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POLYMERES BIODÉGRADABLES MODIFIÉS, LEUR PRÉPARATION ET LEUR
USAGE POUR LA FABRICATION DE BIOMATÉRIAUX ET DE PANSEMENTS
1. Domaine de l'invention
La présente invention a pour objet un nouveau procédé chimique en milieu
aqueux
permettant de modifier des polymères biodégradables. Le procédé comprend une
première étape de réaction en milieu aqueux entre un acide aminé, un peptide
ou un
polypeptide avec l'anhydride maléique pour former un acide vinyl-carboxylique
qui est
lors d'une seconde étape de réaction mis en présence avec un polymère
biodégradable
possédant au moins une fonction amine primaire tel un glycosaminoglycane, tel
que le
chitosane, ou une protéine fibreuse, telle que le collagène ou l'élastine.
La présente invention a également pour objet les polymères modifiés
biodégradables
obtenus selon le procédé et leur usage dans les domaines médical,
pharmaceutique et
cosmétique, particulièrement pour la fabrication de biomatériaux et de
pansements
ayant des propriétés de bio- ou cyto-compatibilité et des propriétés
hémostatiques,
bactéricides et/ou cicatrisantes.
2. Description de l'art antérieur
2.1. Les biomatériaux
Le domaine lié aux pansements de cicatrisation ou chirurgicaux, aux
biomatériaux ou
aux colles fibrines a fait l'objet d'un développement intense depuis un
siècle, et
principalement dans le but d'augmenter l'effet hémostatique de ces différents
produits et
de favoriser ainsi la coagulation du sang. Les résultats de ces développements
ont fait
l'objet à ce jour de centaines de communications écrites dans des revues
spécialisées
et journaux ou de brevets d'invention.
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Il est bien connu de l'Homme de l'art qu'une hémorragie s'arrête d'elle-même
selon le
processus naturel de la coagulation sanguine. Cependant, les conséquences
d'une
hémorragie peuvent varier selon l'importance et l'origine de celle-ci. Une
petite coupure
de l'épiderme ne peut être comparée à une forte hémorragie provoquée lors
d'une
opération chirurgicale entraînant une importante perte de sang et nécessitant
une
transfusion sanguine.
Le pouvoir adhésif du caillot sanguin dû à la présence d'un réseau de fibrine
polymérisée est bien connu depuis 1909 où Bergel confirma que la fibrine peut
être
utilisée comme substance de collage physiologique aux propriétés
cicatrisantes.
Cette découverte permet quelques années plus tard à Grey (1915) d'utiliser des
tampons de fibrine pour coaguler des hémorragies cérébrales et hépatiques.
Cependant, il faudra attendre 1949 pour voir Cronkite, puis Tidrick et Warner,
utiliser du
fibrinogène combiné à de la thrombine, pour la fixation de greffes cutanées.
Finalement, grâce à d'importants travaux de recherche de E. J. Cohn en 1946,
portant
sur le fractionnement des protéines plasmatiques, des protéines de coagulation
ont
commencé à être exploitées et quelques années après le mécanisme des
différentes
protéines participant à cette coagulation a été compris.
Malgré les progrès importants dans le domaine de la guérison des plaies par
des
substances biologiques, on vit apparaître dans les années 60 sur le marché un
adhésif
tissulaire à base de produits synthétiques tel un adhésif de la famille
cyanoacrylate très
puissant, polymérisé en quelques secondes. Toutefois, son utilisation
provoquait une
toxicité cellulaire importante. D'autres colles synthétiques de la même
famille
apparaissent alors mais avec des radicaux plus longs possédant des propriétés
hémostatiques, bactériostatiques et cicatrisantes. Cependant, ces colles
posaient aussi
des problèmes de réactions inflammatoires, et de toxicité tissulaire encore
trop
importants.
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En 1967, les colles à base de formaldéhyde contenant de la gélatine, de la
résorcine et
du formol furent présentées. Elles apportaient une certaine amélioration du
point de vue
de la toxicité mais également des réactions allergiques et une histotoxicité
liée à la
présence du formol. Les réactions inflammatoires, les toxicités tissulaires,
et les
allergies entraînent le rejet de ces adhésifs peu biocompatibles.
Dans le brevet US 3,364,200 (1968), Ashton et al. rapportent que les tampons
de gaze
hémostatiques conventionnels et autres articles de ce type, imprégnés d'un
matériau
hémostatique tel que le chlorure ferrique, la thrombine, ou équivalent, ont
été utilisés en
chirurgie depuis des années pour stopper les saignements. Cependant, ces
matériaux
hémostatiques chirurgicaux sont critiqués car ils ne peuvent pas être laissés
in situ dans
une plaie refermée, à cause du risque de réaction des tissus avoisinants à ces
corps
étrangers. De plus, si ces matériaux sont laissés à l'intérieur d'une plaie
cicatrisée, il
faudra rouvrir la plaie en brisant le caillot sanguin formé impliquant de
nouveaux
saignements. Ashton et al mentionnent donc qu'il existe un besoin vital pour
des
matériaux hémostatiques qui pourraient rester dans une plaie refermée sans
toutefois
causer de réactions sérieuses des tissus avoisinants. Dans cette optique,
Ashton et al.
proposent l'utilisation de la cellulose oxydée qui non seulement présente des
propriétés
hémostatiques, mais qui est aussi absorbable par les tissus animaux. Ashton et
al.
proposent donc des matériaux hémostatiques en cellulose oxydée ayant une
stabilité
accrue contre la détérioration pendant le stockage. La cellulose oxydée
utilisée provient
de pâte de bois, du coton, de linters de coton, de ramie, de jute, de papier
ou de
matériaux similaires, et aussi de cellulose régénérée ou de rayonne produites
par les
procédés "viscose" ou de Bemberg. Cette invention a conduit à la
commercialisation de
SurgicelfTM par Johnson & Johnson.
L'utilisation des propriétés adhésives de la fibrine par l'intermédiaire d'une
très forte
concentration de fibrinogène et de Facteur XIII avec un inhibiteur de la
fibrinolyse pour
effectuer un collage expérimental de nerf a été développée dès 1972 par H.
Matras.
Suite à ses travaux, on vit apparaître sur le marché européen dès 1978 la
première colle
biologique élaborée et fabriquée par Immuno AG (Vienna, Austria). Cette colle
est
utilisée pour arrêter l'hémorragie et est constituée de protéines de
coagulation d'origine
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humaine contenant principalement le fibrinogène et le facteur XIII. Ce composé
est
mélangé juste avant son utilisation avec une solution antifibrinolytique
d'origine bovine :
l'Aprotinine. Cette solution est mélangée au fur et à mesure lors de son
application sur
les plaies avec une solution de thrombine d'origine bovine. Depuis lors,
plusieurs autres
produits semblables sont disponibles, notamment en chirurgie.
Parallèlement aux développements des colles biologiques, les substances ayant
des
propriétés hémostatiques naturelles ou transformées chimiquement sont
introduites sur
le marché. Ces nouveaux produits sont appelés également pansements
biologiques
et parmi les substances utilisées, on trouve les polysaccharides portant
seulement les
motifs glucosiques comme la cellulose et ses dérivés cellulosiques, les gommes
et les
alginates extraits à partir des algues. Les polysaccharides contenant un ou
plusieurs
groupes amines ou une unité répétitive d'une fonction amine sont appelés des
aminopolysaccharides ou glycosaminoglycanes.
Les glycosaminoglycanes sont donc des longues chaînes de polysaccharides non
ramifiées faites de la répétition d'un même motif disaccharide. Les
disaccharides de ce
motif comportent un monosaccharide portant un groupe carboxylique appelé acide
galacturonique et un deuxième saccharide portant un groupe N-acétylamine:
appelé
acétylglucosamine ou N-acétylgalactosamine. Ces glycosaminoglycanes se
trouvent en
abondance dans les tissus conjonctifs, en particulier dans les tissus osseux
et
cartilagineux. Les glycosaminoglycanes les plus utilisés sont par exemple,
l'acide
hyaluronique, le sulfate de chondroïtine, le dermatane, le sulfate d'héparane
ou
l'héparine. Ces mêmes tissus conjonctifs contiennent aussi des protéines
fibreuses de
structure collagène et élastine, ces deux protéines ayant également des
applications
médicales très intéressantes dans le domaine de la guérison des plaies.
D'autre types de glycosaminoglycanes se trouvent dans les carapaces des
invertébrés:
comme la Chitine [R-(1,4)-2-acétamido-2-diseoxy-D-glucose ou poly N-acéty-D-
glycosamine]. La déacétylation de la chitine conduit à la formation du
chitosane [([3-1,4)-
2-amino-2-désoxy-D-glucose]. La chitine est le deuxième polysaccharide naturel
le plus
abondant après la cellulose.
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Il est bien connu que les glycosaminoglycanes et les protéines fibreuses ont
des
propriétés naturelles biocompatibles, biodégradables, hémostatiques et
cicatrisantes.
Ces caractéristiques permettent de les classer comme des biopolymères ou des
biomatériaux. De nombreuses applications médicales ou esthétiques ont été
développées avec ces biomatériaux, surtout dans le domaine de la guérison des
plaies.
Chaque biopolymère natif a ses propres propriétés biologiques et
physicochimiques,
certains ont des propriétés biomécaniques plus fragiles ou se dégradent in
vivo plus
rapidement que d'autres. Selon l'utilisation désirée, beaucoup de travaux sur
leur
modification structurale par voie chimique ont été apportés à ces biopolymères
pour
obtenir un biomatériau mécaniquement et chimiquement plus robuste, plus
absorbant
ou biochimiquement plus actif. Certaines modifications visent à modifier les
propriétés
en volume ou en surface des biopolymères pour que ces nouveaux biomatériaux
apportent une absorption exponentielle de leur épaisseur lorsqu'ils sont en
contact avec
le milieu aqueux.
K. Park et al. (Biodegradable Hydrogels for Drug Delivery - Technomic,
Publishing Co.,
Inc. 1993, page 107) ont classé les polysaccharides selon les sources
suivantes:
i. Algues : Agar-agar, furcelleran, alginate, carrageenan;
ii. Végétales : extrait de plante (amidon, pectine, cellulose), gommes
exudates (gomme Arabique, tragacanth, karaya, ghatti) et gommes
de graines (gomme de guar, gomme de graine de caroube)
iii. Microbienne : xanthane, pullulane, scléroglucane, curdlane,
dextrane, gellane.
iv. Animale : chitine et chitosane, Sulfate de Chondroïtine, Sulfate de
dermatane, héparine, kératane, acide hyaluronique.
Les polymères synthétiques tels que les polyols et leurs dérivés, les
poly(vinylalcools),
les polyvinylpyrrolidones, les polyesters, ou les polyanhydrides sont très
bien exploités
pour différentes applications pharmaceutiques et médicales. Ces polymères,
considérés
comme des matériaux biodégradables, sont souvent appelés hydrogels .
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Les biomatériaux cités plus haut peuvent être réalisés et utilisés seuls en
tenant compte
de leurs propriétés hémostatiques ou en leur incorporant des protéines de
coagulation
tels que le fibrinogène et la thrombine, et des protéines favorisant la
cicatrisation. Les
ingrédients pharmaceutiquement acceptables peuvent également être ajoutés
comme
les antibiotiques, des agents antibactériens, des agents anti-cancéreux, etc.
2.2. Modification des biomatériaux
Tel que mentionné ci-dessus, la première étape du procédé selon l'invention de
modification des polymères biodégradables consiste en une réaction entre
l'anhydride
maléique et un acide aminé ou l'un de ses dérivés.
2.2.1. Réaction entre un acide aminé ou l'un de ses dérivés et
l'anhydride maléique
La réaction entre un anhydride maléique et un acide aminé a fait l'objet de
plusieurs
brevets ou articles scientifiques.
Le brevet japonais JP56012351 (Uesugi Hideyuki et al., 1981) décrit
l'obtention d'un N-
acylaminoacide par la réaction d'un anhydride maléique ou succinique avec un
aminoacide en présence d'un solvant organique inerte tel que le
tétrahydrofurane (THF)
ou le dioxane, conduisant par exemple à l'obtention du N-p-carboxypropionyl-DL-
a-
alanine. La réaction est effectuée à une température comprise entre 40 et
1100, est
utilisée comme un intermédiaire dans la synthèse de composés organiques tels
que des
tensio-actifs ou dans l'extension de la chaîne de composés à haut poids
moléculaire
comme les polyamides ou polyesters.
Le brevet japonais JP 59197459 (Itou Fumisaku et al., 1984) décrit une méthode
d'obtention de matériaux composés de polyamides résistant aux impacts et à la
fatigue
due à la flexion à partir d'anhydride maléique greffé sur un élastomère qui
est ensuite
mis en réaction avec un acide aminé.
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Le brevet US 5,665,693 (Kroner et al., 1997) décrit une méthode de préparation
de
détergents ou de nettoyants contenant un très faible taux de phosphate ou en
absence
de phosphate. Cette méthode consiste à faire réagir l'anhydride maléique,
l'acide
maléique et ou l'acide fumarique sur des protéines ou des protéines
hydrolysées qui
n'ont pas dépassé le stade du dipeptide. La réaction a eu lieu à une
température
comprise entre 120 à 300 C sous haute pression et dans un mélange de solvants
aqueux et organiques.
Le brevet japonais JP 2000319240 ({mai Masaru et al., 2000) décrit une méthode
de
production d'un acide maléinamique par réaction de l'anhydride maléique sur un
acide
amino carboxyle en présence d'un sel d'ammonium et dans un solvant
hydrocarboné
non polaire.
Butlet P. J. G. et al. (Biochemical journal (1967), vol. 108, p.78-79; et
(1969), vol. 112, p.
679-689) ont montré que l'anhydride maléique réagit rapidement et spécialement
avec
des groupes aminés des protéines et des peptides avec formation des maleyl-
protéines.
Le groupe maleyl-aminé est très stable à pH neutre ou alcalin mais facilement
hydrolysé
à pH acide. Cette caractéristique permet de bloquer des groupements aminés de
façon
réversible. Le groupe maleyl pourrait être enlevé à cause des formes protonées
des
groupes carboxyliques libres qui catalysent l'hydrolyse des liaisons amide.
Dixon H. B. F. et al. (Biochemical journal, (1968), vol. 109, p. 312-314) ont
également
mis en évidence le blocage réversible des groupes aminés des protéines, par
l'utilisation
de l'anhydride citraconique (ou anhydride 2-méthylmaléique) ou l'anhydride 2,3-
diméthylmaléique à la place de l'anhydride maléique.
Riley M. et al. (Biochemical journal, (1970), vol. 118, p. 733-739) ont eux
aussi
développé la réaction réversible des groupes aminés des protéines avec
l'anhydride
exo-cis-3,6-endoxo-A-tétrahyd rophthalique.
De Wet P. J. (Agroanimalia, (1975), 7(4), p. 101-104), décrit l'obtention de
la
maléylméthionine par la réaction de l'anhydride maléique sur la L-méthionine.
Selon
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l'auteur, ce composé est stable à pH 5,0 et hydrolysé à 60% à pH 2,20 après 8
heures.
Cette réversibilité de la réaction de l'anhydride maléique avec un a-amino
acide est
proposée comme une méthode possible pour la protection contre la déamination
dans
le rumen.
Toutefois, aucun des documents mentionnés ci-dessus ne décrit l'obtention d'un
composé maiéyl-aminoacide directement par la réaction d'un anhydride maléique
avec
un acide aminé en milieu aqueux.
2.2.2. Modification d'un polymère biodégradable
Tel qu'également mentionné ci-dessus, la seconde étape du procédé selon
l'invention
consiste en la modification d'un polymère biodégradable et notamment le
collagène ou
le chitosane.
Les protéines fibreuses, tels le collagène, et les glycosaminoglycanes, tel le
chitosane,
sont souvent transformés ou polymérisés pour obtenir des produits avec des
caractéristiques nouvelles correspondantes à des nouvelles utilisations
demandées ou
attendues. Ces produits trouvent de très nombreuses applications dans les
domaines
médical, pharmaceutique, esthétique ou cosmétique.
2.2.2.1. le collagène
Le collagène est une glycoprotéine fibreuse contenue dans les tissus
conjonctifs et
interstitiels. De structure moléculaire de taille élevée, il constitue un
élément très
important de la matrice extracellulaire du corps humain. Il y a différents
types de
collagène selon leur localisation avec des propriétés qui lui permettent de se
classer
comme l'un des principaux éléments essentiels de la peau, des tendons, des
cartilages
et des os. Le collagène est inextensible et résiste bien à la traction. Il est
notamment
indispensable au processus de cicatrisation.
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De par ses propriétés hémostatique et cicatrisante, le collagène trouve de
très
nombreuses applications intéressantes dans le domaine biomédical. On note
quelques
applications majeures suivantes du collagène :
- produits chirurgicaux (hémostats topiques et fils de suture),
- implants (implants orthopédiques, dentaires ou vessie),
- produits cosmétiques injectables (rides et ridules faciales, cicatrices),
- ophtalmologie (écran de cornée, lentilles de contact, solution
viscoélastique),
- substituant de peaux.
L'extraction, l'isolation et la transformation du collagène permettent
d'obtenir un
biomatériau médical absorbable. Au fur et à mesure des besoins grandissants et
la
nécessité d'adaptation du produit aux sites utilisés, l'état naturel du
collagène a été
modifié soit par polymérisation chimique ou physique (chaleur, radiation,
greffage,
mélange à d'autres polymères) pour que le produit fabriqué à base de collagène
soit
plus efficace et réponde mieux aux attentes des cliniciens et au confort des
patients tel
que la sécurité d'utilisation du produit (non toxique, non-immunogène et non-
inflammatoire), l'efficacité, la biocompatibilité, la biorésorbabilité, la
tolérance, l'élasticité
ou la maniabilité.
L'une des premières applications du produit à base de collagène a été le
contrôle du
saignement excessif. Le produit le plus ancien qui a été préparé pour cela est
le
GelfoamTM . Le brevet US 2,465,357 (Correll, 1949) décrit en effet une éponge
de
gélatine perméable aux liquides et insoluble dans l'eau, possédant les
caractéristiques
physïques d'une éponge tout en étant absorbable par les corps animaux.
L'éponge
selon l'invention est une substance poreuse qui doit être relativement molle
lorsqu'elle
est mouillée et doit présenter plusieurs interstices fins pour y loger une
certaine quantité
d'agent thérapeutique et permettre une libération lente de celui-ci. L'éponge
agit
également comme un matériau efficace pour absorber les flux libres de fluides
comme
le sang et les exsudats autour d'une plaie. Les chirurgiens ont utilisé ce
produit
hémostatique dès 1940, mais il s'est avéré peu efficace. La gélatine ne joue
qu'un rôle
passif dans l'hémostase topique où le saignement est contrôlé mécaniquement
par une
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pression exercée sur la plaie ou sur la coupure. L'effet hémostatique passif
de la
gélatine ne sert que pour une utilisation restreinte où le besoin d'une éponge
de gélatine
permettant l'absorption du sang abondant est nécessaire. Ces éponges sont des
produits lyophilisés et fabriquées à partir d'une solution de gélatine
purifiée et traitée
spécialement. Placées sur la plaie, elles permettent d'absorber une quantité
de liquide
corporel équivalente à plusieurs fois leur poids.
De par la faible efficacité des éponges de gélatine, la recherche s'est vite
orientée vers
l'isolation du collagène, la purification et la transformation de celui-ci
pour réaliser un
produit plus performant. Un pansement topique à base de collagène est apparu
sur le
marché aux alentours de 1980. Le développement de cette matière s'est
poursuivi avec
d'autres applications comme la protection cornéenne, suivi du collagène
injectable pour
un traitement cosmétique des rides et des cicatrices. Les brevets portant sur
l'isolation,
les transformations, les applications et les méthodes de fabrication de ces
produits avec
le collagène sont innombrables, et nous citons ici quelques brevets portant
sur la
polymérisation ou le greffage du collagène seul ou mélangé à un
glycosaminoglycane
par voie chimique. Les auteurs visent en général l'obtention d'un biomatériau
absorbable et efficace et aux multiples usages tels que :
- un pansement actif pour aider l'arrêt d'hémorragie pendant la chirurgie,
- le traitement des plaies dentaires,
- la fermeture des plaies,
- le traitement des brûlures,
- le traitement des incontinences,
- la protection des yeux après l'abrasion ou la chirurgie de la cataracte,
- un substitut de greffe de la peau,
- un substitut de greffe des os,
- l'élimination des rides, des acnés et des cicatrices, ou
- la prévention des adhésions post-opératoires.
Le collagène natif ne peut être utilisé pour toutes les applications citées ci-
dessus. La
raison souvent évoquée est sa dégradation rapide in vivo, son manque
d'élasticité qui
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l'empêche de s'adapter au contour des plaies et aussi sa faible force de
traction. C'est
pourquoi les auteurs cités ci-après cherchent à modifier l'état naturel du
collagène pour
lui trouver de nouvelles applications. Les modifications du collagène sont
souvent
portées sur la polymérisation ou la greffe d'autres groupements ou d'autres
polymères
d'origine naturelle ou chimique. En général, le changement de la structure
initiale du
collagène réduit considérablement la réaction immunologique.
Différents types et grades de collagène (avec et sans télopeptides) sont
commercialement disponibles. Ces collagènes sont d'origine animale ou humaine.
Par
nature, le collagène a des caractéristiques biochimiques et physicochimiques
qui
conviennent relativement bien pour son usage en biomatériaux. Ces
caractéristiques
sont en particulier une bonne biocompatibilité, une biodégradabilité et une
propriété
hémostatique remarquable. Par contre le collagène a une force de traction
mécanique
trop faible. Les produits à base de collagène comme les implants médicaux,
chirurgicaux ou cosmétiques ont rencontré des défauts d'usage comme la
difficulté de
manipulation manuelle. Le collagène étant difficilement pliable, il s'avère
difficile de
suivre le contour d'une blessure. En outre, la biodégradabilité du collagène
pour
certaine application est considérée comme trop rapide, par exemple l'implant
demande
une longue période pour procurer des actions palliatives et curatives. Pour
répondre aux
attentes des patients, les produits médicaux à base de collagène doivent être
modifiés
chimiquement et souvent par couplage du collagène à un autre groupe chimique.
Depuis que l'on connaît que le constituant majeur de la peau est le collagène,
une
approche logique du développement du substitut de la peau a conduit à étudier
le
comportement du collagène reconstitué placé en contact avec les tissus
vivants.
Cette approche a été explorée par un grand nombre de chercheurs utilisant une
procédure générale d'extraction et de purification à différents degrés du
collagène
d'origine animale. Ce collagène purifié a été ensuite converti en film ou
autres structures
pour usage tels que des pansements hémostatiques ou des implants dans un tissu
vivant pour pouvoir déterminer leur comportement in vivo. En fait, la
purification du
collagène a pour but de digérer par des enzymes protéolytiques la partie non-
hélicale du
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collagène souvent appelée télopeptides pour réduire sensiblement l'immuno-
réaction.
Du collagène modifié par voie enzymatique a été préparé et testé par Rubin et
Stenzel
[Rubin, A. L. and Stenzel, K. H., in Biomaterials (Stark, L. and Aggarwal, G.,
Eds.),
Plenum Press, N. Y. (1969)] qui montrent que le traitement ne provoque pas
d'immuno-
réaction comparé à un collagène non modifié. Cette différence de comportement
s'expliquerait en ce que l'enzyme utilisée enlève efficacement les
télopeptides du
collagène sans pour autant détruire la structure moléculaire initiale.
Dans le brevet US 3,742,955 (1973), Battista et al. rapportent que le
collagène traité ou
préparé est utile en chirurgie pour le traitement des plaies, et que E.
Peacock etal. dans
Ann.. Surg. 161, 238-47, February, 1965, ont rapporté que le collagène
possédait des
propriétés hémostatiques lorsqu'il était utilisé comme pansement. Battista et
al. ont
découvert que la fibre de collagène et les produits fibreux dérivés du
collagène,
lorsqu'ils sont préparés adéquatement et lorsqu'ils sont mouillés par le sang,
non
seulement provoquent l'hémostase, mais montrent aussi des propriétés
d'adhésion aux
surfaces biologiques dans les animaux à sang chaud, totalement inattendues.
Battista
et al. proposent aussi une méthode de préparation de fibres de collagène
finement
divisées et de produits fibreux dérivés du collagène, utiles comme agents
hémostatiques et possédant des propriétés d'adhésion uniques telles que
décrites ci-
dessus. Cette invention a conduit à la mise sur le marché d'Avitene par
ACECON.
Le brevet US 4,488,911 (Luck et a1.,1984) décrit une méthode de préparation de
collagène en solution (CIS), dans laquelle du collagène natif est extrait d'un
tissu animal
et dilué dans une solution acide aqueuse, puis digéré par une enzyme telle que
la
pepsine, trypsine ou PronaseTM. La digestion enzymatique permet de retirer les
portions
télopetides des molécules de collagène, et d'isoler du collagène atélopeptide
en
solution. Le collagène atélopeptide ainsi obtenu est substantiellement non-
immunogène
et substantiellement non-réticulé du fait de l'élimination des régions
réticulées
principales. Le collagène en solution peut ensuite être précipité par dialyse
dans un
environnement de cisaillement modéré pour produire des fibres de collagène qui
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ressemblent à des fibres de collagène natif. Les fibres précipitées et
reconstituées
peuvent en outre être réticulées par chauffage ou radiation en présence d'un
agent
chimique réticulant tel que par exemple un aldéhyde comme le formaldéhyde ou
le
glutaraldéhyde. Les produits obtenus peuvent être utilisés comme implants
médicaux du
fait de leur biocompatibilité et leur immunogénicité réduite.
Malgré la structure protéinique inchangée après sa purification, le collagène
purifié ou
collagène atélopeptides se dégrade plus rapidement in vivo lors de son
implantation
chez les mammifères. Pour cette raison, le collagène atélopeptide polymérisé a
été
réticulé ou greffé de radicaux chimiques pour augmenter son réseau fibreux et
permettre au produit modifié de résister plus longtemps à sa biodégradabilité
in vivo,
d'augmenter sa force de traction ou la viscosité en solution.
De nombreuses études ont été entreprises pour développer les possibilités de
couplage
du collagène grâce à la présence et la disponibilité de nombreux groupements
amines
(NH2) sur sa structure molécualire. Parmi les nouvelles inventions, on trouve
quatre
principaux groupes de couplage pour cette protéine.
Groupe 1 :
Le premier groupe utilise un agent réticulant ou polymérisant qui forme un
pont entre les
mêmes molécules ou par l'intermédiaire de ce pont d'autres molécules
pourraient venir
se greffer sur ce pont.
Les réactifs les plus fréquemment utilisés sont des mono ou dialdéhydes
entraînant par
exemple la formation d'un pont méthylène avec le formaldéhyde ou la formation
d'une
liaison imine et aldol avec la glutaraldéhyde, un agent de réticulation
bifonctionnel, qui
réagit avec des amines libres. Le problème majeur produit par ces formations
est dû à
la présence de groupe terminal aldéhyde (-CHO) qui, une fois ce groupe
relargué, va se
transformer en un polymère de dialdéhydes cytotoxique et irritant.
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Le brevet US 2,900,644 (Rosenberg et al., 1959) décrit une méthode de
préparation
d'un implant tubulaire à partir d'une artère carotide de boruf dont la
solidité est
renforcée par un traitement avec du formaldéhyde. Toutefois, l'utilisation du
collagène
polymérisé par un aldéhyde révèle des réactions inflammatoires.
Pour réduire les réactions inflammatoires, Grillo et al. (J. Surg. Res.,
(1961), vol. 2, p.
69) ont suggéré la polymérisation contrôlée du collagène par le formaldéhyde
pour
ralentir la vitesse de résorption de celui-ci. Gillo et al. ont montré
également que la
réponse immune due aux implants de collagène reconstitué était minime.
Dans le brevet US 3,093,439 (Bothwell et al., 1963), les auteurs utilisent un
diaidéhyde
d'amidon obtenu par réaction d'oxydation de l'amidon avec l'iodate pour
traiter les
artères carotides de boeuf, lesquels sont utilisés comme implants.
Le brevet US patent 3,157,524 (Artandi), décrit des méthodes de préparation
d'éponges
de collagène utilisant du formaldéhyde. Avec le même agent de réticulation,
l'inventeur
a aussi obtenu des tubes poreux de collagène.
Le brevet US 3,823,212 (Chvapil et al., 1974) décrit une méthode d'obtention
de
membranes ou d'éponges à base de collagène réticulé en traitant le collagène
avec le
glutaraldéhyde à basse température, de -5 à-40 C et sur une durée d'un jour à
30
jours. Des antibiotiques peuvent être ajoutés dans le collagène pendant sa
préparation.
Les produits obtenus ont trouvé des applications médicales telles que le
traitement des
brûlures ou des abrasions de la peau (où des larges surfaces affectées doivent
être
recouvertes pour éviter les infections des blessures), aider la guérison des
plaies en
procurant des composés thérapeutiques actifs, ou prévenir la macération des
plaies et
une lente absorption des exsudations.
Le brevet US 4,060,081 (Yannas et al., 1977) décrit l'utilisation du collagène
et de
mucopolysaccharides comme peau synthétique, réticulé en utilisant le
glutaraldéhyde.
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Une autre utilisation du glutardialdéhyde pour réticuler le collagène a été
décrite dans le
brevet US 4,131,650 (Braumer et al., 1978). Les auteurs décrivent un
traitement de la
peau par application sur celle-ci d'une pâte à base d'eau sur laquelle est
placée un
feuillet contenant au moins 3 % en poids de collagène soluble dans l'eau et
ayant une
perméabilité à l'eau de plus d'environ 0,1 g/dm2/min, le collagène étant
transporté à
travers la pâte et absorbé par la peau. De préférence, le feuillet a une
épaisseur
d'environ 0,01 à 0,03 mm et présente un taux de réticulation correspondant à
celui
obtenu pour environ 0,1-0,5 % en poids de glutardialdéhyde utilisé dans un
milieu acide.
Le feuillet peut aussi contenir un agent cosmétique actif tel que acide aminé,
peptide,
protéine, hormone, extrait placentaire, phosphatide, extrait tissulaire,
cellules fraîches et
vitamines. La pâte peut être séchée par chauffage, produisant une rétraction
du feuillet
pour augmenter le contact avec la peau.
Une autre réaction de polymérisation du collagène conjugué aux enzymes
(alkaline
phosphatase) par le glutaraldéhyde a été décrite dans le brevet US 4,409,332
(Jefferies
etal., 1983). Ces auteurs ont obtenu un gel à base de collagène polymérisé en
absence
de réaction inflammatoire pour produire des membranes implantables, des fils
de
suture, un gel injectable et biocompatible, un support transportant des
médicaments, un
collagène injectable utilisé comme implant et une méthode pour l'augmentation
du tissu
mou.
Le brevet US 4,424,208 (Wallace et al., 1984) décrit une formulation de
collagène
améliorée, appropriée pour une utilisation dans l'augmentation des tissus
mous. La
formulation de Wallace comprend du collagène fibrillaire atélopeptide
reconstitué (tel
que par exemple le Zyderm ) en combinaison avec des particules de collagène
atélopeptide réticulé dispersées dans un milieu aqueux. L'addition de
particules de
collagène réticulé améliore la persistance de l'implant ou son habilité à
résister à la
rétraction après implantation. L'agent réticulant utilisé est le
glutaraldéhyde.
Le brevet US 4,582,640 (Smestad et al., 1986) décrit la préparation d'un CIS
atélopeptide réticulé par du gluturaldéhyde (GAX) utilisable dans des implants
médicaux. Le collagène est réticulé dans des conditions favorisant des
liaisons intra-
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fibres plutôt que inter-fibres et le produit obtenu présente une plus grande
persistance
qu'un collagène atélopeptide non-réticulé. Le produit est commercialisé par la
société
Collagen Corporation sous la marque Zyplast .
Le brevet US 4,597,762 (Walter et al., 1986) décrit une méthode de préparation
de
collagène de type I et la polymérisation de celui-ci par le diaidéhyde
glutarique en
présence de ficine et de L-cystéine. Le produit obtenu est pour l'usage en
médecine
humaine et vétérinaire.
Les brevets US 4,600,533; US 4,655,980; US 4689,399 et US 4,725,671 (Chu et
al.)
décrivent l'obtention de membranes de collagène possédant des propriétés
particulières
par diverses techniques de formation de gels, en combinaison avec des méthodes
permettant de transformer ces gels sous forme de solides. Les propriétés de
ces
membranes, ou de toutes autres formes solides, peuvent être modifiées soit en
réticulant la préparation de collagène après la formation de la membrane ou du
gel, soit,
préférentiellement, en mélangeant du collagène réticulé avec le collagène
solubilisé
dans le mélange de départ utilisé pour préparé le gel. Les agents réticulant
utilisés sont
le formaidéhyde, le glutaraldéhyde, le glyoxal, etc. Les membranes de
collagènes ainsi
préparées sont utilisées dans le domaine médical.
Les brevets US 4,980,403 (Bateman et al.); US 5,374,539 (Nimni et al.) et US
5,411,887 (Sjôlander) décrivent tous l'utilisation d'un agent de réticulation,
comme le
glutaraldéhyde, pour polymériser le collagène, lequel sert à fabriquer des
produits pour
les applications médicales humaines et vétérinaires tels que des bioprothèses
ou des
gels et des films pour le traitement des plaies.
Un désavantage majeur à l'utilisation du collagène réticulé est la réaction
biologique
négative due au relargage de l'aldéhyde, un réactif souvent utilisé pour
polymériser le
collagène et le rendre insoluble dans plusieurs applications. Le détachement
de
l'aldéhyde lié au collagène réticulé démontre une cytotoxicité des cellules,
spécifiquement pour le fibroblaste (Speer et al. J. Biomedical Materials
Research 1980,
14, p. 753; Cook et al. British J. Exp. Path. 1983, 64, p. 172). Des travaux
récents
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suggèrent que les polymères de glutaraldéhyde, à la différence du
glutaraldéhyde sous
forme monomérique, forment des liaisons réticulaires entre les molécules de
collagène
et que ces liaisons peuvent se réarranger pour libérer du glutaraldéhyde et
des
polymères de glutaraldéhyde (Cheung, D. T. et Nimni, M. D., Connective Tissue
Research 10,187-217,1982).
Groupe 2 :
Des agents de couplage du collagène utilisés pour éviter la réaction
secondaire et
parasite due aux aldéhydes libres constituent le deuxième groupe de couplage.
Parmi
ces nouveaux agents de couplage, on cite :
- la réaction d'acylation par l'intermédiaire d'un anhydride (composés
dicarboxyliques) produisant une liaison amide ou ester, les anhydrides les
plus souvent utilisés étant les anhydrides succinique, maléique, glutarique,
benzoïque, laurique, diglycolique, méthylsuccinique ou méthyl glutarique;
- la réaction de sulfonation et de phosporylation par des halogènes sulfonylés
et phosphorylés qui établissent une liaison intra et intercaténaire;
- l'utilisation de carbodiimides, de diisocyanates ou de diamines permettant
de
créer des liaisons d'amides;
- la formation d'un pont disulfure -S-S- ; ou
- l'obtention d'une fonction aldéhyde avec des polysaccharides, laquelle vient
s'additionner sur le collagène pour étendre le réseau du polymère.
Le brevet US 4,404,970 (Sawyer) décrit la modification du collagène en faisant
réagir
les fonctions acides de celui-ci avec des amines en présence d'EDC (1-éthyl-
3,3-
diméthylaminopropyl)carbodiimide.
Les brevets US 4,703,108 and US 4,970,298 (Silver et al.) enseignent la
préparation
d'une matrice, d'une éponge ou d'un film à base de collagène par mise en
contact du
collagène avec un agent de réticulation choisi parmi un carbodiimide et un
ester actif
dérive du N-hydroxysuccinimide suivi d'une forte déshydratation.
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Le brevet US 4,713,446 (DeVore et al., 1987) décrit un collagène modifié
chimiquement
préparé par réaction du collagène natif avec des dérivés d'acide di- ou tri-
carboxylique
tels que des halogénures, des sulfonyle, des anhydrides ou des esters en tant
qu'agents
de couplage. Cette réaction est contrôlée de façon à limiter le degré de
réticulation. La
réaction a lieu au niveau des fonctions amine résiduelles de la lysine se
trouvant sur le
collagène. Le produit obtenu est dissout dans un tampon physiologique donnant
ainsi
une solution viscoélastique ayant des applications thérapeutiques variées dans
le
domaine chirurgical et particulièrement en ophtalmologie. Les agents de
réticulation
sont en particulier, l'amino succinique, le chlorure succinique, l'amine
phthalique ou
glutanique.
Le brevet US 4,837,285 (Berg et al., 1989) décrit la réticulation de la
matrice collagène
sous forme de billes, effectuée en dispersant ces billes dans une solution de
carbodimine. La réticulation peut avoir lieu en combinaison avec une forte
déshydratation à des températures entre 50 et 200 C sous un vide inférieur à
50 torr
pour 2 à 92 heures.
Le brevet US 4,958,008 (Petite et al., 1990) décrit un procédé chimique
permettant le
blocage du groupement acide présent sur le collagène et empêchant ainsi
l'utilisation du
glutaraldéhyle qui pourrait entraîner certaines toxicités et induire des
phénomènes de
calcification. Le procédé décrit dans ce brevet consiste en la réticulation du
collagène
par l'introduction de groupements azide qui comprend essentiellement une
estérification
des groupes d'acide libre du collagène, la transformation de ces groupes
estérifiés en
groupes hydrazides suivie d'une transformation en groupes azide par l'action
d'acide
nitreux et caractérisée en ce que chaque étape est effectuée après une étape
de
rinçage par une solution aqueuse saline.
Le brevet US 5,412,076 (Gagnieu C., 1995) décrit un collagène modifié réticulé
soluble
dans l'eau ou dans un solvant organique aprotique et polaire, les groupements
libres de
thiol appartenant aux résidus de cystéine ou ses analogues sont réticulés par
la
formation de ponts disulfide et ce pour donner des gels ou des produits
réticulés en
présence d'agents d'oxydation doux, cette méthode permet un excellent contrôle
de la
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vitesse de réaction et du degré de réticulation. Les diverses applications
sont dans le
domaine des adhésifs, des biomatériaux pour la formation de prothèses,
d'implants ou
d'autres articles médicaux.
Le brevet US 5,332,802 (Kelman et al., 1994) décrit la production d'un
collagène
chimiquement modifié, réticulé, télopeptide issu d'un même donneur humain pour
réimplanter dans le même donneur. La modification chimique du tissu faite par
acylation
et/ou estérification et cela pour former un collagène autoimplantable sous la
forme
d'une solution.
Le brevet US 5,874,537 (Kelman et al., 1999) décrit des compositions à base de
collagène pour des utilisations en tant qu'adhésifs ou de scellants à usage
médical.
Avant la polymérisation, les monomères de collagène solubles ou partiellement
fibrillés
pour solution sont chimiquement modifiés avec un agent acylant, un agent
sulfonant
pour une combinaison des deux. Les compositions de collagène préparées ainsi
peuvent être utilisées comme des adhésifs médicaux pour lier des tissus mous
ou alors
comme films scellants ayant une variété d'usages médicaux tels que la
fermeture de
blessures ou l'enrobage de tendons afin de prévenir la formation d'adhésion
après une
opération chirurgicale.
Les brevets US 5,866,165 et US 5,972,385 (Liu et al., 1999) décrivent la
préparation et
l'utilisation d'une matrice de support permettant la production de tissus tels
que des os,
du cartilage ou des tissus mous. Un polysaccharide est mis en réaction avec un
agent
oxydant pour ouvrir les anneaux de sucre du polyssacharide et former ainsi des
groupes
aldëhyde qui réagissent pour former des liens covalents dans le collagène. De
façon
préférentielle, le polysaccharide utilisé est l'acide hyaluronique.
Le brevet US 6,165,488 (Tardy et al., 2000) décrit un procédé similaire
utilisant une
macromolécule polyaldéhyde d'origine naturelle obtenue par la réticulation du
collagène
avec un periodate pour des utilisations en tant que matériaux biocompatibles,
biorésorbables et non toxiques à usage médical ou thérapeutique.
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Le brevet US 6,309,670 (Heidaran et al., 2001) décrit une méthode de
traitement de
tumeurs des os comprenant l'administration d'une matrice composée d'un
collagène,
d'un polysaccharide et d'un facteur de différentiation. Le polysaccharide
réagit avec un
agent oxydant pour ouvrir les anneaux de sucre formant ainsi des groupes
aldéhyde qui
comme vu précédemment réagissent pour former des liants covalents dans le
collagène. Les polysaccharides utilisés sont l'acide hyaluronique, le dextrane
ou le
sulfate de dextrane.
Le brevet US 6,127,143 (Gunasekaran, 2000) décrit l'utilisation d'une méthode
de
phosphorylaton pour obtenir un produit biocompatible à partir d'un collagène
purifié qui
est produit en utilisant deux traitements enzymatiques protéolytiques et un
agent de
réduction. Avant la phosphorylation, le collagène purifié est délipidé et
ensuite traité par
compression, déshydratation, dispersions et séchage pour former des fibres de
collagène. Le collagène purifié et biocompatible peut être utilisé en
transplantation ou
en hémostase et peut être combiné à des composés tels que des antibiotiques,
des
antiviraux, facteurs de croissance ou autres composés utiles pour les usages
biomédicaux.
Les brevets US 5,492,135; 5,631,243 et 6,448,378 (DeVore et al., 1996, 1997,
2002)
décrivent la préparation d'un film de collagène qui est rapidement dissout à
35 C et
utilisé à libération du médicament au niveau d'un tissu spécifique du corps.
Ce film de
collagène est fabriqué à partir d'un collagène pauvre télopeptide qui est
modifié avec
l'anhydride glutarique.
Le brevet US 6,335,007 (Shimizu et al., 2002) décrit un gel de collagène qui
est obtenu
par réticulation d'un polyanion avec un carbodiimide. Les polyanions utilisés
sont l'acide
alginique, la gomme arabique, l'acide polyglutamique, l'acide polyacrylique,
l'acide
polyaspartique, l'acide polymalique, les carbométhylcellulose tel qu'un amino
carboxylé
et des carbodiimides solubles dans l'eau tel que le 1-éthyl-3-(3-
diméthylaminopropyl)carbodiimide. Le produit revendiqué consiste en un kit
pour
produire le gel de collagène comprenant une solution aqueuse de collagène, une
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solution aqueuse de polyanion et une solution aqueuse du carbodiimide. Le kit
utilisé
comme un adhésif directement sur le corps humain avec des propriétés
hémostatiques,
obstruantes ou remplissantes pour la fabrication de vaisseaux sanguins
artificiels, de
tubes artificiels ou d'oesophages artificiels.
Les brevets 6,969,400 et 6,911,496 (Rhee et al., 2005) décrivent une
composition d'un
polymère réticulé comprenant un premier polymère synthétique contenant de
multiple
groupes nucléophiliques attachés de façon covalente à un second polymère
synthétique
contenant une multitude de groupes électrophysiques. Le premier polymère
synthétique
est préférablement un polypeptide ou un polyéthylène glycol qui a été modifié
pour
contenir plusieurs groupes nucléophiles tels que des amines primaires ou des
thiols. Le
second polymère synthétique peut être un polymère hydrophile ou hydrophobe
contenant ou ayant été modifié pour contenir un ou plusieurs groupes
électrophiles tels
que des groupes succinimidyl. Des compositions peuvent également contenir
d'autres
composés tels que des polysaccharides naturels ou des protéines tels que les
glycosaminoglycanes ou les collagènes et/ou des agents biologiques. Ce brevet
enseigne également des méthodes pour l'utilisation des compositions de
polymère
réticulé afin d'améliorer l'adhésion entre une première et une seconde
surfaces;
l'augmentation des tissus pour prévenir la formation d'adhésion chirurgicale
ou pour
recouvrir les surfaces des implants synthétiques.
Le brevet US 6,962,979 (Rhee et al., 2005) décrit des compositions de
biomatériaux
réticulés qui sont préparés en utilisant des polymères hydrophobes et un agent
réticulant. Les polymères hydrophobes utilisés sont principalement ceux
contenant deux
ou plus de groupes réactifs succinimidyl incluant le subérate de
disuccinimidyl, le
subérate de bis(suifosuccinimidyl) et le dithiobis(succinimidylpropionate).
Les
conipositions de biomatériaux réticulés préparées, utilisant des mélanges de
composés
hydrophobes et d'agents réticulant hydrophiles sont aussi enseignés dans ce
brevet.
Les compositions peuvent être utilisées pour préparer des implants aux
utilisations
médicales variées.
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Le brevet US 6,916,909 (Nicolas et al., 2005) décrit de nouveaux collagènes
peptidiques qui sont modifiés par greffage des fonctions thiol libres ou
substituées
contenues dans les radicaux mercaptoamine. L'essence de cette invention est
d'obtenir
des collagènes thiol qui peuvent être réticulés de façon suffisante et
contrôlée en
formant des ponts sulfurés et qui sont également biocompatibles.
Le brevet US 6,790,438 (Constancis et al., 2004) décrit un collagène modifié
peptidique
pour prévenir les adhésions post-opératoires. Là encore, le collagène
peptidique est
modifié par le greffage des fonctions thiol présentes sur les radicaux
mercaptoamine qui
sont exclusivement greffés sur les acides aspartiques et glutamiques des
chaînes de
collagène en formation de liaisons amine.
Groupe 3 :
Le troisième groupe porte sur des réactions de copolymérisation entre le
collagène et un
polymère par une liaison covalente en donnant une conformation plus ou moins
croisée.
Les polymères les plus associés avec le collagène sont les dérivés acryliques,
les
acrylonitriles, les styrènes, les polyuréthanes, les polyalcools et les
silicones.
Le brevet US 4,452,925 (Kuzma et al., 1984) décrit des hydrogels préparés par
polymérisation d'un mélange comprenant une quantité importante d'un monomère
organique possédant un groupement éthylénique polymérisable tel que N,N-
diméthylacrylamide, 2-hydroxyéthyl méthacrylate, diméthylaminoéthyl
méthacrylate ou
méthoxytriéthylène glycol méthacrylate, et une petite quantité de collagène
solubilisé.
Les réactifs utilisés sont au moins partiellement solubles dans le milieu
réactionnel
aqueux. Les hydrogels ainsi préparés constituent des articles de forme
nouvelle utiles
dans les domaines médical et cosmétique.
Groupe 4 :
Le quatrième groupe de couplage du collagène consiste à réaliser un réseau
dense par
création de liaisons covalentes uniquement entre les molécules de collagène
sans
incorporation d'autres groupes de molécules. Ce groupe comprend :
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- l'irradiation par rayon ultraviolet, bêta ou gamma produisant une
désamination
et permettant ainsi un couplage au niveau des liaisons d'imine et d'aldol ou
des radicaux libres libérés par ces sources de rayons, lesquels forment des
structures avec les ponts covalents. Cette méthode de couplage ne peut être
réalisée qu'avec une source de faible énergie; l'utilisation d'une source de
haute énergie conduisant à une hydrolyse ou une dénaturation du collagène;
- la déshydratation sous pression et à haute température (? 100 C) conduit à
la
formation d'une liaison d'amide et d'ester aussi bien des intra et
intermolécules de lysinoalanines. Les carbodiimides comme les cyanamide et
dicyclohexylcarbodiimide sont des réactifs utilisés dans ce procédé;
- l'oxido-réduction produisant une désamination par oxydation du terminal des
groupes aminés avec la formation d'un groupe d'aldéhydes. Cette méthode
utilise souvent des cations (Cu2+, Fe2+, AI3+) en présence des sulfites ou des
nitrites et est très largement utilisée dans la tannerie du cuir; et
- l'activation fonctionnelle des carboxyles produisant des acides azides ayant
une réactivité très sélective envers les fonctions amines (-NH2) qui
conduisent
à la formation d'une liaison amide.
Le brevet US 4,614,794 (Easton et al., 1986) décrit l'obtention d'un
biomatériau à partir
d'un mélange de collagène et d'alginate de sodium. Après une étape de
lyophilisation,
ces composés sont transformés en un complexe couplé, dit déhydrothermal, par
chauffage à 115 C, sous vide, pendant 48 heures.
Le brevet US 5,331,092 (Huc et al, 1994) décrit une méthode de réticulation ou
de
couplage entre des molécules de collagène en chauffant le produit lyophilisé
de
collagène à 110 C, sous un vide de 400 microbars pendant 10 heures.
Le brevet US 4,931,546 (Tardy et al., 1990) décrit le couplage entre les
molécules de
collagène, à pH neutre ou basique, grâce à des fonctions d'aldéhyde formées
par
l'action d'un acide périodique ou de ses sels de sodium avec la molécule de
collagène.
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Le brevet US 4,958,008 (Petite et al. 1990) décrit une méthode d'obtention
d'un
biomatériau pour la préparation d'une bioprothèse à base de collagène qui
s'est couplé
grâce à la formation d'un groupe d'azide-collagène et l'amine du terminal de
la lysine du
collagène en donnant une liaison amide. Cette formation donne une réaction de
couplage interne du réseau de collagène.
2.2.2.2. Le chitosane
Le chitosane est issu de la chitine désacétylée est un polysaccharide composé
de la
distribution aléatoire de D-glucosamine liée par R-(1-4) (unité désacétylée)
et de N-
acétyl-D-glucosamine (unité acétylée). De par sa propriété hémostatique, son
affinité vis
à vis des lipides, le chitosane est devenu depuis plus de deux décennies une
substance
très exploitée pour ses applications dans le domaine médical, pharmaceutique,
cosmétique et diététique. Les applications médicales sont aussi basées sur les
caractéristiques du chitosane, tels que sa biocompatibilié (minimise les
réactions
inflammatoires), sa biorésorbabilité et biodégradabilité. De plus, le
chitosane est bien
connu pour être un bon substrat pour la colonisation cellulaire stimulant
ainsi la
croissance des cellules et augmentant la vitesse de cicatrisation de plaies
ouvertes en
stimulant la réponse immunitaire et la reconstruction des tissus, en prévenant
les
infections microbiennes et en absorbant l'exsudat. En effet, le chistosane a
également
des propriétés antibactériennes et antimicrobiennes.
Le brevet US 4,031,025 (Vanlerberghe et al., 1977) décrit la méthode
d'acylation du
chitosane avec un anhydride diacide saturé ou insaturé. Le produit obtenu est
utilisé
dans la préparation cosmétique comme agent hydratant de la peau. Les
anhydrides
saturés utilisés sont l'anhydride succinique, l'anhydride acétoxysuccinique,
l'anhydride
méthylsuccinique, l'anhydride diacétyltartarique et anhydride diglycolique.
Les
anhydrides insaturés sont l'anhydride maléique, l'anhydride itaconique ou
l'anhydride
citraconique. Les dérivés de chitosane obtenus portent donc un groupement
d'acide
correspondant à l'anhydride utilisé par la formation d'une liaison covalente
avec les
amines de chitosane.
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WO 2007/028244 PCT/CA2006/001468
Le brevet US 4,424,346 (Hall et al., 1984) décrit l'obtention de dérivés de
chitine et de
chitosane pour leur utilisation dans la chélation des métaux, dans la
formulation
pharmaceutique et cosmétique, dans la séparation chromatographique, dans
l'immobilisation des enzymes, etc. Ces dérivés sont obtenus par une
modification des
résidus d'amine sur la polyglucosamine avec formation des groupes :
(a) -N=CHR ou -NHCH2R
(b) -NHR'
(c) -NHR" et
(d) -NH-CH2COOH ou -NH-glycéryl
où R. est un radical aromatique portant au moins un groupement hydroxyle ou
carboxyle
ou un ligand macrocyclique ; R' est un résidu d'une aldose ou d'une cétose et
R" est
résidu d'un aldéhyde organométallique.
Le brevet US 4,659,700 (Jackson et al., 1987) décrit la préparation d'un gel à
base de
chitosane, du glycérol et de l'eau pour une application sur les plaies.
Les brevets US 4,651,725 (Kifune et al., 1987) et 4,699,135 (Motosugi et al.,
1987)
revendiquent la préparation des filaments de chitine pour la fabrication des
pansements
des plaies. La chitine est simplement mise en solution dans de la
diméthylacétamide en
présence du chlorure de lithium (LiCI) à température ambiante. Cette solution
est
extrudée sous pression à l'aide d'une pompe dans un bain coagulant contenant
du
méthanol. Les fibres de chitine sont traitées avec une solution de soude à 40%
et à
80 C pendant 3 heures. Ensuite les fibres sont neutralisées avec HCI, lavées
et
séchées.
Le brevet US 6,509,039 (Nies, 2003) décrit l'obtention de nouveaux dérivés de
chitosane en faisant réagir de celui-ci avec de l'anhydride pyromellitique et
avec de
d'anhydride polymaléique d'un poids moléculaire jusqu'à 1000. Les dérivés de
chitosane
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obtenus servent à produire des capsules pharmaceutiques, des implants
médicaux, des
matériaux de suture et des recouvrements des plaies.
Liu et al. [J. Mater. Sci. Mater. Med. (2004) v ol. 15(11); pp. 1199-1203]
décrit la
modification du chitosane par greffage de l'arginine en utilisant l'EDC (1-
éthyl-3-(3-
diméthylaminopropyl)carbodiimide et le NHS (N-hydroxysuccinimide) comme agents
de
couplage. Selon les auteurs, le polymère obtenu est un bon candidat comme
biomatériau anticoagulant.
Le brevet US 6,756,363 (Nordquist et al., 2004) décrit la préparation d'une
solution
visco-élastique à base de chitosane glycosylé. Ce dérivé de chitosane est
obtenu en
présence d'un monosaccharide tel que galactose, glucose et ribose via la
formation
d'une base de Schiff suivie d'un réarrangement d'Amadori. Le produit obtenu
est utilisé
dans la chirurgie opthalmique, utilisé comme solution de lavage pour la
prévention
d'adhésion des organes suite à une opération chirurgicale, pansements
hémostatiques,
substrat polymérique naturel pour séparer des tissus dans la prévention du
collage de
tendon et de ligament après la chirurgie orthopédique et pour aider la
régénération
tissulaire après la chirurgie dentaire.
2.3. Problèmes associés à la modification des polymères biodégradables
Les problèmes rencontrés dans le domaine de la présente invention sont de
différentes
natures.
En premier lieu, la modification doit permettre une amélioration et non
l'inverse des
propriétés physiques du polymère biodégradable à modifier choisi, telles que
la force de
traction et la maniabilité.
En second lieu, les polymères une fois modifiés doivent rester des
biomatériaux
biocompatibles et biodégradables. Si le polymère utilisé est un biomatériau,
il doit le
rester après sa modification. Les réactions chimiques de modifications se
passent
généralement en milieu organique pouvant détériorer prématurément la chaîne
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polymère ou fragiliser celle-ci. En milieu aqueux, les composés chimiques
utilisés tels
que l'EDC ou le NHS peuvent également se retrouver prisonniers du matériau et
rendre
celui-ci toxique et donc non biocompatible.
Finalement, l'agent de couplage utilisé pour modifier le polymère ne doit pas
entraîner
de réactions parasites de réticulation des chaînes polymères, et ce pour
éviter là encore
la dénaturation du polymère biodégradable utilisé et conserver ainsi ses
propriétés
initiales.
Il existe donc un réel besoin pour un nouveau procédé de synthèse de nouveaux
biomatériaux biocompatibles, cytocompatibles et biodégradables utilisables
dans le
domaine médical, pharmaceutique ou cosmétique, particulièrement pour la
fabrication
de pansements aux propriétés hémostatiques, bactériostatiques et/ou
cicatrisantes.
3. Sommaire de l'invention
La présente invention a pour but de répondre aux besoins ci-dessus évoqués.
Plus précisément, un premier objet de la présente invention est un procédé de
préparation d'un polymère biodégradable modifié comprenant :
(a) une première étape de réaction en milieu aqueux entre un aminoacide, un
peptide ou un polypeptide et l'anhydride maléique pour former un acide vinyl-
carboxylique;
et
(b)Une seconde étape de réaction en milieu aqueux entre l'acide vinyl-
carboxylique
obtenu à l'étape (a) et un polymère biodégradable ayant au moins une fonction
amine primaire pour obtenir le polymère biodégradable modifié désiré.
Un second objet de la présente invention est le polymère biodégradable modifié
obtenu
par le procédé décrit ci-dessus et son utilisation pour la fabrication de
biomatériaux
ayant des propriétés biocompatibles, hémostatiques et cicatrisantes.
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Un autre objet de la présente invention est un pansement comprenant le
biomatériau tel
que défini ci-dessus. Le pansement hémostatique selon l'invention est
biocompatible et
a des propriétés hémostatiques et cicatrisantes
La présente invention répond aux difficultés rencontrées dans le domaine des
biomatériaux et permet de réaliser très simplement des biomatériaux destinés à
être
utilisé dans la fabrication de pansement biologique, de substitut de la peau,
de prothèse
et/ou d'implant. Ces biomatériaux ont des propriétés à la fois hémostatique,
cicatrisante
et antiseptique, et sont également biocompatible, cytocompatible et
biodégradable.
Les avantages de la présente invention sont essentiellement dus à
l'utilisation lors du
procédé de modification du polymère d'un milieu aqueux permettant de conserver
les
propriétés initiales du polymère et de limiter la présence de composés
chimiques
résiduels dans le matériau rendant celui-ci impropre à son utilisation comme
biomatériau.
De plus, l'utilisation d'un acide dicarboxylique insaturé pour modifier un
polymère
biodégradable aminé permet d'éviter les réactions parasites de réticulation de
ces
polymères.
L'invention et ses avantages ressortiront mieux de la description non
limitative qui suit
de différents modes préférés de l'invention.
4. Description détaillée de l'invention
Tel que mentionné ci-dessus, la présente invention a pour objet un procédé de
préparation d'un polymère biodégradable modifié. Le procédé comprend de façon
générale une première étape (a) de réaction en milieu aqueux entre un
aminoacide, un
peptide ou un polypeptide et l'anhydride maléique (aussi nommé anhydride but-2-
ènoïque) pour former un acide vinyl-carboxylique. Dans une seconde étape (b),
une
réaction en milieu aqueux a lieu entre l'acide vinyl-carboxylique obtenu à
l'étape (a) et
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un polymère biodégradable. Pour que la seconde étape (b) puisse avoir lieu, il
faut que
le polymère biodégradable utilisé ait au moins une fonction amine primaire qui
réagit
avec la double liaison de l'acide vinyl-carboxylique. A l'issu de la seconde
étape, on
obtient le polymère biodégradable modifié.
4.1. Synthèse du composé acide vinyl-carboxylique
D'un point de vue schématique, la réaction chimique générale qui a lieu dans
l'étape a)
du procédé selon l'invention peut être représentée de la façon suivante :
O
HOOC-R-NH2 + O >. HOOC-R-NH-CO-CH=CH-COOH
I II
O
dans laquelle R représente un résidu d'acide aminé, de peptide ou de
polypeptide de
formule générale (I) HOOC-R-NH2.
Le résidu R peut être choisi de façon à ce que la formule générale (I)
représente
préférentiellement un acide aminé essentiel. Plus préférentiellement, l'acide
aminé
essentielle est choisi parmi la glycine, la L-alanine, la valine, la leucine,
l'isoleucine, la
phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, la sérine, la thréonine,
l'asparagine, la
glutamine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, la cystéine, la tyrosine,
l'histidine, la
lysine et l'arginine.
Le résidu R peut également être choisi de façon à ce que la formule générale
(I)
représente un acide aminé non essentiel. Préférentiellement, l'acide aminé non
essentiel est choisi parmi les résidus présentés dans le tableau 1 ci-dessous
:
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Valeur de R Nom de l'acide aminé correspondant
De formule HOOC-R-NH2
-(CH2)2- P alanine
CH3-CH2-CH a ou 2-aminobutyrique
CH3-CH-CH2- (3 ou 3-aminobutyrique
-(CH2)3- y ou 4-aminobutyrique
CH3-CH2-CH2-CH 2-aminopentanoïque ou norvaline
CH3-CH2-C-CH3 2-amino-2-methylbutyrique ou isovaline
5-aminopentanoïque ou
-(CH2)4- 5-aminovalérique
2-aminohexanoïque ou
2-aminocaproque ou
CH3-(CH2)3-CH norieucine
-(CH2)5- 6-aminohexanoïque
-(CH2)6- 7-aminoheptanoïque
Tableau 1
Le résidu R peut être également choisi de façon à ce que la formule (I)
représente un
peptide ou un polypeptide.
Finalement, le résidu R peut également être choisi de façon à ce que la
formule (I)
représente une molécule aromatique, pourvu que les composés de formule (I)
aromatique soient solubles dans l'eau.
L'avantage d'utiliser l'acide maléique réside dans la formation du composé
acide vinyl-
carboxylique de formule (II) possédant une double liaison située en a d'une
fonction
acide dicarboxylique. En conséquence, la double liaison est activée et
réagira,
préférentiellement en milieu aqueux acidulé, avec la ou les fonctions amines
du
polymère biodégradable à modifier dans l'étape (b) du procédé.
De plus, la fonction amine ne réagira pas dans ces conditions avec les
fonctions acides
de la molécule de formule (II), évitant ainsi toute réaction de réticulation
entre plusieurs
chaînes polymères.
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En conséquence, la partie aminoacide, peptidique ou polypeptidique de la
molécule de
formule II demeurera libre une fois que celle-ci sera greffée sur le polymère
biodégradable.
La réaction de l'étape (a) se réalise préférentiellement en milieu aqueux et à
une
température comprise entre environ 20 et 100 C, préférentiellement entre
environ 20 et
80 C et plus préférentiellement entre environ 20 et 60 C.
Le terme environ utilisé dans le présent mémoire descriptif représente
l'erreur qui
peut être commise lors de la lecture d'une température, d'une masse, d'une
durée ou
d'uri volume selon l'appareil utilisé pour réaliser cette mesure. L'erreur est
généralement
admise comme étant de 10% de la valeur lue.
L'un des avantages du procédé selon la présente invention, est l'utilisation
de l'eau
comme solvant de réaction, évitant ainsi une destruction des chaînes polymères
prématurée due à l'utilisation d'un solvant organique. Toutefois, il est bien
connu de
l'Homme de l'art que l'anhydride maléique réagit dans l'eau pour retourner à
son état
hydraté. A cause de cette réaction d'hydrolyse de l'anhydride en milieu
aqueux, le
rapport molaire entre l'anhydride maléique et l'acide amino-carboxylique (I)
utilisée dans
l'étape (a) est compris entre environ 1/1 et 2/1, plus préférentiellement ce
rapport est
compris entre 1,2/1 et 2/1, et encore plus préférentiellement le rapport
molaire entre
l'anhydride maléique et l'acide amino-carboxylique (I) est d'environ 1,5/1.
Le composé de formule (I) utilisé dans l'étape a) du procédé selon l'invention
est
préférentiellement présent dans le milieu réactionnel de façon à ce que sa
concentration
soit très forte. Plus préférentiellement le milieu réactionnel est saturé par
le composé de
formule (I). Selon le degré de solvatation du composé de formule (I), un
chauffage peut
être appliqué pour faciliter sa dissolution et pour accélérer la réaction de
couplage.
La formation de l'acide vinyl-carboxylique (II) (ou produit de couplage) est
instantanée
sous forme de poudres fines. Le produit de couplage est récupéré par
filtration sous
vide et lavé plusieurs fois à l'eau pour enlever l'acide maléique formé par
l'hydrolyse de
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l'anhydride maléique. L'eau de lavage est préférablement refroidie à environ 4
à 10 C
pour éviter la perte de proçuit de couplage. Le produit de couplage est
ensuite séché à
l'air. II est à noter que le rendement obtenu diminue lorsque l'encombrement
stérique du
radical R augmente.
4.2. Couplage de l'acide vinyl-carboxylique avec un polymère biodégradable
Dans la seconde étape b) du procédé selon l'invention, l'acide dicarboxylique
insaturé
de formule générale (II) est mis en réaction avec un polymère naturel
biodégradable
possédant au moins une fbnction amine présente sur sa structure moléculaire.
Le nombre de fonctions amines du polymère biodégradable est variable et dépend
de la
nature du polymère biodégradable choisi.
Tel que déjà mentionné, la double liaison de l'acide vinyl-carboxylique,
obtenu à l'étape
a) du procédé, est activée par la présence de la fonction acide carboxylique
et réagit,
préférentiellement en milieu aqueux acidulé, avec la ou les fonctions amines
du
polymère biodégradable.
Selon un mode préféré de l'invention, le polymère naturel biodégradable
utilisé est une
protéine fibreuse ou un glycosaminoglycane.
Il faut comprendre que de par leur taille moléculaire élevée et la complexité
de leur
structure moléculaire, la détermination du taux de modification (ou taux de
greffage)
d'une protéine fibreuse ou d'un glycosaminoglycane est complexe. En général,
ce taux
de modifications peut être déterminée par des méthodes physico-chimiques
telles que
des mesures de viscosité des solutions des polymères modifiés (voir l'article
Durand A.
et al, Biomacromolecules, 2006, vol 7(3), pp 958-64, relatif à préparation de
polysaccharides modifié hydrophobiquement). Cependant, il n'est pas toujours
nécessaire de connaître ce taux de modifications. Seuls les changements
notables des
propriétés du polymère avant et après sa modification, tel la viscosité en
solution,
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l'élasticité du polymère, la malléabilité en autres, permettent de conclure
que ceux-ci ont
bien été modifiés.
4.2.1. Modification d'une protéine fibreuse Couplage avec l'acide vinyl-
carboxylique de formule (II)
Plus préférentiellement, la protéine fibreuse utilisée est le collagène ou
l'élastine.
Encore plus préférentiellement, la protéine fibreuse utilisée est le
collagène.
Autrement dit, selon un mode préféré de l'invention, l'étape b) du procédé
comprend
une réaction de couplage de façon covalente entre l'acide vinyl-carboxylique
de formule
(II) sur des molécules de collagène.
4.2.1.1. Préparation du collagène
La source de collagène peut être préparée à partir des tendons, ligaments,
peaux ou
toutes autres sources contenant du collagène et bien connue de l'homme de
l'art.
L'origine des sources de collagène peut être sélectionnée chez des animaux
terrestres :
équins, porcins, bovins, reptiles y compris les volatiles et les marins. Le
placenta
d'origine humaine peut être utilisé pour isoler le collagène humain. Bref
toutes sources
et tous types de collagène peuvent être utilisés pour effectuer leur couplage
avec l'acide
vinyl-carboxylique de formule générale (II) obtenu selon l'étape (a) du
procédé décrit ci-
dessus.
Le collagène utilisé peut être natif ou brut, ou traité enzymatiquement par
pepsine ou
ficin ou papain pour enlever le télopeptide. Le collagène peut également être
purifié ou
pré-modifié chimiquement.
De très nombreuses méthodes de préparation du collagène ont été décrites et
très bien
connues dans l'art. Les méthodes conventionnelles pour la préparation du
collagène :
(pur, soluble dans l'acide, collagène monomère en solution et collagène natif)
sont
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incorporées ci-contre comme références, par exemples décrits dans les brevets
US
Nos. 3,934,852; 3,121,049; 3,131,130; 3,314,861; 3,530,037; 3,949,073;
4,233,360;
4,488,911; 4,216,204; 4,455,302 et 5,138,030.
Selon un mode préféré de l'invention, le collagène utilisé dans l'étape (b) du
procédé est
d'origine volatile tel que le poulet, l'oie, le canard ou d'autres types
d'oiseaux.
Préférentiellement, le volatile choisi est un poulet âgé d'environ 6 à 10
semaines dont
on prélève les pattes. Les pattes sont récupérées après l'abattage et
utilisées dans les
24 heures ou peuvent être conservées à-20 C pour une utilisation ultérieure.
Les pattes
sont lavées à l'eau déminéralisée, ensuite désinfectées avec une solution
d'éthanol à
70%, puis fendues longitudinalement le long des métatarses et des doigts, et
sont mises
à tremper dans une solution stérile du chlorure de sodium à une concentration
comprise
entre 2 à 4 M (mol/L), préférablement à 2 M, pendant 1 à 4 semaines à une
température
comprise entre environ 2 et 8 C. Les écailles entourant les pattes sont
retirées et les
tendons, les ligaments et la peau sont enlevés des os et puis coupés en petits
morceaux. Ces matériaux sont ensuite mis en contact sous agitation dans une
solution
de T'ris(hydroxyméthyl)aminométhane (appelé couramment Tris) à 1 % (p/v =
poids /
volume) - Citrate de sodium à 2.40% (p/v), à pH = 7,30-7,50 pendant 24 heures
et à une
température comprise entre environ 2 et 8 C pour éliminer les débris
membranaires et
le sang.
Les matériaux sont ensuite récupérés par une simple filtration et lavés avec
de l'eau
stérile et ensuite mis en contact sous agitation avec une solution d'acide
acétique 0,5 M
ou 3% (v/v = volume / volume) pendant 2 heures à température ambiante.
Par température ambiante on comprend une température de la pièce à
laquelle
l'opérateur travaille et pouvant être comprise généralement entre 15 et 30 C.
Les matériaux sont broyés en utilisant un mixeur domestique pendant une durée
d'au
moins une (1) minute (min.), préférentiellement par à-coups de quatre (4) fois
quinze
(15) secondes (s), ou jusqu'à l'obtention d'une consistance pâteuse.
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La solution de collagène ainsi obtenue est additionnée d'un deuxième volume
d'acide
acétique 0,5 M (ou 3% v/v) et l'agitation continue encore pendant 4 heures à
température ambiante.
Une solution de pepsine (Sigma) dans l'acide acétique 0,5 M (ou 3% v/v) est
ajoutée
dans la solution de collagène permettant de purifier le collagène sans les
télopeptides.
La solution est agitée à température ambiante pendant au moins 24 heures,
préférablement entre 24 à 72 heures. La solution est ensuite centrifugée. Le
résidu est
ainsi écarté et la solution contenant le collagène est récupérée. La solution
du collagène
est refroidie à une température comprise entre environ 0 et 2 C et ensuite son
pH est
ajustée à environ 9 avec une solution de NaOH (10N et 1 N) préalablement
refroidie à
une température d'environ 0 à 2 C pour désactiver la pepsine en excès. La
température
de la solution doit être maintenue constamment à entre environ 0 et 2 C durant
l'ajustement du pH.
Cette solution est ensuite centrifugée à basse température comprise entre
environ 0 et
2 C à une vitesse de rotation d'environ 4200 rpm (round per minute) pendant
une
heure. Le surnageant contenant le collagène purifié, très visqueux, est
récupéré. Le
résidu contenant la pepsine désactivée et les télopeptides est éliminé. Le
collagène
purifié est isolé par addition du NaCI solide sous agitation à une
concentration finale de
2,5 M par litre de solution de collagène ou par addition d'une solution à 1 M
d'acétate de
sodium. Le collagène précipité est récupéré par centrifugation, solubilisé à
nouveau
dans une solution d'acide acétique à 0,5 M (ou 3% v/v) et reprécipité à
nouveau dans
une solution de NaCI (1 M) ou d'acétate de sodium (1 M). Le collagène récupéré
par
centrifugation est lavé deux fois avec une solution de NaCI 0,3 M. Finalement
le
collagène atélopeptide purifié est dissous dans l'acide acétique à 1%(v/v) et
prêt à être
couplé avec l'acide carboxylique insaturé.
Le collagène atélopeptide récupéré après le dernier lavage peut être
déshydraté par
l'éthanol ou l'acétone, séché et conservé pour une utilisation ultérieure.
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4.2.1.2. Réaction de couplage du collagène avec l'acide
vinyl-carboxylique de formule (II)
Le collagène, tel que le collagène atélopeptide obtenu selon le procédé décrit
ci-dessus,
est dissous dans une solution d'acide acétique à environ 1%(v/v).
L'acide vinyl-carboxylique de formule générale (II) (que l'on nomme également
ci-après
l'agent de couplage) est ajouté dans la solution de collagène sous agitation
pendant une
heure. La solution devient visqueuse et est chauffée à 37 C pendant 15 minutes
ou
jusqu'à la dissolution complète de l'agent de couplage. La solution de
collagène couplé
devient plus fluide et l'agitation est maintenu pendant environ une à 4 heures
à environ
20 C.
Par la suite, le collagène couplé est précipité en ajoutant une équivalence de
1 M NaCI
solide ou 1 M acétate de sodium par litre de solution de collagène. Le
précipité est
récupéré par centrifugation pendant 45 minutes à une vitesse de rotation
d'environ 4200
rpm et à une température d'environ 2 à 4 C. Le collagène couplé est dissous à
nouveau
dans une solution d'acide acétique à 1% (p/v), et le collagène est précipité
pour une
deuxième fois en ajoutant une solution à 0,8 M de NaCI ou 1 M d'acétate de
sodium
sous agitation. L'agitation est maintenue pendant environ une à 4 heures pour
compléter la précipitation.
Le nouveau matériau obtenu est récupéré par centrifugation ou filtration et
lavé ensuite
par une solution de Tris(hydroxyméthyl)aminométhane 1% (p/v), à pH = 7,00
0,30.
Finalement le biomatériau récupéré par centrifugation est déshydraté par de
l'éthanol
pur et séché à 20-25 C sous une hotte à flux laminaire.
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4.2.2. Modification d'un glycosaminoglycane avec un acide vinyl-
carboxylique de formule (II)
Tel que mentionné ci-dessus, selon un mode préféré de l'invention, le polymère
naturel
biodégradable utilisé dans l'étape b) du procédé selon l'invention est un
glycosaminoglycane.
Plus préférentiellement, le glycosaminoglycane utilisé est le chitosane issu
de la chitine.
Le chitosane utilisé doit contenir au moins 75% de groupements amine (NH2-),
ce qui
revient à de la chitine désacétylée à un taux d'au moins 75%.
Selon un mode encore plus préféré de l'invention, le chitosane utilisé est du
chitosane
commercial provenant des carapaces de crabe avec un taux de désacétylation
supérieur à 85% (Chitosane référencé C3646 chez Sigma).
Le chitosane est mis en solution dans l'acide acétique à 3% p/v. L'acide vinyl-
carboxylique est ajouté en poudre sous forte agitation. Le mélange est chauffé
à environ
60 C et cette température est maintenue jusqu'à la dissolution totale de
l'acide. Le
chauffage est ensuite coupé et l'agitation est maintenue pendant environ deux
(2)
heures.
Le chitosane couplé est précipité par addition d'une solution 1 M de NaCi ou 1
M
d'acétate de sodium par litre de solution de chitosane. Le précipité est
récupéré par
centrifugation ou par filtration et lavé au moins deux fois avec de l'eau
pure.
Le précipité lavé est finalement récupéré par centrifugation ou filtration et
déshydraté
avec de l'éthanol ou de l'acétone et séché à l'air et à environ 20-25 C.
La présente invention a également pour objet le polymère biodégradable modifié
obtenu
par le procédé décrit ci-dessus ainsi que l'utilisation de ce polymère dans la
fabrication
de biomatériaux.
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Les biomatériaux obtenus sont utilisables spécialement dans le domaine de la
médecine
et plus particulièrement en chirurgie, la pharmacie, la dermatologie,
l'esthétique et la
cosmétique. Les biomatériaux selon la présente l'invention sont
biocompatibles. En
effet, la présence des acides aminés, peptides ou polypeptides greffés le long
de la
chaîne polymère apporte ou accentue les propriétés de biocompatibilité. Le
biomatériau
sera ainsi toléré par les tissus, ce qui permettra d'accentuer les propriétés
hémostatiques et cicatrisantes du polymère biodégradable originel.
Parmi ces produits, un mode préféré de l'invention concerne l'utilisation du
polymère
modifié selon l'invention pour fabriquer un pansement aux propriétés
hémostatiques et
cicatrisantes.
Le pansement selon l'invention peut être fabriqué sous forme de poudre,
d'éponge, de
gel, de film ou de crème.
L'éponge peut être fabriquée par le procédé de lyophilisation connu de l'art.
On comprendra que le pansement selon l'invention peut contenir également une
certaine quantité de polymères biodégradables mais non-modifiés utilisés dans
l'étape
(b) du procédé selon l'invention et qui n'ont pas réagi.
Le film transparent peut être fabriqué par séchage sous ventilation à une
température
comprise entre environ 20 et 25 C. Le temps de séchage mentionné ci-dessus
varie
selon le volume et l'épaisseur du film ou de l'éponge.
La poudre, l'éponge, le film, la crème ou le gel peuvent être conditionnés
individuellement dans des bouteilles de polypropylène ou des sachets
d'aluminium et
prêts à être stérilisés par rayon gamma, technique de stérilisation également
bien connu
également de l'art.
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Des ingrédients acceptables pharmaceutiquement et solubles dans le même milieu
que
le collagène, tels que des antibiotiques, des antiseptiques, des anticancéreux
ou leurs
mélanges, sont incorporables avant la filtration et la lyophilisation.
Le polymère biodégradable de par la modification apportée à sa structure après
le
couplage avec l'acide vinyl-carboxylique de formule (II) influence la
structure du réseau
des chaînes polymères constituantes du matériau fabriqué.
En effet, le réseau de polymère obtenu est plus dense. Il en résulte que le
phénomène
d'écrasement des mailles (ou collapsage) lors du séchage des films préparé
avec ce
composé peut être évité, se traduisant par un maintien de la dimension de
maille (sans
rétractibilité) lors du séchage à l'air ou par le froid et sous vide
(lyophilisation) et une
augmentation notable des propriétés suivantes :
- l'absorption de liquide avec une expansion tridimensionnelle du produit
(surface et épaisseur);
- l'élasticité du polymère (force de traction augmentée);
- l'adhérence sur le tissu à traiter;
- la malléabilité;
- la maniabilité; et
- la viscosité en solution.
Parmi d'autres applications possibles pour le polymère selon l'invention, on
note les
produits préparés pour un usage en médecine comme les tissus ou les
organes artificiels de remplacement tels que la peau (traitement des
brûlures), les os
(prothèses et implants), les ligaments ou les tendons (implants).
Les pansements hémostatiques selon l'invention permettent une guérison plus
rapide
des plaies et ainsi permet de diminuer les cicatrices résiduelles.
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Les biomatériaux selon l'invention peuvent être utilisés en esthétique et
cosmétologie,
pour lutter contre le vieillissement de la peau (rides), les cicatrices
résiduelles
accidentelles, de l'acné ou de brûlure.
On comprendra que les biomatériaux selon l'invention, et particulièrement ceux
sous
forme de poudre, peuvent être encapsulés sous forme de micro-billes, micro-
capsules
ou d'implants pour un relargage contrôlé in vivo.
5. Exemples
Les exemples détaillés ci-dessous décrivent différentes synthèses de composés
acides
vinyl-carboxylique et leurs utilisations dans des procédés de préparation de
nouveaux
biomatériaux à base de collagène ou le chitosane.
5.1. Préparation du HOOC-CH2-NH-CO-CH=CH-COOH
75g (1 mole) de glycine (HOOC-CH2-NH2) sont dissous dans 0,3L d'eau
déminéralisée.
147g (1,5 mole) d'anhydride maléique en poudre sont additionnés sous forte
agitation et
en seule fois, dans la solution de glycine. Des précipités blancs et très fins
apparaissent
dans le milieu réactionnel dès la dissolution de l'anhydride. L'agitation est
maintenue
encore environ 30 minutes et le produit couplé obtenu est filtré sous vide,
lavé
abondamment avec de l'eau déminéralisée refroidie à 2-4 C, jusqu'à ce que
l'eau de
lavage soit légèrement acide (pH = 4 à 5). Le pH est contrôlé avec du papier
pH. Le
produit obtenu après lavage est séché à l'air et à la température ambiante.
147 g de produit sec sont obtenus, ce qui équivaut à un rendement d'environ
85%.
Les spectres de résonance magnétique nucléaire du proton (RMN-'H) ont été
réalisés
sur un Brucker AMX-400 opérant à 400 MHz.
RMN-'H (400 Mhz, DMSO) : â= 3,90 ppm (d, 1 H); â= 6,30 ppm (d, 1 H); 8= 6,41
ppm
(d, 1 H); ô= 9,18 ppm (m, 1 H).
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5.2. Préparation de l'acide vinyl-carboxylique de formule
HOOC-CH2-CH2-NH-CO-CH=CH-COOH
89,09 g(1 mole) de P-alanine (HOOC-CH2-CH2-NH2) sont dissous dans 0,3 L d'eau
déminéralisée. 147 g (1,5 mole) d'anhydride maléique en poudre sont
additionnés sous
forte agitation et en seule fois, dans la solution. Des précipités blancs et
très fins
apparaissent dès la dissolution dans le milieu réactionnel de l'anhydride.
L'agitation est
maintenue encore environ 30 minutes et le produit obtenu est filtré sous vide,
lavé
abondamment avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que l'eau de lavage soit
légèrement acide (pH -= 4 à 5 environ). Le pH est contrôlé avec du papier pH.
Le produit
couplé après lavage est séché à l'air et à température ambiante.
140 g de produit sec sont obtenus avec un rendement d'environ 75%.
5.3 Préparation de l'aide vinyi-carboxylique de formule
HOOC-(CH2)5-NH-CO-CH=CH-COOH
131g (1 mole) d'acide 6-aminohexanoïque (C6H1302N) sont dissous dans 0.5L
d'eau
déminéralisée. 147g (1,5 mole) d'anhydride maléique en poudre sont additionnés
sous
forte agitation et en seule fois, dans la solution d'acide 6-aminohexanoïque.
Des
précipités blancs et très fins apparaissent dès la dissolution de l'anhydride
dans le
milieu réactionnel. L'agitation est maintenue encore environ 30 minutes et le
produit
obtenu est filtré sous vide, lavé abondamment avec de l'eau déminéralisée
jusqu'à ce
que l'eau de lavage soit légèrement acide (pH - 4-5 environ). Le pH est
contrôlé avec
du papier pH. Le produit couplé après lavage est séché à l'air et à
température
ambiante.
164 g de produit sec (C,oHI505N) sont obtenus avec un rendement d'environ
71,6%.
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RMN-'H(400 Mhz, DMSO) : S= 1,30 ppm (m, 2H); â= 1,48 ppm (m, 4H); â= 2,2 ppm
(t, 2H); 8= 3,15 ppm (m, 2H); â= 6,26 ppm (d, 1 H); 8= 6,40 ppm (d, 1 H); S=
9,10 ppm
(s, 1 H).
5.4 Préparation du collagène atélopeptide
Les pattes des poulets âgés de 8 semaines sont récupérées 2 heures après
l'abattage.
Ces pattes sont brossées, lavées et rincées à l'eau déminéralisée, ensuite
désinfectées
en trempant dans une solution d'éthanol à 70% pendant environ une (1) heure.
Les
pattes sont fendues longitudinalement au niveau des métatarses et des doigts
avant de
les tremper dans une solution stérile du chlorure de sodium 2 M(mol/L),
pendant 2
serriaines à une température comprise entre 2 et 8 C. La solution de NaCI 2 M
est
changée 2 fois par semaine. Les écailles entourant les pattes sont retirées et
les
tendons, les ligaments et la peau sont enlevés des os et puis coupés en petits
morceaux qui sont ensuite mis sous agitation dans une solution de
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris) 1%(p/v) - Citrate de sodium 2,40%
(p/v), pH =
7,30-7,50 pendant 24 heures et à 2-8 C pour éliminer les débris membranaires
et le
sang. Les matériaux sont récupérés par une simple filtration et lavés avec de
l'eau
stérile.
75 g de tendons, de ligaments et de peaux sont mis en contact sous agitation
dans 1 L
d'acide acétique (0,5 M ou 3% (v/v)) pendant 2 heures à température ambiante,
puis
sont: broyés en utilisant un mixeur domestique. Le broyage dure au total 1
minute (4 x
15 secondes) ou jusqu'à l'obtention d'une consistance pâteuse. La solution de
collagène est additionnée d'un deuxième volume (1 L) d'acide acétique (0,5 M
ou 3%) et
l'agitation continue encore pendant 4 heures à température ambiante. 2,25g de
pepsine
d'origine porcine mucosa (Sigma) soit 3% en poids par rapport aux morceaux de
poulet
(selon le brevet US 6,448,378) sont dissous dans 10 ml d'acide acétique 0,5 M.
Cette
solution est ajoutée dans la solution de morceaux de poulet. L'agitation
continue
pendant 64 heures à température ambiante. La solution est ensuite centrifugée
à une
vitesse de 4200 rpm pendant 1 heure à 2-4 C. Le surnageant contenant du
collagène
est récupéré et refroidi à 0-2 C. Le pH de la solution du collagène est ajusté
à pH = 9,0
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0,10 avec une solution refroidie à environ 0-2 C de NaOH 10N et 1 N lorsque le
pH de
la solution atteint 8,0; pour dénaturer la pepsine. La température est
constamment
maintenue à environ 0-2 C durant l'ajustement du pH. (Brevet US 5,874,537). On
laisse
reposer la solution à environ 0-2 C pendant 16 heures et elle est centrifugée
par la suite
à 4200 rpm (Beckman J6-MC) pendant 1 heure et à 2-4 C. Deux parties sont
séparées,
la partie claire et très visqueuse contenant le collagène atélopeptide est
transférée dans
un bécher et gardée à 0-2 C, la remontée de la température au delà de 6 C
entraîne la
formation des gels de collagène. Le résidu contenant de la pepsine et les
télopeptides
est éliminé. La solution de collagène ainsi obtenue peut être directement
soumise à un
couplage avec de l'acide vinyl-carboxylique choisi.
Une équivalence de 2,5 M de NaCI (ou 1 M d'acétate de sodium) solide est
ajoutée
sous agitation dans la solution de collagène refroidie à environ 0-2 C. Le
collagène est
précipité instantanément, l'agitation est poursuivie encore pendant 2 à 4
heures et
laissée reposée pour toute une nuit à température ambiante. Le collagène est
récupéré
par centrifugation à 4200 rpm pendant 1 heure et est remis en solution à
environ 0-2 C
dans une solution d'acide acétique à 3%. Le collagène est repurifié par une
deuxième
précipitation en ajoutant 1 M NaCI (ou 1 M d'acétate de sodium) solide dans la
solution
sous agitation. Le collagène précipité est récupéré par centrifugation à 4200
rpm
pendant 1 heure et à 0-2 C. Le précipité est ensuite lavé avec une solution de
Tris(hydroxymethyl)aminométhane 1%(p/v) à pH = 7-7,50. La solution de lavage
est
éliminée par centrifugation à 4200 rpm pendant 1 heure et à 0-2 C et le
précipité est
déshydraté par de l'éthanol pur et séché à 20-25 C.
La masse de collagène obtenue est de 9,40 g.
5.5 Préparation du collagène couplé
5.5.1 Couplage direct du collagène atélopeptïde
Deux. (2) litres de solution de collagène atélopeptide préparée tel que
précédemment
(avant la lyophilisation) sont refroidis à 0-2 C, pH=9,0 ( 0,10). 10g d'acide
vinyl-
carboxylique de formule chimique HOOC-CH2-NH-CO-CH=CH-COOH tels que préparés
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précédemment sont additionnés dans la solution de collagène, sous agitation
pendant
au moins 1 heure. La solution est chauffée à 37 C pendant au moins 30 minutes
ou
jusqu'à la dissolution totale de l'acide. On laisse la température descendre à
20 C avec
agitation pour un temps additionnel de 2 à 4 heures. Le collagène couplé est
précipité
en ajoutant dans la solution et sous agitation une équivalence de 2,5 M NaCI
ou 1 M
d'acétate de sodium solide dans la solution. Un précipité fin apparaît.
L'agitation est
maintenue encore pendant 1 heure et le précipité est laissé au repos à
température
ambiante pour toute une nuit. Le collagène couplé est récupéré par
centrifugation à
4200 rpm pendant 1 heure et à 0-2 C. Le précipité est ensuite dissous à
nouveau dans
un volume égal avant la première précipitation avec une solution d'acide
acétique à 1%
(v/v). Une deuxième précipitation du collagène couplé a été faite en ajoutant
dans la
solution et sous agitation une équivalence de 0,8 M de NaCI ou 1 M d'acétate
de
sodium solide. Le collagène couplé est purifié à nouveau et est de nouveau
récupéré
par centrifugation à 4200 rpm pendant 1 heure et à environ 0-2 C. Le collagène
couplé
est ensuite lavé avec une solution de Tris(hydroxymethyl)aminométhane 1%(p/v),
pH =
7,0-7,5. La solution de lavage est éliminée par centrifugation à 4200 rpm
pendant 1
heure et à 0-2 C et le précipité est déshydraté par de l'éthanol pur et séché
à 20-25 C.
La masse de collagène modifié obtenue est de 8,20 g.
5.5.2 Couplage du collagène atélopeptide purifié
10g du collagène atélopeptide déshydraté obtenu selon le procédé décrit ci-
dessus sont
finement moulus et dissous dans 500 ml d'acide acétique 1 % (v/v). La
concentration
finale du collagène est de 2% (p/v).
2,5 g d'acide vinyl-carboxylique insaturé de formule HOOC-CH2-NH-CO-CH=CH-COOH
sont ajoutés dans la solution de collagène sous agitation pendant 1 heure et à
température ambiante. La solution de collagène devient plus visqueuse. La
solution est
portée à 37 C pendant au moins 30 minutes ou jusqu'à la dissolution complète
de
l'agent de couplage. Le collagène couplé est précipité en ajoutant dans la
solution une
équivalence d'l M NaCI ou 1 M d'acétate de sodium solide. L'agitation est
maintenue
pour au moins 1 heure ou toute la nuit à la température ambiante. Le précipité
est
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récupéré par centrifugation à 4200 rpm, pendant 1 heure et à 0-2 C. (Beckman
J6-MC).
Le précipité est ensuite redissous dans un volume égal avant la première
précipitation
avec une solution d'acide acétique à 1 % (v/v). Une deuxième précipitation du
collagène
couplé a été faite en ajoutant dans la solution sous agitation une équivalence
de 0,8 M
de NaCI ou 1 M d'acétate de sodium solide. Le collagène couplé et purifié à
nouveau et
est récupéré par centrifugation à 4200 rpm pendant 1 heure et à 0-2 C. Le
collagène
couplé est ensuite lavé avec une solution de Tris(hydroxyméthyl)aminométhane
1%
(p/v), pH = 7,0-7,5. La solution de lavage est éliminée par centrifugation à
4200 rpm
pendant 1 heure et à 0-2 C et le précipité est déshydraté par de l'éthanol pur
et séché à
20-25 C.
La masse de collagène modifié obtenue est de 7,02 g.
5.6 Préparation du chitosane couplé
Le deuxième composé utilisé dans cette invention est le chitosane commercial
provenant des carapaces de crabe désacétylées à 85% (Sigma C3646).
10 g de chitosane (1 %) sont dissous dans 1 L d'une solution d'acide acétique
à 0,5 M ou
3%. Le pH de la solution est 3,40. La solution est filtrée pour éliminer les
débris et les
impuretés. 10g d'acide environ vinyl-carboxylique de formule :
HOOC-CH2-NH-CO-CH=CH-COOH
sont ajoutés dans la solution de chitosane sous agitation et à température
ambiante, le
pH du mélange d'environ 3,50. Le mélange est chauffé à 55-60 C pendant au
moins 1
heure ou jusqu'à la dissolution totale de l'agent de couplage. La température
est
abaissée à 20 C sous agitation, et ensuite le chitosane couplé est précipité
en ajoutant
dans la solution sous agitation pendant au moins 1 heure 1 M NaCI ou 1 M
d'acétate de
sodium solide. Le mélange est centrifugé à 4200 rpm pendant 1 heure à 0-2 C
(Beckman J6-MC) pour récupérer le chitosane couplé. Le précipité est lavé deux
fois
avec de l'eau pure et finalement le chitosane couplé est récupéré par
centrifugation à
4200 rpm pendant 1 heure à environ 0-2 C. Le chitosane est déshydraté avec de
l'éthanol et séché à la température ambiante. La masse de chitosane obtenue
est de
9,55g.
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5.7 Préparation de biomatériaux et de pansements hémostatiques.
5.7.1 Préparation d'un biomatériau à base de collagène ou de chitosane
modifié
1 g de collagène couplé ou de chitosane couplé obtenu selon les exemples ci-
dessus est
dissous dans 100 mL d'une solution d'acide acétique à 1%(v/v). 1 mL d'une
solution à
10% (v/v) de polyoxyéthylène sorbitan monooléate (TweenTM 80) est ajouté. Les
bulles
formées dues à la viscosité de la solution sont éliminées par ultrason ou le
vide.
La solution ainsi préparée est un biomatériau qui peut être utilisé soit
directement dans
le domaine médical, biomédical, pharmaceutique ou cosmétique, soit pour la
fabrication
de pansements.
Des ingrédients pharmaceutiques acceptables tels que des antibiotiques, des
bactéricides, ou des anticancéreux peuvent être incorporés dans ce biomatériau
sous
forme liquide avant de réaliser un pansement.
Tel que déjà mentionné, le pansement peut être préparé sous différente formes
telles
qu'une éponge, un film, une poudre, un gel ou une crème. La forme sera choisie
selon
l'usage voulu pour ce pansement.
5.7.2 Préparation des éponges hémostatiques
La solution préparée ci-dessus est versée dans des moules antiadhésifs. Le
volume de
la solution est déterminé selon la dimension du moule et l'épaisseur du
pansement. Les
moules sont placés sur les tablettes d'un lyophilisateur à 20 C (FTS system)
programmé
pour faire descendre la température des tablettes à 0 C, à raison de 1 C par
minute. La
température est maintenue à 0 C pendant'1 heure, ensuite la température
continue à
descendre à-20 C et maintenue pendant 1 heure. Après ce temps, la température
descend à-40 C et maintenue pendant 1 heure pour que la formation de la glace
soit
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bien homogène sans formation des cristaux en surface. Un vide de 200 mtorr est
alors
fait après ce temps et en même temps la température des tablettes remonte à 20
C à
raison de 0,02 C par minute. Le vide est baissé à 20 mtorr et la température
continue à
remonter à 30 C et maintenue encore 2 heures avant la fin du cycle de
lyophilisation.
Les éponges ou les pansements lyophilisés sont sortis de leur moule et
conditionnés
individuellement dans des sachets d'aluminium. Ces sachets sont stérilisés au
rayon
ganima.
5.7.3 Préparation des films transparents
La solution préparée ci-dessus est versée dans des moules en polycrystal, en
polycarbonate ou en polystyrène. Le volume de la solution est déterminé selon
la
dimension du moule et l'épaisseur des films. Les moules sont ensuite placés
sous la
hotte à flux laminaire. Le séchage dure environ de 48 à 60 heures à
température
ambiante. Les films sont décollés de leur moule et conditionnés
individuellement dans
des sachets d'aluminium. Ces sachets sont stérilisés au rayon gamma.
5.7.4 Préparation des poudres hémostatiques
Le collagène couplé ou le chitosane couplé obtenu selon le procédé décrit est
moulu
poui- obtenir une poudre très fine. Cette poudre est conditionnée dans des
flacons en
polypropylène fermés par un bouchon. Ces flacons sont stérilisés au rayon
gamma.
Les ingrédients pharmaceutiques acceptables tels que des antibiotiques, des
bactéricides ou des anticancéreux peuvent être incorporés dans la poudre.
5.8 Essais de l'effet hémostatique des éponges à base de collagène modifié et
de chitosane modifié
Les essais de l'effet hémostatique des pansements obtenus sous forme d'éponge
ont
été effectués sur les lapins au niveau du foie. Les pansements testés sont
préparés
avec du collagène modifié et du chitosane modifié selon le procédé décrit ci-
dessus.
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Chaque pansement a une surface d'environ 5 cm par 3 cm et une épaisseur
d'environ
0,4 cm. Le témoin utilisé est une compresse pliée en 4 épaisseurs pour obtenir
une
épaisseur équivalente à celle des éponges hémostatiques.
Les lapins sont anesthésiés et incisés longitudinalement à l'abdomen, le foie
exposé est
coupé à l'extrémité du lobe d'un morceau d'environ 2cm x 0,5cm. Les éponges
sont
appliquées directement sur les plaies en tenant à la main sans appliquer une
forte
pression. Une pression manuelle plus forte est appliquée avec la compresse.
L'hémostase est observée toutes les 30 secondes (s) jusqu'à l'arrêt complet du
saignement.
Le tableau 2 ci-dessous résume le temps d'arrêt du saignement.
Collagène couplé Chitosane couplé Compresse
Lapin 1 2 3
Temps d'arrêt 90 s 110 s 250s
Tableau 2
Les éponges hémostatiques ont également été appliquées sur des coupures
accidentelles au niveau de l'épiderme humain. L'application de l'éponge a
entraîné un
arrêt rapide (mais non quantifié) du saignement et une cicatrisation accélérée
de la plaie
avec absence de cicatrice résiduelle.
Bien que des modes de réalisation préférés de l'invention aient été décrits en
détail ci
hautõ l'invention n'est pas limitée à ces seuls modes de réalisation et
plusieurs
changements et modifications peuvent y être effectués par une personne du
métier
sans sortir du cadre ni de l'esprit de l'invention.
