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Méthode de construction de matériaux vivants fonctionnels, matériaux obtenus
et
applications
L'invention a pour objet une méthode de construction de biomatériaux
fonctionnels.
Elle vise également les biomatériaux tels qu'obtenus par cette méthode et
leurs applications.
Le terme biomatériau sera utilisé par la suite pour désigner un objet 3D
(biohybride),
constitué au minimum de macromolécules, de cellules vivantes et d'autres
composés
(molécules, particules, vésicules, ...), comme un tissu ou un organe par
exemple, à moins
d'indications contraires.
On sait qu'il existe une forte demande en biomatériaux fonctionnels, pour
réparer des
tissus détériorés ou détruits suite à des maladies, et en particulier un
besoin crucial en organes
pour des transplantations.
Diverses approches ont été proposées pour répondre à ces besoins, mais sont
loin de
permettre une production en routine, même de simples tissus.
L'approche classique utilisée en ingénierie tissulaire consiste à coloniser
une matrice
poreuse inorganique ou hybride par des cellules (1). Cette technique ne permet
pas toutefois
de créer des biomatériaux complexes qui dépendent de l'organisation à la fois
de nombreuses
cellules et de cellules différentes, aucun contrôle ne pouvant être exercé sur
la structuration du
tissu généré et l'environnement individuel autour de chaque type cellulaire.
Une méthode de transfert de couche cellulaire sur un support cellulaire a
également été
proposée (2) et appliquée à l'empilement de quelques couches cellulaires. Mais
ce procédé ne
permet pas de contrôler la structuration 2D et 3D d'un biomatériau et
l'environnement
individuel autour de chaque cellule.
Dans deux approches plus récentes, les auteurs proposent d'effectuer un dépôt
de
cellules viables sur une surface à l'aide d'un distributeur de cellules
vivantes (cell print) ou de
manière préférée à l'aide d'une imprimante à jet d'encre (3) ou par une
impression lazer (4).
Une organisation 3D est obtenue par dépôt successive d'une couche support
formée d'un
hydrogel, d'une couche de cellules et d'une autre couche support. Le
biomatériau obtenu ne
répond toutefois pas aux caractéristiques requises pour disposer d'un
biohybride 3D comme
un tissu et a fortiori un organe fonctionnel. L'utilisation d'un hydrogel en
tant que matrice
extracellulaire ne permet pas de contrôler 1'organisation 2D et 3D d'un
biomatériau et
l'environnement individuel autour de chaque cellule.
Les recherches des inventeurs dans ce domaine les ont amené à développer des
moyens, en exploitant une technique de dépôt dite couche par couche (LbL en
abrégé, pour
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Layer by Layer) (5-10), afin d'organiser tous les éléments nécessaires pour
obtenir un
biomatériau fonctionnel vivant, en particulier permettant de construire un
tissu ou un organe
(biohybride complet), ainsi qu'une structure biohybride, fonctionnels autour
d'un implant ou
d'un dispositif biomédical à implanter (biohybride partiel) (Figure 1).
L'invention a donc pour but de fournir une méthode de construction de
biomatériaux
vivants fonctionnels apportant une solution aux exigences de la technique dans
ce domaine, et
exploitable en routine grâce à sa mise en oruvre aisée et à un faible coût de
fabrication.
Elle vise également les biomatériaux ainsi obtenus, en tant que produits
nouveaux et
leurs applications, en particulier biomédicales et en nano-biotechnologies.
La méthode de construction selon l'invention d'un biomatériau artificiel
vivant
fonctionnel, est caractérisée par l'assemblage couche par couche (3D) d'une
matrice et de
couches (2D) de cellules vivantes fonctionnelles en contrôlant leurs
interactions et la
structuration 3D en fonction de l'organisation et de la forme finale
souhaitées pour le
biomatériau (tissu ou organe), où chaque couche a son propre motif adapté aux
couches
voisines et à la fonctionnalité des biomatériaux artificiels entiers..
Les couches de cellules 2D sont plus spécialement fabriquées soit d'une façon
homogène (couches non structurées) par trempage, pulvérisation (11) ou par un
procédé
donnant une couche mince d'hydrogel (épaisseur du nanomètre au micromètre)
pendant la
période d'immobilisation, soit de façon hétérogène (couches structurées en
motifs
particuliers) par dépôt cellule par cellule "spotting" à l'aide d'une
imprimante ou d'un
dispositif robotique.
Plus particulièrement, la méthode selon l'invention est caractérisée en ce
qu'on
dépose, consécutivement, sur un support, des motifs 2D de cellules vivantes
fonctionnelles ou.
souches, d'éléments nécessaires à leur survie, à leur croissance et à leur
différenciation et
d'une matrice extra-cellulaire, avec une structuration 2D et 3D selon
l'organisation et la
forme finale souhaitées pour l'objet biohybride (tissu ou organe), où chaque
couche a son
propre motif adapté aux couches voisines et à la fonctionnalité des
biomatériaux artificiels
entiers.
Ces dispositions permettent de réaliser et de contrôler avec une précision de
l'ordre du
micromètre (2D) et du nanomètre (3D), une structuration tridimensionnelle fine
des différents
types de cellules vivantes et de macromolécules, au sein d'un même
biomatériau, et de
contrôler la composition de la matrice extracellulaire indispensable à la
survie des cellules et à
leur communication.
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Lors du dépôt 2D cellule par cellule dans chaque couche et du dépôt 3D
consécutif de
plusieurs couches monocellulaires et de couches de matrice selon le processus
couche par
couche, on apporte en effet localement, à chaque cellule individuelle, les
éléments nécessaires
à sa survie, comme les substances nutritives, les agents de transport ou de
fixation de
l'oxygène, les facteurs de croissance, les facteurs de différenciation
cellulaire, les agents anti-
oxydants, les promoteurs d'adhésion cellulaire, les agents anti-
inflammatoires, les agents anti-
bactériens, les agents anti-viraux,les facteurs ou inhibiteurs d'angiogénèse,
les agents
immunosuppresseurs, les co-facteurs, les vitamines, des ADN, des agents de
transfection de
gènes, ou tout facteur stimulant ou bloquant l'activité cellulaire, biologique
ou thérapeutique.
L'invention fournit ainsi les moyens de procurer à chaque cellule
l'environnement
biochimique optimal par rapport à ses besoins et à sa position dans le
biomatériau en cours
d'élaboration.
Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention, pour la construction plus
spécialement d'un biomatériau simple, on procède au dépôt d'une seule couche
de cellules. Il
s'agit de cellules d'un même type ou de cellules d'au moins deux types
cellulaires différents.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, pour la construction d'un
biomatériau complexe, on procède au dépôt consécutif de plusieurs couches
alternées de
polymères et de cellules de types différents selon l'architecture souhaitée.
Les cellules déposées sont par exemple des cellules qui forment la surface
finale de
l'organe (peau), des cellules endothéliales, des cellules de muscle lisse, des
cellules de tissus
connectifs, des cellules formant les vaisseaux sanguins, des cellules
constitutives de tissus ou
d'organes et des cellules souches dont la différenciation en cellules
fonctionnelles sera induite
par des facteurs de différenciation.
Les cellules sont déposées selon le motif requis compte tenu de leur fonction.
Pour contrôler l'interaction cellule-matrice, on utilise des cellules nues ou
individuellement enrobées par des multicouches de polyélectrolytes (12-15) ou
des cellules
im.mobilisées lors de la gélification en surface d'une couche mince d'hydrogel
(épaisseur du
nanomètre au micromètre) composé par exemple d'alginate de calcium. Ces
différentes
approches d'immobilisation permettent d'assurer la fixation des cellules, soit
de façon
hétérogène selon des motifs qui sont imposés par le procédé de dépôt et la
distance entre les
cellules (cellules nues, cellules encapsulées et couche mince d'hydrogel) soit
de façon
homogène (cellules nues, cellules encapsulées et couche mince d'hydrogel),
ainsi que la
survie et la fonctionnalité maximales des cellules dans les objets
biohybrides. ). Les
biohybrides sont construits avec une structure 2D/3D où chaque cellule
individuelle possède
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un environnement biochimique optimal par rapport à ses besoins et sa position
dans l'organe
artificiel.
Dans une variante de réalisation de l'invention, on utilise des cellules
vivantes
encapsulées (12-15) par un revêtement d'une épaisseur de l'ordre du nanomètre.
Des
composés appropriés pour l'élaboration du revêtement comprennent des
macromolécules
fonctionnelles adaptées à l'enrobage cellulaire. Une telle encapsulation
permet, en modifiant
leur surface, d'utiliser des cellules qui sont normalement non-adhérentes.
Elle permet en outre
de rendre la cellule invisible par rapport à une reconnaissance
quelconque, de contrôler
l'accès/sortie des molécules ou macromolécules à l'interface cellule-
environnement (effet de
filtration, filtration sélective) ou de limiter la fibrose.
La méthode de construction définie ci-dessus comprend également le dépôt
d'éléments
nécessaires à la survie, à la croissance et à la différenciation des cellules.
De tels éléments comprennent, notamment, comme indiqué ci-dessus des facteurs
de
croissance, des agents anti-inflammatoires, des agents anti-bactériens, des
facteurs de
différenciation ou encore des promoteurs de vascularisation.
En ce qui concerne la matrice extra-cellulaire, elle est construite soit dans
le sens LbL,
à partir de molécules, macromolécules ou de composés colloïdaux (par exemple
hydrogel en
forme de nano-particules, vésicules, ...) interagissant par des interactions
covalentes et/ou
non covalentes, soit par gélification de 2 composés ou plus, tels que par
exemple l' alginate de
sodium et le calcium. Lors de la construction, il est possible d'incorporer
des molécules soit
dans la matrice multicouche, soit de part et d'autre de la matrice d'hydrogel
naissante en
surface composée par exemple d'alginate de calcium. La matrice présente une
composition
adaptée selon le type cellulaire en utilisant des polymères avec des fonctions
chimiques bien
contrôlées.
De manière avantageuse, elle est principalement composée de macromolécules
biotolérantes ou bioinertes, le cas échéant biodégradables ou bioactives.
Lors de la réalisation de l'invention, l'immobilisation de cellules sur la
matrice
multicouche ou dans la matrice d'hydrogel naissante en surface est envisagée
selon 4
approches en fonction des besoins (Figures 2A à 2D) :
- la première (2A) réside dans le dépôt couche par couche de cellules nues
(adhésion
cellulaire contrôlée) sur un substrat préalablement modifié par un traitement
multicouche.
Ensuite, il est possible de recouvrir les cellules par un autre système
multicouche ;
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- la seconde (2B) implique le dépôt couche par couche de cellules encapsulées
individuellement (4) par des multicouches de polyélectrolytes sur un substrat
préalablement
modifié par un traitement multicouche ;
- la troisième (2C) est basée sur l'incorporation de cellules dans une matrice
d'hydrogel naissante en surface dont l'épaisseur est fonction de l'épaisseur
du réservoir
multicouche contrôlant la concentration d'un des composés nécessaire à la
gélification tel que,
par exemple, le calcium, PLL ou des oligoamines. Par exemple, la matrice
d'alginate de
calcium est formée par gélification d'une solution d'alginate de sodium
contenant des cellules
au contact d'un gélifiant, le calcium ;
- la quatrième (2D), une variante de la troisième, repose aussi sur
l'inclusion de
cellules dans une matrice d'hydrogel naissante en surface composée par exemple
d'alginate
de calcium, mais sans implication d'un réservoir multicouche. La construction
de la matrice
d'alginate de calcium est réalisée, par exemple, par dépôt simultané d'une
solution d'alginate
de sodium contenant les cellules et d'une solution de calcium.
La matrice d'hydrogel naissante en surface, obtenue par pulvérisation, peut
être
déposée entre des multicouches de polyélectrolytes contenant des principes
actifs, tels que par
exemple des facteurs de croissance et des facteurs de différenciation. Cette
approche
d'immobilisation des cellules peut également être utilisée dans la
construction d'un objet
biohybride impliquant une structure en motifs par dépôt d'agents de
gélification à l'aide d'une
imprimante ou d'un dispositif robotique.
L'opération de dépôt des différents composants impliqués dans la construction
du
biomatériau est réalisée soit par trempage ou pulvérisation pour former une
couche 2D non
structurée, soit à l'aide d'une imprimante (Figure 3) ou d'un dispositif
robotique pour
construire une couche 2D structurée en motifs particuliers ou non structurée.
La technique
par pulvérisation (9,10) présente l'avantage de permettre un dépôt rapide et
homogène sur la
surface et également de construire des matrices totalement à façon, en
modulant les
composants tout au long de la construction.
Les biomatériaux tels qu'obtenus par la méthode définie ci-dessus sont des
produits
nouveaux et à ce titre sont également visés par l'invention.
Ces biomatériaux constituent une solution au problème aigu de la demande non
satisfaite en organes en vue de transplantations essentielles à la survie de
patients (biohybride
total ou partiel). Ils constituent aussi des solutions de remplacement dans
les cas où les
transplantations de certains organes ont peu de chances de pouvoir être
réalisées avec succès.
De plus, de manière avantageuse, leur emploi permet de supprimer les fortes
doses
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d'immunosuppresseurs administrées à un transplanté et qui l'empêchent de
récupérer un
maximum de qualité de vie après la transplantation.
La structuration des biomatériaux de l'invention se rapprochant de celle du
tissu réel,
ils sont utilisables, de manière générale, pour les réparations tissulaires,
comme par exemple
la reconstruction du cartilage. Dans ce cas, l'acide hyaluronique, constituant
clé du cartilage,
est alors incorporé dans les matrices destinées à la réparation
ostéochondrale. A l'image de
l'hétérogénéité du tissu hyalin natif, les matrices utilisées peuvent
également inclure des
chondrocytes.
Ces biomatériaux s'avèrent donc particulièrement appropriés pour des
applications
biomédicales et en nano biotechnologies, comme réacteurs à l'interface ou
membranaires en
couche mince pour la bio-fabrication de molécules d'intérêt par des cellules
vivantes, ou
comme organe artificiel, soit complètement biohybride, soit en tant que
dispositif synthétique
enrobé par une couche biohybride.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés ci-après
dans la
description de modes de réalisation, ce qui ne doit nullement être interprété
comme une
limitation de l'invention à ces caractéristiques.
Dans la description qui suit, il sera fait référence aux figures 1 à 7, qui
illustrent,
respectivement,
- la figure 1: la représentation schématique d'un biohybride 2D/3D
complètement construit couche par couche (lA) et d'un biohybride construit
autour d'un
implant ou d'un dispositif biomédical à implanter (1B) ;
- la figure 2: la représentation schématique des 4 approches (2A à 2D)
d'immobilisation de cellules utilisées pour la réalisation de l'invention ;
- la figure 3 : une méthode d'assemblage des éléments d'un biomatériau à
l'aide
d'une imprimante à jet d'encre ;
- la figure 4: une représentation schématique d'une couche cellulaire au sein
d'une architecture multicouche (4A) et une photo en microscopie optique d'une
couche
d'érythrocytes humains incorporés dans un film multicouche (4B);
- les figures 5 A et 5C : une représentation schématique de deux couches
cellulaires au sein d'une architecture multicouche (5A) et deux photos en
microscopie
optique de 2 couches d'érythrocytes humains incorporés dans un film
multicouche (5B et
5C);
- la figure 6: une photo de l'imprimante jet d'encre HP 690C avec un
agrandissement du substrat au niveau de la zone d'impression ;
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- la figure 7: une section verticale de la stratégie selon l'invention de
dépôt par
pulvérisation des différents constituants du cartilage.
Exemule : fabrication d'obiets biohybrides fonctionnels
La figure 3 illustre la construction d'un objet biohybride à l'aide d'un dépôt
couche
par couche 3D mettant en ceuvre une imprimante à jet d'encre. Sur cette
représentation
schématique, la tête de l'imprimante comprend 3 buses de distribution de
liquides, par
exemple contenant, respectivement, des cellules vivantes, des polyanions et
des polycations.
Pour la préparation de biomatériaux complexes, on utilise des têtes
d'imprimantes comportant
le nombre de buses requis pour les différents dépôts à effectuer. 'On procède
au dépôt des
liquides contenant les composants souhaités selon de quantités allant de
picolitres à des
microlitres de manière à former des couches successives des éléments
constitutifs du
biomatériau et de la matrice extracellulaire. Cette technique met en jeu par
exemple des
interactions entre charges opposées (LbL-électrostatique), d'autres
interactions non-
covalentes (liaisons hydrogènes par exemple) et des interactions covalentes
(LbL-covalent)
entre les matériaux constituant les couches. Les dépôts successifs sont
réalisés de manière à
contrôler l'épaisseur et la structuration 2D et 3D de chaque couche.
Pour constituer la matrice artificielle de type hydrogel, on procède au dépôt
de
couches de polysaccharides ou de peptides biodégradables à croissance
exponentielle, ce qui
permet de former des couches épaisses de caractère hydrogel, mais de structure
lâche, tout en
n'effectuant qu'un nombre réduit de cycles.
En combinant des couches à croissance linéaire avec des couches à croissance
exponentielle, on peut fabriquer, si on le souhaite, des films comportant
plusieurs
compartiments.
Protocole de Aréparation de multicouches contenant des érythrocytes sur du
verre :
Les érythrocytes ont été choisis du fait qu'ils s'agissent de cellules non
fonctionnelles
difficiles à immobiliser. L'immobilisation de ces cellules constitue donc un
véritable défi et
leur capacité à traverser des structures vasculaires de petite taille leur
confère une parfaite
adaptation au micro-cisaillement induit par la pulvérisation.
L'absence d'éclatement des érythrocytes en présence de PDDAC (Poly(diallyl
diméthyl ammonium chlorure) contrairement à PLL (Poly-L-Lysine) ou PAH
(Poly(allylamine) hydrochlorure) a induit l'utilisation de ce polymère pour le
contact direct
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avec le matériel sanguin (couche avant et après dépôt des érythrocytes non
encapsulés dans le
cas d'un dépôt sur une surface ainsi que la couche d'encapsulation des
érythrocytes).
A) Activation de la surface
Les substrats (lamelles de verres circulaires) sont préalablement nettoyés à
l'éthanol et
le cas échéant à l'acétone puis séchées sous flux d'azote dans le but
d'obtenir une surface
propre. Ensuite, les lamelles sont activées par immersion consécutive dans une
solution
HC1/MeOH (50/50 v/v) et une solution concentrée de H2SO4 au moins pendant 4
heures pour
chacune d'entre elles. Pour ces différentes opérations, on utilise un portoir
en Téflon réalisé
précédemment à l'ICS qui permet de maintenir 6 lamelles verticalement.
B) Préparation des solutions de polyélectrolytes
Les solutions de polyélectrolytes sont préparées à 0,1% (w/v) dans un tampon
Tris
(25mM) contenant du NaC1 (0,13 à 0,15M) où le pH a été ajusté à 7,3 (+/-0,1).
Les
polyéléctrolytes qui ont été utilisés pour la construction des multicouche
sont : PEI
(poly(éthylène imine)), Alginate, PLL, PSS (poly(styrène sulfonate) de
sodium), PAH et
PDDAC.
C) Préparation des aliquotes sanguins
Un prélèvement de sang total humain est centrifugé et rincé au moins une fois
avec
environ 12mL de tampon Tris (voir section B). Un aliquote de 30 L de cette
préparation est
prélevé et dilué qsp 1mL dans du tampon Tris avant dépôt sur les surfaces
préalablement
activées et traités par des multicouches terminé par PDDAC.
D) Construction du multicouche mixte
Les lamelles activées sont rincées à l'eau ultrapure avant dépôt des couches
polyélectrolytes.
*Dépôt d'une couche polyélectrolyte :
Les lamelles sont immergées durant l5min dans environ 15mL d'une solution de
polyélectrolyte telle que décrite en B). Elles sont ensuite rinçées deux fois
dans 15mL de
tampon pendant 2min pour chaque bain de rinçage, avec agitation manuelle du
portoir
pendant environ lmin. Ce procédé est répété avec une solution de
polyéléctrolyte de charge
opposée, ceci le nombre de fois nécessaire pour réaliser la construction
désirée (voir suivant).
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*Dépôt d'une couche cellulaire :
L'aliquote dilué est prélevé à la pipette pasteur et déposé sur les lamelles
traitées
(terminées PDDAC) de telle sorte que la goutte recouvre toute la surface de la
lamelle. Après
20 minutes de contact, la lamelle est rincée de la même manière que pour le
rinçage des
couches polyélectrolytes. Alternativement, le dépôt d'érythrocytes peut
également être réalisé
par pulvérisation.
La construction d'une multicouche débute toujours avec PEI. La couche suivante
contient soit directement (PSS/PDDAC),,, soit après l'adsorption préalable de
(PSS/PAH)õ
avec PAH couplé à FITC (fluorophore) pour visualisation de la fluorescence par
microscopie
confocale. Les couches recouvrant directement les érythrocytes sont composées
soit de
(PDDAC/PSS)õ ou (PDDAC/PSS)n ensuite recouverts de PAH/PSS avec PAH
fluorescent
pour visualisation du recouvrement par microscopie confocale ou de
fluôrescence. Dans le cas
d'érythrocytes encapsulés (14,15) avec le PDDAC, leur incorporation dans la
multicouche est
réalisée entre 2 couches de polyanions.
Dans le cas où plusieurs couches d'érythrocytes sont déposées. Les
érythrocytes
peuvent être soit directement déposés sur la multicouche (peu de couches
polyélectrolytes
suffisent) soit une multicouche à caractère hydrogel (croissance
exponentielle) peut également
être construite entre les deux couches cellulaires pour assurer une bonne
séparation spatiale
(ici, (PLL/Alg)n avec n de 8 à 20).
La figure 4 montre une image de microscopie optique d'érythrocytes humains
incorporés dans un film multicouche (grossissement de 400).
Les figures 5B et 5C montrent deux images de microscopie optique où 2 couches
d'érythrocytes humains ont été incorporés au sein d'une multicouche. Ces 2
images ne
diffèrent que par la mise au point qui a été faite au niveau de chaque couche
cellulaire.
Contrôle de l'environnement local:
Pour contrôler l'environnement local de chaque cellule, on fonctionnalise
chaque
cellule à sa surface par enrobage LbL avec des macromolécules
biofonctionnelles.
En variante, on fixe des agents actifs tels que RGD (tripeptide qui facilite
l'adhésion
cellulaire) ou a-MSH (agent anti-inflammatoire) à des polyélectrolytes tels
que la poly-L-
lysine (16-19), ce qui conduit à des polymères qui peuvent être aisément
caractérisés en
solution et déposés sur différentes surfaces en utilisant le protocole de
dépôt couche par
couche.
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La figure 6 montre l'imprimante HP 690C utilisée pour imprimer "ICS
Strasbourg"
avec une multicouche de polyélectrolytes sur un substrat de silicium.
Protocole d'impression d'un film polyélectrolyte à l'aide d'une imprimante HP
690C :
A) Préparation des solutions :
PSS et PAH ont été utilisés à la concentration de lmg/mL en solution aqueuse
de
Milli-Q. On travaille sans sel.
B) Préparation d'une cartouche d'imprimante :
Pour commencer, il faut vider la cartouche d'encre noire, la seule que l'on
utilise, en
perçant un trou au niveau de la membrane sur la face supérieure de la
cartouche. Une fois
vidée, la cartouche est nettoyée avec de l'eau du robinet jusqu'à ne plus voir
d'encre coulée,
ni d'encre à l'intérieur. Enfin, la cartouche est abondamment rincée avec une
solution d'eau
Milli-Q puis séchée à l'azote. Les solutions de polyélectrolytes sont
introduites avec une
seringue par la face supérieure.
C) Préparation de l'imprimante :
L'imprimante utilisée, un modèle HP 690C où la cartouche noire est dissociée
de la
cartouche de couleur, permet d'imprimer à partir d'une seule cartouche
d'encre, la noire dans
le cas de l'expérimentation.
Le substrat est collé sur la poutre noire plastifiée de l'imprimante où se
fera
l'impression. . La calibration de la zone d'impression a été réalisée à partir
du logiciel
Canevas en imprimant d'abord sur une vraie page blanche, puis sur un ruban
collé sur la barre
plastifiée.
D) Imprimer un film multicouche.
Pour imprimer un film multicouche sur un substrat de silicium, on imprime donc
alternativement le même dessin (ICS Strasbourg) avec respectivement une
cartouche
contenant du PSS et une cartouche contenant du PAH. Comme la cartouche ne
contient pas de
sel, on peut imprimer sans rinçage.
Remarque : Si l'on désire imprimer à partir de solutions contenant du sel, il
faut
impérativement rincer la surface après le dépôt de chaque couche car des
cristaux de sel sont
très rapidement obtenus en surface. Pour cette étape, il faut décoller et
recoller le substrat au
même endroit.
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Protocole d'immobilisation de cellules par IZélification d'alginate pulvérisé
sur
une surface riche en calcium.
L'alginate de sodium est solubilisé à 0.6 % (w/v) dans un tampon Krebs-Ringer-
Hepes, composé de 25 mM Hepes, 90 mM NaCl, 4.7 mM KCI, 1.2 mM KH2PO4 and 1.2
mM
MgSO4.7H20, dont le pH a été ajusté à 7.3 avec une solution de NaOH 1M.
Ensuite, les
cellules sont dispersées dans la solution d'alginate. La suspension ainsi
obtenue est pulvérisée
à une pression approximative de 1.3 atmosphère sur une boîte de Pétri
préalablement traitée
par une multicouche (PLL/Alg)2/Ca. Finalement, le matériau contenant les
cellules est rincé
par immersion consécutive dans deux bains de tampon Hepes. Le dépôt
additionnel de
couches de polyélectrolytes sur le gel d'alginate peut être réalisé.
Protocole d'encapsulation de cellules avec des polyélectrolytes
L' encapsulation individuelle des cellules est réalisée par dispersion
successive des
cellules dans une solution à 0.3% (w/v) d'alginate dans du tampon Hepes et
dans une solution
0.1 %(w/v) de PLL dans du tampon Hepes pendant 15 minutes. Entre chaque
couche, la
suspension est centrifugée à 2000 tpm pendant 5 minutes, rincée avec du tampon
Hepes et
centrifugée à nouveau.
Reconstruction tridimensionnelle du cartilage par pulvérisation séquentielle
de
cellules et des, constituants matriciels
Les composants de la matrice du cartilage sont déposés par pulvérisation
simultanément et/ou de manière alternée, selon trois sous- unités cellules-
matrice de structure
et de nature différentes à savoir :
(i) un film de (acide hyaluronique (HA)/PLL) comme compartiment actif,
(ii) un gel d'alginate de calcium contenant les cellules,
(iii) un mélange de collagène et d'hydroxyapatite .
Les gels d'alginate et les films fonctionnalisés, par exemple par des facteurs
de
croissance, ont un rôle de tuteur dans le processus de différenciation
cellulaire et de
régénération du cartilage, alors que le mélange de collagène et
d'hydroxyapatite facilite
l'ancrage du biomatériau dans l'os sous-chondral.
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Cette construction est représentée sur la figure 7 qui montre, en section
verticale, la
stratégie suivie pour le dépôt par pulvérisation des différents constituants
du cartilage
utilisés :
(1) une couche de collagène et d'apatite comme matrice ostéo-chondrale,
(2) un film muticouche (par exemple le système HA/poly-L-lysine (PLL)) comme
compartiment fonctionnalisé par des facteurs de croissance d'intérêt comme BMP-
2 et TGF-
a,
(3) une couche d'alginate contenant des cellules souches, à différencier en
chondrocytes,
exprimant le collagène de type X,
(4) un film multicouche (HA/PLL) comme compartiment actif,
(5) une couche d'alginate contenant des cellules souches, à. différencier en
chondrocytes,
exprimant le collagène de type IIB spécifique du cartilage,
(6) un film multicouches (HA/PLL) comme compartiment actif,
(7) une couche d' alginate contenant des cellules souches, à différencier en
chondrocytes,
exprimant le collagène de type I et II.
Les deux réactifs pour former le gel d'alginate de calcium sont le CaC12 et
l'alginate
de sodium, qui est un polymère naturel constiuté de deux unités
monosaccharidiques, l'acide
D-mannuronique (M) et l'acide L-guluronique (G). La proportion en M et G varie
d'une
espèce à l'autre.
Dans les expériences rapportées dans ces exemples, l'alginate de sodium
utilisé
provient de l'algue Macrocystis pyrifera (Sigma-Aldrich). Cet alginate de
sodium présente
une plus grande proportion de blocs M et le quotient M/G est d'environ 1,6. Le
gel est obtenu
par pulvérisation simultanée d'une solution d'ions Ca2+ à une concentration de
0,125M et
d'une solution d'alginate de sodium avec un rapport Ca/alginate en mole de
1/1. Pour la
pulvérisation de cellules, les cellules sont mises en suspension dans la
solution d'alginate de
sodium.
La viabilité des cellules pulvérisées dans les gels d'alginate de calcium a
été vérifiée
par la méthode de MTT et a permis de confirmer que la pulvérisation des
cellules dans les
gels n' entraînait pas de mort cellulaire significative.
L'observation en microscopie confocale de gels renfermant des fibroblastes a
montré
que les cellules restent bien entre deux couches de gels et conservent leur
phénotype.
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