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VARIANTS AMELIORES DE L'INTERFERON- GAMMA HUMAIN (IFNy)
Introduction
La présente invention relève du domaine de l'amélioration des protéines. Elle
porte sur
l'amélioration de l'interféron y humain (IFNy), ainsi que des compositions
comprenant
un IFNy amélioré, un acide nucléique codant celui-ci, et leurs utilisations.
L'IFNy est une cytokine de 166 acides aininés. La molécule possède un peptide
signal
permettant sa translocation membranaire et sa sécrétion, un site de clivage et
une partie
dite protéine mature. Le peptide signal de l'IFNy est constitué des 23
premiers ou des 20
premiers acides aminés selon les auteurs. En effet, il existe un doute dans la
littérature
sur la présence du triplet d'acides aminés Cys-Tyr-Cys (CYC) en N-terminal de
la
séquence mature. L'IFNy existe sous forme d'un homodimère dans lequel les deux
sous
unités ne sont pas liées covalemment. Chaque sous-unité possède deux sites de
N-
glycosylation (positions 48 et 120 du précurseur de 166 aa). On notera, si les
CYC ne
sont pas inclus, l'absence de ponts disulfures et de cystéines sur la protéine
mature in
vivo. Chacun de ces monomères possèdent six hélices alpha avec une partie
compacte
constituée des 4 premières hélices alpha les plus N-terminales (hélices alpha
A, B, C, et
D) et une partie C-terminale composée de deux hélices alpha isolées et
étroitement en
interaction avec le second monomère d'IFNy.
L'IFNy est l'exemple type de cytokine pléiotrope au large spectre d'activités.
En effet,
les interférons (IFNs) sont doués d'activités telles que l'inhibition de la
réplication
virale, l'inhibition de la multiplication cellulaire et l'induction de
l'apoptose.
Notamment, la stimulation des macrophages par l'IFNy induit les réponses
suivantes :
- l'augmentation de la phagocytose et de la bactéricidie (mécanismes directs
anti-microbiens et anti-tumoraux) ;
- la stimulation des voies de présentation et de dégradation des antigènes,
expression du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de type I et II à la
surface
des macrophages ;
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- la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs d'anticorps,
ce
qui a pour conséquence la production d'IgG et l'activation du complément ;
- l'activation de la NO synthase donnant naissance à la production de NO et de
radicaux libres oxygénés cytotoxiques ; et/ou
- l'augmentation de la production de cytokines et la production d'IFN
endogène.
L'action de l'IFNy sur les lymphocytes T est de favoriser leur différenciation
modulant
ainsi la réponse iminunitaire spécifique.
En raison de son large spectre d'activités (antivirale, antiproliférative et
immunomodulatrice), l'IFNy est une molécule développée comme agent
thérapeutique
humain dans le traitement de nombreuses maladies, de natures variées. Les IFNy
commerciaux (Actimmune, et Biogamma) sont aujourd'hui utilisés pour deux
indications thérapeutiques principales : la granulomatose chronique et la
fibrose
pulmonaire idiopathique, en association avec la prednisolone par voie orale.
De
nombreuses nouvelles indications thérapeutiques secondaires sont actuellement
en cours
de développement à différentes phases cliniques, en particulier pour leur rôle
d'immuno-suppresseur par exemple en complément des IFNa pégylés/ribavirine
dans le
cadre du traitement de l'Hépatite C. On peut citer aussi : infections à
mycobactérie
atypique ; cancer du rein ; ostéopétrose ; sclérodermie généralisée ; hépatite
chronique à
virus B; hépatite chronique à virus C; différentes infections virales dont à
papillomavirus ; choc septique ; dermatite allergique ; la polyarthrite
rhumatoïde ;
cancer de l'ovaire ; la fibrose du foie ; l'asthme ; et le lymphome.
Les principaux effets indésirables des IFNs sont dose-dépendants et donc
étroitement
liés au rythme d'administration. Ces effets sont cumulatifs et s'aggravent
avec le temps.
Outre la toxicité aiguë entraînant après injection (2 à 8 heures après
injection sous
cutanée) malaises, nausées et vomissements, les effets indésirables les plus
fréquents
sont les symptômes pseudo-grippaux (frissons, céphalées, asthénie), les
réactions
inflammatoires au site d'injection et l'élévation des transaminases du foie.
Les effets
indésirables les plus sérieux sont des cas de dépressions, lymphopénies ou de
rares cas
de nécrose au site d'injection sous-cutanés. Chez des malades traités avec de
fortes
doses d'IFN, un diabète peut survenir après le début du traitement. En outre,
la
tolérance de l'injection d'IFN est parfois limitée dans le temps et se traduit
par le
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développement d'anticorps neutralisants (chez approximativement 10-20% des
patients).
La demi-vie de l'IFNy humain recoinbinant in vivo est de 25-35 min seulement.
Pour
cette raison, un traitement efficace avec l'IFNy implique des injections
fréquentes. Dès
1990, et l'utilisation de l'IFNy humain recombinant commercialisé sous le nom
d'Actimmune (Intermune inc), le besoin d'améliorer la demi-vie de l'IFNy s'est
fait
ressentir, d'autant plus que de tous les interférons la stabilité thermique de
l'IFNy est la
plus faible. Un IFNy plus stable permettrait en effet une fréquence
d'administration
moins importante, ce qui améliorerait le confort du patient. Un IFNy plus
stable
permettrait également un meilleur effet in vivo, puisque l'effet in vivo est
la
conséquence de la combinaison entre l'activité spécifique de la protéine et sa
durée
d'action. Les intérêts économiques à améliorer la stabilité de l'IFNy sont
donc clairs :
une molécule plus stable (soit parce qu'il s'agit d'un variant, soit parce que
des additifs
sont ajoutés à la molécule, soit parce que la formulation est améliorée,
etc...) pourra
permettre d'obtenir des médicaments de seconde génération, susceptibles de
remplacer
les molécules actuellement sur le marché. On peut même considérer qu'un IFNy
plus
stable permettrait d'étendre les indications de cette molécule : En effet,
dans le cas d'un
certain nombre de pathologies, les IFNa et (3, entre autres molécules, ont
constitué le
traitement de référence. L'IFNy n'a pas été retenu en raison de sa durée de
vie trop
courte. Enfin, à plus long terme, on peut espérer qu'un IFNy stabilisé puisse
permettre
des formulations différentes d'administration de la molécule (forme orale
notamment).
De nombreux travaux de recherche ont déjà été menés sur l'IFNy :
Variants naturels de l'IFNy
Plusieurs formes mutées naturelles ont été décrites. L'une de ces formes est
celle
incluant la séquence N-terminale CYC. Deux variants naturels de l'IFNy humain
présentant une mutation ponctuelle ont également été décrits K29Q et R160Q
(Nishi et
al. (J. Biochem. 97:153-159, 1985). Mais ces polymorphismes ne sont associés
pour
l'instant à aucun effet.
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Mutants artificiels de l'IFNy
US 4,832,959 contient des polypeptides avec des séquences partielles de 1'IFNy
humain
comprenant les résidus 1-127, 5-146 et 5-127 de l'IFNy mature et possédant les
3 acides
aminés additionnels CYC.
US 6,120,762 décrit un fragment peptidique conlprenant les résidus 118-157 de
l'IFNy
précurseur et son utilisation.
W02004005341 décrit les méthodes pour générer et produire une série de mutants
actifs de l'IFNy comprenant les 143 acides aminés de la forme mature de l'IFNy
sans
CYC avec une variation comprenant au moins une des mutations dans le groupe S
155 et
S165 et au moins une mutation dans le groupe R160, R162 et R163. Ces mutants
seraient utiles notamment dans le traitement de la fibrose pulmonaire
idiopathique.
De nombreuses formes tronquées à divers endroits de la région C-terminale de
l'IFNy
ont été décrites. EP 0 219 781 décrit l'utilisation de séquences partielles
d'IFNy humain
comprenant les acides amines 3-124 de la protéine mature. L'importance des 20
derniers acides aminés sur l'activité et la stabilité de l'IFNy a constitué et
constitue
encore une source d'études controversées. Des IFNy humains avec l'extrémité C-
terminale tronquée ont été décrits par Slodowski et al qui ont réalisé des
troncatures de
taille différente (de 10 à 20 acides aminés tronqués) (Eur. J. Biochem.
202:1133-1140,
1991).
Dans le brevet EP 0 306870, des variants de l'IFNy ont été générés avec une
activité qui
est significativement augmentée en coupant de 7 à 11 résidus C-terminaux. De
plus, il
est connu que, lorsque l'IFNy est produit en cellules de mammifères, une
population
hétérogène de polypeptide IFNy est obtenue à cause de troncatures naturelles
par des
activités d'endo- et d'exo- protéases sécrétées par la cellule hôte
productrice. L'une des
façons de résoudre ce problème de'production est décrit dans le brevet US
6,958,388 :
cela consiste à produire un IFNy tronqué contenant les 155 premiers acides
aminés de la
protéine totale associée par exemple aux mutations améliorant la glycosylation
de la
molécule (S122T, E61N+S63T).
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WO 2004/022593 analyse in silico des séquences de nombreuses protéines à visée
thérapeutique, y compris l'IFNy, pour l'existence de sites de protéolyse
sensibles à des
protéases présentes dans le sérum humain (telles que la trypsine,
l'endoprotéinase Asp-
N, la chyniotrypsine et la proline endopeptidase). Les mutations censées
apporter une
protection contre les protéases citées sont les suivantes : L53V, L531, K57Q,
K57N,
K60Q, K60N, E61Q, E61N, E61H, E62Q, E62N, E62H, K78Q, K78N, K81Q, K81N,
K84Q, K84N, D85Q, D85N, D86Q.
Les améliorations (activité ou stabilité) susceptibles d'être apportées par
ces mutations
n'ont à ce jour pas été vérifiées expérimentalement pour aucun de ces mutants
: il ne
s'agit donc ici que de théories scientifiques.
Mutants de l'IFNy avec une amélioration de la thermostabilité
On sait que l'IFNy (sous forme monomérique en particulier) est peu stable.
Cela se
traduit par une sensibilité importante de la protéine dite sauvage à deux
critères : pH
acide et température. Il est attendu que la stabilité accrue de mutants dans
ces conditions
non physiologiques sera associée au même gain de stabilité dans les conditions
physiologiques. Des travaux ont ainsi porté sur la recherclie de mutants ayant
en
premier lieu gagné en thermostabilité, ce paramètre étant le plus simple à
mesurer.
WO 92/08737 décrit des variants de l'IFNy comprenant une méthionine
additionnelle
en N-terminal en position -1, les 132 premiers acides aminés de la séquence
mature
sans CYC, le 133ème acide aminé étant une leucine au lieu d'une glutamine. Ce
variant,
tronqué des 10 acides aminés C-terminaux de l'IFNy, est appelé Delta 10 L ou
encore
C 10L. Il aurait une activité biologique améliorée et présente une stabilité à
la
température légèrement améliorée (tm 55 C) comparée à l'IFNy sauvage (tm = 52-
53 C).
US 4,898,931 décrit une série de mutants de l'IFNy produit chez E.coli avec
des
troncatures des 9 derniers résidus C-terminaux couplées aux mutations de
certains
acides aminés N- et C-terminaux. Ces mutations introduisent des ponts
disulfures qui
confèrent alors à ces molécules des propriétés thermostables tout en
conservant une
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activité anti-virale et anti-tumorale. Dans ce brevet, les acides aminés CYC
font partie
de la protéine mature et des variants des cystéines de ce triplet ont été
réalisés.
Sauvage (séquence totale) 25% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C
Mutation M157C + Delta 9 81% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C
Mutation C21S-M157C et Delta 9 86% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C
Mutation C23S-M157C et Delta 9 98% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C
Mutation C21S-C23S-M157C et Delta 9 23% d'activité résiduelle après 1 h à 50 C
US 6,046,034 décrit des variants therrnostables de l'IFNy humain pour lesquels
des
paires de cystéines ont été incorporées à des endroits précis de la structure
de l'IFNy de
façon à créer des ponts disulfures inter-monomère et intra-monomère et ainsi
assurer la
stabilisation de l'homodimère d'IFNy. La seule paire de cystéines qui permet
la
conservation de l'activité biologique de l'IFNy est E30C-S92C qui relie les
hélices A et
D d'un même monomère, les autres paires de cystéines inter-monomère détruisant
l'activité biologique de l'IFNy. Dans ce brevet, ces mutants possèdent aussi
une
extrémité C-terminale tronquée correspondant au mutant Delta 10.
La modification de l'IFNy par ajout de polymères a été reportée par Kita et
al. (Drug
Des. Deliv. 6:157-167, 1990), et dans les brevets EP 236987 et US 5,109,120.).
WO 99/03887 décrit des variants de protéines de la super-famille structurale
de
l'hormone de croissance (dont fait partie l'IFNy). Dans ce brevet, certains
résidus non
essentiels de la structure peptidique sont remplacés par une cystéine : l'IFNy
y est décrit
comme exemple de cette super-famille mais aucun exemple expérimental de
modifications n'est décrit dans le cas de l'IFNy.
WO 01/36001 décrit de nouvelles molécules d'IFNy modifiées par insertions de
sites de
glycosylations et/ou de dérivation par des entités type PEG. Ces molécules ont
des
propriétés améliorées telles qu'une demi-vie améliorée et/ou une bio-
disponibilité
améliorée.
W003002152 décrit une composition pharmaceutique contenant un dérivé
sulfoalkyl
éther cyclodextrine d'interféron, dont la stabilité serait améliorée.
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Aucun de ces variants n'est pour l'instant disponible sous forme de
médicament. C'est
pour cette raison qu'il existe toujours une forte demande pour un IFNy
amélioré, et
notamment un IFNy présentant une meilleure stabilité dans les conditions
physiologiques. Ce gain de stabilité en conditions physiologiques peut être
évalué par
un gain de stabilité à haute température.
Résumé de l'invention
La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un
fragment fonctionnel de celui-ci.
En particulier, la présente invention concerne une composition pharmaceutique
comprenant un variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel
de
celui-ci comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe
consistant
en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R,
et T95V, le variant ne portant pas de groupement non-peptidique attaché sur
le(s)
résidu(s) introduit(s) par la ou les premières substitution(s). Dans un mode
de
réalisation, le variant diffère d'un polypeptide présentant une séquence
sélectionnée
parmi les séquences SEQ ID Nos 2, 4 et 6 par au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9 ou 10
résidu(s), de préférence par 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s). Dans
un mode de
réalisation particulier, le variant présente une unique substitution. Dans un
autre mode
de réalisation, le variant comprend en outre au moins une autre substitution
sélectionnée
parmi le groupe constitué de M157C, G41S et M100N. Notamment, le variant peut
comprendre ou présenter une combinaison de deux substitutions sélectionnées
parmi le
groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C,
S122D, M100N, L126P, N58R, T95V, M157C et G41S. Dans un mode de réalisation
préféré, le variant comprend ou présente une combinaison de substitutions
sélectionnée
parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C +
E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C +
M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S,
E62C + F159C, E62C + D99Y, E62C + E116C, E62C + L158C, E62C + S74G, E62C +
R162C, E62C + S122D, E62C + M100N, E62C + L126P, E62C + N58R, E62C +
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T95V, E62C + M157C, E62C + G41S, F159C + D99Y, F159C + E116C, F159C +
L158C, F159C + S74G, F159C + R162C, F159C + S122D, F159C + M100N, F159C +
L126P, F159C + N58R, F159C + T95V, F159C + M157C, F159C + G41S, D99Y +
E116C, D99Y + L158C, D99Y + S74G, D99Y + R162C, D99Y + S122D, D99Y +
M100N, D99Y + L126P, D99Y + N58R, D99Y + T95V, D99Y + M157C, D99Y +
G41S, E116C + L158C, E116C + S74G, E116C + R162C, E116C + S122D, E116C +
M100N, E116C + L126P, El 16C + N58R, El 16C + T95V, E116C + M157C, El 16C +
G41S, L158C + S74G, L158C + R162C, L158C + S122D, L158C + M100N, L158C +
L126P, L158C + N58R, L158C + T95V, L158C + M157C, L158C + G41S, S74G +
R162C, S74G + S122D, S74G + M100N, S74G + L126P, S74G + N58R, S74G +
T95V, S74G + M157C, S74G + G41S, R162C + S122D, R162C + M100N, R162C +
L126P, R162C + N58R, R162C + T95V, R162C + M157C, R162C + G41S, S122D +
L126P, S122D + N58R, S122D + T95V, S122D + M157C, S122D + M100N, S122D +
G41S, L126P + N58R, L126P + T95V, L126P + M157C, L126P + M100N, L126P +
G41S, N58R + T95V, N58R + M157C, N58R + M100N, N58R + G41S, T95V +
M157C, T95V + M100N, T95V + G41S, M157C + M100N et M157C + G41S. Dans un
mode de réalisation encore plus préféré, le variant comprend ou présente une
combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C +
E62C,
S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C +
R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V,
S63C + M157C, S63C + G41S. Dans le mode de réalisation tout particulièrement
préféré, le variant comprend ou présente la combinaison S63C + G41S. Dans un
mode
de réalisation particulier, le variant ne présente pas de délétion de 1 à 11
résidus à
l'extrémité C-terminale. Dans un autre mode de réalisation particulier, le
variant
présente une délétion de 1 à 11 résidus à l'extrémité C-terminale. Dans un
mode de
réalisation particulier, le variant ne porte pas de groupement non-peptidique
sélectionné
parmi le groupe constitué d'une molécule polymère, d'une molécule
lipophilique, et
d'un agent organique de dérivatisation. Dans un autre mode de réalisation
particulier, le
variant porte un groupement non-peptidique sélectionné parmi le groupe
constitué d'une
molécule polymère, d'une molécule lipophilique, et d'un agent organique de
dérivatisation. Le groupement non-peptidique considéré est tout
particulièrement une
molécule polymère, de préférence un polyéthylène glycol. Dans un mode de
réalisation
particulier, le variant est glycosylé. Dans un autre mode de réalisation
particulier, le
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variant n'est pas glycosylé. Dans un mode de réalisation particulier, la
composition
pharmaceutique comprend en outre au moins un autre principe actif. L'au moins
un
autre principe actif est de préférence sélectionné parmi le groupe constitué
par un
anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un glucocorticoïde, un
agent
anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-allergique, un
vaccin, un
broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent
immunomodulateur,
une cytokine telle que l'interféron alpha ou béta, l'interleukine 1 ou 2, le
TNF (facteur
de nécrose tumorale), l'hydroxyurée, un agent aikylant, un antagoniste de
l'acide
folique, un antimétabolite du métabolisme des acides nucléiques, un poison
fusoral, un
antibiotique, un analogue de nucléotides, un rétinoïde, un inhibiteur de
lipoxygénase et
de cyclo-oxygénase, un acide fumarique et ses sels, un analgésique, un
spasmolytique,
et un antagoniste du calcium. Dans un mode de réalisation préféré, l'au moins
un autre
principe actif est un interféron de type I, notamment un interféron alpha ou
béta. La
composition pharmaceutique peut être formulée pour une administration orale,
parentérale (par exemple sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, ou
intradermique), sublinguale, topique, locale, intratrachéale, intranasale,
transdermique,
rectale, intraoculaire, ou intra- auriculaire.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique selon
la
présente invention en tant que médicament.
La présente invention concerne un produit comprenant une composition
pharmaceutique
selon la présente invention et un autre principe actif pour une préparation
combinée
destinée à une utilisation simultanée, séquentielle ou séparée en tant que
médicament
antiviral, antiprolifératif ou immunomodulateur. De préférence, l'autre
principe actif est
sélectionné parmi le groupe constitué par un anticorps, un agent anti-tumoral
ou de
chimiothérapie, un glucocorticoïde, un agent anti-histaminique, une hormone
adrénocorticale, un agent anti-allergique, un vaccin, un broncodilatateur, un
stéroïde, un
agent béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, une cytokine telle que
l'interféron alpha ou béta, l'interleukine 1 ou 2, le TNF (facteur de nécrose
tumorale),
l'hydroxyurée, un agent alkylant, un antagoniste de l'acide folique, un
antimétabolite du
métabolisme des acides nucléiques, un poison fusoral, un antibiotique, un
analogue de
nucléotides, un rétinoïde, un inhibiteur de lipoxygénase et de cyclo-
oxygénase, un acide
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fumarique et ses sels, un analgésique, un spasmolytique, et un antagoniste du
calcium.
Dans un mode de réalisation préféré, l'autre principe actif est un interféron
de type I,
notamment un interféron alpha ou béta. Les deux principes actifs peuvent être
administrés par la même voie d'administration ou par deux voies
d'administration
distinctes. Dans un mode de réalisation particulier, le médicament est destiné
au
traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose
chronique
familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie
atypique, le
cancer du rein, l'ostéopétrose, une sclérodermie généralisée, une hépatite
chronique à
virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite
rhumatoïde.
La présente invention concerne en outre l'utilisation d'une composition
pharmaceutique
selon la présente invention pour la préparation d'un médicament antiviral,
antiprolifératif ou immunomodulateur. Dans un mode de réalisation préféré, le
médicament est destiné au traitement d'une pathologie sélectionnée parmi
l'asthme, la
granulomatose chronique familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une
infection à
mycobactérie atypique, le cancer du rein, l'ostéopétrose, une sclérodermie
généralisée,
une hépatite chronique à virus B ou C, un choc septique, une dermatite
allergique, et
l'arthrite rliumatoïde.
La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant
thermostable de
l'IFNy tel que décrit dans les compositions ci-dessus. Elle concerne également
une
cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention, un
vecteur
comprenant un acide nucléique ou une cassette d'expression selon la présente
invention,
et une cellule hôte comprenant un acide nucléique, une cassette d'expression
ou un
vecteur selon la présente invention. Elle concerne enfin l'utilisation d'un
tel acide
nucléique, d'une telle cassette d'expression, d'un tel vecteur ou d'une telle
cellule hôte
pour produire un variant thermostable de l'IFNy tel que décrit dans les
compositions ci-
dessus.
Brève description des figures et tableaux
Figure 1: Schéma du vecteur pNCK utilisé pour la génération des banques de
mutants
et leur sélection dans Thermus thermophilus.
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Figure 2: Résultats de l'analyse fonctionnelle des simples mutants de l'IFNy
sélectionnés par Thernzus thermophilus - Analyse thermostabilité (% d'activité
résiduelle panneau A), activité totale relative par rapport à la protéine
sauvage (panneau
B) et indice d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par
activité totale
relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100) (panneau C).
Figure 3: Résultats de l'analyse fonctionnelle des simples mutants de l'IFNy
issus des
positions doubles et multiples sélectionnées par Thermus therinophilus -
Analyse
thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A), activité totale relative
par rapport à
la protéine sauvage (panneau B) et indice d'amélioration défini par produit
(activité
résiduelle par activité totale relative vis-à-vis de la protéine sauvage /100)
(panneau C).
Figure 4: lère partie des résultats d'analyse fonctionnelle des simples
mutants ponctuels
de l'IFNy générés de façon systématique et ayant été améliorés pour leur
stabilité et/ou
leur activité - Analyse thermostabilité (% d'activité résiduelle panneau A),
activité
totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et indice
d'amélioration
défini par produit (activité résiduelle par activité totale relative vis-à-vis
de la protéine
sauvage /100) (panneau C).
Figure 5: 2ème partie des résultats d'analyse fonctionnelle des simples
mutants
ponctuels de l'IFNy générés de façon systématique et ayant été améliorés pour
leur
stabilité et/ou leur activité - Analyse thermostabilité (% d'activité
résiduelle panneau
A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et
indice
d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale
relative vis-à-vis
de la protéine sauvage /100) (panneau C).
Figure 6: 3ème partie des résultats d'analyse fonctionnelle des simples
mutants
ponctuels de l'IFNy générés de façon systématique et ayant été améliorés pour
leur
stabilité et/ou leur activité - Analyse thermostabilité (% d'activité
résiduelle panneau
A), activité totale relative par rapport à la protéine sauvage (panneau B) et
indice
d'amélioration défini par produit (activité résiduelle par activité totale
relative vis-à-vis
de la protéine sauvage /100) (panneau C).
Figure 7: Evaluation de la thermostabilité des variants protéiques de l'IFNy
humain par
mesure de leur demi-vie in vitro lors d'une cinétique de dénaturation
thermique à 59 C
en présence d'une concentration de SVF ajustée. Ces mesures consistent au
suivi en
fonction du temps de dénaturation à 59 C de la conservation de l'activité de
l'IFNy. Ces
CA 02644127 2008-08-28
WO 2007/101949 PCT/FR2007/000419
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données nous permettent de calculer la demi-vie in vitf=o de ces molécules
dans ces
conditions. Ces calculs de demi vie sont répertoriés dans le tableau N 3.
Figure 8 : Pharmacocinétique de variants thermostables de l'IFNy humain après
administration par voie intraveineuse. Le suivi de la quantité d'IFNy est
réalisé par un
test ELISA sur des prélèvements de sérum de souris C57BL/6 après injection
intraveineuse de 100 l à 10 g/ml.
Figure 9: Exemple de pharmacocinétique de variants thermostables de l'IFNy
humain
après administration par voie sous-cutanée. Le suivi de la concentration
plasmatique en
IFNy gamma est réalisé par quantification ELISA sur des prélèvements de sérum
de
souris C57BL/6 après injection en sous-cutané de 100 l à 6,7 g/ml.
Tableau 1 : Mutants issus de la sélection primaire de la banque de l'IFNy dans
Thermus
thern2ophilus. Les numéros correspondent à la position de la mutation dans la
forme du
précurseur de 166 résidus.
Tableau 2 : Mutants validés en test de sélection secondaire dans Thermus thef
n2ophilus.
Les numéros correspondent à la position de la mutation dans la forme du
précurseur de
166 résidus.
Tableau 3: Récapitulatif des calculs de demi-vie in vitro des variants
thermostables
de l'IFNy lors des expériences d'inactivation thermique à 59 C et calcul du
ratio
d'amélioration des demi-vies des variants par rapport à la demi-vie de l'IFNy
sauvage
produit en CHO.
Tableau 4 : Récapitulatif de calculs de demi-vie terminale d'élimination des
variants
thermostables de IFNy lors des expériences d'injection par voie intraveineuse
et calcul
du ratio d'amélioration des demi-vies des variants par rapport à la demi-vie
de IFNy
sauvage produit en CHO. Les demi-vies terminales d'élimination (T1/2i.v) ont
été
calculées à l'aide du logiciel Kinetica Vs 4.4 en modélisant l'administration
par IV
bolus dans un système non compartimenté.
Tableau 5: Récapitulatif des calculs de l'aire totale sous la courbe (AUC tot.
s.c) et des
demi-vies d'élimination (Tl/2. s.c) lors des expériences d'injection par voie
sous-
cutanée. Calcul des ratios d'amélioration respectif de l'aire totale sous la
courbe et des
demi-vies des variants par rapport à l'aire totale sous la courbe et la demi-
vie de IFNy
sauvage produit en CHO. Ces paramètres ont été calculés à l'aide du logiciel
Kinetica
Vs 4.4.
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Description détaillée de l'invention
La présente invention concerne des variants de l'interféron gamma humain
(IFNy) dont
la stabilité, en particulier la stabilité thermique, est accrue par rapport à
l'IFNy sauvage.
Les variants protéiques de l'IFNy de cette invention ont été obtenus en
couplant la
génération d'une grande diversité de inutations par évolution dirigée à une
méthode de
sélection directe des variants améliorées pour leur thermostabilité. La
stabilité face à la
dénaturation thermique des candidats améliorés ainsi que la conservation de
leur activité
a été validée par des tests biologiques. Les variants de cette invention
constituent des
alternatives aux IFNy recombinants actuellement utilisés dans le domaine
thérapeutique,
notamment dans les traitements de la granulomatose chronique et de la fibrose
pulmonaire idiopathique.
Compte-tenu des doutes résidants sur la présence des acides aminés CYC en N-
terminal
de la protéine mature de l'IFNy, et de ce fait sur la numération correspondant
aux acides
aminés de la protéine mature, la numérotation adoptée dans la présente demande
sera
celle qui tient compte de l'ensemble des résidus de l'IFNy avec la séquence du
peptide
signal incluse (numérotation en acides aminés totaux de 1 pour la méthionine N-
terminale peptide signal inclus à 166 pour la glutamine de l'extrémité C-
terminale de
l'interféron - la séquence SEQ ID No 2). La position de la substitution dans
les deux
autres formes (mature sans CYC, SEQ ID No 4, ou avec CYC, SEQ ID No 6) pourra
facilement être déterminée par l'homme du métier.
La terminologie utilisée pour désigner une substitution est la suivante. C21 G
indique la
substitution du résidu cystéine en position 21 de la SEQ ID No 2 par une
glycine. Les
termes substitution et mutation sont interchangeables. Le signe +
indique une
combinaison de deux substitutions.
La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un
fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution décrite
dans le
tableau 1, le tableau 2 et les figures 2 à 9.
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La présente invention concerne de préférence un variant thermostable de l'IFNy
humain
ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution
sélectionnée parmi un des groupes consistant en :
(a) C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, S23C, Q24A, D25V, P26D, V28C, G411, G41S,
H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L511, L531, G54Q, G54S, G54T,
K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C,
Q69F, Q69T, V731, S74G, Y76D, K78Q, L79V, F80V, K811, D86C, D86Q, D86H,
D861, D86V, Q871, Q87P, S88N, S88Q, T95A, T95V, T95F, 196L, K971, K97R, E98K,
D99N, D99C, D99Q, D99E, D991, D99M, D99S, D99T, D99W, D99Y, D99V, M100I,
M100V, M100N, N101G, N101H, N101F, N101V, K103R, N106D, N106Q, N106G,
S107C, S107G, S107E, K109C, K109Q, K109L, K11OH, D113S, E116C, E116Q,
E116H, E116I, E116V, T119C, T119I, T119M, T119V, T119Y, T119P, N120Q,
N120E, N120L, N120T, Y121T, S122D, S122C, S122E, S122I, S122L, S122K, S122P,
S122H, V123T, V123H, V123P, T124C, T124H, L126R, L126I, L126K, L126P,
L126T, L126V, N127A, N127R, N127Q, N127E, N127G, N127I, N127K, N127F,
N127S, N127W, N127Y, V128I, V128Y, Q129R, Q129C, Q129H, Q129I, Q129Y,
Q129V, R130Q, R130L, R130K, R130T, K131M, K131I, E135V, M140P, A141H,
A141V, E142F, L143I, S144G, S144L, S144W, S144V, A146K, A146M, A147R,
A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P, A147S, T149E, T149M, K151A,
K151C, K151H, K151S, K151V, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L158I,
F159C, F159V, R160A, R162D, R162E, R162Q, R162C, R162I, R162L, R162K,
R162V,R163T, R163L, R163G, A164G, A164S, A164E et S165V ou une combinaison
de ceux-ci; ou
(b) C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G411, G41S,
H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L511, K57S, N58R, N58C, N58H,
N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C,
K109Q, K109L, K11OH, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V,
M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P,
A147S, M157Q, M157W, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A,
R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V ou une combinaison
de ceux-ci ; ou
(c) L531, G54Q, G54S, G54T, Q69F, Q69T, V731, S74G, K78Q, L79V, F80V, K81I,
D86C, D86Q, D86H, D861, D86V, Q87I, Q87P, S88N, S88Q, T95A, T95V, T95F,
CA 02644127 2008-08-28
WO 2007/101949 PCT/FR2007/000419
196L, K971, K97R, D99N, D99C, D99Q, D99E, D991, D99M, D99S, D99T, D99W,
D99Y, D99V, M100I, M100V, N101G, N101H, N101F, N101V, K103R, N106D,
N106Q, N106G, S107C, S107G, S107E, D113S, E116C, E116Q, E116H, E116I,
E116V, T119C, T119I, T119M, T119V, N120Q, N120E, N120L, N120T, S122D,
S122C, S122E, S1221, S122L, S122K, S122P, V 123 T, V123H, V 123 P, T124C,
T124H,
L126R, L126I, L126K, L126P, L126T, L126V, N127A, N127R, N127Q, N127E,
N127G, N127I, N127K, N127F, N127S, N127W, N127Y, V128I, V128Y, Q129R,
Q129C, Q129H, Q129I, Q129Y, Q129V, R130Q, R130L, R130K, R130T, K131I,
K131M, A141H, A141V, E142F, L143I, S144G, S144L, S144W, S144V, T149E,
T149M, K151A, K151C, K151H, K151S, K151V, R162C, R162E, R162I, R162L,
R162K, R162V, A164G, A164S ou une combinaison de ceux-ci ; ou
(d) S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R,
et T95V.
Par comprendre est entendu que le variant ou le fragment de celui-ci
présente une ou
plusieurs substitutions telles qu'indiquées par rapport aux séquences
polypeptidiques
SEQ ID Nos 2, 4 et 6, mais qu'il peut présenter d'autres modifications,
notamment des
substitutions, des délétions ou des additions.
Par présenter est entendu que le variant ou le fragment de celui-ci ne
comporte que
la ou les substitution(s) indiquée(s) par rapport aux séquences
polypeptidiques SEQ ID
Nos 2, 4 et 6.
La présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un
fragment fonctionnel de celui-ci comprenant une combinaison de substitutions
sélectionnées dans les groupes mentionnés ci-dessus. La combinaison peut
consister en
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions sélectionnées dans ce groupe. Par
ailleurs, le
variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention peut
comprendre
d'autres mutations non-décrites dans ce groupe, de préférence des
substitutions,
notamment certaines connues dans le domaine. A titre d'illustration, les
substitutions
connues sont décrites dans WO 92/08737, WO 99/03887, WO01/36001, W002/81507,
W003/002152, W02004/005341, W02004/022593, US 6,958,388, US 4,898,931, US
6,046,034 et W02006/120580.
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Par exemple, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy
humain
ou un fragment fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une substitution
sélectionnée parmi le groupe consistant en C21W, Q24A, D25V, P26D, V28C, G411,
G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H,
K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, K109C, K109L, K109Q, K11OH,
E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S,
A147E, M157W, M157Q, M157L, L158C, L158I, L158W, F159C, F159V, R160A,
R162D, R162Q et R162E ou une combinaison de ceux-ci. Dans un autre exemple, la
présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy humain ou un
fragment
fonctionnel de celui-ci comprenant au moins une des mutations sélectionnées
parmi le
groupe consistant en Q24A, P26D, V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H,
K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y, K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K,
A146M, A147R, A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157L,
L1581, F159C, F159V, R160A, R162E, R162Q et R162D ou une combinaison de ceux-
ci.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la présente invention
concerne un
variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci
comprenant au moins une première substitution sélectionnée parmi le groupe
consistant
en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R,
et T95V. Dans un mode de réalisation préféré, le variant ne porte pas de
groupement
non-peptidique attaché sur le(s) résidu(s) introduit(s) par ladite ou lesdites
premières
substitutions. Ce variant peut comprendre en outre au moins une autre
substitution
sélectionnée parmi le groupe constitué de M157C, G41S et M100N.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne également un
variant
thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci
présentant soit
une unique substitution C23S ou M157C, soit une substitution C23S ou M157C en
combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe
consistant en C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G411,
G41S, H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L511, K57S, N58R, N58C,
N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N,
CA 02644127 2008-08-28
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K109C, K109Q, K109L, K11OH, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I,
E135V, M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M,
A147P, A147S, M157Q, M157L, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V, R160A,
R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E, S165V, L531, G54Q, G54S,
G54T, Q69F, Q69T, V731, S74G, K78Q, L79V, F80V, K81I, D86C, D86Q, D86H,
D861, D86V, Q87I, Q87P, S88N, S88Q, T95A, T95V, T95F, 196L, K971, K97R, D99N,
D99C, D99Q, D99E, D991, D99M, D99S, D99T, D99W, D99Y, D99V, M100I,
M100V, N101G, N101H, N101F, N101V, K103R, N106D, N106Q, N106G, S107C,
S107G, S107E, D113S, E116C, E116Q, E116H, E116I, E116V, T119C, T119I, T119M,
T119V, N120Q, N120E, N120L, N120T, S122D, S122C, S122E, S122I, S122L,
S122K, S122P, V123T, V123H, V123P, T124C, T124H, L126R, L126I, L126K,
L126P, L126T, L126V, N127A, N127R, N127Q, N127E, N127G, N1271, N127K,
N127F, N127S, N127W, N127Y, V128I, V128Y, Q129R, Q129C, Q129H, Q129I,
Q129Y, Q129V, R130Q, R134L, R130K, R130T, K131I, K131M, A141H, A141V,
E142F, L143I, S144G, S144L, S144W, S144V, T149E, T149M, K151A, K151C,
K151H, K151S, K151V, R162C, R162E, R162I, R162L, R162K, R162V, A164G et
A164S. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un
variant
thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci
présentant soit
une unique substitution C23S ou M157C, soit une substitution C23S ou M157C en
combinaison avec une ou plusieurs substitutions sélectionnées parmi le groupe
consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D,
L126P, N58R, M100N, T95V et G41S. Dans un mode de réalisation encore plus
préféré, la présente invention concerne un variant thermostable de l'IFNy
humain ou un
fragment fonctionnel de celui-ci présentant soit une unique substitution
M157C, soit
une substitution M157C en combinaison avec une ou plusieurs substitutions
sélectionnées parmi le groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C,
L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, M100N, T95V et G41S.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne un variant
thermostable de
1'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une unique
substitution sélectionnée parmi un des groupes consistant en :
(a) C21G, C21W, Y22D, Y22T, Y22S, C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G41I, G41S,
H42D, S43C, S43G, S43T, G49K, T50Y, L51H, L511, K57S, N58R, N58C, N58H,
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N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D, E98K, M100N, K109C,
K109Q, K109L, K11OH, T119Y, T119P, Y121T, S122H, S122P, K131I, E135V,
M140P, A146K, A146M, A147R, A147G, A147E, A147F, A147L, A147M, A147P,
A147S, M157Q, M157W, M157L, M157C, L158W, L158C, L158I, F159C, F159V,
R160A, R162D, R162E, R162Q, R163T, R163L, R163G, A164E et S165V. ou
(b) L531, G54Q, G54S, G54T, Q69F, Q69T, V731, S74G, K78Q, L79V, F80V, K81I,
D86C, D86Q, D86H, D861, D86V, Q871, Q87P, S88N, S88Q, T95A, T95V, T95F,
196L, K971, K97R, D99N, D99C, D99Q, D99E, D991, D99M, D99S, D99T, D99W,
D99Y, D99V, M100I, M100V, N101G, N101H, N101F, N101V, K103R, N106D,
N106Q, N106G, S107C, S107G, S107E, D1135, E116C, E116Q, E116H, E1161,
E116V, T119C, T1191, T119M, T119V, N120Q, N120E, N120L, N120T, S122D,
S122C, S122E, S1221, S122L, S122K, S 122P, V 123 T, V123H, V 123 P, T124C,
T124H,
L126R, L1261, L126K, L126P, L126T, L126V, N127A, N127R, N127Q, N127E,
N127G, N127I, N127K, N127F, N127S, N127W, N127Y, V128I, V128Y, Q129R,
Q129C, Q129H, Q129I, Q129Y, Q129V, R130Q, R130L, R130K, R130T, K131I,
K131M, A141H, A141V, E142F, L143I, S144G, S144L, S144W, S144V, T149E,
T149M, K151A, K151C, K151H, K151S, K151V, R162C, R162E, R1621, R162L,
R162K, R162V, A164G et A164S; ou
(c) S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R,
et T95V.
Par exemple, la substitution est sélectiomiée parmi le groupe consistant en
C21W,
C23S, Q24A, D25V, P26D, V28C, G411, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S,
N58R, N58C, N58H, N58Y, W59F, K60H, K60R, E61K, E62C, S63R, S63C, Y76D,
E98K, K109C, K109L, K109Q, K110H, E135V, M140P, A146K, A146M, A147R,
A147G, A147L, A147M, A147P, A147S, A147E, M157W, M157Q, M157C, M157L,
L158C, L1581, L158W, F159C, F159V, R160A, R162D, R162Q et R162E. Notamment,
la substitution peut être sélectionnée parmi le groupe consistant en C23S,
Q24A, P26D,
V28C, G41I, G41S, H42D, G49K, T50Y, L51H, K57S, N58R, N58C, N58H, N58Y,
K60H, K60R, E61K, E62C, S63C, K109C, A146K, A146M, A147R, A147G, A147L,
A147M, A147P, A147S, A147E, M157Q, M157C, M157L, L158I, F159C, F159V,
R160A, R162E, R162Q et R162D. . De préférence, la présente invention concerne
un
variant thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci
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présentant une unique substitution sélectionnée parmi le groupe consistant en
S63C,
E62C, F159C, D99Y, El 16C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, et T95V.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne un variant
thermostable de
l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci présentant une
combinaison de
substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en C21G+F159C,
A147E+R162D,
M100N+T119Y, Y76D+K131I, T50Y+Y121T+M140P, P26D+S122P,
Y22S+L158W+R163G, Y22D+S122H, R162Q+A164E, et
Y22T+K109C+T119P+A147F+R163L.
Dans un autre mode de réalisation, la présente invention concerne un variant
thermostable de l'IFNy humain ou un fragment fonctionnel de celui-ci
comprenant ou
présentant une combinaison de deux substitutions sélectionnée parmi le groupe
consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D,
M100N, L126P, N58R, T95V, M157C et G41S, de préférence une combinaison
sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C +
D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D,
S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C
+ G41S, E62C + F159C, E62C + D99Y, E62C + E116C, E62C + L158C, E62C +
S74G, E62C + R162C, E62C + S122D, E62C + M100N, E62C + L126P, E62C +
N58R, E62C + T95V, E62C + M157C, E62C + G41S, F159C + D99Y, F159C +
E116C, F159C + L158C, F159C + S74G, F159C + R162C, F159C + S122D, F159C +
M100N, F159C + L126P, F159C + N58R, F159C + T95V, F159C + M157C, F159C +
G41S, D99Y + E116C, D99Y + L158C, D99Y + S74G, D99Y + R162C, D99Y +
S122D, D99Y + M100N, D99Y + L126P, D99Y + N58R, D99Y + T95V, D99Y +
M157C, D99Y + G41S, E116C + L158C, E116C + S74G, E116C + R162C, E116C +
S122D, E116C + M100N, E116C + L126P, E116C +N58R, E116C + T95V, E116C +
M157C, E116C + G41S, L158C + S74G, L158C + R162C, L158C + S122D, L158C +
M100N, L158C + L126P, L158C + N58R, L158C + T95V, L158C + M157C, L158C +
G41S, S74G + R162C, S74G + S122D, S74G + M100N, S74G + L126P, S7.4G +
N58R, S74G + T95V, S74G + M157C, S74G + G41S, R162C + S122D, R162C +
M100N, R162C + L126P, R162C + N58R, R162C + T95V, R162C + M157C, R162C +
G41S, S122D + L126P, S122D + N58R, S122D + T95V, S122D + M157C, S122D +
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M100N, S122D + G41S, L126P + N58R, L126P + T95V, L126P + M157C, L126P +
M100N, L126P + G41S, N58R + T95V, N58R + M157C, N58R + M100N, N58R +
G41S, T95V + M157C, T95V + M100N, T95V + G41S, M157C + M100N et M157C +
G41 S. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un
variant
comprenant ou présentant une combinaison de substitutions sélectionnée parmi
le
groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C,
S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C
+ L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S, de préférence
la combinaison S63C + G41 S.
Les séquences SEQ ID Nos 1-6 décrivent les séquences protéiques de l'IFNy
humain
précurseur et mature ainsi que des séquences nucléiques codant celles-ci. Dans
un mode
de réalisation préféré, le variant selon la présente invention correspond à la
protéine
précurseur de 166 acides aminés (SEQ ID No 2), ou à la protéine mature avec ou
sans le
tripeptide CYC (SEQ ID Nos 6 et 4, respectivement) comprenant au moins une
substitution ou une combinaison de substitutions selon la présente invention.
Par
variant est notamment entendu un polypeptide différant d'un polypeptide
présentant
une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 2, 4 et 6 par au
moins 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s), de préférence par 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9 ou 10
résidu(s).
Par fragment fonctionnel est entendu un fragment de I'IFNy humain
présentant
l'activité de l'IFNy humain. Par exemple, ce fragment peut correspondre à
I'IFNy
humain précurseur ou mature, avec ou sans le tripeptide CYC, avec une délétion
C-
terminale de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19
ou 20 acides
aminés, de préférence de 1 à 15 résidus, de manière encore plus préféré de 1 à
11
résidus. Le fragment peut comprendre 100, 110, 120, 130 ou 140 acides aminés
consécutifs de I'IFNy humain.
Par activité de l' IFNy humain est entendu la capacité de se fixer sur le
récepteur à
l'IFNy humain et provoquer la transduction du signal induit par la fixation de
l'IFNy
humain à son récepteur comnie déterminé in vitro ou in vivo. L'activité de
I'IFNy
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humain peut être mesurée par les méthodes décrites ci-après dans la
description et dans
les exemples.
Les variants selon la présente invention présentent une augmentation de la
thermostabilité par rapport à l'IFNy humain sauvage. Cette augmentation est
d'au moins
%, de préférence au moins 10, 20 ou 30 %. Par thermostabilité , est entendu
la
capacité de la protéine à conserver son activité après avoir été soumise à
l'action de la
chaleur. Par exemple, la protéine peut être incubée 10 minutes à 59 C. La
thennostabilité du variant est alors estimée par le pourcentage d'activité
résiduelle après
ce prétraitement. Cette mesure de la thermostabilité d'un variant est alors
comparée à la
même valeur obtenue en utilisant l'IFNy sauvage soumis aux mêmes conditions.
Un variant qui présente une thermostabilité améliorée mais une activité
réduite peut être
utilisable. De préférence, les variants thermostables de la présente invention
conservent
une activité (condition sans prétraitement) qui correspond à au moins 10 % de
l'activité
de l'IFNy humain sauvage, de préférence à au moins 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80
ou 90 %
de l'activité de l'IFNy humain sauvage. Dans un mode de réalisation
particulièrement
préféré, les variants thermostables de la présente invention conservent une
activité
équivalente à celle de l'IFNy humain sauvage, voire augmentée.
Un facteur intéressant de sélection des variants d'intérêt est l'activité
relative du variant
multiplié par le pourcentage d'activité résiduelle.
Par groupement non-peptidique est entendu une molécule non-peptidique qui
peut
être attaché à la chaîne latérale d'un acide aminé de l'IFNy humain. Cette
molécule peut
être une molécule polymère, une molécule lipophilique, un carbohydrate ou un
agent
organique de dérivatisation. Le carbohydrate peut être attaché à l'IFNy par
glycosylation in vitro ou in vivo, par exemple par N- ou 0-glycosylation. Une
molécule
lipophilique peut être par exemple un acide gras saturé ou insaturé, un
terpène, une
vitamine, un stéroïde ou caroténoïde. Une molécule polymère peut être un
polyol, un
polyamine, un polycarbocylique acide ou un polyalkylène oxyde, en particulier
un
polyéthylène glycol (PEG). Ce type de molécules est bien connu de l'homme du
métier.
Un variant portant un groupe PEG sera désigné comme étant peggylé .
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Le variant de l'IFNy humain selon la présente invention peut être glycosylé,
de
préférence aux positions 48 et 120. Dans un autre mode de réalisation, le
variant peut ne
pas être glycosylé. Lorsque le variant comprend la substitution G41 S, il peut
être
glycosylé en position N39 par une N-glycosylation. Dans un mode alternatif, un
tel
variant peut ne pas être glycosylé à cette position.
Dans un mode de réalisation, le variant peut être modifié par ajout d'une
molécule
polymère, en particulier par ajout de polymères (Kita et al., Drug Des. Deliv.
6:157-167,
1990; EP 236987 et US 5,109,120) ou par pégylation (W099/03887; Voir
W02004005341 e< Conjugation of a polymer molecule ). Dans un mode de
réalisation
préféré d'un variant de l'IFNy humain selon la présente invention, la molécule
polymère
est attachée à une position autre que les positions 41, 58, 62, 63, 74, 95,
99, 100, 116,
122, 126, 157, 158, 159 et 162. Notamment, la molécule n'est pas attachée à un
résidu
introduit par une substitution faite dans un variant selon la présente
invention, en
particulier une substitution sélectionnée parmi S63C, E62C, F159C, D99Y,
M100N,
E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, T95V, G41S et M157C.
Dans un autre mode de réalisation, le variant de la présente invention ne
porte pas de
molécule polymère. En particulier, il n'est pas peggylé.
L'activité in vitro de l'IFNy est généralement déterminée par la réduction de
l'effet
cytopathique de virus sur une lignée cellulaire par traitement avec des
quantités
croissantes d'IFNy. Il existe d'autres tests biologiques spécifiques de l'IFNy
(Meager,
Journal of immunological Methods, 261, (2002) 21-36 pour une revue). Ces
nouveaux
tests permettent notamment d'évaluer plus spécifiquement l'une des
caractéristiques de
l'activité pléiotrope de l'IFNy. Il existe également des tests d'activité in
vivo.
La réponse anti-virale à des doses d'IFNy peut être mesurée sur différents
couples de
systèmes (virus /lignée cellulaire adhérente répondant à l'IFNy et sensible au
virus
employé). Par exemple, on peut citer les couples suivants : VSV/MDBK ; VSV ou
EMCV/ A549; VSV, EMCV, SFV ou virus Sindbis/ WISH ; VSV ou EMCV/ HeLa ;
VSV, EMCV ou Mengovirus/ FS4, FS71, ou Hep2 ; VSV, EMCV, Mengovirus ou virus
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Sindbis/ FL ; EMCV/ 2D9, avec VSV = virus de la stomatite vésiculaire ; EMCV =
virus de l'encéphalomyocardite ; SFV = virus de la forêt de Semliki. De
préférence, les
virus utilisés seront le virus de la vaccine ou le virus de la chorioméningite
lymphocytaire (LCMV). Le virus de l'herpès sinlplex (HSV) et le
cytomégalovirus
peuvent également être utilisés.
L'activité de l'IFNy peut également être testée en utilisant un gène
rapporteur, par
exemple la luciférase, sous le contrôle d'un promoteur sensible à l'IFNy
contenant des
éléments GAS (gamma-interféron activation sites) ou ISRE (interferon
stimulated
response element) . Ainsi, le gène rapporteur est dosé suite à une stimulation
par l'IFNy.
Les vecteurs pGAS/Luciférase et pISRE/Luciférase sont disponibles
commercialement
(#219091, Stratagene). Dans un mode de réalisation préféré, la méthode avec le
vecteur
pGAS/luciférase est utilisée pour mesurer l'activité de l'IFNy.
L'augmentation de la thermostabilité de l'IFNy tout en conservant son activité
biologique permet d'envisager l'élaboration de traitements plus efficaces
permettant, à
activité biologique égale, une réduction des doses thérapeutiques utilisées,
et par là
même une réduction des effets secondaires associés au traitement. Cela permet
également des traitements à plus forte dose d'IFNy pour réduire les infections
virales
telles que l'herpès, ces traitements étant jusqu'ici inenvisageables avec ce
type de
molécules. Par ailleurs, les variants selon la présente invention peuvent
présenter
l'avantage d'avoir un temps de demi-vie plus long lors du stockage de ces
variants, et
donc une meilleure conservation, par rapport à l'IFNy sauvage, notamment à
température ambiante.
La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant
un
variant de l'IFNy thermostable selon la présente invention.
Ainsi, la présente invention concerne de préférence une composition
pharmaceutique
comprenant un variant de l'IFN7 thermostable ou un fragment fonctionnel de
celui-ci
comprenant au moins une substitution sélectionnée parmi le groupe consistant
en S63C,
E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C, S122D, L126P, N58R, et T95V,
le variant ne portant pas de groupement non-peptidique attaché sur le(s)
résidu(s)
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introduit(s) par la ou les premières substitution(s). Dans un mode de
réalisation, le
variant diffère d'un polypeptide présentant une séquence sélectionnée parmi
les
séquences SEQ ID Nos 2, 4 et 6 par au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10
résidu(s), de
préférence par 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 résidu(s). Dans un mode de
réalisation
particulier, le variant présente une unique substitution. Dans un autre mode
de
réalisation, le variant comprend en outre au moins une autre substitution
sélectionnée
parmi le groupe constitué de M157C, G41S et M100N. Notamment, le variant peut
comprendre ou présenter une combinaison de deux substitutions sélectionnées
parmi le
groupe consistant en S63C, E62C, F159C, D99Y, E116C, L158C, S74G, R162C,
S122D, M100N, L126P, N58R, T95V, M157C et G41S. Dans un mode de réalisation
préféré, le variant comprend ou présente une combinaison de substitutions
sélectionnée
parmi le groupe consistant en S63C + E62C, S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C +
E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C + R162C, S63C + S122D, S63C +
M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V, S63C + M157C, S63C + G41S,
E62C + F159C, E62C + D99Y, E62C + E116C, E62C + L158C, E62C + S74G, E62C +
R162C, E62C + S122D, E62C + M100N, E62C + L126P, E62C + N58R, E62C +
T95V, E62C + M157C, E62C + G41S, F159C + D99Y, F159C + E116C, F159C +
L158C, F159C + S74G, F159C + R162C, F159C + S122D, F159C + M100N, F159C +
L126P, F159C + N58R, F159C + T95V, F159C + M157C, F159C + G41S, D99Y +
E116C, D99Y + L158C, D99Y + S74G, D99Y + R162C, D99Y + S122D, D99Y +
M100N, D99Y + L126P, D99Y + N58R, D99Y + T95V, D99Y + M157C, D99Y +
G41S, E116C + L158C, E116C + S74G, E116C + R162C, E116C + S122D, E116C +
M100N, E116C + L126P, E116C + N58R, E116C + T95V, E116C + M157C, E116C +
G41S, L158C + S74G, L158C + R162C, L158C + S122D, L158C + M100N, L158C +
L126P, L158C + N58R, L158C + T95V, L158C + M157C, L158C + G41S, S74G +
R162C, S74G + S122D, S74G + M100N, S74G + L126P, S74G + N58R, S74G +
T95V, S74G + M157C, S74G + G41S, R162C + S122D, R162C + M100N, R162C +
L126P, R162C + N58R, R162C + T95V, R162C + M157C, R162C + G41S, S122D +
L126P, S122D + N58R, S122D + T95V, S122D + M157C, S122D + M100N, S122D +
G41S, L126P + N58R, L126P + T95V, L126P + M157C, L126P + M100N, L126P +
G41S, N58R + T95V, N58R + M157C, N58R + M100N, N58R + G41S, T95V +
M157C, T95V + M100N, T95V + G41S, M157C + M100N et M157C + G41S. Dans un
mode de réalisation encore plus préféré, le variant comprend ou présente une
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combinaison de substitutions sélectionnée parmi le groupe consistant en S63C +
E62C,
S63C + F159C, S63C + D99Y, S63C + E116C, S63C + L158C, S63C + S74G, S63C +
R162C, S63C + S122D, S63C + M100N, S63C + L126P, S63C + N58R, S63C + T95V,
S63C + M157C, S63C + G41S. Dans le mode de réalisation tout particulièrement
préféré, le variant comprend ou présente la combinaison S63C + G41S. Dans un
mode
de réalisation particulier, le variant ne présente pas de délétion de 1 à 11
résidus à
l'extrémité C-terminale. Dans un autre mode de réalisation particulier, le
variant
présente une délétion de 1 à 11 résidus à l'extrémité C-terminale. Dans un
mode de
réalisation particulier, le variant ne porte pas de groupement non-peptidique
sélectionné
parmi le groupe constitué d'une molécule polymère, d'une molécule
lipophilique, et
d'un agent organique de dérivatisation. Dans un autre mode de réalisation
particulier, le
variant porte un groupement non-peptidique sélectionné parmi le groupe
constitué d'une
molécule polymère, d'une molécule lipophilique, et d'un agent organique de
dérivatisation. Le groupement non-peptidique considéré est tout
particulièrement une
molécule polymère, de préférence un polyéthylène glycol. Dans un mode de
réalisation
particulier, le variant est glycosylé. Le variant peut notamment être
glycosylé en
position N3 9 par une N-glycosylation lorsqu'il comprend la substitution G41
S.
Une composition pharmaceutique selon la présente invention peut comprendre en
outre
un support ou un excipient pharmaceutiquement acceptable. De tels supports et
excipients sont bien connus de l'homme du métier (Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Coinpany [1990];
Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer
and L.
Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical
Excipients,
3rd edition, A. Kibbe, Ed. , Pharmaceutical Press[2000]).
Une composition pharmaceutique selon la présente invention peut être formulée
sous
différentes formes, notamment de liquide, de gel, lyophilisée, de poudre, de
solide
compressé, et autres.
La présente invention concerne également un variant de l'IFNy thermostable
selon la
présente invention ou une composition selon la présente invention en tant que
médicament. '
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Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont appropriées ou formulées
pour
l'administration orale, parentérale (intradermique, intramusculaire,
intraveineuse, sous-
cutanée), sublinguale, topique, locale, intratrachéale, intranasale,
transdermique, rectale,
intraoculaire, intra- auriculaire, ledit principe actif pouvant être
administré sous forme
unitaire d'administration.
Un exemple de composition pharmaceutique est une solution adaptée pour une
administration parentérale. Bien que la composition puisse être sous forme
liquide,
adaptée pour une administration inunédiate, de telles formulations
parentérales
comprennent également les formes congelées ou lyophilisées. Dans ce cas, la
composition sera décongelée ou mise en solution avant utilisation. Dans le cas
de la
lyophilisation, la composition sera préparée en ajoutant un diluant
pharmaceutiquement
acceptable tel que de l'eau stérile ou un tampon physiologique.
Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés,
des
gélules, des gels des granules, des poudres, des solutions ou suspensions
orales ou
injectables, des timbres transdermiques (patch), des formes d'administration
sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-
auriculaire, par
inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée,
intramusculaire ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des
implants.
Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades,
lotions ou
collyres. Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des
domaines considérés. Dans un mode de réalisation préféré, la composition
pharmaceutique est liquide.
Lesdites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration
journalière de
0,001 à 100 g de principe actif par kg de poids corporel, selon la forme
galénique. Il
peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles
sont
appropriés; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la
pratique
habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin
selon le
mode d'administration, le poids et la réponse du patient.
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Dans un mode de réalisation préféré, l'IFNy est administré par la voie
parentérale, et
préférentiellement par injection sous-cutanée. Par exemple, une dose
habituelle d'IFNy
par injection sous-cutanée est comprise entre 1 et 100 ghn2 si la surface
corporelle est
supérieure à 0,5 m2 et entre 0,01 et 10 g/kg de poids corporel si la surface
corporelle
est inférieure ou égale à 0,5 m2.
L'IFNy est l'exemple type de cytokine pléiotrope au large spectre d'activités.
En effet,
les interférons (IFNs) sont doués d'activités telles que l'inhibition de la
réplication
virale, l'inhibition de la multiplication cellulaire et l'induction de
l'apoptose.
Notamment, la stimulation des macrophages par l'IFNy induit les réponses
suivantes :
- l'augmentation de la phagocytose et de la bactéricidie (mécanismes directs
anti-microbiens et anti-tumoraux) ;
- la stimulation des voies de présentation et de dégradation des antigènes,
expression du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) de type I et II à la
surface
des macrophages ;
- la différenciation des lymphocytes B en plasmocytes sécréteurs d'anticorps,
ce
qui a pour conséquence la production d'immunoglobuline de type G et
l'activation du
complément ;
- l'activation de la NO synthase donnant naissance à la production de NO et de
radicaux libres oxygénés cytotoxiques ; et/ou
- l'augmentation de la production de cytokines et la production d'IFN
endogène.
L'action de l'IFNy sur les lymphocytes T est de favoriser leur différenciation
modulant
ainsi la réponse immunitaire spécifique.
Parmi les propriétés pharmacologiques de l'IFNy, l'effet principal recherché
et
développé en phases cliniques est principalement l'aspect immunomodulateur,
l'aspect
de molécule thérapeutique anti-virale étant moins développé à ce jour.
En raison de son large spectre d'activités (antivirale, antiproliférative et
immunomodulatrice), l'IFNy est une molécule développée comme agent
thérapeutique
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humain dans le traitement de nombreuses maladies assez variées. Les IFNy
commerciaux (Actimmune, et Biogamma) sont notamment utilisés pour deux
indications tllérapeutiques principales : la granulomatose chronique et la
fibrose
pulmonaire idiopathique, en association avec la prednisolone par voie orale.
En plus des
indications thérapeutiques principales, de nombreuses nouvelles indications
thérapeutiques secondaires sont actuellement en cours de développement à
différentes
phases cliniques (II et III), en particulier pour leur rôle d'immuno-
suppresseur par
exemple en complément des IFNa pégylés/ribavirine dans le cadre du traitement
de
l'Hépatite C. On peut citer aussi infections à mycobactérie atypique ; cancer
du rein ;
ostéopétrose ; sclérodermie généralisée ; hépatite chronique à virus B;
hépatite
chronique à virus C; choc septique ; dermatite allergique ; la polyarthrite
rhumatoïde ;
cancer de l'ovaire ; la fibrose du foie ;1'asthme ; et le lymphome.
L'IFNy est également utile dans le traitement d'infections virales variées,
possède une
activité contre l'infection par les papillomavirus humains, et les infections
hépatiques à
virus B et à virus C.
De plus, si le problème de toxicité associée aux fortes doses d'IFNy était
atténué ou
résolu par une molécule plus stable, et ayant donc un plus important effet in
vivo,
l'utilisation de 1'IFNy dans de nouvelles indications, et notamment pour
traiter les
infections virales type herpès (HSV) de type I et II pourrait être
reconsidéré.
Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation d'un variant de l'IFNy
thermostable
selon la présente invention ou d'une composition pharmaceutique selon la
présente
invention pour la préparation d'un médicament antiviral, antiprolifératif ou
immunomodulateur. Ainsi, ce médicament est destiné à traiter des maladies
inflammatoires, des cancers, des infections, des troubles osseux, des maladies
auto-
immunes, etc... Dans un mode de réalisation préféré, le médicament est destiné
au
traitement d'une pathologie sélectionnée parmi l'asthme, la granulomatose
chronique
familiale, la fibrose pulmonaire idiopathique, une infection à mycobactérie
atypique, le
cancer du rein, l'ostéopétrose, une sclérodermie généralisée, une hépatite
chronique à
virus B ou C, un choc septique, une dermatite allergique, et l'arthrite
rhumatoïde. Dans
des modes de réalisation alternatifs, le médicament est destiné au traitement
d'une
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pathologie sélectionnée parmi un prurigo, une névrodermite, le diabète de type
I, une
sténose vasculaire, un épithélioma basocellulaire, un cancer ou un lymphome
tel que un
cancer de l'ovaire, un cancer du rein, une leucémie telle qu'un désordre
hyperprolifératif des cellules B ou T, la leucémie myéloïde chronique et des
syndromes
apparentés, un cancer du sein, un cancer des poumons, un mélanome, un cancer
du
colon, un cancer du cerveau, un cancer de la plèvre, un cancer de l'estomac,
un cancer
du pancréas, une infection virale, par exemple par le virus de l'hépatite C ou
B, la
maladie de Crohn, le psoriasis, la sclérose en plaque, et la sclérose
amyotrophique
latérale.
Le variant thermostable de l'IFNy selon la présente invention peut être
utilisé en
combinaison avec un autre principe actif, par exemple un principe actif
sélectionné
parmi un anticorps, un agent anti-tumoral ou de chimiothérapie, un
glucocorticoïde, un
agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale, un agent anti-
allergique, un
vaccin, un broncodilatateur, un stéroïde, un agent béta-adrénergique, un agent
immunomodulateur, une cytokine telle que l'interféron alpha ou béta,
l'interleukine 1
ou 2, le TNF (facteur de nécrose tumorale), l'hydroxyurée, un agent alkylant,
un
antagoniste de l'acide folique, un antimétabolite du métabolisme des acides
nucléiques,
un poison fusoral, un antibiotique, un analogue de nucléotides, un rétinoïde,
un
inhibiteur de lipoxygénase et de cyclo-oxygénase, un acide fumarique et ses
sels, un
analgésique, un spasmolytique, un antagoniste du calcium et une combinaison de
ceux-
ci. Le principe actif additionnel peut être administré avant, simultanément ou
après
l'administration de l'IFNy selon la présente invention. De plus, il peut être
administré
par la même voie d'administration ou par deux voies d'administration
distinctes. Ainsi,
la présente invention concerne un produit comprenant le variant thermostable
de l'IFNy
ou une composition pharmaceutique selon la présente invention et un autre
principe
actif, de préférence sélectionné dans la liste ci-dessus, pour une préparation
combinée
destinée à une utilisation simultanée, séquentielle ou séparée pour le
traitement d'une
des pathologies citées ci-dessus.
La combinaison avec un anticorps est utile pour le traitement de cancer. En
effet, l'IFNy
est capable d'augmenter l'effet des anticorps par l'ADCC (antibody-dependant
cellular
cytotoxicity). L'anticorps est de préférence dirigé contre un antigène exposé
par les
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cellules cancéreuses. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal,
monoclonal,
humanisé, ou chimérique. De préférence, l'anticorps est monoclonal et
humanisé. Par
exemple, dans le cas d'un désordre hyperprolifératif des cellules B tel que le
lymphome
non-hodgkinien, l'antigène peut être CD20. Cet anticorps peut être le
Rituximab.
La combinaison avec un glucocorticoïde est utile pour le traitement des
maladies
pulmonaires alvéolaires telles que la fibrose pulmonaire idiopathique. Des
exemples de
glucocorticoïdes adaptés sont l'hydrocortisone, la cortisone, la
dexaméthasone, la
bétaméthasone, la prednisolone, la méthyl prednisolone et leurs sels
pharmaceutiquement acceptables. Un mode de réalisation préféré de la présente
invention concerne l'utilisation d'une combinaison entre l'IFNy selon la
présente
invention et la prednisolone.
La combinaison avec un agent anti-histaminique, une hormone adrénocorticale,
un
agent anti-allergique est utile notamment pour le traitement de maladies de la
peau telles
que un prurigo ou une névrodermite.
La combinaison avec un agent anti-allergique, un broncodilatateur, un
stéroïde, un agent
béta-adrénergique, un agent immunomodulateur, ou une cytokine est utile
notamment
pour le traitement de l'asthme.
La présente invention concerne en outre une méthode de traitement antiviral,
antiprolifératif ou immunomodulateur chez un patient le nécessitant,
comprenant
l'administration d'une quantité thérapeutique efficace d'un variant
thermostable de
l'IFNy ou d'une composition pharmaceutique selon la présente invention au
patient. De
préférence, la méthode de traitement est destinée au traitement d'une
pathologie citée
ci-dessus. Facultativement, la méthode peut comprendre en outre
l'administration d'un
autre principe actif, de préférence sélectionné parmi ceux cités ci-dessus.
Une quantité
thérapeutique efficace est la quantité nécessaire pour diminuer ou supprimer
les
symptômes de la maladie ou pour soigner ou ralentir la progression de la
maladie. Le
patient est de préférence un humain.
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La présente invention concerne un acide nucléique codant un variant
thermostable de
l'IFNy humain selon la présente invention. La présente invention concerne
également
une cassette d'expression d'un acide nucléique selon la présente invention.
Elle
concerne en outre un vecteur comprenant un acide nucléique ou une cassette
d'expression selon la présente invention. Le vecteur peut être sélectionné
parmi un
plasmide et un vecteur viral.
L'acide nucléique peut être de l'ADN (ADNc ou ADNg), de l'ARN, un mélange des
deux. Il peut être sous forme simple chaîne ou en duplexe ou un mélange des
deux. Il
peut comprendre des nucléotides modifiés, comprenant par exemple une liaison
modifiée, une base purique ou pyrimidique modifiée, ou un sucre modifié. Il
peut être
préparé par toutes méthodes connues de l'homme du métier, dont la synthèse
chimique,
la recombinaison, la mutagenèse, etc...
La cassette d'expression comprend tous les éléments nécessaires à l'expression
du
variant thermostable de l'IFNy humain selon la présente invention, notamment
les
éléments nécessaires à la transcription et à la traduction dans la cellule
hôte. La cellule
hôte peut être procaryote ou eucaryote. En particulier, la cassette
d'expression
comprend un promoteur et un terminateur, facultativement un amplificateur. Le
promoteur peut être procaryote ou eucaryote. Des exemples de promoteurs
procaryotes
préférés sont les suivants : Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, les
promoteurs
d'ARN polymérase de bactériophage T3 or T7, le promoteur de la polyhèdrine, le
promoteur PR ou PL du phage lambda. Des exeinples de promoteurs eucaryotes
préférés sont les suivants : promoteur précoce du CMV, promoteur de la
thymidine
kinase de HSV, promoteur précoce ou tardif de SV40, le promoteur de la
métallothionéine-L de souris, et les régions LTR de certains rétrovirus. De
manière
générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra
avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou encore aux
techniques décrites par Fuller et al. (1996; Immunology in Current Protocols
in
Molecular Biology).
La présente invention concerne un vecteur portant un acide nucléique ou une
cassette
d'expression codant pour un variant thermostable de l'IFNy humain selon la
présente
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invention. Le vecteur est de préférence un vecteur d'expression, c'est-à-dire
qu'il
comprend les éléments nécessaires à l'expression du variant dans la cellule
hôte. La
cellule hôte peut être un procaryote, par exeinple E. coli, ou un eucaryote.
L'eucaryote
peut être un eucaryote inférieur comme une levure (par exemple, S cerevisiae)
ou un
champignon (par exemple du genre Aspergillus) ou un eucaryote supérieur comme
une
cellule d'insecte (Sf9 ou Sf21 par exemple), de mammifère ou de plante. La
cellule peut
être une cellule mammifère, par exemple COS (lignée cellulaire de singe vert)
(par
exemple, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651), CHO (US 4,889,803 ;
US 5,047,335, CHO-Kl (ATCC CCL-61)), des cellules de souris et des cellules
humaines. Dans un mode de réalisation particulier, la cellule est non-humaine
et non-
embryonnaire. Le vecteur peut être un plasmide, un phage, un phagemide, un
cosmide,
un virus, un YAC, un BAC, un plasmide pTi d'Agrobacterium, etc... Le vecteur
peut
comprendre de préférence un ou plusieurs éléments sélectionnés parmi une
origine de
réplication, un site de clonage multiple et un gène de sélection. Dans un mode
de
réalisation préféré, le vecteur est un plasmide. Des exemples non-exhaustifs
de vecteurs
procaryotes sont les suivants : pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD 10,
phagescript,
psiXl74, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene);
ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pBR322, et pRIT5 (Pharmacia), pET
(Novagen). Des exemples non-exhaustifs de vecteurs eucaryotes sont les
suivants :
pWLNEO, pSV2CAT, pPICZ, pcDNA3.1 (+) Hyg (Invitrogen), pOG44, pXTl, pSG
(Stratagene); pSVK3, pBPV, pCI-neo (Stratagene), pMSG, pSVL (Pharmacia); et
pQE-
30 (QLAexpress). Les vecteurs viraux peuvent être de manière non-exhaustive
des
adénovirus, des AAV, des HSV, des lentivirus, etc... De préférence, le vecteur
d'expression est un plasmide ou un vecteur viral.
La séquence codant l'IFNy selon la présente invention peut comprendre ou ne
pas
comprendre le peptide signal. Dans le cas où elle ne le comprend pas, une
méthionine
peut être éventuellement ajoutée à l'extrémité N-terminale. Dans une autre
alternative,
un peptide signal hétérologue peut être introduit. Ce peptide signal
hétérologue peut être
dérivé d'un procaryote tel que E. coli ou d'un eucaryote, notamment une
cellule
mammifère, d'insecte ou d'une levure.
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La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide, d'une
cassette
d'expression ou d'un vecteur selon la présente invention pour transformer ou
transfecter
une cellule. La présente invention concerne une cellule hôte comprenant un
acide
nucléique, une cassette d'expression ou un vecteur codant un variant
thermostable de
l'IFNy humain et son utilisation pour produire un variant thermostable de
l'IFNy
humain recombinant selon la présente invention. Le terme cellule hôte
englobe les
cellules filles résultant de la culture ou de la croissance de cette cellule.
Dans un mode
de réalisation particulier, la cellule est non-humaine et non-embryonnaire.
Elle concerne
également une méthode de production d'un variant thermostable de l'IFNy humain
recombinant selon la présente invention comprenant la transformation ou
transfection
d'une cellule par un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur
selon la
présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée
; et la récolte
du variant therinostable de l'IFNy humain produit par la cellule. Dans un mode
de
réalisation alternatif, la méthode de production d'un variant thermostable de
l'IFNy
humain recombinant selon la présente invention comprenant la fourniture d'une
cellule
comprenant un polynucléotide, une cassette d'expression ou un vecteur selon la
présente invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée
; et la récolte
du variant thermostable de l'IFNy humain produit par la cellule. En
particulier, la cellule
peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable par l'acide
nucléique
codant le variant. Cet acide nucléique peut être contenu dans la cellule sous
forme
d'épisome ou sous forme chromosomique. Les méthodes de production de protéines
recombinantes sont bien connues par l'homme du métier. Par exemple, on peut
citer les
modes spécifiques décrits dans US 5,004,689, EP 446 582, Wang et al. (Sci.
Sin. B
24:1076-1084, 1994 et Nature 295, page 503) pour une production dans E. coli,
et
JAMES et al. (Protein Science (1996), 5:331-340) pour une production en
cellules
mammifères.
La présente invention peut également concerner une composition pharmaceutique
comprenant un acide nucléique codant un variant de l'IFNy thermostable selon
la
présente invention, une cassette d'expression, un vecteur ou une cellule hôte
selon la
présente invention, son utilisation pour la préparation d'un médicament,
notamment
destiné à traiter les maladies citées ci-dessus. Elle concerne en outre une
méthode de
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traitement d'un patient le nécessitant comprenant l'administration d'une telle
composition en une quantité thérapeutiquement efficace.
Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par
référence dans la
présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention
apparaitront
mieux à la lecture des exemples suivants donnés bien entendu à titre
illustratif et non
limitatif.
Exemples
Sélection des variants thermostables de l'IFNy humain
Les inventeurs ont mis en oeuvre une méthode de sélection directe de variants
protéiques thermostables appelée THR et décrite dans la demande de brevet
français
numéro 0505935.
Cette méthode est basée sur la préparation de protéine de fusion entre les
variants de
l'IFNy humain et un variant d'une protéine de résistance à la kanamycine,
présentant
une thermostabilité accrue (Ce double mutant de la kanamycine nucléotidyl
transférase
est décrit dans Liao, Enzyme Microb. Technol., 1993, 15, 286-92). La banque de
variants de l'IFNy humain a été préparée par la méthode de Massive Mutagenesis
décrite dans FR2813314, et a été transformée à haute température dans la
souche HB27
de Thernzus thermophilus. Les clones transformants de cette banque ont été
sélectionnés
à des concentrations croissantes en kanamycine pour lesquelles la production
de la
fusion IFNy (sauvage)-KNTase ne permet plus aux cellules de pousser. Les
clones
obtenus dans ces conditions sont théoriquement associés à un gain de stabilité
à haute
température, comme indiqué dans la demande de brevet FR 05 05935 déposée le 10
juin
2005. Les mutations portées par les clones sélectionnés ont été identifiées et
les
séquences résultantes sont répertoriées dans le tableau 1. Les différents
mutants isolés
lors de cette sélection primaire ont été transformés à nouveau
individuellement et leur
niveau de résistance a été comparé à celui de la construction sauvage. 21
mutants,
conférant à la souche une résistance plus ou moins importante mais toujours
supérieure
au sauvage, ont ainsi été confirmés (tableau 2).
Génération systématique de variants ponctuels de l'IFNy_
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Par ailleurs, à partir du clone d'expression pORF/IFNy, nous avons généré une
importante collection de mutations ponctuelles de I'IFNy présentant une et une
seule
différence d'acide aminé avec les positions de l'IFNy dit sauvage (en prenant
comme
référence la SEQ N 6).
Analyse fonctionnelle des variants de I'IFNy
Les variants de I'IFNy humain sélectionnés par notre méthode de sélection ou
générés
de façon systématique sur toutes les positions de I'IFNy ont été exprimés
transitoirement en cellules animales COS7. Ces protéines sont sécrétées dans
le
surnageant de culture. De façon à évaluer la stabilité et la conservation de
l'activité de
ces variants, les surnageants de culture de cellules COS7 ont été soumis à une
dénaturation thermique (10 minutes à 59 C). On a ensuite fait agir ces
protéines
(dénaturées ou non) sur des cellules HeLa transfectées contenant la luciférase
comme
gène rapporteur. Après 16 heures de stimulation, pour chaque mutant et pour
chaque
condition, nous avons mesuré le signal de lafirefly luciférase correspondant à
l'activité
de I'IFNy testé. On a ensuite comparé l'activité induite par la protéine non
dénaturée à
l'activité induite par cette même protéine dénaturée et on en a déduit
l'activité résiduelle
après dénaturation thermique pour la protéine étudiée (Activité résiduelle =
Activité
dénaturée/Activité non dénaturée * 100). L'activité basale du variant non
dénaturé a
également été comparée à celle de I'IFNy non muté.
Détails des expériences
Biologie moléculaire
Constructions plasmidiques
Système THR : Le vecteur qui a été utilisé comportait les origines de
réplication de E.
coli et de T. Thermophilus, un gène de résistance à l'ampicilline qui permet
la sélection
de transformants dans E. coli, un gène codant la KNTase thermostable sous
contrôle
d'un promoteur actif à la fois chez E. coli et de T. thermophilus (le
promoteur ps1pA).
Voir Figure 1. La séquence nucléotidique de I'IFNy (codant pour la forme
mature de
146 acides aminés SEQ ID N 5) a été clonée entre les sites NcoI et NotI du
vecteur en
N-terminal de la KNTase. L'IFNy et la KNTase en fusion sont séparés par une
séquence
codant un peptide de liaison ( linker ) qui présentait la séquence
peptidique
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AAAGSSGSI (SEQ ID No 8) et était codée par la séquence nucléique GCG-GCC-
GCA-GGA-AGC-TCT-GGT-TCC-ATC (SEQ ID No 7).
Système d'expression eucaryote : Pour l'expression de l'IFNy en cellules de
mammifères, nous avons utilisé le pORF/IFNy (Invivogen) dans lequel l'IFNy est
clonée dans une cassette d'expression contenant le promoteur hybride (EF-la-
HLTV) et
le signal de polyadénylation fort du SV40.
Génération de mutants référ=ences de l'IFNy
Plusieurs mutants thermostables décrits dans la bibliographie ont été
construits et
utilisés à titre de contrôles positifs. Ils codent pour :
- la protéine IFNy E30C/S92C : mutant avec un pont disulfure (gain de
stabilité
TM +15 C, Waschutza et al., 1996)
- la protéine IFNy delta 10 (extrémité C-terminale de la protéine délétée de
ces
derniers acides aminés activté et stabilité améliorée, TM + 7,5 C et activité
anti-
virale multipliée par 4, Slodowski et al., 1991).
Ces mutants sont générés au niveau des matrices pNCK-IFNy et PORF-IFNy par la
méthode de Massive Mutagenesis décrite dans FR2813314.
Génération dans le pORF-IFNy des mutants de l'IFNy sélectionnés par la méthode
THR
Les mutations simples et multiples correspondants aux mutations identifiées
sur les
séquences des clones sélectionnés par la méthode THR sont introduites sur le
pORF-
IFNy par la méthode de Massive Mutagenesis décrite dans FR2813314.
Génération systématique des mutations sinaples de l'IFNy dans le pORF/ IFNy
La génération de façon systématique de tous les variants simples de l' IFNy
(c'est-à-dire
la substitution de l'acide aminé de la protéine mature de type sauvage par les
19 autres
acides aminés du code génétique) a été réalisée par la méthode de Massive
Mutagenesis décrite dans FR2813314 sur la matrice pORF/IFNy.
Sélection de mutants thermostables par la méthode THR
Une banque de variants de l'IFNy clonée dans le vecteur pNCK a été générée
grâce à
Massive Mutagenesis . Une diversité totale a été introduite sur toutes les
positions (de
21 à 166). La banque a ensuite été transformée à haute température (70 C) dans
la
souche HB27 de Thermus thenmophilus et sélectionnée sur 20 ou 40 g/m1 de
kanamycine (conditions où la fusion IFNy (sauvage)-KNTase ne permet plus à la
cellule
de pousser). Les mutations identifiiées après séquençage sur des clones
poussant sur
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37
milieu sélectif sont répertoriées dans le tableau 1. Les différents mutants
issus de cette
sélection primaire ont ensuite été retransformés de manière unique et leur
niveau de
résistance a été comparé à celui de la construction sauvage. 21 mutants,
conférant à la
souche une résistance plus ou moins importante mais toujours supérieure au
sauvage ont
ainsi été confirmés (tableau 2).
Validation fonctionnelle de la stabilité et de l'activité des mutants de 1'
IFNy
Tous les réactifs de culture cellulaire ont été fournis par Invitrogen. Les
cellules HeLa
((human cervix epitheloid carcinoma cells), les cellules COS-7 (African green
monkey
SV40 transformed kidney cells) et les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) ont
été
cultivées dans des conditions standards de culture (37 C en atmosphère humide
contenant de 5% à 8% C02) en utilisant respectivement les milieux Dulbecco's
Modified Eagle's Medium (D-MEM) et Iscove's Modified Dulbecco's Medium
(IMDM). Tous ces milieux de culture sont préparés selon les recommandations du
fournisseur et contiennent un analogue de la L-glutamine (le glutamax). Ils
sont
supplémentés en sérum de veau foetal décomplémenté (SVF) ( à raison de 10%
final
pour les phases de culture et de transfection et en poucentage de SVF réduit
dans les
phases de production suivant les expériences) et en antibiotiques à raison de
100
units/ml de pénicilline et 0.1 mg/ml de streptomycine pour Hela et COS7 et à
raison de
50 units/ml de pénicilline et 0.05 mg/ml de streptomycine pour les CHO. Le
vecteur
pSV-betagal TM (Promega), qui exprime la béta galactosidase sous le contrôle
du
promoteur précoce SV40, a été utilisé pour normaliser les efficacités de
toutes les
transfections réalisées.
Expression des mutants de 1'IFNy humain en cellules de mammifères COS7
Afin de réaliser les transfections des cellules COS7 par les constructions
pORF/IFNy
natif ou muté, ces cellules ont été trypsinisées lorsqu'elles atteignaient 90%
de
confluence. Les cellules COS7 ont été ré-ensemencées suivant le ratio 1/4
(c'est-à-dire de
façon à ce qu'elles représentent, une fois adhérées sur la surface, une
confluence de
25% environ). La transfection des cellules COS7 a été réalisée en plaque 24
puits avec
un ensemencement de 30 000 à 60 000 cellules par puits lorsque les cellules
atteignent
70-80% confluence. La transfection a été réalisée avec environ 50ng d'ADN et
du Jet
PEI (Polyplus transfection) en utilisant un ratio Jet PEI/ADN de 5 en laissant
30
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minutes à température ambiante. Après 24h de transfection, le milieu (500 L
IMDM +
SVF + antibiotiques) a été changé. Les surnageants contenant l'IFNy (avec un
niveau
d'expression de l'ordre de 0,5 à l g/ml) ont été récupérés à T=24H post-
transfection.
Ils ont été aliquotés et conservés à-20 C avant le dosage de l'activité de
l'IFNy.
Expression des mutants de l'IFNy humain en cellules de maminifères CHO
Afin de réaliser les transfections des cellules CHO par les constructions
pORF/ IFNy
natif ou muté, ces cellules ont été trypsinisées lorsqu'elles atteignaient 80%
de
confluence. Les cellules CHO ont été ré-ensemencées suivant le ratio 1/3
(c'est-à-dire
de façon à ce qu'elles représentent, une fois adhérées sur la surface, une
confluence de
33% environ). La transfection des cellules CHO a été réalisée lorsque les
cellules
atteignent 70% de confluence. Dans une flasque (T75) avec un ensemencement
initial
de 4 Millions de cellules par flasque, la transfection a été réalisée avec
environ 8 g
d'ADN et du Jet PEI (Polyplus transfection) en utilisant un ratio Jet PEI/ADN
de 5 et en
laissant 30 minutes à température ambiante. Après 24h de transfection, le
milieu (lOmis
IMDM + SVF 2,5% + antibiotiques) a été échangé, après un bref lavage en PBS
1X,
contre du milieu IMDM + antibiotiques en absence de SVF additionnel. Les
surnageants
contenant l'IFNy (avec un niveau d'expression de l'ordre de 0,5 à 1 g/ml) ont
été
récupérés à T=48H post-transfection. Ils ont été aliquotés et conservés à-20 C
avant le
dosage de l'activité de l'IFNy.
Quantification de l'IFNI humain sauvage et variant
Le kit ELISA de référence pour la détermination de la quantité totale d'IFNy
provient
de Clinisciences (# 88-7316-86). Nous avons vérifié que les anticorps utilisés
dans cet
ELISA reconnaissaient de la même façon nos variants et la molécule native non
mutée
en quantifiant ces mêmes protéines par un autre ELISA commercial (Biosource #
KHHC4021).
Test primaire d'activité
Il a été déjà été décrit que l'IFNy active spécifiquement les récepteurs à
l'IFNy présents
sur les cellules HeLa. La stimulation de la voie des Jak/Statl des cellules
HeLa par
l'IFNy s'effectue en ayant, en particulier, pour conséquence l'activation de
la
transcription des gènes sous le contrôle de promoteur possédant des séquences
GAS
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pour Gamma Activated Site . Il est alors possible de mesurer et de comparer
les
activités des variants de l'IFNy en transfectant dans les cellules HeLa un
système de
gène rapporteur dans lequel la luciférase (firefly luciferase) est en aval
d'un promoteur
possédant plusieurs sites GAS (plasmide pGAS/Luciférase de Stratagene).
Transfection transitoire des cellules HeLa par le pGAS/Luciférase
Les cellules HeLa ont été trypsinisées lorsqu'elles atteignaient 90% de
confluence et ont
été ré-ensemencées avec un ratio de 1/3. Les transfections de cellules HeLa à
50-80 %
de confluence ont été réalisées en plaque 96 puits selon le protocole du
fournisseur :
20 000 cellules par puits ont été transfectées avec environ 150ng d'ADN
pGAS/Luciférase et du jet PEI dans un rapport Jet PEI/ADN de 5. Le tout a été
vortexé
30s et laissé à température ambiante 30 min. Puis, 20 L du mélange ADN/Jet PEI
ont
été répartis dans chaque puits de la plaque et les cellules ainsi transfectées
sont cultivées
pendant 24 heures à 37 C et en 5% C02.
Crible primaire des variants thermostables de l'IFNy humain
Mesure de l'activité totale basale des variants de l'IFNy (protéine non
dénaturée) /
(protéine sauvage) :
Les surnageants de cellules COS7 contenant l'IFNy ont été dilués au 1/100ème.
10 L
de ces dilutions de surnageants de cellules COS7 contenant l'IFNy ont été
ajoutés sur
les cellules HeLa transfectées par du pGAS/Luciférase. Après 16 heures à 37 C
5%
C02 pendant lesquelles l'expression cytoplasmique de la firefly luciférase
s'est
effectuée, les culots de cellules ont été récupérés et congelés. 50 L de Glo
lysis buffer
TM (Promega), ont été ajoutés pour lyser les cellules. La lyse s'est effectuée
pendant 10
min sous agitation à température ambiante de façon à libérer la luciférase
produite en
réponse à la stimulation spécifique de l'IFNy. La mesure de l'activité a été
initialisée
par l'ajout du réactif Bright Glo TM (Promega) et la quantité de luciférase
accumulée a
ensuite été comptée avec un luminomètre (FLX 800, Bio-Tek Instrument). L'
activité
brute en IFNy est exprimée en RLU pour relative luciferase unit . Le calcul
de
l'activité totale (par rapport à la protéine sauvage) de chaque variant (non
dénaturé) est
une moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations
différentes
(duplicates au minimum) et sur des sumageants de culture provenant, au
minimum, de
deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont
calculées par la
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formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m). L'une des façons de
présenter les
résultats d'activité totale est de rapporter l'activité de base de chaque
variant en
pourcentage de l'activité de base de l'IFNy non muté exprimé dans les mêmes
conditions pour chaque transfection.
Mesure de l'activité yésiduelle des variants après dénaturation thermique par
gène
rapporteur luciférase :
Comme précédemment décrit par le test primaire d'activité par gène rapporteur,
la
quantité de luciférase a été mesurée après stimulation des cellules par lO L
de
surnageants de cellules COS7 dilués au 1/ 100ème contenant l'IFNy qui, suivant
les cas,
ont été soumis à un traitement thermique de 10 minutes à 59 C ou bien n'ont
pas été
traités. L'une des façons de présenter la fraction d'activité de chaque
variant conservée
après dénaturation thermique est de calculer l'activité résiduelle conservée
de chaque
variant définie par le pourcentage de l'activité basale du même variant avant
dénaturation. Le calcul de l'activité résiduelle par rapport à une activité
totale
déterminée avant dénaturation est une moyenne réalisée sur la base de
résultats obtenus
sur 5 manipulations différentes (duplicates au minimum) et sur des surnageants
de
culture provenant, au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres
d'erreur présentées sont calculées sur la formule de l'erreur standard sur la
moyenne
(s.e.m).
Mesure d`un indice d'amélioration des variants de l'IFNy (amélioration de la
thermostabilité et/ou de l'activité) :
Une fois que l'on a vérifié qu'un variant de l'IFNy étudié présente à la fois
une
amélioration de la thermostabilité et une conservation au moins partielle de
l'activité
intrinsèque de la protéine, on peut calculer le produit de l'activité
résiduelle du mutant
étudié après prétraitement, par son activité (sans pré-taitement). Cette
indice donne une
idée de la résultante du gain de thermostabilité et de perte relative
d'activité, et donne
donc une idée de l'effet in vivo attendu de la protéine. Les valeurs obtenues
avec les
protéines de référence sont les suivantes : un indice de 37 pour l'IFNy non
muté et
d'environ 76 pour le variant delta 10 connu dans la bibliographie.
A l'issue du crible primaire, nous avons identifié une série de variants de
l'IFNy humain
présentant une amélioration de thermostabilité et/ou d'activité par rapport à
l'IFNy
humain non muté comme décrit sur les figures 2 à 6.
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Crible secondaire des variants thermostables de l'IFNy humain - mesure de la
demi-vie
in vitro
En vue de comparer l'amélioration de la stabilité intrinsèque des variants de
l'IFNy les
plus thermostables issus du crible primaire, nous avons suivi, dans un crible
secondaire,
l'évolution de l'activité des IFNy variants en fonction du temps lors d'une
dénaturation
thermique à 59 C. Nous avons ainsi déterminé une demi-vie à 59 C encore
appelée ici
demi-vie in vitro qui correspond au temps de dénaturation nécessaire pour
faire
disparaître 50% de l'activité initiale de l'IFNy à 59 C. Cette demi-vie a été
obtenue en
contrôlant particulièrement tous les paramètres suivants: une même
concentration
initiale d'IFNy de 1000pg/ml, une concentration en sérum SVF dans
l'échantillon final
à dénaturer équivalente et ajustée à 0,15% et une température de dénaturation
de 59 C
pendant 30 minutes avec des prélèvements toutes les 10 minutes.
Les concentrations en IFNy des surnageants de cellules CHO ont été estimées
par
ELISA. Ces différents lots d'IFNy variants ont été ensuite dilués à 1000pg/ml
dans un
milieu IMDM SVF 0,15%. Ces dilutions ont été ensuite aliquotées de façon à
subir un
pré-traitement de dénaturation thermique à 59 C pendant 0, 10 20 et 30
minutes. lO L
de ces dilutions pré-traitées ont été ajoutés dans 100 1 de milieu de culture
de cellules
HeLa transfectées par du pGAS/Luciférase comme décrit précédemment. Après 16
heures à 37 C 5% C02, la lyse des culots de cellules et la quantification de
la luciférase
correspondante a été effectuée comme précédemment.
L'une des façons de présenter les données est de reporter l'activité brute
correspondant
à la stimulation spécifique de la voie de transduction par l'IFNy variant,
activité brute
exprimée alors en RLU pour relative luciferase unit . Une autre façon de
présenter la
fraction d'activité conservée après dénaturation thermique (encore appelée
activité
résiduelle) de chaque variant est de calculer, et ce pour chaque temps de
dénaturation, le
pourcentage résiduel d'activité conservée par rapport à l'activité basale du
même
variant avant dénaturation. Ces calculs se font après soustraction de la part
de signal due
aux cellules non transfectées.
Les demi-vies de chaque variant ainsi déterminées sont alors comparées à celle
de
l'IFNy sauvage. Les demi-vies (T1/2) sont exprimées en minutes et sont
calculées à
l'aide de la formule suivante :
T1/2= ln(2)/(k inactivation)
Où k inactivation est la constante de vitesse de la phase d'inactivation.
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Cette constante est calculée sur la moyenne des taux d'inactivation
instantanés de
chaque temps par la formule suivante :
Ln A(t) =1n b - t*(k inactivation)
A (t) est l'activité IFN gamma au temps tps t et b est une constante.
Ainsi, pour résumer, les demi-vies in vitf=o calculées ici, présentées
dans la figure 7
et récapitulées dans le tableau 3, correspondent au temps pour lequel on a
conservé la
moitié de l'activité maximale de chacun des variant d'IFNy.
Un autre paramètre décrit dans le tableau 3 est le ratio d'amélioration de la
demi-vie de
chacun des mutants par rapport à celle de la molécule sauvage non mutée
produite dans
les mêmes conditions. Plus ce paramètre est élevé plus l'amélioration de la
demi-vie
in vitr=o du variant est importante comparée à celle de l'IFNy humain non
muté.
Ainsi, à l'issue de ce crible secondaire, nous décrivons ici 16 mutants de
l'IFNy
présentant une nette amélioration de leur demi-vie in vitro et ce d'un facteur
200 à 1,4
fois comme résumés figure 7 et tableau 3.
Mesure de paramètres pharmacocinétiques des variants thermostables de l'IFNY
humain
chez la souris
Ces expériences pharmacocinétiques descriptives ont pour but de déterminer
dans le cas
des variants thermostables de l'IFNy la demi-vie biologique ou demi-vie
terminale
d'élimination (encore appelée ici demi-vie in vivo ), ainsi que les aires
sous la courbe
pour différents modes d'administration (injection par voie intraveineuse (i.v)
ou par
voie sous-cutanée (s.c)). Ces données seront ensuite comparées à celles
obtenues dans le
cas de l'IFNy sauvage produit en cellules de mammifères et dans le cas de
l'IFNy
standard recombinant produit chez E. coli présentant les caractéristiques de
la molécule
du marché, c'est à dire un pseudo Actimmune .
La mesure de la demi-vie biologique peut être réalisée de multiples façons :
Une méthode décrite par Rutenfranz et al. (J. Interferon Res. 1990, vol. 10,
p. 337-341)
utilise des injections intraveineuses et intramusculaires sur des souris
C57BL/6 de 8
semaines
La demi-vie est alors estimée par un test d'activité anti-virale directement
sur les sérums
murins (Cellules Hep-2 infectées par un virus (vesicular stomatitis virus ou
VVS).
L'ELISA est, dans cet exemple, utilisé comme alternative pour détecter les
niveaux
d' IFNy dans le sérum murin.
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Une autre façon décrite dans Croos and Roberts (J.Pharm., 1993, vol 45, p.
606609)
consiste à réaliser des expériences avec de l'IFNy marqué par un isotope
radioactif et de
suivre l'absorption de cette molécule marquée dans les tissus et son passage
dans le
sérum de rats femelle Sprague-Dawley après injection sous-cutanée. Les
échantillons de
tissus et de sang sont alors analysés pour la quantité d'IFNy marqué qu'ils
contiennent.
L'utilisation de méthode ELISA pour déterminer les paramètres
pharmacocinétiques
d'IFN a été décrite pour l'IFN alpha par administration sous-cutanée par
Rostaing et al.
(1998), J. Am. Soc. Nephrol.9 (12): 2344-48 et par administration
intramusculaire par
Merimsky et al.(1991), Cancer Chemother. Pharmacol. 27 (5).]
L'IFNy sauvage et les mutants ont été exprimés à partir de cellules COS et
CHO. Ces
surnageants de culture ont été centrifugés une seconde fois à 4000 RPM, 10
min, et
filtrés sur filtre Millipore PES 0,22 m. Les volumes des surnageants filtrés
sont alors
concentrés par centrifugation sur des unités de filtration Vivaspin de seuil
de coupure de
5000 daltons (Sartorius). Les concentrations en IFNy sont alors estimées pour
ces
échantillons en appliquant les dilutions préalables adaptées.
Les lots d'IFNy variants et sauvage sont administrés selon deux modes :
- par une injection de 100 1 de solutions d'IFNy concentrées à 10 g/ml dans
les
veines caudales de souris C57BL/6J.
- ou bien par une injection de 100 1 de solution d'IFNy concentrées à 6,7
g/m1
en sous-cutané dans le ventre de souris C57BL/6J.
Pour ces expériences, sont utilisées des souris C57BL/6J agées de 8 semaines
d'un
poids moyen entre 20 et 30 grammes. Ces animaux sont acclimatés une semaine
dans
une pièce sous une température constante de 24,1 C, une humidité constante de
55% et
avec des cycles repos/somzneil de 12h.
Les échantillons de sang de souris sont collectés aux différents temps
suivants après
administration de la molécule d'intérêt. Des prélèvements rétro-orbitaux sont
réalisés
pour les temps 3h, 6h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h, 192h et des
prélèvements
cardiaques post-mortem pour le temps final à 216 heures.
Le sérum est préparé en laissant coaguler le sang pendant 20 minutes à
température
ambiante et en récupérant la fraction correspondant au surnageant d'une
centrifugation à
5000 g, 20 min à 20 C. Le sérum est ensuite isolé et stocké à-80 C en
attendant que
l'activité de l'IFNy soit mesurée en utilisant le dosage ELISA décrit plus
haut.
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On évalue ensuite la concentration plasmatique en IFNy au cours du temps par
le suivi
de la quantité d'IFNy détectée par ELISA dans chaque sérum de souris. Pour
chaque
prélèvement effectué en rétro-orbital, la quantification d'IFNy obtenue
résulte de la
moyenne d'au minimum 3 sérums différents issus de 3 souris. Ces différentes
expériences de pharmacocinétique ont été reproduites pour chaque variant au
minimum
deux fois à partir de lots d'IFNy provenant de transfections différentes. Au
final, on
reporte la concentration en IFNy dans le sérum au cours du temps.
Les paramètres [Tli2 ;.r,, AUC;,r,,] [Tli2sc et AUCScl, sont calculés à l'aide
du logiciel
Kinetica (Vs 4.4.1 Thermo Electron inc).en utilisant un modèle d'analyse
pharmacocinétique Intra Veinous bolus non-compartimental et
extravascular bolus respectivement.
Un autre paramètre décrit dans les tableaux 4 et 5 sont les ratio
d'amélioration de la
demi-vie ou de l'aire sous la courbe de chacun des mutants par rapport aux
paramètres
respectifs de la molécule sauvage non mutée produite dans les mêmes conditions
et par
rapport aux paramètres respectifs de l'IFNy humain recombinant bactérien quand
les
données sont disponibles. Plus ces ratios sont élevés, plus l'amélioration du
variant est
importante comparée à celle de l'IFNy humain non muté.
Les résultats de ces expériences et leur analyse sont présentés respectivement
figure 8 et
tableau 4 dans le cas des injections intraveineuses et figure 9 et tableau 5
dans le cas des
injections en sous-cutané.
Nous voyons que les mutations S63C, G41S ainsi que leur combinaison, ont pour
conséquence une nette amélioration de la demi-vie in vivo de ces variants
comparée à
celle de l'IFNy humain recombinant produit en CHO et à celle de l'IFNy humain
recombinant produit en bactérie. Après administration en sous-cutanée, le
double
mutant présente toujours une nette amélioration de ces paramètres
pharmacocinétiques
comparés à ceux de l'IFNy humain recombinant produit en CHO.
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fJom .osition des mutations (aa#
1 147: GCT- GAA fAla->Glu) 162: CGA-GAC;Arg-AsP}
2 162. CGA--G.AA(Arg ~lu}
4 163 AGA-ACC (A.rg Thr)
5 21: TGT-GGt; (Çys--~GIy) 159 TiT-TGC (Phe-Cys) 8 100 ATG-AAC (f:1et- Asnj
119 ACT-TAC (Thr-Tyr}
9 24: CaG-GÇG {GIn-AIa}
_ ;... ... . . ... - ,
10 22. TAC-GAC (Tyr-Asp) 122 TCG-CAC (Ser-His}
12 25: GAC-+GTC (Asp-Val}
13 76: TAC-~GAC (ryr-.As}.} 131. AAA-ATC (Lys-Ile)
14 22~ACG (fyr-->llir) 109. Ar.A"TGC (Lys-r}s}:119: ACT-ICCC (1hr-Proj 147:
GCT-TrC (xla-Phe# 163 AGA- CTC fArg-Leu
15 50 ACT-TAC (ThrTyr} 121 TAT~ACC (Tyr-Thr) 140 ATG-.CCG (felet-Pro)
17 2&: GTATGC (VaI-Cys}
18 22: TAC-CTC (i}r~Leu) 68: F.TG-Tl=C (H:let- Phe) 86: GAC-.CAG (Asp-Gln}.100
.r.TG-TGG (6ulet- Trp; 119 ACT-AGG (Thr-Arg}
19 21: TGT-GAG (Cys-Glu} 45: GTA-GGT (Val-GI, } 65 AGAATC (Arg--.Ile) 71 CAA--
TGC (GIn-Cys) S9 ATC TC (IIe--Phe)
20 68: ATG- CTG (Pvlet-Leu}
21 26: CC,AGAC (Pro-Asp) 122: TCG-+CCG (Ser-Pro)
22 165 TCC-GTG (Ser-VaI)
23 120: AAT--ATG (F sn- h='let}
26 21: TGT-.CAG (Cys-=CAG) 90 ÇAr-CAT ~GIn- Asn}
28 22. TAC--TCC (fyr Serp 168. CTG-- TGG (Leu-Trp) 163:AG.A-GGA (Arg-Gly)
31 124 A.CT-.CGG (Thr-Arg)
32 164 GCA-GAG {Ata-Glu)
34 126: TTG-?Ci.T (L=_u- His) 1.7 r",TG -TGG t,Pdet- Trfz) ;_....
35 22' TÅCTCC (ryr-~Ser) 158 CTG-TGG (Leu-,Trp) 36 162 CGA-.CAA (ArU-Gln) 164
GCA-.GAG {AIa-~Glu)`
6 21: TGT--TGG ~Cys-Trp} ..,
7 21=TGT-GGC.(Cys _GIfL.. . ._.. .. ...
11 25: GAC-CAC (Asp-=His) 24 22: TAC-TGG (Tyr-Trp)
25 22: T?G..,TTC Tyr-Phej
27 21: TGT-GAG (Cys-Gluj
29 21 TGT GCC (GYS...:rJa;
30 59. TGG-TT (irp-Phe}
33 ,~,1: CTT-TTC (Leu-Phe)
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37 98: GAA-AAA {GIu- Lys}
38 63:AGT.AGG{~er 1rg;. .
... . . ... . . , _ _. .
39 28 GT.A-+TGC (Val-Cvs}
Tableau 1
No clone Positions mutées
1 147. GCT=.GAA (Ala-.Glu) 162 CGA-GAC (A.rg-.AsR)
2 162 CGAGAA (Arg-Glu)
4 163 AGA-ACC (Arg-Thr)
5 21: TGT-GGC (C ys-Gly) 159 T1T TGC (Phe-.Cys)
6 21' TGT TGG (Cys Trp#
8 100. ATG-AAC (rtitet--HAsn} 119: ACT-TAC (Thr-Tyr)
9 24: CAG-GCG (Gin-AIa)
12 25: GAC-GTC (Asp-Val#
13 75- TAC-GAC iTyr-Asp) 131 AAAATC (Lys-'lle)
15 50: ACT-TAC (Thr-yTyr) 121: TAT-ACC (Tyr-=Thr) 140: ATG-.CCG (Met-+Proi
21 26: CCAGAC (Pro-Asp) 122 TCG-CCG (Ser-=Pra)
37 98. GAA AAA (GIu-L}rs)
39 28: GTATGC (L='a1-Cys)
22 165. TCC-GTG (Ser-Val
28 22: TAC-TCC (Tyr-Ser) 158 CTG-TGG (Leu-.Trp) 163:AGAGG :(Arg-Glyj
10 22. TAC-GAC (I'yr-Asp) 122= TCG-.CAC (Ser-His)
34 126. TfG-CAT (Leu-.His) 157: ATG-,TGG (f.tet-Trp;
36 162 CGA- CAA (Arg- GIn} 164. GCA-GAG (AIa-Glu)
14 22.TAC-ACG (Tyr-.Thr) 109 AAA- TGC (Lys-.Cys} 119. ACT--CCC (Thr-Pro) 147:
GCT-.TTC (A.la-Phs) 163: AGACTC (Arg-Leu)
30 59: TGG-Ti (Trp-Phe)
38 63: AGT-AGG (Ser-Arg)
Tableau 2
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TABLEAU 3
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TABLEAU4
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Ratio AUC Ratio T1/2
Dose AUC tot. tot s.c T1/2. s.c, h S.C
670 ng s=c, IWT CHO /WT CHO
IFNy WT CHO 222140 -- 12,3 --
G41S-S63C 914660 4,1 30,3 2,5
TABLEAU5
