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Nouveaux composés interagissant avec PEA- 15
La présente invention a pour objet des composés susceptibles d'interagir avec
la protéine PEA-15 (Phosphoprotéine Enrichie dans les Astrocytes, d'un poids
moléculaire
de 15 kDa), leurs dérivés fluorescents, ainsi que la mise en oeuvre de ces
composés dans
des procédés de criblage et de diagnostic, et des compositions
pharmaceutiques.
PEA-15 est une petite protéine cytoplasmique de 130 acides aminés
abondamment exprimée dans le cerveau, en particulier dans les astrocytes, et,
plus
faiblement, de manière ubiquitaire dans de nombreux autres tissus.
La structure de cette protéine, très conservée parmi les vertébrés, comprend à
l'extrémité N-terminale un domaine effecteur de mort (Death Effector Domain,
DED) de
80 acides aminés, et un domaine NES (Nuclear Export Signal), et une extrémité
C-
terminale de structure peu organisée contenant des sites de phosphorylation
par la protéine
kinase C (PKC), et par la protéine kinase calcium/calmoduline-dépendante de
type II.
La séquence génomique de PEA-15 est composée de quatre exons et s'étend
sur environ 10,2 kb d'ADN génomique (Wolford et al., 2000, Gene, 241:143).
PEA-15 est présente in vivo sous différentes formes : non phosphorylée, mono-
et bi-phosphorylée, présentant chacune une activité biologique différente.
PEA-15 est une protéine multifonctionnelle susceptible d'interagir avec de
nombreux partenaires au moyen de ses différents domaines fonctionnels, et
selon son degré
de phosphorylation (Renault et al., Biochem. Pharmacol, 2003, 66:1581). A ce
jour, sept
partenaires de PEA-15 ont été identifiés, intervenant dans les multiples
fonctions remplies
par cette protéine, à savoir FADD, caspase 8, Omi/HtraA2, ERK1/2, Akt, Rsk2,
et la
phospholipase Dl. Par ces multiples interactions, PEA-15 paraît jouer un rôle
central dans
de nombreux processus cellulaires physiologiques et/ou pathologiques.
Il a été montré que cette protéine possède, notamment, les propriétés
d'inhiber
l'apoptose, d'inhiber l'entrée des cellules dans le cycle cellulaire, d'être
impliquée dans le
rétablissement de la signalisation des intégrines inhibée par l'expression de
l'oncogène H-
Ras, d'inhiber la prolifération cellulaire, et d'être impliquée dans le
transport du glucose et
la sécrétion d'insuline (Renault et al., Biochem. Pharmacol., 2003, 66 :1581).
Par exemple, il a été observé que la suppression de l'expression de PEA-15
dans les astrocytes se traduit par une augmentation de la sensibilité de ces
derniers à
l'apoptose induite par le TNF alpha (Kitsberg et al., J. Neurosci., 1999,
19:8244) et que la
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réduction de l'expression de cette protéine entraîne une augmentation de la
prolifération de
différentes lignées cellulaires telles que les astrocytes, les lymphocytes et
les hépatocytes
(Formstecher et al., Dev. Cell., 2001, 1:239). Il a également été observé que
l'expression
de la protéine inhibe également la migration cellulaire.
Par ailleurs, cette protéine pourrait également être impliquée dans la genèse
et/ou le développement des tumeurs primitives cérébrales, ainsi que dans les
processus
métastatiques.
Par exemple, une augmentation de l'expression de PEA-15 a été observée dans
différentes tumeurs telles que les gliomes, le cancer de l'ovaire, le cancer
du rein, le cancer
du sein, dans les carcinomes hépatocellulaires, les lymphomes ou les mélanomes
(Hwang
et al., Genomics, 1997, 42 :540 ; Bera et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1994, 91 :9789).
De même, la surexpression de cette protéine dans des souris transgéniques
augmente leur sensibilité aux cancers de la peau induits chimiquement
(Formisano et al.,
Oncogene, 2005, 24:7012).
Par contre, l'expression de PEA-15 dans un tissu induit une inhibition de la
permissivité de ce dernier vis-à-vis de l'invasion par des cellules tumorales.
Il a également été montré que des cellules du cancer du sein pouvaient être
sensibilisées à la chimiothérapie par diminution de l'expression de PEA-15
(Stassi et al.,
Cancer Res., 2005, 65:6668).
WO 2004/108961 propose l'utilisation de PEA-15 à titre de marqueur et de
cible thérapeutique pour les papillomes.
En outre, une surexpression de PEA-15 a été observée dans les fibroblastes,
les
muscles striés et le tissu adipeux de patients affectés par le diabète de type
II (Condorelli et
al., EMBO. J., 1997, 17 :3858), et il a été montré que la suppression de
l'expression de
cette protéine permettait de restaurer la sécrétion d'insuline en réponse au
glucose.
Une surexpression de cette protéine est également observée dans certains
processus inflammatoire.
EP 1 189 060 propose l'utilisation de PEA-15 à titre de marqueur et de cible
thérapeutique dans les maladies neurodégénératrices.
Par conséquent, il apparaît que PEA-15 pourrait servir de cible thérapeutique
dans de nombreux états pathologiques. Or, à ce jour, on ne dispose pas de
composés
aisément accessibles susceptibles de moduler l'activité de cette protéine.
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Par ailleurs, on ne dispose pas non plus d'outils susceptibles de permettre de
cribler aisément de tels composés.
Par conséquent, il existe un besoin d'accéder facilement à des composés
susceptibles d'interagir avec PEA- 15 et de moduler son activité.
Il existe également un besoin de disposer d'outils de criblage de composés
susceptibles de moduler l'activité biologique de PEA-15.
Il existe également un besoin de disposer de nouveaux composés pour le
traitement d'état pathologique tel que le cancer et le diabète de type II.
Il existe également un besoin de disposer d'outils pour le diagnostic et/ou le
pronostic d'états pathologiques impliquant PEA-15, et notamment une altération
de son
expression voire de son activité biologique, tels que le diabète de type II,
le cancer,
notamment les gliomes, les carcinomes, ou des états pathologiques impliquant
un excès ou
un défaut d'apoptose ou de prolifération cellulaire, par exemple.
La présente invention a pour but de donner satisfaction en ces termes.
De manière inattendue, les inventeurs ont observé que des composés de
formule générale (I) suivante :
R3
O
R4 O NH
N N N~N A
RI N 5-N p H r
H
O
R2 O (I)
n
dans laquelle n, p, r, Rl, R2, R3, R4 et A sont tels que définis par la suite,
sont susceptibles
d'interagir avec PEA- 15 et d'en moduler l'activité.
Ainsi, les inventeurs ont observé qu'un composé conforme à l'invention,
comme par exemple le composé fluorescent 6D6-1, détaillé par la suite, est
capable
d'interagir de manière spécifique avec une protéine de PEA-15 et de moduler
son activité
biologique.
Par ailleurs, les inventeurs ont également observé qu'il était possible
d'utiliser
un composé de l'invention notamment fluorescent en combinaison avec une
protéine de
fusion fluorescente GFP-PEA-15 (Green Fluorescent Protein) pour développer des
procédés mettant en oeuvre un transfert d'énergie par résonance de
fluorescence (FRET)
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permettant, par exemple, le criblage d'agents susceptibles d'interagir avec
PEA-15 ainsi
que le diagnostic et/ou le pronostic d'états pathologiques impliquant PEA-15.
Il est également possible d'utiliser un tel composé notamment fluorescent en
combinaison avec une protéine de fusion GST-PEA 15 pour mettre en oeuvre un
procédé
de criblage par compétition permettant d'identifier des agents suceptibles
d'interagir avec
PEA15.
Ainsi, selon un de ses premiers aspects, la présente invention se rapporte à
un
composé de formule (I) suivante :
R3
O
R4 O NH
N N NN A
RI N N p H r
H
O
Rz
dans laquelle :
- n peut être égal à 0 ou 1,
- p peut représenter un nombre entier variant de 1 à 6, et en particulier
variant de 2 à 4,
- r peut représenter un nombre entier variant de 1 à 12, et en particulier
variant de 2 à 6, et en particulier est égal à 4,
- Rl peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Cl à C20,
saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à Clo,
saturé ou
insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou
plusieurs atomes
d'halogène, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en Ci à C6, ou un ou plusieurs
radical(aux)
alkyle en Ci à Clo,
- R2 peut représenter une chaîne latérale d'acide aminé ou d'un dérivé d'acide
aminé,
- -COR3 peut représenter un radical acyle porteur d'une entité basique R3
notamment choisie parmi les radicaux de formules suivantes :
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~IR7 R7 R7
N ~ N R7
CH3
R7
7 y--- N+
NN IN~ NH2
N C , /
N N
R6 "
R7 C1
- dans lesquelles * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, Y
peut représenter N ou N+R7, et R6 et R7 peuvent représenter, indépendamment
l'un de
5 l'autre, un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Cl à C20, saturé ou
insaturé, linéaire ou
ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à Clo, saturé ou insaturé, un radical
aryle en C6 à Clo,
optionnellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, un ou
plusieurs
radical(aux) alkoxy en Ci à C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en Cl à
Clo,
- R4 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Cl à Clo,
saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à Clo,
saturé ou
insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou
plusieurs atomes
d'halogène, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en Ci à C6, ou un ou plusieurs
radical(aux)
alkyle en Ci à Clo,
- A peut représenter un radical dérivé d'un reste xanthène, notamment un
reste phényl-9 xanthène, d'un reste acridine, notamment un reste phényl-9
acridine, ou d'un
reste 4-bora-3a,4a-diaza indacène,
- et ses dérivés.
Au sens de l'invention, on entend désigner par reste au regard d'une
molécule donnée, la molécule sous la forme d'un radical.
Avantageusement, A peut représenter un marqueur fluorescent.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte à un procédé
de
criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA-15, ou un de
ses
analogues, comprenant au moins les étapes consistant à:
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(a) mettre en présence, au moins une protéine PEA-15 portant un marqueur
fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un composé notamment
fluorescent
conforme à l'invention, dans des conditions propices à une interaction avec
ladite protéine,
(b) A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie
de fluorescence, convenant à la mise en oeuvre d'un transfert d'énergie par
résonance de
fluorescence,
(c) mesurer un premier signal S1, caractéristique de l'ensemble obtenu à
l'étape
a) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur
d'énergie de
fluorescence,
(d) mettre l'ensemble obtenu à l'étape a) en présence d'un milieu présumé
contenir au moins un agent à cribler dans des conditions propices à une
interaction avec
ladite protéine,
(e) mesurer un second signal S2, de même nature que Si, caractéristique de
l'ensemble obtenu à l'étape c) par irradiation à une longueur d'onde
permettant d'exciter le
donneur d'énergie de fluorescence,
(f) comparer les premier et second signaux Si et S2 afm d'en tirer une
conclusion relative à une éventuelle interaction de ladite protéine PEA-15
avec l'agent à
cribler.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par analogue de
protéine
PEA-15 un composé de type peptidique, présentant une homologie de séquences
avec
PEA-15 et une activité biologique similaire, ainsi que des variants
susceptibles de résulter
de l'épissage alternatif de l'ARNm codant pour cette protéine, comme par
exemple celui
décrit par Underhill et al. (Mamm. Genome, 2001, 12:172), ainsi que des
fragments de
cette protéine ou de ces composés de type peptidique présentant la capacité de
lier un
composé de formule conforme à l'invention. Par activité biologique , on
entend
désigner les propriétés biologiques de la protéine PEA-15, notamment telles
qu'indiquées
précédemment.
Par homologie de séquences , on entend désigner une identité de séquence
d'au moins 85 %, en particulier d'au moins 90 % et plus particulièrement d'au
moins 95 %
de l'analogue avec la protéine PEA- 15, et en particulier les séquences
caractéristiques de
PEA-15 (Renault et al., Biochem. Pharmacol. 2003, 66 :1581), à savoir le
domaine DED,
et notamment la séquence conservée RxDLF, le domaine NES (Nuclear Export
Signal), les
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séquences peptidiques impliquées dans l'interaction de la protéine PEA-15 avec
ses
différents partenaires protéiques (par exemple ERK1/2, Akt, FADD, caspase 8)
et les
séquences peptidiques comprenant les sites de phosphorylation par la protéine
kinase C
(PKC) ou la protéine kinase calcium/camoduline-dépendante de type II, à savoir
respectivement les motifs LTRIPSAKK (S104) et DIRQPSEEIIK (S116) (S : sérine
phosphorylée).
La nature des modifications susceptibles d'être introduites dans une protéine
pour obtenir des analogues tels que définis ci-dessus et les procédés pour les
mettre en
oeuvre relèvent des connaissances et de la pratique de routine de l'homme de
l'art.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention a pour objet un procédé
de
criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA-15, ou un de
ses
analogues, comprenant au moins les étapes consistant à:
(a) mettre en présence au moins une protéine PEA-15 liée à un support avec
un composé conforme à l'invention, dans des conditions propices à une
interaction avec
ladite protéine,
(b) mesurer un premier signal Si caractéristique de l'ensemble obtenu à
l'étape
a),
(c) mettre en présence l'ensemble obtenu à l'étape a) avec un agent à cribler
dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine,
(d) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de
l'ensemble obtenu à l'étape c),
(e) comparer S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle
interaction de ladite protéine PEA- 15 avec l'agent à cribler.
Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte à un
procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un état pathologique susceptible
d'impliquer
PEA-15 par détection et, éventuellement, par quantification de PEA-15 dans un
échantillon
biologique prélevé chez un individu comprenant au moins les étapes consistant
à:
(a) mettre en présence au moins une protéine PEA-15 portant un marqueur
fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un composé, notamment
fluorescent,
conforme à l'invention dans des conditions propices à une interaction avec
ladite protéine,
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(b) A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie
de fluorescence, convenant à la mise en oeuvre d'un transfert d'énergie par
résonance de
fluorescence,
(c) mesurer un premier signal S1 caractéristique de l'ensemble obtenu à
l'étape
a) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur
d'énergie de
fluorescence,
(d) mettre l'ensemble obtenu à l'étape a) en présence d'un échantillon
biologique présumé comprendre au moins une protéine PEA-15 dans des conditions
propices à l'interaction de ladite protéine PEA-15 de l'échantillon biologique
avec ledit
composé selon l'invention,
(e) mesurer un second signal S2, de même nature que Si, caractéristique de
l'ensemble obtenu à l'étape c) par irradiation à une longueur d'onde
permettant d'exciter le
donneur d'énergie de fluorescence,
(f) comparer S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle
présence de la protéine PEA-15 dans ledit échantillon biologique, et
éventuellement une
conclusion relative à la quantité de ladite protéine.
Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte
également à un complexe isolé comprenant au moins une protéine PEA-15 et au
moins un
composé de formule conforme à l'invention.
Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention concerne également
une trousse pour criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine
PEA-15, ou
l'un de ses analogues, comprenant :
- au moins une protéine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D ou un
marqueur de purification, et
- au moins un composé conforme à l'invention,
le cas échéant, A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-
donneur d'énergie
de fluorescence, convenant à la mise en oeuvre d'un transfert d'énergie par
résonance de
fluorescence.
COMPOSES
Les composés de l'invention sont de formule générale (I) suivante :
(I)
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R3
O
R4 O NH
N N N~N A
RI N N p H r
H
RZ 0 n
dans laquelle :
- n peut être égal à 0 ou 1,
- p peut représenter un nombre entier variant de 1 à 6, et en particulier
variant de 2 à 4,
- r peut représenter un nombre entier variant de 1 à 12, et en particulier
variant de 2 à 6, et en particulier égal à 4,
- Rl peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Cl à C20,
saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à Clo,
saturé ou
insaturé, un radical aryle en C6 à Clo substitué par un ou plusieurs atome(s)
d'halogène, un
ou plusieurs radical(aux) alkoxy en Cl à C6, ou un ou plusieurs radical(aux)
alkyle en Ci à
Cio,
- R2 peut représenter une chaîne latérale d'acide aminé ou d'un dérivé d'acide
aminé,
- -COR3 peut représenter un radical acyle porteur d'une entité basique R3
notamment choisie parmi les radicaux de formules suivantes :
~ I I C I ,
J ~ I ~ I
N
.~R7 R7 f _R7
N ~ N R7
0 CH3 (J
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R7
7
S. D~.
N N~
I N+
R6
~ ~I
N +
N N+
R6 \ ci
R7
- dans lesquelles * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, Y
peut représenter N ou N+- R7, et R6 et R7 peuvent représenter, indépendamment
l'un de
5 l'autre, un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Cl à C20, saturé ou
insaturé, linéaire ou
ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à Clo, saturé ou insaturé, un radical
aryle en C6 à C10,
optionnellement substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène, un ou
plusieurs
radical(aux) alkoxy en Ci à C6, ou un ou plusieurs radical(aux) alkyle en Cl à
Clo,
- R4 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Cl à Clo,
10 saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à
Clo, saturé ou
insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou
plusieurs atomes
d'halogène, un ou plusieurs radical(aux) alkoxy en Ci à C6, ou un ou plusieurs
radical(aux)
alkyle en Ci à Clo,
- A peut représenter un radical dérivé d'un reste xanthène, notamment d'un
reste phényl-9 xanthène, d'un reste acridine, notamment d'un reste phényl-9
acridine, ou
d'un reste 4-bora-3a,4a-diaza indacène,
- et ses dérivés.
Selon un mode de réalisation, A peut représenter un marqueur fluorescent.
Au sens de l'invention, on entend désigner par reste au regard d'une
molécule donnée, la molécule sous la forme d'un radical.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par dérivé , des
formes
tautomères, des formes stéréoisomères, des formes polymorphes, des sels
pharmaceutiquement acceptables et des solvates pharmaceutiquement acceptables.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par forme tautomère ,
l'un des isomères dont les structures diffèrent par la position d'un atome, en
général
d'hydrogène, et d'une ou de plusieurs liaisons multiples et qui sont capables
de se
transformer facilement et réversiblement l'un dans l'autre.
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Au sens de la présente invention, on entend désigner par forme
stéréoisomère des isomères de molécules de constitution identique, et qui ne
diffèrent
que par un ou des arrangement(s) différents de leurs atomes dans l'espace.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par sels
pharmaceutiquement acceptables des composés obtenus par réaction d'un
composé de
formule générale (I) avec une base ou un acide.
A titre d'exemple de base convenant à l'invention on peut mentionner
l'hydroxyde de sodium, le méthoxyde de sodium, l'hydrure de sodium, le t-
butoxyde de
potassium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de magnésium, et analogues, et
leurs
mélanges, dans des solvants tels que le THF (tétrahydrofurane), le méthanol,
le t-butanol,
le dioxane, l'isopropanol, l'éthanol, leurs analogues, et leurs mélanges.
Les bases organiques comme la lysine, l'arginine, la diéthanolamine, la
choline, la trométhamine, la guanidine et leurs dérivés peuvent également être
utilisés.
A titre d'exemple de sels d'addition d'acide convenant à l'invention, on peut
citer ceux susceptibles d'être préparés par réaction d'un composé de formule
générale (I)
avec un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide
nitrique, l'acide
sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide p-toluènesulfonique, l'acide
méthanesulfonique,
l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide salycilique,
l'acide
hydroxynapthoïque, l'acide ascorbique, l'acide palmitique, l'acide succinique,
l'acide
benzoïque, l'acide benzènesulfonique, l'acide tartrique, et analogues, et
leurs mélanges,
dans les solvants tels que l'acétate d'éthyle, l'éther, des solvants
alcooliques, l'acétone, le
THF, le dioxane, leurs analogues et leurs mélanges.
On entend désigner par forme polymorphe , des composés obtenus par
cristallisation d'un composé de formule générale (I) dans différentes
conditions, telles que
par exemple l'utilisation de différents solvants, généralement utilisés pour
la cristallisation.
La cristallisation à différentes températures impliquent, par exemple,
différents modes de
refroidissement, par exemple des refroidissements très rapides à très lents
impliquant des
étapes de chauffage ou fusion de composés suivi par un refroidissement graduel
ou rapide.
La présence de formes polymorphes peut être déterminée au moyen d'analyses par
spectroscopie RMN, par spectroscopie IR (infrarouge), par DSC (Differencial
Scaning
Calorimetry), par diffraction de rayons X ou d'autres techniques analogues.
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Au sens de la présente invention, on entend désigner par radical alkyle ,
un
radical hydrocarboné linéaire, ou ramifié, saturé ou insaturé, de 1 à 20
atomes de carbone,
en particulier de 2 à 18 atomes de carbone, en particulier de 3 à 16 atomes de
carbone, en
particulier de 4 à 12 atomes et plus particulièrement de 6 à 10 atomes de
carbone,
susceptible d'être substitué par des radicaux tels que définis ci-après.
A titre d'exemple, sont inclus dans cette défmition des radicaux tels que
méthyle, éthyle, isopropyle, n-butyle, t-butyle, t-butylméthyle, n-propyle,
pentyle, n-
hexyle, 2-éthylbutyle, heptyle, octyle, nonyle, ou décyle.
Au sens de la présente invention, on entend par radical cycloalkyle , un
cycle alkylène, optionnellement ramifié, saturé ou insaturé, de 3 à 10 atomes
de carbone,
en particulier en C4 à C8 et plus particulièrement en C6, tel que le
cyclopropyle, le
cyclopentyle, le cyclohexyle, le cyclohexylméthyle, le cycloheptyle.
Au sens de la présente invention, on entend par radical aryle , un cycle
aromatique comprenant de 1 à 3 noyaux aromatiques, éventuellement fusionnés,
de 6 à 20
atomes de carbone, notamment de 10 à 14 atomes de carbone, comprenant
optionnellement
un plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, et le cas échéant étant
substitués par des
radicaux tels que définis ci-dessus et ci-après.
A titre d'exemple de radicaux aryle convenant à la mise en oeuvre de
l'invention
il est possible de mentionner le radical phényle, le radical benzyle, le
radical phenétyle, le
radical naphtyle, le radical anthryle, et tous les cycles aromatiques
comprenant un plusieurs
hétéroatomes choisis parmi O, N et S, tel que par exemple la pyridine, le
thiophène, le
pyrrole, le furanne, la quinoléine, l'acridine, le xanthène, le 4-bora-3a,4a
diaza indacène.
Au sens de la présente invention, on entend par radical alkoxy , un radical
-
OR dans lequel le reste alkyle est un radical hydrocarboné linéaire, ramifié
ou cyclique,
condensé ou non, saturé ou insaturé de 1 à 20 atomes de carbone, en
particulier de 2 à 18
atomes de carbone, en particulier de 3 à 16 atomes de carbone, en particulier
de 4 à 12
atomes et plus particulièrement de 6 à 10 atomes de carbone.
On peut citer, à titre d'exemple, les groupes méthoxy, éthoxy, propoxy,
butoxy,
n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, n-pentoxy, isopentoxy, sec-pentoxy, t-
pentoxy, hexyloxy,
méthoxyéthoxy, méthoxypropoxy, éthoxyéthoxy, éthoxypropoxy et analogues.
Au sens de la présente invention, on entend par radical acyle , un radical
hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou
insaturé,
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comprenant une fonction C=O et ayant de 1 à 10 atomes de carbone, en
particulier de 2 à 8
atomes de carbone et de préférence de 3 à 6 atomes de carbone et plus
particulièrement de
4 atomes de carbone par exemple, un radical formyle, un radical acétyle, un
radical
succinyle, un radical benzoyle, un radical 1 -naphtoyle ou 2-naphtoyle.
La chaîne hydrocarbonée des radicaux précités peut être, le cas échéant,
interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis, par exemple, parmi O, N
et S, pour
former, par exemple, un radical hétéroalkyle comme un radical alkyléther, un
radical
alkylester ou un hétérocycle.
Au sens de la présente invention, on entend par radical hétérocyclique ,
par
exemple, et de manière non limitative, un radical furanyle, un radical
thiophènyle, un
radical pyrrolyle, un radical oxazolyle, un radical isoxazolyle, un radical
thiazolyle, un
radical isothiazolyle, un radical imidazolyle, un radical pyrazolyle, un
radical furazanyle,
un radical pyranyle, un radical pyridinyle, un radical pyridadinyle, un
radical pyrimidinyle
ou un radical pyradinyle, un radical furannyle, un radical quinoléinyle.
Les radicaux définis ci-dessus peuvent le cas échéant être substitués par un
ou
plusieurs atomes d'halogène.
Au sens de la présente invention, on entend par atome d'halogène , un atome
de F, Cl, Br ou I. Les atomes d'halogène avantageusement mis en oeuvre dans la
présente
invention sont le fluor et le chlore.
En particulier, les radicaux alkylhalogénés peuvent être des radicaux
perfluoroalkyles de formule générale CõF2õ+i dans laquelle n peut varier de 1
à 10, en
particulier de 2 à 8 et plus particulièrement de 3 à 6.
Selon un mode de réalisation, Rl peut représenter notamment un atome
d'hydrogène, un radical alkyle en Cl-C18, un radical alkyle en C2-C16, par
exemple un
radical aryle en C6 à Clo, par exemple optionnellement substitués par un ou
plusieurs
atomes d'halogène.
En particulier, Rl peut représenter notamment un atome d'hydrogène, un
radical méthyle, un radical éthyle, un radical isopropyle, un radical n-
propyle, un radical
benzyle, un radical phénétyle, ou un radical perfluoroalkyle de formule
CõF2õ+i dans
laquelle n peut varier de 1 à 10, en particulier de 2 à 8 et plus
particulièrement de 3 à 6.
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En particulier, Rl peut être un radical méthyle ou un radical benzyle.
Selon un mode de réalisation, R2 peut représenter une chaîne latérale d'un
acide aminé ou dérivé d'acide aminé choisi, par exemple, parmi l'alanine, la
glutamine, la
leucine, la glycine, le tryptophane, la P-alanine, la phénylalanine, la 4-
chloro-
phénylalanine, l'acide isonipécotinique, l'acide 4-aminométhylbenzoïque,
l'acide 3-
tétrahydroisoquinoléinique et l'histidine libre ou benzylée.
L'acide aminé ou dérivé d'acide aminé peut, par exemple, être choisi parmi :
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O
O H
HO HO II N O
II ~
I--~-NH2
/ HO
NH
2
acide 4-amino-méthylbenzoique acide 3-tétrahydroisoquinoléinique glycine
O O
O HO I NH2 HO NH2
HO
H ~ O
HzN
acide isonipécotinique Cl
4-chloro-phénylalanine glutamine
O O
HO II NH2 NH2
HO II O
N HO ~NHz
N
histidine benzylée phénylalanine B-alanine
O O
NH2 HO II NH2
HO
I /
N leucine
tryptophane
O
O
HO NH2 HO NH2
N alanine
N
histidine H
Selon un mode de réalisation, R2 peut être de formule (VI) suivante :
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*
N
N
R5
dans laquelle
- * symbolise une liaison covalente avec le reste d'un composé de formule
générale (I), et
- R5 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Cl à C20,
saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié, un radical cycloalkyle en C3 à Clo,
saturé ou
insaturé, un radical aryle en C6 à C10, optionnellement substitué par un ou
plusieurs
atome(s) d'halogène.
Selon un mode de réalisation, les radicaux alkyle ou cycloalkyle susceptibles
de figurer le radical R5 peuvent être également substitués par les radicaux
tels que définis
précédemment ou voir leurs chaînes hydrocarbonées interrompues par un ou
plusieurs
hétéroatomes tels que défmis précédemment.
En particulier, R5 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical alkyle en
Cl-C18, un radical alkyle en C2-C16, un radical aryle en C6 à Clo,
optionnellement substitués
par un ou plusieurs atome(s) d'halogène.
En particulier, R5 peut représenter un atome d'hydrogène, un radical méthyle,
un radical éthyle, un radical isopropyle, un radical n-propyle, un radical
benzyle, un radical
phénétyle, un radical perfluoroalkyle de formule CõF2õ+i dans laquelle n peut
varier de 1 à
10, en particulier de 2 à 8 et plus particulièrement de 3 à 6.
En particulier, R5 peut être un radical méthyle ou un radical benzyle.
R2 peut notamment être une histidine ou un dérivé d'histidine tel qu'une
histidine benzylée.
Selon un mode de réalisation, -COR3 peut être un radical acyle, notamment un
radical acétyle, substitué par une entité basique R3 telle que définie
précédemment. En
particulier, cette entité basique R3 peut être un radical de formule (VII)
suivante :
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Y~\
N+\R
6
* (VII)
dans laquelle :
- * symbolise une liaison avec le radical acyle,
- Y peut représenter N ou N+R7, et
- R6 et R7 peuvent représenter, indépendamment l'un de l'autre, un atome
d'hydrogène, un radical alkyle en Cl-C18, un radical alkyle en C2-C16, un
radical aryle en
C6 à Clo, optionnellement substitués par un ou plusieurs atome(s) d'halogène.
En particulier, R6 et R7 peuvent représenter, indépendamment l'un de l'autre
un
atome d'hydrogène, un radical méthyle, un radical éthyle, un radical
isopropyle, un radical
n-propyle, un radical benzyle, un radical phénétyle, un radical
perfluoroalkyle de formule
CõF2õ+i dans laquelle n peut varier de 1 à 10, en particulier de 2 à 8 et plus
particulièrement
de 3 à 6.
En particulier, R6 et R7 peuvent être indépendamment l'un de l'autre un
radical
méthyle ou un radical benzyle
Selon un mode de réalisation, le radical A peut représenter un radical de
formule générale (Va)
R8 z \
Ria R>>
R13
1 R1z
dans laquelle :
- * symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de formule (I),
- Z=OouNH,
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- R8 = R9 = N(R')2 avec R' pouvant représenter un radical alkyle en Cl à C6,
en particulier un radical alkyle en C2-C4 ou R8 = OH et R9 = 0,
- R10 = R11= H ou X, avec X= F, C1, Br, en particulier X= F
- ou d'une part R8 et Rlo et/ou d'autre part R9 et Rll peuvent respectivement
former un hétérocycle à 5 ou 6 chaînons condensé avec le reste acridine ou
xanthène, le cas
échéant substitué par un, deux, trois, voire plus de groupements méthyle et
dont
l'hétéroatome est placé en a du reste acridine ou xanthène et est choisi parmi
N ou 0,
- R12 =*-NHS02- ou *-NHCO-, avec * symbolisant une liaison covalente
avec le reste du composé de formule (I)
- R13 = H, 1_1SO3- ou COOH.
En particulier, le radical de formule (Va) peut être tel que R8 = R9 = NMe2 ou
NEt2,
En particulier, le radical A de formule (Va) peut être tel que R12 peut être
en
position ortho, méta ou para.
En particulier, lorsque R12 =*-NHS02-, il peut être avantageusement en
position ortho.
Selon un mode de réalisation, A peut représenter un radical de formule
générale (Vb)
R1a
N
R6B
R17 N
R15
dans laquelle :
- * symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de formule (I),
- R14 peut représenter un reste acyle en C2 à C4,
- R15 peut représenter un radical hétérocyclique en C5 à C7, et notamment un
radical thiophenyl, et
- R16 = R17 = X, avec X = F, Cl ou Br, et notamment F.
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Selon un mode de réalisation, les radicaux de formule (Va) et (Vb) peuvent
être
des radicaux de marqueurs fluorescents.
A titre d'exemples de marqueurs fluorescents susceptibles de convenir à la
mise en oeuvre de la présente invention, il est possible de mentionner la
rhodamine et ses
dérivés tels que la tetraméthylrhodamine, la rhodamine Red-X (lissamine), le
Bodipy et ses
dérivés, le Texas Red et ses dérivés, la fluoresceine et ses dérivés, l'Alexa
et ses dérivés
ainsi que l'Oregon Green et ses dérivés.
Selon un mode de réalisation, le radical A peut représenter un marqueur
fluorescent choisi parmi des marqueurs fluorescents de formule(s) suivante(s)
:
Et2N +NEtz HO ~ O O HO ~ O_
H JOf F -~F
N~ I I
s SO- COOH COOH
* O/O 3 H II H I
*-N~
O O
Sulfonylrhodamine (lissamine) Fluoresceine Oregon Green
SO3H S03-
MezN O N~Mez H
N CN
coo -
H
N-I
*~ II
O
N O
H
Tetraméthylrhodamine Alexa 532
O
* \\
N
F--
F~B\ N
S
Bodipy
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dans laquelle * symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de
formule (I)
selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, le marqueur fluorescent A peut être choisi parmi
des marqueurs fluorescents dérivés de la rhodamine, comme par exemple un
dérivé de la
5 sulfonylrhodamine B.
En particulier, le reste du composé de formule générale (I) peut être lié en
position ortho au dérivé de la sulfonylrhodamine (lissamine).
Notamment, le radical dérivé de lissamine peut être représenté par le radical
de
formule suivante :
so3 N
S02
10 Lissamine
dans laquelle * symbolise une liaison covalente avec le reste du composé de
formule (I)
selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être de
15 formule générale (I) dans laquelle n peut être égal à 0.
Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être
représenté, par exemple, par la formule générale (II) suivante :
R3
R4 O <
O NH
H
Rl N H~N II H A
O p
R2
(II)
20 dans laquelle :
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- Rl, R2, R3, R4, A et p peuvent être, par exemple, tels que définis
précédemment.
Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être de
formule générale (I) dans laquelle n peut être égal à 0, p peut être égal à 4,
Rl peut
représenter un radical méthyle, R2 peut représenter un radical de formule
suivante :
*
N
N-
R5
dans laquelle * et R5 peuvent être tels que définis précédemment, et -COR3
peut
représenter un radical acyle, notamment acétyle, substitué par une entité
basique R3, de
formule suivante :
R6\N
dans laquelle * symbolise une liaison covalente avec le radical acyle, et Y et
R6 peuvent
être tels que définis précédemment, et R4 peut être un atome d'hydrogène.
Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être de
formule générale (III) suivante
R6
Y
O
O NH
- -A
N~H N O H
N
5 (III)
dans laquelle A, R5, Y et R6 peuvent être tel que défini précédemment.
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Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être un
composé de formule générale (III) telle que définie précédemment dans laquelle
le
marqueur fluorescent A peut être, par exemple, un radical sulfonylrhodamine
tel que défini
précédemment, et notamment tel que le reste du composé de formule (III) soit
en ortho du
radical sulfonylrhodamine, R5 peut être un radical benzyle, Y peut être N et
R6 peut être un
radical méthyle.
Avantageusement, un composé conforme à l'invention n'est pas un composé de
formule générale (I) telle que définie précédemment dans laquelle le marqueur
fluorescent
A est un radical sulfonylrhodamine (lissamine) tel que le reste du composé de
formule (I)
soit en para du radical sulfonylrhodamine.
Avantageusement, un composé conforme à l'invention n'est pas un composé de
formule générale (III) telle que définie précédemment dans laquelle le
marqueur
fluorescent A est un radical sulfonylrhodamine (lissamine) tel que le reste du
composé de
formule (III) soit en para du radical sulfonylrhodamine, et R5 est un radical
benzyle, Y est
N et R6 est un radical méthyle.
Selon une variante de réalisation, un composé conforme à l'invention peut être
représenté par la formule (IV) suivante
N= O
O~S'O
i
0=S=0
O
O H ~
C~N O
N H N
H
O
N\~--N
C ~
PROCEDE DE SYNTHESE
Des composés conformes à l'invention peuvent être obtenus soit sous forme
d'une bibliothèque de composés de formules variées, soit sous forme de
composés isolés
sous une forme pure ou en mélange de stéréoisomères.
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Le procédé de synthèse peut être effectué sur une résine de polystyrène de
type
REM (REgenerated Michael), constitué d'une résine hydroxyméthylpoylstyrène
fonctionnalisée par un ester acrylique accepteur de Michael.
La résine de type REM convient particulièrement à la synthèse de bibliothèque
d'amines tertiaires, via une addition initiale de type Michael d'une amine
afin de fixer cette
dernière au support suivie de la synthèse de la molécule sur support et enfin
sa coupure du
support selon un processus de quaternisation de l'amine puis une élimination
de type
HOFMANN.
Après fixation d'une amine secondaire sur le support solide, les autres
résidus
peuvent être introduits au moyen de méthodes de couplage de peptides
classiques, utilisant
l'activation DIC/HOBt (1,3-diisopropylcarbodiimide/1-hydroxybenzotriazole).
Un radical A, par exemple, de type sulforhodamine (lissamine, par exemple),
peut être greffé directement sur une fonction amine, par exemple du radical s-
NH2 d'une
lysine ou sur un espaceur greffé sur le radical s-NH2 de la lysine, tel qu'un
espaceur
diamino-butane, au moyen d'une liaison uréthane.
La libération du ou des composés de la résine peut être effectuée après
alkylation de l'amine secondaire en présence par exemple d'un halogenure
d'alkyle tel
qu'un iodure de méthyle, ou un bromure de benzyle, suivi d'un traitement en
présence
d'une résine basique échangeuse d'ions de type Amberlite IRA-95.
Selon un mode de réalisation, un tel procédé de synthèse conforme à
l'invention peut être réalisé en parallèle sur des plaques, par exemple des
plaques de 96
puits, en utilisant un équipement FLEXCHEM (Robbins Scientific).
Selon un mode de réalisation, un composé selon l'invention peut être obtenu
selon un procédé de préparation sur support solide comprenant au moins les
étapes
consistant à :
a. coupler sur un support solide de formule
~io\\
0
un composé de formule :
R4
IHN NH boc
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pour obtenir un composé de formule (1) suivante :
R4
ON~NH boc
O
R4 peut être tel que défmi ci-dessus.
b. déprotéger le composé de formule (1), puis de coupler ledit composé
déprotégé avec le composé de formule :
O
NHBoc
HO
R2
pour obtenir un composé de formule (2) suivante :
Ra O
NHBoc
O~/N N
R2
O
R2 pouvant être tel que défmi ci-dessus,
c. déprotéger le composé de formule (2), puis coupler ledit composé
déprotégé avec le composé de formule suivante:
NHFmoc
HO Y4_ NHBoc
P
O
pour obtenir un composé de formule (3) suivante :
R O NHFmoc
a
H NHBoc
O N N N
P
R2
p pouvant être tel que défmi ci-dessus,
d. déprotéger du groupe Fmoc le composé de formule (3), puis coupler ledit
composé déprotégé avec un composé R3COOH pour obtenir un composé de formule
(4)
suivante :
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R3
O
R
a O NH
NHBoc
O N N N
P
R2
O
COR3 pouvant être tel que défmi ci-dessus,
e. déprotéger le composé de formule (4), pour obtenir un composé de
formule (5) suivante :
R3
O~
R4 O NH
0 N H
_~_> H N NH2
P
R2
5 0
f. optionnellement, faire réagir le composé de formule (5) avec le p-
nitrophénylchloroformate puis avec une diamine de formule
H2N~~NH 2
pour obtenir un composé de formule (6) suivante :
R3
R O
a O NH H
H r
~/N NN NH2
C~O N N p
R2 0 OI
10 0
r pouvant être tel que défini ci-dessus,
g. faire réagir le composé de formule (5) ou le composé de formule (6) avec
un traceur électrophile, notamment avec A-Cl, pour obtenir un composé de
formule (7)
suivante :
R,
O <
Ra O NH
O H N N
O ~N A
N N p
R 2 O I~ n
15 0
R2, R3, A, n, p et r étant tels que définis précédemment.
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h. cliver le composé de formule (7) avec un composé de formule R1X, R1
pouvant être tel que défini ci-dessus, et X pouvant représenter un atome
d'halogène,
notamment I ou Br, pour obtenir un composé de formule (I) tel que défini
précédemment.
PROCEDE DE CRIBLAGE ET DE DIAGNOSTIC
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage d'un agent
susceptible d'interagir avec une protéine PEA-15 ou un de ses analogues,
comprenant au
moins les étapes consistant à:
(a) mettre en présence, au moins une protéine PEA-15 portant un marqueur
fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un composé fluorescent,
conforme à
l'invention, dans des conditions propices à une interaction avec ladite
protéine,
A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de
fluorescence,
convenant à la mise en oeuvre d'un transfert d'énergie par résonance de
fluorescence,
(b) mesurer un premier signal S1 caractéristique de l'ensemble obtenu à
l'étape
a) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur
d'énergie de
fluorescence,
(c) mettre l'ensemble obtenu à l'étape a) en présence d'un milieu présumé
contenir au moins un agent à cribler dans des conditions propices à une
interaction avec
ladite protéine,
(d) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de
l'ensemble obtenu à l'étape c) par irradiation à une longueur d'onde
permettant d'exciter le
donneur d'énergie de fluorescence,
(e) comparer le premier et second signal S1 et S2 afin d'en tirer une
conclusion relative à une éventuelle interaction de ladite protéine PEA-15
avec l'agent à
cribler.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par l'expression A et D
étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie de
fluorescence,
convenant à la mise en oeuvre d'un transfert d'énergie par résonance de
fluorescence , un
couple de marqueurs fluorescents dont le spectre d'émission de l'un (donneur
d'énergie de
fluorescence) recouvre tout ou partie du spectre d'excitation de l'autre
(accepteur d'énergie
de fluorescence). En particulier, le spectre d'excitation du donneur ne
recouvre pas, ou
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qu'en très faible partie, le spectre d'excitation de l'accepteur, évitant ou
réduisant ainsi
l'apparition de faux positifs.
Selon un mode de réalisation, les premier et second signaux peuvent être des
signaux fluorescents de l'accepteur et/ou du donneur d'énergie.
En présence d'un composé portant un accepteur d'énergie de fluorescence
susceptible d'interagir avec un composé portant un donneur d'énergie de
fluorescence,
l'irradiation de l'ensemble à une longueur du spectre d'excitation du donneur
d'énergie de
fluorescence peut produire un transfert d'énergie par résonance de
fluorescence (FRET).
Au sens de l'invention, on entend désigner par transfert d'énergie de
fluorescence , un processus physique, dépendant de la distance, par lequel de
l'énergie est
transmise, de manière non radiative, d'un chromophore excité, le donneur
d'énergie de
fluorescence, à un autre chromophore, l'accepteur d'énergie de fluorescence,
par
interaction dipole-dipole.
La manifestation d'un tel transfert peut se détecter par une modulation du
signal fluorescent du donneur et/ou du signal fluorescent de l'accepteur,
comme par
exemple la diminution d'amplitude du signal fluorescent du donneur de
fluorescence et/ou
par une augmentation d'amplitude du signal fluorescent de l'accepteur.
Les variations d'amplitude du signal fluorescent du donneur peuvent être
concomitantes avec les variations d'amplitude du signal fluorescent de
l'accepteur.
Alternativement, un des signaux fluorescents peut varier sans qu'une variation
de l'autre
signal fluorescent puisse être détectée.
Les conditions et les paramètres à ajuster pour effectuer un transfert
d'énergie
de fluorescence relèvent de la pratique de l'homme du métier qui peut se
référer par
exemple à Sekar and Periasamy (J. Cell. Biol., 2003, 160:629).
Selon un mode de réalisation, la comparaison des premier et second signaux
peut permettre de détecter une modulation d'amplitude d'un signal fluorescent.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par modulation
d'amplitude d'un signal fluorescent , dans le contexte du transfert d'énergie
par résonance
de fluorescence, toute modulation de l'amplitude du signal de fluorescence du
donneur, de
l'amplitude du spectre d'excitation ou l'amplitude du signal d'émission du
donneur tel que
défini précédemment.
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Une modulation de ces signaux de fluorescence peut traduire une éventuelle
interaction de l'agent à cribler avec une protéine PEA- 15 portant un marqueur
fluorescent
D. Une telle interaction étant susceptible d'entraîner la dissociation d'un
complexe protéine
PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D/composé selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, un procédé de criblage selon l'invention peut
comprendre, en outre, une étape consistant à préparer au moins un échantillon
contrôle
dans lequel ledit milieu ajouté à l'étape c), du procédé selon l'invention
définie
précédemment, est dépourvu d'agent à cribler.
Le ou les échantillons contrôles peuvent être préparés, selon un procédé
conforme à l'invention, simultanément ou indépendamment de la mise en oeuvre
d'un tel
procédé pour le criblage d'un agent susceptible d'interagir avec PEA- 15.
Un procédé selon l'invention peut comprendre une étape consistant à comparer
un signal S3 mesuré à partir d'un échantillon contrôle avec les signaux S1 et
S2 tels que
définis précédemment pour en tirer une information sur ledit agent à cribler.
Une différence entre les signaux ainsi comparés peut être informatif de la
présence, de la quantité, et/ou d'une interaction avec PEA-15, d'un agent à
cribler dans un
échantillon.
Selon un mode de réalisation, le marqueur fluorescent D porté par la protéine
PEA-15 peut être choisi, de manière non limitative, parmi une protéine, telle
qu'une
protéine fluorescente, un marqueur fluorescent, par exemple choisi parmi un
dérivé de la
fluoresceine, un dérivé de la rhodamine, un dérivé de l'Alexa 532 , un dérivé
du Bodipy ou
un dérivé de l'Oregon Green , sous réserve que D et A soient tels que définis
ci-dessus.
Selon un mode de réalisation, la protéine fluorescente peut être choisie, de
manière non exhaustive, parmi la Green Fluorescent Protein, ou un de ses
variants
fluorescents, tels que la Yellow Fluorescent Protein (YFP), la Cyan
Fluorescent Protein
(GFP) ou la Red Fluorescent Protein (RFP) ou le DS Red ou un de ses variants.
Selon un mode de réalisation, la protéine PEA-15 portant un marqueur
fluorescent peut être notamment une protéine de fusion, par exemple GFP-PEA-
15. Une
telle protéine peut être obtenue par toute technique de biologie moléculaire
connue de
l'homme du métier, et notamment celles décrites dans Molecular Cloning : A
Laboratory
Manual , Cold Spring Harbor, Laboratory Cold Spring Harbor, NY, 1989, 2d Ed.
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La construction et l'obtention de vecteur d'expression contenant une protéine
de fusion, telle que par exemple GFP-PEA-15 relève des connaissances et de la
pratique
habituelles de l'homme du métier. Les séquences codant pour ces protéines sont
par
exemple disponibles dans des banques de données, sur le site
www.ncbi.nlm.nih.gov ou
sur le site ca.expasy.org, et également commercialement.
Des vecteurs d'expression, contenant une séquence d'acides nucléiques codant
pour la GFP (ou un de ses variants) ou le DS Red peuvent être disponible
commercialement, notamment auprès de sociétés telles que Invitrogen ou
Clontech.
L'expression de tels vecteurs peut se faire dans toute cellule hôte adaptée,
et la
récupération de la protéine de fusion ou le cas échéant de l'acide nucléique
codant par une
telle protéine, comme l'ARNm ou l'ADNc, peut se faire par tout moyen adapté
connu de
l'homme de l'art.
Par exemple, une protéine de fusion GFP-PEA-15 a été décrite par KITSBERG
et al. (J. Neurosci., 1999,19:8244).
Selon un mode de réalisation, un procédé de criblage conforme à l'invention
peut être mis en oeuvre, par exemple, en utilisant un composé conforme à
l'invention de
formule (IV).
Selon un mode de réalisation, la protéine PEA-15 portant un marqueur
fluorescent D peut être une protéine de fusion GFP-PEA-15.
Selon un mode de réalisation, un procédé de criblage conforme à l'invention
peut être effectué ex vivo ou in vitro.
Par exemple, un procédé conforme à l'invention mis en oeuvre peut être
effectué ex vivo à partir d'un tissu prélevé à partir d'un animal de
laboratoire modifié
génétiquement pour que ses cellules expriment, de manière tissu spécifique ou
non, une
protéine de fusion GFP-PEA-15.
Un procédé conforme à l'invention réalisé peut être effectué in vitro
notamment in cellulo à partir de cellules intactes, ou ex cellulo, par exemple
dans un lysat
de cellules ou après séparation des éléments d'intérêts, comme la protéine de
fusion GFP-
PEA-15.
Un procédé de criblage conforme à l'invention peut être effectué in cellulo
dans des cellules exprimant la protéine de fusion selon l'invention, soit
après transfection
de cellules, primaires ou en lignées, au moyen d'un vecteur d'expression tel
que défini
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précédemment, soit par mise en culture de cellules prélevées chez un animal de
laboratoire
modifié génétiquement de manière à exprimer une construction comme défini ci-
dessus,
soit par perfusion de cellules primaires ou en lignées, par exemple au moyen
d'une
micropipette ou de tout autre moyen connu de l'homme de l'art, d'une protéine
de fusion
5 selon l'invention, ou d'une séquence d'acide nucléique codant pour cette
protéine de
fusion.
Selon un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte à un procédé
de
criblage d'un agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA-15, ou un de
ses
10 analogues, comprenant au moins les étapes consistant à:
(a) mettre en présence au moins une protéine PEA-15 liée à un support avec
un composé conforme à l'invention, dans des conditions propices à une
interaction avec
ladite protéine,
(b) mesurer un premier signal S 1 caractéristique de l'ensemble obtenu à
l'étape
15 a),
(c) mettre en présence l'ensemble obtenu à l'étape a) avec un agent à cribler
dans des conditions propices à une interaction avec ladite protéine,
(d) mesurer un second signal S2, de même nature que S1, caractéristique de
l'ensemble obtenu à l'étape c),
20 (e) comparer S 1 et S2 afm d'en tirer une conclusion relative à une
éventuelle
interaction de ladite protéine PEA- 15 avec l'agent à cribler.
Selon un mode de réalisation, la protéine PEA- 15 peut être liée à un support
au
moyen d'un marqueur dit marqueur de purification .
Au sens de la présente invention, on entend désigner par marqueur de
25 purification , toute structure susceptible d'être utilisée à des fins de
liaison entre la
protéine PEA- 15 et un support.
Un marqueur de purification peut être, par exemple et de manière non
limitative, une étiquette FLAG, une étiquette polyHistidine, ou une protéine
GST(Glutathion S Transferase).
30 Une protéine PEA-15 liée à un marqueur de purification tel que défini
précédemment peut être une protéine de fusion obtenue par toutes méthodes de
biologie
moléculaire connues de l'homme de l'art, notamment comme indiqué ci-dessus.
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Par exemple une protéine de fusion GST-PEA- 15 peut être été obtenue selon le
protocole décrit par Kitsberg et al. (J. Neurosci, 1999, 19 : 8244).
Selon le marqueur de purification considérée, un support convenant à la mise
de l'invention peut être, par exemple et de manière non exhaustive, une
surface d'une bille
de Sepharose ou d'une plaque pour culture de cellules recouverte de glutathion
tel que des
plaques 96 puits commercialisées par SIGMA (ref. P3233), une colonne de
nickel, un
anticorps anti-FLAG lié à une colonne de protéine G ou de protéine A, ou à la
surface
d'une bille de Sepharose ou au fond d'un puits d'une plaque de culture de
cellules.
Par ailleurs pour une mise en oeuvre d'un procédé selon, la protéine PEA- 15
peut être liée à la surface d'une sensor ship, pour une mise en oeuvre dans un
procédé de
détection d'un signal par résonance plasmonique de surface, selon des moyens
connus de
l'homme de l'art.
Selon un mode de réalisation, le composé selon l'invention peut être
fluorescent et le premier signal S1 et le second signal S2 peuvent être des
signaux de
fluorescence.
La mesure de ces signaux peut être obtenue par toutes méthodes de
spectrofluorimétrie ou d'imagerie par fluorescence, connues de l'homme de
l'art. Les
conditions d'excitation et d'enregistrement de l'émission de fluorescence sont
à adapter
selon différents facteurs connus de l'homme de l'art, tels que, par exemple et
de manière
non exhaustive, la nature du marqueur fluorescent A, le support sur lequel est
la protéine
PEA-15.
Une éventuelle interaction de la protéine PEA-15 avec un agent à cribler
entraînant le déplacement du composé selon l'invention préalablement lié peut
être
détectée par une différence d'intensité de fluorescence entre les deux signaux
S1 et S2.
Selon un autre mode de réalisation, le premier signal S1 et le second signal
S2
peuvent être des signaux obtenus par résonance plasmonique de surface, par
exemple au
moyen d'un appareil de type Biacoreselon des protocoles connus de 1'homme de
1'art.
Ces signaux sont indépendants de la nature fluorescente ou non d'un composé
selon l'invention.
Ainsi dans cette mise en aeuvre du procédé précédemment décrit, le composé
conforme à l'invention peut ne pas être fluorescent.
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La protéine PEA-15 peut être fixée sur une sensor ship comme décrit
précédemment.
Un composé selon l'invention peut être mis en contact avec ladite protéine
fixée au sensor ship. Les interactions entre le composé et la protéine peuvent
être détectées
par résonance plasmonique de surface. Une éventuelle interaction de la
protéine PEA-15
avec un agent à cribler entraînant le déplacement du composé selon l'invention
préalablement lié peut être détectée par résonance plasmonique de surface.
Selon un autre mode de réalisation, la présente invention a pour objet un
procédé de diagnostic et/ou de pronostic d'un état pathologique susceptible
d'impliquer
PEA- 15 par détection et, éventuellement, quantification de la protéine PEA-
15 dans au
moins un échantillon biologique présumé comprendre ladite protéine comprenant
au moins
les étapes consistant à :
(a) mettre en présence au moins une protéine PEA-15 portant un marqueur
fluorescent D, ou un de ses analogues, et au moins un composé fluorescent
conforme à
l'invention dans des conditions propices à une interaction avec ladite
protéine,
(b) A et D étant tels qu'ils définissent un couple accepteur-donneur d'énergie
de fluorescence, convenant à la mise en oeuvre d'un transfert d'énergie par
résonance de
fluorescence,
(c) mesurer un premier signal S1 caractéristique de l'ensemble obtenu à
l'étape
a) par irradiation à une longueur d'onde permettant d'exciter le donneur
d'énergie de
fluorescence,
(d) mettre l'ensemble obtenu à l'étape a) en présence d'un échantillon
biologique présumé comprendre au moins une protéine PEA-15 dans des conditions
propices à l'interaction de ladite protéine PEA-15 de l'échantillon biologique
avec ledit
composé selon l'invention,
(e) mesurer un second signal S2, de même nature que Si, caractéristique de
l'ensemble obtenu à l'étape c) par irradiation à une longueur d'onde
permettant d'exciter le
donneur d'énergie de fluorescence,
(f) comparer S1 et S2 afin d'en tirer une conclusion relative à une éventuelle
présence de la protéine PEA-15 dans ledit échantillon biologique, et
éventuellement une
conclusion relative à la quantité de ladite protéine.
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Une comparaison du premier et du second signal peut permettre une détection
d'une modulation d'amplitude d'un signal fluorescent. Une telle modulation
peut être
informatif de la présence, et éventuellement, de la quantité de protéine PEA-
15
éventuellement présente dans l'échantillon.
La détermination de la présence et éventuellement de la quantité de la
protéine
PEA-15, éventuellement comparée à des valeurs de références obtenues, soit à
partir d'un
échantillon contrôle comprenant une quantité connue de cette protéine, soit à
partir d'un
échantillon biologique sain, éventuellement en parallèle avec la mesure
précédente, peut
être informatif d'un état pathologique impliquant notamment PEA-15 et/ou une
évolution
d'un tel état.
A titre d'exemple d'état pathologique susceptible d'être diagnostiqué et/ou
pronostiqué par un procédé selon l'invention, on peut mentionner le cancer, et
notamment
les gliomes, les cancers des ovaires, les cancers du sein, les cancers du
rein, les
mélanomes, et également le diabète de type II.
Un échantillon biologique peut être obtenu à partir d'un tissu biologique ou
d'un fluide corporel.
Un procédé selon l'invention peut comprendre une étape consistant à comparer
un signal S3 mesuré à partir d'un échantillon contrôle avec les signaux S1 et
S2 tels que
définis précédemment pour en tirer une information la présence et,
éventuellement, la
quantité de PEA-15 dans un échantillon biologique.
Selon un mode de réalisation, le premier et le second signal peuvent être
comparé à un ou plusieurs signaux fluorescents détectés à partir d'un ou
plusieurs
échantillon(s) contrôle(s). De tels échantillons contrôles peuvent être
obtenus en mettant en
oeuvre un procédé selon l'invention et en remplaçant à l'étape c)
l'échantillon biologique
par un ou des échantillon(s) comprenant une quantité connue de protéine PEA-
15.
Le ou les échantillons contrôles peuvent être préparés selon un procédé
conforme à l'invention simultanément ou indépendamment de la mise en oeuvre
d'un
procédé selon l'invention pour la détection et, éventuellement, la
quantification de la
protéine PEA-15 dans un échantillon biologique.
Selon un mode de réalisation, il est possible de faire varier les quantités
connues de PEA- 15 du ou des échantillon(s) contrôle(s) ou la quantité de
protéine PEA- 15
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portant un marqueur fluorescent D et ou de composé fluorescent conforme à
l'invention de
façon au pouvoir obtenir une gamme étalon.
Une corrélation d'un signal de fluorescence à l'une des quantités variables
précédemment définies peut être ainsi réalisée.
Ainsi, une corrélation d'un signal de FRET peut être établie avec des
quantités
connues de protéine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D, de composé
fluorescent
conforme à l'invention de protéine PEA- 15.
Selon un mode de réalisation, la protéine PEA-15 portant un marqueur
fluorescent D peut, notamment, être telle que définie précédemment.
Selon un mode de réalisation, une protéine PEA-15 portant un marqueur
fluorescent D peut être une protéine de fusion de type GFP-PEA-15.
Selon un mode de réalisation, le composé conforme à l'invention peut être tel
que défini précédemment, et notamment peut être de formule (IV) tel que
précisé ci-
dessus.
De nombreuses variations d'un procédé de diagnostic selon l'invention peuvent
être envisagées et le cas échéant combinées à des caractéristiques d'un
procédé de criblage
selon l'invention.
Ainsi, selon un mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de
diagnostic et/ou de pronostic d'un état pathologique susceptible d'impliquer
PEA-15 mis
en oeuvre selon les principes indiqués ci-dessus pour le procédé de criblage,
par exemple,
mettant en oeuvre une détection par résonance plasmonique de surface, dans
lequel, l'agent
à cribler est remplacé par l'échantillon biologique.
La PEA-15 éventuellement présente dans un tel échantillon pourra se lier au
composé conforme à l'invention et modifier ainsi le signal enregistré.
TROUSSE POUR CRIBLAGE OU DIAGNOSTIC
La présente invention a également pour objet une trousse pour criblage d'un
agent susceptible d'interagir avec une protéine PEA-15, ou d'un de ses
analogues ou pour
le diagnostic et/ou le pronostic d'un état pathologique susceptible
d'impliquer PEA-15
comprenant :
- au moins une protéine PEA-15 portant un marqueur fluorescent D ou un
marqueur de purification, et
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- au moins un composé conforme à l'invention,
le cas échéant, A et D étant tels qu'ils peuvent définir un couple accepteur-
donneur
d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en oeuvre d'un transfert
d'énergie par
résonance de fluorescence.
5 Selon un mode de réalisation, la protéine PEA-15 portant un marqueur de
fluorescence D ou un marqueur de purification peut être telle que défmie
précédemment.
Selon un mode de réalisation, lorsque la trousse selon l'invention est plus
particulièrement mise en oeuvre pour le diagnostic et/ou pronostic d'un état
pathologique,
elle peut comprendre en outre au moins une protéine PEA- 15 non marquée.
10 Selon un mode de réalisation, la protéine de fusion formée d'une protéine
PEA- 15 avec une protéine fluorescente ou la protéine PEA- 15 non marquée
peuvent être
présentes dans une trousse conforme à l'invention sous la forme d'une séquence
d'acides
nucléiques codant pour lesdites protéines, telle qu'un ADNc, un ARNm, ou un
vecteur
d'expression.
COMPOSITION PHARMACEUTIQUE
Selon un mode de réalisation, la présente invention a également pour objet un
composé conforme à l'invention pour une utilisation à titre d'agent actif dans
une
composition pharmaceutique.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par composition
pharmaceutique , une composition ou une substance présentée comme possédant
des
propriétés curatives ou préventives à l'égard de maladies humaines ou
animales, ainsi
qu'une substance ou composition destinée à être utilisée afin d'établir un
diagnostic et/ou
de pronostic d'un état pathologique ou non, ou de restaurer, corriger ou
modifier les
fonctions organiques d'un individu.
La méthode de diagnostic et/ou de pronostic susceptible d'être mise en oeuvre
par une composition pharmaceutique selon l'invention peut être effectuée in
vitro ou ex
vivo.
Une composition pharmaceutique conforme à l'invention peut comprendre un
composé conforme à l'invention de formule générale (I), ou un de ses dérivés
tels qu'une
forme tautomère, une forme stéréoisomère, une forme polymorphe, un sel
pharmaceutiquement acceptable, ou un solvate pharmaceutiquement acceptable, en
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combinaison avec des véhicules, des diluants, ou des excipients usuellement
utilisés en
pharmacie.
Une composition pharmaceutique conforme à l'invention peut être présentée
sous une forme galénique usuellement utilisée dans le domaine, telle que des
comprimés,
des gélules, une poudre, un sirop, une solution, une suspension.
Une composition pharmaceutique conforme à l'invention peut être présentée
sous une forme galénique convenant à l'administration par d'autres voies,
telles que la voie
orale, la voie nasale, la voie sublinguale, la voie topique, la voie
ophtalmique, la voie
rectale, etc.
Une composition cosmétique conforme à l'invention peut également être
présentée sous une forme stérile convenant à une administration par voie
parentérale, telle
que la voie sous-cutanée, transdermique, intramusculaire, intraveineuse, intra-
artérielle,
intra-cardiaque, etc.
Une composition pharmaceutique conforme à l'invention peut également être
présentée sous une forme lyophilisée, combinée au moment de son utilisation
avec une
solution aqueuse stérile ou non.
En particulier, la solution aqueuse peut être stérile si la composition
conforme
à l'invention est destinée à une administration parentérale.
La quantité de composé conforme à l'invention présente dans une composition
pharmaceutique est à ajuster, par exemple, selon la voie d'administration, le
type
d'individu à traiter, la nature de la pathologie à traiter.
L'ajustement des quantités et des posologies en fonction de ces paramètres est
connu de l'homme de l'art.
Une composition conforme à l'invention comprend généralement une quantité
suffisante d'un composé conforme à l'invention.
On entend désigner par quantité suffisante , la quantité nécessaire à
l'obtention d'un effet recherché. Au sens de la présente invention, un tel
effet peut être par
exemple la réduction ou le traitement des symptômes présentés par un individu
présumé
atteint d'une pathologie telle qu'un cancer ou un diabète de type II.
Le cancer peut être par exemple un gliome, un cancer du rein, un cancer du
sein, ou un mélanome.
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Selon encore un autre de ses objets, la présente invention a pour objet
l'utilisation d'un composé conforme à l'invention pour la fabrication d'une
composition
pharmaceutique destinée au traitement d'un état pathologique susceptible
d'impliquer
PEA-15.
La protéine PEA-15 peut être impliquée soit par une altération de son
expression, à savoir par exemple une surexpression ou un manque d'expression,
soit par
une altération de son activité biologique, se traduisant, par exemple, par une
augmentation
de son activité ou une diminution de son activité, et pouvant être le résultat
soit d'une
mutation (par exemple substitution, insertion ou délétion) dans la séquence de
la protéine
PEA-15, soit résultant d'une altération des signaux cellulaires modulant
l'activité
biologique et/ou l'expression de la protéine PEA- 15.
En relation avec un état pathologique susceptible d'impliquer PEA-15, le terme
traitement vise à désigner la réduction de la sévérité d'une maladie, telle
que par
exemple la réduction des symptômes ou la prévention de ces symptômes.
Ainsi, et dans ce dernier cas, un composé conforme à l'invention peut être
administré avant le développement de l'état pathologique.
Les états pathologiques visés par la présente invention peuvent être notamment
ceux défmis précédemment, tels que le cancer, et notamment les gliomes, les
cancers du
rein, les cancers du sein, les cancers de l'ovaire, les mélanomes, et
également le diabète de
type II.
On entend désigner par individu au sens de la présente invention l'homme,
des primates non humains, ainsi que des animaux de laboratoire tels que les
rongeurs (par
exemple souris, rat, cochon d'inde ou hamster), des animaux de ferme, en
particulier des
animaux économiquement intéressants tels que la volaille,les bovins, les
ovins, les porcs,
les chèvres et les poissons, et particulièrement ceux produisant des produits
convenant à la
consommation humaine tels que la viande, les oeufs et le lait. Ce terme vise
également à
désigner les animaux domestiques tels que les chats et les chiens.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique
telle que défmie précédemment.
Selon un mode de réalisation, la présente invention a également pour objet un
complexe isolé comprenant au moins une protéine PEA-15 portant un marqueur
fluorescent D ou un marqueur de purification et au moins un composé de formule
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conforme à l'invention, A et D étant tels qu'ils peuvent définir un couple
accepteur-
donneur d'énergie de fluorescence, convenant à la mise en oeuvre d'un
transfert d'énergie
par résonance de fluorescence.
Selon une variante de réalisation, un complexe selon l'invention peut
comprendre à titre de protéine PEA- 15 portant un marqueur fluorescent D, une
protéine de
fusion GFP-PEA-15 et à titre de composé de formule conforme à l'invention, un
composé
de formule (IV), tel que défini précédemment.
De nombreuses modifications de l'invention telle qu'exposée ci-dessus peuvent
être envisagées par l'homme de l'art sans s'écarter de la portée de celle-ci.
De telles modifications sont couvertes par la présente demande.
L'invention est illustrée par les exemples suivants, qui ne doivent pas être
interprétés comme limitant la portée de la présente invention.
LEGENDE DES FIGURES
Fi u : représente des images obtenues par imagerie confocale de la
localisation du composé intracellulaire des protéines ERK et PEA-15 avant et
après
traitement avec 50 M 6D6-1. Le traitement des cellules avec le composé 6D6-1
se traduit
par une relocalisation de la protéine ERK dans le noyau alors que la protéine
PEA- 15 reste
cytoplasmique.
La barre d'échelle correspond à 40 m.
Figure 2: représente l'intensité moyenne de la fluorescence de bille de
Sépharose recouverte de glutathion, portant une protéine de fusion GST-PEA-15,
incubées
en présence de 1 et 5 M de 6D6-1.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 :
Synthèse du composé 6D6-1
Synthèse de (1-Méthyl-pipéridin-4-yl)-carbamic acid tert-butyl ester
ND-N HBoc
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Dans un réacteur, la résine REM (REgenerated Michael, résine de polystyrène)
(5 g, 4 mmol, 0,8 mmol.g.mol-1 de charge théorique) est gonflée dans une
qualité
minimale de diméthyleformamide (DMF). Une solution de
tertiobutyloxycarbonylaminopipéridine (8 g, 40 mmol) dans le DMF (50 ml) est
portée à
80 C puis ajoutée à la résine en suspension. Le mélange est agité pendant 16
heures à 80
C, puis filtré, et lavé trois fois selon la séquence DMF, CH2C12 MeOH. Dans
une seringue
Supelco, la résine (2.3g, 1.5 mmol) est expansée dans 20 mL de DMF et l'iodure
de
méthyle (3.81 mL, 61 mmol) est ajouté. Le mélange est agité par rotation
pendant 24 h, la
résine est filtrée, lavée avec 3 séquences de DMF/ DCM. Dans les mêmes
conditions une
deuxième étape d'alkylation par l'iodure de méthyle est répétée. Le clivage de
la pipéridine
sur la résine est réalisé dans un ballon avec 40 mL de DCM et en présence de
la résine
IRA-95 (3.16 g, 1.5 mmol). Après 24 h d'agitation par un barreau aimanté, la
résine est
filtrée, lavée DCM/MeOH. Le filtrat est collecté et amené à sec sous pression
réduite. Une
purification par flash chromatographie sur gel de silice (DCM/ MeOH : 9/1)
conduit au (1-
Methyl-piperidin-4-yl)-carbamic acid tert-butyl ester sous forme d'une poudre
blanche.
Rdt = 100 %; 1H NMR (CDC13, 200 MHz): 4.43 (m, 11-1), 2.77 (m, 21-1), 2.26
(s, 31-1), 2.13-1.87 (m, 41-1), 1.53-1.46 (m, 21-1), 1.42 (s, 91-1). 13C NMR
(CDC13, 50 MIHz)
155.60, 110.00, 54.86, 46.47, 32.90, 28.80.
Synthèse de la 1-méthyl-pipéridin-4- His(Bzl)-NHBoc
o N
-J~~
N
-ND-N NHBoc
A température ambiante et sous agitation magnétique, la (1-Methyl-piperidin-
4-yl)-carbamic acid tert-butyl ester (0.07 g, 0.34 mmol) est traitée par une
solution de
TFA/DCM (1mL /1mL) pendant 1H30. La solution est ensuite évaporée à sec sous
pression réduite et le produit obtenu est séché sous vide pendant 18 h. La N-
méthyl
pipéridine déprotégée est dissout dans 1 mL de DMF et sont successivement
additionnés
la Boc-His(Bzl)-OH (0.12 g, 0.32 mmol), le benzotriazol-1-yl-
oxytrispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate [PyBop] (0.17 g, 0.32 mmol)
et la
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diisopropyléthylamine [DIEA] (0.27 mL, 1.6mmo1). Après une agitation
magnétique de
3h à température ambiante, la réaction est évaporée à sec puis purifié par
HPLC et conduit
après lyophilisation à une huile translucide.
Rdt= 100 %; tr = 15.74 min ;~~ = 220 nm ; gradient t= 0 min : 0% solvant B
5 à t = 5 min : 0% solvant B à t = 35 min : 100 % solvant B. MS (ESI-TOF) m/z
(M+H)
calculé pour [C241-135N503 +H ] 442 trouvé 442.
Synthèse de la Fmoc-Lys(o-Lissamine)-OH
N,O N
O
5~ OH
O 0 7 O
OS O- A
10 A température ambiante et sous agitation magnétique, la Fmoc-lys(Boc)-OH
(0.57 g, 1.23 mmol) est traitée par une solution de TFA/DCM (5mL /5mL) pendant
2H. La
solution est ensuite évaporée à sec sous pression réduite et le produit obtenu
est séché sous
vide pendant 18 h. La Fmoc-lys-OH est ensuite mis en solution dans 17 mL de
DCM puis
de la triéthylamine [TEA] (1.38 mL, 9.84 mmol) est additionné pour ajusté le
pH au
15 environ de 8-9, on observe alors la formation d'un gel qui disparaît lors
de l'addition en
une demi-heure à 0 C de la lissamine (0.78 g, 1.35 mmol). Ramené à température
ambiante, la réaction est laissée sous agitation magnétique pendant 5 H. Le
mélange
réactionnel est ensuite dilué avec 50 mL de DCM, lavé deux fois avec HC1 10%
(10 mL),
puis la phase organique est séchée sur sulfate de soduim, évaporée à sec. La
purification et
20 la séparation des deux isomères de position est obtenue sur gel de silice
(dichlorométhane/méthanol/acide acétique : 94/5/1) et conduit à deux poudres
violettes.
Rdt : isomère para 40 % et isomère ortho 5 %. MS (ESI-TOF) m/z (M+H)
calculé pour [C48H52N4010S2+H] 909, trouvé 909.
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Synthèse de la 1-méthyl-pipéridin-4- His(Bzl)- Lys(o-Lissamine)-NHFmoc
L N=
O
~ O
HN~ 0 OS O
O
-N O ~ H0O
N
H N O
N \ N
d
A température ambiante et sous agitation magnétique, la 1-methyl-piperidin-4-
His(Bzl)-NHBoc (0.03 g, 0.08 mmol) est traitée par une solution de TFA/DCM
(1mL /1mL) pendant 1H30. La solution est ensuite évaporée à sec sous pression
réduite et
le produit est séché sous vide pendant 18 h. L'amine ainsi obtenue est dissout
dans 0.5 mL
de DMF et sont successivement additionnés la Fmoc-Lys(o-Lissamine)-OH (0.06 g,
0.07
mmol), le PyBop (0.03 g, 0.07 mmol) et la TEA (0.01 mL, 0.07 mmol). Après une
agitation magnétique de 4h à température ambiante, la réaction est évaporée à
sec puis
purifié par HPLC et conduit après lyophilisation à une poudre violette.
Rdt = 15 %; tr = 18.97 min ;~~ = 220 nm ; gradient t = 0 min : 5 % solvant B à
t = 30 min : 100 % solvant B. MS (ESI-TOF) m/z (M+H) calculé pour [C671-
177N9010S2+1-1]
1232, trouvé 1232.
CA 02633264 2008-06-13
WO 2007/071874 PCT/FR2006/051367
42
Synthèse de la 1-méthyl-piperidin-4-His(Bzl)-Lys(o-Lissamine)- 1-méthyl-
1H-imidazol-4-yl)-acétamide
L N=-1
O
~ l O
N ~ S 0 ô5 O
HNO
~N ~ O ~~
H
N N N II N
H O H
N
N
d
Dans une première étape la 1-méthyl-piperidin-4- His(Bzl)-Lys(o-Lissamine)-
NHFmoc (O.Olmg, 0.01 mmol) est traitée par 0.12 mL de pipéridine dans 0.5 mL
de DMF
pendant 1 H à température ambiante. La solution est ensuite directement
injectée sur HPLC
semi-préparative et conduit au produit déprotégé sur l'amine terminale avec un
rendement
de 40 %. L'amine (0.004 g, 0.004 mmol) ainsi obtenue est engagée dans une
dernière
étape de couplage avec la 1-methyl-4-imidazoleacetic acid hydrochloride (0.001
g, 0.007
mmol) en présence de PyBop (0.003 g, 0.007 mmol) et de DIEA ( 0.005 mL, 0.033
mmol)
dans 0.3 mL de DMSO. Après 1h30 d'agitation à température ambiante, la
solution est
directement injectée sur HPLC semi-préparative et conduit après lyophilisation
à une
poudre violette.
Rdt 30 % tr = 17.70 min 220 nm ; gradient t = 0 min : 5 % solvant B à t
35 min : 100 % solvant B. MS (ESI-TOF) m/z (M+H) calculé pour [C581-
173N1109S+1-1
]
1132, trouvé 1132.
EXEMPLE 2
Détection par FRET de l'interaction du composé 6D6-1 avec la PEA-15-GFP
La lignée cellulaire 3T3 exprimant la GFP-PEA-15 (cellule 3T3-GFP-PEA-15)
a été obtenue comme décrit par FORMSTECHER et al. (Dev. Cell., 2001, 1: 239)
par
transfection des cellules NIH3T3 avec un plasmide pEGFP-PEA-15 obtenu comme
décrit
par KITSBERG et al. (J. Neurosci., 1999, 19:8244).
CA 02633264 2008-06-13
WO 2007/071874 PCT/FR2006/051367
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Des clones résistants à la néomycine (G418) ont été sélectionnés et cultivés
dans un milieu DMEM (Roche) complété avec 10 % de sérum de veau foetal, 2mM de
glutamine, de la pénicilline (5 IU/ml) et de la stréptomycine (5 g/ml).
L'expression de la protéine GFP-PEA-15 a été vérifiée par mesure de la
fluorescence des cellules vivantes et une analyse par transfert WESTERN avec
un
anticorps anti-GFP (Roche, cat n 1 814 460 mélange de deux anticorps
monoclonaux faits
chez la souris (clone 7.1 et clone 13.1)) et un anti-PEA-15 (anticorps
polyclonal de lapin,
Sharif et al., Neuroscience, 126 :263, 2004).
Les cellules 3T3-GFP-PEA-15 sont ensuite cultivées jusqu'à confluence dans
un milieu HAM-F12 comprenant de la pénicilline (10 000 U/ml)/stréptomycine
(10 000 g/ml), 7 % de sérum de veau foetal (BIOWIHITTAKER) avant les
expériences de
transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET).
Une solution stock du composé 6D6-1, dissous dans du DMSO à une
concentration d'environ 20 mM est diluée avant utilisation dans du PBS à une
concentration de 10 fois la concentration finale.
Le composé 6D6-1 est testé à 10-4 M et 10-5 M.
Après addition du composé 6D6-1, les cellules sont agitées doucement (100
rpm) pendant 60 minutes avant la lecture de la fluorescence afin de permettre
aux
composés de diffuser et de rentrer dans les cellules.
Les cellules sont irradiées à une longueur d'excitation à 465 nm.
La protéine GFP excitée à 465 nm émet un signal de fluorescence à 535 nm.
La liaison du composé 6D6-1 à la protéine GFP-PEA-15, permet un transfert
d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) se traduisant par l'émission
d'un signal de
fluorescence à 590 nm.
EXEMPLE 3
Effet du composé 6D6-1 sur la localisation de ERK
Des cultures primaires d'astrocytes ont été préparées à partir de cortex et de
striatum d'embryons de souris (jour 16) comme décrit par ARAUJO et al. (J.
Biol. Chem.,
1993, 268:5911).
CA 02633264 2008-06-13
WO 2007/071874 PCT/FR2006/051367
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Les cultures primaires d'astrocytes ont été maintenues pendant 24 heures en
absence de sérum, une condition connue pour induire une localisation
principalement
cytoplasmique d'ERK.
Les cellules ont ensuite été traitées ou non par 50 M du composé 6D6-1
pendant 2 heures 15.
La localisation sub-cellulaire d'ERK et de PEA-15 a été observée par
microscopie confocale après marquage des cellules par des anticorps
fluorescents.
Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS (tampon salin phosphate de
Dulbecco, sans CaC12 ni MgC12, Sigma), et fixées avec du paraformaldéhyde à 4
% dans du
PBS (pH 7,5), pendant 15 minutes, puis lavées deux fois avec du PBS comprenant
0,1 M
de glycine, à température ambiante.
Ensuite, les cellules ont été incubées pendant 5 minutes dans du PBS contenant
0,2 % de triton X-100.
Les sites non spécifiques ont été bloqués avec du PBS contenant 10 % de
sérum de chèvre normal (NGS) pendant une heure à température ambiante.
Puis les cellules ont été incubées sur la nuit à 4 C avec des anticorps
spécifiques de PEA- 15 (anticorps polyclonal de lapin, Sharif et al,
Neuroscience, 2004) ou
de ERK (anticorps polyclonal de lapin, Santa Cruz K-23 (ref sc-94)), dilués
dans du PBS
contenant 1,5 % de NGS.
Après trois lavages dans du PBS, les cellules sont incubées pendant une heure
à
température ambiante avec un anticorps anti-lapin marqué par Alexa-488
(Molecular
Probes).
Les noyaux cellulaires ont été marqués avec de l'iodure de TOPRO2 selon les
spécifications du fabricant (HOECHST).
Les lamelles ont été montées sur des lames de verre dans un milieu
FLUOROMOUNT (Southern Biotechnology) et examinées par microscopie confocale
(TCS SP2, LEICA) avec les filtres appropriés.
Pour l'analyse confocale, les longueurs d'ondes d'excitation étaient 488 nm
pour Alexa 488 et 633 nm pour TOPRO, les longueurs d'ondes d'émission étaient
510-525
nm pour Alexa-488 et 647 nm pour TOPRO.
Le traitement des astrocytes par 50 M du composé 6D6-1 conduit à la
relocalisation d'ERK dans le noyau, alors que PEA-15 reste cytoplasmique
(Figure 1).
CA 02633264 2008-06-13
WO 2007/071874 PCT/FR2006/051367
EXEMPLE 4
Interaction 6D6-1/protéine PEA-15
La protéine de fusion GST-PEA- 15 a été obtenue selon le protocole décrit par
Kitsberg et al. (J. Neurosci, 1999, 19 : 8244).
5 Les protéines de fusion GST-PEA-15 ont été récupérées après lyse des
bactéries et incubées en présence de bille de Sépharose recouverte de
gluthation.
Les billes ainsi obtenues sont incubées en présence de 1 ou 5 M de 6D6-1,
dans un tampon Tris-HC1 20 mM pH7,4 ; NaC1 100 mM ; MgC12 1 mM ; Triton X-100
1 %).
10 Après une série de trois lavages, les billes sont séchés sur une membrane
de
cellulose et la fluorescence est quantifiée au moyen d'un phospholmager
(Biorad), en
mesurant la fluorescence de la lissamine par excitation à 543 nm et mesure de
l'émission à
590 nm.
Les résultats sont la moyenne de trois expériences indépendantes.
15 Les résultats indiquent que l'intensité moyenne de fluorescence dépend de
la
concentration du composé et suggèrent ainsi une interaction spécifique entre
le composé
6D6-1 et la protéine PEA-15.
