=17 ; P<0,0001, sur la base de 17 observations complètes). Dans
le
groupe prébiotique, le SCORAD moyen était de 39,3 avant le traitement (n=24)
contre
24,0 après trois mois (n=22; P<0,0001).
La différence entre les deux groupes de traitement est nette mais faible d'un
point de
vue statistique tant au niveau du SCORAD objectif'qu'au niveau du SCORAD après
3
mois de traitement (P=0,418 et P=0,535, respectivement). Ces résultats sont
compatibles avec ceux obtenus dans les analyses réalisées en remplaçant les
valeurs
manquantes pour le SCORAD et le SCORAD objectif à M3.
Comme la réponse au traitement était plus prononcée chez les patients
allergiques
comparés aux patients non allergiques dans la première étude réalisée chez des
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enfants de plus de un an (17), les inventeurs ont également analysé les
résultats en
tena0t compte de la présence, ou non, d'autres manifestations atopiques. Vingt-
cinq
patients présehtaient d'autres manifestations atopiques (13 dans le groupe
prébiotique
et 12 dans le groupe symbiotique). Au taux de base, le SCORAD était de 41,7
11,4
dans le groupe prébiotique contre 49,6 16,8 dans le groupe symbiotique
(P=0,181).
Les deux groupes ont montré une baisse importante de leurs SCORAD après trois
mois de traitement ; la différence observée entre les deux groupes n'atteint
toutefois
pas la significativité statistique.
L'évolution des scores IGA est similaire à celle des SCORAD. Dans le groupe
recevant
des symbiotiques, le score IGA moyen était de 3,33 (intervalle de confiance
:2,97-3,70)
avant traitement (n=24) contre 2,41 (IC : 1,75-3,07) après trois mois de
traitement
(n=17; P=0,002, sur la base de 17 observations complètes).
Dans le groupe recevant des prébiotiques, le score IGA moyen était de 3,42
(intervalle
de confiance :3,20-3,63) avant traitement (n=24) contre 2,73 (IC : 2,31-3,14)
après
trois mois de traitement (n=22 ; P=0,006).
Utilisation de médicaments topigues : Les traitements topiques utilisés par
les patients ont été classés en trois groupes : les
dermocorticoïdes (n=34) ; les pommades ayant comme principe actif un
inhibiteur de la
calcineurine (n=11) et les émollients (n=3). La pommade de tacrolimus 0,03%
est le
seul produit utilisé dans le groupe des inhibiteurs de la calcineurine. En
comparant la
consommation des tubes de pommade pendant toute la période de l'étude au sein
de
chacun des deux groupes (prébiotiques et symbiotiques), aucune différence
statistique
n'a été observée (P=0,966). Des résultats similaires ont été obtenus en
comparant
l'utilisation durant le dernier mois de l'étude (P=0,919). Dans les deux
groupes,
l'utilisation de dermocorticoïdes ou de pommades ayant comme principe actif un
inhibiteur de la calcineurine (tacrolimus) durant le mois précédant l'étude
était plus
éleveé que durant le mois M3 (prébiotique, P=0,005 ; symbiotique, P=0,07).
Tolérance au traitement :
Le traitement a été bien toléré dans les deux groupes. Aucun effet secondaire
sérieux
,.. ,
n'a été observé ; seuls trois épisodes de douleurs abdominales modérées ont
été
notés_ deux dans le groupe recevant le symbiotique et un dans le groupe
recevant le
prébiotique.
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Suivi :
Tous les enfants pour lesquels une amélioration de la dermatite atopique a été
observée durant le traitement, sauf deux, ont subi une rechute de la maladie,
ou tout
au moins une détérioration de l'état de la peau dans les 2 à 4 mois après la
fin du
traitement (soit par le symbiotique soit par le prébiotique).
Discussion
Une amélioration de la dermatite atopique à la fin de l'étude a été observée
dans les
deux groupes de patients (groupes recevant un prébiotique et groupe recevant
un
symbiotique), avec un niveau de satisfaction élevé. L'amélioration dans le
groupe des
patients recevant le symbiotique, d'un point de vue statistique, n'apparaît
que peu
supérieure au groupe de patients recevant le prébiotique.
Chaque souche bactérienne probiotique a des propriétés spécifiques et une
capacité à
proliférer et survivre dans le tube digestif. La souche L. rhamnosus LCR35
utilisée
dans la présente étude possède de nombreuses propriétés intéressantes. Elle
présente 96% d'homologie avec L. rhamnosus GG par comparaison des séquences
16S-23S. Cette séquence signature pour la souche L. rhamnosus LCR35 est donnée
dans la figure 1.
De plus, la souche L. rhamnosus Lcr35 a la capacité de fermenter le lactose
alors que
la souche L. rhamnosus GG ne peut le faire. Enfin, des études précédentes ont
démontré la capacité de L. rhamnosus Lcr35 à effectuer une colonisation à long
terme
de la muqueuse intestinale après son administration par voie orale (20).
L'évaluation de l'efficacité de symbiotiques dans le traitement de la
dermatite atopique
est intéressante car l'association à des prébiotiques adéquats peut améliorer
le taux de
survie de souches de probiotiques suite à l'ingestion (21).
Les inventeurs ont donc fait l'hypothèse que la combinaison prébiotiques-
probiotiques
pourrait donner de meilleurs résultats dans le traitement de la dermatite
atopique par
rapport à des probiotiques seuls. Des résultats récents montrent que le
lactose et
l'amidon de pomme de terre peuvent être considérés comme des prébiotiques (22,
23).
Cependant, l'utilisation d'une préparation spécifique de prébiotique (comme
décrite
plus haut) repose sur sa capacité à améliorer la prplifération et la survie de
la souche
L. rhamnosus Lcr35 in vitro.
De manière intéressante, comme la préparation de prébiotique utilisée est le
milieu de
fermentation de L. rhamnosus Lcr35, le traitement symbiotique est composé du
milieu
de culture contenant les prébiotiques, du probiotique mais en plus des
métabolites
sécrétés par ce probiotique. Ces métabolites peuvent être définis comme des
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eubiotigues. La combinaison (probiotique, prébiotique, eubiotique) est
présente dans le
produit Bacilor commercialisé par les laboratoires Lyocentre. Son efficacité
dans le
traitement symptomatique d'appoint de la diarrhée est reconnue et le produit
est
commercialisé pour cette indication thérapeutique.
La durée de l'étude a été fixée à 3 mois afin de bénéficier d'une période
suffisante pour
évaluer les effets du traitement tout en limitant la probabilité d'une
interférence avec
une variation spontanée d'intensité de la maladie.
Le traitement de la dermatite atopique des enfants âgés de deux ans et plus
par des
symbiotiques [prébiotiques+ la souche de L. rhamnosus Lcr35 (1,2x109 unités
formant
colonie, trois fois par jour)] a une efficacité supérieure au traitement
composé
uniquement de prébiotiques, bien que la différence soit peu prononcée. Ceci
est
démontré à la fois par l'évolution du SCORAD au cours de l'étude mais
également par
l'évaluation subjective des patients concernant l'efficacité du traitement.
Bien que la
sévérité et l'importance des lésions soient restées constantes, le traitement
avec les
symbiotiques semble avoir fait diminuer le nombre de poussées et l'utilisation
de
médicaments topiques. La différence statistique pour ces deux paramètres reste
cependant faible. - ~
En fait, il a bien été observé une diminution plus importante du SCORAD moyen
dans
le groupe symbiotique (20,5 contre 15,6), mais cette différence est dans les
limites de
la significativité d'un point de vue statistique.
A ce jour, aucune étude n'a évalué l'efficacité de symbiotiques et de
prébiotiques dans
le traitement de la dermatite atopique, ou dans toute autre maladie atopique.
Cependant, il a récemment été démontré chez des patients en bonne santé que
les
prébiotiques et les probiotiques (versus placebo), pouvaient diminuer de
manière
significative la génération et l'accumulation de produits de fermentation
potentiellement
toxiques (24).
Ainsi, des prébiotiques en eux-mêmes peuvent avoir un impact important sur la
flore
intestinale et peuvent aussi induire des changements immunologiques. Bien que
des
études supplémentaires soient nécessaires, les données préliminaires suggèrent
que
la consommation de prébiotiques peut avoir une influence sur des paramètres
liés à
l'immunité à médiation cellulaire et.donc modifier,fe rapport Thl/Th2 (25,
26). Ainsi,
des prébiotiques spécifiques peuvent agir sur la flore intestinale pour
induire une
immunomodulation susceptible d'être bénéfique à la diminution des
manifestations de
la dermatite atopique.
Bien que les présents résultats démontrent l'importance des prébiotiques
(spécialement en combinaison avec des probiotiques pour former des
symbiotiques),
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d'autres facteurs éventuels, autres que les traitements, ont toutefois été
recherchés
pour-expliquer l'amélioration de l'état des patients.
L'effet des saisons peut être éliminé parce que l'inclusion des patients s'est
déroulée
tout au long de l'année, et la randomisation a été réalisée en tenant compte
des
saisons. Cependant, la fréquence des visites ainsi que l'inclusion dans un
essai
clinique avec l'espoir de voir sa maladie améliorée, a pu jouer un rôle
psychologique
favorable pour les patients comme pour leur famille.
L'absence de comparaison avec un réel placebo (les prébiotiques ne pouvant
être
considérés comme un placebo) ne permet pas de conclure définitivement ;
cependant,
quelque soit l'impact psychologique d'un placebo, il ne permet pas en général
d'induire
une amélioration du SCORAD de plus de 5 points (13, 17, 27-29). Or, dans la
présente
étude, les traitements avec le prébiotique et avec le symbiotique (et les
métabolites)
ont tous les deux permis d'obtenir une baisse du SCORAD de plus de 15 points
(15,6
et 20,5 points respectivement).
De plus, cette amélioration ne peut pas être liée à une augmentation de la
consommation de dermocorticoïdes ou d'immunosuppresseurs locaux. Au contraire,
l'utilisation de ces substances a très nettement baissé à la fin de la
présente étude.
Enfin, la rechute de la maladie observée dans les 2 à 4 mois après l'arrêt du
traitement
pour quasiment tous les patients, suggère aussi que l'amélioration n'était pas
due à un
hasard ou à une évolution spontanée de la dermatite atopique. Toutes ces
données
confirment l'efficacité des prébiotiques, et surtout des symbiotiques, dans le
traitement
de la dermatite atopique (DA).
Les présents résultats vont dans le même sens que l'amélioration clinique
observée
dans d'autres études qui ont évalué l'utilisation de probiotiques (mais non de
symbiotiques) dans le traitement de la DA. Bien qu'un effet important ait été
observé
dans la première des études évaluant l'efficacité de probiotiques chez des
enfants de
moins de deux ans (13), l'amélioration observée dans la seconde étude, dans
laquelle
les enfants étaient âgés d'au moins un an, était nettement moins significative
(17).
La différence d'efficacité entre ces études (13 et17) pourrait s'expliquer par
les critères
d'inclusions ( très spécifiques ) des patients de l'étude (13) qui étaient :
- des patients âgés de moins de deux ans, .,'
- avec une allergie prouvée au lait de vache.
L'amélioration observée dans le SCORAD pour la présente étude avec à la fois
des
prébiotiques et des symbiotiques semble être supérieure à celle observée dans
l'étude
menée par Rosenfeldt (17). Cette différence pourrait s'expliquer par la
différence dans
la durée du traitement [6 semaines dans l'étude de Rosenfeldt (17) contre 3
mois dans
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WO 2007/023226 24 PCT/FR2006/001979
la présente étude]. Mais il est très probable que l'utilisation d'une
association
p robiotiq ues/pré b iotiq ues/méta bol ites joue également un rôle important
dans la
différence obsérvée. L'étude de Rosenfeldt a en effet été réalisée avec
uniquement un
probiotique.
Cependant, il est à noter que très peu de données sont disponibles concernant
le rôle
respectif des probiotiques, prébiotiques, symbiotiques et métabolites dans la
modulation du système immunitaire. Une étude récente suggère que les
probiotiques
et les prébiotiques pourraient agir via des mécanismes différents (30).
Deux études en double aveugle avec placebo ont été rapportées récemment,
toutes
les deux réalisées avec des probiotiques pour traiter des enfants atteints de
DA et
âgés de moins de 28 mois.
Dans la première, Lactobacillus GG, un mélange de quatre souches de
probiotiques, et
un placebo ont été donnés aux patients atteints de la DA suspectés d'être
allergiques
au lait de vache, pendant 4 semaines (14). Aucune différence n'a été montrée
entre les
groupes de traitement, immédiatement ou après 4 semaines de traitement, mais
dans
un sous-groupe [enfants sensibles à l'Immunoglobuline E(IgE)], le groupe
Lactobacillus a montré une réduction statistiquement supérieure du _SCORAD par
rapport au groupe placebo.
Dans la seconde étude, L. fermentum et un placebo ont été administrés pendant
8
semaines (15). La réduction du SCORAD durant la période a été significative
dans le
groupe de probiotique mais non dans le groupe placebo.
Il faut noter que dans ces deux études, une réduction du SCORAD pour le groupe
placebo a été observée (-20 et -10 points selon l'étude). L'observation plus
précise des
placebos utilisés pourrait apporter une explication à l'effet inhabituel du
placebo dans
le traitement de la DA. En effet, de la cellulose et de la maltodextrine ont
été utilisés
respectivement dans l'étude de Weston et al (15) et Viljanen et al (14). Les
substances
choisies pour le placebo sont toutes les deux des substances qui peuvent être
considérées comme des prébiotiques. Ainsi, les résultats obtenus avec de tels
'placebos' dans ces études pourraient être similaires à ceux obtenus dans le
groupe
prébiotique de la présente étude. Ces résultats mettent aussi en lumière
l'importance
du choix d'un vrai placebo (et non un composé avec des propriétés
prébiotiques) lors
de la réalisation d'essais cliniques sur le DA avec des prébiotiques,
probiotiques ou
des symbiotiques.
En conclusion, un composé symbiotique (L. rhamnosus Lcr35 plus un prébiotique)
est
capable d'améliorer les manifestations de la dermatite atopique chez des
enfants âgés
de deux ans ou plus. L'importance de l'amélioration observée dans cette étude
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souligne l'intérêt des prébiotiques et des symbiotiques dans le traitement de
la
dermatite atopique.
Exemple 3: Séquence signature de Lactobacillus rhamnosus Lcr35
5 L'identification a été réalisée par PCR puis séquençage du gène des ARN
ribosomaux
16S et de la partie intergénique 16-23S. Le séquençage est un séquençage
double
brin (procédé LI-COR), suivi d'un alignement avec des séquences d'autres
souches.
Les résultats et la stratégie sont présentés dans les figures 1 et 2.
10 Résultats de l'analyse de la séquence de la partie 16S
Position : 16S
Longueur : 1320 paires de bases
Ambigu'ité de lecture < 5%
Identité (%)
Lactobacillus casei / rhamnosus 96
Lactobacillus zeae 96
Résultats de l'analyse de la séquence de la partie 16-23S
Position : 16-23S
Longueur: 483 paires de bases
Ambiguïté de lecture < 5%
Identité (%)
Lactobacillus rhamnosus 96
Lactobaillus casei 93
Lactobacillus zeae 93
La souche analysée appartient à la sous espèce Lactobacillus casei subsp
rhamnosus.
Le séquençage de la presque totalité du gène ribosomal 16S ne permet pas de
différencier Lactobacillus casei subsp casei de Lpctobacillus casei subsp
rhamnosus
aussi dénommé Lactobacillus rhamnosus.
La séquence signature de Lactobacillus casei subsp rhamnosus se situe dans la
partie
intergénique 16-23S.
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Exemple 4: Comparatif entre le profil API de Lactobacillus rhamnosus Lcr35 et
celui
de Lactobacillus GG.
Les figures 3A et 3B présentent le profil métabolique API 50 CH des souches
Lactobacillus rhamnosus LCR35 et Lactobacillus GG, pour des temps de 24 et 48
heures.
Le profil API 50 CH est une galerie " Recherche " permettant d'étudier le
métabolisme
de 49 sucres et adaptée à:
- l'identification des Bacillus avec le milieu API 50 CHB, en 48 heures
environ,
- l'identification des Lactobacillus avec le milieu API 50 CHL, en 48 heures,
- l'identification et le biotypage des entérobactéries avec le milieu API 50
CHE en 48
heures,
- toute autre application " recherche " d'étude du métabolisme des sucres.
L'identification API (R) est bien connue'de l'homme du métier.
II apparaît nettement que les deux souches Lactobacillus rhamnosus LCR35 et
Lactobacillus GG n'ont pas exactement le même profil, notamment pour du
lactose.
Une différence de comportement in vitro vis-à-vis du métabolisme des sucres
sous
entend une différence de comportement in vivo.
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